JP2018186759A - Production method of organic acid producing sake yeast strain, production method of refined sake, and mutation pex22 gene - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、有機酸生成酒酵母株の製造方法、清酒の製造方法、および変異PEX22遺伝子に関する。 The present invention relates to a method for producing an organic acid-producing liquor yeast strain, a method for producing sake, and a mutant PEX22 gene.
酸味の強い爽やかな口当たりの清酒を製造するために、近年、有機酸を高生成する酒酵母の改良が行われている。しかしながら、報告されている自然変異法による酵母の改良は、有機酸を高生成できるものの、発酵力が不十分であり、結果として清酒が甘口に、あるいは、低アルコールになるという問題があった(非特許文献1)。また、どのような改良であれば、有機酸の高生成と発酵力の維持とを両立できるかも不明である。 In order to produce sake with a refreshing taste with a strong acidity, in recent years, sake yeast that produces a high amount of organic acid has been improved. However, although the reported improvement of yeast by the natural mutation method can produce organic acids at a high rate, the fermentation power is insufficient, resulting in a problem that sake becomes sweet or low alcohol ( Non-patent document 1). It is also unclear what improvements can achieve both high production of organic acids and maintenance of fermentation power.
そこで、本発明は、十分な発酵力を維持し且つ有機酸生成能に優れる酒酵母株の製造方法を提供する。 Then, this invention provides the manufacturing method of the liquor yeast strain | stump | stock which maintains sufficient fermentative power and is excellent in an organic acid production | generation ability.
本発明の有機酸生成酒酵母株の製造方法は、酒酵母株について、そのPEX22遺伝子を変異PEX22遺伝子に変異させる変異工程を含み、
前記変異工程において、前記PEX22遺伝子における配列番号1の塩基配列で示される部分領域について、塩基NNNを、ストップコドンに変異させることを特徴とする。
The method for producing an organic acid-producing liquor yeast strain of the present invention comprises a mutation step of mutating the PEX22 gene to a mutant PEX22 gene for the liquor yeast strain,
In the mutation step, the base NNN is mutated to a stop codon in the partial region represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 in the PEX22 gene.
本発明の清酒の製造方法は、酒酵母株から有機酸生成酒酵母株を作製する作製工程、および
前記有機酸生成酒酵母株を用いて、清酒を製造する製造工程を含み、
前記作製工程は、前記本発明の有機酸生成酒酵母株の製造方法により実施されることを特徴とする。
The method for producing sake of the present invention includes a production process for producing an organic acid-producing sake yeast strain from a sake yeast strain, and a production process for producing sake using the organic acid-producing sake yeast strain,
The production step is performed by the method for producing an organic acid-producing sake yeast strain of the present invention.
本発明の変異PEX22遺伝子は、PEX22遺伝子における配列番号1の塩基配列で示される部分領域において、塩基NNNが、ストップコドンであることを特徴とする。 The mutant PEX22 gene of the present invention is characterized in that the base NNN is a stop codon in the partial region represented by the base sequence of SEQ ID NO: 1 in the PEX22 gene.
本発明によれば、十分な発酵力を維持し且つ有機酸生成能に優れる酒酵母株を製造できる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the liquor yeast strain | stump | stock which maintains sufficient fermentative power and is excellent in organic acid production ability can be manufactured.
<有機酸生成酒酵母株の製造方法>
本発明の有機酸生成酒酵母株の製造方法(以下、「酵母株の製造方法」ともいう)は、前述のように、酒酵母株について、そのPEX22遺伝子を変異PEX22遺伝子に変異させる変異工程を含み、前記変異工程において、前記PEX22遺伝子における配列番号1の塩基配列で示される部分領域について、塩基NNNを、ストップコドンに変異させることを特徴とする。本発明の酵母株の製造方法は、前記変異工程において、前記酒酵母株のPEX22遺伝子における配列番号1の塩基配列で示される部分領域について、塩基NNNを、ストップコドンに変異させることが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。
<Method for producing organic acid-producing liquor yeast strain>
As described above, the method for producing an organic acid-producing liquor yeast strain of the present invention (hereinafter also referred to as “yeast strain production method”) comprises a mutation step of mutating the PEX22 gene into a mutant PEX22 gene for the sake yeast strain. In the mutation step, the base NNN is mutated to a stop codon in the partial region represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 in the PEX22 gene. The method for producing a yeast strain of the present invention is characterized in that, in the mutation step, the base NNN is mutated to a stop codon in the partial region represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 in the PEX22 gene of the liquor yeast strain. The other steps and conditions are not particularly limited.
本発明者らは、鋭意研究の結果、前記酒酵母株のPEX22遺伝子における配列番号1の塩基配列で示される部分領域について、塩基NNNを、ストップコドンに変異させた変異PEX22遺伝子とすることにより、酒酵母株の有機酸の生成量を増大できることを見出し、本発明を完成させるに至った。このため、本発明は、例えば、PEX22遺伝子以外が同一である酵母(以下、「親株」ともいう)と比較した場合、発酵力を維持し且つより優れた有機酸生成能を示す酵母株を製造できる。つまり、本発明によれば、本来、有機酸生成能に劣る酵母株(親株)であっても、例えば、前述のように、前記PEX22遺伝子を前記変異PEX22遺伝子に変異させた変異酵母株とすることで、前記親株と比較して有機酸の生成量を増大でき、優れた有機酸生成能を付与することができる。 As a result of diligent research, the present inventors have determined that the partial region represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 in the PEX22 gene of the liquor yeast strain is a mutant PEX22 gene in which the base NNN is mutated to a stop codon, The present inventors have found that the production amount of organic acid of a sake yeast strain can be increased, and have completed the present invention. For this reason, for example, the present invention produces a yeast strain that maintains fermentative power and exhibits a superior organic acid-producing ability when compared with, for example, a yeast that is identical except for the PEX22 gene (hereinafter also referred to as “parent strain”). it can. That is, according to the present invention, even a yeast strain (parent strain) that is originally inferior in organic acid-producing ability is, for example, a mutant yeast strain in which the PEX22 gene is mutated to the mutant PEX22 gene as described above. Thereby, compared with the said parent strain | stump | stock, the production amount of an organic acid can be increased and the outstanding organic acid production | generation ability can be provided.
前記変異工程は、前述のように、酒酵母株について、そのPEX22遺伝子を変異PEX22遺伝子に変異させる工程である。前記変異工程では、前記PEX22遺伝子における配列番号1の塩基配列で示される部分領域について、塩基NNNを、ストップコドンに変異させる。 As described above, the mutation step is a step of mutating the PEX22 gene to the mutant PEX22 gene for the sake yeast strain. In the mutation step, the base NNN is mutated to a stop codon in the partial region represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 in the PEX22 gene.
前記酒酵母株は、特に制限されず、例えば、商品としての酒の製造に使用する酵母でもよいし、酒製造の実験に使用する酵母でもよい。具体例として、前記酒酵母は、例えば、清酒の製造または清酒製造の実験に使用する清酒酵母等があげられる。また、前記酒酵母の分類は、例えば、Saccharomyces属、Schizosaccharomyces属、Candida属、Yarrowia属、Hansenula属、Kluyveromyces属等があげられ、好ましくはSaccharomyces属である。Saccharomyces属の中でも、例えば、Saccharomyces cerevisiaeが特に好ましい。前記酒酵母の具体例としては、例えば、Saccharomyces cerevisiaeに属しているものがあげられ、一倍体でも、二倍体でもよく、二倍体が好ましい。前記酒酵母株は、例えば、広義の意味で市販(契約酵母も含む)されているものでもよく、また、天然界から単離しても良い(例えば、特開2014-212782号公報)が、清酒酵母(清酒醸造用酵母)として市販されているものがより好ましい。前記清酒醸造用酵母として市販されているものは、例えば、日本醸造協会が販売している酵母(K-6、K-7、K-9、K-10、K-11、K-14、K-601、K-701、K-901、K-1001、K-1401、K-1501、K-1801、K-1601、K-1701、きょうかいNo.28、きょうかいNo.77等)、その他公的機関が開発した清酒醸造用酵母、例えば、青森県工業総合研究センター開発酵母(まほろば華酵母、イ号酵母・ロ号酵母等)等があげられる。前記清酒醸造用酵母は、例えば、前述のように入手し得る清酒醸造用酵母を直接用いてもよいし、自然変異等でさらに育種改良したもの(例えば、セルレニン耐性が付与され、吟醸香生産の高くなった清酒醸造用酵母等)を用いてもよく、具体例として、日本醸造協会が販売しているK-701(別名:きょうかい701号酵母)があげられる。前記清酒醸造用酵母は、コメを原料とした清酒の製造に使用できればよく、例えば、焼酎用の酵母等であってもよい。 The liquor yeast strain is not particularly limited, and may be, for example, a yeast used for the production of sake as a commercial product or a yeast used for an experiment for liquor production. Specific examples of the sake yeast include sake yeast used for sake production or sake production experiments. Examples of the classification of the liquor yeast include the genus Saccharomyces, the genus Schizosaccharomyces, the genus Candida, the genus Yarrowia, the genus Hansenula, the genus Kluyveromyces , and preferably the genus Saccharomyces . Among the genus Saccharomyces , for example, Saccharomyces cerevisiae is particularly preferable. Specific examples of the liquor yeast include, for example, those belonging to Saccharomyces cerevisiae , which may be haploid or diploid, and preferably diploid. The liquor yeast strain may be commercially available (including contracted yeast) in a broad sense, or may be isolated from the natural world (for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2014-212782). What is marketed as yeast (yeast for sake brewing) is more preferable. What is marketed as the yeast for sake brewing is, for example, yeast sold by the Japan Brewing Association (K-6, K-7, K-9, K-10, K-11, K-14, K -601, K-701, K-901, K-1001, K-1401, K-1501, K-1801, K-1601, K-1701, Kyoto No.28, Kyoto No.77, etc. Examples include yeast for sake brewing developed by a public institution, such as yeast developed by Aomori Prefectural Industrial Research Center (Mahoroba Hana yeast, No. 1 yeast, No. 2 yeast, etc.). As the sake brewing yeast, for example, the sake brewing yeast that can be obtained as described above may be used directly, or further breeding improved by natural mutation or the like (for example, cerulenin resistance is imparted, Sake brewing yeast, etc., which have become higher may be used, and specific examples include K-701 (also known as Kyokai No. 701 yeast) sold by the Japan Brewing Association. The sake brewer's yeast may be used for the production of sake using rice as a raw material. For example, yeast for shochu may be used.
本発明において、前記親株は、例えば、中でも、優れた有機酸生成能を示す変異酵母株の取得が困難であった二倍体清酒酵母であるK−7、またはその派生株である二倍体清酒酵母であるK−701、もしくはK−701をさらに変異原で処理し、育種改良した清酒酵母(例えば、5’,5’,5’-トリフルオロロイシン耐性が付与され、酢酸イソアミルの生成量が増大した清酒醸造用酵母)(以下、併せて、「K−7派生株」ともいう)を、親株として使用することが好ましい。本発明によれば、このような親株であっても、優れた有機酸生成能を有する変異酵母株を得ることができる。 In the present invention, the parent strain is, for example, K-7, which is a diploid sake yeast that has been difficult to obtain a mutant yeast strain exhibiting excellent organic acid production ability, or a diploid that is a derivative strain thereof. Sake yeast K-701 or K-701 further treated with a mutagen to improve breeding (for example, 5 ', 5', 5'-trifluoroleucine resistance is imparted and the amount of isoamyl acetate produced) It is preferable to use the yeast for sake brewing with increased (hereinafter also referred to as “K-7 derivative strain”) as the parent strain. According to the present invention, even such a parent strain, a mutant yeast strain having an excellent ability to produce an organic acid can be obtained.
前記酒酵母株は、例えば、前記PEX22遺伝子が欠失しておらず且つ前記変異PEX22遺伝子を有していないことが好ましい。具体例として、前記酒酵母株が一倍体の場合、前記酒酵母株は、例えば、前記PEX22遺伝子が欠失しておらず、且つ前記変異PEX22遺伝子を有していないことが好ましい。また、前記酒酵母株が二倍体の場合、前記酒酵母株は、例えば、2つのPEX22遺伝子が欠失しておらず、且つ変異PEX22遺伝子をホモ接合で有していないこと、すなわち、2つのPEX22遺伝子が欠失しておらず、且つPEX22遺伝子をホモ接合で有する、またはPEX22遺伝子および変異PEX22遺伝子をヘテロ接合で有することが好ましい。前記PEX22遺伝子の欠失は、例えば、前記PEX22遺伝子の機能欠損を意味し、具体例として、塩基の欠失もしくは挿入、またはこれらの組合せにより生じるフレームシフトによる機能的なPEX22タンパク質の発現の欠失、前記PEX22遺伝子の部分または全塩基配列の欠失による機能的なPEX22タンパク質の発現の欠失等があげられる。 For example, the liquor yeast strain preferably does not have the PEX22 gene deleted and does not have the mutant PEX22 gene. As a specific example, when the liquor yeast strain is haploid, the liquor yeast strain preferably does not have the PEX22 gene deleted and does not have the mutant PEX22 gene, for example. Further, when the liquor yeast strain is diploid, the liquor yeast strain does not have, for example, two PEX22 genes deleted and does not have a mutant PEX22 gene homozygously, that is, 2 Preferably, one PEX22 gene is not deleted and the PEX22 gene is homozygous, or the PEX22 gene and the mutant PEX22 gene are heterozygous. Deletion of the PEX22 gene means, for example, a functional defect of the PEX22 gene. As a specific example, functional PEX22 protein expression loss due to a frame shift caused by deletion or insertion of a base, or a combination thereof. Deletion of functional PEX22 protein expression due to deletion of a part of the PEX22 gene or the entire base sequence, and the like.
前記PEX22遺伝子における部分領域は、下記配列番号1で示される塩基配列(例えば、下記配列番号1の塩基配列からなるポリヌクレオチド)である。下記配列番号1の塩基配列において、塩基NNNは、後述するストップコドン以外のコドンである。下記配列番号1の塩基配列において、各塩基Nは、例えば、前記塩基NNNがストップコドンとならない塩基であり、且つA(アデニン)、T(チミン)、G(グアニン)、およびC(シトシン)のいずれかである。具体例として、前記NNNは、例えば、TGGである。 The partial region in the PEX22 gene is a base sequence represented by SEQ ID NO: 1 (for example, a polynucleotide comprising the base sequence of SEQ ID NO: 1). In the base sequence of SEQ ID NO: 1, the base NNN is a codon other than the stop codon described later. In the base sequence of SEQ ID NO: 1 below, each base N is, for example, a base where the base NNN is not a stop codon, and A (adenine), T (thymine), G (guanine), and C (cytosine). Either. As a specific example, the NNN is, for example, TGG.
PEX22遺伝子における部分領域(配列番号1)
5’-GATGGATTANNNTCATGT-3’
Partial region in PEX22 gene (SEQ ID NO: 1)
5'-GATGGATTANNNTCATGT-3 '
前記変異PEX22遺伝子における部分領域は、前記配列番号1の塩基配列において、前記NNNが、ストップコドンである塩基配列である。前記ストップコドンは、特に制限されず、例えば、TAG、TAA、TGA等があげられ、好ましくは、TAGである。 The partial region in the mutant PEX22 gene is a base sequence in which the NNN is a stop codon in the base sequence of SEQ ID NO: 1. The stop codon is not particularly limited, and examples thereof include TAG, TAA, TGA and the like, and preferably TAG.
前記PEX22遺伝子は、例えば、Saccharomyces Genome Database、Genbank等公知のデータベースに登録された塩基配列を参照できる。前記PEX22遺伝子は、例えば、Saccharomyces Genome DatabaseにアクセッションID(SGD ID):S000000051で登録された塩基配列、GenbankにアクセッションNo:DG000037で登録された塩基配列等があげられる。具体例として、前記PEX22遺伝子は、例えば、下記配列番号2の塩基配列からなる(例えば、下記配列番号2の塩基配列からなるポリヌクレオチド)。下記配列番号2の塩基配列は、例えば、酵母(例えば、Saccharomyces cerevisiae)のPEX22遺伝子の全長配列に相当する。下記配列番号2の塩基配列において、下線で示す塩基配列が、前記PEX22遺伝子の部分領域に対応する塩基配列である。下記配列番号2の塩基配列における塩基NNNおよび塩基Nの説明は、例えば、それぞれ、前記配列番号1における塩基NNNおよび塩基Nの説明を援用できる。 For the PEX22 gene, for example, a base sequence registered in a known database such as Saccharomyces Genome Database or Genbank can be referred to. Examples of the PEX22 gene include a base sequence registered under the accession ID (SGD ID): S000000051 in the Saccharomyces Genome Database, a base sequence registered under the accession No: DG000037 in the Genbank, and the like. As a specific example, the PEX22 gene has, for example, a base sequence of SEQ ID NO: 2 below (for example, a polynucleotide having a base sequence of SEQ ID NO: 2 below). The base sequence of SEQ ID NO: 2 below corresponds to, for example, the full-length sequence of the PEX22 gene of yeast (eg, Saccharomyces cerevisiae ). In the base sequence of SEQ ID NO: 2, the base sequence indicated by the underline is a base sequence corresponding to the partial region of the PEX22 gene. For the explanation of base NNN and base N in the base sequence of SEQ ID NO: 2 below, for example, the explanation of base NNN and base N in SEQ ID NO: 1 can be cited, respectively.
PEX22遺伝子(配列番号2)
5’-ATGCCACCACCATCAAGAAGTAGAATAAACAAAACAAGAACATTAGGAATAATGGGTACAGCTATAGCAGTGTTGGTCACGTCCTACTATATATATCAAAAGGTGACAAGTGCAAAGGAAGATAATGGGGCACGACCTCCAGAGGGTGATTCAGTAAAAGAGAACAAAAAGGCAAGGAAGAGCAAATGTATTATAATGAGCAAGTCGATACAAGGACTGCCCATAAAGTGGGAGGAGTACGCCGCTGATGAAGTGGTTTTGCTGGTACCTACGAGCCACACTGATGGATCAATGAAACAAGCCATTGGGGATGCCTTTCGCAAGACGAAAAACGAACACAAAATCATATATTGCGATAGCATGGATGGATTANNNTCATGTGTAAGACGGCTAGGTAAATTTCAGTGCATATTGAACTCCAGGGACTTCACAAGTAGTGGTGGTAGCGATGCAGCAGTTGTTCCTGAAGATATAGGCAGGTTTGTCAAATTTGTTGTTGATAGCGATGTAGAGGATGTGCTGATTGACACTTTATGCAATTAA-3’
PEX22 gene (SEQ ID NO: 2)
5'-ATGCCACCACCATCAAGAAGTAGAATAAACAAAACAAGAACATTAGGAATAATGGGTACAGCTATAGCAGTGTTGGTCACGTCCTACTATATATATCAAAAGGTGACAAGTGCAAAGGAAGATAATGGGGCACGACCTCCAGAGGGTGATTCAGTAAAAGAGAACAAAAAGGCAAGGAAGAGCAAATGTATTATAATGAGCAAGTCGATACAAGGACTGCCCATAAAGTGGGAGGAGTACGCCGCTGATGAAGTGGTTTTGCTGGTACCTACGAGCCACACTGATGGATCAATGAAACAAGCCATTGGGGATGCCTTTCGCAAGACGAAAAACGAACACAAAATCATATATTGCGATAGCATG GATGGATTANNNTCATGT GTAAGACGGCTAGGTAAATTTCAGTGCATATTGAACTCCAGGGACTTCACAAGTAGTGGTGGTAGCGATGCAGCAGTTGTTCCTGAAGATATAGGCAGGTTTGTCAAATTTGTTGTTGATAGCGATGTAGAGGATGTGCTGATTGACACTTTATGCAATTAA-3 '
前記変異PEX22遺伝子は、前記配列番号2の塩基配列において、前記NNNが、ストップコドンである塩基配列である。前記ストップコドンは、特に制限されず、例えば、TAG、TAA、TGA等があげられ、好ましくは、TAGである。 The mutant PEX22 gene is a base sequence in which the NNN is a stop codon in the base sequence of SEQ ID NO: 2. The stop codon is not particularly limited, and examples thereof include TAG, TAA, TGA and the like, and preferably TAG.
前記変異工程における前記変異の導入方法は、特に制限されず、例えば、遺伝子編集技術、遺伝子組換え技術、部位特異的突然変異誘発等の公知の遺伝子工学的手法により実施してもよいし、変異原等を用いる非遺伝子工学的手法により実施してもよい。前記変異の種類は、特に制限されず、例えば、塩基の欠失、置換、挿入、もしくは付加、またはこれらの組合せがあげられる。前記PEX22遺伝子は、例えば、PEX22遺伝子座に座乗する。このため、前記変異工程では、例えば、前記PEX22遺伝子座に座乗するPEX22遺伝子に対して変異を導入する(以下、同様)。前記変異PEX22遺伝子により付与される形質、すなわち、有機酸の生成量の増大は、例えば、劣性形質である。このため、前記親株が一倍体の場合、前記変異工程では、例えば、1つのPEX22遺伝子を変異PEX22遺伝子に変異させる。また、前記親株が二倍体であり、2つのPEX22遺伝子を有する場合、前記変異工程では、例えば、2つのPEX22遺伝子を、2つの変異PEX22遺伝子に変異させる、すなわち、前記変異PEX22遺伝子のホモ接合となるように変異させる。さらに、前記親株が二倍体であり、前記PEX22遺伝子および前記変異PEX22遺伝子をヘテロ接合で有する場合、前記変異工程では、1つのPEX22遺伝子を変異PEX22遺伝子に変異させること、すなわち、前記変異PEX22遺伝子のホモ接合となるように変異させることが好ましい。 The method for introducing the mutation in the mutation step is not particularly limited, and may be performed by, for example, a known genetic engineering technique such as gene editing technique, gene recombination technique, site-directed mutagenesis, or mutation. You may implement by the non-genetic engineering method using a raw material etc. The type of the mutation is not particularly limited, and examples thereof include base deletion, substitution, insertion, or addition, or a combination thereof. The PEX22 gene sits at, for example, the PEX22 gene locus. Therefore, in the mutation step, for example, mutation is introduced into the PEX22 gene seated at the PEX22 locus (the same applies hereinafter). The character imparted by the mutant PEX22 gene, that is, the increase in the amount of organic acid produced is, for example, a recessive character. For this reason, when the parent strain is haploid, in the mutation step, for example, one PEX22 gene is mutated to a mutant PEX22 gene. When the parent strain is diploid and has two PEX22 genes, in the mutation step, for example, two PEX22 genes are mutated into two mutant PEX22 genes, that is, homozygous of the mutant PEX22 genes. Mutate so that Further, when the parent strain is diploid and has the PEX22 gene and the mutant PEX22 gene in a heterozygote, in the mutation step, one PEX22 gene is mutated to a mutant PEX22 gene, that is, the mutant PEX22 gene It is preferable to mutate so as to be homozygous.
前記変異工程は、例えば、前記PEX22遺伝子に変異を導入する変異導入工程と、前記PEX22遺伝子における配列番号1の塩基配列で示される部分領域について、塩基NNNが、ストップコドンである酒酵母株を、有機酸生成酒酵母株として選抜する選抜工程とを含む。前記PEX22遺伝子が前記配列番号2の塩基配列からなる場合、前記選抜工程では、例えば、前記配列番号2の塩基配列における塩基NNNが、ストップコドンである酒酵母株を、前記有機酸生成酒酵母株として選抜してもよい。 The mutation step includes, for example, a mutation introduction step for introducing a mutation into the PEX22 gene, and a liquor yeast strain in which the base NNN is a stop codon in the partial region represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 in the PEX22 gene, And a selection step of selecting as an organic acid-producing liquor yeast strain. When the PEX22 gene consists of the base sequence of SEQ ID NO: 2, in the selection step, for example, a liquor yeast strain in which the base NNN in the base sequence of SEQ ID NO: 2 is a stop codon is used as the organic acid-producing liquor yeast strain You may select as.
前記変異導入工程は、前記PEX22遺伝子に変異を導入する工程である。前記変異導入工程における変異の導入方法は、例えば、前記変異工程における変異の導入方法の説明を援用できる。前記親株が一倍体の場合、前記変異導入工程では、例えば、1つのPEX22遺伝子に変異を導入する。また、前記親株が二倍体であり、2つのPEX22遺伝子を有する場合、前記変異導入工程では、例えば、2つのPEX22遺伝子に変異を導入する。さらに、前記親株が二倍体であり、前記PEX22遺伝子および前記変異PEX22遺伝子をヘテロ接合で有する場合、前記変異導入工程では、例えば、1つのPEX22遺伝子に変異を導入する、または、前記PEX22遺伝子および前記変異PEX22遺伝子に変異を導入する。 The mutation introducing step is a step of introducing a mutation into the PEX22 gene. For the method of introducing a mutation in the mutation introducing step, for example, the description of the method of introducing a mutation in the mutation step can be cited. When the parent strain is haploid, in the mutation introducing step, for example, mutation is introduced into one PEX22 gene. Further, when the parent strain is diploid and has two PEX22 genes, in the mutation introducing step, for example, mutations are introduced into two PEX22 genes. Furthermore, when the parent strain is a diploid and has the PEX22 gene and the mutant PEX22 gene in a heterozygote, in the mutation introduction step, for example, a mutation is introduced into one PEX22 gene, or the PEX22 gene and Mutation is introduced into the mutant PEX22 gene.
つぎに、前記選抜工程では、前記PEX22遺伝子における配列番号1の塩基配列で示される部分領域について、塩基NNNが、ストップコドンである酒酵母株を、有機酸生成酒酵母株として選抜する工程である。前記選抜工程では、例えば、変異が導入された親株について、PEX22遺伝子における部分領域の塩基配列に対応する塩基配列を解読する。そして、前記部分領域の塩基配列に対応する塩基配列における塩基NNNが、例えば、ストップコドンであるか否かを確認することにより実施できる。具体的には、前記親株が一倍体の場合、例えば、1つのPEX22遺伝子における配列番号1の塩基配列で示される部分領域の塩基配列と対応する塩基配列について、塩基NNNが、ストップコドンである酵母株を、有機酸生成酒酵母株として選抜する。また、前記親株が二倍体である場合、例えば、2つのPEX22遺伝子における配列番号1の塩基配列で示される部分領域の塩基配列と対応する塩基配列について、塩基NNNが、両者ともストップコドンである酵母株を有機酸生成酒酵母株として選抜する。 Next, in the selection step, for a partial region represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 in the PEX22 gene, a liquor yeast strain whose base NNN is a stop codon is selected as an organic acid-producing liquor yeast strain. . In the selection step, for example, the base sequence corresponding to the base sequence of the partial region in the PEX22 gene is decoded for the parent strain into which the mutation has been introduced. And it can implement by confirming whether the base NNN in the base sequence corresponding to the base sequence of the said partial region is a stop codon, for example. Specifically, when the parent strain is haploid, for example, in the base sequence corresponding to the base sequence of the partial region represented by the base sequence of SEQ ID NO: 1 in one PEX22 gene, the base NNN is a stop codon. The yeast strain is selected as an organic acid-producing liquor yeast strain. Further, when the parent strain is diploid, for example, in the base sequence corresponding to the base sequence of the partial region represented by the base sequence of SEQ ID NO: 1 in the two PEX22 genes, the base NNN is both a stop codon. A yeast strain is selected as an organic acid-producing liquor yeast strain.
また、前記選抜工程は、例えば、前記PEX22遺伝子の部分領域に代えて、前記PEX22遺伝子の全領域、すなわち、前記配列番号2の塩基配列における塩基NNNに基づき、選抜してもよい。この場合、前記選抜工程では、例えば、変異が導入された親株について、PEX22遺伝子における全領域、すなわち、配列番号2の塩基配列に対応する塩基配列を解読する。そして、前記配列番号2の塩基配列に対応する塩基配列における前記塩基NNNが、例えば、ストップコドンであるか否かを確認することにより実施できる。具体的には、前記親株が一倍体の場合、例えば、1つの配列番号2の塩基配列に対応する塩基配列における塩基NNNが、ストップコドンである酵母株を、有機酸生成酒酵母株として選抜する。また、前記親株が二倍体である場合、例えば、2つの配列番号2の塩基配列に対応する塩基配列における塩基NNNが、両者ともストップコドンである酵母株を有機酸生成酒酵母株として選抜する。 In the selection step, for example, instead of the partial region of the PEX22 gene, selection may be performed based on the entire region of the PEX22 gene, that is, the base NNN in the base sequence of SEQ ID NO: 2. In this case, in the selection step, for example, for the parent strain into which a mutation has been introduced, the entire region in the PEX22 gene, that is, the base sequence corresponding to the base sequence of SEQ ID NO: 2 is decoded. And it can implement by confirming whether the said base NNN in the base sequence corresponding to the base sequence of the said sequence number 2 is a stop codon, for example. Specifically, when the parent strain is haploid, for example, a yeast strain in which the base NNN in the base sequence corresponding to the base sequence of SEQ ID NO: 2 is a stop codon is selected as an organic acid-producing liquor yeast strain. To do. In addition, when the parent strain is diploid, for example, a yeast strain in which the base NNN in the base sequence corresponding to the two base sequences of SEQ ID NO: 2 is both a stop codon is selected as an organic acid-producing liquor yeast strain. .
以上のようにして、有機酸生成酒酵母株を製造できる。 As described above, an organic acid-producing sake yeast strain can be produced.
前記有機酸生成酒酵母株において、生成量が増大される有機酸は、特に制限されず、例えば、生成される有機酸の合計量が、前記親株と比較して、増大されてもよいし、生成される有機酸のうち、一部の有機酸の生成量が、前記親株と比較して、増大されてもよい。具体的に、前記親株と比較して生成量が増大される有機酸は、例えば、リンゴ酸である。また、前記親株と比較して生成量が増大される有機酸は、例えば、コハク酸を含んでもよい。前記親株と比較して生成量が増大される有機酸は、例えば、酢酸を除く。前記リンゴ酸の生成量の増大割合の下限は、特に制限されず、前記親株の生成量に対して、例えば、1.5倍以上、1.8倍以上、2倍以上、3倍以上である。前記リンゴ酸の生成量の増大割合の上限は、特に制限されず、前記親株の生成量に対して、例えば、10倍以下、8倍以下、6倍以下、5.5倍以下である。前記リンゴ酸の生成量の増大割合の範囲は、特に制限されず、前記親株の生成量に対して、例えば、1.5〜10倍、1.8〜6倍、2〜5.5倍である。前記親株として、K−7派生株を用いる場合、前記リンゴ酸の生成量の増大割合の範囲は、特に制限されず、前記親株の生成量に対して、例えば、3〜10倍、3〜6倍、3〜5.5倍である。前記コハク酸の生成量の変化割合は、特に制限されないが、前記親株の生成量に対して、同程度であってもよく、例えば、0.9〜2倍、0.95〜1.8倍、0.95〜1.7倍である。 In the organic acid producing brewer's yeast strain, the organic acid whose production amount is increased is not particularly limited, for example, the total amount of the organic acid produced may be increased as compared with the parent strain, Of the organic acids that are produced, the amount of some organic acids produced may be increased compared to the parent strain. Specifically, the organic acid whose production amount is increased as compared with the parent strain is, for example, malic acid. The organic acid whose production amount is increased as compared with the parent strain may include, for example, succinic acid. The organic acid whose production amount is increased as compared with the parent strain excludes, for example, acetic acid. The lower limit of the increase rate of the malic acid production amount is not particularly limited, and is 1.5 times or more, 1.8 times or more, 2 times or more, 3 times or more, for example, with respect to the production amount of the parent strain. . The upper limit of the increase rate of the production amount of malic acid is not particularly limited, and is, for example, 10 times or less, 8 times or less, 6 times or less, 5.5 times or less with respect to the production amount of the parent strain. The range of the increase rate of the production amount of malic acid is not particularly limited, and is, for example, 1.5 to 10 times, 1.8 to 6 times, or 2 to 5.5 times the production amount of the parent strain. is there. When a K-7 derivative is used as the parent strain, the range of the rate of increase in the amount of malic acid produced is not particularly limited, and is 3 to 10 times, 3 to 6 times the amount of parent strain produced, for example. Times, 3 to 5.5 times. The change rate of the production amount of the succinic acid is not particularly limited, but may be the same as the production amount of the parent strain, for example, 0.9 to 2 times, 0.95 to 1.8 times. 0.95 to 1.7 times.
前記有機酸生成酒酵母株において、例えば、リンゴ酸およびコハク酸以外の有機酸であり、且つ有機酸生成酵母において生成される各種有機酸(例えば、αケトグルタル酸、クエン酸、ピルビン酸、乳酸、フマル酸、ピログルタミン酸)は、例えば、前記親株と比較した場合、その生成量が増大されてもよいし、同程度でもよい。 In the organic acid producing liquor yeast strain, for example, organic acids other than malic acid and succinic acid, and various organic acids produced in organic acid producing yeast (for example, α-ketoglutaric acid, citric acid, pyruvic acid, lactic acid, For example, when compared with the parent strain, fumaric acid and pyroglutamic acid) may be produced in the same amount or at the same level.
前記有機酸生成酒酵母株において、エタノールの生成量の下限は、特に制限されず、前記親株の生成量に対して、例えば、0.9倍以上、0.91倍以上、0.93倍以上、0.94倍以上である。前記エタノールの生成量の上限は、特に制限されず、前記親株の生成量に対して、例えば、1.2倍以下、0.98倍以下、0.97倍以下である。前記エタノールの生成量の範囲は、特に制限されず、前記親株の生成量に対して、例えば、0.9〜1.2倍、0.94〜0.97倍である。 In the organic acid-producing sake yeast strain, the lower limit of the amount of ethanol produced is not particularly limited, and is, for example, 0.9 times or more, 0.91 times or more, 0.93 times or more with respect to the production amount of the parent strain. 0.94 times or more. The upper limit of the production amount of ethanol is not particularly limited, and is, for example, 1.2 times or less, 0.98 times or less, or 0.97 times or less with respect to the production amount of the parent strain. The range of the production amount of ethanol is not particularly limited, and is, for example, 0.9 to 1.2 times and 0.94 to 0.97 times the production amount of the parent strain.
前記有機酸生成酒酵母株は、優れた有機酸生成能を有するため、これを使用することで、例えば、前記親株を使用するよりも、高含量の有機酸を含む発酵産物を得ることができる。 The organic acid-producing brewer's yeast strain has an excellent ability to produce an organic acid. By using this, for example, it is possible to obtain a fermentation product containing a higher content of organic acid than using the parent strain. .
前記発酵産物の種類は、特に制限されず、例えば、原料の種類によって種々の発酵産物を得ることができる。前記原料としては、例えば、コメ類、ムギ類等の穀類、芋類、マメ類等の野菜、ブドウ類等の果実等が原料としてあげられる。前記発酵産物としては、例えば、コメ類を用いた清酒、各種原料を用いた焼酎、ビール、ワイン、原料の一部にコメ等の副原料を用いたビール様飲料(発泡酒、リキュール等)、果実酒、その他酒税法で雑酒に分類される醸造飲料等があげられる。 The type of the fermentation product is not particularly limited. For example, various fermentation products can be obtained depending on the type of raw material. Examples of the raw material include cereals such as rice and wheat, vegetables such as potatoes and beans, fruits such as grapes, and the like. Examples of the fermentation products include sake using rice, shochu using various raw materials, beer, wine, beer-like beverages using auxiliary materials such as rice as part of the raw materials (sparkling liquor, liqueur, etc.), Examples include fruit wine and other brewed beverages that are classified as miscellaneous sake under the Liquor Tax Law.
なお、本発明の酒酵母株の製造方法では、PEX22遺伝子に基づき、有機酸生成酒酵母株を製造したが、例えば、前記有機酸生成酒酵母株は、例えば、後述する本発明の有機酸生成酒酵母株のスクリーニング方法(以下、「スクリーニング方法」ともいう)により製造することもできる。 In the method for producing a liquor yeast strain of the present invention, an organic acid-producing liquor yeast strain was produced based on the PEX22 gene. It can also be produced by a method for screening a sake yeast strain (hereinafter also referred to as “screening method”).
<第1の清酒の製造方法>
本発明の第1の清酒の製造方法(以下、「第1の製造方法」ともいう)は、前述のように、酒酵母株から有機酸生成酒酵母株を作製する作製工程、および前記有機酸生成酒酵母株を用いて、清酒を製造する製造工程を含み、前記作製工程は、前記本発明の有機酸生成酒酵母株の製造方法により実施されることを特徴とする。本発明の第1の製造方法は、前記作製工程が、前記本発明の酒酵母株の製造方法により実施されることが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の第1の製造方法は、例えば、前記本発明の酒酵母株の製造方法の説明を援用できる。本発明の第1の製造方法によれば、例えば、前記変異工程で得られた有機酸生成酒酵母株を使用することによって、親株で清酒を製造した場合と比較して、清酒の有機酸の含有量を増大できる。
<First Sake Production Method>
The first sake production method of the present invention (hereinafter also referred to as “first production method”) includes, as described above, a production step of producing an organic acid-producing sake yeast strain from a sake yeast strain, and the organic acid It includes a production process for producing sake using a produced liquor yeast strain, wherein the production process is carried out by the method for producing an organic acid producing liquor yeast strain of the present invention. The first production method of the present invention is characterized in that the production step is performed by the production method of the sake yeast strain of the present invention, and other steps and conditions are not particularly limited. For the first production method of the present invention, for example, the description of the production method of the sake yeast strain of the present invention can be cited. According to the first production method of the present invention, for example, by using the organic acid-producing sake yeast strain obtained in the mutation step, compared with the case where sake is produced in the parent strain, The content can be increased.
本発明において、清酒は、例えば、アルコールを含むコメ類の発酵液でもよいが、好ましくは、日本国の酒税法(以下、「酒税法」ともいう)で定義される合成清酒または清酒であることが好ましく、酒税法で定義される清酒であることがより好ましい。前記アルコールは、例えば、エタノールである。 In the present invention, the sake may be, for example, a fermented rice product containing alcohol, but is preferably a synthetic sake or sake defined by the Japanese liquor tax law (hereinafter also referred to as “the liquor tax law”). Is preferred, and more preferably sake defined by the Liquor Tax Law. The alcohol is, for example, ethanol.
前記作製工程は、酒酵母株から有機酸生成酒酵母株を作製する工程である。前記作製工程は、例えば、前記本発明の酒酵母株の製造方法の説明を援用できる。本発明の第1の製造方法は、例えば、前記作製工程で得られた有機酸生成酒酵母株をすぐに前記製造工程に用いてもよいし、前記有機酸生成酒酵母株を保存し、保存後の有機酸生成酒酵母株を前記製造工程に用いてもよい。また、前記有機酸生成酒酵母株を増殖させた後、増殖後の有機酸生成酒酵母株を前記製造工程に用いてもよい。 The production step is a step of producing an organic acid-producing sake yeast strain from the sake yeast strain. For the production step, for example, the description of the method for producing a sake yeast strain of the present invention can be used. In the first production method of the present invention, for example, the organic acid-producing sake yeast strain obtained in the production step may be used immediately in the production step, or the organic acid-producing sake yeast strain is stored and stored. Later organic acid-producing liquor yeast strains may be used in the production process. Further, after the organic acid-producing liquor yeast strain is grown, the organic acid-producing liquor yeast strain after the growth may be used in the production process.
前記製造工程は、前記有機酸生成酒酵母株を用いて、清酒を製造する工程である。前記製造工程は、例えば、前記有機酸生成酒酵母株により、原料を発酵させる発酵工程を含む。前記原料は、例えば、コメ類である。前記発酵の条件は、特に制限されず、例えば、従来の酵母による発酵条件と同様の条件を採用できる。前記製造工程では、さらに、有機酸生成酒酵母株以外の酒酵母株を用いてもよい。前記有機酸生成酒酵母株以外の酒酵母株は、例えば、前述の清酒醸造用酵母の説明が援用でき、好ましくは、5’,5’,5’-トリフルオロロイシン耐性が付与され、酢酸イソアミルの生成量が増大した清酒醸造用酵母である。このように、複数の酒酵母株を用いることにより、混合醸造を実施できる。 The production process is a process for producing sake using the organic acid-producing sake yeast strain. The manufacturing process includes, for example, a fermentation process in which the raw material is fermented with the organic acid-producing sake yeast strain. The raw material is, for example, rice. The conditions for the fermentation are not particularly limited, and for example, the same conditions as those for conventional yeast fermentation can be employed. In the production process, a sake yeast strain other than the organic acid-producing sake yeast strain may be used. For the sake yeast strains other than the organic acid-producing sake yeast strain, for example, the description of the aforementioned sake brewing yeast can be used, and preferably 5 ', 5', 5'-trifluoroleucine resistance is imparted and isoamyl acetate is provided. This is a sake brewer's yeast with an increased production amount. Thus, mixed brewing can be carried out by using a plurality of sake yeast strains.
前記製造工程は、例えば、前記清酒を混合する工程を含んでもよい。前記清酒の混合は、例えば、異なる酒酵母株を用いて製造(醸造)したそれぞれの清酒を混合することを意味するが、前述の複数の酒酵母株を併用して製造(混合醸造)することを意味してもよい。前記清酒の混合の時期は、特に制限されず、例えば、醪を上槽する前に混合してもよいし、上槽後に混合してもよい。前記清酒の混合の割合は、特に制限されず、前記有機酸生成酒酵母株で製造した清酒と、他の清酒との総量を100%とした場合、前記有機酸生成酒酵母株で製造した清酒の割合の下限は、例えば、0.01%、0.03%、0.1%、0.3%、1%、3%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、もしくは90%である。前記有機酸生成酒酵母株で製造した清酒の割合は、例えば、前記下限値の例示における2つの数値を両端とする数値範囲を満たしてもよい。また、前記清酒の混合が混合醸造の場合、醸造開始時の前記有機酸生成酒酵母株と、前記有機酸生成酒酵母株以外の酒酵母株の植菌(接種)割合を、前記清酒の混合の割合を満たすように、設定してもよい。 The manufacturing process may include, for example, a process of mixing the sake. Mixing of the sake means, for example, mixing each sake produced (brewed) using different sake yeast strains, but producing (mixed brewing) using the aforementioned plurality of sake yeast strains in combination. May mean. The timing of mixing the sake is not particularly limited. For example, the sake may be mixed before the koji is added to the upper tank or may be mixed after the upper tank. The mixing ratio of the sake is not particularly limited. When the total amount of sake produced with the organic acid-producing sake yeast strain and other sake is 100%, the sake produced with the organic acid-producing sake yeast strain. The lower limit of the ratio of, for example, 0.01%, 0.03%, 0.1%, 0.3%, 1%, 3%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60 %, 70%, 80%, or 90%. The ratio of sake produced with the organic acid-producing liquor yeast strain may satisfy, for example, a numerical range having two numerical values in the example of the lower limit as both ends. Moreover, when the mixing of the sake is mixed brewing, the inoculation (inoculation) ratio of the organic acid-producing sake yeast strain at the start of brewing and a sake yeast strain other than the organic acid-producing sake yeast strain is determined by mixing the sake. You may set so that the ratio of may be satisfy | filled.
前記製造工程は、例えば、前記原料の発酵で得られた醪を上糟する上糟工程を含む。前記上糟の条件は、特に制限されず、例えば、一般的な清酒の製造における上糟の条件と同様の条件を採用できる。 The manufacturing process includes, for example, an upper koji process for koji obtained from fermentation of the raw material. The upper koji conditions are not particularly limited, and for example, the same conditions as the upper koji conditions in general sake production can be employed.
前記製造工程は、例えば、前記上糟後の清酒について、火入れ(加熱処理)する火入れ工程を含んでもよい。前記加熱処理の条件は、特に制限されず、例えば、一般的な清酒の製造における加熱処理の条件と同様の条件を採用できる。前記火入れ工程は、例えば、前記上糟工程後、後述する容器詰め工程前等に実施する。前記火入れの回数は、特に制限されず、例えば、1回以上であり、具体例として、1回または2回である。前記容器詰め工程前のみに火入れを1回のみ行ったものは、例えば、「生貯蔵酒」、前記上槽工程後に火入れを1回のみおこなったものは、例えば、「生詰め」(ひやおろし)ということができる(酒税法にかかる清酒の製法品質表示基準(平成元年11月22日付国税庁告示第8号、改正 平成29年 国税庁告示第4号))。また、前記製造工程において、前記火入れ工程を実施しない場合、前記清酒は、例えば、「生酒」ということができる(前記酒税法にかかる清酒の製法品質表示基準)。 The manufacturing process may include, for example, a firing process for firing (heat treatment) the sake after the top koji. The conditions for the heat treatment are not particularly limited, and for example, the same conditions as the heat treatment conditions in general sake production can be employed. The firing process is performed, for example, after the upper potting process and before the container filling process described later. The number of times of firing is not particularly limited, and is, for example, one or more times, and as a specific example, once or twice. For example, “freshly stored liquor” is one that has been lit only once before the container stuffing step, and “raw stuffed” is one that has been lit only once after the upper tank step, for example. (Sake liquor quality indication standards for sake tax law (National Tax Agency notification No. 8 dated November 22, 1989, revised 2017 National Tax Agency notification No. 4)). Moreover, in the said manufacturing process, when not performing the said burning process, the said sake can be called "raw sake", for example (the manufacturing quality display standard of the sake concerning the said liquor tax law).
前記製造工程後の清酒は、例えば、吟醸香として知られている成分である酢酸イソアミルを含む。前記製造工程後の清酒における酢酸イソアミルの濃度の下限値は、特に制限されず、例えば、0.03、0.1、0.3、1、3、5、10、20、30、50、100mg/Lである。前記酢酸イソアミルの濃度は、例えば、前記下限値の例示における2つの数値を両端とする数値範囲を満たしてもよい。前記製造工程後の清酒における酢酸イソアミルの濃度は、例えば、前記酒酵母株の種類を変更することにより、具体的には、酢酸イソアミルの生成能が異なる酒酵母株を用いることにより、調整できる。 The sake after the production process includes, for example, isoamyl acetate, which is a component known as Ginjo Aroma. The lower limit of the concentration of isoamyl acetate in sake after the production process is not particularly limited, and is, for example, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3, 5, 10, 20, 30, 50, 100 mg. / L. The concentration of isoamyl acetate may satisfy, for example, a numerical range having two numerical values in the example of the lower limit as both ends. The concentration of isoamyl acetate in sake after the production process can be adjusted, for example, by changing the type of the liquor yeast strain, specifically, by using a liquor yeast strain having a different ability to produce isoamyl acetate.
本発明の第1の製造方法は、さらに、前記清酒を容器に充填する充填工程を含むことが好ましい。本発明の第1の製造方法が前記充填工程を含む場合、容器詰めされた清酒を製造することができる。このため、本発明の第1の製造方法は、例えば、「容器詰め清酒の製造方法」ということもできる。前記容器は、特に制限されず、例えば、ガラス瓶、ガラス製コップ等のガラス容器;アルミ缶等の金属容器;凸版印刷社製清酒用紙パック容器、大日本印刷社製の清酒用紙パック容器等のアルコール飲料用紙パック;凸版印刷社製パウチ容器またはボトル容器、大日本印刷社製パウチ容器またはボトル容器等の複合プラスチック容器等があげられる。前記容器には、例えば、前述の「生酒」、「生貯蔵酒」、または「ひやおろし」等が表示されてもよい。そして、前記容器への充填後、例えば、前記容器の開口を封止することにより密封する。 It is preferable that the 1st manufacturing method of this invention further includes the filling process which fills the said sake with a container. When the 1st manufacturing method of this invention includes the said filling process, the sake packed in the container can be manufactured. For this reason, the 1st manufacturing method of this invention can also be called "the manufacturing method of containerized sake." The container is not particularly limited. For example, glass containers such as glass bottles and glass cups; metal containers such as aluminum cans; alcohol such as sake paper pack containers manufactured by Toppan Printing Co., sake paper pack containers manufactured by Dai Nippon Printing Co., Ltd. Beverage paper packs: Pouch containers or bottle containers manufactured by Toppan Printing Co., Ltd., composite plastic containers such as pouch containers or bottle containers manufactured by Dai Nippon Printing Co., Ltd., and the like. In the container, for example, the above-mentioned “raw sake”, “raw stored liquor”, or “Hiya-Goshi” may be displayed. Then, after filling the container, for example, the container is sealed by sealing the opening of the container.
このようにして、清酒を製造できる。 In this way, sake can be produced.
<有機酸生成酒酵母株>
本発明の有機酸生成酒酵母株は、そのPEX22遺伝子における配列番号1の塩基配列で示される部分領域について、塩基NNNがストップコドンである変異PEX22遺伝子を含むことを特徴とする。本発明の有機酸生成酒酵母株は、そのPEX22遺伝子における配列番号1の塩基配列で示される部分領域について、塩基NNNがストップコドンである変異PEX22遺伝子を含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の有機酸生成酒酵母株は、例えば、PEX22遺伝子以外が同一である酵母と比較した場合、発酵力を維持し且つより優れた有機酸生成能を示す。本発明の有機酸生成酒酵母株は、例えば、前記本発明の酒酵母株の製造方法または後述の本発明のスクリーニング方法により製造できる。本発明の有機酸生成酒酵母株は、例えば、前記本発明の酒酵母株の製造方法、第1の製造方法およびスクリーニング方法の説明を援用できる。
<Organic acid producing liquor yeast strain>
The organic acid-producing liquor yeast strain of the present invention is characterized in that a partial region represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 in the PEX22 gene contains a mutant PEX22 gene having a base NNN as a stop codon. The organic acid-producing liquor yeast strain of the present invention is characterized in that the partial region represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 in the PEX22 gene contains a mutant PEX22 gene having a base NNN as a stop codon. Conditions are not particularly limited. The organic acid-producing liquor yeast strain of the present invention maintains fermenting power and exhibits a more excellent organic acid-producing ability when compared with, for example, yeasts other than the PEX22 gene. The organic acid-producing liquor yeast strain of the present invention can be produced, for example, by the above-described method for producing a liquor yeast strain of the present invention or the screening method of the present invention described later. For the organic acid-producing liquor yeast strain of the present invention, for example, the description of the production method, the first production method and the screening method of the liquor yeast strain of the present invention can be cited.
前記変異PEX22遺伝子は、例えば、前記配列番号1の塩基配列からなり、且つ前記配列番号1の塩基配列における塩基NNNが、ストップコドンであるポリヌクレオチドということもできる。 The mutant PEX22 gene can also be referred to as a polynucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 1 and the base NNN in the base sequence of SEQ ID NO: 1 being a stop codon, for example.
本発明において、前記変異PEX22遺伝子は、例えば、配列番号2の塩基配列からなり且つ前記配列番号2の塩基配列における塩基NNNが、ストップコドンであるポリヌクレオチドであってもよい。 In the present invention, the mutant PEX22 gene may be, for example, a polynucleotide comprising the base sequence of SEQ ID NO: 2 and the base NNN in the base sequence of SEQ ID NO: 2 being a stop codon.
本発明の有機酸生成酒酵母株において、例えば、前記変異PEX22遺伝子は、そのPEX22遺伝子が、配列番号3のアミノ酸配列からなるペプチドからなる変異PEX22タンパク質をコードする変異PEX22遺伝子であってもよい。 In the organic acid-producing sake yeast strain of the present invention, for example, the mutant PEX22 gene may be a mutant PEX22 gene that encodes a mutant PEX22 protein comprising a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
変異PEX22タンパク質(配列番号3)
MPPPSRSRINKTRTLGIMGTAIAVLVTSYYIYQKVTSAKEDNGARPPEGDSVKENKKARKSKCIIMSKSIQGLPIKWEEYAADEVVLLVPTSHTDGSMKQAIGDAFRKTKNEHKIIYCDSMDGL
Mutant PEX22 protein (SEQ ID NO: 3)
MPPPSRSRINKTRTLGIMGTAIAVLVTSYYIYQKVTSAKEDNGARPPEGDSVKENKKARKSKCIIMSKSIQGLPIKWEEYAADEVVLLVPTSHTDGSMKQAIGDAFRKTKNEHKIIYCDSMDGL
本発明の有機酸生成酒酵母株が一倍体の場合、前記有機酸生成酒酵母株は、例えば、1つの変異PEX22遺伝子を有する。また、本発明の有機酸生成酒酵母株が二倍体の場合、前記有機酸生成酒酵母株は、例えば、2つの変異PEX22遺伝子を有する、すなわち、未変異(野生型)のPEX22遺伝子を有さない。 When the organic acid-producing sake yeast strain of the present invention is haploid, the organic acid-producing sake yeast strain has, for example, one mutant PEX22 gene. Further, when the organic acid-producing sake yeast strain of the present invention is diploid, the organic acid-producing sake yeast strain has, for example, two mutant PEX22 genes, that is, an unmutated (wild-type) PEX22 gene. No.
<第2の清酒の製造方法>
本発明の第2の清酒の製造方法(以下、「第2の製造方法」ともいう)は、前記本発明の有機酸生成酒酵母株を用いて、清酒を製造する製造工程を含むことを特徴とする。本発明の第2の清酒の製造方法は、前記本発明の有機酸生成酒酵母株を用いることが特徴であって、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の第2の製造方法は、前記本発明の有機酸生成酒酵母株を使用することによって、親株で清酒を製造した場合と比較して、清酒の有機酸の含有量を増大できる。本発明の第2の製造方法は、例えば、前記本発明の酒酵母株の製造方法、第1の製造方法および有機酸生成酒酵母株の説明を援用できる。
<Method for producing second sake>
The second method for producing sake of the present invention (hereinafter also referred to as “second production method”) includes a production process for producing sake using the organic acid-producing sake yeast strain of the present invention. And The second method for producing sake of the present invention is characterized by using the organic acid-producing sake yeast strain of the present invention, and the other steps and conditions are not particularly limited. The 2nd manufacturing method of this invention can increase content of the organic acid of sake by using the organic acid production | generation liquor yeast strain | stump | stock of the said invention compared with the case where sake is manufactured with a parent strain. In the second production method of the present invention, for example, the description of the production method of the liquor yeast strain of the present invention, the first production method and the organic acid-producing liquor yeast strain can be cited.
本発明の第2の製造方法は、例えば、前記本発明の有機酸生成酒酵母株により、原料を発酵させる工程を含む。前記原料は、例えば、コメ類であり、発酵の条件は、特に制限されず、従来の酵母による発酵条件と同様の条件が採用できる。前記製造工程は、例えば、前記本発明の第1の製造方法における製造工程の説明を援用できる。また、本発明の第2の製造方法は、例えば、前述の充填工程を含んでもよい。 The 2nd manufacturing method of this invention includes the process of fermenting a raw material with the organic acid production | generation liquor yeast strain | stump | stock of this invention, for example. The raw material is, for example, rice, and the fermentation conditions are not particularly limited, and the same conditions as the conventional fermentation conditions using yeast can be employed. For the manufacturing process, for example, the description of the manufacturing process in the first manufacturing method of the present invention can be cited. Moreover, the 2nd manufacturing method of this invention may also include the above-mentioned filling process, for example.
<有機酸生成酒酵母株のスクリーニング方法>
本発明の有機酸生成酒酵母株のスクリーニング方法は、酒酵母株を、生存率0.01〜90%となるように変異原を用いて処理する変異工程と、
前記変異処理後の酒酵母株から、下記条件(1)および(2)を満たす酒酵母株を、有機酸生成酒酵母株として選択する選択工程とを含むことを特徴とする。
(1)変異原を用いて処理する前と比較して、アルコール生成量が0.9〜1.2倍である。
(2)変異原を用いて処理する前と比較して、リンゴ酸生成量が1.5〜10倍である。
<Screening method for organic acid-producing liquor yeast strain>
The organic acid-producing liquor yeast screening method of the present invention includes a mutation step of treating a liquor yeast strain with a mutagen so that the survival rate is 0.01 to 90%.
And a selection step of selecting, as an organic acid-producing liquor yeast strain, a liquor yeast strain satisfying the following conditions (1) and (2) from the mutant yeast strain after the mutation treatment.
(1) The amount of alcohol produced is 0.9 to 1.2 times that before treatment with a mutagen.
(2) The amount of malic acid produced is 1.5 to 10 times that before treatment with the mutagen.
本発明のスクリーニング方法によれば、前記変異処理を施す前の酵母株(以下、「親株」ともいう)と比較して、十分な発酵力を維持し且つ有機酸生成能に優れる酒酵母株、すなわち、本発明の有機酸生成酒酵母株を得ることができる。本発明の有機酸生成酒酵母株が得られることから、例えば、有機酸生成酒酵母株の製造方法ということもできる。 According to the screening method of the present invention, compared with a yeast strain before the mutation treatment (hereinafter also referred to as “parent strain”), a liquor yeast strain that maintains sufficient fermentative power and is excellent in organic acid-producing ability, That is, the organic acid-producing sake yeast strain of the present invention can be obtained. Since the organic acid-producing sake yeast strain of the present invention is obtained, it can also be referred to as, for example, a method for producing an organic acid-producing sake yeast strain.
前記変異工程において、前記変異原は、例えば、エチルメタンスルホン酸(EMS)、N−メチル−N−ニトロ−N−ニトロソグアニジン、亜硝酸、アクリジン系色素等があげられ、好ましくは、EMSである。また、前記変異は、例えば、UV照射、各種イオンビーム、各種放射線照射等によって、誘発してもよい。 In the mutation step, examples of the mutagen include ethylmethanesulfonic acid (EMS), N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine, nitrous acid, acridine dye, and the like, and preferably EMS. . The mutation may be induced by, for example, UV irradiation, various ion beams, various radiation irradiations, and the like.
前記変異工程において、前記変異原による変異処理の方法は、特に制限されず、例えば、前記変異原の存在下で、前記親株をインキュベートすればよく、具体的には、前記変異原を含有する溶媒中で、前記親株をインキュベートすればよい。前記溶媒の種類は、特に制限されず、例えば、緩衝液、培地等があげられる。前記溶媒中の前記変異原の濃度は、特に制限されず、例えば、0.1%〜10%である。前記変異処理の条件は、特に制限されず、処理温度は、例えば、4〜50℃であり、処理時間は、例えば、0.5〜360分である。 In the mutation step, the method of mutagenesis treatment with the mutagen is not particularly limited, and for example, the parent strain may be incubated in the presence of the mutagen. Specifically, the solvent containing the mutagen Inside, the parent strain may be incubated. The kind of the solvent is not particularly limited, and examples thereof include a buffer solution and a medium. The concentration of the mutagen in the solvent is not particularly limited and is, for example, 0.1% to 10%. The conditions for the mutation treatment are not particularly limited, and the treatment temperature is, for example, 4 to 50 ° C., and the treatment time is, for example, 0.5 to 360 minutes.
前記変異工程においては、生存率は、0.01〜90%に設定し、好ましくは、0.01〜50%、0.1〜40%、0.5〜40%、1〜30%、5〜30%に設定する。前記生存率を前記範囲に設定する方法は、特に制限されず、例えば、変異処理の時間によって調整してもよいし、前記変異原の量によって調整してもよいし、処理温度によって調整してもよく、中でも、経時変化により、生存率をモニターすることが好ましい。 In the mutation step, the survival rate is set to 0.01 to 90%, preferably 0.01 to 50%, 0.1 to 40%, 0.5 to 40%, 1 to 30%, 5 Set to ~ 30%. The method for setting the survival rate within the range is not particularly limited, and may be adjusted according to the time of the mutation treatment, may be adjusted depending on the amount of the mutagen, or may be adjusted depending on the treatment temperature. In particular, it is preferable to monitor the survival rate according to changes over time.
本発明における前記生存率とは、前記変異処理に供する全親株のうち、前記変異処理後にも生存する親株の割合を意味する。本発明においては、例えば、以下の方法により、前記生存率を算出できる。まず、親株の混合液を準備し、前記混合液のうち所定量Yを下記培養条件Aで培養し、得られた生存コロニー数X0を100%とする。そして、前記混合液のうち同量Yについて、前記変異処理を施した後、同じ培養条件Aで培養し、得られた生存コロニー数X1の割合(100×[X1/X0])を、生存率%とする。前記培養条件は、例えば、以下の通りである。
培地:YPD寒天培地、YPD培地に相当する栄養源豊富な培地、YM寒天培地(独立行政法人製品評価技術基盤機構推奨培地、http://www.nite.go.jp/nbrc/cultures/cultures/cultures.html:平成27年7月14日付)
培養温度:30℃前後(例えば、25℃±7℃)
培養時間:数日間(例えば、1〜10日間)
培養方法:静置培養
生存率の調整方法:EMS処理中に、前記混合液から数分ごとにサンプリングし、前記条件で培養を行い、目的となる生存率のものを選択する。
The said survival rate in this invention means the ratio of the parent strain which survives after the said mutation treatment among all the parent strains used for the said mutation treatment. In the present invention, for example, the survival rate can be calculated by the following method. First, was prepared a mixture of the parent strain, a predetermined amount Y of the mixed solution was cultivated in the following culture conditions A, the surviving colonies number X 0 obtained is 100%. Then, the same amount Y of the mixed liquid, after being subjected to the mutation treatment, and cultured under the same culture conditions A, the ratio of the resultant viable colony count X 1 a (100 × [X 1 / X 0]) Let the survival rate be%. The culture conditions are, for example, as follows.
Medium: YPD agar medium, medium rich in nutrient sources equivalent to YPD medium, YM agar medium (Recommended medium for product evaluation technology foundation, http://www.nite.go.jp/nbrc/cultures/cultures/ cultures.html: July 14, 2015)
Culture temperature: around 30 ° C. (for example, 25 ° C. ± 7 ° C.)
Incubation time: several days (for example, 1 to 10 days)
Culturing method: Method for adjusting stationary culture survival rate: During the EMS treatment, sampling is performed every few minutes from the mixed solution, culturing is performed under the above-described conditions, and a target survival rate is selected.
生存率の測定において、前記変異処理後の親株は、例えば、洗浄処理を施した後、培養を行うことが好ましい。前記洗浄方法は、特に制限されず、例えば、滅菌水等の滅菌溶媒で洗浄する方法があげられる。 In the measurement of the survival rate, it is preferable that the parent strain after the mutation treatment is cultured after, for example, washing treatment. The washing method is not particularly limited, and examples thereof include a method of washing with a sterilizing solvent such as sterilized water.
前記変異処理工程後、前記変異処理した酒酵母株(親株)を培養し、生存した酒酵母株を採取する工程を含んでもよい。前記培養の方法および条件は、特に制限されないが、例えば、前述した生存率の測定方法における培養の方法および条件が例示できる。また、前記変異処理した親株は、例えば、前記培養に先立って、例えば、滅菌水等の滅菌溶媒で洗浄することが好ましい。 After the mutation treatment step, a step of culturing the mutation-treated sake yeast strain (parent strain) and collecting a surviving sake yeast strain may be included. The culture method and conditions are not particularly limited, and examples thereof include the culture method and conditions in the above-described method for measuring the survival rate. Moreover, it is preferable to wash the mutated parent strain with, for example, a sterilizing solvent such as sterilized water prior to the culturing.
前記選択工程は、前記変異工程によって得られた酒酵母株から、前記条件(1)および(2)を満たす酒酵母株を選択する工程である。前記変異工程によって得られた酒酵母株とは、例えば、前記変異処理した親株のうち、前記変異処理後の培養によって生存を示した酒酵母株である(以下、変異酵母株ともいう)。 The selection step is a step of selecting a sake yeast strain that satisfies the conditions (1) and (2) from the sake yeast strain obtained by the mutation step. The liquor yeast strain obtained by the mutation step is, for example, a liquor yeast strain that has survived in the culture after the mutation treatment, among the parent strains subjected to the mutation treatment (hereinafter also referred to as mutant yeast strain).
前記変異酵母株からの前記条件(1)および(2)の条件を満たす酒酵母株の選択は、例えば、以下のようにして行うことができる。すなわち、まず、前記変異処理を施す前の前記親株について、所定の条件下、コメ原料のアルコール発酵を行い、得られた発酵産物中のアルコールおよびリンゴ酸を測定する。そして、前記変異処理によって得られた前記変異酵母株について、同様の条件でアルコール発酵を行い、得られた発酵産物中のアルコールおよびリンゴ酸を測定する。そして、前記親株を用いた発酵産物中のアルコールおよびリンゴ酸の生成量と、前記変異酵母株を用いた発酵産物中のアルコールおよびリンゴ酸の生成量とを比較する。そして、前記条件(1)および(2)を満たす変異酵母株を、本発明の有機酸生成酒酵母株として選択することができる。前記アルコールとは、例えば、エタノールである。前記アルコールの生成量およびリンゴ酸の生成量は、例えば、それぞれ、前述のエタノールの生成量およびリンゴ酸の生成量の増大割合の説明を援用できる。 Selection of the liquor yeast strain satisfying the conditions (1) and (2) from the mutant yeast strain can be performed, for example, as follows. That is, first, with respect to the parent strain before the mutation treatment, alcohol fermentation of rice raw material is performed under predetermined conditions, and alcohol and malic acid in the obtained fermentation product are measured. And about the mutant yeast strain obtained by the said mutation process, alcohol fermentation is performed on the same conditions, and the alcohol and malic acid in the obtained fermentation product are measured. And the production amount of alcohol and malic acid in the fermentation product using the parent strain is compared with the production amount of alcohol and malic acid in the fermentation product using the mutant yeast strain. And the mutant yeast strain which satisfy | fills the said conditions (1) and (2) can be selected as an organic acid production | generation liquor yeast strain | stump | stock of this invention. The alcohol is, for example, ethanol. For the production amount of the alcohol and the production amount of malic acid, for example, the description of the increase rate of the production amount of ethanol and the production amount of malic acid can be cited, respectively.
前記選択工程では、例えば、さらに、下記(3)を満たす酒酵母株を、有機酸生成酒酵母株として選択してもよい。
(3)変異原を用いて処理する前と比較して、コハク酸生成量が0.9〜2倍である。
In the selection step, for example, a sake yeast strain that satisfies the following (3) may be selected as an organic acid-producing sake yeast strain.
(3) The amount of succinic acid produced is 0.9 to 2 times that before treatment with the mutagen.
前記変異酵母株からの前記条件(3)の条件を満たす酒酵母株の選択は、例えば、以下のようにして行なうことができる。すなわち、まず、前記条件(1)および(2)を満たす酒酵母株の選択と同様の条件において得られた発酵産物中のコハク酸を測定し、前記親株を用いた発酵産物中のコハク酸と、前記変異酵母株を用いた発酵産物中のコハク酸とを比較する。そして、前記条件(1)および(2)に加え、条件(3)を満たす変異酵母株を、本発明の有機酸生成酒酵母株として選択することができる。前記コハク酸の生成量は、例えば、前述のコハク酸の生成量の変化割合の説明を援用できる。 Selection of the liquor yeast strain satisfying the condition (3) from the mutant yeast strain can be performed, for example, as follows. That is, first, succinic acid in the fermentation product obtained under the same conditions as the selection of the liquor yeast strain satisfying the conditions (1) and (2) is measured, and succinic acid in the fermentation product using the parent strain The succinic acid in the fermentation product using the mutant yeast strain is compared. And the mutant yeast strain which satisfy | fills conditions (3) in addition to said conditions (1) and (2) can be selected as an organic acid production | generation liquor yeast strain | stump | stock of this invention. For the production amount of the succinic acid, for example, the description of the change rate of the production amount of the succinic acid described above can be cited.
本発明において、前記有機酸生成酒酵母株の選択は、前記親株を使用した生成量に対する前記変異処理株を使用した生成量の倍率により判断できることから、前記親株と前記変異処理株とにおける前記アルコール発酵は、例えば、同条件であればよく、その方法は、特に制限されない。 In the present invention, the selection of the organic acid-producing brewer's yeast strain can be determined by multiplying the production amount using the mutation-treated strain with respect to the production amount using the parent strain. Therefore, the alcohol in the parent strain and the mutation-treated strain is used. For example, the fermentation may be performed under the same conditions, and the method is not particularly limited.
前記コメ原料のアルコール発酵は、例えば、コメを含む仕込み液を使用できる。前記仕込み液は、例えば、1トンスケール程度の大型仕込みでも、小仕込みでもよく、前記小仕込みで調製されていることが好ましい。 For the alcohol fermentation of the rice raw material, for example, a feed solution containing rice can be used. The feed liquid may be, for example, a large charge of about 1 ton scale or a small charge, and is preferably prepared by the small charge.
前記小仕込みは、特に制限されず、例えば、一段仕込みでもよく、三段仕込みでもよい。また、前記仕込みに使用するコメの総量、すなわち総米は、例えば、10gから1kg程度が例示できる。使用するコメの種類は、特に制限されず、例えば、酒造好適米でもよいし、コシヒカリ等の飯米等でもよい。また、前記コメの精米歩合は、特に制限されず、例えば、60〜85%である。また、前記仕込み液の調製においては、例えば、乳酸を仕込み時に添加することが好ましい。仕込み時には、例えば、前記総米に、掛米、麹米、汲水、乳酸および酵母を加えて、発酵を開始することが好ましい。 The small preparation is not particularly limited, and may be one-stage preparation or three-stage preparation, for example. In addition, the total amount of rice used for the preparation, that is, the total rice can be exemplified by about 10 g to 1 kg, for example. The kind of rice to be used is not particularly limited, and may be, for example, sake-brewed rice or rice such as Koshihikari. Moreover, the rice polishing rate of the rice is not particularly limited, and is, for example, 60 to 85%. Moreover, in preparation of the said preparation liquid, it is preferable to add lactic acid at the time of preparation, for example. At the time of preparation, for example, it is preferable to start fermentation by adding, to, for example, the above-mentioned total rice, rice cake, rice bran, pumped water, lactic acid and yeast.
前記仕込み液に対する被検酵母株(前記変異処理株または前記親株)の添加量は、特に制限されず、例えば、前記仕込み液中の最終濃度が、10の6乗〜10の7乗cells/mL程度であればよい。 The addition amount of the test yeast strain (the mutation-treated strain or the parent strain) to the preparation solution is not particularly limited. For example, the final concentration in the preparation solution is 10 6 to 10 7 cells / mL. Any degree is acceptable.
前記アルコール発酵の発酵工程は、例えば、温度一定で管理してもよいし、適宜温度調整してもよく、具体例として、例えば、4℃〜20℃で温度調整を行うことが好ましい。発酵期間は、特に限定されず、例えば、10日〜25日程度が好ましい。 The fermentation process of the alcohol fermentation may be managed at a constant temperature, for example, or may be adjusted as appropriate. For example, it is preferable to adjust the temperature at 4 ° C. to 20 ° C., for example. The fermentation period is not particularly limited, and is preferably about 10 to 25 days, for example.
前記発酵産物中のアルコール、有機酸(リンゴ酸およびコハク酸)の生成量の測定方法および発酵経過に伴う炭酸ガスの生成量の測定は、特に制限されず、従来の方法や機器が使用できる。前記機器としては、アルコール生成量の測定には、例えば、市販のアルコール濃度計(例えば、商品名アルコメイトAL−3、ウッドソン社)等が使用でき、前記有機酸生成量の測定には、例えば、汎用HPLC、具体的には、例えば、汎用HPLCシステム(例えば、商品名LCsolutionで制御されたHPLCシステム、島津製作所社製)が使用でき、前記炭酸ガス生成量の測定には、例えば、ガス発生量自動計測装置(例えば、商品名ファーモグラフ、アトー社製)等があげられる。前記アルコール発酵の終了後、前記発酵産物におけるアルコール(例えば、エタノール)、日本酒度、酸度、アミノ酸度は、例えば、市販の汎用機器を用いて測定することができ、具体例として、国税庁が定める所定分析法(国税庁訓令第1号、改正平19国税庁訓令第6号、http://www.nta.go.jp/shiraberu/zeiho-kaishaku/tsutatsu/kobetsu/sonota/kaisei070622/01.pdf:平成27年7月15日付)に従うことが好ましく、また、それに準じた方法でもよい。 The method for measuring the production amount of alcohol and organic acids (malic acid and succinic acid) in the fermentation product and the measurement of the production amount of carbon dioxide gas accompanying the fermentation process are not particularly limited, and conventional methods and equipment can be used. As the instrument, for example, a commercially available alcohol concentration meter (for example, trade name Alcomate AL-3, Woodson) or the like can be used to measure the amount of alcohol produced. General-purpose HPLC, specifically, for example, a general-purpose HPLC system (for example, an HPLC system controlled by the trade name LCsolution, manufactured by Shimadzu Corporation) can be used. Examples thereof include an automatic quantity measuring device (for example, trade name “Pharmograph” manufactured by Ato Inc.). After completion of the alcohol fermentation, alcohol (for example, ethanol), sake degree, acidity, and amino acid degree in the fermentation product can be measured using, for example, a commercially available general-purpose device. Analysis method (National Tax Agency Directive No. 1, revised Heisei 19 National Tax Agency Directive No. 6, http://www.nta.go.jp/shiraberu/zeiho-kaishaku/tsutatsu/kobetsu/sonota/kaisei070622/01.pdf: 2015 It is preferable to follow the date of July 15, 2015, or a method according to that may be used.
<変異PEX22遺伝子>
本発明の変異PEX22遺伝子は、前述のように、PEX22遺伝子における配列番号1の塩基配列で示される部分領域において、塩基NNNが、ストップコドンであることを特徴とする。本発明の変異PEX22遺伝子は、前記PEX22遺伝子における配列番号1の塩基配列で示される部分領域において、塩基NNNが、ストップコドンであることが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の変異PEX22遺伝子は、例えば、前記本発明の酒酵母株の製造方法、第1の製造方法、有機酸生成酒酵母株、第2の製造方法、およびスクリーニング方法の説明を援用できる。
<Mutant PEX22 gene>
As described above, the mutant PEX22 gene of the present invention is characterized in that the base NNN is a stop codon in the partial region represented by the base sequence of SEQ ID NO: 1 in the PEX22 gene. The mutant PEX22 gene of the present invention is characterized in that the base NNN is a stop codon in the partial region represented by the base sequence of SEQ ID NO: 1 in the PEX22 gene, and other configurations and conditions are not particularly limited. For the mutant PEX22 gene of the present invention, for example, the description of the production method, the first production method, the organic acid-producing sake yeast strain, the second production method, and the screening method of the present invention can be cited.
本発明において、前記変異PEX22遺伝子は、例えば、配列番号2の塩基配列からなり、塩基NNNが、ストップコドンであることが好ましい。 In the present invention, the mutant PEX22 gene preferably has, for example, the base sequence of SEQ ID NO: 2, and the base NNN is preferably a stop codon.
<変異PEX22タンパク質>
本発明の変異PEX22タンパク質は、配列番号3のアミノ酸配列からなるペプチドであることを特徴とする。本発明の変異PEX22タンパク質は、前記配列番号3のアミノ酸配列からなるペプチドであることが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の変異PEX22タンパク質は、本発明の有機酸生成酒酵母株の説明を援用できる。
<Mutant PEX22 protein>
The mutant PEX22 protein of the present invention is a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3. The mutant PEX22 protein of the present invention is characterized in that it is a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and other configurations and conditions are not particularly limited. For the mutant PEX22 protein of the present invention, the description of the organic acid-producing sake yeast strain of the present invention can be used.
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、以下の実施例により何ら制限されない。 Next, examples of the present invention will be described. However, this invention is not restrict | limited at all by the following examples.
[実施例1]
本発明の有機酸生成酒酵母株が、親株と比較して、優れた有機酸生成能を有することを確認した。
[Example 1]
It confirmed that the organic acid production | generation liquor yeast strain | stump | stock of this invention had the outstanding organic acid production ability compared with a parent strain.
(1)変異型酵母株の取得
清酒醸造用酵母K−701を親株として使用した。変異型酵母株は、下記参考文献を参照し、取得した。具体的には、5重量% EMS含有カリウムリン酸緩衝液にK−701を懸濁し、撹拌しながら30℃で60分間インキュベートして変異処理を実施した。前記変異処理後の親株(以下、「第1変異処理株」という)を、1mmol/L 5’,5’,5’-トリフルオロロイシン存在下、YNB寒天培地(0.67%Difco yeast nitrogen base、2%グルコース、2%寒天)で生育および選抜することにより、5’,5’,5’-トリフルオロロイシン耐性が付与され、K−701と同等以上のエタノール産生能を示し、K−701と比較して、酢酸イソアミルの生成量が増大した酒酵母株(以下、「F−19株」ともいう)が得られた。
参考文献:Shinzo ASHIDA et.al., “Isolation and Application of Mutant Producing Sufficient Isoamyl Acetate, a Sake Flaovr Component”, Argic. Biol. Chem, 1987, vol.51, No.8, pages 2061-2065
(1) Acquisition of mutant yeast strain Yeast for sake brewing K-701 was used as a parent strain. Mutant yeast strains were obtained with reference to the following references. Specifically, mutation treatment was performed by suspending K-701 in a 5 wt% EMS-containing potassium phosphate buffer and incubating at 30 ° C. for 60 minutes with stirring. The parent strain after the mutation treatment (hereinafter referred to as “first mutation treatment strain”) was added to a YNB agar medium (0.67% Difco yeast nitrogen base) in the presence of 1 mmol / L 5 ′, 5 ′, 5′-trifluoroleucine. Growth and selection with 2% glucose, 2% agar), imparting 5 ', 5', 5'-trifluoroleucine resistance, showing ethanol production ability equal to or higher than K-701, and K-701 As a result, a liquor yeast strain (hereinafter also referred to as “F-19 strain”) in which the amount of isoamyl acetate produced was increased was obtained.
References: Shinzo ASHIDA et.al., “Isolation and Application of Mutant Producing Sufficient Isoamyl Acetate, a Sake Flaovr Component”, Argic. Biol. Chem, 1987, vol.51, No.8, pages 2061-2065
つぎに、3重量% EMS含有カリウムリン酸緩衝液にF−19株を懸濁し、処理後の生存率が20−30%となるように、変異処理を実施した。前記変異処理後の親株(以下、「第2変異処理株」という)のうち生存した約8000株を選抜し、小仕込み試験を行い、親株よりも多酸性を示し、さらに、親株と同程度以上のエタノール生成能を示す4株を選抜した(試験例1)。 Next, the F-19 strain was suspended in a 3 wt% EMS-containing potassium phosphate buffer, and the mutation treatment was performed so that the survival rate after the treatment was 20-30%. About 8,000 strains that survived were selected from the parent strain after the mutation treatment (hereinafter referred to as “second mutation treatment strain”), a small preparation test was performed, and it was more polyacidic than the parent strain. 4 strains showing ethanol production ability were selected (Test Example 1).
前記試験例1で得られた多酸性かつエタノール生産に優れる4株を、さらに総米200gの小仕込み試験に供し、1株選抜して、これをF−19Hとした。なお、F−19Hの発酵経過をファーモグラフィで測定したところ良好であった。 Four strains obtained in the test example 1 and excellent in ethanol production were subjected to a small preparation test of 200 g of total rice, and one strain was selected and designated as F-19H. In addition, it was favorable when the fermentation progress of F-19H was measured by the farmography.
つぎに、得られたF−19Hと親株であるF−19との比較を行った。比較は、総米200gの小仕込み試験により行った。前記小仕込み試験は、使用した株が異なる以外、掛米量、酒酵母株の最終濃度、発酵温度(15℃一定)等、全て同じ条件とした。前記小仕込み試験において、仕込み液の発酵経過をファーモグラフィで測定したところ、F−19HとF−19との間において、発酵経過の遅延等の差異は見られなかった。つまり、F−19Hは、親株F−19と同様の発酵力であることがわかった。 Next, the obtained F-19H was compared with the parent strain F-19. The comparison was made by a small preparation test of 200 g of total rice. The small preparation test was carried out under the same conditions such as the amount of hung rice, the final concentration of the liquor yeast strain, the fermentation temperature (constant at 15 ° C.), etc., except that the strain used was different. In the small preparation test, the fermentation progress of the preparation liquid was measured by a farmography. As a result, no difference such as a delay in the fermentation progress was observed between F-19H and F-19. That is, F-19H was found to have the same fermentative power as the parent strain F-19.
下記表1に、前記仕込み試験の結果、すなわち、前記仕込み開始から15日経過時の発酵産物における各測定項目の結果を示す。測定した項目は、エタノール、酸度、アミノ酸度、リンゴ酸、コハク酸、酢酸イソアミル、およびその他各種有機酸(αケトグルタル酸、クエン酸、ピルビン酸、乳酸、ピログルタミン酸等)である。 Table 1 below shows the result of the preparation test, that is, the result of each measurement item in the fermentation product after 15 days from the start of the preparation. Items measured were ethanol, acidity, amino acidity, malic acid, succinic acid, isoamyl acetate, and various other organic acids (α-ketoglutaric acid, citric acid, pyruvic acid, lactic acid, pyroglutamic acid, etc.).
前記表1に示すように、F−19Hによれば、アルコール生成量に関して、F−19の0.96倍であり、F−19と同等のアルコール生成量(エタノール生成量)を維持していた。また、前記アルコール発酵の過程において、経時的に炭酸ガスの発生量と炭酸ガスの発生速度を確認した結果、F−19Hは、F−19と同様の挙動を示した。そして、F−19Hは、リンゴ酸生成量に関しては、親株の約5.4倍であった。つまり、取得した変異酵母株F−19Hは、前記条件(1)および条件(2)を満たすことが確認できた。さらに、F−19Hの酸度は、F−19と比較して、1.55倍であった。これらの結果から、本発明の有機酸生成酒酵母株が、親株と同程度の発酵能を維持しつつ、且つ、親株よりも優れた有機酸生成能を有することがわかった。 As shown in Table 1, according to F-19H, the alcohol production amount was 0.96 times that of F-19, and the alcohol production amount (ethanol production amount) equivalent to F-19 was maintained. . In addition, as a result of confirming the generation amount of carbon dioxide and the generation rate of carbon dioxide over time in the process of alcohol fermentation, F-19H showed the same behavior as F-19. And F-19H was about 5.4 times the parent strain in terms of the amount of malic acid produced. That is, it was confirmed that the obtained mutant yeast strain F-19H satisfies the conditions (1) and (2). Furthermore, the acidity of F-19H was 1.55 times that of F-19. From these results, it was found that the organic acid-producing liquor yeast strain of the present invention has a fermentability comparable to that of the parent strain and has an organic acid-producing ability superior to that of the parent strain.
(2)F−19Hの遺伝子解析
F−19Hは、F−19と異なり優れた有機酸生成能を有することから、F−19Hについて、この特性に対応する遺伝子変異の解析を行った。その結果、F−19Hは、K−701と比較して、複数の変異を有していた。そのうちの1つは、K−701が、配列番号2の塩基配列における塩基NNNが、TGGであるPEX22遺伝子をホモ接合で有するのに対し、F−19Hが、配列番号2の塩基配列における塩基NNNが、TAG(ストップコドン)である変異PEX22遺伝子をホモ接合で有しているという変異であった。すなわち、F−19Hでは、2つのPEX22遺伝子について、その374番目の塩基がGからAに変異する点変異が生じていた。なお、F−19についても、PEX22遺伝子の塩基配列を調べたところ、F−19は、配列番号2の塩基配列における塩基NNNが、TGGであるPEX22遺伝子と、配列番号2の塩基配列における塩基NNNが、TAG(ストップコドン)である変異PEX22遺伝子とをヘテロ接合で有していた。
(2) Gene analysis of F-19H Unlike F-19, F-19H has an excellent ability to produce an organic acid. Therefore, F-19H was analyzed for a gene mutation corresponding to this characteristic. As a result, F-19H had a plurality of mutations compared to K-701. One of them is that K-701 is homozygous for the base NNN in the base sequence of SEQ ID NO: 2 and the PEX22 gene that is TGG, whereas F-19H is the base NNN in the base sequence of SEQ ID NO: 2. However, it was a mutation that has a mutant PEX22 gene, which is a TAG (stop codon), in homozygosity. That is, in F-19H, a point mutation in which the 374th base was mutated from G to A occurred in two PEX22 genes. As for F-19, the base sequence of the PEX22 gene was also examined. As a result, the base sequence NNN in the base sequence of SEQ ID NO: 2 was TGG and the base NNN in the base sequence of SEQ ID NO: 2 Had heterozygous mutated PEX22 gene which is TAG (stop codon).
[実施例2]
前記実施例1において得られた点変異の前記変異PEX22遺伝子を、親株S. cerevisiae 4011(水津、醸協、91、87、1992年)に、遺伝子工学的に導入した。そして、得られた点変異導入株について、発酵試験を行い、エタノール発酵性を損じることなく、有機酸を前記親株よりも向上させることを確認した。
[Example 2]
The mutant PEX22 gene of the point mutation obtained in Example 1 was introduced into the parent strain S. cerevisiae 4011 (Mizutsu, Shukyo, 91, 87, 1992) by genetic engineering. And the fermentation test was done about the obtained point mutation introduction | transduction strain | stump | stock, and it confirmed that organic acid was improved rather than the said parent strain | stump | stock, without impairing ethanol fermentability.
(1)点変異導入株の調製
前記親株S. cerevisiae 4011から、一倍体4011a(MATa)を分離し、これにウラシル要求性を付与し、これを宿主GX−11として使用した。前記宿主は、URA3遺伝子について、46番目のアミノ酸残基が終止コドン(アンバーコドン)となっていることを確認済みである。
(1) Preparation of Point Mutation-Introduced Strain A haploid 4011a (MATa) was isolated from the parent strain S. cerevisiae 4011, imparted with uracil requirement, and used as the host GX-11. The host has confirmed that the 46th amino acid residue is a stop codon (amber codon) in the URA3 gene.
F−19Hのゲノムにおける変異PEX22遺伝子のORF領域(配列番号2の塩基配列の全ての塩基)と、ターミネーター領域とを下記プライマーセット1を用いて、PCRで増幅し、第1の増幅断片を得た。 The ORF region of the mutant PEX22 gene in the F-19H genome (all bases of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2) and the terminator region are amplified by PCR using the following primer set 1 to obtain a first amplified fragment It was.
プライマーセット1
フォワードプライマー1(PEX22(1)InFusion-F、配列番号4)
5’-CTATAGGGCGAATTGATGCCACCACCATCAAGAAGTAGAATAAACAAAACAAGAACATTAGGAATAG-3’
リバースプライマー1(PEX22(743)InFusion-R、配列番号5)
5’-AGGGAACAAAAGCTGGGCATTGTTAGACATCTAATTGATTCGGTCAAGTTGTAATGATGATTTC-3’
Primer set 1
Forward primer 1 (PEX22 (1) InFusion-F, SEQ ID NO: 4)
5'-CTATAGGGCGAATTGATGCCACCACCATCAAGAAGTAGAATAAACAAAACAAGAACATTAGGAATAG-3 '
Reverse primer 1 (PEX22 (743) InFusion-R, SEQ ID NO: 5)
5'-AGGGAACAAAAGCTGGGCATTGTTAGACATCTAATTGATTCGGTCAAGTTGTAATGATGATTTC-3 '
また、プラスミドpRS406を鋳型として、下記プライマーセット2を用いて、PCRで増幅し、増幅断片を得た。 In addition, amplification was performed by PCR using plasmid pRS406 as a template and the following primer set 2 to obtain an amplified fragment.
プライマーセット2
フォワードプライマー2(pRS406InFusion-F、配列番号6)
5’- CAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGGG-3’
リバースプライマー2(pRS406InFusion-R、配列番号7)
5’- CAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTAC-3’
Primer set 2
Forward primer 2 (pRS406InFusion-F, SEQ ID NO: 6)
5'- CAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGGG-3 '
Reverse primer 2 (pRS406InFusion-R, SEQ ID NO: 7)
5'- CAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTAC-3 '
つぎに、サブクローニングキット(In Fusion(登録商標)、タカラバイオ社製)を用いて、pRS406のマルチクローニングサイトに前記第1の増幅断片をサブクローニングすることにより、組換え用プラスミドベクターを作製した。前記ベクターは、マーカー配列として、URA3遺伝子およびアンピシリン耐性遺伝子を有する。そして、前記組換えプラスミド制限酵素処理物を、酢酸リチウム法により、宿主GX−11に導入して形質転換を行い、ウラシル未添加のSD培地での培養により、前記組換えベクターが、前記宿主のPEX22遺伝子座に挿入された形質転換体の選択を行った。さらに、選択された形質転換体について、5−フルオロオロチン酸(FOA)とウラシルを含むアミノ酸未添加のSD培地での培養を行い、さらに、ループアウトにより前記URA3遺伝子およびアンピシリン遺伝子が除かれた形質転換体のみを選択した。このようにして選択された形質転換体を、目的の変異酵母株として、変異PEX22遺伝子の確認を行った。その結果、配列番号2の塩基配列において374番目の塩基がGからAに点変異した変異PEX22遺伝子を有することが確認された。得られた変異酵母株を、以下、GX−PEX22という。なお、GX−PEX22は、2株取得した。 Next, a plasmid vector for recombination was prepared by subcloning the first amplified fragment at the multicloning site of pRS406 using a subcloning kit (In Fusion (registered trademark), manufactured by Takara Bio Inc.). The vector has a URA3 gene and an ampicillin resistance gene as marker sequences. Then, the recombinant plasmid restriction enzyme-treated product is introduced into the host GX-11 by the lithium acetate method for transformation, and the recombinant vector is transformed into the host by culturing in SD medium without uracil. A transformant inserted into the PEX22 locus was selected. Further, the selected transformant was cultured in an SD medium not containing amino acids containing 5-fluoroorotic acid (FOA) and uracil, and the URA3 gene and ampicillin gene were removed by loopout. Only transformants were selected. The transformant thus selected was used as a target mutant yeast strain, and the mutant PEX22 gene was confirmed. As a result, it was confirmed that the base sequence of SEQ ID NO: 2 has a mutant PEX22 gene in which the 374th base is point-mutated from G to A. The obtained mutant yeast strain is hereinafter referred to as GX-PEX22. In addition, 2 shares of GX-PEX22 were acquired.
(2)エタノール生成量および有機酸生成量の測定
前記宿主および前記GX−PEX22について、総米100gの小仕込み試験とした以外は、前記実施例1と同様にして、エタノール生成量および有機酸生成量を測定した。下記表2に、前記仕込み試験の結果、すなわち、前記仕込み開始から15日経過時の発酵産物における各測定項目の結果(2株の平均値)を示す。測定した項目は、エタノール、酸度、アミノ酸度、リンゴ酸、コハク酸、およびその他各種有機酸(αケトグルタル酸、クエン酸、ピルビン酸、乳酸、ピログルタミン酸等)である。
(2) Measurement of ethanol production amount and organic acid production amount About the host and the GX-PEX22, the ethanol production amount and the organic acid production were performed in the same manner as in Example 1 except that a small preparation test of 100 g of total rice was performed. The amount was measured. Table 2 below shows the result of the preparation test, that is, the result of each measurement item (average value of two strains) in the fermentation product after 15 days from the start of the preparation. Items measured were ethanol, acidity, amino acidity, malic acid, succinic acid, and other various organic acids (α-ketoglutaric acid, citric acid, pyruvic acid, lactic acid, pyroglutamic acid, etc.).
前記表2に示すように、前記GX−PEX22は、アルコール生成量(エタノール生成量)に関しては、宿主GX−11の約0.95倍であり、前記宿主と同等のアルコール生成量を維持しており、エタノール発酵性を損じていないことが確認できた。また、前記GX−PEX22は、リンゴ酸生成量に関しては、前記宿主の約2.05倍であり、コハク酸生成量に関しては、前記宿主の約1.59倍であり、有機酸生成量を宿主よりも向上させることを確認した。また、前記GX−PEX22の酸度は、前記宿主の1.38倍であった。この結果から、本発明の有機酸生成酒酵母株が、宿主と同程度の発酵能を維持しつつ、且つ、宿主よりも優れた有機酸生成能を有すること、また、このような性質が、PEX22遺伝子の374番目の塩基の点変異、すなわち、配列番号1または2における塩基NNNがストップコドンに変異することにより得られることが確認できた。 As shown in Table 2, the GX-PEX22 is about 0.95 times as much as the host GX-11 in terms of alcohol production (ethanol production), and maintains an alcohol production equivalent to that of the host. It was confirmed that the ethanol fermentability was not impaired. The GX-PEX22 is about 2.05 times the host in terms of malic acid production, and about 1.59 times that of the host in terms of succinic acid production. It was confirmed to improve more than. The acidity of the GX-PEX22 was 1.38 times that of the host. From this result, the organic acid-producing brewer's yeast strain of the present invention has an organic acid-producing ability superior to that of the host while maintaining the same level of fermentation ability as that of the host. It was confirmed that the point mutation at the 374th base of the PEX22 gene, that is, the base NNN in SEQ ID NO: 1 or 2 was obtained by mutating to a stop codon.
[実施例3]
前記変異PEX22遺伝子により付与される形質、すなわち、有機酸の生成量の増大は、劣性形質であることを確認した。
[Example 3]
It was confirmed that the character imparted by the mutant PEX22 gene, that is, the increase in the amount of organic acid produced was a recessive character.
K−701、F−19、およびF−19Hについて、Yeast extract Malt(YEM)培地で培養した。つぎに、5mLのYEM培地(グルコース10g/100mL)に、OD600=0.1となるように植菌し、30℃で4日間培養した。得られた培養液について、有機酸生成量を測定した。下記表3にこの結果を示す。 K-701, F-19, and F-19H were cultured in Yeast extract Malt (YEM) medium. Next, the YEM medium 5 mL (glucose 10 g / 100 mL), was inoculated so that OD 600 = 0.1, and cultured for 4 days at 30 ° C.. About the obtained culture solution, the amount of organic acid production was measured. The results are shown in Table 3 below.
前記表3に示すように、F−19Hは、リンゴ酸およびコハク酸の生成量に関して、変異PEX22遺伝子を有さないK−701の3.25倍および1.42倍であった。また、F−19Hは、リンゴ酸およびコハク酸の生成量に関して、変異PEX22遺伝子をヘテロ接合で有するF−19の3.28倍および1.69倍であった。これらの結果から、前記変異PEX22遺伝子により付与される形質、すなわち、有機酸の生成量の増大は、劣性形質であることがわかった。 As shown in the said Table 3, F-19H was 3.25 times and 1.42 times of K-701 which does not have a mutant PEX22 gene regarding the production amount of malic acid and succinic acid. Moreover, F-19H was 3.28 times and 1.69 times that of F-19 having a mutant PEX22 gene in a heterozygote with respect to the production amounts of malic acid and succinic acid. From these results, it was found that the character imparted by the mutant PEX22 gene, that is, the increase in the amount of organic acid produced was a recessive character.
[実施例4]
本発明の有機酸生成酒酵母株の製造方法により得られた有機酸生成酒酵母株と、他の酒酵母株とを用い、混合醸造できることを確認した。
[Example 4]
It was confirmed that mixed brewing was possible using the organic acid-producing liquor yeast strain obtained by the method for producing an organic acid-producing liquor yeast strain of the present invention and other liquor yeast strains.
実施例1で得られたF−19とF−19Hとの醸造開始時の混合割合を変えて、総米656gの仕込みとした以外は、実施例1と同様にして、エタノール生成量、有機酸生成量、および酢酸イソアミルの生成量を測定した。F−19とF−19Hとの混合割合(F−19:F−19H)は、10:0、7:3、5:5、4:6、3:7、または0:10とし、107酒酵母数(cells)/mLとなるように接種した。その結果、エタノール、有機酸(リンゴ酸+コハク酸)、酢酸イソアミルの濃度は、F−19およびF−19Hを、それぞれ単独で醸造した清酒を混合したもの(理論値)と10%程度の誤差であり、精度良く混合醸造できることがわかった。また、F−19およびF−19Hを、それぞれ単独で醸造した結果のみを下記表4に示す。 The amount of ethanol produced and organic acid were the same as in Example 1 except that the mixing ratio at the start of brewing of F-19 and F-19H obtained in Example 1 was changed to prepare 656 g of total rice. The production amount and the production amount of isoamyl acetate were measured. The mixing ratio of the F-19 and F-19H (F-19: F-19H) is 10: 0, 7: 3, 5: 5,4: 6,3: 7, or a 0:10, 107 It inoculated so that it might become the number of liquor yeast (cells) / mL. As a result, the concentrations of ethanol, organic acid (malic acid + succinic acid), and isoamyl acetate were mixed with sake brewed by F-19 and F-19H independently (theoretical value) and an error of about 10%. It was found that mixed brewing can be performed with high accuracy. Moreover, only the result of brewing F-19 and F-19H independently is shown in Table 4 below.
以上、実施形態および実施例を参照して本発明を説明したが、本発明は、上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本発明の構成や詳細には、本発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をできる。 As mentioned above, although this invention was demonstrated with reference to embodiment and an Example, this invention is not limited to the said embodiment and Example. Various changes that can be understood by those skilled in the art can be made to the configuration and details of the present invention within the scope of the present invention.
本発明によれば、十分な発酵力を維持し且つ有機酸生成能に優れる酵母株を製造できる。このため、本発明は、例えば、酒造分野において極めて重要である。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the yeast strain | stump | stock which maintains sufficient fermentative power and is excellent in organic acid production ability can be manufactured. For this reason, the present invention is extremely important, for example, in the field of brewing.
Claims (6)
前記変異工程において、前記PEX22遺伝子における配列番号1の塩基配列で示される部分領域について、塩基NNNを、ストップコドンに変異させることを特徴とする、有機酸生成酒酵母株の製造方法。 A sake yeast strain comprising a mutation step of mutating its PEX22 gene to a mutant PEX22 gene;
In the mutation step, the base NNN is mutated to a stop codon in the partial region represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 in the PEX22 gene.
前記配列番号2の塩基配列における塩基NNNを、ストップコドンに変異させる、請求項1記載の有機酸生成酒酵母株の製造方法。 The PEX22 gene consists of the base sequence of SEQ ID NO: 2,
The method for producing an organic acid-producing liquor yeast strain according to claim 1, wherein the base NNN in the base sequence of SEQ ID NO: 2 is mutated to a stop codon.
前記有機酸生成酒酵母株を用いて、清酒を製造する製造工程を含み、
前記作製工程は、請求項1から3のいずれか一項に記載の有機酸生成酒酵母株の製造方法により実施されることを特徴とする、清酒の製造方法。 A production process for producing an organic acid-producing liquor yeast strain from a liquor yeast strain, and a production process for producing sake using the organic acid-producing liquor yeast strain,
The said production process is implemented by the manufacturing method of the organic acid production | generation liquor yeast strain as described in any one of Claim 1 to 3, The manufacturing method of sake.
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