JP2018504891A - リアルタイムPCRによる細胞溶解物からのHBV cccDNA定量化のための新規ハイスループット法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、(1)B型肝炎ウイルス(HBV)環状DNA(cccDNA)の高効率リアルタイムqPCRに使用可能な新規DNAプライマーセット、および(2)リアルタイムqPCRによる新規DNAプライマーのこのセットを用いた、細胞由来のHBV cccDNAの定量化のための新規ハイスループット法を提供する。本発明はまた、実験的に感染させた肝細胞におけるcccDNAレベルを監視する際のこの方法の使用、およびHBVに対する療法的効果の評価も提供する。
Description
本発明は、(1)B型肝炎ウイルス(HBV)共有閉鎖環状DNA(cccDNA)の高効率リアルタイムqPCRに使用可能な新規DNAプライマーセット、および(2)リアルタイムqPCRによる、当該新規DNAプライマーのセットを用いた細胞由来のHBV cccDNAの定量化のための新規ハイスループット法に関する。本発明はまた、実験的に感染させた肝細胞におけるcccDNAレベルを監視する際のこの方法の使用、およびHBVに対する療法的効果の評価にも関する。
cccDNAは、HBV生物学において重要な役割を果たすため、cccDNAをターゲティングする潜在的な薬剤候補の研究のために、多くの実験系が確立されてきている。cccDNAの調節可能細胞モデルを提供するため、Ladnerら(Ladner, S.K., Otto, M.J., Barker, C.S., Zaifert, K., Wang, G.H., Guo, J.T., Seeger, C., King, R.W., Antimicrob Agents Chemother. 1997年8月;41(8):1715−20)は、tetプロモーター系の転写制御下で、HBVウイルスゲノムを挿入した。さらに、挿入物の長さは、HBVの全ゲノムの長さより長く、Nt(ヌクレオチド)1805−1900に渡る配列重複を提供した(Caiら, Antimicrob Agents Chemother. 2012年8月; 56(8): 4277−88)。このスキームは、cccDNAレベルおよび機能の代理マーカーとして、eAg産生の使用を可能にした。最後に、Guoら(J. Virol. 2007, 81(22):12472)は、上記遺伝的背景において、sAg遺伝子をさらに突然変異させると、HepDES19と称される細胞株において、ウイルスDNAの形成は、成熟ウイルス粒子を形成するためには使用不能であり、したがって、核へとサイクリングされる経路にしたがって、cccDNA形成のより多くの前駆体が提供されることを示唆した。これらの修飾は、cccDNAの調節された産生、cccDNAの代理測定および機能的ウイルス粒子の排除を生じたため、HepDES19に基づく細胞モデルは、cccDNAの研究を非常に容易にし、そしてcccDNAの代理マーカーとしてeAgを用いるハイスループットスクリーニング(HTS)アッセイの確立を生じた(Antimicrob Agents Chemother. 2012年8月; 56(8): 4277−88)。
しかし、cccDNAは、HBV疾患治療の直接の関心対象ターゲットである。したがって、細胞株、特にHepDES19細胞におけるcccDNAの直接測定は、cccDNA産生および安定性に関する活性評価において重要である。
慣用的(従来型、conventional)技術、例えばサザンハイブリダイゼーションによるcccDNAの測定は、感度またはスループットが低いため、ハイスループット法としては使用不能である。He(BBRC 295 (2002) 1102−1107、米国特許出願:20040058314)、Shaoら(CN 101503740 B)およびLuら(CN 101285105B)は、以前、qPCRに基づくcccDNA定量化アッセイ法を報告してきている。詳細なqPCR法は異なる可能性もあるが、すべての方法は、分析前にHBV DNAの抽出を必要とする。DNA抽出は複雑で、そしてqPCRに重要な系に必須の構成要素を除去する。したがって、こうしたDNA抽出が関与する場合、一般的に、等量の出発材料、例えば細胞数を用いることによって調節する。こうした調節は、結果を同等化することをどのように試みるかの示唆を提供するが、これらは、厳密に言って、実際の実験対照を含まない。
DNA精製工程を含むため、qPCRによるcccDNA直接測定は、ハイスループットスクリーニング形式にスケールアップすることが不可能である(Hirt, B, J. Mol. Biol. 1967; 26, 365−9)。すべての試料供給源、特にHepDES19細胞モデル系由来のものにおけるcccDNAハイスループット測定を可能にしうる、より優れた方法を提供するため、新規のロバストなスクリーニングスキームが必要である。
多くの人々が、DNAのプレ精製を伴わない細胞溶解物試料において、ある核酸の特定の型を直接測定する方法を記載してきている(Yang K.ら, Gene. 2013年12月1日, 531(2):199−204; Kumar JSら, Mol Cell Probes. 2014年4月13日; Pang Zら, PLoS One. 2014年4月21日, 9(4): e95635.)。これらのアプローチは、アッセイ効率を有意に増加させた。しかし、これらのアプローチは、He、ShaoおよびLuによって記載されるcccDNA qPCR法に適用不能である。彼らの引用される方法からのプライマー配列情報に基づいて、その逆方向プライマーはすべて、q−PCRアッセイに容易に使用可能であるように、HBV Nt−1990上流の配列範囲内にある。このため、HepDES19細胞において、これらのqPCRに基づく方法はすべて、1.1× HBVゲノムの染色体挿入物からのDNAシグナルを増幅し(Guoら, J Virol. 2007年11月, 81(22):12472−84)、したがってcccDNAを選択的に増幅することに失敗する。さらに、直接溶解後のqPCRは、HBV DNAの他の型、例えば弛緩環状DNA(rcDNA)および細胞中に挿入されたHBVゲノムからcccDNAを区別することに関与するプライマーのより高い特異性を必要とする。
Ladner, S.K., Otto, M.J., Barker, C.S., Zaifert, K., Wang, G.H., Guo, J.T., Seeger, C., King, R.W., Antimicrob Agents Chemother. 1997年8月;41(8):1715−20
Caiら, Antimicrob Agents Chemother. 2012年8月; 56(8): 4277−88
Guoら(J. Virol. 2007, 81(22):12472)
He(BBRC 295 (2002) 1102−1107)
Hirt, B, J. Mol. Biol. 1967; 26, 365−9
Yang K.ら, Gene. 2013年12月1日, 531(2):199−204
Kumar JSら, Mol Cell Probes. 2014年4月13日
Pang Zら, PLoS One. 2014年4月21日, 9(4): e95635.
要約すると、HBV DNAをあらかじめ抽出することなく、HBV感染細胞、特にHepDES19において、cccDNAレベルを定量化するために利用可能な高感度および特異的HTS直接アッセイはない。したがって、高感度、ハイスループットおよび高特異性をもって、cccDNAを定量化する方法が必要である。本発明の目的は、本明細書に示すように、これらの必要性を満たすことである。
発明の概略
本発明は、HBV感染細胞、特にHepDES19細胞からの、事前のDNA抽出および精製を伴わない、直接リアルタイムPCRによる、一工程cccDNA定量的HTS(ハイスループットスクリーニング)法を開発するためのものである。
本発明は、HBV感染細胞、特にHepDES19細胞からの、事前のDNA抽出および精製を伴わない、直接リアルタイムPCRによる、一工程cccDNA定量的HTS(ハイスループットスクリーニング)法を開発するためのものである。
本発明者らは、cccDNA特異的プライマーセットを設計した。プライマーのこの新規セットは、HBV cccDNAからDNA断片を増幅するが、ゲノムDNAまたは染色体に挿入されたHBV DNAからは増幅せず、cccDNA特異的であることが立証されてきている。これらのプライマーのcccDNAに対する特異性は、DNA抽出およびcccDNA精製工程に対する必要性を排除し、そしてHTSモードのマイクロタイタープレートアッセイ形式でcccDNAを定量化することを可能にする。
本発明の1つの態様は、極3’端に、B型肝炎ウイルス(HBV)ゲノム(配列番号1)のヌクレオチド配列内の少なくとも16の連続配列を認識する配列を含む、逆方向プライマーである。
本発明の別の態様は、上述のような有意性を有する逆方向プライマーおよび普遍的順方向プライマーからなるプライマー対であって、普遍的順方向プライマーの長さが、16〜200ヌクレオチド、17〜35ヌクレオチド、18〜30ヌクレオチド、21〜30ヌクレオチド、24〜30ヌクレオチドまたは21〜24ヌクレオチドであり、そしてHBVゲノムのDR2上流を認識する、前記プライマー対である。
本発明の別の態様は、プローブの長さが、16〜200ヌクレオチド、17〜35ヌクレオチド、18〜30ヌクレオチド、21〜30ヌクレオチド、24〜30ヌクレオチドまたは21〜24ヌクレオチドである、抽出DNAまたは一工程qPCRアッセイの溶解物を検出するためのプローブである。
本発明は、逆方向プライマーおよびプローブが上述のような有意性を有する、逆方向プライマーおよびプローブで構成される組み合わせに関する。
本発明は、テンプレートとしてHBVゲノム(配列番号1)を用いるか、逆方向プライマーおよび普遍的順方向プライマーのプライマー対を用いるか、または逆方向プライマーおよびプローブで構成される組み合わせを用いることで構成され、逆方向プライマー、普遍的順方向プライマーおよびプローブが上述のような有意性を有する、PCRによってHBV cccDNAを検出するための方法に関する。
本発明は、テンプレートとしてHBVゲノム(配列番号1)を用いるか、逆方向プライマーおよび普遍的順方向プライマーのプライマー対を用いるか、または逆方向プライマーおよびプローブで構成される組み合わせを用いることで構成され、逆方向プライマー、普遍的順方向プライマーおよびプローブが上述のような有意性を有する、PCRによってHBV cccDNAを検出するための方法に関する。
本発明は、上述のような有意性を有する、HBVに対する療法的効果を評価する際に用いる方法に関する。
本発明は、HBVに対する療法的効果を評価するための、逆方向プライマー、逆方向プライマーおよび普遍的順方向プライマーのプライマー対、または逆方向プライマーおよびプローブで構成される組み合わせの使用であって、逆方向プライマー、普遍的順方向プライマーおよびプローブが上述のような有意性を有する、前記使用に関する。
本発明は、HBVに対する療法的効果を評価するための、逆方向プライマー、逆方向プライマーおよび普遍的順方向プライマーのプライマー対、または逆方向プライマーおよびプローブで構成される組み合わせの使用であって、逆方向プライマー、普遍的順方向プライマーおよびプローブが上述のような有意性を有する、前記使用に関する。
本発明は、HBVに対する療法的効果を評価するための検出剤調製における、逆方向プライマー、逆方向プライマーおよび普遍的順方向プライマーのプライマー対、または逆方向プライマーおよびプローブで構成される組み合わせの使用であって、逆方向プライマー、普遍的順方向プライマーおよびプローブが上述のような有意性を有する、前記使用に関する。
本発明は、規準化対象としての内部参照遺伝子の使用に関する。これは、qPCR定量化対照としてのゲノムDNA上の遺伝子(単数または複数)に対するプライマーの使用を含む。
本発明におけるすべてのDNA構成要素の一部の保存は、こうした定量化対照を可能にする。
本発明は、逆方向プライマー、プライマー対、または組み合わせで構成され、逆方向プライマー、プライマー対、および組み合わせが上述のような有意性を有する、HBVに対する療法的効果を評価するためのキットに関する。
本発明は、逆方向プライマー、プライマー対、または組み合わせで構成され、逆方向プライマー、プライマー対、および組み合わせが上述のような有意性を有する、HBVに対する療法的効果を評価するためのキットに関する。
本発明はまた、HBV DNAに対するおよび参照遺伝子に対する、参照対照遺伝子プライマーおよびプローブ対と組み合わせた、逆方向プライマー、プライマー対で構成される、HBVに対する療法的効果を評価するための多重化キットであって、逆方向プライマーおよびプライマー対が、上述のような有意性を有する、前記キットにも関する。
定義
別に定義しない限り、本明細書に用いるすべての技術的および科学的用語は、本発明が関連する技術分野の一般的な当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載するものと類似の本質的に任意の方法および材料を本発明の実施または試験に使用可能であるが、例示的な方法および材料のみを記載する。本発明の目的のため、以下の用語を以下に定義する。
別に定義しない限り、本明細書に用いるすべての技術的および科学的用語は、本発明が関連する技術分野の一般的な当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載するものと類似の本質的に任意の方法および材料を本発明の実施または試験に使用可能であるが、例示的な方法および材料のみを記載する。本発明の目的のため、以下の用語を以下に定義する。
用語「ヌクレオチド」は、天然存在リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド単量体への言及に加えて、背景が明らかに別のものを示さない限り、関連するその構造変異体も指すと理解されるものとし、ヌクレオチドが使用される特定の背景(例えば相補的塩基へのハイブリダイゼーション)に関して機能的に同等である、誘導体および類似体が含まれる。
用語「同一性」は、2またはそれより多い核酸またはポリペプチド配列の背景において、同じである2またはそれより多い配列または下位配列を指す。配列は、以下の配列比較アルゴリズムの1つを用いてまたは手動整列および視覚的検査によって測定した際、比較ウィンドウまたは指定される領域に渡って、最大対応のために比較し、そして整列させた際に、同じであるヌクレオチドまたはアミノ酸残基の明記される割合(例えば、明記される領域に渡る、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、または少なくとも95%の同一性)を有する場合、互いに「実質的に同一」である。これらの定義はまた、試験配列の相補体も指す。場合によって、同一性は、長さ少なくとも約50ヌクレオチドである領域に渡って、あるいはより典型的には、長さ100〜500または1000またはそれより多いヌクレオチドの領域に渡って存在する。
用語「PCR」は、本明細書において、ポリメラーゼ連鎖反応を指す。
用語「qPCR」は、一般的に、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応、定量的ポリメラーゼ連鎖反応または動力学的ポリメラーゼ連鎖反応として知られるPCR技術を指す。この技術は、PCRを用いてターゲット核酸を増幅すると同時に定量化し、ここで、定量化は、ターゲット核酸にハイブリダイズした場合にしか検出可能でない蛍光レポーター分子を含有する、挿入蛍光色素または配列特異的プローブによる。
用語「qPCR」は、一般的に、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応、定量的ポリメラーゼ連鎖反応または動力学的ポリメラーゼ連鎖反応として知られるPCR技術を指す。この技術は、PCRを用いてターゲット核酸を増幅すると同時に定量化し、ここで、定量化は、ターゲット核酸にハイブリダイズした場合にしか検出可能でない蛍光レポーター分子を含有する、挿入蛍光色素または配列特異的プローブによる。
用語「プライマー」は、本明細書において、qPCR反応におけるDNA複製反応イニシエーターとして働くことが可能なオリゴヌクレオチドDNAを指す。
用語「プローブ」は、本明細書において、反応中に存在する相補的DNAのレベルの増加と相関する蛍光強度変化を変化させることが可能な蛍光標識を伴うオリゴヌクレオチドを指す。
用語「プローブ」は、本明細書において、反応中に存在する相補的DNAのレベルの増加と相関する蛍光強度変化を変化させることが可能な蛍光標識を伴うオリゴヌクレオチドを指す。
用語「Cp」は、投入ターゲット核酸の定量化を可能にする値を指す。Cp値は、二次導関数最大値法(Van Luu−Theら, 「二次導関数計算および二重補正を用いたハイスループット測定のための改善リアルタイムRT−PCR法」 BioTechniques, Vol. 38, No. 2, 2005年2月, pp. 287−293)にしたがって決定可能である。二次導関数法において、Cpは、二次導関数曲線の最初のピークに相当する。このピークは、対数線形相の始まりに相当する。二次導関数法は、リアルタイム蛍光強度曲線の二次導関数値を計算し、そして1つの値のみが得られる。元来のCp法は、例えば多項式関数による強度値の局所定義微分近似に基づく。次いで、三次導関数を計算する。Cp値は、三次導関数の最小根である。Cpはまた、対数線形領域において、閾値線の平行線の交差点によってCpを決定するフィットポイント法を用いても決定可能である(Van Luu−Theら, BioTechniques, Vol. 38, No. 2, 2005年2月, pp. 287−293)。これらの計算は、いかなる当業者によっても容易に実行される。
用語「抽出」は、本明細書において、修飾Hirt法(Arad U, Biotechniques. 1998年5月; 24(5):760−2; Hirt, B, J. Mol. Biol. 1967; 26, 365−9)にしたがった、染色体外DNAの精製を指す。
用語「慣用的」(conventional)は、当該分野においてよく認められた公表参考文献に基づく実験法および材料を指す。曖昧さを回避するため、図中の「慣用群」および「慣用的」は異なる意味を有し、これは以下の略語部分に例示される。
用語「一工程qPCR」は、細胞材料を溶解し、そして直接qPCR分析に供する実験法を指す。
用語「Z因子」は、アッセイの統計的再現性の測定値である。これは、ハイスループットスクリーニングにおいて、特定のアッセイにおける反応が、さらなる注目を保証するために十分に大きいかどうかを判断するためのハイスループットスクリーニングにおける使用のために提唱されてきている(この場合、Zプライムとしても知られ、そして一般的にZ’と書かれる)。Z因子は、4つのパラメータ:陽性(p)および陰性(n)対照両方の平均および標準偏差に関して定義される(μp、σp、μnおよびσn)。これらの値を考慮して、Z因子は:
用語「Z因子」は、アッセイの統計的再現性の測定値である。これは、ハイスループットスクリーニングにおいて、特定のアッセイにおける反応が、さらなる注目を保証するために十分に大きいかどうかを判断するためのハイスループットスクリーニングにおける使用のために提唱されてきている(この場合、Zプライムとしても知られ、そして一般的にZ’と書かれる)。Z因子は、4つのパラメータ:陽性(p)および陰性(n)対照両方の平均および標準偏差に関して定義される(μp、σp、μnおよびσn)。これらの値を考慮して、Z因子は:
と定義される。
用語「TAMRA」は、色素としての5−カルボキシ−テトラメチルローダミンN−スクシニミジルエステルを指す。色素代替物を探す際、以下の基準が重要である:1)励起および検出波長が、装置光源および検出系と適合する。2)プローブに関しては、消光剤がレポーターの発光波長で光を有効に吸収する。3)消光係数がより高ければ色素はより明るく、これは高感度検出に寄与する。
用語「TAMRA」は、色素としての5−カルボキシ−テトラメチルローダミンN−スクシニミジルエステルを指す。色素代替物を探す際、以下の基準が重要である:1)励起および検出波長が、装置光源および検出系と適合する。2)プローブに関しては、消光剤がレポーターの発光波長で光を有効に吸収する。3)消光係数がより高ければ色素はより明るく、これは高感度検出に寄与する。
用語「BHQ2」は、消光剤としての色素消光剤、ブラックホールクエンチャー−2を指す。消光剤:消光分子は、典型的には、単一分子プローブの3’に配置される。消光剤は蛍光(TAMRATM)または非蛍光分子(DABCYL、ブラックホールクエンチャー(登録商標)(BHQ(登録商標)))であってもよい。最適な性能のため、消光剤吸光度スペクトルは、可能な限りレポーター発光スペクトルに近くマッチしているべきである。一般的に用いられる消光剤はDABCYLおよびTAMRAである。一般的に用いられるダーク消光剤には、ブラックホールクエンチャーTM(BHQ)、アイオワブラックTMおよびブラックベリーTMクエンチャー650(BBQ−650)が含まれる。一般的に用いられる対は、色素6−FAM/JOE/TETと消光剤BHQ−1/TAMRA、色素TAMRAと消光剤BHQ−2である。
本発明者らは最初に、逆方向プライマーを1990上流に設計すると、染色体HBV DNA挿入物がqPCRアッセイにおいて増幅され、cccDNA定量化のためにウイルスDNAの抽出が必要となることを見出した。このことは、慣用的な逆方向プライマーを用いた際になぜウイルスDNAの抽出が必要であるかを説明する(Takkenbergら, Methods in Molecular Biology, vol. 903, DOI 10.1007/978−1−61779−937−2_7)。本発明者らは、驚くべきことに、逆方向プライマーを1990の下流に設計することによって、新規逆方向プライマーが、図において、順方向プライマーの左側に位置し(互いに反対方向を指し)、ゲノムHBV DNA挿入物がqPCRアッセイにおいて増幅されず、そして新規逆方向プライマーは、なおcccDNA上では、順方向プライマーの方を指し、cccDNAの環状の性質のために、生産的なqPCR反応を生じることを見出した。
図2は、抽出ウイルスゲノムDNAに対して慣用的cccDNAプライマーを用いた、および一工程qPCRアッセイを用いた、qPCRアッセイを示す。
図3は、HepDES19由来の抽出DNA、または抽出を伴わない直接溶解物(一工程qPCRアッセイ)を検出するための新規cccDNAプライマーの設計および試験を示す。
図4は、HepDES19由来の抽出DNA、または抽出を伴わない直接溶解物(一工程qPCRアッセイ)を検出するための新規cccDNAプローブの設計および試験を示す。
図5は、DNAアガロースゲルによる、pHBV1.3陽性対照プラスミド(pHBV1.3陽性対照プラスミドに関しては、J. Virol. 2007年9月; 81(18): 10072−80. Epub 2007年7月3日を参照されたい)および一工程qPCRアッセイ由来のPCR産物のサイズ比較を提供する。
図6は、qPCRアッセイによる、pHBV1.3陽性プラスミドおよびHBV DNA対照を用いた、cccDNAプライマーの特異性の確認を提供する。
図7は、プラスミドセーフATP依存性DNアーゼ(PSAD、非環状DNAを切断不能、Epicentre、米国ウィスコンシン州マディソンより購入、カタログ番号:E3101K)前処理を伴いまたは伴わず、その後、qPCRアッセイを行った、cccDNAプライマー対の特異性の確認を提供する。
図8は、qPCRアッセイによる、HepG2.2.15、HepDE19およびHepDES19細胞の上清を用いた、cccDNAプライマーの特異性の確認を提供する。
図9は、96ウェルマイクロタイタープレート(Corning 3599)中のcccDNAのレベルの試験を示す。
図10は、新規逆方向プライマーの設計およびHBV cccDNA検出に関する能力の比較を示す。
本発明は、リアルタイムPCRによる細胞溶解物からのHBV cccDNAの定量化のための新規ハイスループット法、ならびに感染肝細胞におけるcccDNAレベルの監視およびHBVに対する療法的効果の評価におけるその使用を提供する。
本発明の1つの態様は、(i)極3’端に、B型肝炎ウイルス(HBV)ゲノム(配列番号1)のヌクレオチド配列内の少なくとも16の連続配列を認識する配列を含む、逆方向プライマーである。
本発明のさらなる態様は、(ii)極3’端に、配列番号1の1996からヌクレオチド2278までのHBVゲノムのヌクレオチド配列内の少なくとも16の連続配列を認識する配列を含む、逆方向プライマーである。
本発明の別の態様は(iii)逆方向プライマーの長さが、16〜200ヌクレオチド、17〜35ヌクレオチド、18〜30ヌクレオチド、21〜30ヌクレオチド、24〜30ヌクレオチドまたは21〜24ヌクレオチドである、態様(i)または(ii)に提供する有意性を有する逆方向プライマーである。
本発明の別の態様は、(iv)好ましくは極3’端ヌクレオチドにおいて、5’から3’方向に、以下の配列から選択される配列を含む、逆方向プライマーである:
本発明の別の態様は、(v)逆方向プライマーおよび普遍的順方向プライマーからなるプライマー対であって、逆方向プライマーが本明細書において前に定義するような有意性を有し、普遍的順方向プライマーの長さが、16〜200ヌクレオチド、17〜35ヌクレオチド、18〜30ヌクレオチド、21〜30ヌクレオチド、24〜30ヌクレオチドまたは21〜24ヌクレオチドであり、そして普遍的順方向プライマーがHBVゲノムのDR2上流を認識する、前記プライマー対である。
本発明のさらなる態様は、(vi)逆方向プライマーおよび普遍的順方向プライマーからなるプライマー対であって、逆方向プライマーが本明細書において前に定義するような有意性を有し;普遍的順方向プライマーの長さが、16〜200ヌクレオチド、17〜35ヌクレオチド、18〜30ヌクレオチド、21〜30ヌクレオチド、24〜30ヌクレオチドまたは21〜24ヌクレオチドであり、そして普遍的順方向プライマーが、ヌクレオチド1528〜ヌクレオチド1548の配列番号5のヌクレオチド配列と、少なくとも80%の配列同一性を有する、前記プライマー対である。
本発明のさらなる態様は、(vii)逆方向プライマーおよび普遍的順方向プライマーからなるプライマー対であって、逆方向プライマーが本明細書において前に定義するような有意性を有し;普遍的順方向プライマーの長さが、16〜200ヌクレオチド、17〜35ヌクレオチド、18〜30ヌクレオチド、21〜30ヌクレオチド、24〜30ヌクレオチドまたは21〜24ヌクレオチドであり、そして普遍的順方向プライマーがHBVゲノムのDR2上流を認識し、そして普遍的順方向プライマーが、ヌクレオチド1528〜ヌクレオチド1548の配列番号5のヌクレオチド配列と、少なくとも80%の配列同一性を有する、前記プライマー対である。
本発明のさらなる態様は、(viii)逆方向プライマーおよび普遍的順方向プライマーからなるプライマー対であって、逆方向プライマーが上に定義するような有意性を有し;普遍的順方向プライマーの長さが、16〜200ヌクレオチド、17〜35ヌクレオチド、18〜30ヌクレオチド、21〜30ヌクレオチド、24〜30ヌクレオチドまたは21〜24ヌクレオチドであり、そして普遍的順方向プライマーが、5’から3’方向に、配列番号5を含む、前記プライマー対である。
本発明の別の態様は、(ix)プローブの長さが、16〜200ヌクレオチド、17〜35ヌクレオチド、18〜30ヌクレオチド、21〜30ヌクレオチド、24〜30ヌクレオチドまたは21〜24ヌクレオチドである、抽出DNAまたは一工程qPCRアッセイの溶解物を検出するためのプローブである。特に、本発明はまた、HepDES19由来の抽出DNAまたは一工程qPCRアッセイの溶解物を検出するためのプローブであって、プローブの長さが、16〜200ヌクレオチド、17〜35ヌクレオチド、18〜30ヌクレオチド、21〜30ヌクレオチド、24〜30ヌクレオチドまたは21〜24ヌクレオチドである、前記プローブにも関する。
本発明のさらなる態様は、(x)プローブが配列番号6、配列番号7、配列番号8および配列番号9より選択される配列の部分を含む配列と、少なくとも80%の配列同一性を有する、抽出DNAまたは一工程qPCRアッセイの溶解物を検出するためのプローブである。
本発明のさらなる態様は、(xi)配列番号6、配列番号7、配列番号8および配列番号9と、少なくとも80%の配列同一性を有し、そして他の技術的特徴が上に定義するような有用性を有するプローブである。
本発明のさらなる態様は、(xii)5’から3’方向に、配列番号6、配列番号7、配列番号8および配列番号9より選択される配列を有し、そして他の技術的特徴が上に定義するような有用性を有するプローブである。
本発明のさらなる態様は、(xiii)P0、P1、P2またはP3のプローブであって、
P0が5’−色素+配列番号6+消光剤−3’であり;
P1が5’−色素+配列番号7+消光剤−3’であり;
P2が5’−色素+配列番号8+消光剤−3’であり;
P3が5’−色素+配列番号9+消光剤−3’である
前記プローブである。
P0が5’−色素+配列番号6+消光剤−3’であり;
P1が5’−色素+配列番号7+消光剤−3’であり;
P2が5’−色素+配列番号8+消光剤−3’であり;
P3が5’−色素+配列番号9+消光剤−3’である
前記プローブである。
本発明のさらなる態様は、(xiv)配列番号6、配列番号7、配列番号8および配列番号9より選択される配列の部分を含む配列と、少なくとも80%の配列同一性を有し、色素が6−FAM、JOEまたはTETであり、一方、消光剤がBHQ−1またはTAMRAであるか、あるいは色素がTAMRAであり、一方、消光剤がBHQ−2であるプローブである。
本発明の別の態様は、(xv)逆方向プライマーが、R0、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11またはR4(30bp)であり;そしてプローブがP0、P1、P2またはP3である、逆方向プライマーおよびプローブで構成される組み合わせである。
本発明のさらなる態様は、(xvi)逆方向プライマーがR3、R4、R5またはR4(30bp)であり;そしてプローブがTAMRA+配列番号6+BHQ2またはTAMRA+配列番号8+BHQ2である、逆方向プライマーおよびプローブで構成される組み合わせである。
本発明の別の態様は、(xvii)テンプレートとしてHBVゲノム(配列番号1)を用い、そして逆方向プライマーおよび普遍的順方向プライマーのプライマー対、または逆方向プライマーおよびプローブで構成される組み合わせを用いることで構成され;逆方向プライマー、普遍的順方向プライマーおよびプローブが上に定義するような有意性を有する、PCRによってHBV cccDNAを検出するための方法である。
本発明の別の態様は、(xviii)テンプレートとしてHBVゲノム(配列番号1)を用い、そして逆方向プライマーおよび普遍的順方向プライマーのプライマー対、または逆方向プライマーおよびプローブで構成される組み合わせを用いる工程を含み;PCRがリアルタイムPCRであり;逆方向プライマー、普遍的順方向プライマーおよびプローブが上に定義するような有意性を有する、PCRによってHBV cccDNAを検出するための方法である。
本発明の別の態様は、(xix)テンプレートとしてHBVゲノム(配列番号1)を用い、そして逆方向プライマーおよび普遍的順方向プライマーのプライマー対、または逆方向プライマーおよびプローブで構成される組み合わせを用いることで構成され;方法がハイスループット法であり;逆方向プライマー、普遍的順方向プライマーおよびプローブが上に定義するような有意性を有する、PCRによってHBV cccDNAを検出するための方法である。
本発明の別の態様は、(xx)プレDNA抽出および精製を伴わないリアルタイムPCRによる一工程cccDNA検出法であって、以下の手順:
(1)試験しようとする化合物で細胞を処理し;
(2)処理後に細胞を採取し;
(3)溶解緩衝液を、採取した細胞に添加し;そして
(4)上に定義するような有用性を有するリアルタイムPCRを実行する
工程を含む、前記検出法である。
(1)試験しようとする化合物で細胞を処理し;
(2)処理後に細胞を採取し;
(3)溶解緩衝液を、採取した細胞に添加し;そして
(4)上に定義するような有用性を有するリアルタイムPCRを実行する
工程を含む、前記検出法である。
本発明のさらなる態様は、(xxi)態様(xx)記載のプレDNA抽出および精製を伴わないリアルタイムPCRによる一工程cccDNA検出法であって、溶解緩衝液が、商業的に入手可能な溶解緩衝液、例えばRIPA緩衝液:50mM Tris−HCl(pH7.5)、150mM NaCl、1%Triton X−100、0.5%デオキシコール酸ナトリウム、0.1%SDSおよび5mM EDTA;NP−40緩衝液:50mM Tris−HCl(pH8.0)、150mM NaCl、0.5%NP−40置換物および5mM EDTA;ならびにDSP緩衝液:40mM HEPES(pH7.5)、120mM NaCl、1%Triton X−100、1mM EDTA、10mM β−グリセロリン酸および50mM NaFであり;そして他の技術的特徴が上に定義するような有用性を有する、前記検出法に関する。
本発明のさらなる態様は、(xxii)態様(xx)記載のプレDNA抽出および精製を伴わないリアルタイムPCRによる一工程cccDNA検出法であって、溶解緩衝液がInvitrogenのものであり、そしてカタログ番号がAM8723であり;そして他の技術的特徴が上に定義するような有用性を有する、前記検出法に関する。
本発明のさらなる態様は、(xxiii)態様(xx)記載のプレDNA抽出および精製を伴わないリアルタイムPCRによる一工程cccDNA検出法であって、細胞をオーブン中、50℃〜75℃の間の温度で30分間〜2時間処理し、96ウェルプレート中のウェルあたり、20〜100μLの溶解緩衝液を添加し、そして次いで、0℃〜25℃の間の温度でリアルタイムPCRを行い;そして他の技術的特徴が上に定義するような有用性を有する、前記検出法に関する。
本発明の別の態様は、(xxiv)上に定義するような有用性を有する方法を用いる工程を含む、HBVに対する療法的効果を評価する際に用いる方法である。
本発明の別の態様は、(xxv)HBVに対する療法的効果を評価するための、逆方向プライマー、逆方向プライマーおよび普遍的順方向プライマーのプライマー対、または逆方向プライマーおよびプローブで構成される組み合わせの使用であって、逆方向プライマー、普遍的順方向プライマーおよびプローブが上に定義するような有用性を有する、前記使用である。
本発明の別の態様は、(xxv)HBVに対する療法的効果を評価するための、逆方向プライマー、逆方向プライマーおよび普遍的順方向プライマーのプライマー対、または逆方向プライマーおよびプローブで構成される組み合わせの使用であって、逆方向プライマー、普遍的順方向プライマーおよびプローブが上に定義するような有用性を有する、前記使用である。
本発明の別の態様は、(xxvi)HBVに対する療法的効果を評価するための検出剤調製における、逆方向プライマー、逆方向プライマーおよび普遍的順方向プライマーのプライマー対、または逆方向プライマーおよびプローブで構成される組み合わせの使用であって、逆方向プライマー、普遍的順方向プライマーおよびプローブが上に定義するような有用性を有する、前記使用である。
本発明の別の態様は、(xxvii)逆方向プライマー、逆方向プライマーおよび普遍的順方向プライマーのプライマー対、または逆方向プライマーおよびプローブで構成される組み合わせで構成される、HBVに対する療法的効果を評価するためのキットであって、逆方向プライマー、普遍的順方向プライマーおよびプローブが上に定義するような有用性を有する、前記キットである。
本発明の別の態様は、(xxviii)リアルタイムPCRによってHBV cccDNAを検出するための新規プライマーおよびプローブの原理であって;選択プライマーおよびqPCR設計の一般的な原理が図1に示されるとおりである、前記原理である。1.1xHBV組込みゲノムの戦略的位置にqPCRプライマーを注意深く設計することによって、PCR DNA供給源としてcccDNAを用いた際に特定のサイズのqPCR産物が生成可能となる一方、組込みゲノムHBV DNAをPCR供給源として用いた場合には、生産的PCR産物は生じないであろうことが可能となる。このプライマー対は、qPCR分析の供給源として、精製ウイルスDNA調製を用いることを必要としない、十分な特異性および選択性を提供する。
材料および方法
細胞培養
HepG2.2.15細胞を、10%(v/v)ウシ胎児血清(Clontech、Tet系認可FBS、カタログ番号631106)および300μg/mL G418(Invitrogen、カタログ番号10131−027)を補充したDMEM/F12培地(Invitrogen、カタログ番号10565−018)中、37℃で培養した。
細胞培養
HepG2.2.15細胞を、10%(v/v)ウシ胎児血清(Clontech、Tet系認可FBS、カタログ番号631106)および300μg/mL G418(Invitrogen、カタログ番号10131−027)を補充したDMEM/F12培地(Invitrogen、カタログ番号10565−018)中、37℃で培養した。
HepDE19およびHepDES19細胞を、10%(v/v)ウシ胎児血清、300μg/mL G418、および1μg/mLテトラサイクリン(Sigma、カタログ番号T0600000)を補充したDMEM/F12培地中、37℃で培養した。HBVウイルスDNAを得るため、HepDES19細胞を60mm培養プレート中、テトラサイクリンを含まず、10%(v/v)ウシ胎児血清、300μg/mL G418を補充したDMEM/F12培地中に植え付けた。
DNA抽出法(修飾Hirt DNA抽出、1998, biotechniques 24:760−762)
50μg/mL RNアーゼA(Sigma、カタログ番号R6148)を含むまたは含まない250μLの50mM Tris−HCL pH7.5および10mM EDTA中に細胞を再懸濁した。次いで、試料をボルテックスによって250μLの1.2%SDS(Sigma、カタログ番号74255)と混合し、そして次いで5分間放置した。350μLの3M CsCl、1M酢酸カリウムおよび0.67M酢酸を添加することによって、細胞破片および染色体DNAを沈殿させた。混合物を1.5mL試験管に移し、そして次いで、ピペットで直ちにしかし穏やかに試験管を混合し、そして氷上に15分間置いた。試料を14000g(rcf)、4℃で15分間遠心分離し、上清をカラム(QIAmp DNAミニキットのQiagenスピンカラム;Qiagen GmbH、ドイツ・ヒルデン、カタログ番号51306)上に装填した。14000g(rcf)、4℃で遠心分離することによって、カラムを750μLの洗浄緩衝液(80mM酢酸カリウム、10mM Tris、pH7.5、40μM EDTAおよび60%エタノールV/V)で洗浄した。次いで、14000g(rcf)、4℃で遠心分離することによって、50μLの水またはTE緩衝液(10mM Tris−HCl、pH8.0、1mM EDTA)でDNAを溶出した。
50μg/mL RNアーゼA(Sigma、カタログ番号R6148)を含むまたは含まない250μLの50mM Tris−HCL pH7.5および10mM EDTA中に細胞を再懸濁した。次いで、試料をボルテックスによって250μLの1.2%SDS(Sigma、カタログ番号74255)と混合し、そして次いで5分間放置した。350μLの3M CsCl、1M酢酸カリウムおよび0.67M酢酸を添加することによって、細胞破片および染色体DNAを沈殿させた。混合物を1.5mL試験管に移し、そして次いで、ピペットで直ちにしかし穏やかに試験管を混合し、そして氷上に15分間置いた。試料を14000g(rcf)、4℃で15分間遠心分離し、上清をカラム(QIAmp DNAミニキットのQiagenスピンカラム;Qiagen GmbH、ドイツ・ヒルデン、カタログ番号51306)上に装填した。14000g(rcf)、4℃で遠心分離することによって、カラムを750μLの洗浄緩衝液(80mM酢酸カリウム、10mM Tris、pH7.5、40μM EDTAおよび60%エタノールV/V)で洗浄した。次いで、14000g(rcf)、4℃で遠心分離することによって、50μLの水またはTE緩衝液(10mM Tris−HCl、pH8.0、1mM EDTA)でDNAを溶出した。
一工程qPCRアッセイ:
96ウェルプレート中のウェルあたり40,000細胞を37℃で6日間インキュベーションした後、細胞をCa2+およびMg2+不含リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、そして50μLの特別溶解緩衝液(Invitrogen、カタログ番号AM8723)によって溶解した。生じた試料をオーブン中、75℃で2時間インキュベーションした。リアルタイムPCRを行うまで、溶解物を4℃で維持した。qPCRを実行するため、2μLの溶解物を分析に用いた。異なる試料に関して、各反応を、各750nMプライマー、400nMプローブおよび10μLのLightCycler 480プローブマスター(RD04887301001−01、Roche)を含有する最終体積20μL中、LightCycler 480 II装置(Roche Diagnostic, INC)によって実行した。PCRサイクリングプログラムを以下のように実行した:50℃で2分間開始、次いで、95℃の温度で10分間変性、その後、95℃の温度で10秒間の変性、58℃の温度で5秒間のアニーリング、63℃10秒間、および72℃の温度で40秒間の伸長の45周期の増幅、そして次いで72℃10分間の最終伸長。PCRサイクリングプログラムの完了後、Cp値を得て、投入ターゲット核酸の定量化を決定した。
96ウェルプレート中のウェルあたり40,000細胞を37℃で6日間インキュベーションした後、細胞をCa2+およびMg2+不含リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、そして50μLの特別溶解緩衝液(Invitrogen、カタログ番号AM8723)によって溶解した。生じた試料をオーブン中、75℃で2時間インキュベーションした。リアルタイムPCRを行うまで、溶解物を4℃で維持した。qPCRを実行するため、2μLの溶解物を分析に用いた。異なる試料に関して、各反応を、各750nMプライマー、400nMプローブおよび10μLのLightCycler 480プローブマスター(RD04887301001−01、Roche)を含有する最終体積20μL中、LightCycler 480 II装置(Roche Diagnostic, INC)によって実行した。PCRサイクリングプログラムを以下のように実行した:50℃で2分間開始、次いで、95℃の温度で10分間変性、その後、95℃の温度で10秒間の変性、58℃の温度で5秒間のアニーリング、63℃10秒間、および72℃の温度で40秒間の伸長の45周期の増幅、そして次いで72℃10分間の最終伸長。PCRサイクリングプログラムの完了後、Cp値を得て、投入ターゲット核酸の定量化を決定した。
実施例
以下の実施例は、請求する発明を例示するよう提供されるが、限定するためではない。
本明細書に用いる略語は以下の通りである:
慣用群:慣用的逆方向プライマー(配列番号4)および慣用的プローブ(5’−TAMRA+配列番号2+BHQ2−3’)と対形成する慣用的順方向プライマー(配列番号3)を意味し、「慣用群」(Conventional Group)は、すべての図において「慣用的」(Conventional)と略される。
以下の実施例は、請求する発明を例示するよう提供されるが、限定するためではない。
本明細書に用いる略語は以下の通りである:
慣用群:慣用的逆方向プライマー(配列番号4)および慣用的プローブ(5’−TAMRA+配列番号2+BHQ2−3’)と対形成する慣用的順方向プライマー(配列番号3)を意味し、「慣用群」(Conventional Group)は、すべての図において「慣用的」(Conventional)と略される。
HBV DNA群:HBV−R(配列番号26)およびHBV DNAプローブ(5’−TAMRA+配列番号27+BHQ2−3’)と対形成するHBV−F(配列番号25)を意味する。
実施例1:抽出ウイルスゲノムDNAのための慣用的cccDNAプライマー対を用いた、および一工程qPCRアッセイを用いた、qPCRアッセイの比較
細胞材料の供給源は、cccDNA誘導を伴わない(1μg/mLテトラサイクリンの存在によるバックグラウンド)または誘導を伴う(テトラサイクリンが存在しないことによるcccDNA発現)、培養6日後のHepDES19由来であった。慣用群を試験した。DNA抽出法および一工程qPCRアッセイを上述の方法にしたがって行った。
細胞材料の供給源は、cccDNA誘導を伴わない(1μg/mLテトラサイクリンの存在によるバックグラウンド)または誘導を伴う(テトラサイクリンが存在しないことによるcccDNA発現)、培養6日後のHepDES19由来であった。慣用群を試験した。DNA抽出法および一工程qPCRアッセイを上述の方法にしたがって行った。
図2に示す結果は、Tetオン(バックグラウンド)条件由来のDNAおよびTetオフ(cccDNA発現)条件由来のDNAの間の範囲を示した。抽出DNA法に関して、慣用群は、qPCRアッセイにおいて11.3倍の相違を示した。一工程qPCRアッセイに関しては、1.3倍しか相違がなかった。抽出DNA法および一工程qPCRアッセイの結果を比較することによって、慣用群は、一工程cccDNA定量化アッセイを確立するために使用することができなかった。
実施例2:HepDES19由来の抽出DNAまたは抽出を伴わない直接溶解物(一工程qPCRアッセイ)を検出するための新規cccDNAプライマーの試験
細胞材料の供給源は、cccDNA誘導を伴わない(1μg/mLテトラサイクリンの存在によるバックグラウンド)または誘導を伴う(テトラサイクリンが存在しないことによるcccDNA発現)、培養6日後のHepDES19由来であった。本実施例では、以下の材料を用いた:慣用群、PAIR0−P0、PAIR1−P0、PAIR2−P0、PAIR3−P0、およびPAIR4−P0。P0中で用いた色素はTAMRAであり、そしてP0中で用いた消光剤はBHQ2であった。一工程qPCRアッセイを、上述のような以下の方法で行った。
細胞材料の供給源は、cccDNA誘導を伴わない(1μg/mLテトラサイクリンの存在によるバックグラウンド)または誘導を伴う(テトラサイクリンが存在しないことによるcccDNA発現)、培養6日後のHepDES19由来であった。本実施例では、以下の材料を用いた:慣用群、PAIR0−P0、PAIR1−P0、PAIR2−P0、PAIR3−P0、およびPAIR4−P0。P0中で用いた色素はTAMRAであり、そしてP0中で用いた消光剤はBHQ2であった。一工程qPCRアッセイを、上述のような以下の方法で行った。
図3aに示す結果は、HepDES19細胞におけるバックグラウンド由来の抽出DNAおよびcccDNA発現由来の抽出DNAの間の範囲が、PAIR0−P0、PAIR1−P0、PAIR2−P0、PAIR3−P0、およびPAIR4−P0において、慣用群における11.3倍から、50〜80倍に改善されたことを示した。これは、新規プライマー対およびプローブ、すなわちPAIR0−P0、PAIR1−P0、PAIR2−P0、PAIR3−P0、およびPAIR4−P0が、低いバックグラウンドで、cccDNAの検出に関してより優れた感度を有することを示した。図3bに示す結果は、一工程qPCRアッセイに関して、バックグラウンドおよびcccDNA発現の間にほぼ6.8倍の相違があることを示した。慣用群とは異なり、新規cccDNAプライマー対およびプローブ、すなわちPAIR0−P0、PAIR1−P0、PAIR2−P0、PAIR3−P0、およびPAIR4−P0は、HepDES19細胞中のHBVゲノムDNAを検出することは不能であり、そして一工程qPCRアッセイに有用であることに注目することは価値あることであった。これは、新規プライマー対およびプローブと関連する改善を説明した。
実施例3:HepDES19由来の抽出DNAまたは抽出を伴わない一工程qPCRアッセイの直接溶解物(一工程qPCRアッセイ)を検出するための新規cccDNAプローブの試験
細胞材料の供給源は、cccDNA誘導を伴わない(1μg/mLテトラサイクリンの存在によるバックグラウンド)または誘導を伴う(テトラサイクリンが存在しないことによるcccDNA発現)、培養6日後のHepDES19由来であった。
細胞材料の供給源は、cccDNA誘導を伴わない(1μg/mLテトラサイクリンの存在によるバックグラウンド)または誘導を伴う(テトラサイクリンが存在しないことによるcccDNA発現)、培養6日後のHepDES19由来であった。
DNA抽出研究に関して、用いたプローブはP0、P1、P2およびP3であり、各プローブにおいて、用いた色素はTAMRAであり、そして用いた消光剤はBHQ2であった。すべての反応に用いたプライマーは、PAIR4であった。
一工程qPCRアッセイに関して、用いたプローブはP2であり、そしてP2で用いた色素はTAMRAであり、そしてP2で用いた消光剤はBHQ2であった。用いたプライマーは、それぞれ、PAIR1およびPAIR4であった。慣用群もまた、対照として用いた。
図4aに示す結果は、新規プローブの設計、および抽出されたウイルスDNAにおいてHBV cccDNAを検出する能力の比較を示した。qPCRアッセイにおいて、PAIR4に固定し、P0およびP2は優れた効率を示し、そしてバックグラウンドおよびcccDNA発現の間の相違はほぼ90倍であった。一工程qPCRアッセイに関しては、図4bに示す結果は、PAIR1−P2およびPAIR4−P2が8倍より多い相違を有する一方、慣用群に関しては1.3倍の相違しかないことを示した。この結果から、新規プライマーおよびプローブ対は、ハイスループットアッセイの開発に有用であると結論づけられた。
実施例4:DNAアガロースゲルによる、pHBV1.3陽性対照プラスミドおよび一工程qPCRアッセイ由来のPCR産物のサイズ比較
細胞材料の供給源は、誘導を伴う(テトラサイクリンを含まないcccDNA発現)、培養6日後のHepDES19由来であった。
細胞材料の供給源は、誘導を伴う(テトラサイクリンを含まないcccDNA発現)、培養6日後のHepDES19由来であった。
PAIR1−P2、PAIR4−P2および慣用群を、DNA抽出および一工程qPCRアッセイで用いた。HBV DNA群および慣用群を対照として用いた。用いたP2中の色素はTAMRAであり、そして用いたP2中の消光剤はBHQ2であった。
図5の左部分は、テンプレートとしてpHBV1.3を用いたqPCR由来の反応産物の1%アガロースゲル電気泳動結果であった。図5の右部分は、同じプライマーおよびプローブ表示を用いた一工程qPCRアッセイの結果を提供した。
図5に示す結果は、pHBV1.3陽性対照プラスミド由来および一工程qPCRアッセイ由来のPCR産物のサイズが同じであることを示し、これは、一工程由来のPCR産物が正しい産物であることと一致した。PAIR4−P2由来の一工程qPCR産物は、慣用的プライマー対由来のPCR産物よりもより特異的なバンドを有した。
実施例5:cccDNAプライマーおよびプローブの特異性の確認
細胞材料の供給源は、誘導を伴う(テトラサイクリンを含まないcccDNA発現)、培養6日後のHepDES19由来であった。pHBV1.3プラスミドを陽性対照として用い、そしてHBV DNAをDNA抽出法によって抽出した。HBV DNA群、PAIR1−P2およびPAIR4−P2をこの研究で用いた。P2に関して、用いた色素はTAMRAであり、そして用いた消光剤はBHQ2であった。陽性対照pHBV1.3プラスミドを用いて、多様なDNAプライマー対のレベルを較正した。較正後、プライマー対は、等量のPCR産物(白いバー)を生じた。しかし、同じ量のプライマー対をHepDES19抽出DNAに適用した際、qPCR産物の異なるCp値が検出された。図6に示すように、HepDES19細胞において、HBV DNA群を用いた実験で検出されるHBV DNAのレベルは、PAIR1−P2およびPAIR4−P2を用いた実験において検出されるcccDNAレベルよりも20倍高かった。
細胞材料の供給源は、誘導を伴う(テトラサイクリンを含まないcccDNA発現)、培養6日後のHepDES19由来であった。pHBV1.3プラスミドを陽性対照として用い、そしてHBV DNAをDNA抽出法によって抽出した。HBV DNA群、PAIR1−P2およびPAIR4−P2をこの研究で用いた。P2に関して、用いた色素はTAMRAであり、そして用いた消光剤はBHQ2であった。陽性対照pHBV1.3プラスミドを用いて、多様なDNAプライマー対のレベルを較正した。較正後、プライマー対は、等量のPCR産物(白いバー)を生じた。しかし、同じ量のプライマー対をHepDES19抽出DNAに適用した際、qPCR産物の異なるCp値が検出された。図6に示すように、HepDES19細胞において、HBV DNA群を用いた実験で検出されるHBV DNAのレベルは、PAIR1−P2およびPAIR4−P2を用いた実験において検出されるcccDNAレベルよりも20倍高かった。
実施例6:cccDNAプライマー対の特異性の確認
DNA抽出法の手順にしたがって、本研究において、HBV DNA群、PAIR1−P2およびPAIR4−P2を用いた。反応混合物は、6.8μLの抽出DNA、4U PSAD、1mM ATPおよび2μLの反応緩衝液と、最終体積20μLまでの水を含有した。消化を30℃で16時間行った。細胞材料の供給源は、cccDNAの誘導を伴わない(1μg/mLテトラサイクリンを含むバックグラウンド)または誘導を伴う(テトラサイクリンを含まないcccDNA発現)、培養6日後のHepDES19由来であった。供給源DNAは、HepDES19細胞由来の抽出DNAであった。PSADは、二本鎖弛緩環状DNA(rcDNA)を含む非環状HBV DNAを切断可能である。結果を図7に示した。一般的HBV DNA群を用いて、PSAD処理を伴う、および伴わないDNA試料間で、2.4倍の相違があった。しかし、PAIR1−P2およびPAIR4−P2を用いると相違はなく、PAIR1−P2およびPAIR4−P2のqPCRテンプレートは、DNAの環状供給源(cccDNA)であることが示された。
DNA抽出法の手順にしたがって、本研究において、HBV DNA群、PAIR1−P2およびPAIR4−P2を用いた。反応混合物は、6.8μLの抽出DNA、4U PSAD、1mM ATPおよび2μLの反応緩衝液と、最終体積20μLまでの水を含有した。消化を30℃で16時間行った。細胞材料の供給源は、cccDNAの誘導を伴わない(1μg/mLテトラサイクリンを含むバックグラウンド)または誘導を伴う(テトラサイクリンを含まないcccDNA発現)、培養6日後のHepDES19由来であった。供給源DNAは、HepDES19細胞由来の抽出DNAであった。PSADは、二本鎖弛緩環状DNA(rcDNA)を含む非環状HBV DNAを切断可能である。結果を図7に示した。一般的HBV DNA群を用いて、PSAD処理を伴う、および伴わないDNA試料間で、2.4倍の相違があった。しかし、PAIR1−P2およびPAIR4−P2を用いると相違はなく、PAIR1−P2およびPAIR4−P2のqPCRテンプレートは、DNAの環状供給源(cccDNA)であることが示された。
実施例7:qPCRアッセイによる、HepG2.2.15、HepDE19およびHepDES19細胞の上清を用いた、cccDNAプライマーの特異性の確認
本実施例ではPAIR4−P2を用いた。陽性対照プラスミドpHBV1.3を用いて、HBV DNAプライマーおよびcccDNAプライマーの効率を較正した。HepG2.2.15細胞を、10%(v/v)ウシ胎児血清および300μg/mL G418を補充したDMEM/F12培地中、37℃で培養した。HepDE19およびHepDES19細胞を、10%(v/v)ウシ胎児血清、300μg/mL G418、および1μg/mLテトラサイクリンを補充したDMEM/F12培地中、37℃で培養した。cccDNAは、HepG2.2.15細胞(HBVウイルスを連続して発現する安定細胞株)の上清中では検出されなかった。HepDE19細胞(テトラサイクリンをオフにした6日後)およびHepDES19(テトラサイクリンをオフにした6日後)細胞の上清において、cccDNAはバックグラウンドレベルでしか検出されなかったが、rcDNAはこれらの細胞株において検出された。細胞を6日間インキュベーションした後、qPCRを実行するため、2μLの上清を分析に用いた。異なる試料に関して、各反応を、各750nMプライマー、400nMプローブおよび10μLのLightCycler 480プローブマスター(RD04887301001−01、Roche)を含有する最終体積20μL中、LightCycler 480 II装置(Roche)を用いることによって実行した。PCRサイクリングプログラムを以下のように実行した:50℃で2分間開始、次いで、95℃の温度で10分間変性、その後、95℃の温度で10秒間の変性、58℃の温度で5秒間のアニーリング、63℃10秒間、および72℃の温度で40秒間の伸長の45周期の増幅、そして次いで72℃の温度で10分間の最終伸長。結果を図8に示す。
本実施例ではPAIR4−P2を用いた。陽性対照プラスミドpHBV1.3を用いて、HBV DNAプライマーおよびcccDNAプライマーの効率を較正した。HepG2.2.15細胞を、10%(v/v)ウシ胎児血清および300μg/mL G418を補充したDMEM/F12培地中、37℃で培養した。HepDE19およびHepDES19細胞を、10%(v/v)ウシ胎児血清、300μg/mL G418、および1μg/mLテトラサイクリンを補充したDMEM/F12培地中、37℃で培養した。cccDNAは、HepG2.2.15細胞(HBVウイルスを連続して発現する安定細胞株)の上清中では検出されなかった。HepDE19細胞(テトラサイクリンをオフにした6日後)およびHepDES19(テトラサイクリンをオフにした6日後)細胞の上清において、cccDNAはバックグラウンドレベルでしか検出されなかったが、rcDNAはこれらの細胞株において検出された。細胞を6日間インキュベーションした後、qPCRを実行するため、2μLの上清を分析に用いた。異なる試料に関して、各反応を、各750nMプライマー、400nMプローブおよび10μLのLightCycler 480プローブマスター(RD04887301001−01、Roche)を含有する最終体積20μL中、LightCycler 480 II装置(Roche)を用いることによって実行した。PCRサイクリングプログラムを以下のように実行した:50℃で2分間開始、次いで、95℃の温度で10分間変性、その後、95℃の温度で10秒間の変性、58℃の温度で5秒間のアニーリング、63℃10秒間、および72℃の温度で40秒間の伸長の45周期の増幅、そして次いで72℃の温度で10分間の最終伸長。結果を図8に示す。
実施例8:リアルタイムPCRによってHBV cccDNAを検出するためのアッセイ開発
一工程qPCRアッセイにおいて、PAIR4−P2をこの実施例で用いた。ウェルあたり40,000細胞を植え付けた。細胞材料の供給源は、cccDNA誘導を伴わない(1μg/mLテトラサイクリンを含むバックグラウンド)または誘導を伴う(テトラサイクリンを含まないcccDNA発現)、培養6日後のHepDES19由来であった。ウェル1からウェル48の試料はcccDNA発現であり、そして49〜96の試料はバックグラウンドであった。
一工程qPCRアッセイにおいて、PAIR4−P2をこの実施例で用いた。ウェルあたり40,000細胞を植え付けた。細胞材料の供給源は、cccDNA誘導を伴わない(1μg/mLテトラサイクリンを含むバックグラウンド)または誘導を伴う(テトラサイクリンを含まないcccDNA発現)、培養6日後のHepDES19由来であった。ウェル1からウェル48の試料はcccDNA発現であり、そして49〜96の試料はバックグラウンドであった。
図9に示す結果は、最適化条件を示した。細胞を含む溶解の最適なインキュベーションは、約30分から1時間であった。96マイクロタイタープレート上のcccDNA発現に対する細胞数は、ウェルあたり40,000細胞であった。Cp差は、Tetオン(cccDNA発現)に比較した際、Tetオフ(バックグラウンド)後、約3.0周期であり、そしてZ因子は約0.53であり、これは、ハイスループットスクリーニング、または感染生存細胞において、cccDNAの集積をブロックする化合物をスクリーニングするためのハイスループットスクリーニングに適していた。
実施例9:一工程qPCRアッセイによるHBV cccDNAの検出のための新規逆方向プライマーの能力の比較
一工程qPCRアッセイによって、96ウェルマイクロタイタープレート(Corning3599)において、cccDNAのレベルを試験した。すべての場合で、新規順方向cccDNAプライマー(配列番号5)およびP2に固定し、ここで、用いるP2中の色素はTAMRAであり、そして用いるP2中の消光剤はBHQ2であった。試験した複数の逆方向プライマーもまたあり、ここで、逆方向プライマーは、R5(配列番号15);R6(配列番号16);R7(配列番号17);R8(配列番号18);R9(配列番号19);R10(配列番号20);R11(配列番号21);またはR4(30bp)(配列番号24)である。ウェルあたり40,000細胞を植え付けた。細胞材料の供給源は、cccDNA誘導を伴わない(1μg/mLを含むバックグラウンド)または誘導を伴う(テトラサイクリンを含まないcccDNA発現)、培養6日後のHepDES19由来であった。ウェル1からウェル48の試料はcccDNA発現であり、そして49〜96の試料はバックグラウンドであった。このアッセイにおいて、PAIR4−P2を用いた。
一工程qPCRアッセイによって、96ウェルマイクロタイタープレート(Corning3599)において、cccDNAのレベルを試験した。すべての場合で、新規順方向cccDNAプライマー(配列番号5)およびP2に固定し、ここで、用いるP2中の色素はTAMRAであり、そして用いるP2中の消光剤はBHQ2であった。試験した複数の逆方向プライマーもまたあり、ここで、逆方向プライマーは、R5(配列番号15);R6(配列番号16);R7(配列番号17);R8(配列番号18);R9(配列番号19);R10(配列番号20);R11(配列番号21);またはR4(30bp)(配列番号24)である。ウェルあたり40,000細胞を植え付けた。細胞材料の供給源は、cccDNA誘導を伴わない(1μg/mLを含むバックグラウンド)または誘導を伴う(テトラサイクリンを含まないcccDNA発現)、培養6日後のHepDES19由来であった。ウェル1からウェル48の試料はcccDNA発現であり、そして49〜96の試料はバックグラウンドであった。このアッセイにおいて、PAIR4−P2を用いた。
結果を図10に示した。逆方向プライマーR5〜R10は、優れた効率を示し、そしてこれらは、バックグラウンドおよびcccDNA発現間で、ほぼ8倍の相違を有した。R4(30bp)(配列番号24)もまた試験した。図10の結果は、R4(30bp)(配列番号24)がR4(配列番号14)に比較して、同様に有効であることを示した。
本明細書記載の実施例および態様は、例示目的のみのためであり、そしてこれを考慮して、多様な修飾または変更が当業者には示唆されることが理解される。
非公式配列表
非公式配列表
Claims (25)
- 極3’端に、B型肝炎ウイルス(HBV)ゲノム(配列番号1)のヌクレオチド配列内の少なくとも16の連続配列を認識する配列を含む、逆方向プライマー。
- 極3’端に、配列番号1の1996からヌクレオチド2278までのHBVゲノムのヌクレオチド配列内の少なくとも16の連続配列を認識する配列を含む、請求項1記載の逆方向プライマー。
- 逆方向プライマーの長さが、16〜200ヌクレオチド、17〜35ヌクレオチド、18〜30ヌクレオチド、21〜30ヌクレオチド、24〜30ヌクレオチドまたは21〜24ヌクレオチドである、請求項1または2記載の逆方向プライマー。
- 逆方向プライマーが、5’から3’方向に:
- 請求項1〜4のいずれか一項の逆方向プライマーおよび普遍的順方向プライマーからなるプライマー対であって、普遍的順方向プライマーの長さが、16〜200ヌクレオチド、17〜35ヌクレオチド、18〜30ヌクレオチド、21〜30ヌクレオチド、24〜30ヌクレオチドまたは21〜24ヌクレオチドであり、そして普遍的順方向プライマーがHBVゲノムのDR2上流を認識する、前記プライマー対。
- 普遍的順方向プライマーが、ヌクレオチド1528〜ヌクレオチド1548の配列番号5のヌクレオチド配列と、少なくとも80%の配列同一性を有する、請求項5記載のプライマー対。
- 普遍的順方向プライマーが、5’から3’方向に、配列番号5を含む、請求項5記載のプライマー対。
- プローブの長さが、16〜200ヌクレオチド、17〜35ヌクレオチド、18〜30ヌクレオチド、21〜30ヌクレオチド、24〜30ヌクレオチドまたは21〜24ヌクレオチドである、抽出DNAまたは一工程qPCRアッセイの溶解物を検出するためのプローブ。
- 配列番号6、配列番号7、配列番号8および配列番号9より選択される配列の部分を含む配列と、少なくとも80%の配列同一性を有する、請求項8記載のプローブ。
- 配列番号6、配列番号7、配列番号8および配列番号9と少なくとも80%の配列同一性を有する、請求項8記載のプローブ。
- 5’から3’方向に、配列番号6、配列番号7、配列番号8および配列番号9より選択される配列を有する、請求項8記載のプローブ。
- プローブが、P0、P1、P2またはP3であって、
P0が5’−色素+配列番号6+消光剤−3’であり;
P1が5’−色素+配列番号7+消光剤−3’であり;
P2が5’−色素+配列番号8+消光剤−3’であり;
P3が5’−色素+配列番号9+消光剤−3’である
請求項8〜11のいずれか一項記載のプローブ。 - 逆方向プライマーが、R0、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11またはR4(30bp)であり、そしてプローブがP0、P1、P2またはP3である、逆方向プライマーおよびプローブで構成される組み合わせ。
- 逆方向プライマーがR3、R4、R5またはR4(30bp)であり、そしてプローブがTAMRA+配列番号6+BHQ2またはTAMRA+配列番号8+BHQ2である、請求項13記載の組み合わせ。
- テンプレートとしてHBVゲノム(配列番号1)を用いるか、請求項5〜7のいずれか一項のプライマー対を用いるか、あるいは請求項13または14の組み合わせを用いることで構成される、PCRによってHBV cccDNAを検出するための方法。
- PCRがリアルタイムPCRである、請求項15記載の方法。
- 方法がハイスループット法である、請求項15または16記載の方法。
- プレDNA抽出および精製を伴わないリアルタイムPCRによる一工程cccDNA検出法であって、以下の手順:
(1)試験しようとする化合物で細胞を処理し;
(2)処理後に細胞を採取し;
(3)溶解緩衝液を、採取した細胞に添加し;そして
(4)請求項15〜17のいずれか一項のリアルタイムPCRを実行する
工程を含む、前記検出法。 - 溶解緩衝液がInvitrogenのものであり、そしてカタログ番号がAM8723である、請求項18記載の方法。
- 細胞をオーブン中、50℃〜75℃の間の温度で30分間〜2時間処理し、96ウェルプレート中のウェルあたり、20〜100μLの溶解緩衝液を添加し、そして次いで、0℃〜25℃の温度でリアルタイムPCRを行う、請求項18または19記載の方法。
- 請求項15〜20のいずれか一項の方法を用いる工程を含む、HBVに対する療法的効果を評価する際に用いる方法。
- HBVに対する療法的効果を評価するための、請求項1〜4のいずれか一項の逆方向プライマー、請求項5〜7のいずれか一項のプライマー対、あるいは請求項13または14の組み合わせの使用。
- HBVに対する療法的効果を評価するための検出剤の調製における、請求項1〜4のいずれか一項の逆方向プライマー、請求項5〜7のいずれか一項のプライマー対、あるいは請求項13または14の組み合わせの使用。
- 請求項1〜4のいずれか一項の逆方向プライマー、請求項5〜7のプライマー対、あるいは請求項13または14の組み合わせで構成される、HBVに対する療法的効果を評価するためのキット。
- 本明細書で先に記述した発明。
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