JP2018503620A - 組換えタンパク質を精製する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2014年12月22日出願の米国仮特許出願第62/095,281号の優先権を主張するものであり、この出願の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
例えば、陰イオン交換クロマトグラフィーを通して)組換えタンパク質を最終精製すること、及びウイルスろ過を実施することを含む。
は複数の単位操作)。いくつかの実施形態において、工程(d)は、組換えタンパク質をデプスフィルターを通して流す工程(工程(c))の直後に、ウイルスろ過を実施することを含む。いくつかの実施形態において、工程(d)は、組換えタンパク質を精製する単位操作を実施すること及びウイルスろ過を実施することを含む。いくつかの実施形態において、工程(d)は、組換えタンパク質を最終精製する単位操作を実施すること及びウイルスろ過を実施することを含む。いくつかの実施形態において、工程(d)は、(例えば、陽イオン交換クロマトグラフィーを通して)組換えタンパク質を精製する単位操作を実施すること、(例えば、陰イオン交換クロマトグラフィーを通して)組換えタンパク質を最終精製すること、及びウイルスろ過を実施することを含む。いくつかの実施形態において、工程(d)は、限外ろ過/ダイアフィルトレーションの単位操作を実施すること、(例えば、陽イオン交換クロマトグラフィーを通して)組換えタンパク質を精製すること、(例えば、陰イオン交換クロマトグラフィーを通して)組換えタンパク質を最終精製すること、及びウイルスろ過を実施することを含む。
本明細書に提供される方法によって生産されうる組換えタンパク質の非限定的な例は、免疫グロブリン(軽鎖及び重鎖免疫グロブリンを含む)、抗体(例えば、エクリズマブ又はAlexion1210を含む)、又は抗体断片(例えば、本明細書に記載される任意の抗体断片)、酵素、タンパク質(例えば、ヒトエリスロポエチン、腫瘍壊死因子(TNF)、又はインターフェロンアルファ又はベータ)、或いは免疫原性若しくは抗原性のタンパク質又はタンパク質断片(例えば、ワクチンに使用するためのタンパク質)を含む。組換えタンパク質は、少なくとも1つの多機能性の組換えタンパク質スカフォールド(例えば、米国特許出願公開第2012/0164066号に記載されている組換え抗原結合性タンパク質)を含む操作された抗原結合性のポリペプチドであってもよい。抗体である組換えタンパク質の非限定的な例には、エクリズマブ、Alexion1210、パニツムマブ(panitumumab)、オマリズマブ、アバゴボマブ(abagovomab)、アブシキマブ(abciximab)、アクトクスマブ(actoxumab)、アダリムマブ、アデカツムマブ(adecatumumab)、アフェリモマブ、アフツズマブ(afutuzumab)、アラシズマブ(alacizumab)、アラシズマブ(alacizumab)、アレムツズマブ、アリロクマブ(alirocumab)、アルツモマブ(altumomab)、アマツキシマブ(amatuximab)、アマツキシマブ(amatuximab)、アナツモマブ(anatumomab)、アンルキンズマブ(anrukinzumab)、アポリズマブ(apolizumab)、アルシツモマブ(arcitumomab)、アチヌマブ(atinumab)、トシリズマブ(tocilizumab)、バシリジマブ(basilizimab)、ベクツモマブ(bectumomab)、ベリムマブ、ベバシズマブ、ベシレソマブ(besilesomab)、ベズロトクスマブ、ビシロマブ(biciromab)、カナキヌマブ、セルトリズマブ、セツキシマブ(cetuximab)、シクスツムマブ(cixutumumab)、ダクリズマブ、デノスマブ、デンスマブ(densumab)、エドレコロマブ(edrecolomab)、エファリズマブ、エフングマブ(efungumab)、エプラツズマブ、エルツマキソマブ(ertumaxomab)、エタラシズマブ(etaracizumab)、フィギツムマブ(figitumumab)、ゴリムマブ、イブリツモマブ チウキセタン、イゴボマブ(igovomab)、イムガツズマブ(imgatuzumab)、インフリキシマブ、イノリモマブ(inolimomab)、イノツズマブ(inotuzumab)、ラベツズマブ(labetuzumab)、レブリキズマブ、モキセツモマブ(moxetumomab)、ナタリズマブ、オビヌツズマブ、オレゴボマブ(oregovomab)、パリビズマブ、パニツムマブ(panitumumab)、ペルツズマブ(pertuzumab)、ラニビズマブ、リツキシマブ、トシリズマブ(tocilizumab)、トシツモマブ(tositumomab)、トラロキヌマブ、ツコツズマブ(tucotuzumab)、トラスツズマブ、ベルツズマブ(veltuzumab)、ザルツムマブ(zalutumumab)、及びザツキシマブ(zatuximab)が含まれる。本明細書に記載される方法によって生産されうる組換え抗体の更なる例は、当技術分野において公知である。
組換えタンパク質をコードする核酸を含む細胞を使用して、組換えタンパク質(例えば、分泌組換えタンパク質)を生産することができる。いくつかの実施例において、組換えタンパク質をコードする核酸は、細胞のゲノムに安定に組み込まれる。組換えタンパク質を生産するため使用される細胞は、細菌(例えば、グラム陰性菌)、酵母(例えば、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)、ピキアパストリス(Pichia pastoris)、ハンゼヌラポリモルファ(Hansenula polymorpha)、クリベロマイセスラクティス(Kluyveromyces lactis)、***酵母(Schizosaccharomyces pombe)、ヤロウイアリポリティカ(Yarrowia lipolytica)、又はアークスラアデニニボランス(Arxula adeninivorans))、又は哺乳動物細胞であってもよい。
本明細書に記載される方法における培養する工程は、流加培養を含んでいてもよい。当技術分野において公知のものとして、流加培養は、細胞培養から最初の液体培養培地を実質的に又は有意に除去することなく、最初の液体培養培地を含む、初期の細胞培養への供給培養培地の漸増的(周期的)又は連続的な添加を含む。流加培養での細胞培養は、バイオリアクター(例えば、生産バイオリアクター、例えば、10,000Lの生産バイオリアクター)に配置されてもよい。いくつかの例において、供給培養培地は、最初の液体培養培地と同じである。供給培養培地は、液体形態又は乾燥粉末のいずれであってもよい。いくつかの例において、供給培養培地は、最初の液体培養培地の濃縮された形態である及び/又は乾燥粉末として添加される。いくつかの実施形態において、第1の液体供給培養培地及び異なる第2の液体供給培養培地の双方が、第1の液体培養培地に添加される(例えば、連続的に添加される)。いくつかの例において、第1の液体供給培養培地の添加及び第2の液体供給培養培地の培養への添加は、およそ同じ時間に開始される。いくつかの例において、全培養期間にわたって培養に添加される第1の液体供給培養培地及び第2の液体供給培養培地の総容量は、およそ同じである。
本明細書に記載される方法における培養する工程は、灌流培養であってもよい。当技術分野において公知のものとして、灌流培養は、バイオリアクター(例えば、生産バイオリアクター)から第1の容量の第1の液体培養培地を除去すること、及び生産バイオリアクターに第2の容量の第2の液体培養培地を添加することを含み、第1の容量及び第2の容量は典型的にはおよそ等しい(が、そうである必要はない)。哺乳動物細胞は、何らかの細胞保持装置又は細胞設置(cell settling)などの当技術分野において公知の技術によってバイオリアクター中に保持される。灌流培養における培養培地の除去及び添加は、同時に又は逐次的に、又は何らかの2つの組合せで実施することができる。さらに、除去及び添加は、時間増加に伴って(例えば、24時間の時間増加に伴って)、バイオリアクターの容量の0.1%から800%の間、1%と700%の間、1%と600%の間、1%と500%の間、1%と400%の間、1%と350%の間、1%と300%の間、1%と250%の間、1%と100%の間、100%と200%の間、5%と150%の間、10%と50%の間、15%と40%の間、8%と80%の間、又は4%と30%の間の量を除去及び交換する速度で連続的に実施することができる。
組換えタンパク質を含む溶液(例えば、組換えタンパク質を含み、細胞を実質的に含まない液体培養培地)は、任意の供給源に由来するものでもよい。例えば、液体培養培地は、組換え細胞培養(例えば、組換え細菌、酵母、又は哺乳動物細胞培養)から得られてもよい。液体培養培地は、哺乳動物細胞流加培養(例えば、組換えタンパク質を分泌する哺乳動物細胞の培養物を含有する流加式バイオリアクター)又は灌流細胞哺乳動物細胞培養(例えば、組換えタンパク質を分泌する哺乳動物細胞の培養物を含有する灌流バイオリアクター)から得られてもよい。液体培養培地は、組換えタンパク質を分泌する細菌、酵母、又は哺乳動物細胞の培養からの清澄化された液体培養培地であってもよい。
本明細書に提供される方法は、組換えタンパク質(例えば、分泌組換えタンパク質を含む清澄化された液体培養培地又は緩衝化された溶液で希釈されている組換えタンパク質を含む清澄化された液体培養培地)を含む溶液から組換えタンパク質を捕獲する工程を含む。
方法は、組換えタンパク質をデプスフィルターを通して流して、精製された組換えタンパク質を含み、可溶性タンパク質凝集物を実質的に含まないろ過物を提供する工程を含む。本明細書に記載される深層ろ過のための任意の例示的なデプスフィルター又は方法を使用して、組換えタンパク質をデプスフィルターを通して流すことができる。
m2/時間から約340L/m2/時間の間、約260L/m2/時間から約320L/m2/時間の間、約260L/m2/時間から約300L/m2/時間の間、約260L/m2/時間から約280L/m2/時間の間、約280L/m2/時間から約400L/m2/時間の間、約280L/m2/時間から約380L/m2/時間の間、約280L/m2/時間から約360L/m2/時間の間、約280L/m2/時間から約340L/m2/時間の間、約280L/m2/時間から約320L/m2/時間の間、約280L/m2/時間から約300L/m2/時間の間、約300L/m2/時間から約400L/m2/時間の間、約300L/m2/時間から約380L/m2/時間の間、約300L/m2/時間から約360L/m2/時間の間、約300L/m2/時間から約340L/m2/時間の間、約300L/m2/時間から約320L/m2/時間の間、約320L/m2/時間から約400L/m2/時間の間、約320L/m2/時間から約380L/m2/時間の間、約320L/m2/時間から約360L/m2/時間の間、約320L/m2/時間から約340L/m2/時間の間、約340L/m2/時間から約400L/m2/時間の間、約340L/m2/時間から約380L/m2/時間の間、約340L/m2/時間から約360L/m2/時間の間、約360L/m2/時間から約400L/m2/時間の間、約360L/m2/時間から約380L/m2/時間の間、又は約380L/m2/時間から約400L/m2/時間の間の流量でデプスフィルターを通して流されて、選択的に可溶性タンパク質凝集物、例えば、タンパク質二量体及びより高次のタンパク質オリゴマー(例えば、可溶性組換えタンパク質凝集物)が維持される。このろ過工程は、例えば、シリカ、1つ又は複数の層の繊維性の媒体、1つ又は複数の層の帯電した又は表面修飾した微孔性膜、又は小さいベッドのクロマトグラフィー媒体のろ過媒体を含むデプスフィルターを用いて実施される。本明細書に記載されるデプスフィルターは、約10cm2から約32000cm2の間、約10cm2から約31000cm2の間、約10cm2から約30000cm2の間、約10cm2から約29000cm2の間、約10cm2から約28000cm2の間、約10cm2から約27000cm2の間、約10cm2から約26000cm2の間、約10cm2から約25000cm2の間、約10cm2から約24000cm2の間、約10cm2から約23000cm2の間、約10cm2から約22000cm2の間、約10cm2から約21000cm2の間、約10cm2から約20000cm2の間、約10cm2から約19000cm2の間、約10cm2から約18000cm2の間、約10cm2から約17000cm2の間、約10cm2から約16000cm2の間、約10cm2から約15000cm2の間、約10cm2から約14000cm2の間、約10cm2から約13000cm2の間、約10cm2から約12000cm2の間、約10cm2から約11000cm2の間、約10cm2から約10000cm2の間、約10cm2から約9000cm2の間、約10cm2から約8000cm2の間、約10cm2から約7000cm2の間、約10cm2から約6000cm2の間、約10cm2から約5000cm2の間、約10cm2から約4000cm2の間、約10cm2から約3000cm2の間、約10cm2から約2000cm2の間、約10cm2から約1500cm2の間、約10cm2から約1020cm2の間、約10cm2から約1000cm2の間、約10cm2から約500cm2の間、約10cm2から約75cm2の間、約100cm2から約25000cm2の間、約100cm2から約24000cm2の間、約100cm2から約23000cm2の間、約100cm2から約22000cm2の間、約100cm2から約21000cm2の間、約100cm2から約20000cm2の間、約100cm2から約19000cm2の間、約100cm2から約18000cm2の間、約100cm2から約17000cm2の間、約100cm2から約16000cm2の間、約100cm2から約15000cm2の間、約100cm2から約14000cm2の間、約100cm2から約13000cm2の間、約100cm2から約12000cm2の間、約100cm2から約11000cm2の間、約100cm2から約10000cm2の間、約1000cm2から約9000cm2の間、約100cm2から約8000cm2の間、約100cm2から約7000cm2の間、約100cm2から約6000cm2の間、約100cm2から約5000cm2の間、約100cm2から約4000cm2の間、約100cm2から約3000cm2の間、約100cm2から約2000cm2の間、約100cm2から約1000cm2の間、約100cm2から約500cm2の間、約500cm2から約25000cm2の間、約500cm2から約24000cm2の間、約500cm2から約23000cm2の間、約500cm2から約22000cm2の間、約500cm2から約21000cm2の間、約500cm2から約20000cm2の間、約500cm2から約19000cm2の間、約500cm2から約18000cm2の間、約500cm2から約17000cm2の間、約500cm2から約16000cm2の間、約500cm2から約15000cm2の間、約500cm2から約14000cm2の間、約500cm2から約13000cm2の間、約500cm2から約12000cm2の間、約500cm2から約1
1000cm2の間、約500cm2から約10000cm2の間、約500cm2から約9000cm2の間、約500cm2から約8000cm2の間、約500cm2から約7000cm2の間、約500cm2から約6000cm2の間、約500cm2から約5000cm2の間、約500cm2から約4000cm2の間、約500cm2から約3000cm2の間、約500cm2から約2000cm2の間、約500cm2から約1000cm2の間、約1000cm2から約25000cm2の間、約1000cm2から約24000cm2の間、約1000cm2から約23000cm2の間、約1000cm2から約22000cm2の間、約1000cm2から約21000cm2の間、約1000cm2から約20000cm2の間、約1000cm2から約19000cm2の間、約1000cm2から約18000cm2の間、約1000cm2から約17000cm2の間、約1000cm2から約16000cm2の間、約1000cm2から約15000cm2の間、約1000cm2から約14000cm2の間、約1000cm2から約13000cm2の間、約1000cm2から約12000cm2の間、約1000cm2から約11000cm2の間、約1000cm2から約10000cm2の間、約1000cm2から約9000cm2の間、約1000cm2から約8000cm2の間、約1000cm2から約7000cm2の間、約1000cm2から約6000cm2の間、約1000cm2から約5000cm2の間、約1000cm2から約4000cm2の間、約1000cm2から約3000cm2の間、約1000cm2から約2000cm2の間、約5000cm2から約25000cm2の間、約5000cm2から約24000cm2の間、約5000cm2から約23000cm2の間、約5000cm2から約22000cm2の間、約5000cm2から約21000cm2の間、約5000cm2から約20000cm2の間、約5000cm2から約19000cm2の間、約5000cm2から約18000cm2の間、約5000cm2から約17000cm2の間、約5000cm2から約16000cm2の間、約5000cm2から約15000cm2の間、約5000cm2から約14000cm2の間、約5000
cm2から約13000cm2の間、約5000cm2から約12000cm2の間、約5000cm2から約11000cm2の間、約5000cm2から約10000cm2の間、約5000cm2から約9000cm2の間、約5000cm2から約8000cm2の間、約5000cm2から約7000cm2の間、約5000cm2から約6000cm2の間、約10000cm2から約25000cm2の間、約10000cm2から約24000cm2の間、約10000cm2から約23000cm2の間、約10000cm2から約2200cm2の間、約10000cm2から約21000cm2の間、約10000cm2から約20000cm2の間、約10000cm2から約19000cm2の間、約10000cm2から約18000cm2の間、約10000cm2から約17000cm2の間、約10000cm2から約16000cm2の間、約10000cm2から約15000cm2の間、約10000cm2から約14000cm2の間、約10000cm2から約13000cm2の間、約10000cm2から約12000cm2の間、約10000cm2から約11000cm2の間、約15000cm2から約25000cm2の間、約15000cm2から約24000cm2の間、約15000cm2から約23000cm2の間、約15000cm2から約22000cm2の間、約15000cm2から約21000cm2の間、約15000cm2から約20000cm2の間、約15000cm2から約19000cm2の間、約15000cm2から約18000cm2の間、約15000cm2から約17000cm2の間、約15000cm2から約16000cm2の間、約20000cm2から約25000cm2の間、約20000cm2から約24000cm2の間、約20000cm2から約23000cm2の間、約20000cm2から約22000cm2の間、約20000cm2から約21000cm2の間、又は約25cm2の膜表面面積を有してもよい。いくつかの例において、2つ以上のデプスフィルターは、精製プロセス中の1つ又は複数の工程でデプスフィルターを通して流される組換えタンパク質の量を増加させるためのマニフォールドに流体連通される。
本明細書に記載される任意の方法のいくつかの実施形態は、捕獲の工程と組換えタンパク質をデプスフィルターを通して流す工程の間に、組換えタンパク質を含む溶液に1つ又は複数の(例えば、2、3、4、又は5つの)単位操作を実施する工程、例えば、ろ過すること(例えば、溶液中の組換えタンパク質を濃縮するための限外ろ過/ダイアフィルトレーション)、組換えタンパク質を精製すること、組換えタンパク質を最終精製すること、ウイルス不活性化、ろ過によってウイルスを除去すること、及び組換えタンパク質を含む溶液のpHとイオン濃度の一方又は両方を調整することの群から選択される1つ又は複数の単位操作を含む。本明細書に記載される任意の方法のいくつかの実施形態は、捕獲の工程と組換えタンパク質をデプスフィルターを通して流す工程の間に、組換えタンパク質を含む溶液に1つ又は複数の(例えば、2、3、4、又は5つの)単位操作を実施する工程、例えば、溶液中の組換えタンパク質を濃縮するための限外ろ過/ダイアフィルトレーション、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、組換えタンパク質を最終精製すること、組換えタンパク質を含む溶液のウイルス不活性化、ウイルスろ過、pHの調整、イオン強度の調整、及びpHとイオン強度の両方の調整の群からの1つ又は複数の単位操作を含む。本明細書に記載される任意の方法のいくつかの実施形態において、方法は、捕獲の工程と組換えタンパク質をデプスフィルターを通して流す工程の間に、最終精製すること(例えば、疎水性相互作用クロマトグラフィーを実施することによって)及び溶液中の組換えタンパク質を濃縮するための限外ろ過/ダイアフィルトレーションの逐次的な単位操作を実施することを含む。
本明細書に記載される方法は、組換えタンパク質を精製する単位操作を実施するため使用することができる少なくとも1つのクロマトグラフィーカラムを用いて組換えタンパク質を精製する工程を含んでいてもよい。本明細書に記載される方法は、組換えタンパク質を最終精製する単位操作を実施するため使用することができる少なくとも1つのクロマトグラフィーカラム又はクロマトグラフィー膜を用いて組換えタンパク質を最終精製する工程を含んでいてもよい。
組換え治療タンパク質を含む流体中に存在するウイルスを不活性化する単位操作は、クロマトグラフィーカラム、クロマトグラフィー膜、又は組換え治療タンパク質を含む流体を、約3.0から5.0の間、約3.5から約4.5の間、約3.5から約4.25の間、約3.5から約4.0の間、約3.5から約3.8の間、又は約3.75のpHで、少なくとも25分間、約30分間から1.5時間の間の期間、約30分間から1.25時間の間の期間、約0.75時間から1.25時間の間の期間、又は約1時間の期間インキュベートする能力のある貯蔵タンクを用いて実施することができる。
本明細書に記載される任意の方法のいくつかの実施形態は、組換えタンパク質又は組換えタンパク質産物を医薬組成物に製剤化する工程を更に含む。例えば、製剤化は、薬学的に許容される賦形剤を精製された組換えタンパク質又は組換えタンパク質産物(例えば、本明細書に記載される、組換えタンパク質を精製する任意の方法又は組換えタンパク質産物を製造する任意の方法によって生産される)に添加することを含んでいてもよい。製剤化は、薬学的に許容される賦形剤を精製された組換えタンパク質又は組換えタンパク質産物と混合することを含んでいてもよい。薬学的に許容される賦形剤の例(例えば、非天然の薬学的に許容される賦形剤)は、当技術分野において周知である。いくつかの実施形態において、精製された組換えタンパク質又は組換えタンパク質産物は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、又は筋肉内投与について製剤化される。
組換え抗体を精製する方法における可溶性タンパク質凝集物レベル
第1のセットの実験を実施して、2つの異なる組換え抗体を精製するためのプロセスにおいて可溶性タンパク質凝集物を除去するデプスフィルターの効果を評価した。この例において、各プロセスは、少なくとも以下の単位操作を含む:プロテインAクロマトグラフィーを用いる抗体捕獲、ウイルス不活性化、深層ろ過、限外ろ過/ダイアフィルトレーション、及びイオン交換クロマトグラフィー。抗体凝集物の量、単量体(非凝集性の抗体)、及び宿主細胞タンパク質を、各単位操作後に測定した。例えば、凝集物、モノマー、及びHCPのレベルを、2つの異なる抗体(抗体A及び抗体B)を精製するためのプロセスにおいて、プールしたプロテインAクロマトグラフィー溶出液、ウイルス不活性化の後の溶液、デプスフィルター溶出液、及びプールしたイオン交換クロマトグラフィー溶出液において決定した。
組換えFc融合タンパク質を精製するためのプロセスにおける下流の深層ろ過の使用
実験のセットを実施して、組換えタンパク質精製プロセスにおけるデプスフィルターの下流又は後(例えば、細胞培養培地清澄化、限外ろ過/ダイアフィルトレーション、ウイルス不活性化、プロテインA捕獲、疎水性相互作用クロマトグラフィー(例えば、最終精製すること)、及び第2の限外ろ過/ダイアフィルトレーション工程の後)の使用が、清澄化された細胞培養から組換えFc融合タンパク質を精製するための方法において、ウイルスフィルターにおける流量の減衰を減少させるかどうかを決定した。
深層ろ過におけるpH及びフィルターのローディングの効果
実験のセットを実施して、以下の工程を含むプロセスにおいて実施される深層ろ過工程におけるpH及びフィルターのローディングの効果を検査した:培養培地の清澄化、限外ろ過/ダイアフィルトレーション、ウイルス不活性化、プロテインAクロマトグラフィー(捕獲)、疎水性相互作用クロマトグラフィー(例えば、最終精製)、限外ろ過/ダイアフィルトレーション、深層ろ過、及びウイルスろ過。これらの方法においてデプスフィルターを通過させる溶液は、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、又は8.5のpHを有し、及び場合によって、70L/m2、125L/m2、及び180L/m2のフィルターのローディングでフィルターを通過させた。
3つの異なる精製プロセスを、この実施例において検査した。各々の検査したプロセスには、深層ろ過及び1つ又は複数の更なる下流の単位操作を実施する前に、プロテインAクロマトグラフィー捕獲工程及び精製された組換えタンパク質を含む溶液のpHとイオン濃度の一方又は両方を調整することを含めた。検査したプロセスの各々(概略図1から概略図3)は、図5及び図6に示される。産物収率及び可溶性タンパク質凝集物クリアランスを、3つの検査したプロセスの間で比較した。
材料
単回のバイオリアクター培養実行から収穫されたエクリズマブを含む培養培地を、各実験に使用した。以下の更なる物質を使用して、検査したプロセスを実施した:Millipore DOHC、Millipore A1HC、Millipore Express SHC(0.2μm)、MabSelect(商標)SuRe(商標)樹脂(GE Healthcare社)、Zeta Plus Dilipidフィルター(3M DELI08A)、Pelicon3 UF/DF膜、POROS 50HSカラム(Life Technologies社)、POROS 50HQ樹脂(Life Technologies社)、Capto Adhere ImpRes樹脂(GE Healthcare社)、Sartorius MAXプレフィルター、Sartorius Virosart CPV、AKTA Avantクロマトグラフィーシステム(Unicornソフトウェアを備える)、pHメータ、及び伝導度メータ。全ての緩衝剤を、USPグレードの化学物質を用いて作製した。Table 7(表7)は、この実施例に使用される各々のカラム及びフィルターの寸法を列挙する。
MabSelect(商標)SuRe(商標)クロマトグラフィーは、産物を濃縮するため及び不純物を除去するため使用されるFc親和性ベース捕獲工程である。産物は、中性pHでカラムに結合し、25mM酢酸ナトリウム(pH3.7)を用いて低pHで溶出される。5つのクロマトグラフィーサイクルを実施して、図5及び図6に図示される3つの検査したプロセス(概略図1から概略図3)のための出発原料を生成した。Table 8(表8)及びTable 9(表9)は、エクリズマブのプロテインA精製のためのプロセス条件を要約する。
プロテインA捕獲クロマトグラフィーのデータは、Table 20(表20)に示される。プロテインAクロマトグラフィー捕獲の実施は、実施した5つのサイクルの間で一致し、平均収率88%±1%標準偏差であった。MabSelect(商標)SuRe(商標)クロマトグラフィーサイクルからの5つのクロマトグラムは、非常に類似する溶出プロファイルを共有する。産物収率は、低pH不活性化及び中和後に、およそ100%であった(Table 21(表21))。しかしながら、濁度は、およそ9.8倍に平均105NTUに増加し(Table 21(表21))、概略図1のプロセスにおいて中和した低pH不活性化プール中に37.53%の可溶性タンパク質凝集物が存在していた(Table 22(表22))。
プロテインAクロマトグラフィー溶出及び深層ろ過の最適化
実験のセットを実施して、沈殿及び凝集を防止するプロテインA溶出緩衝剤中に必要とされる塩化ナトリウムの最少量を評価した。
単回のバイオリアクター培養から得られたエクリズマブを含む清澄化された培養培地を、これらの実験に使用した。GE Healthcare培地(カタログ番号17-5438-05、ロット番号10037980)からのMabSelect(商標)SuRe(商標)を使用して、106mLのカラム容量を有する2.5cm×20cmカラムを調製した。Millipore Pellicon3 UF/DF膜を使用して、限外ろ過/ダイアフィルトレーションを実施した。Orion Conductivityプローブ(E12/026)を使用して伝導度を測定した、伝導度メータは毎日の開始時に100mS/cm伝導度緩衝剤で標準化後に使用した。Hach Turbidityメータ(カタログ番号470060、シリアル番号05080C020561)を使用して流体の濁度を測定した。
Table 34(表34)及びTable 35(表35)、並びに図12は、これらの実験の結果を示す。150mM NaClを有するプロテインAプールが、80%収率をもたらしたことをデータは示す(Table 34(表34))。ダイアフィルトレーションによってプロテインAプール中で伝導度及びpHが減少するにつれて、濁度も減少することをもデータは示す(Table 35(表35)及び図12)。25mM酢酸緩衝剤中およそ4mg/mLの濃度、pH4と7の間、伝導度<1〜15mS/cm(<10〜150mM NaCl)、室温及び2℃から8℃でエクリズマブが沈殿しないことをもデータは示す。
深層ろ過工程の最適化
実験のセットを実施して、3つの異なるプロテインAクロマトグラフィー溶出緩衝剤を検査した。各プロテインAクロマトグラフィー溶出プールを、低pHで処理してウイルス不活性化を達成し、それをZeta Plus Delipidデプスフィルターを通過させる前に、所望のpH(6又は7のpH)に中和した。全体で6つの異なるローディング条件を、≦100L/m2のローディング及び150LMHの流れでDelipidデプスフィルター(25cm2のろ過面積)を通してろ過した。
単回のバイオリアクター培養から得られたエクリズマブを含む清澄化された培養培地を、これらの実験に使用した。GE Healthcare培地(カタログ番号17-5438-05、ロット番号10037980)からのMabSelect(商標)SuRe(商標)を使用して、106mLのカラム容量を有する2.5cm×20cmカラムを調製した。3M Zeta Plus Delipidデプスフィルター(カタログ番号BC0025LDELI08A、ロット番号43720及び43534)を使用して深層ろ過の工程を実施した。Explorer及びAvant自動液体クロマトグラフィーシステムを使用してプロテインAカラムクロマトグラフィーを実施した。Orion Rossウルトラフラット表面pHプローブ(Sx1-15902)及びpHメータを、pH4、7、及び10の緩衝剤で毎日の開始時に標準化して、pHを検出するため使用した。
Table 40(表40)〜Table 42(表42)は、プロテインAクロマトグラフィーデータ及び低pHウイルス不活性化データを示す。NaCl濃度がプロテインAクロマトグラフィー溶出緩衝剤中で増加するにつれて、プール容量は減少し、収率は増加した。しかしながら、プロテインA溶出緩衝剤中のNaCl濃度が増加するにつれて、濁度は増加した(Table 40(表40))。(低pHに保持後)pH6又は7に中和にしたプロテインAプールは、NaCl濃度が増加するにつれて、濁度のレベル(Table 41(表41))及び可溶性タンパク質凝集物のレベル(Table 42(表42))が増加した。同じNaCl濃度で比較した場合に、濁度は(低pH処理及び中和後)プロテインAプールから中和したプロテインAプールで実質的に増加した(Table 40(表40)及びTable 41(表41))。
抗体回収及び不純物クリアランスを最大にする深層ろ過の最適化
更なるセットの実験を実施して、抗体回収を至適化し、不純物(宿主細胞タンパク質及び可溶性タンパク質凝集物)を除去する試みにおいて異なるDelipidデプスフィルターのローディング条件を検査した。
単回のバイオリアクター培養から得られたAlexion1210の二パラトープ抗体を含む清澄化された培養培地を、これらの実験に使用した。GE Healthcare培地(カタログ番号17-5438-05、ロット番号10037980)からのMabSelect(商標)SuRe(商標)を使用して、106mLのカラム容量を有する2.5cm×20cmカラムを調製した。3M Zeta Plus Delipidデプスフィルター(カタログ番号BC0025LDELI08A、ロット番号43720及び43534)を使用して深層ろ過の工程を実施した。Explorer及びAvant自動液体クロマトグラフィーシステムを使用してプロテインAカラムクロマトグラフィーを実施した。Orion Rossウルトラフラット表面pHプローブ(Sx1-15902)及びpHメータを、pH4、7、及び10の緩衝剤で毎日の開始時に標準化して、pHを検出するため使用した。
Table 48(表48)及びTable 49(表49)は、プロテインA及び低pHウイルス不活性化データを示す。Table 50(表50)〜Table 52(表52)及び図15は、Delipid深層ろ過データを示す。これらのデータは、Zeta Plus Delipidフィルターが、≦275g/m2でローディングして抗体の精製を至適化しうることを示す。
本発明は、その詳細な説明と共に記載されている一方で、前述の説明は、例示することを意図しており、本発明の範囲は限定されず、添付の特許請求の範囲により定義されることが理解される。他の態様、利点、及び修飾は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
Claims (48)
- 組換えタンパク質を精製する方法であって、
(a)組換えタンパク質を含む溶液から組換えタンパク質を捕獲する工程;
(b)捕獲する工程の後に、溶液に1つ又は複数の単位操作を実施する工程;及び
(c)工程(a)及び(b)の後に、組換えタンパク質をデプスフィルターを通して流して、精製された組換えタンパク質を含み、可溶性タンパク質凝集物を実質的に含まないろ過物を提供する工程
を含む方法。 - 捕獲する工程が、親和性クロマトグラフィー樹脂、陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂、陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂、混合モードクロマトグラフィー樹脂、分子ふるいクロマトグラフィー樹脂、又は疎水的相互作用クロマトグラフィー樹脂を用いて実施される、請求項1に記載の方法。
- 親和性クロマトグラフィー樹脂が、プロテインA結合捕獲機構、抗体又は抗体断片結合捕獲機構、基質結合捕獲機構、及びコファクター結合捕獲機構からなる群から選択される捕獲機構を利用する、請求項2に記載の方法。
- 工程(b)における1つ又は複数の単位操作が、溶液中の組換えタンパク質を濃縮するための限外ろ過/ダイアフィルトレーション、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、組換えタンパク質を最終精製する工程、組換えタンパク質を含む溶液の、ウイルス不活性化、ウイルスろ過、pHの調整、イオン強度の調整、及びpHとイオン強度の両方の調整からなる群から選択される、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 最終精製する工程が、疎水性相互作用クロマトグラフィー又はイオン交換クロマトグラフィーを用いて実施される、請求項4に記載の方法。
- 工程(b)における1つ又は複数の単位操作が、疎水性相互作用クロマトグラフィー及び溶液中の組換えタンパク質を濃縮するための限外ろ過/ダイアフィルトレーションを用いて最終精製する工程である、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(a)における組換えタンパク質を含む溶液が、組換えタンパク質を含む清澄化された液体培養培地又は緩衝化された溶液である、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- 組換えタンパク質が、約4.0から約7.5の間のpHを有する溶液中でデプスフィルターを通して流される、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 組換えタンパク質が、約5.5から約7.5の間のpHを有する溶液中でデプスフィルターを通して流される、請求項8に記載の方法。
- 組換えタンパク質が、約6.5から約7.5の間のpHを有する溶液中でデプスフィルターを通して流される、請求項9に記載の方法。
- 組換えタンパク質がデプスフィルターを通して流され、タンパク質凝集物及びHCPの双方が、少なくとも50%低下する、請求項10に記載の方法。
- 組換えタンパク質が、約25L/m2/時間から約400L/m2/時間の間の流量でデプスフィルターを通して流される、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
- 組換えタンパク質が、約70L/m2/時間から約150L/m2/時間の間の流量でデプスフィルターを通して流される、請求項12に記載の方法。
- デプスフィルターが、約10cm2から約32000cm2の間の膜表面面積を有する、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
- デプスフィルターが、約10cm2から約1020cm2の間の膜表面面積を有する、請求項14に記載の方法。
- デプスフィルターが、正に帯電したろ過媒体を含む、請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。
- デプスフィルターが、シリカを含むろ過媒体を含む、請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。
- 組換えタンパク質をデプスフィルターを通して流す工程の後に、ろ過物が、1つ又は複数の更なるデプスフィルター又はウイルスフィルターを通して流される、請求項1から17のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(a)の前に、溶液中の組換えタンパク質を濃縮するための限外ろ過/ダイアフィルトレーション、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、組換えタンパク質を最終精製する工程、組換えタンパク質を含む溶液の、ウイルス不活性化、ウイルスろ過、pHの調整、イオン強度の調整、及びpHとイオン強度の両方の調整からなる群から選択される1つ又は複数の単位操作を実施する工程を更に含む、請求項1から18のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(c)における精製された組換えタンパク質を含むろ過物が、工程(c)におけるデプスフィルターを通して流される組換えタンパク質における宿主細胞タンパク質のレベルと比較して、低下したレベルの宿主細胞タンパク質を更に含む、請求項1から19のいずれか一項に記載の方法。
- 組換えタンパク質産物を製造する方法であって、
(a)組換えタンパク質を含む清澄化された液体培養培地から組換えタンパク質を捕獲する工程;
(b)捕獲する工程の後に、溶液に1つ又は複数の単位操作を実施する工程;
(c)工程(a)及び(b)の後に、組換えタンパク質をデプスフィルターを通して流して、精製された組換えタンパク質を含み、可溶性タンパク質凝集物を実質的に含まないろ過物を提供する工程;並びに
(d)精製された組換えタンパク質に1つ又は複数の単位操作を実施することによって、組換えタンパク質産物を生産する工程
を含む方法。 - 捕獲する工程が、親和性クロマトグラフィー樹脂、陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂、陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂、混合モードクロマトグラフィー樹脂、分子ふるいクロマトグラフィー樹脂、又は疎水的相互作用クロマトグラフィー樹脂を用いて実施される、請求項21に記載の方法。
- 親和性クロマトグラフィー樹脂が、プロテインA結合捕獲機構、抗体又は抗体断片結合捕獲機構、基質結合捕獲機構、及びコファクター結合捕獲機構からなる群から選択される捕獲機構を利用する、請求項22に記載の方法。
- 工程(b)における1つ又は複数の単位操作が、溶液中の組換えタンパク質を濃縮するための限外ろ過/ダイアフィルトレーション、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、組換えタンパク質を最終精製する工程、組換えタンパク質を含む溶液の、ウイルス不活性化、ウイルスろ過、pHの調整、イオン強度の調整、及びpHとイオン強度の両方の調整からなる群から選択される、請求項21から23のいずれか一項に記載の方法。
- 最終精製する工程が、疎水性相互作用カラムクロマトグラフィー又はイオン交換クロマトグラフィーを用いて実施される、請求項24に記載の方法。
- 工程(b)における1つ又は複数の単位操作が、疎水性相互作用クロマトグラフィー及び溶液中の組換えタンパク質を濃縮するための限外ろ過/ダイアフィルトレーションを用いて最終精製する工程である、請求項21から25のいずれか一項に記載の方法。
- 組換えタンパク質が、約4.0から約7.5の間のpHを有する溶液中でデプスフィルターを通して流される、請求項21から26のいずれか一項に記載の方法。
- 組換えタンパク質が、約5.5から約7.5の間のpHを有する溶液中でデプスフィルターを通して流される、請求項27に記載の方法。
- 組換えタンパク質が、約6.5から約7.5の間のpHを有する溶液中でデプスフィルターを通して流される、請求項28に記載の方法。
- 組換えタンパク質がデプスフィルターを通して流され、タンパク質凝集物及びHCPが、少なくとも50%低下する、請求項29に記載の方法。
- 組換えタンパク質が、約25L/m2/時間から約400L/m2/時間の間の流量でデプスフィルターを通して流される、請求項21から30のいずれか一項に記載の方法。
- 組換えタンパク質が、約70L/m2/時間から約150L/m2/時間の間の流量でデプスフィルターを通して流される、請求項31に記載の方法。
- デプスフィルターが、約10cm2から約32000cm2の間の膜表面面積を有する、請求項21から32のいずれか一項に記載の方法。
- デプスフィルターが、約10cm2から約1020cm2の間の膜表面面積を有する、請求項33に記載の方法。
- デプスフィルターが、正に帯電したろ過媒体を含む、請求項21から34のいずれか一項に記載の方法。
- デプスフィルターが、シリカを含むろ過媒体を含む、請求項21から35のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(d)における1つ又は複数の単位操作が、組換えタンパク質を精製する工程、組換えタンパク質を最終精製する工程、ウイルスを不活性化する工程、ろ過によってウイルスを除去する工程、精製された組換えタンパク質を含む溶液のpHとイオン濃度の一方又は両方を調整する工程、又は流体を更なるデプスフィルターを通過させる工程からなる群から選択される、請求項21から36のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(d)における1つ又は複数の単位操作が、ろ過によってウイルスを除去する工程である、請求項37に記載の方法。
- 工程(c)における精製された組換えタンパク質を含むろ過物が、工程(c)におけるデプスフィルターを通して流される組換えタンパク質における宿主細胞タンパク質のレベルと比較して、低下したレベルの宿主細胞タンパク質を更に含む、請求項21から38のいずれか一項に記載の方法。
- 組換えタンパク質が抗体である、請求項1から39のいずれか一項に記載の方法。
- 組換えタンパク質がヒト又はヒト化抗体である、請求項40に記載の方法。
- 抗体が、ヒト補体タンパク質C5に特異的に結合する、請求項41に記載の方法。
- 抗体が、エクリズマブである、請求項42に記載の方法。
- 抗体が、配列番号1を含む重鎖及び配列番号2を含む軽鎖からなる、請求項43に記載の方法。
- 抗体が、配列番号1からなる重鎖及び配列番号2からなる軽鎖からなる、請求項44に記載の方法。
- 抗体が、Alexion1210である、請求項42に記載の方法。
- 抗体が、配列番号3を含む重鎖及び配列番号4を含む軽鎖からなる、請求項46に記載の方法。
- 抗体が、配列番号3からなる重鎖及び配列番号4からなる軽鎖からなる、請求項47に記載の方法。
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