JP2018171005A - Human myeloid blood cells and methods for producing cells - Google Patents

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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To develop preventive or therapeutic agents against a malignant tumor.SOLUTION: The present invention relates to a method for producing human myeloid blood cells in which tumorigenicity is suppressed, the method comprising suppressing the expression of c-MYC gene in human myeloid blood cells expressing c-MYC gene and thereby obtaining human myeloid blood cells in which the expression of the c-MYC gene is suppressed. The invention also relates to a cancer preventive or therapeutic agent comprising cells produced by the method, and to cancer prophylactic or therapeutic method using the cells, and the like.SELECTED DRAWING: Figure 9

Description

本発明は、造腫瘍性が抑制された新規なヒトミエロイド系血液細胞、及び造腫瘍性が抑制されたヒトミエロイド系血液細胞を作製する方法に関し、さらに該細胞を含む癌の予防又は治療剤、並びに該細胞を用いた癌の予防又は治療方法に関するものである。より詳細には、c−MYC遺伝子を発現するヒトミエロイド系血液細胞において、当該c−MYC遺伝子の発現を抑制し、c−MYC遺伝子の発現が抑制されたヒトミエロイド系血液細胞を得る工程を含む、造腫瘍性の抑制されたヒトミエロイド系血液細胞の作製方法に関する。さらに本発明は、該方法によって作製された細胞を含む、癌の予防又は治療剤、及び該細胞を用いた癌の予防又は治療方法などに関する。   The present invention relates to a novel human myeloid blood cell with suppressed tumorigenicity and a method for producing human myeloid blood cell with suppressed tumorigenicity, and further a preventive or therapeutic agent for cancer containing the cell, The present invention also relates to a method for preventing or treating cancer using the cells. More specifically, the method includes a step of obtaining human myeloid blood cells in which expression of the c-MYC gene is suppressed by suppressing the expression of the c-MYC gene in human myeloid blood cells expressing the c-MYC gene. The present invention also relates to a method for producing human myeloid blood cells with suppressed tumorigenicity. The present invention further relates to a preventive or therapeutic agent for cancer containing cells produced by the method, a method for preventing or treating cancer using the cells, and the like.

iPS−MC（iPS cell−derived myeloid cell:単球又はマクロファージ類似細胞）は、ヒトの誘導多能性幹（iPS）細胞をin vitroの培養系において分化誘導することにより作成されるヒトミエロイド系血液細胞である。iPS−MLは、iPS−MCに細胞増殖因子（例えば、cMYC＋MBI1＋MDM2）の遺伝子を導入し増殖能力を付与したものである。iPS−MLは、一度樹立すると、少なくとも３〜４ヶ月にわたり増殖させることが可能である。そして、増殖後も、ミエロイド系細胞のマーカー分子の発現、異物貪食能力、及び樹状細胞への分化能力等の特性を保持している（特許文献１）。iPS−MLは、単純な浮遊細胞培養系を用いて増殖させることが可能であり、自動大量培養装置を用いた培養も可能である。以上より、iPS−ML作製技術は、生理的な機能を有するヒトミエロイド細胞の大量生産を可能とする唯一のものであると言える。   iPS-MC (iPS cell-derived myeloid cell: monocyte or macrophage-like cell) is a human myeloid blood produced by inducing differentiation of human induced pluripotent stem (iPS) cells in an in vitro culture system. It is a cell. iPS-ML is a cell growth factor (for example, cMYC + MBI1 + MDM2) gene introduced into iPS-MC and imparted with a proliferation ability. Once established, iPS-ML can be propagated for at least 3-4 months. And after proliferation, it retains characteristics such as the expression of marker molecules of myeloid cells, foreign phagocytic ability, and ability to differentiate into dendritic cells (Patent Document 1). iPS-ML can be grown using a simple floating cell culture system, and can be cultured using an automatic mass culture apparatus. From the above, it can be said that the iPS-ML production technique is the only one that enables mass production of human myeloid cells having physiological functions.

本発明者らは、ヒトインターフェロンβ（IFNβ）を発現するiPS−ML（iPS−ML／IFNβ）を、マウス腹膜播種モデルの腹腔内に投与することにより、該マウスの腫瘍の悪性化を抑制することができ、また該腫瘍を縮小させることができることを見出した（非特許文献１）。   The present inventors suppress the malignant transformation of a mouse tumor by administering iPS-ML (iPS-ML / IFNβ) expressing human interferon β (IFNβ) into the peritoneal cavity of a mouse peritoneal dissemination model. And it was found that the tumor can be reduced (Non-patent Document 1).

国際公開第２０１２／０４３６５１号International Publication No. 2012/043651

Koba C, Haruta M, Matsunaga Y, Matsumura K, Haga E, Sasaki Y, Ikeda T, Takamatsu K, Nishimura Y, Senju S., "Therapeutic effect of human iPS-cell-derived myeloid cells expressing IFN-β against peritoneally disseminated cancer in xenograft models."PLoS One. 2013;8(6):e67567Koba C, Haruta M, Matsunaga Y, Matsumura K, Haga E, Sasaki Y, Ikeda T, Takamatsu K, Nishimura Y, Senju S., "Therapeutic effect of human iPS-cell-derived myeloid cells expressing IFN-β against peritoneally disseminated cancer in xenograft models. "PLoS One. 2013; 8 (6): e67567

本発明の目的は、ヒト悪性腫瘍に対する、予防又は治療剤を開発することである。   An object of the present invention is to develop a preventive or therapeutic agent for human malignant tumors.

本発明者らは、ヒトM−CSF又はヒトGM−CSFを発現するiPS−ML細胞（iPS−ML／M、又はiPS−ML／GM）を作製し、マウスに投与したところ、該iPS−ML／M又はiPS−ML／GMがマウス体内で腫瘍を形成することを見出した。一方、通常、マウス体内にはマウスM−CSF及びマウスGM−CSFが存在しているが、iPS−ML細胞（すなわち、外来性ヒトM−CSF及びヒトGM−CSFのいずれも発現しないiPS−ML細胞）は、マウスM−CSF及びマウスGM−CSF存在下において造腫瘍性を示さなかった。造腫瘍性を抑制するため、本発明者らが鋭意検討したところ、c−MYCを誘導性プロモーターの制御下で発現させたミエロイド系血液細胞（iPS−TML）は、外来性ヒトM−CSF及び／又はGM−CSFを発現する場合においても造腫瘍性を示さないことを見出した。   The present inventors prepared iPS-ML cells (iPS-ML / M or iPS-ML / GM) expressing human M-CSF or human GM-CSF and administered them to mice. / M or iPS-ML / GM was found to form tumors in mice. On the other hand, mouse M-CSF and mouse GM-CSF are usually present in the mouse body, but iPS-ML cells (i.e., iPS-ML that does not express exogenous human M-CSF or human GM-CSF). Cells) did not show tumorigenicity in the presence of mouse M-CSF and mouse GM-CSF. In order to suppress tumorigenicity, the present inventors have intensively studied. As a result, myeloid blood cells (iPS-TML) in which c-MYC is expressed under the control of an inducible promoter are exogenous human M-CSF and It was found that tumorigenicity was not exhibited even when GM-CSF was expressed.

発明者らはさらに本発見に基づいて鋭意検討し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は以下の態様を含むものである：
［１］ 造腫瘍性が抑制されたヒトミエロイド系血液細胞を作製する方法であって、下記の工程（C）を行うことを含む方法：
（C）c−MYC遺伝子を発現するヒトミエロイド系血液細胞において、該c−MYC遺伝子の発現を抑制し、それによりc−MYC遺伝子の発現が抑制されたヒトミエロイド系血液細胞を得る工程。
［２］ ヒトミエロイド系血液細胞が、ヒト多能性幹細胞に由来するヒトミエロイド系血液細胞である、［１］に記載の方法。
［３］ ヒト多能性幹細胞から造腫瘍性が抑制されたヒトミエロイド系血液細胞を作製する方法であって、下記の工程（A）及び（C）を含む方法：
（A）ヒト多能性幹細胞から、c−MYC遺伝子を発現するヒトミエロイド系血液細胞を得る工程、
（C）工程（A）で得られるc−MYC遺伝子を発現するヒトミエロイド系血液細胞において、該c−MYC遺伝子の発現を抑制し、それによりc−MYC遺伝子の発現が抑制されたヒトミエロイド系血液細胞を得る工程。
［４］ c−MYC遺伝子を発現するヒトミエロイド系血液細胞が、調節性プロモーターと機能的に連結されたc−MYC遺伝子を有するヒトミエロイド系血液細胞である、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］ in vitroにおいて増殖させることが可能であり、かつ造腫瘍性が抑制されたヒトミエロイド系血液細胞を作製する方法である、［４］に記載の方法。
［６］ ヒトミエロイド系血液細胞が、B cell−specific Moloney murine leukemia virus integration site 1（BMI1）遺伝子、Enhancer of zeste homolog 2 （EZH2）遺伝子、MDM2遺伝子、MDM4遺伝子及びHypoxia Inducible Factor 1 Alpha Subunit（HIF1A）遺伝子からなる群から選択される少なくとも一つの外来性遺伝子を発現する、［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］ ヒトミエロイド系血液細胞が、外来性ヒトM−CSFを発現する、［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［８］ ヒトミエロイド系血液細胞が、インターフェロンβ（IFNβ）遺伝子を発現する、［１］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［９］ ヒトミエロイド系血液細胞の、内在性のIFNAR遺伝子の発現が抑制されている、［８］に記載の方法。
［１０］ c−MYC遺伝子が外来性c−MYC遺伝子である、請求項［１］〜［９］のいずれかに記載の方法。
［１１］ 調節性プロモーターと機能的に連結されたc−MYC遺伝子を有する、ヒトミエロイド系血液細胞。
［１２］ 調節性プロモーターがテトラサイクリン反応性プロモーターである、［１１］に記載の細胞。
［１３］ 部位特異的組換え配列又はトランスポゾン配列に挟まれた、外来性プロモーターと機能的に連結されたc−MYC遺伝子を有する、ヒトミエロイド系血液細胞。
［１４］ BMI1遺伝子、EZH2遺伝子、MDM2遺伝子、MDM4遺伝子及びHIF1A遺伝子からなる群から選択される少なくとも一つの外来性遺伝子を発現する、［１１］〜［１３］のいずれかに記載の細胞。
［１５］ 外来性ヒトM−CSF遺伝子を発現する、［１１］〜［１４］のいずれかに記載の細胞。
［１６］ インターフェロンβ（IFNβ）遺伝子を発現する、［１１］〜［１５］のいずれかに記載の細胞。
［１７］ 内在性のIFNAR遺伝子の発現が抑制されている、［１６］に記載の細胞。
［１８］ CD11b陽性かつCD45陽性である、［１１］〜［１７］のいずれかに記載の細胞。
［１９］ in vitroにおいて増殖させることが可能であり、かつ造腫瘍性が抑制されたヒトミエロイド系血液細胞である、［１１］〜［１８］のいずれかに記載の細胞。
［２０］ c−MYC遺伝子が外来性c−MYC遺伝子である、［１１］〜［１９］のいずれか一項に記載の細胞。
［２１］ 予防又は治療上有効量の［１１］〜［２０］のいずれかに記載の細胞又は［１］〜［１０］のいずれかに記載の方法を用いて作製された細胞を含む、がんの予防又は治療剤。
［２２］ 予防又は治療上有効量の［１１］〜［２０］のいずれかに記載の細胞又は［１］〜［１０］のいずれかに記載の方法を用いて作製された細胞を投与することを含む、がんの予防又は治療方法。 The inventors have further intensively studied based on this discovery and have completed the present invention.
That is, the present invention includes the following aspects:
[1] A method for producing human myeloid blood cells in which tumorigenicity is suppressed, the method comprising performing the following step (C):
(C) A step of obtaining human myeloid blood cells in which expression of the c-MYC gene is suppressed by suppressing expression of the c-MYC gene in human myeloid blood cells expressing the c-MYC gene.
[2] The method according to [1], wherein the human myeloid blood cells are human myeloid blood cells derived from human pluripotent stem cells.
[3] A method for producing human myeloid blood cells in which tumorigenicity is suppressed from human pluripotent stem cells, the method comprising the following steps (A) and (C):
(A) A step of obtaining human myeloid blood cells expressing c-MYC gene from human pluripotent stem cells,
(C) In the human myeloid blood cells that express the c-MYC gene obtained in step (A), the expression of the c-MYC gene is suppressed, thereby suppressing the expression of the c-MYC gene. Obtaining blood cells.
[4] Any of [1] to [3], wherein the human myeloid blood cell expressing the c-MYC gene is a human myeloid blood cell having a c-MYC gene operably linked to a regulatory promoter. The method of crab.
[5] The method according to [4], which is a method for producing human myeloid blood cells that can be proliferated in vitro and have suppressed tumorigenicity.
[6] Human myeloid blood cells are expressed as B cell-specific Moloney murine leukemia virus integration site 1 (BMI1) gene, Enhancer of zeste homolog 2 (EZH2) gene, MDM2 gene, MDM4 gene and Hypoxia Inducible Factor 1 Alpha Subunit (HIF1A ) The method according to any one of [1] to [5], wherein at least one foreign gene selected from the group consisting of genes is expressed.
[7] The method according to any one of [1] to [6], wherein the human myeloid blood cell expresses exogenous human M-CSF.
[8] The method according to any one of [1] to [7], wherein the human myeloid blood cell expresses an interferon β (IFNβ) gene.
[9] The method according to [8], wherein the expression of endogenous IFNAR gene in human myeloid blood cells is suppressed.
[10] The method according to any one of [1] to [9], wherein the c-MYC gene is an exogenous c-MYC gene.
[11] A human myeloid blood cell having a c-MYC gene operably linked to a regulatable promoter.
[12] The cell according to [11], wherein the regulatable promoter is a tetracycline responsive promoter.
[13] A human myeloid blood cell having a c-MYC gene operably linked to an exogenous promoter sandwiched between site-specific recombination sequences or transposon sequences.
[14] The cell according to any one of [11] to [13], which expresses at least one foreign gene selected from the group consisting of BMI1 gene, EZH2 gene, MDM2 gene, MDM4 gene and HIF1A gene.
[15] The cell according to any one of [11] to [14], which expresses an exogenous human M-CSF gene.
[16] The cell according to any one of [11] to [15], which expresses an interferon β (IFNβ) gene.
[17] The cell according to [16], wherein the endogenous IFNAR gene expression is suppressed.
[18] The cell according to any one of [11] to [17], which is CD11b positive and CD45 positive.
[19] The cell according to any one of [11] to [18], which is a human myeloid blood cell that can be proliferated in vitro and has suppressed tumorigenicity.
[20] The cell according to any one of [11] to [19], wherein the c-MYC gene is an exogenous c-MYC gene.
[21] A prophylactically or therapeutically effective amount of the cell according to any one of [11] to [20] or the cell produced using the method according to any one of [1] to [10], Preventive or therapeutic agent for cancer.
[22] Administering a prophylactically or therapeutically effective amount of the cell according to any one of [11] to [20] or the cell produced using the method according to any one of [1] to [10] A method for preventing or treating cancer, comprising:

本発明によれば、造腫瘍性が抑制されたヒトミエロイド系血液細胞を作製することが可能となり得る。本発明により提供されるヒトミエロイド系血液細胞を、腫瘍を有する哺乳動物に投与すると、ヒトM−CSF及び／又はヒトGM−CSFの存在下においてもヒトミエロイド系血液細胞自身は造腫瘍性を示さずに、哺乳動物内の腫瘍の増殖を阻害し、縮小化を行い、若しくは転移を抑制するなどの優れた癌（悪性腫瘍）の予防又は治療効果をもたらし得る。すなわち、本発明によれば、ヒトM−CSF及び／又はヒトGM−CSFが通常存在するヒト体内においても、ヒトミエロイド系血液細胞自身が腫瘍を形成せずに、ヒト体内の腫瘍形成を抑制し得るなどの効果を発揮し得る。従って、本発明により、癌（悪性腫瘍）に対する優れた免疫細胞治療医薬品を提供することが可能となり得、さらに、癌（悪性腫瘍）に対する予防又は治療方法を提供することが可能となり得る。   According to the present invention, it may be possible to produce human myeloid blood cells with suppressed tumorigenicity. When human myeloid blood cells provided by the present invention are administered to a mammal having a tumor, the human myeloid blood cells themselves exhibit tumorigenicity even in the presence of human M-CSF and / or human GM-CSF. In addition, it can provide an excellent preventive or therapeutic effect for cancer (malignant tumor) such as inhibiting the growth of a tumor in a mammal, reducing the size, or suppressing metastasis. That is, according to the present invention, even in the human body where human M-CSF and / or human GM-CSF is usually present, human myeloid blood cells themselves do not form tumors and suppress tumor formation in the human body. The effect of obtaining can be demonstrated. Therefore, according to the present invention, it is possible to provide an excellent immune cell therapeutic drug for cancer (malignant tumor), and further, it may be possible to provide a preventive or therapeutic method for cancer (malignant tumor).

図１は、本発明の一態様の概要を示す図である。FIG. 1 is a diagram illustrating an outline of one embodiment of the present invention. 図２は、iPS−ML及びiPS−TML作成に使用したレンチウイルス発現ベクターの構造を示す図である。EF1プロモーターcMYC、EF1プロモーターBMI1、EF1プロモーターMDM2、EF1プロモーターM−CSF、EF1プロモーターM−CSF、EF1プロモーターrtTA及びTetR（テトラサイクリン応答性）プロモーターcMYCの構造を示す。FIG. 2 is a diagram showing the structure of a lentiviral expression vector used for preparation of iPS-ML and iPS-TML. The structures of EF1 promoter cMYC, EF1 promoter BMI1, EF1 promoter MDM2, EF1 promoter M-CSF, EF1 promoter M-CSF, EF1 promoter rtTA and TetR (tetracycline responsive) promoter cMYC are shown. 図３は、iPS−ML及びiPS−TML作成法の概要を示す図である。FIG. 3 is a diagram showing an outline of an iPS-ML and iPS-TML creation method. 図４は、iPS−ML、iPS−ML／M＋GM、iPS−TML又はiPS−TML／M＋GMの作成に際して導入した因子及び細胞増殖に必要な因子を示す図である。FIG. 4 is a diagram showing factors introduced in the production of iPS-ML, iPS-ML / M + GM, iPS-TML or iPS-TML / M + GM and factors necessary for cell proliferation. 図５は、iPS−ML、iPS−ML／M＋GM、及びiPS−TML／M＋GMの顕微鏡写真を示す図である。FIG. 5 shows micrographs of iPS-ML, iPS-ML / M + GM, and iPS-TML / M + GM. 図６は、iPS−TML／M＋GMのドキシサイクリン依存性増殖を示す図である。FIG. 6 is a diagram showing doxycycline-dependent proliferation of iPS-TML / M + GM. 図７は、iPS−TML／M＋GMのドキシサイクリン依存性増殖を示す図である。FIG. 7 is a diagram showing doxycycline-dependent proliferation of iPS-TML / M + GM. 図８は、テトラサイクリン反応性プロモーターによるcMYCの発現制御とiPS−TMLの増殖制御を示す図である。FIG. 8 is a diagram showing cMYC expression control and iPS-TML growth control by a tetracycline-responsive promoter. 図９は、NOD／SCIDマウスを用いた、iPS−ML、iPS−ML／M＋GM又はiPS−TML／M＋GMの造腫瘍性を検討した結果を示す図である。FIG. 9 is a diagram showing the results of examining the tumorigenicity of iPS-ML, iPS-ML / M + GM or iPS-TML / M + GM using NOD / SCID mice.

以下、本発明を、例示的な実施態様を例として詳細に説明するが、本発明は以下に記載の実施態様に限定されるものではない。
なお、文中で特に断らない限り、本明細書で用いるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味をもつ。また、本明細書に記載されたものと同等又は同様の任意の材料及び方法は、本発明の実施において同様に使用することができる。
また、本明細書に記載された発明に関連して本明細書中で引用されるすべての刊行物及び特許は、例えば、本発明で使用できる方法や材料その他を示すものとして、本明細書の一部を構成するものである。
本明細書において「及び／又は」は、いずれか一方、あるいは、両方を包含する意味で使用される。 Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of exemplary embodiments, but the present invention is not limited to the embodiments described below.
Unless otherwise noted in the text, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. In addition, any materials and methods equivalent or similar to those described herein can be used as well in the practice of the invention.
In addition, all publications and patents cited in this specification in relation to the invention described herein are hereby incorporated by reference, as examples of methods, materials, etc. that can be used with the invention. Part of it.
In the present specification, “and / or” is used in a sense including either one or both.

１．造腫瘍性が抑制されたヒトミエロイド系血液細胞の作製方法
本発明は、c−MYC遺伝子を発現するヒトミエロイド系血液細胞において当該c−MYC遺伝子の発現を抑制する工程を含む、造腫瘍性が抑制されたヒトミエロイド系血液細胞の作製方法（本明細書中、本発明の作製方法とも称する）を提供する。
本発明において造腫瘍性とは、ヒトミエロイド系血液細胞を動物に投与（移植）した場合に、該動物個体において該細胞に由来する腫瘍が形成されることを意味し、従って、「造腫瘍性が抑制された」ヒトミエロイド系血液細胞とは、該細胞を動物個体に投与（移植）した場合に、移植したヒトミエロイド系血液細胞が腫瘍を形成しないことを意味する。 1. The present invention relates to a method for producing human myeloid blood cells with suppressed tumorigenicity.The present invention comprises a step of suppressing the expression of c-MYC gene in human myeloid blood cells expressing c-MYC gene. Provided is a method for producing a suppressed human myeloid blood cell (also referred to herein as a production method of the present invention).
In the present invention, tumorigenicity means that when a human myeloid blood cell is administered (transplanted) to an animal, a tumor derived from the cell is formed in the animal individual. The term “inhibited human myeloid blood cells” means that when the cells are administered (transplanted) to an animal individual, the transplanted human myeloid blood cells do not form a tumor.

本発明の方法工程（C）において、ヒトミエロイド系血液細胞が発現するc−MYC遺伝子は、該ヒトミエロイド系血液細胞をin vitroで増殖させない程度の量であってもよく、該ヒトミエロイド系血液細胞をin vitroで増殖させる程度の量であってもよい。
本発明の好ましい一態様において、ヒトミエロイド系血液細胞は、該細胞のin vitroでの増殖を促進させ得る量のc−MYC遺伝子を発現する。 In the method step (C) of the present invention, the c-MYC gene expressed by human myeloid blood cells may be in an amount that does not allow the human myeloid blood cells to proliferate in vitro. It may be an amount that allows cells to grow in vitro.
In a preferred embodiment of the present invention, human myeloid blood cells express an amount of the c-MYC gene that can promote proliferation of the cells in vitro.

本発明の方法工程（C）において、ヒトミエロイド系血液細胞が発現するc−MYC遺伝子は、外来性プロモーター（好ましくは調節性プロモーターであり、より好ましくは誘導可能な調節性プロモーター）と機能的に連結された内在性c−MYC遺伝子であってもよく、或いは内在性プロモーター又は外来性プロモーター（好ましくは調節性プロモーターであり、より好ましくは誘導可能な調節性プロモーター）と機能的に連結された外来性c−MYC遺伝子であってもよい。c−MYC遺伝子を発現する細胞の入手の容易さ及びc−MYC遺伝子の発現の抑制の容易さの観点から、本発明の方法工程（C）において、ヒトミエロイド系血液細胞が発現するc−MYC遺伝子は、好ましくは、外来性プロモーターと機能的に連結された外来性c−MYC遺伝子であり、より好ましくは調節性プロモーターと機能的に連結された外来性c−MYC遺伝子であり、さらに好ましくは誘導可能な調節性プロモーターと機能的に連結された外来性c−MYC遺伝子である。   In the method step (C) of the present invention, the c-MYC gene expressed by human myeloid blood cells is functionally combined with an exogenous promoter (preferably a regulatable promoter, more preferably an inducible regulatable promoter). It may be a linked endogenous c-MYC gene, or a foreign operably linked to an endogenous promoter or an exogenous promoter (preferably a regulatable promoter, more preferably an inducible regulatable promoter). It may be a sex c-MYC gene. From the viewpoint of easy availability of cells expressing c-MYC gene and ease of suppression of expression of c-MYC gene, c-MYC expressed by human myeloid blood cells in the method step (C) of the present invention The gene is preferably an exogenous c-MYC gene operably linked to an exogenous promoter, more preferably an exogenous c-MYC gene operably linked to a regulatory promoter, more preferably An exogenous c-MYC gene operably linked to an inducible regulatable promoter.

本発明の作製方法は、in vitroにおいて行われる。   The production method of the present invention is performed in vitro.

（１）c−MYC遺伝子を発現するヒトミエロイド系血液細胞
本発明において「ミエロイド系血液細胞」とは、CD11b（インテグリンαMとしても知られる）分子及び／又はCD33（sialic acid binding Ig−like lectin 3、SIGLEC3、SIGLEC−3、gp67又はp67としても知られる）分子が細胞表面に存在する細胞として定義される。本発明に用いるヒトミエロイド系血液細胞は、好ましくはCD11bを発現する（CD11b陽性）細胞であり、より好ましくはCD45（Protein tyrosine phosphatase, receptor type, C、PTPRCとしても知られる）及びCD11b陽性細胞であり、さらに好ましくはCD11b及びCD45陽性である浮遊細胞である。 (1) Human myeloid blood cell expressing c-MYC gene In the present invention, “myeloid blood cell” means CD11b (also known as integrin αM) molecule and / or CD33 (sialic acid binding Ig-like lectin 3 , Also known as SIGLEC3, SIGLEC-3, gp67, or p67) is defined as a cell on the cell surface. Human myeloid blood cells used in the present invention are preferably cells that express CD11b (CD11b positive), more preferably CD45 (also known as protein tyrosine phosphatase, receptor type, C, PTPRC) and CD11b positive cells. Yes, more preferred are floating cells that are positive for CD11b and CD45.

本明細書中、「浮遊細胞」とは、培養器などの支持体に付着しておらず、適当な液体培地中を自由に移動する細胞を意味する。   In the present specification, the “floating cell” means a cell that is not attached to a support such as an incubator and moves freely in a suitable liquid medium.

本発明に用いるヒトミエロイド系血液細胞の由来は特に限定されるものではないが、例えば、ヒト多能性幹細胞に由来するヒトミエロイド系血液細胞、生体（例えば、ヒト血液）から採取されたヒトミエロイド系血液細胞（例えば、末梢血単球）が例として挙げられる。本発明において用いられるヒトミエロイド系血液細胞は、好ましくは、ヒト多能性幹細胞に由来するヒトミエロイド系血液細胞であり、より好ましくはヒト多能性幹細胞由来の中胚葉系細胞をM−CSF存在下で（さらにより好ましくはM−CSF及びGM−CSF存在下で）一定期間培養することにより得られるCD11b陽性細胞（より好ましくはCD45及びCD11b陽性細胞、さらに好ましくはCD45及びCD11b陽性である浮遊細胞）である。   The origin of the human myeloid blood cells used in the present invention is not particularly limited. For example, human myeloid blood cells derived from human pluripotent stem cells, human myeloid collected from a living body (for example, human blood) Systemic blood cells (eg, peripheral blood monocytes) are examples. The human myeloid blood cells used in the present invention are preferably human myeloid blood cells derived from human pluripotent stem cells, and more preferably mesodermal cells derived from human pluripotent stem cells are present in M-CSF. CD11b positive cells (more preferably CD45 and CD11b positive cells, more preferably CD45 and CD11b positive floating cells) obtained by culturing for a certain period of time under (even more preferably in the presence of M-CSF and GM-CSF) ).

本明細書中、「多能性幹細胞（PSC）」とは、未分化状態を保持しながら増殖することを可能とする「自己複製」、及び胚の３つ全ての一次胚葉に分化することを可能とする「多能性」を保有する、いかなる未分化細胞でもあってもよい。本発明において用いる多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（ES細胞）又は誘導多能性幹細胞（iPS細胞）が好ましく、iPS細胞がより好ましい。   In this specification, “pluripotent stem cell (PSC)” means “self-replication” that allows proliferation while maintaining an undifferentiated state, and differentiation into all three primary germ layers of an embryo. It can be any undifferentiated cell that possesses the “pluripotency” that it enables. As the pluripotent stem cell used in the present invention, an embryonic stem cell (ES cell) or an induced pluripotent stem cell (iPS cell) is preferable, and an iPS cell is more preferable.

ES細胞は、初期胚（例えば、胚盤胞）の内部細胞塊から樹立することのできる、多能性と自己複製による増殖能を有する幹細胞である。ES細胞は、ヒトの受精卵の胚盤胞から内部細胞塊を取り出し、線維芽細胞フィーダー細胞上で、内部細胞塊を培養することにより樹立することができる。ヒトES細胞の樹立及び維持方法は公知である。   ES cells are stem cells that can be established from the inner cell mass of early embryos (for example, blastocysts) and have the ability to proliferate by self-replication. ES cells can be established by removing an inner cell mass from a blastocyst of a human fertilized egg and culturing the inner cell mass on a fibroblast feeder cell. Methods for establishing and maintaining human ES cells are known.

誘導多能性幹（iPS）細胞は、体細胞に由来する人工的な幹細胞であって、特異的な再プログラム化因子をDNA又はタンパク質の形態で体細胞に導入することにより製造することができ、ES細胞とほぼ同等の特性（例、分化多能性及び自己複製に基づく増殖能）を示す（K. Takahashi及びS. Yamanaka (2006) Cell, 126:663−676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131:861−872; J. Yu et al. (2007), Science, 318:1917−1920; Nakagawa, M. et al., Nat. Biotechnol. 26:101−106 (2008); WO2007/069666）。再プログラム化因子は、ES細胞で特異的に発現される遺伝子、その遺伝子産物若しくはその非コードRNA、ES細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子、その遺伝子産物若しくはその非コードRNA、又は低分子量化合物で構成されてもよい。再プログラム化因子に含まれる遺伝子の例としては、Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c−MYC、N−Myc、L−Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15−2、Tcl1、beta−catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3、Glis1等が挙げられる。これらの再プログラム化因子は、単独で、あるいは組合わせて使用してもよい。なお、再プログラミング因子としてｃ−MYCの遺伝子を体細胞に導入して用いる場合は、iPS細胞の作成後に、導入したｃ−MYC遺伝子が標的細胞の染色体に組み込まれる可能性が低い導入方法を用いるのが好ましく、例えば、これに限定されないが、センダイウイルスベクターやエピゾーマルベクターを用いた導入をあげることができる。   Induced pluripotent stem (iPS) cells are artificial stem cells derived from somatic cells that can be produced by introducing specific reprogramming factors into somatic cells in the form of DNA or protein. , Show almost the same characteristics as ES cells (eg, proliferation ability based on differentiation pluripotency and self-replication) (K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126: 663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131: 861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318: 1917-1920; Nakagawa, M. et al., Nat. Biotechnol. 26: 101-106 (2008) ; WO2007 / 069666). A reprogramming factor is a gene that is specifically expressed in ES cells, its gene product or its non-coding RNA, a gene that plays an important role in maintaining undifferentiation of ES cells, its gene product or its non-coding RNA, or It may be composed of a low molecular weight compound. Examples of genes included in the reprogramming factor include Oct3 / 4, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Klf4, Klf2, c-MYC, N-Myc, L-Myc, Nanog, Lin28, Fbx15, ERas , ECAT15-2, Tcl1, beta-catenin, Lin28b, Sall1, Sall4, Esrrb, Nr5a2, Tbx3, Glis1, and the like. These reprogramming factors may be used alone or in combination. When a c-MYC gene is introduced into a somatic cell as a reprogramming factor, an introduction method is used that has a low possibility that the introduced c-MYC gene is integrated into the chromosome of the target cell after the creation of the iPS cell. For example, but not limited to this, introduction using a Sendai virus vector or episomal vector can be mentioned.

ES細胞又はiPS細胞の作製方法、培養方法、未分化状態の維持方法などは自体公知であり、例えば上記に例示した文献に記載の方法に準じて、作製及び培養することができる。   ES cell or iPS cell production methods, culture methods, undifferentiated state maintenance methods, and the like are known per se, and can be produced and cultured in accordance with, for example, the methods described in the literature exemplified above.

本発明において、「ヒト多能性幹細胞に由来するヒトミエロイド系血液細胞」とは、ヒト多能性幹細胞を生体外（in vitro）で培養し分化誘導することにより作製された細胞であって、細胞表面上にヒトミエロイド系血液細胞のマーカー分子であるCD11b或いはCD33分子を発現する細胞を言う。   In the present invention, “human myeloid blood cells derived from human pluripotent stem cells” are cells produced by inducing differentiation by culturing human pluripotent stem cells in vitro (in vitro), A cell that expresses CD11b or CD33 molecule, which is a marker molecule of human myeloid blood cells, on the cell surface.

ヒト多能性幹細胞をヒトミエロイド系血液細胞へ分化誘導する方法は、例えば、Su, Z, et al., (2008) Clin Cancer Res 14:6207−6217、Tseng, SY et al., (2009) Regen Med 4:513−526、Senju S et al.,(2007) Stem cells 25:2720−2729、Choi, KD et al., (2009) J Clin Invest 119:2818−2829、特許文献１、国際公開2008/056734号などに記載されている。   Methods for inducing differentiation of human pluripotent stem cells into human myeloid blood cells are described, for example, in Su, Z, et al., (2008) Clin Cancer Res 14: 6207-6217, Tseng, SY et al., (2009). Regen Med 4: 513-526, Senju S et al., (2007) Stem cells 25: 2720-2729, Choi, KD et al., (2009) J Clin Invest 119: 2818-2829, Patent Document 1, International Publication It is described in 2008/056734.

以下において、ミエロイド系血液細胞入手方法の例について具体的に説明するが、所望の効果を有する限り、ミエロイド系血液細胞入手方法は限定されるものではない。   Hereinafter, an example of a method for obtaining myeloid blood cells will be described in detail. However, the method for obtaining myeloid blood cells is not limited as long as the method has a desired effect.

（多能性幹細胞からヒトミエロイド系血液細胞を作製する方法）
本発明において、ヒト多能性幹細胞からヒトミエロイド系血液細胞を作製する方法の例としては、
下記の工程（A1）又は（A1'）を行い、その後工程（A2）を行うことを含む方法が挙げられる：
（A1）ヒト多能性幹細胞と、血液細胞の分化と増殖とを誘導する性質を有する細胞とを共培養し、該ヒト多能性幹細胞の培養の結果物として、細胞集団A1を得る工程、
（A1'）ヒト多能性幹細胞を未分化性非維持条件下で培養し、該ヒト多能性幹細胞の培養の結果物として、細胞集団A1'を得る工程、
（A2）前記工程（A1）で得られた細胞集団A1又は前記工程（A1'）で得られた細胞集団A1'を、M−CSF及び／又はGM−CSF存在下で培養して、該細胞集団A1又は該細胞集団A1'の培養の結果物として、細胞集団A2を得る工程。 (Method for producing human myeloid blood cells from pluripotent stem cells)
In the present invention, as an example of a method for producing human myeloid blood cells from human pluripotent stem cells,
Examples include a method including performing the following step (A1) or (A1 ′) and then performing step (A2):
(A1) a step of co-culturing human pluripotent stem cells and cells having the property of inducing differentiation and proliferation of blood cells, and obtaining cell population A1 as a result of culturing the human pluripotent stem cells;
(A1 ′) culturing human pluripotent stem cells under undifferentiated non-maintenance conditions, and obtaining cell population A1 ′ as a result of culturing the human pluripotent stem cells;
(A2) The cell population A1 obtained in the step (A1) or the cell population A1 ′ obtained in the step (A1 ′) is cultured in the presence of M-CSF and / or GM-CSF, A step of obtaining a cell population A2 as a result of culturing the population A1 or the cell population A1 ′.

本明細書中、上記細胞集団A1及び細胞集団A1'を総称して、中胚葉系細胞と称する。   In the present specification, the cell population A1 and the cell population A1 ′ are collectively referred to as mesodermal cells.

― 工程A１
血液細胞の分化と増殖とを誘導する性質を有する細胞をフィーダー細胞として、ヒト多能性幹細胞と、該フィーダー細胞とを共培養することにより、ヒト多能性幹細胞を、中胚葉系細胞を含む細胞集団に分化させることができる。
「血液細胞の分化と増殖とを誘導する性質を有する細胞」としては、例えば、OP9細胞（理研バイオリソースセンター寄託番号：RCB1124）、ST2細胞（理研バイオリソースセンター寄託番号：RCB0224）、PA6細胞（理研バイオリソースセンター寄託番号：RCB1127）等が挙げられ、なかでも、血球細胞への分化誘導効率を向上させる観点から、OP9細胞（理研バイオリソースセンター寄託番号：RCB1124）を用いることが好ましい。
該フィーダー細胞の培養に適した培地及びその培養条件については、国際公開2008/056734号などに記載されており、それらに記載の方法に準じて培養を行うことができる。 ― Process A1
Human pluripotent stem cells, including mesodermal cells, are co-cultured with human pluripotent stem cells and the feeder cells using cells having the property of inducing differentiation and proliferation of blood cells as feeder cells. It can be differentiated into a cell population.
Examples of “cells having the property of inducing differentiation and proliferation of blood cells” include, for example, OP9 cells (RIKEN BioResource Center deposit number: RCB1124), ST2 cells (RIKEN Bioresource Center deposit number: RCB0224), PA6 cells (RIKEN bioresource) Center deposit number: RCB1127), among others, from the viewpoint of improving the efficiency of differentiation induction into blood cells, it is preferable to use OP9 cells (RIKEN BioResource Center deposit number: RCB1124).
The culture medium suitable for the culture of the feeder cells and the culture conditions thereof are described in International Publication No. 2008/056734, and the culture can be performed according to the methods described therein.

フィーダー細胞は、適切な培地の入った培養器において、該フィーダー細胞に応じた培養条件下に培養し、該培養器の底面をほぼ覆う程度まで増殖させ、マイトマイシンC溶液による処理又は放射線照射により細胞増殖を失わせた後に、再度、別途用意した細胞培養器に移植してフィーダー細胞層を形成させて用いることができる。このようにして作製したフィーダー細胞上に、上記ヒト多能性幹細胞を播種し、共培養を行うことができる。   Feeder cells are cultured in an incubator containing an appropriate medium under the culture conditions according to the feeder cells, grown to the extent that the bottom surface of the incubator is almost covered, and treated by treatment with mitomycin C solution or irradiation. After the growth is lost, the cells can be transplanted again into a separately prepared cell culture vessel to form a feeder cell layer and used. The human pluripotent stem cells can be seeded on the feeder cells thus prepared, and co-culture can be performed.

フィーダー細胞とヒト多能性幹細胞との共培養に用いる培養液は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、所望の中胚葉系細胞が得られる限り限定されるものではないが、αMEM（イーグル最小必須培地 α改変型）、DMEM（ダルベッコ改変イーグル培地）、IMDM（イスコブ改変ダルベッコ培地）など、及びこれらの混合物が挙げられる。培地には、血清が含有されていてもよく、あるいは無血清でもよく、必要に応じて、培地は、血清代替物を含んでもよく、脂質、アミノ酸、L−グルタミン、Glutamax（Invitrogen）、非必須アミノ酸、ビタミン、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの1つ以上の培地添加物も含有し得る。所望の細胞が得られる限り特に限定されるものではないが、マイトマイシンC処理又は放射線照射により増殖能力を失わせたOP9細胞をフィーダー細胞として用いる場合、ヒト多能性幹細胞との共培養に用いる好ましい培養液の例としては、20％の血清（FCS）を含有したαMEM培地が挙げられる。   A culture solution used for co-culture of feeder cells and human pluripotent stem cells can be prepared using a medium used for culturing animal cells as a basal medium. The basal medium is not limited as long as desired mesodermal cells can be obtained. ΑMEM (eagle minimum essential medium α modified type), DMEM (Dulbecco modified Eagle medium), IMDM (Iscob modified Dulbecco medium), etc. , And mixtures thereof. The medium may contain serum or may be serum-free, and if necessary, the medium may contain serum substitutes, lipids, amino acids, L-glutamine, Glutamax (Invitrogen), non-essential One or more media additives such as amino acids, vitamins, antibiotics, antioxidants, pyruvate, buffers, inorganic salts and the like may also be included. Although it is not particularly limited as long as desired cells can be obtained, when OP9 cells whose growth ability has been lost by mitomycin C treatment or irradiation are used as feeder cells, they are preferably used for co-culture with human pluripotent stem cells. An example of the culture solution is αMEM medium containing 20% serum (FCS).

本発明において用いる培養器としては、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、及びローラーボトルを包含し得るが、特に限定されない。   Incubators used in the present invention include flasks, tissue culture flasks, dishes, petri dishes, tissue culture dishes, multi dishes, micro plates, micro well plates, multi plates, multi well plates, micro slides, chamber slides, petri dishes. , Tubes, trays, culture bags, and roller bottles, but are not particularly limited.

培養器は細胞接着性であり得る。細胞接着性の培養器は、器表面の細胞接着性を改善させる目的で、細胞外マトリックス（ECM）などの任意の細胞接着用基質でコートされたものであり得る。細胞接着用基質は、ヒト多能性幹細胞又はフィーダー細胞（用いられる場合）の接着を目的とする任意の材料であり得る。細胞接着用基質としては、コラーゲン、ゼラチン、ポリ−L−リシン、ポリ−D−リシン、ポリ−L−オルチニン、ラミニン及びフィブロネクチン、並びに例えばマトリゲル等のそれらの混合物、並びに溶解細胞膜調製物（lysed cell membrane preparation）が挙げられる（Klimanskaya I et al 2005. Lancet 365：p1636−1641）。   The incubator can be cell adherent. The cell adhesion incubator can be coated with any cell adhesion substrate such as an extracellular matrix (ECM) for the purpose of improving cell adhesion on the surface of the vessel. The substrate for cell adhesion can be any material intended for adhesion of human pluripotent stem cells or feeder cells (if used). Cell adhesion substrates include collagen, gelatin, poly-L-lysine, poly-D-lysine, poly-L-ortinin, laminin and fibronectin, and mixtures thereof such as, for example, matrigel, and lysed cell membrane preparations. membrane preparation) (Klimanskaya I et al 2005. Lancet 365: p1636-1641).

所望の細胞が得られる限り特に限定されるものではないが、マイトマイシンC処理又は放射線照射により増殖能力を失わせたOP9細胞をフィーダー細胞として用いる場合、例えば0.1重量％ゼラチン溶液等でコーティングされた培養器を用いることができる。   Although not particularly limited as long as desired cells can be obtained, when OP9 cells whose growth ability has been lost by mitomycin C treatment or irradiation are used as feeder cells, for example, a culture coated with a 0.1% gelatin solution or the like Can be used.

上記共培養の気相条件は、用いられるヒト多能性幹細胞の種類、培養液の組成等に応じて、適宜設定されうるが、通常、1〜10％CO2／99〜90％大気の雰囲気下、インキュベーター中で約30〜40℃、好ましくは約37℃で、培養することができる。培養期間は、所望の中胚葉系細胞が得られる限り限定されるものではないが、通常10日以上、好ましくは約15日以上、培養する。
上記共培養により得られる細胞集団は、中胚葉系細胞の性質を示すものであり、球状に近い形態を示す細胞の塊を含有する細胞集団として得られうる。 Gas phase conditions for the co-culture, the type of human pluripotent stem cells used, depending on the composition of the culture medium, but may be set appropriately, usually of 1~10% CO 2 / 99~90% air atmosphere Below, it can culture | cultivate at about 30-40 degreeC in an incubator, Preferably it is about 37 degreeC. The culture period is not limited as long as a desired mesodermal cell can be obtained, but it is usually cultured for 10 days or longer, preferably about 15 days or longer.
The cell population obtained by the above co-culture exhibits the properties of mesodermal cells and can be obtained as a cell population containing a mass of cells exhibiting a nearly spherical shape.

ヒト多能性幹細胞とフィーダー細胞との共培養物から、特に、ヒト多能性幹細胞に由来し、中胚葉系細胞に分化した細胞を多く含む浮遊細胞集団を分離して、後の工程に用いることが好ましい。
分化した中胚葉系細胞を多く含む浮遊細胞集団を分離する方法としては、共培養後に回収した細胞を培養器中に静置して付着性の強い細胞を除去することにより、付着性の弱い細胞である中胚葉系細胞を回収する方法を挙げることができる。例えば、上記共培養物をトリプシン、コラゲナーゼ等の酵素で処理し、全細胞を回収し、DMEM等の適切な培地適当量で希釈した後、該細胞溶液を新たに用意したゼラチンなどによりコートのされていないノンコートの培養器に播種する。播種から2〜5時間経過した後、培養器に付着しなかった細胞を、中胚葉系細胞を多く含む浮遊細胞集団として回収することができる。また、回収した細胞浮遊液に含まれる100μm以上の大きさの細胞塊は、ナイロン製のメッシュ（例えば、BD.Falcon社、セルストレイナー、100μmナイロン）等を用いて除去することが好ましい。 From a co-culture of human pluripotent stem cells and feeder cells, in particular, a floating cell population derived from human pluripotent stem cells and containing many cells that have differentiated into mesodermal cells is used for subsequent steps. It is preferable.
As a method of separating a floating cell population that contains a lot of differentiated mesodermal cells, cells that have been collected after co-culture are left in the incubator to remove cells with weak adhesion, and cells with weak adhesion are removed. And a method for recovering mesodermal cells. For example, the co-culture is treated with an enzyme such as trypsin or collagenase, whole cells are collected, diluted with an appropriate amount of an appropriate medium such as DMEM, and the cell solution is coated with newly prepared gelatin or the like. Seed in an uncoated incubator. After 2 to 5 hours have passed since seeding, cells that did not adhere to the incubator can be collected as a floating cell population containing a lot of mesodermal cells. Moreover, it is preferable to remove a cell mass having a size of 100 μm or more contained in the collected cell suspension using a nylon mesh (for example, BD. Falcon, Cell Strainer, 100 μm nylon).

― 工程A１’
中胚葉系細胞集団は、未分化性非維持条件下でヒト多能性幹細胞を培養することによっても得ることができる。 ― Process A1 '
Mesodermal cell populations can also be obtained by culturing human pluripotent stem cells under undifferentiated non-maintaining conditions.

本明細書中、多能性幹細胞の「未分化性非維持条件」とは、多能性幹細胞に胚様体を形成させることにより、或いは何か他の方法によって、分化経路に向けて分化を開始させるような条件をいう。   In the present specification, “undifferentiated non-maintaining conditions” for pluripotent stem cells refer to differentiation toward the differentiation pathway by forming embryoid bodies in pluripotent stem cells or by some other method. A condition that starts.

分化経路に向けて分化が開始される限り特に限定されるものではないが、「未分化性非維持条件」の具体的な例としては、多能性幹細胞に胚様体又は凝集体を形成させるような条件が挙げられる。用語「胚様体」は「凝集体」と同義の専門用語であり、多能性幹細胞が単層培養において過剰増殖した場合又は懸濁培養液中で維持される場合に現れる、様々なサイズの分化細胞および未分化細胞の凝集塊を意味する。胚様体は、形態学的基準および免疫細胞化学的手法により検出可能な細胞マーカーによって識別可能ないくつかの胚葉に典型的に由来する、様々な細胞種の混合物である。中胚葉系細胞集団が得られる限り特に限定されるものではないが、例えば、胚様体は、多能性幹細胞を過剰増殖させることによるか、或いは低付着性の特性をもつ基質を有する培養器中の懸濁液において多能性幹細胞を培養することによって、作製することができる。「未分化性非維持条件」は、未分化維持因子の非存在下で多能性幹細胞を培養することによっても達成され得る。例えば、フィーダー細胞及び血清を含まない培地においては、未分化維持因子を含まない培地が挙げられる。本工程において、「未分化維持因子」とは、ヒト多能性幹細胞が多能性を維持したまま増殖するために必須の因子を意味する。例えば、未分化維持因子は、ヒト多能性幹細胞培養用として通常用いられるフィーダー細胞であり、あるいは、ヒトにおいては塩基性線維芽細胞成長因子（basic fibroblast growth factor（bFGF））である。「未分化維持因子の非存在下」とは、ヒト多能性幹細胞が多能性を維持したまま増殖するために十分な量の未分化維持因子が存在しない条件下を意味し、該条件下においては、ヒト多能性幹細胞は分化を開始する。   Although it is not particularly limited as long as differentiation is initiated toward the differentiation pathway, a specific example of “undifferentiated non-maintenance conditions” is to form embryoid bodies or aggregates in pluripotent stem cells Such conditions are mentioned. The term "embryoid body" is a technical term synonymous with "aggregate" and is of various sizes that appear when pluripotent stem cells are overgrown in monolayer culture or maintained in suspension culture. It means an aggregate of differentiated cells and undifferentiated cells. Embryoid bodies are a mixture of various cell types, typically derived from several germ layers that can be distinguished by morphological criteria and cell markers detectable by immunocytochemical techniques. Although it is not particularly limited as long as a mesoderm cell population is obtained, for example, an embryoid body is obtained by overproliferating pluripotent stem cells, or a culture vessel having a substrate with low adhesion characteristics It can be produced by culturing pluripotent stem cells in a suspension therein. “Undifferentiated non-maintaining conditions” can also be achieved by culturing pluripotent stem cells in the absence of an undifferentiated maintenance factor. For example, in a medium that does not contain feeder cells and serum, a medium that does not contain an undifferentiated maintenance factor can be mentioned. In this step, the “undifferentiation maintenance factor” means a factor essential for human pluripotent stem cells to proliferate while maintaining pluripotency. For example, the undifferentiated maintenance factor is a feeder cell usually used for culturing human pluripotent stem cells, or a basic fibroblast growth factor (bFGF) in humans. The term “in the absence of an undifferentiated maintenance factor” means a condition where there is no sufficient amount of an undifferentiated maintenance factor for human pluripotent stem cells to proliferate while maintaining pluripotency, In, human pluripotent stem cells initiate differentiation.

工程（A1'）で得られる細胞集団A1'は、胚様体を形成していてもよい。   The cell population A1 ′ obtained in the step (A1 ′) may form an embryoid body.

フィーダー細胞を用いない場合においても、ヒト多能性幹細胞の培養に用いる培養液は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、所望の中胚葉系細胞が得られる限り限定されるものではないが、αMEM、DMEM、IMDMなど、及びこれらの混合物が挙げられる。所望の中胚葉系細胞が得られる限りにおいて限定されるものではないが、フィーダー細胞及び血清を用いずに培養を行う場合の培地としては、Knockout Serum Replacement（KSR）（ライフテクノロジー社製）、Peprogrow III （ぺプロテック社製）などの血清代替物に加え、脂質、アミノ酸、L−グルタミン、Glutamax（Invitrogen）、非必須アミノ酸、ビタミン、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの1つ以上の培地添加物も含む培地が挙げられる。市販の無血清培養液（AIM−V、OpTmizer: ライフテクノロジー社 Stemline: シグマ社）を用いることもできる。また、培地には、ヒト多能性幹細胞の分化を促進する目的で、ヒトBMP−4 （Bone Morphogenic Protein 4）を添加してもよい。好ましい培地としては、OpTimizerTM T−Cell Expansion SFM （Life Technologies社）とStemline II Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium（SIGMA社）とを1：1で混合し、Peprogrow III（Peprotech社）及び5 ng／mL BMP−4を加えた培地である。 Even when feeder cells are not used, a culture solution used for culturing human pluripotent stem cells can be prepared using a medium used for culturing animal cells as a basal medium. The basal medium is not limited as long as desired mesodermal cells can be obtained, and examples include αMEM, DMEM, IMDM, and a mixture thereof. The medium is not limited as long as desired mesodermal cells can be obtained. As a medium for culturing without using feeder cells and serum, Knockout Serum Replacement (KSR) (manufactured by Life Technologies), Peprogrow In addition to serum substitutes such as III (manufactured by Peprotech), lipids, amino acids, L-glutamine, Glutamax (Invitrogen), non-essential amino acids, vitamins, antibiotics, antioxidants, pyruvic acid, buffers, inorganic salts And a medium containing one or more medium additives such as. A commercially available serum-free medium (AIM-V, OpTmizer: Life Technology Stemline: Sigma) can also be used. Further, human BMP-4 (Bone Morphogenic Protein 4) may be added to the medium for the purpose of promoting the differentiation of human pluripotent stem cells. As a preferable medium, OpTimizer ™ T-Cell Expansion SFM (Life Technologies) and Stemline II Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium (SIGMA) are mixed at a ratio of 1: 1, Peprogrow III (Peprotech) and 5 ng / mL BMP. Medium with -4 added.

フィーダー細胞を用いずに分化誘導を行う場合、細胞の培養器への付着を助けるために、フィブロネクチンなどによるコーティングを施した培養器を用いてもよい。培養器のコーティングに用いるフィブロネクチンは、ヒト血漿から精製したもの、あるいは、遺伝子組換えタンパク質として作製されたヒトフィブロネクチン断片等を用いることが可能である。   When differentiation induction is performed without using feeder cells, an incubator coated with fibronectin or the like may be used to help adhere cells to the incubator. Fibronectin used for coating of the incubator can be purified from human plasma, or can be a human fibronectin fragment prepared as a recombinant protein.

上記ヒトのフィブロネクチンをコートした培養器中で、ヒト多能性幹細胞を動物由来の血清を含有しない培養液（好ましくはBMP−4を含有する培地）を用いて、15日以上、好ましくは20日以上、より好ましくは25日以上培養する。   In the above-mentioned incubator coated with human fibronectin, human pluripotent stem cells are cultured for 15 days or more, preferably 20 days using a culture solution containing no animal-derived serum (preferably a medium containing BMP-4). More preferably, the culture is performed for 25 days or longer.

分化誘導培養を行うと様々な細胞系譜の分化細胞が出現するが、この中から中胚葉系細胞に分化した細胞を分離して、分離した細胞を、中胚葉系細胞を含む細胞集団として後の工程に用いることが好ましい。分化した中胚葉系細胞を分離する方法としては、フィーダー細胞を用いた分化誘導法の場合と同様に、培養後に回収した細胞を培養器中に静置して付着細胞を除去することにより、浮遊細胞である中胚葉系細胞を多く含む細胞集団を回収する方法を挙げることができる。   Differentiated cells of various cell lineages appear when differentiation-induced culture is performed. From these cells, cells that have differentiated into mesodermal cells are isolated, and the separated cells are later converted into cell populations containing mesodermal cells. It is preferable to use in the process. As a method for separating differentiated mesoderm cells, as in the case of the differentiation induction method using feeder cells, the cells collected after culturing are allowed to stand in an incubator to remove adherent cells. A method for recovering a cell population containing a large amount of mesodermal cells that are cells can be mentioned.

―工程A2
続いて、上記の通り得られた中胚葉系細胞を含む細胞集団を、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM−CSF）及び／又はマクロファージコロニー刺激因子（M−CSF）（好ましくはM−CSF存在下、より好ましくはGM−CSF及びM−CSF存在下）の存在下で、通常、1日〜20日、好ましくは2日〜15日、培養することにより、該中胚葉系細胞をヒトミエロイド系血液細胞に分化させることができる。 ―Process A2
Subsequently, the cell population containing mesodermal cells obtained as described above is used in the presence of granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) and / or macrophage colony stimulating factor (M-CSF) (preferably in the presence of M-CSF. In the presence of GM-CSF and M-CSF, the mesodermal cells are usually cultivated for 1 to 20 days, preferably 2 to 15 days. It can be differentiated into cells.

該培地中のGM−CSFタンパク質の含有量は、中胚葉系細胞からミエロイド系血液細胞への分化を促進させる観点から、50〜200 ng／mL、好ましくは70〜150 ng／mLの範囲とすることができる。
培地中のGM−CSFタンパク質は、培地と接触する細胞（例えば、外来性GM−CSF遺伝子を導入された中胚葉系細胞）から分泌されたものであってもよく、単離したGM−CSFタンパク質を培地に添加したものであってもよい。
また、培地中のM−CSFタンパク質の含有量は、中胚葉系細胞からミエロイド系血液細胞への分化を促進させる観点から、10〜100 ng／mL、好ましくは30〜70 ng／mLの範囲とすることができる。
培地中のM−CSFタンパク質は、培地と接触する細胞（例えば、外来性M−CSF遺伝子を導入された中胚葉系細胞）から分泌されたものであってもよく、単離したM−CSFタンパク質を培地に添加したものであってもよい。 The content of GM-CSF protein in the medium is in the range of 50 to 200 ng / mL, preferably 70 to 150 ng / mL, from the viewpoint of promoting differentiation from mesodermal cells to myeloid blood cells. be able to.
The GM-CSF protein in the medium may be secreted from a cell in contact with the medium (for example, a mesodermal cell into which an exogenous GM-CSF gene has been introduced), and the isolated GM-CSF protein May be added to the medium.
In addition, the content of M-CSF protein in the medium is in the range of 10 to 100 ng / mL, preferably 30 to 70 ng / mL, from the viewpoint of promoting differentiation from mesodermal cells to myeloid blood cells. can do.
The M-CSF protein in the medium may be secreted from a cell in contact with the medium (for example, a mesodermal cell into which an exogenous M-CSF gene has been introduced), and the isolated M-CSF protein May be added to the medium.

中胚葉系細胞のミエロイド系血液細胞への分化に要する培養期間としては、培養条件等により異なるが、通常、1日〜20日であり、好ましくは2日〜15日程度である。   The culture period required for the differentiation of mesoderm cells into myeloid blood cells varies depending on the culture conditions and the like, but is usually 1 day to 20 days, preferably about 2 days to 15 days.

その他の培養条件等は、中胚葉系細胞を含む細胞集団をミエロイド系血液細胞に分化させることができる限り特に限定されるものではなく、例えば、上述のフィーダー細胞の培養及び共培養と同様の培地、培養条件等を採用することができる。   Other culture conditions and the like are not particularly limited as long as the cell population containing mesodermal cells can be differentiated into myeloid blood cells. For example, the same culture medium as the above-described feeder cell culture and co-culture Culture conditions and the like can be employed.

上記の工程により得られる、GM−CSF及び／又はM−CSFの存在下で増殖可能な浮遊細胞は、通常、CD45＋ CD11＋ミエロイド系血液細胞である。従って、中胚葉系細胞をGM−CSF及び／又はM−CSF存在下で培養することにより得られた細胞集団から、浮遊性細胞を回収することで、ミエロイド系血液細胞を得ることができるため、得られた細胞集団からミエロイド系血液細胞のマーカー（例、CD11b、CD33又はCD45）に対して陽性である細胞をさらに選別しなくてもよい。しかしながら、より純度の高いヒトミエロイド系血液細胞を得ることなどを目的として、工程A3：ヒトミエロイド系血液細胞のマーカー（例、CD11b、CD33又はCD45）に対して陽性である細胞を選別する工程を行ってもよい。 The floating cells obtained by the above process and capable of growing in the presence of GM-CSF and / or M-CSF are usually CD45 + CD11 + myeloid blood cells. Therefore, myeloid blood cells can be obtained by recovering suspension cells from a cell population obtained by culturing mesoderm cells in the presence of GM-CSF and / or M-CSF. It is not necessary to further select cells that are positive for a myeloid blood cell marker (eg, CD11b, CD33, or CD45) from the obtained cell population. However, for the purpose of obtaining higher-purity human myeloid blood cells, etc., step A3: a step of selecting cells positive for human myeloid blood cell markers (eg, CD11b, CD33 or CD45) You may go.

所望の細胞が得られる限り特に限定されるものではないが、特定のマーカー（例、CD11b、CD33又はCD45）に対して陽性である細胞（或いは細胞集団）は、例えば、フローサイトメトリー、すなわちFACS（fluorescence activated cell sorting）を使用することにより分離することができる。例えば、CD11b陽性細胞は、抗CD11b抗体などの特異的な試薬への結合強度に基づき、並びに細胞の大きさ及び光散乱などの他のパラメーターに基づいて、セルソーターにより、CD11b陽性であるヒトミエロイド系血液細胞集団を分離することもできる。
マーカーについて陽性である細胞（或いは細胞集団）の分離は、例えば、該マーカーに対して特異的な抗体とアイソタイプ適合対照抗体とを用いたFACSにより行うことができる。細胞の、マーカーに対し特異的な抗体による染色の強度が、アイソタイプ適合対照抗体による細胞（或いは細胞集団）の染色の強度を上回る場合に、該細胞は該マーカー陽性であると決定することができる。また、細胞の、マーカーに対して特異的な抗体による染色の強度と、アイソタイプ適合対照抗体による細胞（或いは細胞集団）の染色の強度とに差が存在しない場合に、該細胞は該マーカー陰性であると決定することができる。 Although not particularly limited as long as the desired cells can be obtained, cells (or cell populations) that are positive for a specific marker (eg, CD11b, CD33, or CD45) are, for example, flow cytometry, ie FACS. Separation can be achieved by using (fluorescence activated cell sorting). For example, a CD11b positive cell is a human myeloid system that is CD11b positive by a cell sorter based on binding strength to a specific reagent such as an anti-CD11b antibody and based on other parameters such as cell size and light scattering. Blood cell populations can also be isolated.
Separation of cells (or cell populations) that are positive for the marker can be performed, for example, by FACS using an antibody specific for the marker and an isotype-matched control antibody. A cell can be determined to be positive if the intensity of staining with an antibody specific for the marker exceeds the intensity of staining of the cell (or cell population) with an isotype-matched control antibody. . In addition, if there is no difference between the intensity of staining with an antibody specific for the marker and the intensity of staining of the cell (or cell population) with an isotype-matched control antibody, the cell is negative for the marker. It can be determined that there is.

また、特定のマーカーに対して陽性である細胞は、従来の親和性又は抗体技術を用い、細胞を濃縮、枯渇、分離、選別、及び／又は精製することもできる。例えば、リガンド及び／又は抗体に、標識、例えば、磁気ビーズ；アビジン又はストレプトアビジンに対して高親和性で結合するビオチン；蛍光標示式細胞分取器で使用することのできる蛍光色素；ハプテン；及び同様物などを結合させることで、特定の細胞種の分離を容易にすることもできる。   Cells that are positive for a particular marker can also be enriched, depleted, separated, sorted, and / or purified using conventional affinity or antibody techniques. For example, ligands and / or antibodies with labels such as magnetic beads; biotin that binds with high affinity to avidin or streptavidin; fluorescent dyes that can be used in a fluorescence activated cell sorter; and haptens; and Separation of specific cell types can also be facilitated by combining similar substances.

好ましい態様において、ヒト多能性幹細胞からヒトミエロイド系血液細胞の作製方法は、下記の工程（A1）又は（A1'）を行い、その後工程（A2）を行い、任意で工程（A3）を行うことを含む：
（A1）ヒト多能性幹細胞と、血液細胞の分化と増殖とを誘導する性質を有する細胞（好ましくはST2細胞、PA6細胞及びOP9細胞からなる群より選択される細胞であり、より好ましくはOP9細胞）とを（好ましくは10日以上、より好ましくは約15日以上）共培養し、（さらに任意選択で、浮遊細胞の回収を行い）、該ヒト多能性幹細胞の培養の結果物として、細胞集団A1を得る工程、
（A1'）ヒト多能性幹細胞を未分化性非維持条件下で（好ましくはBMP−4タンパク質の存在下）（好ましくは15日以上、より好ましくは約20日以上）培養し、（さらに任意選択で、浮遊細胞の回収を行い）、該ヒト多能性幹細胞の培養の結果物として、細胞集団A1'を得る工程、
（A2）前記工程（A1）で得られた細胞集団A1又は前記工程（A1'）で得られた細胞集団A1'を、M−CSF（通常10〜100 ng／mL、好ましくは30〜70 ng／mL）存在下（さらに好ましくは、M−CSF：通常10〜100 ng／mL、好ましくは30〜70 ng／mL、及びGM−CSF：通常50〜200 ng／mL、好ましくは70〜150 ng／mL存在下）で（好ましくは1日以上、より好ましくは1日〜20日、さらに好ましくは2日〜15日）培養して、該細胞集団A1又は該細胞集団A1'の培養の結果物として、細胞集団A2を得る工程、
（A3）ヒトミエロイド系血液細胞のマーカー（例、CD11b、CD33又はCD45、好ましくはCD11b、より好ましくはCD11b及びCD45）に対して陽性である細胞を選別する工程。 In a preferred embodiment, the method for producing human myeloid blood cells from human pluripotent stem cells includes the following step (A1) or (A1 ′), followed by step (A2), and optionally step (A3). Including:
(A1) Human pluripotent stem cells and cells having the property of inducing differentiation and proliferation of blood cells (preferably cells selected from the group consisting of ST2 cells, PA6 cells and OP9 cells, more preferably OP9 Cells) (preferably 10 days or more, more preferably about 15 days or more), and (optionally, collecting floating cells), as a result of culturing the human pluripotent stem cells, Obtaining a cell population A1,
(A1 ′) Human pluripotent stem cells are cultured under undifferentiated non-maintaining conditions (preferably in the presence of BMP-4 protein) (preferably 15 days or more, more preferably about 20 days or more) A step of collecting floating cells by selection), and obtaining a cell population A1 ′ as a result of culturing the human pluripotent stem cells;
(A2) The cell population A1 obtained in the step (A1) or the cell population A1 ′ obtained in the step (A1 ′) is converted into M-CSF (usually 10 to 100 ng / mL, preferably 30 to 70 ng). / ML) in the presence (more preferably, M-CSF: usually 10 to 100 ng / mL, preferably 30 to 70 ng / mL, and GM-CSF: usually 50 to 200 ng / mL, preferably 70 to 150 ng (Preferably 1 day or more, more preferably 1 to 20 days, even more preferably 2 to 15 days) in the presence of / mL, and the result of culturing the cell population A1 or the cell population A1 ′ Obtaining a cell population A2,
(A3) A step of selecting cells that are positive for markers of human myeloid blood cells (eg, CD11b, CD33 or CD45, preferably CD11b, more preferably CD11b and CD45).

（ヒト末梢血からヒトミエロイド系血液細胞を単離する方法）
本発明においては、生体内（例えば、ヒトの体内）に存在するヒトミエロイド系血液細胞を用いることも可能である。生体内に存在するヒトミエロイド系血液細胞として、例えば、末梢血中の単球（モノサイト）を用いることも可能であり、ヒトミエロイド系血液細胞としてヒトの末梢血単球を用いることが好ましい。以下に、生体内に存在するヒトミエロイド系血液細胞を得る方法の一例としてヒトの末梢血中からの単球の分離方法を説明するが、本発明において用いられるヒトミエロイド系血液細胞を得る方法は、この方法に限定されるものではない。 (Method for isolating human myeloid blood cells from human peripheral blood)
In the present invention, it is also possible to use human myeloid blood cells present in the living body (for example, the human body). As human myeloid blood cells existing in the living body, for example, monocytes (monosites) in peripheral blood can be used, and it is preferable to use human peripheral blood monocytes as human myeloid blood cells. Hereinafter, a method for separating monocytes from human peripheral blood will be described as an example of a method for obtaining human myeloid blood cells present in the living body. A method for obtaining human myeloid blood cells used in the present invention is described below. However, it is not limited to this method.

ヒトミエロイド系血液細胞は、ヒトの末梢血を採血し、単球を分離することにより得ることができる。末梢血からの単球の分離は、遠心分離、磁気ビーズ法、FACSなどの公知の方法を用いて行うことができる。
遠心分離により単球を末梢血から分離する方法の例としては、抗凝固剤としてヘパリン又はクエン酸などを用い、採血した血液を等量の生理的食塩水、リン酸緩衝生理的食塩水、あるいは、ハンクス緩衝溶液などを用いて希釈し、次に、希釈した血液を、あらかじめ遠心チューブ（BD−Falcon 352070等）中に分注しておいたフィコール液（GE ヘルスケア社）の上に重層する。そして、遠心分離装置を用いて、遠心力500gで20分間遠心した後、界面付近に存在する単核細胞分画（リンパ球と単球を含む）を回収することにより、単球を得ることができる。 Human myeloid blood cells can be obtained by collecting human peripheral blood and isolating monocytes. Separation of monocytes from peripheral blood can be performed using known methods such as centrifugation, magnetic bead method, and FACS.
Examples of methods for separating monocytes from peripheral blood by centrifugation include using heparin or citrate as an anticoagulant and collecting the collected blood in an equal volume of physiological saline, phosphate buffered saline, or , Diluted with Hanks buffer solution, etc., and then the diluted blood is layered on Ficoll solution (GE Healthcare) previously dispensed into a centrifuge tube (BD-Falcon 352070 etc.) . Then, using a centrifuge, after centrifuging at a centrifugal force of 500 g for 20 minutes, monocytes can be obtained by collecting the mononuclear cell fraction (including lymphocytes and monocytes) present near the interface. it can.

また、ヒトミエロイド系血液細胞は、ヒト血液からCD14分子の発現を指標として、磁気ビーズ法などにより分離することができる。例えば、CD14マイクロビーズ（ミルテニー社 130−050−201）等を用いることにより分離することが可能である。あるいは、単核細胞分画を、細胞培養用の表面処理がなされた細胞培養器を用いて6−16時間ほど培養し、容器に付着した細胞を除去することにより、単球あるいはそれに由来するマクロファージを得ることも可能である。通常、健康な成人の末梢血10mLから、200,000〜500,000個の単球を回収することができる。   Human myeloid blood cells can be separated from human blood by the magnetic bead method or the like using the expression of CD14 molecule as an index. For example, it can be separated by using CD14 microbeads (Milteny 130-050-201) or the like. Alternatively, monocytes or macrophages derived therefrom are obtained by culturing the mononuclear cell fraction for about 6 to 16 hours using a cell culture vessel that has been surface-treated for cell culture, and removing the cells attached to the container. It is also possible to obtain Usually, 200,000 to 500,000 monocytes can be collected from 10 mL of peripheral blood of healthy adults.

好ましい一態様において、本発明の方法工程（C）に供されるヒトミエロイド系血液細胞は、ヒト胚性幹細胞又はヒトiPS細胞などのヒト多能性幹細胞に由来するヒトミエロイド系血液細胞であり、より好ましい一態様において、本発明の方法工程（C）に供されるヒトミエロイド系血液細胞は、ヒトiPS細胞に由来するヒトミエロイド系血液細胞である。   In a preferred embodiment, the human myeloid blood cell subjected to the method step (C) of the present invention is a human myeloid blood cell derived from a human pluripotent stem cell such as a human embryonic stem cell or a human iPS cell, In a more preferred embodiment, the human myeloid blood cell subjected to the method step (C) of the present invention is a human myeloid blood cell derived from a human iPS cell.

本発明の工程（C）に用いる「c−MYC遺伝子を発現するヒトミエロイド系血液細胞」は、上記のように得たヒトミエロイド系血液細胞にc−MYC遺伝子を導入するか、上記ヒトミエロイド系血液細胞の作製過程のいずれかの段階でc−MYC遺伝子を導入しc−MYC遺伝子が導入された細胞からヒトミエロイド系血液細胞を作製するか、c−MYC遺伝子が導入された多能性幹細胞を用いてヒトミエロイド系血液細胞を作製することにより得ることができる。   The “human myeloid blood cell expressing c-MYC gene” used in the step (C) of the present invention is a human myeloid blood cell obtained by introducing the c-MYC gene into the human myeloid blood cell obtained as described above. A pluripotent stem cell in which a human myeloid blood cell is prepared from a cell into which the c-MYC gene is introduced and the c-MYC gene is introduced at any stage of the blood cell production process, or the c-MYC gene is introduced Can be obtained by preparing human myeloid blood cells.

本発明において、細胞へのc−MYC遺伝子の導入は、外来性プロモーター（好ましくは調節性プロモーターであり、より好ましくは誘導可能な調節性プロモーター）と機能的に連結された外来性c−MYC遺伝子を該細胞に導入するか、相同的組み換え技術などを用いて内在性c−MYC遺伝子と機能的に連結するように外来性プロモーター（好ましくは調節性プロモーターであり、より好ましくは誘導可能な調節性プロモーター）を該細胞ゲノムに導入するか、或いは相同的組み換え技術などを用いて内在性プロモーターと機能的に連結するように外来性c−MYC遺伝子を該細胞ゲノムに導入することにより行うことができる。   In the present invention, the introduction of the c-MYC gene into the cell is performed by exogenous c-MYC gene operably linked to a foreign promoter (preferably a regulatory promoter, more preferably an inducible regulatory promoter). A foreign promoter (preferably a regulatable promoter, more preferably an inducible regulatory property so as to be operably linked to the endogenous c-MYC gene using a homologous recombination technique or the like. Promoter) can be introduced into the cell genome, or by introducing an exogenous c-MYC gene into the cell genome so as to be operably linked to the endogenous promoter using homologous recombination techniques or the like. .

c−MYC遺伝子の具体例としては、ヒトc−MYC遺伝子（NM_002467）を挙げることができ（括弧内は、NCBI accession番号を示す。）、例えば配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するc−MYCタンパク質をコードする核酸が挙げられる。配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するc−MYCタンパク質をコードする核酸の例としては、配列番号２に記載のヌクレオチド配列を有するc−MYC遺伝子が挙げられる。
c−MYC遺伝子は、ヒトを含む哺乳動物において共通して存在する遺伝子であり、本発明において任意の哺乳動物由来（例えばヒト、マウス、ラット、サルなどの哺乳動物由来）の遺伝子を用いることができる。また、野生型の遺伝子に対して、数個（例えば1〜30個、好ましくは1〜20、より好ましくは1〜10個、さらに好ましくは1〜5個、特に好ましくは1から3個）の塩基が置換、挿入、付加及び／又は欠失した変異遺伝子であって、野生型の遺伝子と同様の機能を有する遺伝子を使用することもできる。また、野生型の遺伝子と同等あるいはそれ以上の機能を有する限りにおいて、該遺伝子の産物が他のタンパク質あるいはペプチドとの融合タンパク質として発現されるように人為的に修飾を加えた遺伝子でも良い。 Specific examples of the c-MYC gene include a human c-MYC gene (NM_002467) (the NCBI accession number is shown in parentheses). For example, c-MYC having the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 Examples include nucleic acids encoding proteins. Examples of the nucleic acid encoding the c-MYC protein having the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 include the c-MYC gene having the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 2.
The c-MYC gene is a gene that exists in common in mammals including humans, and in the present invention, a gene derived from any mammal (eg, derived from mammals such as humans, mice, rats, monkeys, etc.) is used. it can. In addition, several (for example, 1 to 30, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, particularly preferably 1 to 3) of wild type genes It is also possible to use a mutated gene having a base substitution, insertion, addition and / or deletion and having the same function as a wild-type gene. Further, the gene may be artificially modified so that the product of the gene is expressed as a fusion protein with another protein or peptide as long as it has a function equivalent to or higher than that of the wild-type gene.

さらに、性質の似たアミノ酸（例えば、グリシンとアラニン、セリンとトレオニン、アスパラギン酸とグルタミン酸、アスパラギンとグルタミン、ロイシンとイソロイシン、リシンとアルギニン、システインとメチオニン、フェニルアラニンとチロシン等）同士の置換等であれば、より多くの個数の置換等があり得る。上述のようにアミノ酸が欠失、置換又は挿入されている場合、その欠失、置換、挿入の位置は、腫瘍の増殖抑制などの所望の効果が保持される限り、特に限定されない。   Furthermore, substitution between amino acids with similar properties (eg, glycine and alanine, serine and threonine, aspartic acid and glutamic acid, asparagine and glutamine, leucine and isoleucine, lysine and arginine, cysteine and methionine, phenylalanine and tyrosine, etc.) For example, there can be a greater number of substitutions. When the amino acid is deleted, substituted, or inserted as described above, the position of the deletion, substitution, or insertion is not particularly limited as long as a desired effect such as suppression of tumor growth is maintained.

本発明において、遺伝子の導入は自体公知の方法を用いて、行うことができ、所望の効果がもたらされる限り、その方法は特に制限されない。
遺伝子の導入方法としては、例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体などのベクターを用いて、あるいはリポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクションなどの手法によって、細胞内に所望の遺伝子を導入する方法を挙げることができる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター（以上、Cell, 126, pp.663-676, 2006; Cell, 131, pp.861-872, 2007; Science, 318, pp.1917-1920, 2007）、アデノウイルスベクター（Science, 322, 945-949, 2008）、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクター（WO 2010/008054）などが例示される。また、人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体（HAC）、酵母人工染色体（YAC）、細菌人工染色体(BAC、PAC)などが含まれる。プラスミドとしては、哺乳動物細胞用プラスミドを使用しうる(Science, 322:949-953, 2008)。ベクターには、所望の遺伝子が発現可能なように、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイトなどの制御配列を含むことができ、さらに、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子(例えばカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など）、選択マーカー配列（例えば、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子など）、レポーター遺伝子配列（例えば、緑色蛍光タンパク質などの蛍光タンパク質遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子など）などを含むことができる。また、上記ベクターには、細胞への遺伝子導入後、導入された遺伝子及びそれと結合する制御配列などの配列を切除するために、それらの前後にLoxP配列を有してもよい。また、本発明において、LoxP配列に代えてlox511、lox2272及びloxFAS配列などを用いてもよい。別の好ましい一実施態様においては、トランスポゾンを用いて染色体に導入遺伝子を組み込んだ後に、細胞にトランスポゼースを作用させ、導入遺伝子を完全に染色体から除去する方法が用いられ得る。好ましいトランスポゾンとしては、例えば、鱗翅目昆虫由来のトランスポゾンであるpiggyBac等が挙げられる（Kaji, K. et al., (2009), Nature, 458: 771-775、Woltjen et al., (2009), Nature, 458: 766-770、WO 2010/012077）。また、ベクターは、染色体への組み込みがなくとも複製されて、エピソーマルに存在するように、哺乳動物細胞で機能的な複製開始点と、該複製開始点に結合して複製を制御するタンパク質をコードする遺伝子を有していてもよい。哺乳動物細胞で機能的な複製開始点と、該複製開始点に結合して複製を制御するタンパク質の例としては、EBVにあっては複製開始点oriPとEBNA-1遺伝子、SV40にあっては複製開始点oriとSV40 large T antigen遺伝子などが挙げられる（WO 2009/115295、WO 2009/157201およびWO2009/149233）。また、複数の所望の遺伝子を同時に導入するために、ポリシストロニックに発現させる発現ベクターを用いてもよい。ポリシストロニックに発現させるためには、遺伝子をコードする配列の間は、Internal Ribosome Entry Site（IRES）または口蹄病ウイルス（FMDV）2Aコード領域により結合されていてもよい（Science, 322:949-953, 2008およびWO 2009/0920422009/152529）。 In the present invention, gene introduction can be performed using a method known per se, and the method is not particularly limited as long as a desired effect is brought about.
Examples of the gene introduction method include a method of introducing a desired gene into a cell using a vector such as a virus, a plasmid, or an artificial chromosome, or a technique such as lipofection, liposome, or microinjection. Examples of viral vectors include retroviral vectors and lentiviral vectors (above, Cell, 126, pp.663-676, 2006; Cell, 131, pp.861-872, 2007; Science, 318, pp.1917-1920, 2007 ), Adenovirus vectors (Science, 322, 945-949, 2008), adeno-associated virus vectors, Sendai virus vectors (WO 2010/008054), and the like. Examples of artificial chromosome vectors include human artificial chromosomes (HAC), yeast artificial chromosomes (YAC), bacterial artificial chromosomes (BAC, PAC), and the like. As a plasmid, a plasmid for mammalian cells can be used (Science, 322: 949-953, 2008). The vector can contain regulatory sequences such as a promoter, an enhancer, a ribosome binding sequence, a terminator, a polyadenylation site and the like so that a desired gene can be expressed. Resistance gene, ampicillin resistance gene, puromycin resistance gene, etc.), selectable marker sequence (eg, thymidine kinase gene, diphtheria toxin gene, etc.), reporter gene sequence (eg, fluorescent protein gene such as green fluorescent protein, β-galactosidase gene, Luciferase gene and the like). In addition, the above vector may have a LoxP sequence before and after the introduced gene and a sequence such as a control sequence that binds to the introduced gene after gene introduction into the cell. In the present invention, lox511, lox2272, and loxFAS sequences may be used in place of the LoxP sequence. In another preferred embodiment, a method can be used in which a transposon is used to integrate a transgene into a chromosome, and then a transposase is applied to the cell to completely remove the transgene from the chromosome. Preferred transposons include, for example, piggyBac, a transposon derived from lepidopterous insects (Kaji, K. et al., (2009), Nature, 458: 771-775, Woltjen et al., (2009), Nature, 458: 766-770, WO 2010/012077). In addition, the vector encodes a replication origin that is functional in mammalian cells and a protein that controls replication by binding to the replication origin so that the vector is replicated without being integrated into the chromosome and exists episomally. It may have a gene to do. Examples of a replication origin functional in mammalian cells and a protein that binds to the replication origin and regulates replication include the origin of replication oriP and the EBNA-1 gene and SV40 in EBV. Examples include the origin of replication ori and the SV40 large T antigen gene (WO 2009/115295, WO 2009/157201 and WO2009 / 149233). Further, in order to simultaneously introduce a plurality of desired genes, an expression vector that is expressed polycistronically may be used. For polycistronic expression, the gene-encoding sequence may be linked by an Internal Ribosome Entry Site (IRES) or foot-and-mouth disease virus (FMDV) 2A coding region (Science, 322: 949). -953, 2008 and WO 2009/0920422009/152529).

本明細書中、「遺伝子」とは、タンパク質を発現するポリヌクレオチド配列を指し、コード領域のみを指してもよく、またはコード領域上流及び／または下流の制御配列を含んでもよい（例えばコード領域の転写開始部位上流の５’非翻訳領域）。
本明細書中、「内在性」又は「天然」の遺伝子とは、それ自身の制御配列と共に天然に見られる遺伝子を指し、この遺伝子は、生物のゲノム内のその自然な位置に位置する。特定のタンパク質をコードする内在性ポリヌクレオチドは、内在性遺伝子の一例である。
本明細書中、「外来性」の遺伝子とは、遺伝子移入によって宿主細胞に導入された遺伝子を指す。外来性遺伝子は、非天然遺伝子、天然宿主細胞中の新たな位置に導入された天然遺伝子、またはキメラ遺伝子を包含する。 As used herein, “gene” refers to a polynucleotide sequence that expresses a protein and may refer only to the coding region or may include regulatory sequences upstream and / or downstream of the coding region (eg, coding region). 5 'untranslated region upstream of the transcription start site).
As used herein, an “endogenous” or “native” gene refers to a gene found in nature with its own regulatory sequences, and this gene is located at its natural location in the genome of an organism. An endogenous polynucleotide that encodes a particular protein is an example of an endogenous gene.
In the present specification, a “foreign” gene refers to a gene introduced into a host cell by gene transfer. Exogenous genes include non-native genes, natural genes introduced at new locations in natural host cells, or chimeric genes.

本明細書中、遺伝子をプロモーターと機能的に連結させるとは、当該プロモーターの制御を受けるように、当該プロモーターの下流に当該遺伝子配列を連結することを意味する。該プロモーターは、内在性プロモーターであってもよく、外来性のプロモーターであってもよい。   In the present specification, functionally linking a gene with a promoter means linking the gene sequence downstream of the promoter so as to be controlled by the promoter. The promoter may be an endogenous promoter or an exogenous promoter.

本明細書中、遺伝子の「内在性」プロモーターとは、ゲノム中における該遺伝子と自然な状態で連結されているプロモーターを意味し、遺伝子の「外来性」のプロモーターとは、遺伝操作（すなわち分子生物学的技法）によって、該遺伝子の近位に、該遺伝子の転写が、機能的に連結されているプロモーターによって指示されるように配置されているものを意味する。   In the present specification, the “endogenous” promoter of a gene means a promoter that is naturally linked to the gene in the genome, and the “foreign” promoter of a gene means genetic manipulation (ie, molecular By biological technique, it is meant that the gene is located in the proximity of the gene, such that transcription of the gene is directed by a functionally linked promoter.

本明細書中、調節性プロモーターとは、誘導可能又は抑制解除可能なプロモーターを意味し、リプレッサー又はインデューサーのいずれか一方と結合することのできる、プロモーターと共に働くDNA配列を有するプロモーターを指す。プロモーターが誘導されるか或いは抑制解除されると「オンの状態」になり、プロモーターが誘導されないか或いは抑制解除されていない状態では、プロモーターは「オフの状態」となる。   In the present specification, a regulatable promoter means an inducible or derepressible promoter, and refers to a promoter having a DNA sequence that works with a promoter and can bind to either a repressor or an inducer. When the promoter is induced or derepressed, it is “on” and when the promoter is not induced or derepressed, the promoter is “off”.

調節性プロモーターの例としては、テトラサイクリン反応性プロモーター、ステロイド反応性プロモーター、メタロチオネインプロモーターなどが挙げられる。   Examples of regulatable promoters include tetracycline responsive promoters, steroid responsive promoters, metallothionein promoters, and the like.

本明細書中、テトラサイクリン反応性プロモーターとは、テトラサイクリン又はその誘導体（例えば、ドキシサイクリン（Dox））の存在または非存在によって可逆的に制御される、既知の調節性プロモーターである。
テトラサイクリン反応性プロモーターは、内部にテトラサイクリン応答エレメント（TRE）が配置されたプロモーターであり、リバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子（rtTA）タンパク質又はテトラサイクリン制御性トランス活性化因子（tTA）のTREへの結合により、活性化される（即ち、目的タンパク質の発現を誘導する）プロモーターである。rtTAタンパク質はDox存在下でTREに結合し、一方tTAタンパク質はDox非存在下でTREに結合して、TRE配列の下流のプロモーターと機能的に連結された目的遺伝子の発現を誘導する。 As used herein, a tetracycline responsive promoter is a known regulatable promoter that is reversibly controlled by the presence or absence of tetracycline or a derivative thereof (eg, doxycycline (Dox)).
Tetracycline-responsive promoter is a promoter with a tetracycline response element (TRE) placed inside, and binding of reverse tetracycline-regulated transactivator (rtTA) protein or tetracycline-regulated transactivator (tTA) to TRE Is a promoter that is activated (ie, induces expression of the target protein). The rtTA protein binds to TRE in the presence of Dox, while the tTA protein binds to TRE in the absence of Dox to induce expression of the gene of interest operably linked to a promoter downstream of the TRE sequence.

テトラサイクリン反応性プロモーターを用いる場合、テトラサイクリン反応性プロモーターと機能的に連結された該遺伝子と、rtTA又はtTAタンパク質とが導入された細胞を、Dox存在下で培養することにより、Dox依存的に該遺伝子の発現を誘導又は抑制することができる。   When a tetracycline-responsive promoter is used, the gene operably linked to the tetracycline-responsive promoter and a cell into which rtTA or tTA protein has been introduced are cultured in the presence of Dox, so that the gene is dependent on Dox. Expression can be induced or suppressed.

細胞へのrtTA又はtTAタンパク質の導入は、公知の方法を用いて行うことができる。例えば、該タンパク質は、プロモーターと機能的に連結された該タンパク質をコードする核酸を細胞に導入することにより行うことができる。プロモーターと機能的に連結されたrtTA又はtTAタンパク質をコードする核酸は、例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体などのベクターを用いて、あるいはリポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどの手法によって、体細胞内に導入する方法を挙げることができる。プロモーターと機能的に連結されたrtTA又はtTAタンパク質をコードする核酸と、テトラサイクリン反応性プロモーターと機能的に連結された所望の遺伝子は、同一のベクター上に存在してもよく、別々のベクター上に存在してもよい。rtTA又はtTAタンパク質は、RNA又はタンパク質の形態で導入してもよい。タンパク質の形態の場合、例えば、細胞膜透過性ペプチド（例えば、HIV由来のTATおよびポリアルギニン）との融合させた状態で細胞と接触させてもよく、リポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入しても良い。RNAの形態の場合、導入には、リポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどの手法を用いてもよい。   Introduction of rtTA or tTA protein into cells can be performed using a known method. For example, the protein can be performed by introducing into the cell a nucleic acid encoding the protein operably linked to a promoter. A nucleic acid encoding an rtTA or tTA protein operably linked to a promoter can be obtained by using a vector such as a virus, a plasmid, or an artificial chromosome, or by a technique such as lipofection, liposome, microinjection, or electroporation. Examples of the method include introduction into cells. The nucleic acid encoding the rtTA or tTA protein operably linked to the promoter and the desired gene operably linked to the tetracycline responsive promoter may be present on the same vector or on separate vectors. May be present. The rtTA or tTA protein may be introduced in the form of RNA or protein. In the case of a protein form, for example, the cell may be contacted with a cell membrane-penetrating peptide (for example, HIV-derived TAT and polyarginine) in a fused state. It may be introduced inside. In the case of the RNA form, a method such as lipofection, liposome, microinjection or electroporation may be used for introduction.

本発明に用いるc−MYC遺伝子を発現するヒトミエロイド細胞は、工程（C）において、c−MYC遺伝子の発現を安定的に抑制しやすいという観点から、c−MYC遺伝子の発現が誘導性発現システムにより行われる細胞であることが好ましい。本明細書中「誘導性発現システム」とは、外因性化合物もしくは外因性タンパク質であるインデューサーの添加により遺伝子の発現が誘導され、インデューサーが添加されない場合にその発現が抑制されるシステムを言う。   From the viewpoint that the human myeloid cell expressing the c-MYC gene used in the present invention is likely to stably suppress the expression of the c-MYC gene in the step (C), the expression system of the c-MYC gene is an inducible expression system. It is preferable that the cell is subjected to the above. In the present specification, “inducible expression system” refers to a system in which gene expression is induced by the addition of an exogenous compound or an inducer that is an exogenous protein, and the expression is suppressed when no inducer is added. .

構成的プロモーターの例としては、ポリペプチド鎖伸長因子遺伝子プロモーター（EF−1α）プロモーター、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター、シミアンウィルス（SV40）プロモーター、ユビキチンC（UbC）プロモーター、ラウス肉腫ウィルス（RSV）プロモーター、βアクチン（CAG）プロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、本発明において用いられる構成的プロモーターは、EF−1αプロモーターである。   Examples of constitutive promoters include polypeptide chain elongation factor gene promoter (EF-1α) promoter, cytomegalovirus (CMV) promoter, simian virus (SV40) promoter, ubiquitin C (UbC) promoter, Rous sarcoma virus (RSV) Examples include, but are not limited to, promoters and β-actin (CAG) promoters. Preferably, the constitutive promoter used in the present invention is the EF-1α promoter.

好ましい一態様において、c−MYC遺伝子と機能的に連結されるプロモーターは、外来性の調節性プロモーターであり、より好ましくは外来性のテトラサイクリン反応性プロモーターである。
本発明の好ましい一態様において、c−MYC遺伝子を発現するヒトミエロイド細胞は、外来性の調節性プロモーターと機能的に連結した外来性のc−MYC遺伝子を有する細胞であり、より好ましくは外来性のテトラサイクリン反応性プロモーターと機能的に連結した外来性のc−MYC遺伝子を有する細胞であり、さらに好ましくは、外来性のテトラサイクリン反応性プロモーターと機能的に連結した外来性のc−MYC遺伝子を有し且つrtTAタンパク質が導入されている細胞である。 In a preferred embodiment, the promoter operably linked to the c-MYC gene is an exogenous regulatable promoter, more preferably an exogenous tetracycline responsive promoter.
In a preferred embodiment of the present invention, the human myeloid cell expressing the c-MYC gene is a cell having an exogenous c-MYC gene operably linked to an exogenous regulatory promoter, more preferably exogenous. Cells having an exogenous c-MYC gene operably linked to a tetracycline-responsive promoter, and more preferably having an exogenous c-MYC gene operably linked to an exogenous tetracycline-responsive promoter. And rtTA protein is introduced into the cell.

別の好ましい態様において、c−MYC遺伝子と機能的に連結されるプロモーターは構成的プロモーター又は調節性プロモーターであり、該プロモーターとc−MYC遺伝子は、トランスポゾン配列又はloxP配列に挟まれている。
すなわち、好ましい一態様において、c−MYC遺伝子を発現するヒトミエロイド細胞は、構成的プロモーター又は調節性プロモーターと機能的に連結されたc−MYC遺伝子を有し、該プロモーター及び／又は該c−MYC遺伝子が、トランスポゾン配列又はloxP配列に挟まれている細胞である。 In another preferred embodiment, the promoter operably linked to the c-MYC gene is a constitutive promoter or a regulatable promoter, and the promoter and c-MYC gene are sandwiched between a transposon sequence or a loxP sequence.
That is, in a preferred embodiment, a human myeloid cell expressing a c-MYC gene has a c-MYC gene operably linked to a constitutive promoter or a regulatory promoter, and the promoter and / or the c-MYC A cell whose gene is flanked by transposon or loxP sequences.

より好ましい一態様において、外来性プロモーターと機能的に連結されたc−MYC遺伝子は、その両端にloxP配列が同じ向きに配置されている。両端にloxP配列が配置された外来性プロモーターと機能的に連結されたc−MYC遺伝子を組み込んだ後に、細胞にCreリコンビナーゼタンパク質を導入し、loxP配列に挟まれた外来性プロモーターと機能的に連結されたc−MYC遺伝子を染色体から除去する方法が用いられ得る。
別の好ましい一態様において、外来性プロモーターと機能的に連結されたc−MYC遺伝子は、その両端にトランスポゾン配列が配置されている。トランスポゾンを用いて染色体に外来性プロモーターと機能的に連結されたc−MYC遺伝子を組み込んだ後に、細胞に転移酵素を作用させ、導入遺伝子を完全に染色体から除去する方法が用いられ得る。好ましいトランスポゾンとしては、例えば、鱗翅目昆虫由来のトランスポゾンであるpiggyBac等が挙げられる。piggyBacトランスポゾンを用いる具体的手段は、Kaji, K. et al., Nature, 458: 771-775 (2009)、Woltjen et al., Nature, 458: 766-770 (2009)などにに開示されている。 In a more preferred embodiment, the c-MYC gene operably linked to an exogenous promoter has loxP sequences arranged in the same orientation at both ends. After incorporating the c-MYC gene operably linked to an exogenous promoter with loxP sequences located at both ends, Cre recombinase protein is introduced into the cell and operably linked to the exogenous promoter sandwiched between loxP sequences A method of removing the c-MYC gene made from the chromosome can be used.
In another preferred embodiment, the c-MYC gene operably linked to an exogenous promoter has a transposon sequence at both ends. A method can be used in which a transposon is used to incorporate a c-MYC gene operably linked to an exogenous promoter into a chromosome, and then a transferase is allowed to act on the cell to completely remove the transgene from the chromosome. Preferred transposons include, for example, piggyBac, which is a transposon derived from a lepidopteran insect. Specific means using the piggyBac transposon are disclosed in Kaji, K. et al., Nature, 458: 771-775 (2009), Woltjen et al., Nature, 458: 766-770 (2009), etc. .

本発明の好ましい一態様において、工程（C）に供されるヒトミエロイド系血液細胞は、該細胞をM−CSFタンパク質の存在下で培養した場合に、in vitroで該細胞の増殖を促進し得る量のc−MYC遺伝子を発現する。
in vitroでヒトミエロイド系血液細胞の増殖を促進し得る量のc−MYC遺伝子とは、当該量のc−MYC遺伝子を発現するヒトミエロイド系血液細胞の倍加速度が、c−MYC遺伝子を発現していないことを除いては上記細胞と同様に作製したヒトミエロイド系血液細胞と比較して、有意に上昇するようなc−MYC遺伝子の量を意味する。 In a preferred embodiment of the present invention, the human myeloid blood cell subjected to step (C) can promote proliferation of the cell in vitro when the cell is cultured in the presence of M-CSF protein. Expresses the amount of c-MYC gene.
The amount of c-MYC gene that can promote the proliferation of human myeloid blood cells in vitro means that the double acceleration of human myeloid blood cells that express the amount of c-MYC gene expresses c-MYC gene. The amount of the c-MYC gene is significantly increased as compared with the human myeloid blood cells prepared in the same manner as the above cells except that it is not.

in vitroでヒトミエロイド系血液細胞の増殖を促進し得る量のc−MYC遺伝子とは、例えば、テトラサイクリン反応性プロモーターと機能的に連結させたc−MYC遺伝子を有するヒトミエロイド系血液細胞を用いる場合、該細胞を、ドキシサイクリン（通常、100ng／mL以上、好ましくは125 ng／mL以上、増殖効率を高めるという観点から、より好ましくは1 μg／mL以上）を含む培地中で、培養することにより、該細胞の増殖を促進するのに十分な量のc−MYC遺伝子を発現させることができる。   The amount of c-MYC gene that can promote the proliferation of human myeloid blood cells in vitro is, for example, when human myeloid blood cells having a c-MYC gene operably linked to a tetracycline-responsive promoter are used. Culturing the cells in a medium containing doxycycline (usually 100 ng / mL or more, preferably 125 ng / mL or more, more preferably 1 μg / mL or more from the viewpoint of increasing the growth efficiency), A sufficient amount of the c-MYC gene can be expressed to promote the growth of the cells.

本発明において、ヒトミエロイド系血液細胞は、増殖能力を増強するという観点から、下記の外来性遺伝子を発現していてもよく、していなくてもよい：
（i）B cell−specific Moloney murine leukemia virus integration site 1（BMI1）遺伝子、
（ii）Enhancer of zeste homolog 2 （EZH2）遺伝子、
（iii）MDM2遺伝子、
（iv）MDM4遺伝子、及び
（v）Hypoxia Inducible Factor 1 Alpha Subunit（HIF1A）遺伝子
からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子。
細胞増殖が促進され、操作の効率性が上がる場合があるなどの観点から、本発明においては、上記外来性遺伝子（i）〜（v）のいずれかを発現するヒトミエロイド系血液細胞を用いることが好ましく、外来性BMI1及びMDM2遺伝子を発現するヒトミエロイド系血液細胞を用いることがより好ましい。 In the present invention, human myeloid blood cells may or may not express the following foreign genes from the viewpoint of enhancing proliferation ability:
(I) B cell-specific Moloney murine leukemia virus integration site 1 (BMI1) gene,
(Ii) Enhancer of zeste homolog 2 (EZH2) gene,
(Iii) MDM2 gene,
(Iv) at least one gene selected from the group consisting of MDM4 gene and (v) Hypoxia Inducible Factor 1 Alpha Subunit (HIF1A) gene.
In the present invention, from the standpoint that cell proliferation may be promoted and operational efficiency may increase, human myeloid blood cells that express any of the exogenous genes (i) to (v) are used in the present invention. It is preferable to use human myeloid blood cells that express exogenous BMI1 and MDM2 genes.

BMI1遺伝子、EZH2遺伝子、MDM2遺伝子、MDM4遺伝子、HIF1A遺伝子の具体例としては、それぞれ、ヒトBMI1遺伝子（NM_005180）、ヒトEZH2遺伝子（NM_004456）、ヒトMDM2遺伝子（NM_002392）、ヒトMDM4遺伝子（NM_002393）、ヒトHIF1A遺伝子（NM_001530）を挙げることができる。   Specific examples of BMI1 gene, EZH2 gene, MDM2 gene, MDM4 gene, and HIF1A gene are human BMI1 gene (NM_005180), human EZH2 gene (NM_004456), human MDM2 gene (NM_002392), human MDM4 gene (NM_002393), respectively. Mention may be made of the human HIF1A gene (NM_001530).

BMI1遺伝子、EZH2遺伝子、MDM2遺伝子、MDM4遺伝子及びHIF1A遺伝子は、野生型の遺伝子に対して、数個（例えば1〜30個、好ましくは1〜20、より好ましくは1〜10個、さらに好ましくは1〜5個、特に好ましくは1から3個）の塩基が置換、挿入、付加及び／又は欠失した変異遺伝子であって、野生型の遺伝子と同様の機能を有する遺伝子を使用することもできる。また、野生型の遺伝子と同等あるいはそれ以上の機能を有する限りにおいて、該遺伝子の産物が他のタンパク質あるいはペプチドとの融合タンパク質として発現されるように人為的に修飾を加えた遺伝子でも良い。   BMI1 gene, EZH2 gene, MDM2 gene, MDM4 gene and HIF1A gene are several (for example, 1 to 30, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, more preferably relative to the wild type gene) A mutant gene in which 1 to 5 (particularly preferably 1 to 3) bases are substituted, inserted, added and / or deleted can be used, and a gene having the same function as a wild-type gene can also be used. . Further, the gene may be artificially modified so that the product of the gene is expressed as a fusion protein with another protein or peptide as long as it has a function equivalent to or higher than that of the wild-type gene.

上記外来性遺伝子（i）〜（v）の１以上をヒトミエロイド系血液細胞を発現する細胞は、例えば、外来性プロモーターと機能的に連結させた該外来性遺伝子をヒトミエロイド系血液細胞に導入することにより得ることができる。上記外来性遺伝子（i）〜（v）をヒトミエロイド系血液細胞に導入する方法は、導入されたこれらの遺伝子が発現してヒトミエロイド系血液細胞に長期増殖能を付与できる限り、特に限定されるものではなく、公知の方法を用いることができる。   For example, cells expressing one or more of the exogenous genes (i) to (v) expressing human myeloid blood cells introduce the exogenous gene operably linked to an exogenous promoter into human myeloid blood cells. Can be obtained. The method of introducing the exogenous genes (i) to (v) into human myeloid blood cells is particularly limited as long as these introduced genes can be expressed and impart long-term proliferating ability to human myeloid blood cells. It is not a thing and a well-known method can be used.

好ましい一態様において、工程（C）に供されるヒトミエロイド系血液細胞は、該細胞をM−CSFタンパク質の存在下で培養した場合に、in vitroで該細胞の増殖を促進し得る量のc−MYC遺伝子を発現し、かつ上記外来性遺伝子（i）〜（v）の１以上を発現する。   In a preferred embodiment, the human myeloid blood cell subjected to step (C) has an amount of c that can promote proliferation of the cell in vitro when the cell is cultured in the presence of M-CSF protein. -Express the MYC gene and express one or more of the exogenous genes (i) to (v).

本発明において、ヒトミエロイド系血液細胞は、外来性プロモーターに機能的に連結されたインターフェロンβタンパク質をコードする核酸を有していても良い。
本明細書中、IFNβタンパク質とは、腫瘍の増殖抑制などの所望の効果を有する限り特に限定されないが、好ましくは、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかであり、より好ましくは以下の（ａ）又は（ｂ）であり、さらに好ましくは（ａ）である。
（ａ）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失及び／又は置換及び／又は挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ腫瘍の増殖抑制などの所望の効果タンパク質
（ｃ）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質の、他の哺乳動物におけるオルソログであって、腫瘍の増殖抑制などの所望の効果を有するタンパク質 In the present invention, human myeloid blood cells may have a nucleic acid encoding interferon β protein operably linked to an exogenous promoter.
In the present specification, the IFNβ protein is not particularly limited as long as it has a desired effect such as suppression of tumor growth, but is preferably any of the following (a) to (c), more preferably: (A) or (b), more preferably (a).
(A) Protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 (b) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, one or more amino acids are deleted and / or substituted and / or inserted and / or added A desired effect protein such as a tumor growth inhibitory protein having an amino acid sequence (c) An ortholog of a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 in other mammals, such as a tumor growth inhibitory Protein with the effect of

上記（ｂ）に関し、より具体的には、（i）配列番号３に示されるアミノ酸配列中の1〜50個、好ましくは1〜20個、より好ましくは1〜数（5、4、3もしくは2）個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ii）配列番号３に示されるアミノ酸配列に1〜50個、好ましくは1〜20個、より好ましくは1〜数（5、4、3もしくは2）個のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（iii）配列番号３に示されるアミノ酸配列に1〜50個、好ましくは1〜20個、より好ましくは1〜数（5、4、3もしくは2）個のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（iv）配列番号３に示されるアミノ酸配列中の1〜50個、好ましくは1〜20個、より好ましくは1〜数（5、4、3もしくは2）個のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、又は（v）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含むタンパク質が挙げられる。   Regarding (b) above, more specifically, (i) 1 to 50, preferably 1 to 20, more preferably 1 to number (5, 4, 3, or 3) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 2) an amino acid sequence in which one amino acid is deleted, (ii) 1 to 50, preferably 1 to 20, more preferably 1 to a number (5, 4, 3 or 2) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3. ) Amino acid sequence added with amino acids, (iii) 1 to 50, preferably 1 to 20, more preferably 1 to several (5, 4, 3 or 2) amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 3. (Iv) 1 to 50, preferably 1 to 20, more preferably 1 to several (5, 4, 3 or 2) of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3. An amino acid sequence in which the amino acid is replaced with another amino acid, or (v) a protein comprising an amino acid sequence combining them And the like.

上記（ｂ）に関し、配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１又は数（5、4、3もしくは2）個のアミノ酸が欠失及び／又は置換及び／又は挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ腫瘍の増殖抑制などの所望の効果タンパク質であることがより好ましい。   With respect to (b) above, in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, one or several (5, 4, 3 or 2) amino acids are deleted and / or substituted and / or inserted and / or added. It is more preferable that the protein has a desired effect such as suppression of tumor growth.

上記（ａ）に記載のインターフェロンβタンパク質をコードする核酸の例としては、配列番号４に示されるヌクレオチド配列が挙げられる。   Examples of the nucleic acid encoding the interferon β protein described in (a) above include the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4.

本発明に使用するヒトミエロイド系血液細胞は、内在性インターフェロンα／β受容体（IFNAR）遺伝子（IFNAR1遺伝子又はIFNAR2遺伝子）の発現が抑制されたものであってもよい。   The human myeloid blood cell used in the present invention may be one in which the expression of an endogenous interferon α / β receptor (IFNAR) gene (IFNAR1 gene or IFNAR2 gene) is suppressed.

本発明において、遺伝子発現抑制の方法としては、所望の遺伝子の発現が抑制される限り特に限定されず、例えば、クラスター化等間隔短鎖回分リピート（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat / CRISPR associated proteins）（CRISPR／CAS9）（Cong L et al., Science. 2013 Feb 15;339（6121):819−23、Ran FA et al., Cell. 2013 Sep 12;154(6):1380−9、Guilinger JP, Nat Biotechnol. 2014 Jun;32(6):577−82）、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（Carroll D., Gene Ther. 2008 Nov;15(22):1463−8.）又は転写アクチベーター様エフェクター（TALE）ヌクレアーゼ（Nucleic Acids Res. 2011 Jul;39(12):e82）などを用いるゲノム編集（ゲノムターゲティング）による遺伝子破壊、siRNA、RNAiなどを用いた、ダウンレギュレーションまたはサイレンシングなどが挙げられる。   In the present invention, the method for suppressing gene expression is not particularly limited as long as expression of a desired gene is suppressed. For example, clustered regularly spaced short chain repeats (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat / CRISPR associated proteins) ( CRISPR / CAS9) (Cong L et al., Science. 2013 Feb 15; 339 (6121): 819-23, Ran FA et al., Cell. 2013 Sep 12; 154 (6): 1380-9, Guilinger JP, Nat Biotechnol. 2014 Jun; 32 (6): 577-82), zinc finger nuclease (Carroll D., Gene Ther. 2008 Nov; 15 (22): 1463-8.) Or transcriptional activator-like effector (TALE) nuclease (Nucleic Acids Res. 2011 Jul; 39 (12): e82) and the like, gene disruption by genome editing (genome targeting), down regulation or silencing using siRNA, RNAi and the like.

遺伝子の発現抑制は、例えば、該遺伝子からの転写産物の生成量の減少、該遺伝子のコードするタンパク質の生成量の減少等によって確認できる。遺伝子からの転写産物の生成量、又はタンパク質の生成量の測定は、定量的PCR、マイクロアレイなどを用いた核酸量の測定方法、ELISA、ウエスタンブロッティングなどの免疫学的手法などを用いたタンパク質量の測定方法などの、公知の方法を用いて行うことができる。   Inhibition of gene expression can be confirmed, for example, by a decrease in the amount of transcription product generated from the gene, a decrease in the amount of protein encoded by the gene, or the like. The amount of transcript produced from a gene or the amount of protein produced can be measured using quantitative PCR, a method for measuring the amount of nucleic acid using a microarray, etc., or an amount of protein using an immunological technique such as ELISA or Western blotting. It can carry out using well-known methods, such as a measuring method.

本明細書中、IFNAR遺伝子の発現が抑制された細胞とは、該細胞における内在性のIFNAR遺伝子の発現が、IFNAR遺伝子の発現抑制させていないことを除いては該細胞と同様に作製した細胞における、内在性のIFNAR遺伝子の発現と比較して有意に低い、または発現が無い細胞をいう。   In the present specification, a cell in which the expression of IFNAR gene is suppressed is a cell prepared in the same manner as that cell except that the expression of endogenous IFNAR gene in the cell is not suppressed in expression of IFNAR gene. In which the expression of the endogenous IFNAR gene is significantly lower or absent.

IFNAR遺伝子の発現が抑制された細胞のIFNβ産生量を増加させるなどの所望の効果を有する限り特に限定されるものではないが、IFNAR遺伝子の発現抑制は、IFNAR1を標的とした発現抑制であってもよく、IFNAR2を標的とした発現抑制であってもよい。IFNAR遺伝子の発現抑制の標的配列としては、用いる遺伝子抑制の方法によっても異なり、また所望の効果をもたらす限り特に限定されるものではないが、例えば、後述するDouble Strand BreakによるヒトIFNAR2の遺伝子破壊を行うことにより遺伝子発現を抑制する場合は、ヒトIFNAR2のエクソン2〜4、より好ましくはエクソン3、さらに好ましくはヒトIFNAR2のエクソン3の1番目と19番目の塩基の間を標的とすることにより、遺伝子破壊を行うことができる。ヒトIFNAR１の遺伝子破壊を行うことにより遺伝子発現を抑制する場合は、ヒトIFNAR1のエクソン1〜3、より好ましくはエクソン2、さらに好ましくはヒトIFNAR1のエクソン2の73番目と92番目の塩基の間を標的とすることにより、遺伝子破壊を行うことができる。
ヒトIFNAR１は、21q22.11に位置している。IFNAR1遺伝子の具体例としては、ヒトIFNAR１遺伝子（NM_000629）などを挙げることができる（括弧内は、NCBI accession番号を示す。）。ヒトIFNAR2も、21q22.11に位置している。IFNAR2遺伝子の具体例としては、ヒトIFNAR2遺伝子（NM_207585）などを挙げることができる（括弧内は、NCBI accession番号を示す。）。 Although there is no particular limitation as long as it has a desired effect such as increasing the amount of IFNβ produced by cells in which IFNAR gene expression is suppressed, suppression of IFNAR gene expression is expression suppression targeting IFNAR1. Alternatively, expression suppression targeting IFNAR2 may be used. The target sequence for suppressing the expression of IFNAR gene varies depending on the gene suppression method used, and is not particularly limited as long as it provides the desired effect.For example, human IFNAR2 gene disruption by Double Strand Break described later is used. When suppressing gene expression by performing exon 2-4 of human IFNAR2, more preferably exon 3, more preferably by targeting between the first and 19th bases of exon 3 of human IFNAR2, Gene disruption can be performed. When gene expression is suppressed by disrupting the human IFNAR1 gene, exon 1 to 3 of human IFNAR1, more preferably exon 2, more preferably between the 73rd and 92nd bases of exon 2 of human IFNAR1 By targeting, gene disruption can be performed.
Human IFNAR1 is located at 21q22.11. Specific examples of the IFNAR1 gene include a human IFNAR1 gene (NM_000629) and the like (NCBI accession numbers are shown in parentheses). Human IFNAR2 is also located at 21q22.11. Specific examples of the IFNAR2 gene include a human IFNAR2 gene (NM_207585) (the parentheses indicate NCBI accession numbers).

IFNAR遺伝子の発現を抑制する場合、遺伝子発現抑制の方法としては、例えば、CRISPR／CAS9、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ又は転写アクチベーター様エフェクター（TALE）ヌクレアーゼにより、標的DNAの二本鎖の損傷（Double Strand Break）を起こすことにより行うことができる。   In the case of suppressing IFNAR gene expression, for example, CRISPR / CAS9, zinc finger nuclease or transcriptional activator-like effector (TALE) nuclease can be used to damage the target DNA double strand (Double Strand Break). ).

一般に、細胞内で、DNAの二本鎖の損傷（Double strand Break）が起こると、その修復のため、非相同末端結合（NHEJ）又は相同組換え修復（HDR）が起こることが知られている。また、DNAの二本鎖の損傷時に、鋳型配列を導入することにより、標的部位へ鋳型配列が挿入することが可能となり、その結果、遺伝子への特定配列のノックイン、また、ノックアウトを行うこともできる。
本発明の作製方法においては、DSBを導入し、DSBを導入した細胞の中から、NHEJの修復エラーにより、フレームシフト及び／又はストップコドンの挿入が起こった細胞を選別することにより、遺伝子発現が抑制された細胞を得てもよい。或いは、DSBを導入する際に、標的配列のフレームシフト及び／又はストップコドンの挿入を誘導するための鋳型配列を細胞に導入してHDRを誘導し、DSBを導入した細胞の中から、成功裏に遺伝子発現が抑制された細胞を選別することにより、遺伝子発現が抑制された細胞を得てもよい。
HDRを誘導する場合、NHEJの抑制剤としてSCR7（Chu VT et al., Nat Biotechnol. 2015 May;33(5):543−8）、或いはHDRの促進剤としてL755,507（Yu C et al., Cell Stem Cell. 2015 Feb 5;16(2):142−7）を用いてもよく、またNHEJのエラーを利用して遺伝子発現を行う場合、NHEJの促進剤としてAzidothymidine（Yu C et al., Cell Stem Cell. 2015 Feb 5;16(2):142−7）を用いてもよい。 In general, it is known that when DNA double-strand breaks occur in cells, non-homologous end joining (NHEJ) or homologous recombination repair (HDR) occurs due to the repair. . In addition, by introducing a template sequence at the time of DNA double-strand damage, it becomes possible to insert the template sequence into the target site. As a result, knocking in or knocking out a specific sequence into the gene may be performed. it can.
In the production method of the present invention, gene expression is achieved by introducing a DSB and selecting a cell in which a frame shift and / or a stop codon has been inserted due to an NHEJ repair error from among the cells into which the DSB has been introduced. Inhibited cells may be obtained. Alternatively, when introducing DSB, a template sequence for inducing frame shift of the target sequence and / or insertion of a stop codon is introduced into the cell to induce HDR, and from among the cells into which DSB has been introduced, A cell in which gene expression is suppressed may be obtained by selecting cells in which gene expression is suppressed.
When inducing HDR, SCR7 (Chu VT et al., Nat Biotechnol. 2015 May; 33 (5): 543-8) as an inhibitor of NHEJ, or L755,507 (Yu C et al. , Cell Stem Cell. 2015 Feb 5; 16 (2): 142-7), and when gene expression is performed using NHEJ error, Azidothymidine (Yu C et al. Cell Stem Cell. 2015 Feb 5; 16 (2): 142-7).

DSBを誘導した細胞において、フレームシフト及び／又はストップコドンの挿入が成功裏に行われたか否かは、自体公知の方法により検出することができる。例えば、DSBを誘導した細胞から公知の方法によりゲノムDNAを抽出し、該ゲノムDNAを鋳型として、標的配列の近傍に設計したプライマーを用いて、PCRを行い、増幅させたDNAのシーケンスを行うことにより、確認することができる。   Whether or not the frameshift and / or the stop codon has been successfully inserted in the cells in which DSB has been induced can be detected by a method known per se. For example, genomic DNA is extracted from a DSB-induced cell by a known method, PCR is performed using the genomic DNA as a template and primers designed in the vicinity of the target sequence, and the amplified DNA is sequenced. Can be confirmed.

CRISPR／Cas9系を用いるゲノム編集は、ガイドRNA（gRNA）とCas9という2つの分子を用いて、標的DNAの二本鎖の損傷（Double Strand Break）を起こすことにより行うことができる。ガイドRNAは標的部位と相補的な配列を含み、このため、標的配列を含む核酸と特異的に結合できる。
ガイドRNAの配列は、標的遺伝子及び標的配列に応じて適宜設定することができる。また、ライフサイエンス統合データベースセンター（DBCLS）のCRISPRdirectなどの公知のガイドRNAの設計ツールを用いて設計することもでき、また、市販のガイドRNAを利用することができる。
所望の効果がもたらされる限り、特に限定されるものではないが、ヒトIFNAR2の遺伝子破壊を行うことにより遺伝子発現を抑制する場合は、配列番号５を標的とするガイドRNAを用いることができる。ヒトIFNAR2の遺伝子破壊を行うことにより遺伝子発現を抑制する場合は、配列番号６を標的とするガイドRNAを用いることができる。 Genome editing using the CRISPR / Cas9 system can be performed by causing double strand breaks in the target DNA using two molecules, guide RNA (gRNA) and Cas9. The guide RNA contains a sequence complementary to the target site, and can thus specifically bind to the nucleic acid containing the target sequence.
The sequence of the guide RNA can be appropriately set according to the target gene and the target sequence. Moreover, it can also design using well-known guide RNA design tools, such as CRISPRdirect of Life Science Integrated Database Center (DBCLS), and a commercially available guide RNA can be used.
Although not particularly limited as long as a desired effect is brought about, a guide RNA targeting SEQ ID NO: 5 can be used when gene expression is suppressed by disrupting human IFNAR2. When gene expression is suppressed by gene disruption of human IFNAR2, a guide RNA targeting SEQ ID NO: 6 can be used.

CRISPR／Cas9系を用いてゲノム編集を行う場合、off−target作用を低減させるという観点から、Cas9の2つのヌクレアーゼドメインのうち1か所に変異を入れたCas9ニッカーゼ（D10A変異型Cas9）或いはCas9の2つのヌクレアーゼドメインの両方に変異を入れたdCas（dead Cas9）などの変異型Cas9を用いることもできる（Ran FA et al., Cell. 2013 Sep 12;154(6):1380−9、Guilinger JP, Nat Biotechnol. 2014 Jun;32(6):577−82）。D10A変異型Cas9を用いる場合、近接する2箇所にgRNAを設計し、それぞれのDNA鎖をCas9ニッカーゼによりDNAニックを入れることにより、その領域においてDouble Strand Breakが導入される形となる。D10A変異型Cas9を用いた場合、gRNAが類似配列に結合した場合、DNAニックが入るが、欠失や挿入変異は導入されない。dCas9を用いる場合、dCas9のC末端側にTALENで利用されている制限酵素FokIのヌクレアーゼドメインを連結させ（FokI−dCas9）、近接する2箇所に結合するgRNAとFokI−dCas9により、標的配列にDSBを導入できる。   When genome editing is performed using the CRISPR / Cas9 system, Cas9 nickase (D10A mutant Cas9) or Cas9 with mutation in one of the two nuclease domains of Cas9 from the viewpoint of reducing off-target action Mutant Cas9 such as dCas (dead Cas9) mutated in both of the two nuclease domains can also be used (Ran FA et al., Cell. 2013 Sep 12; 154 (6): 1380-9, Guilinger JP, Nat Biotechnol. 2014 Jun; 32 (6): 577-82). When D10A mutant Cas9 is used, gRNAs are designed in two adjacent positions, and DNA nicks are inserted into the respective DNA strands using Cas9 nickase, so that a double strand break is introduced in that region. When D10A mutant Cas9 is used, if gRNA binds to a similar sequence, a DNA nick is inserted, but no deletion or insertion mutation is introduced. When dCas9 is used, the nuclease domain of restriction enzyme FokI used by TALEN is linked to the C-terminal side of dCas9 (FokI-dCas9), and DSB is added to the target sequence by gRNA and FokI-dCas9 that bind to two adjacent sites. Can be introduced.

亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ZFN）は、DNA結合ドメイン（亜鉛フィンガー）及びDNA切断ドメイン（FokIヌクレアーゼ）の二つの機能ドメインで構成される人工キメラタンパク質である。二種類のZFNの二量体を形成させることにより、配列特異的にDNAを切断（Double Strand Break）することが出来る。   Zinc finger nuclease (ZFN) is an artificial chimeric protein composed of two functional domains, a DNA binding domain (zinc finger) and a DNA cleavage domain (FokI nuclease). By forming two kinds of ZFN dimers, DNA can be cleaved in a sequence-specific manner (Double Strand Break).

TALEヌクレアーゼ（TALEN）は、DNA切断ドメイン（FokI）と、DNA結合ドメイン（植物病原細菌キサントモナス属（Xanthomonas）から分泌されるTALEタンパク質のDNA結合ドメイン）を融合させた人口キメラタンパク質である。二種類のTALENタンパク質が標的DNAの反対鎖にそれぞれ結合し、両者が適切な距離を維持して二量体を形成させることにより、配列特異的にDNAを切断（Double Strand Break）することが出来る。TALENのDNA結合ドメインは、公知の方法を用いてデザインすることができる。また、Platinum TALENを用いることで設計が容易になる。   TALE nuclease (TALEN) is an artificial chimeric protein in which a DNA cleavage domain (FokI) and a DNA binding domain (DNA binding domain of TALE protein secreted from the phytopathogenic bacterium Xanthomonas) are fused. Two types of TALEN proteins bind to opposite strands of the target DNA, and the two can maintain a proper distance to form a dimer, thereby making it possible to cleave DNA (Double Strand Break) in a sequence-specific manner. . The DNA binding domain of TALEN can be designed using a known method. In addition, using Platinum TALEN facilitates design.

ミエロイド系血液細胞の内在性IFNAR遺伝子の発現を抑制する場合、遺伝子破壊の方法としては、設計の容易さなどの観点からCRISPR／CAS9系又はTALENを用いる方法が好ましく、中でもCRISPR／CAS9系を用いることがより好ましく、配列番号５又は配列番号６を標的とするガイドRNAを用いたCRISPR／CAS9系を用いる方法がさらに好ましい。   When suppressing the expression of the endogenous IFNAR gene in myeloid blood cells, the gene disruption method is preferably a method using CRISPR / CAS9 system or TALEN from the viewpoint of ease of design, etc. Among them, CRISPR / CAS9 system is used. More preferably, a method using a CRISPR / CAS9 system using a guide RNA targeting SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6 is more preferable.

工程（C）に供されるc−MYC遺伝子を発現するヒトミエロイド系血液細胞は、造腫瘍性を示す。好ましい一態様において、工程（C）に供されるc−MYC遺伝子を発現するヒトミエロイド系血液細胞は、ヒトM−CSF又はヒトGM−CSF依存的な造腫瘍性を示す。
本明細書中、ヒトミエロイド系血液細胞がヒトM−CSF又はヒトGM−CSF依存的な造腫瘍性を示すとは、ヒトM−CSF又はヒトGM−CSFを発現するヒトミエロイド系血液細胞（例えば3〜4 x 107個）を実施例に記載の方法に準じた方法によりNOD／SCIDマウスに投与（移植）した場合には一定期間（例えば30日〜50日）経過後に腫瘍を形成するが、ヒトM−CSF及びヒトGM−CSFのいずれも発現しないことを除いては上記細胞と同様に作製したヒトミエロイド系血液細胞を同様の方法によりNOD／SCIDマウスに投与（移植）した場合には腫瘍を形成しないことを意味する。 Human myeloid blood cells expressing the c-MYC gene subjected to step (C) exhibit tumorigenicity. In a preferred embodiment, the human myeloid blood cell expressing the c-MYC gene subjected to step (C) exhibits human M-CSF or human GM-CSF-dependent tumorigenicity.
In the present specification, human myeloid blood cells exhibit human M-CSF or human GM-CSF-dependent tumorigenicity means that human myeloid blood cells expressing human M-CSF or human GM-CSF (for example, When 3-4 × 10 7 ) are administered (transplanted) to NOD / SCID mice by a method according to the method described in the Examples, a tumor is formed after a certain period (for example, 30 to 50 days). When human myeloid blood cells prepared in the same manner as the above cells are administered (transplanted) to NOD / SCID mice by the same method except that neither human M-CSF nor human GM-CSF is expressed It means not forming a tumor.

（２）c−MYC遺伝子を発現するヒトミエロイド系血液細胞において、c−MYC遺伝子の発現を抑制する工程(2) A step of suppressing c-MYC gene expression in human myeloid blood cells that express c-MYC gene

本発明の作製方法は、c−MYC遺伝子を発現するヒトミエロイド系血液細胞において当該c−MYC遺伝子の発現を抑制する工程（工程（C））を含む。   The production method of the present invention includes a step of suppressing the expression of the c-MYC gene in human myeloid blood cells that express the c-MYC gene (step (C)).

好ましい一態様において本発明の作製方法は、
工程（C）c−MYC遺伝子を発現するヒトミエロイド系血液細胞において、該c−MYC遺伝子の発現を抑制し、それによりc−MYC遺伝子の発現が抑制されたヒトミエロイド系血液細胞を得る工程
を含む。 In a preferred embodiment, the production method of the present invention comprises:
Step (C) In the human myeloid blood cell expressing the c-MYC gene, the step of suppressing the expression of the c-MYC gene, thereby obtaining a human myeloid blood cell in which the expression of the c-MYC gene is suppressed. Including.

より好ましい一態様において、本発明の作製方法は、
工程（C）外来性c−MYC遺伝子を発現するヒトミエロイド系血液細胞において、該外来性c−MYC遺伝子の発現を抑制し、それにより外来性c−MYC遺伝子の発現が抑制されたヒトミエロイド系血液細胞を得る工程
を含む。 In a more preferred embodiment, the production method of the present invention comprises:
Step (C) In human myeloid blood cells that express an exogenous c-MYC gene, the expression of the exogenous c-MYC gene is suppressed, thereby suppressing the expression of the exogenous c-MYC gene. Obtaining a blood cell.

工程（C）における、c−MYC遺伝子発現の抑制の方法は、c−MYC遺伝子の発現が抑制され造腫瘍性を抑制するなどの所望の効果を得られる限り特に限定されず、自体公知の方法を用いることができる。   The method for suppressing c-MYC gene expression in step (C) is not particularly limited as long as a desired effect such as suppression of tumorigenicity can be obtained by suppressing the expression of c-MYC gene. Can be used.

例えば、工程（C）において、c−MYC遺伝子を発現するヒトミエロイド系血液細胞として、調節性プロモーターと機能的に連結されたc−MYC遺伝子を有するヒトミエロイド系血液細胞を用いる場合、c−MYC遺伝子の発現抑制は、調節性プロモーターによるc−MYC遺伝子の発現を誘導しないか或いは抑制解除しないことにより行うことができる。   For example, in the step (C), when human myeloid blood cells having a c-MYC gene operably linked to a regulatory promoter are used as human myeloid blood cells expressing the c-MYC gene, c-MYC Suppression of gene expression can be performed by not inducing the expression of the c-MYC gene by a regulatory promoter or by not releasing the suppression.

或いは、工程（C）において、c−MYC遺伝子を発現するヒトミエロイド系血液細胞として、c−MYCをコードする核酸の両端にloxP配列が同じ向きに配置されているヒトミエロイド系血液細胞を用いる場合、c−MYC遺伝子の発現抑制は、該細胞にCreリコンビナーゼタンパク質を導入し、loxP配列に挟まれたc−MYC遺伝子を染色体から除去することにより行うこともできる。   Alternatively, in the step (C), human myeloid blood cells in which loxP sequences are arranged in the same direction at both ends of the nucleic acid encoding c-MYC are used as human myeloid blood cells expressing the c-MYC gene. The suppression of the expression of the c-MYC gene can also be carried out by introducing Cre recombinase protein into the cell and removing the c-MYC gene sandwiched between loxP sequences from the chromosome.

また、工程（C）において、c−MYC遺伝子を発現するヒトミエロイド系血液細胞として、c−MYCをコードする核酸の両端にトランスポゾン配列が配置されているヒトミエロイド系血液細胞を用いる場合、c−MYC遺伝子の発現抑制は、該細胞に転移酵素を導入し、loxP配列に挟まれたc−MYC遺伝子を染色体から除去することにより行うこともできる。   In the step (C), when human myeloid blood cells in which transposon sequences are arranged at both ends of a nucleic acid encoding c-MYC are used as human myeloid blood cells expressing the c-MYC gene, c- Suppression of MYC gene expression can also be performed by introducing a transferase into the cell and removing the c-MYC gene sandwiched between loxP sequences from the chromosome.

上述した方法以外の、工程（C）において用いることができる遺伝子発現抑制の方法の例としては、例えば、クラスター化等間隔短鎖回分リピート（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat / CRISPR associated proteins）（CRISPR／CAS9）（Cong L et al., Science. 2013 Feb 15;339（6121):819−23、Ran FA et al., Cell. 2013 Sep 12;154(6):1380−9、Guilinger JP, Nat Biotechnol. 2014 Jun;32(6):577−82）、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（Carroll D., Gene Ther. 2008 Nov;15(22):1463−8.）又は転写アクチベーター様エフェクター（TALE）ヌクレアーゼ（Nucleic Acids Res. 2011 Jul;39(12):e82）などを用いるゲノム編集（ゲノムターゲティング）による遺伝子破壊が挙げられる。   Examples of gene expression suppression methods that can be used in step (C) other than those described above include, for example, Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat / CRISPR associated proteins (CRISPR / CAS9) (Cong L et al., Science. 2013 Feb 15; 339 (6121): 819-23, Ran FA et al., Cell. 2013 Sep 12; 154 (6): 1380-9, Guilinger JP, Nat Biotechnol 2014 Jun; 32 (6): 577-82), zinc finger nuclease (Carroll D., Gene Ther. 2008 Nov; 15 (22): 1463-8.) Or transcription activator-like effector (TALE) nuclease (Nucleic Acids Res. 2011 Jul; 39 (12): e82) and the like.

本発明の方法は、工程（C）により、造腫瘍性が十分に抑制されるのに十分な程度にc−MYC遺伝子の発現が抑制された細胞を得る工程を含み得る。   The method of the present invention can include a step of obtaining a cell in which the expression of the c-MYC gene is suppressed to a sufficient extent that the tumorigenicity is sufficiently suppressed by the step (C).

遺伝子の発現抑制は、例えば、該遺伝子からの転写産物の生成量の減少、該遺伝子のコードするタンパク質の生成量の減少等によって確認できる。遺伝子からの転写産物の生成量、又はタンパク質の生成量の測定は、定量的PCR、マイクロアレイなどを用いた核酸量の測定方法、ELISA、ウエスタンブロッティングなどの免疫学的手法などを用いたタンパク質量の測定方法などの、公知の方法を用いて行うことができる。   Inhibition of gene expression can be confirmed, for example, by a decrease in the amount of transcription product generated from the gene, a decrease in the amount of protein encoded by the gene, or the like. The amount of transcript produced from a gene or the amount of protein produced can be measured using quantitative PCR, a method for measuring the amount of nucleic acid using a microarray, etc., or an amount of protein using an immunological technique such as ELISA or Western blotting. It can carry out using well-known methods, such as a measuring method.

本発明の作製方法の一態様は、造腫瘍性が抑制されたヒトミエロイド系血液細胞を作製する方法であって、下記の工程（C）を行うことを含む方法：
（C）c−MYC遺伝子（好ましくはヒトc―MYC遺伝子であり、より好ましくは配列番号１記載のc―MYCタンパク質をコードする核酸）を発現するヒトミエロイド系血液細胞（好ましくは、ヒト多能性幹細胞由来の中胚葉系細胞をM−CSF（通常10〜100 ng／mL、好ましくは30〜70 ng／mL）存在下（より好ましくは、M−CSF：通常10〜100 ng／mL、好ましくは30〜70 ng／mL、及びGM−CSF：通常50〜200 ng／mL、好ましくは70〜150 ng／mL存在下）で一定期間（通常、1〜20日、好ましくは2日〜15日）培養することにより得られるヒトミエロイド系血液細胞（好ましくはCD11b陽性細胞であり、より好ましくはCD45及びCD11b陽性細胞であって、さらに好ましくはCD45及びCD11b陽性細胞である浮遊細胞であり、該細胞は、BMI1、EZH2、MDM2、MDM4及びHIF1Aからなる群より選択される少なくとも1つの外来性遺伝子を発現していてもよく、していなくてもよいが、好ましくは、BMI1及びMDM2遺伝子を発現する細胞）において、該c−MYC遺伝子の発現を抑制し、それによりc−MYC遺伝子の発現が抑制されたヒトミエロイド系血液細胞を得る工程、
である。
本発明の作製方法のより好ましい一態様は、造腫瘍性が抑制されたヒトミエロイド系血液細胞を作製する方法であって、下記の工程（C）を行うことを含む方法：
（C）c−MYC遺伝子（好ましくは外来性c―MYC遺伝子であり、より好ましくは配列番号１記載のc―MYC遺伝子タンパク質をコードする核酸）を発現するヒトミエロイド系血液細胞（好ましくは、ヒト多能性幹細胞由来の中胚葉系細胞をM−CSF（通常10〜100 ng／mL、好ましくは30〜70 ng／mL）存在下（より好ましくはM−CSF：通常10〜100 ng／mL、好ましくは30〜70 ng／mL、及びGM−CSF：通常50〜200 ng／mL、好ましくは70〜150 ng／mL存在下）で一定期間（通常、1〜20日、好ましくは2日〜15日）培養することにより得られるヒトミエロイド系血液細胞（好ましくはCD11b陽性細胞であり、より好ましくはCD45及びCD11b陽性細胞であって、さらに好ましくはCD45及びCD11b陽性細胞である浮遊細胞であり、該細胞は、BMI1、EZH2、MDM2、MDM4及びHIF1Aからなる群より選択される少なくとも1つの外来性遺伝子を発現していてもよく、していなくてもよいが、好ましくは、BMI1及びMDM2遺伝子を発現する細胞であって、該細胞は、調節性プロモーターと機能的に連結されたc−MYC遺伝子を有する細胞であり、好ましくはテトラサイクリン反応性プロモーターと機能的に連結されたc−MYC遺伝子を有し、かつrtTAタンパク質が導入されている細胞であって、好ましくはヒトM−CSF又はヒトGM−CSF依存的造腫瘍性を示す細胞において、該c−MYC遺伝子の発現を抑制し（好ましくは上記テトラサイクリン反応性プロモーターと機能的に連結されたc−MYC遺伝子を有する細胞において、テトラサイクリン又はその誘導体を添加しないことにより発現を抑制し）、それによりc−MYC遺伝子の発現が抑制されたヒトミエロイド系血液細胞を得る工程、
である。 One embodiment of the production method of the present invention is a method of producing human myeloid blood cells with suppressed tumorigenicity, which comprises performing the following step (C):
(C) Human myeloid blood cells (preferably human pluripotent) that express a c-MYC gene (preferably a human c-MYC gene, more preferably a nucleic acid encoding the c-MYC protein described in SEQ ID NO: 1) Sexual stem cell-derived mesodermal cells are present in the presence of M-CSF (usually 10 to 100 ng / mL, preferably 30 to 70 ng / mL) (more preferably M-CSF: usually 10 to 100 ng / mL, preferably 30 to 70 ng / mL, and GM-CSF: usually 50 to 200 ng / mL, preferably in the presence of 70 to 150 ng / mL) for a certain period (usually 1 to 20 days, preferably 2 to 15 days) ) Human myeloid blood cells obtained by culturing (preferably CD11b positive cells, more preferably CD45 and CD11b positive cells, and still more preferably floating cells that are CD45 and CD11b positive cells, Is at least one selected from the group consisting of BMI1, EZH2, MDM2, MDM4 and HIF1A May or may not express a native gene, but preferably suppresses the expression of the c-MYC gene in a cell expressing the BMI1 and MDM2 genes), whereby the c-MYC gene Obtaining human myeloid blood cells in which the expression of is suppressed,
It is.
A more preferred embodiment of the production method of the present invention is a method for producing human myeloid blood cells with suppressed tumorigenicity, comprising the following step (C):
(C) A human myeloid blood cell (preferably human) that expresses a c-MYC gene (preferably a foreign c-MYC gene, more preferably a nucleic acid encoding the c-MYC gene protein of SEQ ID NO: 1) Mesodermal cells derived from pluripotent stem cells are present in the presence of M-CSF (usually 10 to 100 ng / mL, preferably 30 to 70 ng / mL) (more preferably M-CSF: usually 10 to 100 ng / mL, Preferably 30 to 70 ng / mL and GM-CSF: usually 50 to 200 ng / mL, preferably in the presence of 70 to 150 ng / mL) for a certain period (usually 1 to 20 days, preferably 2 to 15 days) Human myeloid blood cells obtained by culturing (preferably CD11b positive cells, more preferably CD45 and CD11b positive cells, and still more preferably floating cells that are CD45 and CD11b positive cells, The cell is at least selected from the group consisting of BMI1, EZH2, MDM2, MDM4 and HIF1A. A foreign gene may or may not be expressed, but is preferably a cell that expresses the BMI1 and MDM2 genes, the cell being operably linked to a regulatable promoter a cell having a c-MYC gene, preferably a cell having a c-MYC gene operably linked to a tetracycline-responsive promoter and having an rtTA protein introduced therein, preferably human M-CSF Alternatively, in a cell exhibiting human GM-CSF-dependent tumorigenicity, the expression of the c-MYC gene is suppressed (preferably in a cell having a c-MYC gene operably linked to the tetracycline-responsive promoter, tetracycline Or by suppressing the expression by not adding a derivative thereof), thereby obtaining human myeloid blood cells in which the expression of the c-MYC gene is suppressed,
It is.

（３）c−MYC遺伝子を発現するヒトミエロイド系血液細胞を増殖させる工程
好ましい一態様において、本発明に用いるc−MYC遺伝子を発現するヒトミエロイド系血液細胞は、該細胞をM−CSFタンパク質の存在下で培養した場合に、該細胞の増殖を促進し得る量のc−MYC遺伝子を発現する。
ヒトミエロイド系血液細胞において増殖を促進し得る量のc−MYC遺伝子を発現させる方法としては、例えば、テトラサイクリン反応性プロモーターと機能的に連結させたc−MYC遺伝子を有するヒトミエロイド系血液細胞を用いる場合、ドキシサイクリン（通常、100ng／mL以上、好ましくは125 ng／mL以上、増殖効率を高めるという観点から、より好ましくは1 μg／mL以上）を含む培地中で、該細胞を培養することにより、該細胞の増殖を促進するのに十分な量のc−MYC遺伝子を発現させることができる。
あるいは、例えば、EF1αプロモーターと機能的に連結させたc−MYC遺伝子を有するヒトミエロイド系血液細胞を培養することにより、該細胞の増殖を促進するのに十分な量のc−MYC遺伝子を発現させることができる。 (3) Step of proliferating human myeloid blood cells expressing c-MYC gene In a preferred embodiment, human myeloid blood cells expressing c-MYC gene used in the present invention are treated with M-CSF protein. When cultured in the presence, it expresses an amount of the c-MYC gene that can promote the growth of the cells.
As a method for expressing an amount of c-MYC gene capable of promoting proliferation in human myeloid blood cells, for example, human myeloid blood cells having c-MYC gene operably linked to a tetracycline-responsive promoter are used. In this case, by culturing the cells in a medium containing doxycycline (usually 100 ng / mL or more, preferably 125 ng / mL or more, more preferably 1 μg / mL or more from the viewpoint of increasing the growth efficiency), A sufficient amount of the c-MYC gene can be expressed to promote the growth of the cells.
Alternatively, for example, by culturing human myeloid blood cells having a c-MYC gene operably linked to the EF1α promoter, a sufficient amount of the c-MYC gene is expressed to promote proliferation of the cell. be able to.

c−MYC遺伝子を発現するヒトミエロイド系血液細胞が、増殖を促進するのに十分な量のc−MYC遺伝子を発現する場合、本発明の作製方法は、c−MYC遺伝子を発現するヒトミエロイド系血液細胞を増殖させる工程をさらに含んでもよい。
本発明の一態様において、本発明の作製方法は
工程（B）c−MYC遺伝子を発現するヒトミエロイド系血液細胞を、ヒトM−CSFタンパク質の存在下で培養する工程
を含み得る。
工程（B）の培養により得られる結果物を工程（C）に付することができる。 When the human myeloid blood cell expressing the c-MYC gene expresses a sufficient amount of the c-MYC gene to promote proliferation, the production method of the present invention comprises the human myeloid system expressing the c-MYC gene. A step of growing blood cells may be further included.
In one embodiment of the present invention, the production method of the present invention may comprise the step (B) of culturing human myeloid blood cells expressing c-MYC gene in the presence of human M-CSF protein.
The resulting product obtained by culturing in step (B) can be subjected to step (C).

すなわち、本発明は、一態様として、
ヒトM−CSF若しくはヒトGM−CSF及び／又はM−CSF遺伝子若しくはGM−CSF遺伝子に依存する造腫瘍性が抑制されたヒトミエロイド系血液細胞を作製する方法であって、下記の工程（B）に続いて下記工程（C）を行うことを含む方法：
（B）ヒトM−CSFの存在下で、c−MYC遺伝子を発現するヒトミエロイド系血液細胞を培養する工程。
（C）工程（B）で培養したヒトミエロイド系血液細胞において、c−MYC遺伝子の発現を抑制し、それによりc−MYC遺伝子の発現が抑制されたヒトミエロイド系血液細胞を得る工程、
を提供する。 That is, the present invention as one aspect,
A method for producing human myeloid blood cells in which tumorigenicity dependent on human M-CSF or human GM-CSF and / or M-CSF gene or GM-CSF gene is suppressed, comprising the following step (B) Followed by the following step (C):
(B) A step of culturing human myeloid blood cells expressing the c-MYC gene in the presence of human M-CSF.
(C) In the human myeloid blood cells cultured in step (B), the step of obtaining human myeloid blood cells in which the expression of c-MYC gene is suppressed by suppressing the expression of c-MYC gene,
I will provide a.

本明細書中、「ヒトM−CSFタンパク質の存在下で培養する」とは、ヒトM−CSFタンパク質を含む培地中で培養することを意味する。培地中のヒトM−CSFタンパク質の濃度は、ヒトミエロイド系血液細胞の増殖を促進させ得る限り特に限定されるものではないが、通常10〜100 ng／mL以上、好ましくは30〜70 ng／mLの範囲である。培地中のM−CSFタンパク質は、培地と接触する細胞（例えば、外来性M−CSF遺伝子が導入されたヒトミエロイド系血液細胞）により産生させたものであってもよく、単離したM−CSFタンパク質を培地に添加したものであってもよい。すなわち、工程（B）においては、培地中のM−CSFタンパク質は、培地と接触する細胞（例えば、外来性M−CSFを発現するヒトミエロイド系血液細胞又はヒトミエロイド系血液細胞と共培養される細胞など）により産生させたものであってもよく、単離したM−CSFタンパク質が培地に添加されたものであってもよい。
従って、一態様において、培養に供されるヒトミエロイド系血液細胞には、外来性のM−CSF遺伝子が導入されている。ヒトM−CSFのアミノ酸配列の一例としては、配列番号７に記載のアミノ酸配列(NCBI NP_000748.3)が挙げられ、ヒトM−CSF遺伝子の例としては、配列番号７に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸が挙げられる。 In the present specification, “culturing in the presence of human M-CSF protein” means culturing in a medium containing human M-CSF protein. The concentration of human M-CSF protein in the medium is not particularly limited as long as it can promote the growth of human myeloid blood cells, but usually 10 to 100 ng / mL or more, preferably 30 to 70 ng / mL. Range. The M-CSF protein in the medium may be produced by cells in contact with the medium (for example, human myeloid blood cells into which an exogenous M-CSF gene has been introduced). The protein may be added to the medium. That is, in step (B), the M-CSF protein in the medium is co-cultured with cells that are in contact with the medium (for example, human myeloid blood cells expressing human M-CSF or human myeloid blood cells). Cells), or an isolated M-CSF protein added to a medium.
Therefore, in one embodiment, an exogenous M-CSF gene has been introduced into human myeloid blood cells to be cultured. An example of the amino acid sequence of human M-CSF includes the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 7 (NCBI NP_000748.3), and an example of the human M-CSF gene has the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 7. Examples include nucleic acids encoding proteins.

ヒトミエロイド系血液細胞の培養用の培地は、さらにGM−CSFを含み得る。培地中のGM−CSFの含有量は、ヒトミエロイド系血液細胞の増殖を促進させ得る限り限定されるものではないが、好ましくは50〜200 ng／mL、より好ましくは70〜150 ng／mLである。培地中のGM−CSFタンパク質は、培地と接触する細胞（例えば、外来性GM−CSF遺伝子が導入されたヒトミエロイド系血液細胞）により産生させたものであってもよく、単離したGM−CSFタンパク質が培地に添加されたものであってもよい。
従って、一態様において、ヒトミエロイド系血液細胞は、外来性のGM−CSF遺伝子が導入されている。ヒトGM−CSFのアミノ酸配列の一例としては、配列番号８に記載のアミノ酸配列(NCBI NP_000749.2)が挙げられ、ヒトGM−CSF遺伝子の例としては、配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸が挙げられる。
（４）c−MYC遺伝子を発現するヒトミエロイド系血液細胞を入手する工程 The culture medium for culturing human myeloid blood cells may further contain GM-CSF. The content of GM-CSF in the medium is not limited as long as it can promote the growth of human myeloid blood cells, but is preferably 50 to 200 ng / mL, more preferably 70 to 150 ng / mL. is there. The GM-CSF protein in the medium may be produced by cells in contact with the medium (for example, human myeloid blood cells into which an exogenous GM-CSF gene has been introduced), and isolated GM-CSF. The protein may be added to the medium.
Accordingly, in one embodiment, the exogenous GM-CSF gene is introduced into human myeloid blood cells. An example of the amino acid sequence of human GM-CSF is the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 8 (NCBI NP_000749.2), and an example of the human GM-CSF gene has the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 8. Examples include nucleic acids encoding proteins.
(4) Step of obtaining human myeloid blood cells expressing c-MYC gene

その他の培養条件等は、ミエロイド系血液細胞を増殖させることができる限り特に限定されるものではなく、例えば、上述のミエロイド系血液細胞分化誘導と同様の培地、培養条件等を採用することができる。   Other culture conditions and the like are not particularly limited as long as myeloid blood cells can be grown. For example, the same culture medium and culture conditions as the above-described myeloid blood cell differentiation induction can be employed. .

本発明の作製方法は、工程（C）に供すべき細胞を入手する工程を含み得る。一実施態様において、本発明の作製方法は、工程（C）の前に、工程（A）多能性幹細胞からc−MYC遺伝子を発現するヒトミエロイド系血液細胞を得る工程を含み得る。別の実施態様において、本発明の作製方法は、工程（C）の前に、工程（Ab）ヒトミエロイド系血液細胞にc−MYC遺伝子を導入する工程を含み得る。   The production method of the present invention may include a step of obtaining cells to be subjected to step (C). In one embodiment, the production method of the present invention may include, before step (C), the step (A) obtaining human myeloid blood cells expressing c-MYC gene from pluripotent stem cells. In another embodiment, the production method of the present invention may comprise a step (Ab) of introducing a c-MYC gene into human myeloid blood cells before the step (C).

従って、一態様として、本発明は、ヒト多能性幹細胞から造腫瘍性が抑制されたヒトミエロイド系血液細胞を作製する方法であって、下記の工程（A）及び（C）を含む方法：
（A）ヒト多能性幹細胞から、c−MYC遺伝子を発現するヒトミエロイド系血液細胞を得る工程、
（C）工程（A）で得られるc−MYC遺伝子を発現するヒトミエロイド系血液細胞において、該c−MYC遺伝子の発現を抑制し、それによりc−MYC遺伝子の発現が抑制されたヒトミエロイド系血液細胞を得る工程、
を提供する。
ヒト多能性幹細胞から、c−MYC遺伝子を発現するヒトミエロイド系血液細胞を得る工程については上述のとおりである。 Therefore, as one aspect, the present invention provides a method for producing human myeloid blood cells with suppressed tumorigenicity from human pluripotent stem cells, the method comprising the following steps (A) and (C):
(A) A step of obtaining human myeloid blood cells expressing c-MYC gene from human pluripotent stem cells,
(C) In the human myeloid blood cells that express the c-MYC gene obtained in step (A), the expression of the c-MYC gene is suppressed, thereby suppressing the expression of the c-MYC gene. Obtaining blood cells;
I will provide a.
The process of obtaining human myeloid blood cells expressing the c-MYC gene from human pluripotent stem cells is as described above.

また別の態様として、工程（A）により得た細胞を工程（B）に供し、得られた細胞を工程（C）に供することができる。従って、本発明は、
（A）ヒト多能性幹細胞から、c−MYC遺伝子を発現するヒトミエロイド系血液細胞を得る工程、
（B）ヒトM−CSFの存在下で、工程（A）で得られる、c−MYC遺伝子を発現するヒトミエロイド系血液細胞を培養する工程。
（C）工程（B）で培養したヒトミエロイド系血液細胞において、該c−MYC遺伝子の発現を抑制し、それによりc−MYC遺伝子の発現が抑制されたヒトミエロイド系血液細胞を得る工程を含む、ヒト多能性幹細胞から造腫瘍性が抑制されたヒトミエロイド系血液細胞を作製する方法を提供する。 Moreover, as another aspect, the cell obtained by the process (A) can be used for a process (B), and the obtained cell can be used for a process (C). Therefore, the present invention
(A) A step of obtaining human myeloid blood cells expressing c-MYC gene from human pluripotent stem cells,
(B) A step of culturing human myeloid blood cells expressing c-MYC gene obtained in step (A) in the presence of human M-CSF.
(C) In the human myeloid blood cells cultured in step (B), the method includes the step of obtaining the human myeloid blood cells in which the expression of the c-MYC gene is suppressed, thereby suppressing the expression of the c-MYC gene A method for producing human myeloid blood cells with suppressed tumorigenicity from human pluripotent stem cells is provided.

さらに別の態様として、本発明は、
（A）ヒト多能性幹細胞から、c−MYC遺伝子及び外来性ヒトM−CSF遺伝子を発現するヒトミエロイド系細胞を得る工程、
（B）工程（A）で得られる、c−MYC遺伝子及び外来性ヒトM−CSF遺伝子を発現するヒトミエロイド系血液細胞を培養する工程、
（C）工程（B）で培養したヒトミエロイド系血液細胞において、該c−MYC遺伝子の発現を抑制し、それによりc−MYC遺伝子の発現が抑制されたヒトミエロイド系血液細胞を得る工程、を含む、ヒト多能性幹細胞から造腫瘍性が抑制されたヒトミエロイド系血液細胞を作製する方法を提供する。 In yet another aspect, the present invention provides:
(A) obtaining human myeloid cells expressing c-MYC gene and exogenous human M-CSF gene from human pluripotent stem cells;
(B) a step of culturing human myeloid blood cells expressing c-MYC gene and exogenous human M-CSF gene obtained in step (A),
(C) In the human myeloid blood cell cultured in step (B), the step of suppressing the expression of the c-MYC gene, thereby obtaining the human myeloid blood cell in which the expression of the c-MYC gene is suppressed, And a method for producing human myeloid blood cells with suppressed tumorigenicity from human pluripotent stem cells.

本発明の作製方法工程（A）において、多能性幹細胞は、好ましくはiPS細胞又は胚性幹細胞であり、より好ましくはiPS細胞である。   In the production method step (A) of the present invention, the pluripotent stem cells are preferably iPS cells or embryonic stem cells, more preferably iPS cells.

一実施態様において、本発明の作製方法は、工程（Ab）ヒトミエロイド系血液細胞にc−MYC遺伝子を導入する工程を含み、さらに工程（Aa）ヒトミエロイド系血液細胞を得る工程を含み得る。ヒトミエロイド系血液細胞の入手方法については上述のとおりである。
従って、一態様として、本発明は、造腫瘍性が抑制されたヒトミエロイド系血液細胞を作製する方法であって、下記の工程（Ab）及び（C）を含む方法：
（Ab）ヒトミエロイド系血液細胞にc−MYC遺伝子を導入し、c−MYC遺伝子を発現するヒトミエロイド系血液細胞を得る工程、
（C）工程（A）で得られるc−MYC遺伝子を発現するヒトミエロイド系血液細胞において、該c−MYC遺伝子の発現を抑制し、それによりc−MYC遺伝子の発現が抑制されたヒトミエロイド系血液細胞を得る工程、
を提供する。 In one embodiment, the production method of the present invention may comprise a step (Ab) introducing a c-MYC gene into human myeloid blood cells, and further comprising a step (Aa) obtaining human myeloid blood cells. The method for obtaining human myeloid blood cells is as described above.
Therefore, as one aspect, the present invention is a method for producing human myeloid blood cells with suppressed tumorigenicity, which comprises the following steps (Ab) and (C):
(Ab) a step of introducing a c-MYC gene into human myeloid blood cells to obtain human myeloid blood cells expressing the c-MYC gene,
(C) In the human myeloid blood cells that express the c-MYC gene obtained in step (A), the expression of the c-MYC gene is suppressed, thereby suppressing the expression of the c-MYC gene. Obtaining blood cells;
I will provide a.

本発明の工程（Ab）において、ヒトミエロイド系血液細胞へのc−MYC遺伝子の導入は、外来性プロモーター（好ましくは調節性プロモーターであり、より好ましくは誘導可能な調節性プロモーター）と機能的に連結された外来性c−MYC遺伝子を該細胞に導入するか、相同的組み換え技術などを用いて内在性c−MYC遺伝子と機能的に連結するように外来性プロモーター（好ましくは調節性プロモーターであり、より好ましくは誘導可能な調節性プロモーター）を該細胞ゲノムに導入するか、或いは相同的組み換え技術などを用いて内在性プロモーターと機能的に連結するように外来性c−MYC遺伝子を該細胞ゲノムに導入することにより行うことができる。本発明の工程（Ab）において、ヒトミエロイド系血液細胞へのc−MYC遺伝子の導入は、好ましくは外来性プロモーター（好ましくは調節性プロモーターであり、より好ましくは誘導可能な調節性プロモーター）と機能的に連結された外来性c−MYC遺伝子を該細胞に導入することにより行われる。   In the step (Ab) of the present invention, the introduction of the c-MYC gene into human myeloid blood cells is functionally performed with an exogenous promoter (preferably a regulatable promoter, more preferably an inducible regulatable promoter). A foreign promoter (preferably a regulatable promoter is used so as to introduce a linked exogenous c-MYC gene into the cell or to be functionally linked to the endogenous c-MYC gene using a homologous recombination technique or the like. More preferably, an inducible regulatable promoter) is introduced into the cell genome, or the exogenous c-MYC gene is operably linked to the endogenous promoter using homologous recombination techniques or the like. It can be done by introducing it. In the step (Ab) of the present invention, the introduction of the c-MYC gene into human myeloid blood cells is preferably an exogenous promoter (preferably a regulatable promoter, more preferably an inducible regulatable promoter) and function. This is done by introducing an exogenously linked exogenous c-MYC gene into the cells.

また別の態様として、工程（Ab）により得た細胞を工程（B）に供し、工程（B）により得られた細胞を工程（C）に供することができる。従って、本発明は、
（Ab）ヒトミエロイド系血液細胞にc−MYC遺伝子（好ましくは調節性プロモーターと機能的に連結された外来性c−MYC遺伝子であり、より好ましくは誘導可能な調節性プロモーターと機能的に連結された外来性c−MYC遺伝子）を導入し、c−MYC遺伝子を発現するヒトミエロイド系血液細胞を得る工程、
（B）ヒトM−CSFの存在下で、工程（Ab）で得られる、c−MYC遺伝子を発現するヒトミエロイド系血液細胞を培養する工程。
（C）工程（B）で培養したヒトミエロイド系血液細胞において、該c−MYC遺伝子の発現を抑制し、それによりc−MYC遺伝子の発現が抑制されたヒトミエロイド系血液細胞を得る工程を含む、造腫瘍性が抑制されたヒトミエロイド系血液細胞を作製する方法を提供する。 In another embodiment, the cells obtained by the step (Ab) can be used for the step (B), and the cells obtained by the step (B) can be used for the step (C). Therefore, the present invention
(Ab) c-MYC gene (preferably an exogenous c-MYC gene operably linked to a regulatable promoter, more preferably operably linked to an inducible regulatable promoter to human myeloid blood cells. Exogenous c-MYC gene) and obtaining human myeloid blood cells expressing the c-MYC gene,
(B) A step of culturing human myeloid blood cells expressing c-MYC gene obtained in step (Ab) in the presence of human M-CSF.
(C) In the human myeloid blood cells cultured in step (B), the method includes the step of obtaining the human myeloid blood cells in which the expression of the c-MYC gene is suppressed, thereby suppressing the expression of the c-MYC gene A method for producing human myeloid blood cells with suppressed tumorigenicity is provided.

さらに別の態様として、本発明は、
（Ab）ヒトミエロイド系血液細胞に、c−MYC遺伝子（好ましくは調節性プロモーターと機能的に連結された外来性c−MYC遺伝子であり、より好ましくは誘導可能な調節性プロモーターと機能的に連結された外来性c−MYC遺伝子）及び外来性ヒトM−CSF遺伝子を導入し、c−MYC遺伝子及び外来性ヒトM−CSF遺伝子を発現するヒトミエロイド系細胞を得る工程、
（B）工程（Ab）で得られる、c−MYC遺伝子及び外来性ヒトM−CSF遺伝子を発現するヒトミエロイド系血液細胞を培養する工程、
（C）工程（B）で培養したヒトミエロイド系血液細胞において、該c−MYC遺伝子の発現を抑制し、それによりc−MYC遺伝子の発現が抑制されたヒトミエロイド系血液細胞を得る工程、を含む、造腫瘍性が抑制されたヒトミエロイド系血液細胞を作製する方法を提供する。 In yet another aspect, the present invention provides:
(Ab) c-MYC gene (preferably an exogenous c-MYC gene operably linked to a regulatable promoter, more preferably operably linked to an inducible regulatable promoter to human myeloid blood cells. The exogenous exogenous c-MYC gene) and exogenous human M-CSF gene, and obtaining human myeloid cells expressing the c-MYC gene and exogenous human M-CSF gene,
(B) a step of culturing human myeloid blood cells expressing c-MYC gene and exogenous human M-CSF gene obtained in step (Ab),
(C) In the human myeloid blood cell cultured in step (B), the step of suppressing the expression of the c-MYC gene, thereby obtaining the human myeloid blood cell in which the expression of the c-MYC gene is suppressed, A method for producing a human myeloid blood cell with suppressed tumorigenicity is also provided.

本発明の作製方法により得られるヒトミエロイド系血液細胞は、腫瘍転移の抑制、腫瘍の縮小に有用な癌の予防又は治療剤の材料として好適に用いられる。腫瘍転移の抑制、腫瘍の縮小に有用な癌の予防又は治療剤として用いる場合、本発明の細胞は、好ましくは外来性IFN−βを発現しており、より好ましくは外来性IFN−βを発現しかつ内在性IFNARの遺伝子の発現が人工的に抑制されている。   Human myeloid blood cells obtained by the production method of the present invention are suitably used as a material for cancer preventive or therapeutic agents useful for suppression of tumor metastasis and tumor shrinkage. When used as a prophylactic or therapeutic agent for cancer useful for suppressing tumor metastasis and tumor shrinkage, the cells of the present invention preferably express exogenous IFN-β, more preferably express exogenous IFN-β. However, the expression of the endogenous IFNAR gene is artificially suppressed.

（５）in vitroで増殖能力を有し造腫瘍性を抑制可能なヒトミエロイド系血液細胞の作製方法
さらに、本発明は、調節性プロモーター（好ましくは、テトラサイクリン反応性プロモーター）と機能的に連結されたc−MYC遺伝子を発現するヒトミエロイド系血液細胞を得ることを含む、in vitroで増殖能力を有し造腫瘍性を抑制可能なヒトミエロイド系血液細胞の作製方法を提供する。
各用語の定義、及び調節性プロモーター（好ましくは、テトラサイクリン反応性プロモーター）と機能的に連結されたc−MYC遺伝子を発現するヒトミエロイド系液細胞の入手方法は、上記（１）〜（４）に記載のとおりである。 (5) Method for producing human myeloid blood cells that can proliferate and suppress tumorigenicity in vitro Further, the present invention is functionally linked to a regulatory promoter (preferably a tetracycline-responsive promoter). The present invention also provides a method for producing human myeloid blood cells that can proliferate and suppress tumorigenicity in vitro, including obtaining human myeloid blood cells that express the c-MYC gene.
The definition of each term and the method for obtaining human myeloid fluid cells expressing the c-MYC gene operably linked to a regulatable promoter (preferably a tetracycline responsive promoter) are the above (1) to (4). It is as described in.

好ましい一態様として、本発明は、in vitroで増殖能力を有し造腫瘍性を抑制可能なヒトミエロイド系血液細胞の作製方法であって、下記の工程（Ab）を行うことを含む方法を提供する：
（Ab）ヒトミエロイド系血液細胞に、テトラサイクリン反応性プロモーターと機能的に連結されたc−MYC遺伝子（好ましくは外来性c−MYC遺伝子であり、より好ましくは外来性ヒトc―MYC遺伝子であり、さらに好ましくは配列番号１記載のc―MYCタンパク質をコードする核酸）及びrtTAタンパク質を導入し、rtTAタンパク質が導入されc−MYC遺伝子を発現可能なヒトミエロイド系血液細胞を得る工程。
工程（Ab）により得られるヒトミエロイド系血液細胞は、テトラサイクリン又はその誘導体の存在下において（即ちテトラサイクリン反応性プロモーターが「オン」の状態において）in vitroで増殖させることが可能であり、テトラサイクリン又はその誘導体の非存在下（即ちテトラサイクリン反応性プロモーターが「オフ」の状態において）において、M−CSF及び／又はGM−CSF依存的な造腫瘍性が抑制されている。 As a preferred embodiment, the present invention provides a method for producing a human myeloid blood cell that can proliferate and suppress tumorigenicity in vitro, the method comprising performing the following step (Ab): To:
(Ab) human myeloid blood cells, c-MYC gene operably linked to a tetracycline-responsive promoter (preferably a foreign c-MYC gene, more preferably a foreign human c-MYC gene, More preferably, a step of introducing a nucleic acid encoding c-MYC protein described in SEQ ID NO: 1) and rtTA protein to obtain human myeloid blood cells into which rtTA protein is introduced and capable of expressing c-MYC gene.
Human myeloid blood cells obtained by the step (Ab) can be grown in vitro in the presence of tetracycline or a derivative thereof (that is, in a state where the tetracycline-responsive promoter is “on”). In the absence of the derivative (ie, when the tetracycline responsive promoter is “off”), M-CSF and / or GM-CSF dependent tumorigenicity is suppressed.

より好ましい一態様として、本発明は、in vitroで増殖能力を有し造腫瘍性を抑制可能なヒトミエロイド系血液細胞の作製方法であって、下記の工程（Ab）を行うことを含む方法を提供する：
（Ab）ヒトミエロイド系血液細胞（好ましくは、ヒト多能性幹細胞由来の中胚葉系細胞をM−CSF（通常10〜100 ng／mL、好ましくは30〜70 ng／mL）存在下（より好ましくは、M−CSF：通常10〜100 ng／mL、好ましくは30〜70 ng／mL、及びGM−CSF：通常50〜200 ng／mL、好ましくは70〜150 ng／mL存在下）で一定期間（通常、1〜20日、好ましくは2日〜15日）培養することにより得られるヒトミエロイド系血液細胞（好ましくはCD11b陽性細胞であり、より好ましくはCD45及びCD11b陽性細胞であって、さらに好ましくはCD45及びCD11b陽性細胞である浮遊細胞））に、テトラサイクリン反応性プロモーターと機能的に連結されたc−MYC遺伝子（好ましくは外来性c−MYC遺伝子であり、より好ましくは外来性ヒトc―MYC遺伝子であり、さらに好ましくは配列番号１記載のc―MYCタンパク質をコードする核酸）及びrtTAタンパク質を導入し、rtTAタンパク質が導入されc−MYC遺伝子を発現可能なヒトミエロイド系血液細胞を得る工程。 As a more preferred embodiment, the present invention relates to a method for producing human myeloid blood cells that can proliferate and suppress tumorigenicity in vitro, the method comprising the following step (Ab): provide:
(Ab) Human myeloid blood cells (preferably mesodermal cells derived from human pluripotent stem cells in the presence of M-CSF (usually 10 to 100 ng / mL, preferably 30 to 70 ng / mL) (more preferably M-CSF: usually 10 to 100 ng / mL, preferably 30 to 70 ng / mL, and GM-CSF: usually 50 to 200 ng / mL, preferably in the presence of 70 to 150 ng / mL) for a certain period of time (Usually 1 to 20 days, preferably 2 to 15 days) human myeloid blood cells obtained by culturing (preferably CD11b positive cells, more preferably CD45 and CD11b positive cells, more preferably Is a floating cell which is a CD45- and CD11b-positive cell)) and a c-MYC gene operatively linked to a tetracycline-responsive promoter (preferably a foreign c-MYC gene, more preferably a foreign human c-MYC A gene, more preferably c-MYC protein described in SEQ ID NO: 1. And a rtTA protein, and a human myeloid blood cell capable of expressing the c-MYC gene by introducing the rtTA protein.

上記、in vitroで増殖能力を有し造腫瘍性を抑制可能なヒトミエロイド系血液細胞の作製方法は、さらに工程（Ab）により得られた細胞を増殖させる工程を含み得る。すなわち、本発明は、in vitroで増殖能力を有し造腫瘍性を抑制可能なヒトミエロイド系血液細胞の作製方法であって、下記の工程（Ab）及び（B）を行うことを含む方法を提供する：
（Ab）ヒトミエロイド系血液細胞（好ましくは、ヒト多能性幹細胞由来の中胚葉系細胞をM−CSF（通常10〜100 ng／mL、好ましくは30〜70 ng／mL）存在下（より好ましくは、M−CSF：通常10〜100 ng／mL、好ましくは30〜70 ng／mL、及びGM−CSF：通常50〜200 ng／mL、好ましくは70〜150 ng／mL存在下）で一定期間（通常、1〜20日、好ましくは2日〜15日）培養することにより得られるヒトミエロイド系血液細胞（好ましくはCD11b陽性細胞であり、より好ましくはCD45及びCD11b陽性細胞であって、さらに好ましくはCD45及びCD11b陽性細胞である浮遊細胞））に、テトラサイクリン反応性プロモーターと機能的に連結されたc−MYC遺伝子（好ましくは外来性c−MYC遺伝子であり、より好ましくは外来性ヒトc―MYC遺伝子であり、さらに好ましくは配列番号１記載のc―MYCタンパク質をコードする核酸）及びrtTAタンパク質を導入し、rtTAタンパク質が導入されc−MYC遺伝子を発現可能なヒトミエロイド系血液細胞を得る工程、
（B）工程（Ab）で得られる、rtTAタンパク質が導入されc−MYC遺伝子を発現可能なヒトミエロイド系血液細胞をテトラサイクリン又はその誘導体（好ましくはドキシサイクリン100 ng／mL以上、より好ましくは125 ng／mL以上、さらに好ましくは1 μg／mL以上）及びヒトM−CSF（好ましくはヒトM−CSF 10〜100 ng／mL、より好ましくはヒトM−CSF 30〜70 ng／mL）存在下で培養する工程。 The above-described method for producing a human myeloid blood cell that has a proliferation ability in vitro and can suppress tumorigenicity may further comprise a step of growing the cells obtained by the step (Ab). That is, the present invention relates to a method for producing a human myeloid blood cell that has a proliferation ability in vitro and is capable of suppressing tumorigenicity, comprising the following steps (Ab) and (B): provide:
(Ab) Human myeloid blood cells (preferably mesodermal cells derived from human pluripotent stem cells in the presence of M-CSF (usually 10 to 100 ng / mL, preferably 30 to 70 ng / mL) (more preferably M-CSF: usually 10 to 100 ng / mL, preferably 30 to 70 ng / mL, and GM-CSF: usually 50 to 200 ng / mL, preferably in the presence of 70 to 150 ng / mL) for a certain period of time (Usually 1 to 20 days, preferably 2 to 15 days) human myeloid blood cells obtained by culturing (preferably CD11b positive cells, more preferably CD45 and CD11b positive cells, more preferably Is a floating cell which is a CD45- and CD11b-positive cell)) and a c-MYC gene operatively linked to a tetracycline-responsive promoter (preferably a foreign c-MYC gene, more preferably a foreign human c-MYC A gene, more preferably c-MYC protein described in SEQ ID NO: 1. A nucleic acid encoding the rtTA protein, and a human myeloid blood cell capable of expressing the c-MYC gene by introducing the rtTA protein,
(B) Human myeloid blood cells obtained in step (Ab) into which rtTA protein is introduced and capable of expressing c-MYC gene are converted to tetracycline or a derivative thereof (preferably doxycycline 100 ng / mL or more, more preferably 125 ng / culturing in the presence of at least mL, more preferably at least 1 μg / mL) and human M-CSF (preferably human M-CSF 10-100 ng / mL, more preferably human M-CSF 30-70 ng / mL) Process.

２．造腫瘍性が抑制されたヒトミエロイド系血液細胞
さらに本発明は、c−MYC遺伝子を制御可能に発現し得るミエロイド系血液細胞（本明細書中、本発明の細胞とも称する。）を提供する。
一態様において、本発明の細胞は、調節性プロモーターと機能的に連結されたc−MYC遺伝子を有する。
別の態様において、本発明の細胞は、切り出し可能な、外来性プロモーターと機能的に連結されたc−MYC遺伝子を有する。 2. Human myeloid blood cells with suppressed tumorigenicity Furthermore, the present invention provides myeloid blood cells that can controllably express the c-MYC gene (also referred to herein as cells of the present invention).
In one embodiment, the cells of the invention have a c-MYC gene operably linked to a regulatable promoter.
In another embodiment, the cells of the invention have a c-MYC gene operably linked to an exogenous promoter that can be excised.

本発明の細胞は、その増殖能力を高めるという観点から、BMI1、EZH2、MDM2、MDM4及びHIF1Aからなる群より選択される少なくとも1つの外来性遺伝子を発現していることが好ましく、さらに好ましくはBMI1及びMDM2を発現する。
また、癌の予防又は治療用として用いることを目的とする場合、本発明の細胞は、外来性のIFNβを発現していることが好ましい。
また、癌の予防又は治療用として用いることを目的とする場合、本発明の細胞は、内在性IFNAR遺伝子の発現が抑制されていることもまた好ましい。 The cell of the present invention preferably expresses at least one foreign gene selected from the group consisting of BMI1, EZH2, MDM2, MDM4, and HIF1A, more preferably BMI1 from the viewpoint of enhancing its proliferation ability. And expresses MDM2.
In addition, when intended for use for cancer prevention or treatment, the cells of the present invention preferably express exogenous IFNβ.
Moreover, when it is intended to be used for the prevention or treatment of cancer, it is also preferable that the expression of the endogenous IFNAR gene is suppressed in the cells of the present invention.

好ましい一態様として、本発明の細胞は、
― 調節性プロモーターと機能的に連結されたc−MYC遺伝子を有する、ヒトミエロイド系血液細胞（より好ましくはテトラサイクリン反応性プロモーターと機能的に連結された外来性ヒトc−MYC遺伝子を有するヒトミエロイド系血液細胞であり、さらに好ましくはテトラサイクリン反応性プロモーターと機能的に連結された外来性ヒトc−MYC遺伝子を有しかつrtTAタンパク質が導入されているヒトミエロイド系血液細胞）であって、
― 該細胞はさらに、ヒトBMI1、ヒトEZH2、ヒトMDM2、ヒトMDM4及びヒトHIF1Aからなる群より選択される少なくとも1つの外来性遺伝子を発現していてもよく、していなくてもよいが、好ましくは、外来性のヒトBMI1及びヒトMDM2遺伝子を発現し、
― 該細胞はさらに、ヒトM−CSF遺伝子及び／又はヒトGM−CSF遺伝子を発現していてもよく、していなくてもよい細胞である。
調節性プロモーターと機能的に連結されたc−MYC遺伝子を有する、ヒトミエロイド系血液細胞は、c−MYC遺伝子の発現を誘導することでヒトM−CSFタンパク質の存在下で培養することによりin vitroで増殖させることが可能となり、c−MYC遺伝子の発現を抑制することで造腫瘍性を抑制することができる。 In a preferred embodiment, the cell of the present invention is
A human myeloid blood cell having a c-MYC gene operably linked to a regulatable promoter (more preferably a human myeloid system having an exogenous human c-MYC gene operably linked to a tetracycline responsive promoter. A blood cell, more preferably a human myeloid blood cell having an exogenous human c-MYC gene operably linked to a tetracycline responsive promoter and having an rtTA protein introduced therein,
The cell may or may not express at least one foreign gene selected from the group consisting of human BMI1, human EZH2, human MDM2, human MDM4 and human HIF1A, but preferably Expresses exogenous human BMI1 and human MDM2 genes,
-The cell is a cell that may or may not express a human M-CSF gene and / or a human GM-CSF gene.
Human myeloid blood cells having a c-MYC gene operably linked to a regulatable promoter can be generated in vitro by culturing in the presence of human M-CSF protein by inducing expression of the c-MYC gene. The tumorigenicity can be suppressed by suppressing the expression of the c-MYC gene.

一態様において、本発明の細胞は癌の予防又は治療用である。
別の態様として、本発明の細胞は癌の予防又は治療剤の製造に用いることができる。 In one embodiment, the cells of the present invention are for cancer prevention or treatment.
In another embodiment, the cell of the present invention can be used for producing a preventive or therapeutic agent for cancer.

癌の予防又は治療に用いる場合の好ましい一態様として、本発明の細胞は、
― 調節性プロモーターと機能的に連結されたc−MYC遺伝子を有する、ヒトミエロイド系血液細胞（より好ましくはテトラサイクリン反応性プロモーターと機能的に連結された外来性ヒトc−MYC遺伝子を有するヒトミエロイド系血液細胞であり、さらに好ましくはテトラサイクリン反応性プロモーターと機能的に連結された外来性ヒトc−MYC遺伝子を有しかつrtTAタンパク質が導入されているヒトミエロイド系血液細胞）であって、
― 該細胞はさらに、ヒトBMI1、ヒトEZH2、ヒトMDM2、ヒトMDM4及びヒトHIF1Aからなる群より選択される少なくとも1つの外来性遺伝子を発現していてもよく、していなくてもよいが、好ましくは、外来性のヒトBMI1及びヒトMDM2遺伝子を発現し、
― 該細胞はさらに、ヒトM−CSF遺伝子及び／又はヒトGM−CSF遺伝子を発現していてもよく、していなくてもよく、
― 外来性プロモーター（好ましくは構成的プロモーター又は調節性プロモーターであり、より好ましくは構成的プロモーターであり、さらに好ましくはEF−1αプロモーター）と機能的に連結された外来性ヒトIFNβ遺伝子（好ましくは配列番号３記載のアミノ酸配列を有するIFNβタンパク質をコードする核酸）を有し
― 内在性のIFNAR遺伝子の発現が抑制されている（好ましくはIFNAR1又は2遺伝子へのフレームシフト及び／又はストップコドンの挿入により抑制されており、より好ましくはIFNAR1のエクソン1〜3若しくはIFNAR2遺伝子のエクソン2〜4のいずれかへのフレームシフト及び／又はストップコドンの挿入により抑制されており、さらに好ましくは、IFNAR1遺伝子のエクソン2若しくはIFNAR2遺伝子のエクソン3へのフレームシフト及び／又はストップコドンの挿入によって抑制されている）。 As a preferred embodiment when used for prevention or treatment of cancer, the cell of the present invention comprises:
A human myeloid blood cell having a c-MYC gene operably linked to a regulatable promoter (more preferably a human myeloid system having an exogenous human c-MYC gene operably linked to a tetracycline responsive promoter. A blood cell, more preferably a human myeloid blood cell having an exogenous human c-MYC gene operably linked to a tetracycline responsive promoter and having an rtTA protein introduced therein,
The cell may or may not express at least one foreign gene selected from the group consisting of human BMI1, human EZH2, human MDM2, human MDM4 and human HIF1A, but preferably Expresses exogenous human BMI1 and human MDM2 genes,
The cell may or may not further express a human M-CSF gene and / or a human GM-CSF gene;
An exogenous human IFNβ gene (preferably a sequence preferably linked to an exogenous promoter (preferably a constitutive promoter or regulatable promoter, more preferably a constitutive promoter, more preferably an EF-1α promoter) The nucleic acid encoding the IFNβ protein having the amino acid sequence of No. 3) —the expression of the endogenous IFNAR gene is suppressed (preferably by frameshifting into the IFNAR1 or 2 gene and / or insertion of a stop codon) More preferably suppressed by a frameshift and / or insertion of a stop codon into either exon 1 to 3 of IFNAR1 or exon 2 to 4 of the IFNAR2 gene, and more preferably an exon of the IFNAR1 gene Frameshift and / or stop of exon 3 of 2 or IFNAR2 gene Is suppressed by insertion of Don).

各用語の定義は、本発明の作製方法について記載した部分に順ずる。   The definition of each term follows the portion described for the manufacturing method of the present invention.

一態様において、本発明の細胞は、本発明の作製方法により得られる、造腫瘍性が抑制されたヒトミエロイド系血液細胞が挙げられ、好ましくはヒトM−CSF又はヒトGM−CSF依存的造腫瘍性が抑制されたヒトミエロイド系血液細胞であり、さらに好ましくはin vitroで増殖することが可能であり、かつ造腫瘍性が抑制された細胞が挙げられる。   In one embodiment, the cells of the present invention include human myeloid blood cells that are obtained by the production method of the present invention and have suppressed tumorigenicity, preferably human M-CSF or human GM-CSF-dependent tumor formation It is a human myeloid blood cell whose sex is suppressed, and more preferably a cell that can proliferate in vitro and whose tumorigenicity is suppressed.

３．造腫瘍性が抑制されたヒトミエロイド系血液細胞を含む、癌の予防又は治療剤
さらに、本発明は、本発明の作製方法１又は２により得られる細胞又は本発明の細胞を含む、癌の予防又は治療剤（本明細書中、本発明の予防又は治療剤とも称する。）を提供する。 3. A preventive or therapeutic agent for cancer comprising human myeloid blood cells whose tumorigenicity is suppressed. Furthermore, the present invention provides a preventive for cancer comprising cells obtained by the production method 1 or 2 of the present invention or cells of the present invention. Alternatively, a therapeutic agent (also referred to herein as a prophylactic or therapeutic agent of the present invention) is provided.

癌の例としては、肝臓癌（例、肝細胞癌、原発性肝癌、肝外胆管癌）、胃癌（例、乳頭腺癌、粘液性腺癌、腺扁平上皮癌）、膵癌（例、膵管癌、膵内分泌腫瘍）、十二指腸癌、小腸癌、大腸癌（例、結腸癌、直腸癌、肛門癌、家族性大腸癌、遺伝性非ポリポーシス大腸癌、消化管間質腫瘍）、咽頭癌、喉頭癌、食道癌、乳癌（例、浸潤性乳管癌、非浸潤性乳管癌、炎症性乳癌）、卵巣癌（例、上皮性卵巣癌、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣性胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍）、精巣腫瘍、前立腺癌（例、ホルモン依存性前立腺癌、ホルモン非依存性前立腺癌）、甲状腺癌（例、甲状腺髄様癌）、腎臓癌（例、腎細胞癌、腎盂と尿管の移行上皮癌）、子宮癌（例、子宮頚部癌、子宮体部癌、子宮肉腫）、肺癌（例、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、悪性中皮腫）、中皮腫、脳腫瘍（例、髄芽細胞腫、神経膠腫、松果体星細胞腫瘍、毛様細胞性星細胞腫、びまん性星細胞腫、退形成性星細胞腫、下垂体腺腫）、網膜芽細胞腫、皮膚癌（例、基底細胞腫、悪性黒色腫）、肉腫（例、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、軟部肉腫）、悪性骨腫瘍、膀胱癌、血液癌（例、多発性骨髄腫、白血病、悪性リンパ腫、ホジキン病、慢性骨髄増殖性疾患）、原発不明癌等が挙げられるが、これらに限定されない。
また、本発明の予防又は治療剤は、インターフェロンβ感受性の高い癌の予防又は治療用として用いることができる。 Examples of cancer include liver cancer (eg, hepatocellular carcinoma, primary liver cancer, extrahepatic bile duct cancer), gastric cancer (eg, papillary adenocarcinoma, mucinous adenocarcinoma, adenosquamous carcinoma), pancreatic cancer (eg, pancreatic duct cancer, Pancreatic endocrine tumors), duodenal cancer, small intestine cancer, colon cancer (eg, colon cancer, rectal cancer, anal cancer, familial colon cancer, hereditary nonpolyposis colon cancer, gastrointestinal stromal tumor), pharyngeal cancer, laryngeal cancer, Esophageal cancer, breast cancer (eg, invasive ductal carcinoma, non-invasive ductal carcinoma, inflammatory breast cancer), ovarian cancer (eg, epithelial ovarian cancer, extragonadal germ cell tumor, ovarian germ cell tumor, ovarian hypomalignant) Grade tumor), testicular tumor, prostate cancer (eg, hormone-dependent prostate cancer, hormone-independent prostate cancer), thyroid cancer (eg, medullary thyroid cancer), kidney cancer (eg, renal cell carcinoma, renal pelvis and ureter) Transitional cell carcinoma), uterine cancer (eg, cervical cancer, uterine body cancer, uterine sarcoma), lung cancer (eg, non-small cell lung cancer, small cell lung cancer, malignant Tumor), mesothelioma, brain tumor (eg, medulloblastoma, glioma, pineal astrocytoma, ciliary astrocytoma, diffuse astrocytoma, anaplastic astrocytoma, pituitary gland) Adenoma), retinoblastoma, skin cancer (eg, basal cell tumor, malignant melanoma), sarcoma (eg, rhabdomyosarcoma, leiomyosarcoma, soft tissue sarcoma), malignant bone tumor, bladder cancer, blood cancer (eg , Multiple myeloma, leukemia, malignant lymphoma, Hodgkin's disease, chronic myeloproliferative disease), cancer of unknown primary origin, and the like.
Moreover, the preventive or therapeutic agent of the present invention can be used for the prevention or treatment of cancer with high sensitivity to interferon β.

一実施態様において、本発明の予防又は治療剤に含まれるヒトミエロイド系血液細胞としては、患者本人の体細胞由来のiPS細胞から分化させたヒトミエロイド系血液細胞が好ましく使用される。
別の実施態様において、本発明の予防又は治療剤に含まれるヒトミエロイド系血液細胞としては、患者とHLAの型が同一もしくは実質的に同一である他人から誘導されたヒト多能性幹細胞から分化誘導したヒトミエロイド系血液細胞が好ましく使用される。 In one embodiment, human myeloid blood cells differentiated from iPS cells derived from the patient's own somatic cells are preferably used as human myeloid blood cells contained in the preventive or therapeutic agent of the present invention.
In another embodiment, the human myeloid blood cell contained in the preventive or therapeutic agent of the present invention is differentiated from a human pluripotent stem cell derived from another person having the same or substantially the same HLA type as the patient. Induced human myeloid blood cells are preferably used.

本発明の予防又は治療剤に含まれるヒトミエロイド系血液細胞は、常套手段にしたがって医薬上許容される担体と混合するなどして注射剤、懸濁剤、点滴剤等の非経口製剤として製造される。当該非経口製剤に含まれ得る医薬上許容される担体としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、D−ソルビトール、D−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などの注射用の水性液を挙げることができるが、これらに限定されない。本発明の剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩酸リドカイン、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、安息香酸ナトリウム、塩化ベンザルコニウムなど）、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、エデト酸ナトリウムなど）などと配合しても良い。   Human myeloid blood cells contained in the preventive or therapeutic agent of the present invention are produced as parenteral preparations such as injections, suspensions, drops, etc. by mixing with pharmaceutically acceptable carriers according to conventional means. The Examples of pharmaceutically acceptable carriers that can be included in the parenteral preparation include isotonic solutions (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, and the like) that include physiological saline, glucose, and other adjuvants. However, the present invention is not limited to these. The agent of the present invention includes, for example, a buffer (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer), a soothing agent (eg, lidocaine hydrochloride, procaine hydrochloride, etc.), a stabilizer (eg, human serum albumin, polyethylene glycol) Etc.), preservatives (eg, sodium benzoate, benzalkonium chloride, etc.), antioxidants (eg, ascorbic acid, sodium edetate, etc.), and the like.

本発明の剤を水性懸濁液剤として製剤化する場合、例えば、上記水性液に約1.0×106〜約1.0×1012細胞／mLとなるように、ヒトミエロイド系血液細胞を懸濁させればよい。投与方法は特に限定されないが、好ましくは注射であり、腹腔内投与、腫瘍患部への局所投与などが挙げられる。本発明の剤の投与量は、投与対象、治療標的部位、症状、投与方法などにより差異はあるが、通常、患者（体重60kgとして）においては、例えば、腹腔内注射の場合、１回につきヒトミエロイド系血液細胞の量として約106〜約1×1011細胞を、1週間に約2〜3回、約2〜3週間以上投与することができる。 When formulating the agent of the present invention as an aqueous suspension, for example, human myeloid blood cells can be suspended in the aqueous solution so as to be about 1.0 × 10 6 to about 1.0 × 10 12 cells / mL. That's fine. Although the administration method is not particularly limited, it is preferably injection, and intraperitoneal administration, local administration to a tumor affected part, and the like can be mentioned. The dose of the agent of the present invention varies depending on the administration subject, treatment target site, symptom, administration method, and the like, but usually in a patient (with a body weight of 60 kg), for example, in the case of intraperitoneal injection, humans per one time About 10 6 to about 1 × 10 11 cells can be administered as the amount of myeloid blood cells about 2 to 3 times a week for about 2 to 3 weeks or more.

本発明の予防又は治療剤の投与対象となり得る動物は、本発明の予防又は治療剤がその効果を発揮し得る限り特に限定されるものではないが、好ましくはヒトであり、より好ましくは癌に罹患しているヒトである。   The animal that can be administered with the preventive or therapeutic agent of the present invention is not particularly limited as long as the preventive or therapeutic agent of the present invention can exert its effect, but is preferably a human, more preferably cancer. Affected humans.

本発明の細胞又は本発明の作製方法により得られる細胞は、造腫瘍性が抑制されているため、特にヒトM−CSFタンパク質が存在する箇所への投与に好適に用いることができる。   Since the tumorigenicity is suppressed, the cell of the present invention or the cell obtained by the production method of the present invention can be suitably used particularly for administration to a site where human M-CSF protein is present.

４．予防又は治療上有効量の、造腫瘍性が抑制されたヒトミエロイド系血液細胞を、投与することを含む、ヒトにおける癌の予防又は治療方法
本発明の一態様として、本発明の細胞（好ましくは本発明の予防又は治療剤）をヒトに予防又は治療上有効量投与することを含む、それを必要とするヒトにおける、癌の予防又は治療方法（本明細書中、本発明の予防又は治療方法とも称する）を提供する。
本発明の予防又は治療方法に用いられる本発明の細胞、その投与対象、投与方法などについては、本発明の予防又は治療剤について記載した部分に準ずる。
本発明の予防又は治療方法において、有効量とは、対象に投与されると、予防上又は治療上の有用性をもたらすのに十分な、活性成分（すなわち本発明の細胞）の量を指す。 4). A method for preventing or treating cancer in humans comprising administering a prophylactically or therapeutically effective amount of a human myeloid blood cell with suppressed tumorigenicity As one aspect of the present invention, the cell of the present invention (preferably A method for preventing or treating cancer in a human in need thereof, comprising administering a prophylactic or therapeutic agent of the present invention to a human in a prophylactic or therapeutic amount (in the present specification, a method for preventing or treating the present invention) Also referred to as).
About the cell of this invention used for the prevention or treatment method of this invention, its administration object, administration method, etc., it applies to the part described about the prevention or treatment agent of this invention.
In the prophylactic or therapeutic methods of the present invention, an effective amount refers to the amount of active ingredient (ie, a cell of the present invention) that, when administered to a subject, is sufficient to provide prophylactic or therapeutic utility.

以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の単なる例示を示すものにすぎず、本発明の範囲を何ら限定するものではない。   The present invention will be described more specifically with reference to the following examples. However, the examples are merely illustrative of the present invention and do not limit the scope of the present invention.

実施例１：M−CSF及びGM−CSFを発現するiPS−ML細胞の造腫瘍性
iPS−ML及びiPS−TML作成法の概要
（１）iPS細胞の調整方法
インターロイキン2及び抗CD3モノクローナル抗体で前刺激したヒト末梢血単核球に、センダイウイルスベクター（CytoTune−iPS、Dnavec、Tsukuba、Japan）を用いて初期化４因子の遺伝子導入を行った。遺伝子導入した細胞を、マウス胚性線維芽細胞のフィーダー細胞層上で培養した。20日後に予想された形態を呈するiPS細胞コロニーを選択した。
（２）OP9フィーダー細胞の調整
マウス由来の培養細胞株OP9をマイトマイシンCにて処理（0.01 mg／mL、60分）したものを、ゼラチンをコートしたディッシュに播種し、翌日以降に使用した。 Example 1: Tumorigenicity of iPS-ML cells expressing M-CSF and GM-CSF
Overview of iPS-ML and iPS-TML preparation method (1) Preparation of iPS cells Sendai virus vectors (CytoTune-iPS, Dnavec, Tsukuba, pre-stimulated with interleukin-2 and anti-CD3 monoclonal antibodies. , Japan) was used for gene transfer of reprogramming 4 factors. The transfected cells were cultured on a feeder cell layer of mouse embryonic fibroblasts. IPS cell colonies exhibiting the expected morphology after 20 days were selected.
(2) Preparation of OP9 feeder cells A mouse-derived cultured cell line OP9 treated with mitomycin C (0.01 mg / mL, 60 minutes) was seeded in a gelatin-coated dish and used on the following day.

（３）分化誘導培養
（１）で得たiPS細胞を、CTK液を用いて5〜10分間処理し、牛胎児（FCS）血清入りのDMEM培養液で回収した。細胞をα−MEM／20％FCSに懸濁し、OP9フィーダー細胞上へ播種し、分化誘導培養を開始した。以降、3日に1度、培養液（α−MEM／20％FCS）を交換しつつ培養を継続した。 (3) Differentiation-inducing culture The iPS cells obtained in (1) were treated with CTK solution for 5 to 10 minutes, and collected in a DMEM culture solution containing fetal calf (FCS) serum. The cells were suspended in α-MEM / 20% FCS, seeded on OP9 feeder cells, and differentiation induction culture was started. Thereafter, the culture was continued once every 3 days while changing the culture solution (α-MEM / 20% FCS).

分化誘導開始から18〜25日後、トリプシン−コラゲナーゼ液を用いて細胞を処理（37℃ 60分）して解離させて回収し、ピペッティング操作により細胞浮遊液を作製した。そして、ディッシュ1枚由来の細胞を10 mLのDMEM／10％ FCSに懸濁し、フィーダー細胞なし、ゼラチンコートなしのディッシュ2枚に播種した。2〜5時間後、ディッシュに付着しなかった細胞を回収し、100ミクロンのメッシュ（BD Falcon社製セルストレイナー）を通過させることにより、凝集細胞塊を除いた細胞浮遊液を得た。   18 to 25 days after the initiation of differentiation induction, cells were treated with trypsin-collagenase solution (at 37 ° C. for 60 minutes), dissociated and collected, and a cell suspension was prepared by pipetting. Then, cells derived from one dish were suspended in 10 mL of DMEM / 10% FCS, and seeded on two dishes without feeder cells and without gelatin coating. After 2 to 5 hours, the cells that did not adhere to the dish were collected and passed through a 100 micron mesh (BD Falcon cell strainer) to obtain a cell suspension from which aggregated cell mass had been removed.

メッシュを通過した細胞を、α−MEM／20％FCS／ヒトGM−CSF（100 ng／mL、ぺプロテック社製）／ヒトM−CSF（50 ng／mL、ぺプロテック社製）に浮遊させ、OP9フィーダー細胞を用いずに、培養を行った。その後、3〜9日程度経過すると、浮遊性あるいは弱付着性の細胞（iPS−MC）が増加し、日を追って細胞数が増加するのが観察された。   Cells that have passed through the mesh are suspended in α-MEM / 20% FCS / human GM-CSF (100 ng / mL, manufactured by Peprotech) / human M-CSF (50 ng / mL, manufactured by Peprotech) The cells were cultured without using OP9 feeder cells. Thereafter, when about 3 to 9 days passed, floating or weakly adherent cells (iPS-MC) increased, and it was observed that the number of cells increased day by day.

（４）iPS−MCへのcMYC、BMI−1及びMDM2発現ベクターの導入による長期増殖能力の付与
iPS−MLの作成
前項で作成したiPS−MCを24穴培養プレート中で培養し、そこへcMYC、BMI−1、及びMDM2を発現するレンチウイルス懸濁液を同時に加えることにより、感染させた。遺伝子導入の翌日より、細胞の増殖に応じて培養液を追加しつつ、培養スケールの拡大を行った。培養液としては、α−MEM／20％FCS／ヒトGM−CSF（100 ng／mL）／ヒトM−CSF（100 ng／mL）を用いた。 (4) Providing long-term proliferation ability by introducing cMYC, BMI-1, and MDM2 expression vectors into iPS-MC
Preparation of iPS-ML The iPS-MC prepared in the previous section was cultured in a 24-well culture plate, and a lentiviral suspension expressing cMYC, BMI-1, and MDM2 was simultaneously added thereto for infection. From the day after the gene transfer, the culture scale was expanded while adding a culture solution according to the cell growth. As a culture solution, α-MEM / 20% FCS / human GM-CSF (100 ng / mL) / human M-CSF (100 ng / mL) was used.

iPS−ML／M＋GMの作成
上記のように作成したiPS−MLにM−CSFとGM−CSFの発現ベクターを同時に導入した。ベクター導入の3日後より、ヒトGM−CSFとM−CSFのいずれも含まないα−MEM／20％FCS（牛胎児血清）を用いて培養した。 Preparation of iPS-ML / M + GM Expression vectors for M-CSF and GM-CSF were simultaneously introduced into iPS-ML prepared as described above. From 3 days after the introduction of the vector, the cells were cultured using α-MEM / 20% FCS (fetal calf serum) containing neither human GM-CSF nor M-CSF.

iPS−TMLの作成
iPS−MCを２４穴培養プレート中で培養し、そこへrtTA、BMI1、及びMDM2の発現ベクター（いずれもEF1プロモーター制御下）とcMYCの発現ベクター（テトラサイクリン反応性プロモーター制御下）を導入した。細胞の増殖に応じて培養液を追加しつつ、培養スケールの拡大を行った。培養液としては、α−MEM／20％FCS／ヒト GM−CSF （100 ng／mL）／ヒトM−CSF（100 ng／mL）／ドキシサイクリン（1,000 ng／mL）を用いた。 iPS-TML creation
iPS-MC was cultured in a 24-well culture plate, and rtTA, BMI1, and MDM2 expression vectors (all under the control of the EF1 promoter) and cMYC expression vectors (under the control of the tetracycline-responsive promoter) were introduced therein. The culture scale was expanded while adding a culture solution according to cell growth. As a culture solution, α-MEM / 20% FCS / human GM-CSF (100 ng / mL) / human M-CSF (100 ng / mL) / doxycycline (1,000 ng / mL) was used.

iPS−TML／M＋GMの作成
iPS−TMLにM−CSFとGM−CSFの発現ベクターを同時に導入した。ベクター導入の三日後より、α−MEM／20％FCS／ドキシサイクリン（1,000 ng／mL）を用いて培養した。 iPS-TML / M + GM creation
The expression vectors for M-CSF and GM-CSF were introduced simultaneously into iPS-TML. Three days after the introduction of the vector, the cells were cultured using α-MEM / 20% FCS / doxycycline (1,000 ng / mL).

図４に、各々の細胞の作成に際して導入した因子及び細胞増殖に必要な因子を示している。
図５に、iPS−ML、iPS−ML／M＋GM及びiPS−TML／M＋GMの顕微鏡写真を示す。各々の細胞を細胞培養用6穴プレート（BD−FALCON）に播種した。顕微鏡撮影装置（Carl−Zeiss Axiovison）を用いて位相差顕微鏡画像を撮影した。 FIG. 4 shows factors introduced in the preparation of each cell and factors necessary for cell growth.
FIG. 5 shows micrographs of iPS-ML, iPS-ML / M + GM, and iPS-TML / M + GM. Each cell was seeded in a cell culture 6-well plate (BD-FALCON). The phase-contrast microscope image was image | photographed using the microscope imaging device (Carl-Zeiss Axiovison).

図６及び７に、iPS−TML／M＋GMのドキシサイクリン依存性増殖を示す実験結果を示す。iPS−TML／M＋GMをα−MEM／20％FCS中に1 x 105／mLの細胞密度で浮遊させ、細胞培養用6穴プレートに播種した。ドキシサイクリンを、0、125、あるいは1,000 ng／mL添加して培養を開始した。培養開始から、1、2及び3日後に各々の条件の細胞を一部回収し、トライパンブルー液と混和した後、血球計算盤を用いて細胞密度を数えた。図４に示すように、ドキシサイクリン非存在下では、細胞は全く増殖しなかった。ドキシサイクリンを125、あるいは1,000 ng／mL添加した場合は、増殖した。培養開始から3日後では、ドキシサイクリン濃度125ng／mLよりも1,000 ng／mL添加した条件において、より多くの細胞が存在しており、より速い増殖が誘導されたことを示す。図７に、ドキシサイクリン濃度0、125、あるいは1,000 ng／mLの条件下での培養開始から3日後のiPS−TML／M＋GMの顕微鏡写真を示す。 6 and 7 show experimental results showing doxycycline-dependent proliferation of iPS-TML / M + GM. iPS-TML / M + GM was suspended in α-MEM / 20% FCS at a cell density of 1 × 10 5 / mL and seeded in a 6-well plate for cell culture. Doxycycline was added at 0, 125, or 1,000 ng / mL to start the culture. One, two and three days after the start of the culture, some of the cells under each condition were collected and mixed with trypan blue solution, and then the cell density was counted using a hemocytometer. As shown in FIG. 4, in the absence of doxycycline, the cells did not grow at all. When doxycycline was added at 125 or 1,000 ng / mL, it grew. Three days after the start of the culture, more cells were present under conditions where 1,000 ng / mL was added than the doxycycline concentration of 125 ng / mL, indicating that faster proliferation was induced. FIG. 7 shows a photomicrograph of iPS-TML / M + GM 3 days after the start of culture under doxycycline concentrations of 0, 125, or 1,000 ng / mL.

図８に、テトラサイクリン反応性プロモーターによるcMYCの発現制御とiPS−TMLの増殖制御の概念図を示す。iPS−TML／M＋GMは、rtTA（テトラサイクリンリバーストランスクリプションアクチベータ）を恒常的に発現し、また、テトラサイクリン反応性プロモーターに制御されたcMYC遺伝子を保持している。ドキシサイクリンなど、rtTAに結合してTREプロモーターの活性を誘導する薬剤の存在下でのみ、cMYC遺伝子を発現する。このため、iPS−TML／M＋GMはドキシサイクリン等が存在する場合には増殖するが、ドキシサイクリン等が存在しない場合には増殖しない。   FIG. 8 shows a conceptual diagram of cMYC expression control and iPS-TML growth control by a tetracycline-responsive promoter. iPS-TML / M + GM constantly expresses rtTA (tetracycline reverse transcription activator) and holds the cMYC gene controlled by a tetracycline-responsive promoter. The cMYC gene is expressed only in the presence of agents that bind to rtTA and induce the activity of the TRE promoter, such as doxycycline. For this reason, iPS-TML / M + GM proliferates in the presence of doxycycline and the like, but does not proliferate in the absence of doxycycline and the like.

図９に、NOD／SCIDマウスを用いて、iPS−ML、iPS−ML／M＋GM、あるいはiPS−TML／M＋GMの造腫瘍性を検討した結果を示す。NOD／SCIDマウス（雌7〜9週令）の腹腔内に、iPS−ML、iPS−ML／M＋GM、あるいはiPS−TML／M＋GM をマウス１頭あたり3−4 x 107 個移植した。細胞移植の36−40日後に、マウスの状態を観察した。iPS−MLあるいはiPS−TML／M＋GMを移植したマウスでは、特に異常を認めなかった。iPS−ML／M＋GMを移植したマウスでは、腹部の膨大、及び、毛の逆立ちが認められた。 FIG. 9 shows the results of examining the tumorigenicity of iPS-ML, iPS-ML / M + GM, or iPS-TML / M + GM using NOD / SCID mice. 3-4 x 10 7 iPS-ML, iPS-ML / M + GM, or iPS-TML / M + GM per mouse were transplanted into the abdominal cavity of NOD / SCID mice (female 7-9 weeks old). The state of the mice was observed 36-40 days after cell transplantation. No abnormalities were observed in mice transplanted with iPS-ML or iPS-TML / M + GM. In mice transplanted with iPS-ML / M + GM, abdominal enlargement and hair handstand were observed.

実施例２：M−CSF又はGM−CSFを発現するiPS−ML細胞の造腫瘍性
実施例１と同様にして、iPS−MLを作製し、作製した細胞にM−CSFの発現ベクターを導入した（iPS−ML／M）。ベクター導入の3日後より、ヒトGM−CSFを含むα−MEM／20％FCSを用いて培養した。
実施例１と同様にして、iPS−MLを作製し、作製した細胞にGM−CSFの発現ベクターを導入した（iPS−ML／GM）。ベクター導入の3日後より、ヒトM−CSFを含むα−MEM／20％FCSを用いて培養した。
また、実施例１と同様にして、iPS−TMLを作製し、作製した細胞にM−CSF又はGM−CSFの発現ベクターを導入した（それぞれiPS−TML／M、iPS−TML／GM）。ベクター導入の三日後より、α−MEM／20％FCS／ドキシサイクリン（1,000 ng／mL）を用いて培養した。
上記のようにして得たiPS−ML／M、iPS−ML／GM、iPS−TML／M、iPS−TML／GMを用いて実施例１と同様に造腫瘍性を検討した。その結果、iPS−ML／M及びiPS−ML／GMは、いずれも造腫瘍性を示した。一方、iPS−TML／M又はiPS−TML／GMはいずれも造腫瘍性を示さなかった。
尚、iPS−ML／GMは、培養系においてはヒトM−CSFの非存在下では増殖することができないが、生体内においては腫瘍を形成することから、腫瘍形成能は、in vitroでの増殖能の有無から予測できないことが示唆された。 Example 2: Tumorigenicity of iPS-ML cells expressing M-CSF or GM-CSF In the same manner as in Example 1, iPS-ML was prepared and an M-CSF expression vector was introduced into the prepared cells. (IPS-ML / M). From 3 days after the introduction of the vector, the cells were cultured using α-MEM / 20% FCS containing human GM-CSF.
In the same manner as in Example 1, iPS-ML was prepared, and an expression vector for GM-CSF was introduced into the prepared cells (iPS-ML / GM). From 3 days after the introduction of the vector, the cells were cultured using α-MEM / 20% FCS containing human M-CSF.
Further, iPS-TML was prepared in the same manner as in Example 1, and M-CSF or GM-CSF expression vectors were introduced into the prepared cells (iPS-TML / M and iPS-TML / GM, respectively). Three days after the introduction of the vector, the cells were cultured using α-MEM / 20% FCS / doxycycline (1,000 ng / mL).
Tumorogenicity was examined in the same manner as in Example 1 using iPS-ML / M, iPS-ML / GM, iPS-TML / M, and iPS-TML / GM obtained as described above. As a result, both iPS-ML / M and iPS-ML / GM showed tumorigenicity. On the other hand, neither iPS-TML / M nor iPS-TML / GM showed tumorigenicity.
Although iPS-ML / GM cannot grow in the absence of human M-CSF in the culture system, it forms a tumor in vivo. It was suggested that it could not be predicted from the presence or absence of ability.

実施例３：iPS myc −TML／M＋GM細胞の造腫瘍性
iPS細胞の樹立時にレンチウイルスベクターを用いて恒常発現プロモーター（EF1プロモーター）に連結したc−MYCを導入して作成したiPS細胞を用いて、実施例１と同様にiPSmyc−MCを作製した。作製したiPSmyc−MCを24穴培養プレート中で培養し、そこへBMI−1、及びMDM2を発現するレンチウイルス懸濁液を同時に加えることにより、感染させ、遺伝子導入の翌日より、α−MEM／20％FCS／ヒトGM−CSF（100 ng／mL）／ヒトM−CSF（100 ng／mL）を用いて培養した。しかしながら、該細胞、増殖しなかった。従って、iPSmyc−MCが発現するc−MYCの量は、培養系においてヒトミエロイド系細胞の増殖を促進させるには不十分であることが示唆された。
次に上記と同様にして作製したiPSmyc−MC細胞に、実施例１に記載の方法に準じて、テトラサイクリン誘導プロモーターに連結したcMYCを導入し、さらに、M−CSFとGM−CSFの発現ベクターを導入してiPSmyc−TML／M＋GMを作製した。実施例１に記載の方法に準じて、iPSmyc−TML／M＋GMをNOD／SCIDマウスに移植したところ、iPSmyc−TML／M＋GMは腫瘍を形成した。
以上より、培養系においてヒトミエロイド系細胞の増殖を促進させるには不十分な量のc−MYCを発現する細胞であっても、造腫瘍性を有することが示された。従って、腫瘍形成能は、in vitroでの増殖能の有無から予測できないことが示唆された。 Example 3: Tumorigenicity of iPS myc -TML / M + GM cells
In the same manner as in Example 1, iPS myc- MC was prepared using iPS cells prepared by introducing c-MYC linked to a constitutive expression promoter (EF1 promoter) using a lentiviral vector when iPS cells were established. The prepared iPS myc- MC is cultured in a 24-well culture plate, and a lentivirus suspension expressing BMI-1 and MDM2 is simultaneously added thereto to infect it. From the day after gene introduction, α-MEM / 20% FCS / human GM-CSF (100 ng / mL) / human M-CSF (100 ng / mL). However, the cells did not proliferate. Therefore, it was suggested that the amount of c-MYC expressed by iPS myc- MC is insufficient to promote the proliferation of human myeloid cells in the culture system.
Next, cMYC linked to a tetracycline-inducible promoter was introduced into iPS myc- MC cells prepared in the same manner as described above in accordance with the method described in Example 1, and M-CSF and GM-CSF expression vectors were further introduced. IPS myc -TML / M + GM was prepared. According to the method described in Example 1, iPS myc- TML / M + GM was transplanted into NOD / SCID mice, and iPS myc- TML / M + GM formed a tumor.
From the above, it was shown that even cells expressing an insufficient amount of c-MYC to promote the growth of human myeloid cells in the culture system have tumorigenicity. Therefore, it was suggested that tumorigenicity cannot be predicted from the presence or absence of proliferation ability in vitro.

本発明によれば、造腫瘍性が抑制されたヒトミエロイド系血液細胞を作製することが可能となり得る。本発明により提供されるヒトミエロイド系血液細胞を、腫瘍を有する哺乳動物に投与すると、ヒトM−CSF又はヒトGM−CSFの存在下においてもヒトミエロイド系血液細胞自身は造腫瘍性を示さずに、哺乳動物内の腫瘍の増殖を阻害し、縮小化を行い、若しくは転移を抑制するなどの優れた癌（悪性腫瘍）の予防又は治療効果をもたらし得る。すなわち、本発明によれば、ヒトM−CSF又はヒトGM−CSFが通常存在するヒト体内においても、ヒトミエロイド系血液細胞自身が腫瘍を形成せずに、ヒト体内の腫瘍形成を抑制し得るなどの効果を発揮し得る。従って、本発明により、癌（悪性腫瘍）に対する優れた免疫細胞治療医薬品を提供することが可能となり得、さらに、癌（悪性腫瘍）に対する予防又は治療方法を提供することが可能となり得る。   According to the present invention, it may be possible to produce human myeloid blood cells with suppressed tumorigenicity. When the human myeloid blood cells provided by the present invention are administered to a mammal having a tumor, the human myeloid blood cells themselves do not exhibit tumorigenicity even in the presence of human M-CSF or human GM-CSF. It can bring about an excellent preventive or therapeutic effect on cancer (malignant tumor) such as inhibiting the growth of a tumor in a mammal, reducing the size, or suppressing metastasis. That is, according to the present invention, even in the human body where human M-CSF or human GM-CSF normally exists, human myeloid blood cells themselves can suppress tumor formation in the human body without forming a tumor, etc. The effect of can be demonstrated. Therefore, according to the present invention, it is possible to provide an excellent immune cell therapeutic drug for cancer (malignant tumor), and further, it may be possible to provide a preventive or therapeutic method for cancer (malignant tumor).

Claims (22)

造腫瘍性が抑制されたヒトミエロイド系血液細胞を作製する方法であって、下記の工程（C）を含む方法：
（C）c−MYC遺伝子を発現するヒトミエロイド系血液細胞において、該c−MYC遺伝子の発現を抑制し、それによりc−MYC遺伝子の発現が抑制されたヒトミエロイド系血液細胞を得る工程。 A method for producing human myeloid blood cells with suppressed tumorigenicity, comprising the following step (C):
(C) A step of obtaining human myeloid blood cells in which expression of the c-MYC gene is suppressed by suppressing expression of the c-MYC gene in human myeloid blood cells expressing the c-MYC gene. ヒトミエロイド系血液細胞が、ヒト多能性幹細胞に由来するヒトミエロイド系血液細胞である、請求項１に記載の方法。   The method according to claim 1, wherein the human myeloid blood cells are human myeloid blood cells derived from human pluripotent stem cells. ヒト多能性幹細胞から造腫瘍性が抑制されたヒトミエロイド系血液細胞を作製する方法であって、下記の工程（A）及び（C）を含む方法：
（A）ヒト多能性幹細胞から、c−MYC遺伝子を発現するヒトミエロイド系血液細胞を得る工程、
（C）工程（A）により得たヒトミエロイド系血液細胞において、該c−MYC遺伝子の発現を抑制し、それによりc−MYC遺伝子の発現が抑制されたヒトミエロイド系血液細胞を得る工程。 A method for producing human myeloid blood cells with suppressed tumorigenicity from human pluripotent stem cells, comprising the following steps (A) and (C):
(A) A step of obtaining human myeloid blood cells expressing c-MYC gene from human pluripotent stem cells,
(C) A step of obtaining human myeloid blood cells in which the expression of the c-MYC gene is suppressed in the human myeloid blood cells obtained in step (A), thereby suppressing the expression of the c-MYC gene. c−MYC遺伝子を発現するヒトミエロイド系血液細胞が、調節性プロモーターと機能的に連結されたc−MYC遺伝子を有するヒトミエロイド系血液細胞である、請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載の方法。   4. The human myeloid blood cell expressing a c-MYC gene is a human myeloid blood cell having a c-MYC gene operably linked to a regulatable promoter. The method described in 1. in vitroにおいて増殖させることが可能であり、かつ造腫瘍性が抑制されたヒトミエロイド系血液細胞を作製する方法である、請求項４に記載の方法。   The method according to claim 4, which is a method for producing human myeloid blood cells that can be proliferated in vitro and have suppressed tumorigenicity. ヒトミエロイド系血液細胞が、B cell−specific Moloney murine leukemia virus integration site 1（BMI1）遺伝子、Enhancer of zeste homolog 2 （EZH2）遺伝子、MDM2遺伝子、MDM4遺伝子及びHypoxia Inducible Factor 1 Alpha Subunit（HIF1A）遺伝子からなる群から選択される少なくとも一つの外来性遺伝子を発現する、請求項１〜請求項５のいずれか一項に記載の方法。   Human myeloid blood cells are derived from B cell-specific Moloney murine leukemia virus integration site 1 (BMI1) gene, Enhancer of zeste homolog 2 (EZH2) gene, MDM2 gene, MDM4 gene and Hypoxia Inducible Factor 1 Alpha Subunit (HIF1A) gene The method according to any one of claims 1 to 5, wherein at least one exogenous gene selected from the group consisting of is expressed. ヒトミエロイド系血液細胞が、外来性ヒトM−CSFを発現する、請求項１〜請求項６のいずれか一項に記載の方法。   The method according to any one of claims 1 to 6, wherein the human myeloid blood cell expresses exogenous human M-CSF. ヒトミエロイド系血液細胞が、インターフェロンβ（IFNβ）遺伝子を発現する、請求項１〜請求項７のいずれか一項に記載の方法。   The method according to any one of claims 1 to 7, wherein the human myeloid blood cell expresses an interferon β (IFNβ) gene. ヒトミエロイド系血液細胞の、内在性のIFNAR遺伝子の発現が抑制されている、請求項８に記載の方法。   The method according to claim 8, wherein the expression of endogenous IFNAR gene in human myeloid blood cells is suppressed. c−MYC遺伝子が外来性c−MYC遺伝子である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。   The method according to any one of claims 1 to 9, wherein the c-MYC gene is an exogenous c-MYC gene. 調節性プロモーターと機能的に連結されたc−MYC遺伝子を有する、ヒトミエロイド系血液細胞。   A human myeloid blood cell having a c-MYC gene operably linked to a regulatable promoter. 調節性プロモーターがテトラサイクリン反応性プロモーターである、請求項１１に記載の細胞。   The cell according to claim 11, wherein the regulatable promoter is a tetracycline responsive promoter. 部位特異的組換え配列又はトランスポゾン配列に挟まれた、外来性プロモーターと機能的に連結されたc−MYC遺伝子を有する、ヒトミエロイド系血液細胞。   A human myeloid blood cell having a c-MYC gene operably linked to an exogenous promoter sandwiched between site-specific recombination sequences or transposon sequences. BMI1遺伝子、EZH2遺伝子、MDM2遺伝子、MDM4遺伝子及びHIF1A遺伝子からなる群から選択される少なくとも一つの外来性遺伝子を発現する、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の細胞。   The cell according to any one of claims 11 to 13, which expresses at least one foreign gene selected from the group consisting of BMI1 gene, EZH2 gene, MDM2 gene, MDM4 gene and HIF1A gene. 外来性ヒトM−CSF遺伝子を発現する、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の細胞。   The cell according to any one of claims 11 to 14, which expresses an exogenous human M-CSF gene. インターフェロンβ（IFNβ）遺伝子を発現する、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の細胞。   The cell according to any one of claims 11 to 15, which expresses an interferon β (IFNβ) gene. 内在性のIFNAR遺伝子の発現が抑制されている、請求項１６に記載の細胞。   The cell according to claim 16, wherein the expression of an endogenous IFNAR gene is suppressed. CD11b陽性かつCD45陽性である、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の細胞。   The cell according to any one of claims 11 to 17, which is CD11b positive and CD45 positive. in vitroにおいて増殖させることが可能であり、かつ造腫瘍性が抑制されたヒトミエロイド系血液細胞である、請求項１１〜１８のいずれか一項に記載の細胞。   The cell according to any one of claims 11 to 18, which is a human myeloid blood cell that can be proliferated in vitro and has suppressed tumorigenicity. c−MYC遺伝子が外来性c−MYC遺伝子である、請求項１１〜１９のいずれか一項に記載の細胞。   The cell according to any one of claims 11 to 19, wherein the c-MYC gene is an exogenous c-MYC gene. 予防又は治療上有効量の請求項１１〜２０のいずれか一項に記載の細胞又は請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法を用いて作製された細胞を含む、がんの予防又は治療剤。   Prevention of cancer comprising a prophylactically or therapeutically effective amount of cells according to any one of claims 11 to 20 or cells produced using the method according to any one of claims 1 to 10. Or a therapeutic agent. 予防又は治療上有効量の請求項１１〜２０のいずれか一項に記載の細胞又は請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法を用いて作製された細胞を投与することを含む、がんの予防又は治療方法。   Administering a prophylactically or therapeutically effective amount of a cell according to any one of claims 11 to 20 or a cell produced using the method according to any one of claims 1 to 10, Cancer prevention or treatment method.
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