JP2018166516A - 抗angptl3抗体及びその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
に関与する4つの保存システイン残基を含有する;しかしながら、ANGPTL3は、血管新生を促進するタンパク質成長因子である、アンギオポエチンのFD(ANG;即ち、ANG1、ANG2及びANG4)中に見出される、2つの更なるシステインも特徴的なカルシウム結合モチーフも含有しない(非特許文献1)。加えて、ANGと異なり、ANGPTL3はTie2に結合しない;しかしながら、それはまたそのC末端FDを介してインテグリンαvβ3に結合することにより血管新生を誘導し得る(非特許文献2)。
、そして機能性に影響を与えるように、例えば残存エフェクタ機能を除去するように修飾され得る(Reddy et al., 2000, J. Immunol. 164:1925-1933)。
90%、少なくとも95%、少なくとも98%又は少なくとも99%配列同一性を有する実質的にその類似配列から成る群から選択される軽鎖可変領域(LCVR)を含む。別の実施態様では、抗体又は抗体の抗原結合部分は、配列番号10、26、42、74、90、122及び188から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するLCVRを含む。尚別の実施態様では、抗体又は抗体の抗原結合部分は、配列番号74のアミノ酸配列を有するLCVRを含む。
2/54/56、68/70/72、84/86/88、100/102/104、116/118/120、132/134/136、148/150/152及び182/184/186から成る群から選択されるHCDR1/HCDR2/HCDR3組み合わせ;及び/又は配列番号12/14/16、28/30/32、44/46/48、60/
62/64、76/78/80、92/94/96、108/110/112、124/126/128、140/142/144、156/158/160及び190/192/194から成る群から選択されるLCDR1/LCDR2/LCDR3組み合わせを含んでなる、抗体又は抗体の抗原結合フラグメントを特徴とする。1つの実施態様では、重鎖及び軽鎖CDRアミノ酸配列は、配列番号4/6/8/12/14/16、20/22/24/28/30/32、36/38/40/44/46/48、52/54/56/60/62/64、68/70/72/76/78/80、84/86/88/92/94/96、100/102/104/108/110/112、116/118/120/124/126/128、132/134/136/140/142/144、148/150/152/156/158/160及び182/184/186/190/192/194から成る群から選択されるCDR組み合わせを含む。1つの実施態様では、重鎖及び軽鎖CDRアミノ酸配列は、配列番号4/6/8/12/14/16、20/22/24/28/30/32、36/38/40/44/46/48、68/70/72/76/78/80、84/86/88/92/94/96、116/118/120/124/126/128又は182/184/186/190/192/194のCDR組み合わせを含む。別の実施態様では、重鎖及び軽鎖CDRアミノ酸配列は、配列番号68/70/72/76/78/80のCDR配列組み合わせを含む。
り、そしてAbM定義はKabatとChothiaアプローチ間の折衷案である。例えば、Kabat、「免疫学的に重要なタンパク質の配列」、National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997);及びMartin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9268-9272 (1989)を参照されたい。公開データベースは
また抗体内のCDR配列を同定するのに入手可能である。1つの実施態様では、抗体又はそのフラグメントは、配列番号2/10、18/26、34/42、66/74、82/90、114/122又は180/188のHCVR及びLCVRペア内に含有されるCDR配列を含む。別の実施態様では、抗体又はそのフラグメントは、配列番号66/74のHCVR及びLCVRペア内に含有されるCDR配列を含む。
/16、20/22/24/28/30/32、36/38/40/44/46/48、52/54/56/60/62/64、68/70/72/76/78/80、84/86/88/92/94/96、100/102/104/108/110/112、116/118/120/124/126/128、132/134/136/140/142/144、148/150/152/156/158/160及び182/184/186/190/192/194から成る群から選択される重鎖及び軽鎖CDR配列組み合わせを含んでなる、抗体又はそのフラグメントとhANGPTL3への特異的結合を競合する。1つの実施態様では、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号68/70/72/76/78/80の重鎖及び軽鎖CDR配列組み合わせを含んでなる、抗体又はそのフラグメントとhANGPTL3への特異的結合を競合する。
かかわり得るエピトープを結合し、但し選択的に抗体又はそのフラグメントは配列番号170のANGPTL3ペプチドに結合しない。
。別の実施態様では、抗体又はそのフラグメントは、配列番号7/15、23/31、39/47、71/79、87/95、119/127又は185/193の核酸配列ペアによってコード化されるHCDR3及びLCDR3配列ペアを含む。尚別の実施態様では、抗体又はそのフラグメントは、配列番号71/79核酸配列ペアによってコード化されるHCDR3及びLCDR3配列ペアを含む。
15、27/29/31、43/45/47、59/61/63、75/77/79、91/93/95、107/109/111、123/125/127、139/141/143、155/157/159及び189/191/193から成る群から選択されるヌクレオチド配列組み合わせによってコード化される、LCDR1/LCDR2/LCDR3組み合わせを含んでなる、抗体又は抗体の抗原結合フラグメントを特徴とする。1つの実施態様では、抗体又はそのフラグメントは、配列番号67/69/71/75/77/79ヌクレオチド配列組み合わせによってコード化される重鎖及び軽鎖CDR配列を含む。
ド配列セグメントによってコード化される重鎖可変領域(HCVR)、及びVK及びJK生殖細胞系配列から由来するヌクレオチド配列セグメントによってコード化される軽鎖可変領域(LCVR)を含んでなる、ヒト抗ANGPTL3抗体又はその抗原結合フラグメントを特徴とし、ここでHCVR及びLCVRは:(i) VH3−43、DH3−3、JH
3、VK1−5及びJK2;(ii)VH3−11、DH1−1、JH4、VK1−39及びJK4;(iii)VH3−30、DH1−7、JH6、VK1−5及びJK1;(iv)VH3
−30、DH1−26、JH6、VK1−12及びJK3;(v)VH3−30、DH3−10、JH6、VK1−12及びJK3;及び(vi)VH3−23、DH3−10、JH4、VK
1−5及びJK1から成る群から選択される生殖細胞系遺伝子組み合わせから由来するヌ
クレオチド配列セグメントによってコード化される。
で測定された通り、約7nM以下、約6nM以下、約5nM以下、約4nM以下、約3nM以下、2nM以下、又は約1nM以下の平行解離定数(KD)でhANGPTL3に特
異的に結合する、抗体又はその抗原結合フラグメントを特徴とする。ある実施態様では、本発明の抗体は、約800pM以下、約700pM以下;約600pM以下、約500pM以下;約400pM以下;約300pM以下;約200pM以下;約100pM以下;又は約50pM以下のKDを示す。
録商標)XMAP(登録商標)技術によって決定されるように、ヒトアンギオポエチン様タンパク質4(hANGPTL4;配列番号164)のような、関連タンパク質と交差反応しない。ANGPTL4は、LPL活性を低下させることが知られている別の分泌タンパク質であり、そしてN末端コイルドコイル領域及びC末端フィブリノーゲン様ドメインを有する (Ge et al., 2004, J Biol Chem 279:2038-2045; Yau et al., 2009, J Biol Chem 284:11942-11952)。関連実施態様では、本発明は、hANGPTL3タンパク質を結合し、そしてhANGPTL4タンパク質と交差反応する抗hANGPTL3抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。ある実施態様では、hANGPTL4タンパク質に対するhANGPTL3抗体又はそのフラグメントの結合親和性は、hANGPTL3タンパク質に対する抗体又はフラグメントの結合親和性の、約75%以下、又は約50%以下である。
al. (2002) JBC 277:26733参照)は有用であり得る。他の応用では、Nグリコシル化部位の除去は、治療抗体に対する望ましくない免疫反応を減少させ得るか、又は抗体の親和性を増加させ得る。尚他の応用では、ガラクトシル化修飾が、補体依存性細胞傷害(CDC)を修飾するために行われることができる。
R/LCVR)を含んでなる抗体の組み合わせを含む。
TL3抗体又はその抗原結合フラグメント、及び選択的に上記の1つ又はそれ以上の更なる治療剤を含んでなる、医薬組成物の医療的有効量を投与することを含んでなる、上記方法を提供する。本発明の抗ANGPTL3抗体又はそのフラグメントは、ANGPTL3に対する中和抗体若しくは非ブロッキング抗体、又はその組み合わせであってよい。
み合わせは:(i)それぞれ、配列番号82/90及び180/188;(ii)それぞれ、配列番号114/122及び180/188;(iii)それぞれ、配列番号82/90及び18/26;又は(iv)それぞれ、配列番号114/122及び18/26の、HCVR及びLCVR配列ペア(HCVR/LCVR)を含む。
poC2変質、ApoE欠乏、ApoB増加、超低密度リポタンパク質(VLDL)の産生増加及び/又は除去減少、ある薬物処置(例えば、グルココルチコイド処置誘発脂質異常症、いずれかの遺伝性素因、食事、ライフスタイルなどに起因する、アテローム性脂質異常症、糖尿病性アテローム性脂質異常症、TG>1000 mg/dLの重度高トリグリセリド血症を含む高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、カイロミクロン血症、混合脂質異常症(肥満、メタボリックシンドローム、糖尿病など)、リポジストロフィー、脂肪萎縮症を含む、高脂血症、高リポ蛋白質血症及び脂質異常症などの脂質代謝にかかわる疾患を含む。本発明の方法はまた、限定されるものではないが、アテローム性動脈硬化症、動脈瘤、高血圧症、狭心症、卒中、脳血管疾患、欝血性心不全、冠状動脈疾患、心筋梗塞、末梢血管疾患などの心血管疾患及び障害;急性膵炎;非アルコール性脂肪性肝炎(NASH);糖尿病のような血糖障害;肥満などを含み、高脂血症、高リポ蛋白質血症、及び/又は脂質異常症を伴う又はそれから生じる疾患又は障害を阻止又は処置することができる。
ることを目的とするものではない。
本明細書に使用される用語「ヒトアンギオポエチン様蛋白質3」又は「hANGPTL3」は、配列番号162に示される核酸配列及び配列番号161のアミノ酸配列、又は生物学的に活性なそのフラグメントを有するANGPTL3をいう。
ばれるより保存されている領域が組み入れられている、重鎖相補性決定領域(CDR)と呼ばれる超可変領域に細分されることができる。各HCVR及びLCVRは、下記の順序:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4でアミノ末端からカルボキシ末端まで配列された3つのCDR及び4つのFRから成る。
抗体とそれらの抗原間の接触領域を解析し、そしてCDR残基の約1/5〜1/3だけが実際に抗原と接触すると結論した。Padlanはまた、1つ又は2つのCDRが抗原と接触したアミノ酸を有さない多くの抗体を見出した (Vajdos et al. 2002 J Mol Biol 320:415-428をも参照されたい)。
DRの外側にあるKabatCDRの領域から、既研究(例えば、CDRH2中のH60−H
65はしばしば必要とされない)に基づいて同定されることができる。CDR又はその1つ又は複数の残基が欠落している場合、それは通常別のヒト抗体配列又はそのような配列のコンセンサス中に対応する位置を占めるアミノ酸と置換される。置換しようとするCDR及びアミノ酸内に置換する位置はまた、経験的に選択されることができる。経験的置換は保存的又は非保存的置換であり得る。
以上のアミノ酸の置換、挿入及び/又は欠失を含んでよい。そのような突然変異は、本明細書に開示されるアミノ酸配列を、例えば公開抗体配列データベースから得られる生殖細胞系配列と比較することによって容易に確認されることができる。本発明は、本明細書に開示のいずれかのアミノ酸配列から由来する抗体、及びその抗原結合フラグメントを含み、ここで1つ又はそれ以上のフレームワーク及び/又はCDR領域内の1つ又はそれ以上のアミノ酸は、抗体が由来する生殖細胞系配列の対応する1つ又は複数の残基に、又は別のヒト生殖細胞系配列の対応する1つ又は複数の残基に、又は対応する1つ又は複数の生殖細胞系列残基の保存的アミノ酸置換に突然変異される(そのような配列変化は本明細書において総称して「生殖細胞系突然変異」といわれる)。本明細書に開示の配列重鎖及び軽鎖可変領域配列を始めとして、当業者は、1つ又はそれ以上の個々の生殖細胞系復帰突然変異又はその組み合わせを含む、多数の抗体及びその抗原結合フラグメントを容易に産生することができる。ある実施態様では、VH及び/又はVLドメイン内のフレームワーク及び/又はCDR残基のすべては、抗体が由来する元の生殖細胞系配列に見出される残基に復帰突然変異される。他の実施態様では、ある残基だけ、例えば、FR1の最初の8アミノ酸内又はFR4の最後の8アミノ酸内に見出される変異残基だけ、又はCDR1、CDR2又はCDR3内に見出される変異残基だけが元の生殖細胞系配列に復帰突然変異される。他の実施態様では、1つ又はそれ以上のフレームワーク及び/又は1つ又は複数のCDR残基は、異なる生殖細胞系配列(即ち、抗体が元々由来する生殖細胞系配列と異な
る生殖細胞系配列)の対応する1つ又は複数の残基に突然変異される。更に、本発明の抗
体は、フレームワーク及び/又はCDR領域内の2つ又はそれ以上の生殖細胞系突然変異のいずれの組み合わせを含んでもよく、例えば、ここである個々の残基は、特定の生殖細胞系配列の対応する残基に突然変異され、一方で元の生殖細胞系配列と異なるある他の残基は維持され、又は異なる生殖細胞系配列の対応する残基に突然変異される。一度得られると、1つ又はそれ以上の生殖細胞系突然変異を含有する抗体及びその抗原結合フラグメントは、結合特異性改善、結合親和性増加、アンタゴニスト又はアゴニスト生物学的特性の改善又は強化(場合うによっては)、免疫原性低減などのような1つ又はそれ以上の望ましい性質を容易に検査されることができる。一般的このようにして得られる抗体及びその抗原結合フラグメント本発明の範囲に包含される。
ら、2つの免疫グロブリン重鎖及び2つの免疫グロブリン軽鎖(即ち、「完全抗体分子」)、並びにその抗原結合フラグメントを含んでなる抗体分子を包含する。本明細書に使用される用語、抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合フラグメント」などは、複合体を形成するために抗原を特異的に結合する、いずれの自然発生、酵素的に得られる、合成、又は遺伝子工学によるポリペプチド又は糖タンパク質を含む。抗体の抗原結合フラグメントは、例えば、タンパク質分解のようないずれの好適な標準的技術、又は抗体の可変及び(選択的に)定常ドメインをコードするDNAの操作及び発現にかかわる組換遺伝子工学技術を用いて、例えば、完全抗体分子から導かれ得る。そのようなDNAは公知であり、及び/又は例えば、商業ソース、DNAライブラリー(例えば、ファージディスプレイ抗体ライブラリーを含む)から容易に得られ、又は合成されることができる。DNAは、例えば、1つ又はそれ以上の可変及び/又は定常ドメインを好適な立体配置に配列するために、又はコドンを導入し、システイン残基を創出し、アミノ酸を修飾し、付加し又は欠失させるなどのために、化学的に及び分子生物学的技術を用いることによって配列決定されそして操作され得る。
単鎖Fv(scFv)分子;(vi)dAbフラグメント;及び(vii)抗体の超可変領域(例えば、CDR3ペプチドのような単離された相補性決定領域(CDR))、又は束縛FR3−CDR3−FR4ペプチドを倣するアミノ酸残基から成る最小認識単位を含む。ドメイン特異抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、CDRグラフト抗体、二量体、三量体、四量体、ミニ体、ナノ体(例えば一価ナノ体、二価ナノ体など)、小分子免疫医薬(SMIP)、及びサメ可変IgNARドメインなどの他の改変分子もまた、本明細書に使用される表現「抗原結合フラグメント」内に包含される。
CH1−CH2;(v)VH−CH1−CH2−CH3;(vi)VH−CH2−CH3;(vi
i)VH−CL;(viii)VL−CH1;(ix)VL−CH2;(x)VL−CH3;(xi)VL−CH1−CH2;(xii)VL−CH1−CH2−CH3;(xiii)VL−CH
2−CH3;及び(xiv)VL−CLを含む。上記に掲載されたいずれもの例示的立体配
置を含む、可変及び定常ドメインのいずれもの立体配置では、可変及び定常ドメインは、互いに直接結合され得るか又は完全若しくは部分ヒンジ又はリンカー領域によって結合され得る。ヒンジ領域は、単一ポリペプチド分子中で隣接した可変及び/又は定常ドメイン間のフレキシブル又はセミフレキシブル結合をもたらす、少なくとも2つ(例えば、5、10、15、20、40、60又はそれ以上)のアミノ酸から成り得る。その上、本発明の抗体の抗原結合フラグメントは、互いと及び/又は1つ又はそれ以上の単量体VH又は
VLドメインとの非共有結合(例えば、1つ又は複数のジスルフィド結合による)におい
て、上記に掲載されたいずれもの可変及び定常ドメイン立体配置のホモ二量体又はヘテロ二量体(又は他の多量体)を含んでよい。
性ELISAによって測定された、約2x10-9M以下、約1.5x10-9M以下、約1x10-9M以下、約0.5x10-9M以下、約0.25x10-9M以下、約1x10-10
M以下、又は約0.5x10-10M以下のKDで表されるhANGPTL3への結合親和性を有するそれらの抗体をいう。
うことが目的とされる。
えば、BIACORE(商標)によって測定された、4x10-3s-1以下、3x10-3s-1以下、
2x10-3s-1以下、1x10-3s-1以下、1x10-4s-1以下の速度定数でhANGPTL3から解離する抗体を意味する。
PTL3活性を「中和し」、「ブロックし」又は「停止する」抗体)は、ANGPTL3へのその結合が当技術分野で公知の標準インビトロアッセイによって評価されるように、ANGPTL3の少なくとも1つの生物活性の直接阻害をもたらす、抗体をいうことが目的とされる(例えば、下記の実施例を参照されたい)。用語「中和する」、「阻害する」、「ブロックする」及び「停止する」は本明細書において同義的に使用され得る。「非ブロッキング」抗体は、ANGPTL3へのその結合が標準インビトロアッセイによって評価されるように、ANGPTL3の標的活性を直接ブロックしない抗体をいうが、しかし尚、ANGPTL3へのその結合が、例えば、循環からのANGPTL3のクリアランスを強化することにより、インビボでANGPTL3の少なくとも1つの生物活性の間接阻害、減少、減弱、又は他の干渉をもたらす「干渉」抗体であってよい。循環からのANGPTL3のクリアランスは、少なくとも2つの非ブロッキング抗体の組み合わせによって特に増強されることができる。ANGPTL3の生物活性の、中和、阻害、停止、減少、減弱又は干渉は、当技術分野で公知の1つ又はそれ以上の幾つかの標準インビトロ又はインビボアッセイにより、ANGPTL3の生物活性の1つ又はそれ以上のインジケータを測定することによって評価されることができる(例えば、下記の実施例を参照されたい)。
ンサマトリックス内のタンパク質濃度変化の検出により、リアルタイム生物特異的相互作用の解析を可能にする光学的現象をいう。
しくは少なくとも95%、98%又は99%配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換だけ異なる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の化学的性質(例えば、電荷又は疎水性)の側鎖(R基)を有する別のアミノ酸残基によって置換されるものである。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的性質を実質的に変化し得ない。2つ又はそれ以上のアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なるという場合には、類似性の百分率又は程度は置換の保存的性質を是正するように上方に調整され得る。この調整をする手段は当業者に周知されている。例えば、Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331を参照されたい。類似
の化学的性質の側鎖を有するアミノ酸グループの例は、1)脂肪族側鎖:グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン;2)脂肪族ヒドロキシル側鎖:セリン及びト
レオニン;3)アミド含有側鎖:アスパラギン及びグルタミン;4)芳香族側鎖:フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン;5)塩基性側鎖:リジン、アルギニン、及びヒスチジン;6)酸性側鎖:アスパラギン酸及びグルタミン酸;及び7)含硫側鎖:システイン及びメチオニンを含む。好ましい保存的アミノ酸置換基は:バリン−ロイシン−イソロイソン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、及びグルタミン酸−アスパラギン酸、及びアスパラギン−グルタミンである。あるいは、保存的置換は、Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443 45に開示のPAM250対数
尤度マトリックスにおいて正値を有するいずれもの変化である。「中程度に保存的」置換はPAM250対数尤度マトリックスにおいて非負値を有するいずれもの変化である。
らの多数の配列を含有するデータベースと比較するとき、別の好ましいアルゴリズムは、デフォルトパラメータを使用した計算機プログラムのBLAST、特にBLASTP又はTBLASTNである。例えば、 Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 410
and (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389 402を参照されたい。
トランスジェニックマウスにおいてヒト抗体を生成する方法は当技術分野で公知である。いずれのそのような公知方法は、ANGPTL3に特異的に結合するヒト抗体を作るために本発明の関連で使用されることができる。
て、ヒト可変領域及びマウス定常領域を有するANGPTL3に対する高親和性キメラ抗体が最初に分離される。下記の実験の項におけるように、抗体は特徴付けられ、そして親和性、選択性、エピトープなどを含む望ましい特性で選択される。
特定のエピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、Antibodies, Harlow a
nd Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY)に記載のように、ルーチ
ン交差ブロッキングアッセイは行われることができる。他の方法は、アラニン走査突然変異体、ペプチドブロット(Reineke (2004) Methods Mol Biol 248:443-63)、又はペプチド切断解析を含む。加えて、抗原のエピトープ切除、エピトープ抽出及び化学修飾などの方法が用いられ得る(Tomer (2000) Protein Science 9: 487-496)。
161)のN末端コイルドコイルドメイン(残基17〜209)内でエピトープを結合し、
そしてhANGPTL3の少なくとも1つの活性を中和する(例えば、LPL活性の阻害)。別の実施態様では、抗hANGPTL3抗体又はその抗原結合フラグメントは、hANGPTL3のN末端コイルドコイルドメイン内でエピトープを結合し、そしてhANGPTL3の少なくとも1つの活性を中和し、但し、抗体又はそのフラグメントは配列番号170のANGPTL3ペプチドに結合しない。1つの実施態様では、抗体又はそのフラグメントは、hANGPTL3(配列番号161)の残基17〜200、17〜100、17〜70、17〜65、17〜60、17〜57、17〜55、17〜50、17〜45、17〜40、又は17〜35内でエピトープに結合し、但し、選択的にその抗体又はそのフラグメントは配列番号170のANGPTL3ペプチドに結合しない。別の実施態様では、抗体又はそのフラグメントは、hANGPTL3(配列番号161)の残基40〜200、40〜100、40〜70、50〜200、50〜100、50〜70、58〜200、58〜100、58〜70、58〜68、又は61〜66(「ヘパリン結合モチーフ」として公知)内でエピトープを特異的に結合し、但し、選択的に抗体又はそのフラグメントは配列番号170のANGPTL3ペプチドに結合しない。幾つかの実施態様では、抗体又は抗体フラグメントは、hANGPTL3のN末端コイルドコイルドメイン内で列挙エピトープ又は残基の1つより多くを含み得るエピトープを結合し、但し、選択的に抗体又はそのフラグメントは配列番号170のANGPTL3ペプチドに結合しない。
の1つ又はそれ以上のフラグメント、例えば、hANGPTL3(配列番号161)の少なくとも5残基、少なくとも7残基、少なくとも10残基、少なくとも20残基、少なくとも30残基、少なくとも50残基、少なくとも70残基、少なくとも100残基、少なくとも150残基、又は少なくとも200残基のフラグメントを結合し、但し、選択的に抗体又はそのフラグメントは配列番号170のANGPTL3ペプチドに結合しない。
本発明は、細胞毒、化学療法薬、免疫抑制薬又は放射性同位体など、治療部分(「免疫複合体」)に結合されるヒト抗hANGPTL3モノクローナル抗体を包含する。細胞毒
剤は細胞に有害ないずれの薬剤をも含む。免疫複合体を形成するための好適な細胞毒剤及び化学療法薬の例は当技術分野で公知であり、例えばWO05/103081を参照されたい。
本発明の抗体は、単一特異性、二重特異性、又は多重特異性であってよい。多重特異性mAbは1つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに特異的であり得て、又は1つの標的ポリペプチドより多くに対して特異的な抗原結合ドメインを含有し得る。例えば、Tutt
et al. (1991) J. Immunol. 147:60-69を参照されたい。ヒト抗hANGPTL3mAbは別の機能性分子、例えは、別のペプチド又はタンパク質に結合され又はそれと共発現されることができる。例えば、抗体又はそのフラグメントは、第2の結合特異性をもつ二重特異性又は多重特異性抗体を生産するために、別の抗体又は抗体フラグメントのような1つ又はそれ以上の他の分子実体に、機能的に結合されることができる(例えば、化学的カップリング、遺伝的融合、非共有結合などにより)。
して少なくとも1つのアミノ酸差は、アミノ酸差を欠いている二重特異性抗体と比べてプロテインAへの二重特異性抗体の結合を減少させる。1つの実施態様では、第1のIgCH3ドメインはプロテインAを結合し、そして第2のIgCH3ドメインはH95R修飾(IMGTエキソン付番による;EU付番によるH435R)のようなプロテインA結合を減少させ又は停止する突然変異を含有する。第2のCH3は更に、Y96F修飾(IMG
Tによる;EUによるY436F)を含んでよい。第2のCH3内に見出され得る更なる
修飾は:IgG1抗体の場合にD16E、L18M、N44S、K52N、V57M、及びV82I(IMGTによる;EUによるD356E、L358M、N384S、K392N、V397M、及びV422I);IgG2抗体の場合にN44S、K52N、及びV82I(IMGT;EUによるN384S、K392N、及びV422I);及びIgG4抗体の場合にQ15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q、及びV82I(IMGTによる;EUによるQ355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q、及びV422I)を含む。上記の二重特異性抗体フォーマットでの変動は本発明の範囲内とみなされる。
本発明の抗hANGPTL3抗体及び抗体フラグメントは、記載のmAbのものと異なり、しかしヒトANGPTL3を結合する能力を保持するアミノ酸配列を有するタンパク質を包含する。そのような変異mAb及び抗体フラグメントは、元の配列と比べるとき、1つ又はそれ以上のアミノ酸の付加、欠失、又は置換を含み、しかし本質的に記載mAbと同等の生物活性を示す。同様に、本発明の抗hANGPTL3抗体コード化DNA配列は、開示配列と比べるとき1つ又はそれ以上のヌクレオチドの付加、欠失、又は置換を含み、しかし本発明の抗hANGPTL3抗体又は抗体フラグメントに本質的に生物学的に同等である抗hANGPTL3抗体又は抗体フラグメントをコードする、配列を包含する。そのような変異アミノ酸及びDNA配列が上記で検討される。
の試験医薬品にとって医学的に重要ではないことから、生物学的同等性であると考えられ得る。1つの実施態様では、2つの抗原結合タンパク質は、それらの安全性、純度、及び有効性において臨床的に有意味な差がない場合、生物学的同等性である。
間の関数として測定される、ヒト又は他の哺乳動物でのインビボテスト; (b)ヒトインビボバイオアベイラビリティデータと相関されそして合理的に予測されるインビトロテスト;(c)抗体の適切な急性薬理効果(又はその標的)が時間の関数として測定される、ヒト又は他の哺乳動物でのインビボテスト; 及び(d)抗体の安全性、有効性、又はバイオアベイラビリティ若しくは生物学的同等性を確立する十分管理された臨床試験を含む。
本発明は、本発明の抗hANGPTL3抗体又はその抗原結合フラグメントを含んでなる治療的組成物、及びそれを用いる治療的方法を提供する。本発明に基づく治療的組成物の投与は、移動、送達、耐容性の改善などをもたらすために、製剤へ組み込まれる好適な担体、賦形剤、及び他の薬剤と併せて投与され得る。多数の適切な製剤は、すべての薬学化学者に公知の処方集に見出されることができる:Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA。これらの製剤は、例えば、散剤、ペースト剤、軟膏剤、ジェリー剤、ワックス、オイル、脂質類、ベシクル(LIPOFECTIN(商標)など)を含有する脂質(陽イオン性又は陰イオン性)、DNA複合体、無水吸収ペースト剤、水中油及び油中水乳剤、乳剤カルボワックス(種々の分子量のポリエチレングリコール)、半固形ゲル、及びカルボワックスを含有する半固形混合物を含む。また Powell et al. 「
非経口製剤用の賦形剤の概論」 PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311を参照されたい。
〜約200mg、約100mg、又は50mgまでの初回用量として投与されることができる。ある実施態様では、初回用量は、初回用量とほぼ同じか又はそれより少なくてよい量で、抗体又はその抗原結合フラグメントの第2の又は複数の以後の用量投与が続けられ得て、ここでその後の用量は、少なくとも1日〜3日; 少なくとも1週、少なくとも2週;少なくとも3週;少なくとも4週;少なくとも5週;少なくとも6週;少なくとも7週;少なくとも8週;少なくとも9週;少なくとも10週;少なくとも12週;又は少なくとも14週で分けられる。
はないが、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、及び経口経路を含む。組成物はいずれかの従来の経路により、例えば、点滴及びボーラス注射により、上皮又は粘膜皮膚ライニング(例えば、口腔粘膜、直腸及び腸粘膜など)を介した吸収により投与され得て、そして他の生理活性物質と併せて投与され得る。投与は全身的又は局所的であり得る。
御放出の医学応用, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974)
参照。尚別の実施態様では、制御放出システムは組成物の標的の近傍に入れられることができ、その結果全身用量のわずかだけを必要とする(例えば、Goodson, 制御放出の医学用途, supra, vol. 2, pp. 115-138, 1984を参照されたい) 。
デバイス内のリザーバ中に保存された医薬組成物をプレフィルドされるようになる。一度リザーバで医薬組成物が空の状態になると、デバイス全体は廃棄される。
デバイス例は、勿論限定されるものではないが、SOLOSTAR(商標)ペン (sanofi-aventis)
、FLEXPEN(商標) (Novo Nordisk)、及び KWIKPEN(商標) (Eli Lilly)を含む。
本発明は更に、本発明のhANGPTL3抗体又はそのフラグメントを1つ又はそれ以上の更なる治療剤と組み合わせて投与することにより、hANGPTL3と直接又は間接に関連する疾患又は障害を処置する治療方法を提供する。更なる治療剤は、セリバスタチン、アトルバスタチン、シンバスタチン、ピタバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチンなどのHMG−CoAレダクターゼ阻害剤; ナイアシン;フェノフィブラート、ベザフィブラート、シプロフィブラート、クロフィブラート
、ゲムフィブロジルなどの種々のフィブラート系薬; LXR転写因子アクチベータなどを含み、1つ又はそれ以上の本発明の抗体又はそのフラグメントと有利に組み合わせられる1つ又はそれ以上のいずれの活性物質であってよい。更に、本発明のhANGPTL3抗体又はそのフラグメントは、他のhANGPTL3阻害剤と、並びに脂質代謝、特にコレステロール及び/又はトリグリセリドホメオスタシスに関与する、ANGPTL4、ANGPTL5、ANGPTL6及びプロタンパク質コンベルターゼスブチリシン/ケキシンタイプ9(PCSK9)などの、他の分子の阻害剤と同時投与されることができる。これらの分子の阻害剤は、これらの分子に特異的に結合しそしてそれらの活性をブロックする小分子及び抗体を含む(例えば、U.S.2010/0166768A1に開示の抗PCSK9抗体を参照されたい)。
ようなデルタ様リガンド4(Dll4)アンタゴニスト、及びDll4の細胞外ドメイン、例えば、U.S.特許出願公開2008/0107648に記載のDll4−Fcを含有する融合タンパク質を含む抗血管新生剤;ソラフェニブ(NEXAVAR(登録商標)by Bayer Pharmaceuticals Corp.)、スニチニブ(SUTENT(登録商標) by Pfizer)、パゾパニブ(VOTRIENT(商標) by GlaxoSmithKline)、トセラニブ(PALLADIA(商標) by Pfizer)、バンデタニブ(ZACTIMA(商標)by AstraZeneca)、セジラニブ(RECENTIN(登録商標)by AstraZeneca)、レ
ゴラフェニブ(BAY 73-4506 by Bayer)、アキシチニブ(AG013736 by Pfizer) 、レスタウ
ルチニブ(CEP-701 by Cephalon)、エルロチニブ(TARCEVA(登録商標)by Genentech)、ゲフィチニブ(IRESSA(商標) by AstraZeneca), BIBW 2992 (TOVOK(商標) by Boehringer Ingelheim)、ラパチニブ(TYKERB(登録商標)by GlaxoSmithKline)、ネラチニブ (HKI-272 by Wyeth/Pfizerなどを含む受容体チロシンキナーゼ及び/又は血管新生阻害剤、及び薬学的
に許容される塩、酸又は上記のいずれかの誘導体を含む。加えて、鎮痛薬、Cox−2阻害剤のような非ステロイド性抗炎症薬(NSAIDS)を含む抗炎症薬などの他の治療剤は、基礎となる癌/腫瘍に伴う症状を軽減し及び/又は減少させるために、本発明のhANGPTL3抗体又はそのフラグメントを同時投与され得る。
本発明の抗ANGPTL3抗体はまた、サンプル中のANGPTL3を、例えば、診断目的のために検出及び/又は測定するのに使用されることができる。例えば、抗ANGPTL3Ab又はそのフラグメントは、異常発現(例えば、過剰発現、発現不足、発現欠如など)によって特徴付けられる病態及び疾患を診断するのに使用されることができる。ANGPTL3の例示的診断的アッセイは、例えば、本発明の抗ANGPTL3Abと患者から得られるサンプルを接触させることを含んでよく、ここで抗ANGPTL3抗体は、検出可能な標識又はレポーター分子で標識され、又は患者サンプル由来のANGPTL3タンパク質を選択的に捕捉しそして分離するのに使用される。あるいは、非標識抗ANGPTL3Abは、それ自体検出可能に標識される二次抗体と組み合わせて診断用途に使用されることができる。検出可能な標識又はレポーター分子は、3H、14C、32P、35S、131I又は125Iなどの放射性同位体;フルオレセインイソチオシアナート、又はローダミ
ンなどの蛍光又は化学発光部分;又はアルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、又はルシフェラーゼなどの酵素であってよい。サンプル中のANGPTL3を検出又は測定するのに使用されることができるアッセイは、酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)、蛍光細胞分析分離(FACS)などを含む。
VELOCIMMUNE(商標)マウスをヒトANGPTL3で免疫感作し、そして抗体免疫反応を
これらのマウスから得られた血清を用いて抗原特異的イムノアッセイによってモニターし
た。B細胞を発現する抗hANGPTL3は、抗hANGPTL3抗体タイターを上昇させたことが示される免疫されたマウスの脾臓から回収し、そしてハイブリドーマを形成するためにマウスミエローマ細胞と融合した。ハイブリドーマをスクリーニングし、そして下記のアッセイを用いてhANGPTL3特異的抗体を発現する細胞株を同定するために選択した。アッセイは、キメラ抗hANGPTL3抗体、例えば、H1M896Nを産生する幾つかの細胞株を同定した。
産性抗体の構造を解析するために、抗体可変領域をコードする核酸をクローン化しそして配列決定した。抗体の核酸配列及び予測アミノ酸配列から、遺伝子利用法を、各重鎖可変領域(HCVR)及び軽鎖可変領域(LCVR)で同定した。表1は、本発明に基づいた選択抗体での利用法を示す。
すべての速度論的結合実験は、BIACORE(商標)T200ラベルフリー分子相互作用機器(GE Healthcare) にCM5センサチップを用いて25℃又は37℃で行った。簡単に言うと、
抗原捕獲表面は、抗マウスIgG特異抗体(抗mFc; GE Healthcare;カタログ#BR−1008−38)か又は抗ペンタヒスチジン特異抗体 (Qiagen; カタログ #34660)を、標準アミンカップリング法を用いてCM5センサチップの表面に共有結合することによって生成した。実施緩衝液として、HBS−EP(10mMHEPES、150mMNaCl、3mMEDTA、0.05%界面活性剤P20、pH7.4)、又はPBSP(10mMリン酸ナトリウム、2.7mMKCl、137mMNaCl、0.025%界面活性剤P20、pH7.2又は5.75)を用いて、4.4−46.5RUの結合反応を実現するまで、オリゴヒスチジンタグのANGPTL3のヒト及び種バリアントを抗ペンタヒスチジン結合表面で捕獲した。捕獲組換タンパク質は:C末端デカヒスチジンタグ[hANGPTL3(17−460)−His;R&D Systems,MN;カタログ#3829−
AN]の完全長成熟ヒトANGPTL3(即ち、配列番号161のアミノ酸残基17−460)、C末端ヘキサヒスチジンタグ[hANGPTL3(17−170)−His]を含有する、hANGPTL3のN末端コイルドコイルドメイン(即ち、配列番号161のアミノ酸残基17−170)、myc−myc−ヘキサヒスチジンタグ[MfANGPTL3(17−170)−mmH;配列番号167]を含有する、カニクイザル由来のANGPTL3のN末端コイルドコイルドメイン[即ち、配列番号177のアミノ酸残基17−170(カニクイザルANGPTL3の部分配列)]、C末端デカヒスチジンタグ[mANGPTL3(17−455)−His;R&D Systems, MN;カタログ#136−AN]の、ハツカネズミ由来完全長成熟ANGPTL3(即ち、配列番号163のアミノ酸残基17−455)、ヘキサヒスチジンタグ[mANGPTL3(17−240)−His;配列番号166]を含有する、ハツカネズミ由来のANGPTL3のN末端コイルドコイルドメイン(即ち、配列番号163のアミノ酸残基17−240)、及びmyc−myc−ヒスチジンタグ[rANGPTL3(17−240)−mmH;配列番号176]を含有する、ドブネズミ由来のANGPTL3のN末端コイルドコイルドメイン(即ち、配列番号175のアミノ酸残基17−240)である。加えて、24.8±1.5RUの結合反応を実現するまで、C末端Fc融合[hANGPTL3(17−169)−mFc;配列番号165]を含有する、hANGPTL3のN末端コイルドコイルドメイン(即ち、配列番号161のアミノ酸残基17−169)を抗mFc結合表面に捕獲した。抗体/抗原複合体の形成の連結及び解離速度を測定するために、単一(表3及び7)及び複数(表4〜6)濃度の抗体を、50μl/分の流速で3分間捕獲タンパク質表面をわたって注入し、そして複合体の解離を20分間モニターした。結合データを処理し、そして Scrubbe
rバージョン2.0a(BioLogic Software)で物質移動により1:1結合モデルに合わせた。動的半減期(t1/2)を解離速度定数、kdから計算した。
GPTL3(17−460)−His]と完全長タンパク質に、そして8.41pMから6.23nMまで変動するKDsのC末端Fc融合[hANGPTL3(17−169)
−mFc]とN末端コイルドコイルドメインに結合した。
るH4H1276SのANGPTL3への異種結合を示す。表6は、PBSP緩衝液中pH5.75又はpH7.2で、25℃又は37℃におけるH4H1276Sのヒト又はカニクイザルANGPTL3への結合を示す。
スチジンタグ[hANGPTL3(17−460)−His]と完全長タンパク質に、そしてmANGPTL3に対して検出可能結合を示さなかったH4H1248P及びH4H1263Sを除いて、167pMから682pMまで変動するKDsのマウスANGPT
L3[mANGPTL3(17−455)−His]に結合した。また動的半減期(t1/2)を示す。
本質的に上記実施例3に記載のBiacoreで25℃において交差競合研究を実施した。簡
単に言えば、実施緩衝液としてHBS−EPを用いて、C末端デカヒスチジンタグ[hANGPTL3(17−460)−His;R&D Systems,MN;カタログ#3829−AN
]の完全長hANGPTL3(即ち、配列番号161のアミノ酸残基17−460)を、64RUの結合反応を実現するまで、抗ペンタヒスチジン結合表面に捕獲した。2つの抗体が捕獲ANGPTL3に同時に結合し得るかを決定するために、抗体ペアは各々167nMで4μl/分の流速において15分間逐次的に表面にわたって注入し、そして最大結合反応シグナル(RU)を各結合イベントに対して測定した。結果は表8に、第1の抗体(mAb1)の結合反応、続いて第1の抗体をプレロードしたANGPTL3表面への第2の抗体(mAb2)の結合反応で示す。太字の数は、抗体ペアがhANGPTL3に同時に結合が可能であることを示す。イタリックの数は、他ではなく1つの方向に逐次的に加えられるとき、抗体ペアがhANGPTL3に同時に結合が可能であることを示す。
体結合
ANGPTL3のN末端コイルドコイル領域由来ペプチドへの抗ANGPTL3抗体H4H1276Sの結合を評価するために、標識なしバイオセンサ結合アッセイをOCTET(
登録商標)RED システム(ForteBio, Inc.)を用いて行った。センサペプチドへの固定のために、ペプチドは、N末端ビオチンタグ[ペプチド1及びペプチド2ではフレキシブルリンカー、アミノ酸「AGSSPGG」(配列番号171);及びペプチド3ではアミノ酸「GGGGS」(配列番号172)によって分離された]か,又はC末端ビオチンタグ[ペプチド1及びペプチド2ではフレキシブルリンカー、アミノ酸「GPSSGAPPPK」(配列番号173);及びペプチド3ではアミノ酸「GGGGSK」(配列番号174)によって分離された]で標識した。試験したペプチド配列は:陰性対照ペプチド、N末端ビオチンタグ化ペプチド1(配列番号168;配列番号164のヒトANTGPTL4の残基Arg34〜Leu66);及びANGPTL3のN末端コイルドコイル領域由来ペプチド、即ち、N末端ビオチンタグ化ペプチド2(配列番号169;配列番号161のhANGPTL3の残基Arg36〜Leu68);C末端ビオチンタグ化ペプチド2;N末端ビオチンタグ化ペプチド3(配列番号170;配列番号161のhANGPTL3の残基Glu32〜Leu57に対応);及びC末端ビオチンタグ化ペプチド3であった。ペプチド配列はまた図1に示される。ストレプトアビジンコーティングバイオセンサチップはビオチニル化ペプチドでコーティングし、ペプチドに応じて1.22−2.26nmの結合反応単位をもたらした。ペプチドコーティングバイオセンサチップは、次いで1μMの抗ANGPTL3抗体のH4H1276Sか又はイソタイプ適合陰性対照抗体を含有するウェルに浸漬し、そして結合を2.5分間モニターした。各ペプチドへのH4H1276S及びイソタイプ対照抗体の結合反応は、図2にまとめられる。H4H1276Sはペプチド2によって規定されるANGPTL3線状配列に結合し、しかしペプチド3によって規定される重複しかし異なる配列はそうでないことを認めた(図1も参照されたい)。このイソタイプ対照抗体は特異的にhANGPTL4を認識することから、イソタイプ対照抗体はまた、バイオセンサへのペプチド1(即ち、hANGPTL4ペプチド)の負荷に対する陽性対照としての機能を果たした。図2に示されるように、ペプチド1への対照抗体の結合は、ペプチド1がセンサ表面に存在し、そしてそれで他のペプチドであることを確認した。
リポタンパク質リパーゼ(LPL)はヒトの脂質代謝において重要な役割を果たしている。LPLはトリグリセリドの加水分解を触媒し、そして代謝されるように脂肪酸を放出する。ANGPTL3はLPL活性を阻害し脂質のレベル増加をもたらす(Oike et al., 2005, Trends in Molecular Medicine 11(10):473-479)。ANGPTL3のN末端コイルドコイル領域は、C末端フィブリノーゲン領域なしに発現されるときLPLを阻害し、そしてその結果その阻害機能を与えるように見える。LPL活性のANGPTL3誘導減少を阻害する抗ANGPTL3抗体の能力を測定する無細胞バイオアッセイを開発した。
1のアミノ酸残基17−460)、C末端マウスFc融合[hANGPTL3(17−169)−mFc;配列番号165]のN末端コイルドコイルド領域(即ち、配列番号161のアミノ酸残基17−169)、及びC末端ヘキサヒスチジンタグ[hANGPTL3(17−170)−His]を含有する、hANGPTL3のN末端コイルドコイルドメイン(即ち、配列番号161のアミノ酸残基17−170)、を用いて測定した。
登録商標)3マイクロプレートリーダー(Molecular Devices, CA)を用いて、342nm/400nm(励起/放出)で蛍光を測定した。蛍光はLPL活性に正比例する。
のハツカネズミ由来の完全長成熟ANGPTL3(即ち、配列番号163のアミノ酸残基17−455)。IC50は、500nM定常MfANGPTL3(17−170)−mmHでは10nM、80nM定常mANGPTL3(17−455)−Hisでは14nM、そして500nM定常mANGPTL3(17−240)−Hisでは31nMと決定した。抗体濃度は試験サル及びマウスANGPTL3タンパク質で0から600nMまで変動した。結果は表9にまとめられる。
血清脂質レベルに対する抗hANGPTL3抗体のH4H1276Sの効果を、C57Bl/6マウスで測定した。マウスを実験の7日前にプレ放血し、そして各試験抗体用量に対して各々6マウス群を割り当てた。抗体を、5mg/kg(H4H1726S)及び10mg/kg[H4H1726S及び無関係な特異性のイソタイプ適合hIgG4(S108P)対照]用量レベルで、試験の0日目に皮下注射によって投与した。マウスを抗体注射の1、4、7及び12日後に4時間の絶食後に放血し、そして血清脂質レベル(トリグリセリド、総コレステロール、非HDLコレステロール、LDLコレステロール及びHDLコレステロール)を、ADVIA(R) 1800 Chemistry System (Siemens)によって血清で測定した。各抗体に対してそれぞれの時点での平均値を算出した。(平均±SEM)の血清脂質濃度で表した結果を表10〜14に示した。
を用いて化学ルミネセンスによって検出した。(平均±SEM)で表した結果を表15に示した。対照:イソタイプ適合対照Abを受けたマウス。
血清脂質レベルに対する抗ANGPTL3抗体のH4H1276S及びコンパレータ4.9.1のインビボ効果の評価は、C57Bl/6マウスで実施した。抗体4.9.1は、US特許出願公開2008/0177045に開示のそしてマウスイソタイプIgG1として配列番号24(VH)及び配列番号32(VL)のアミノ酸配列に基づいて調製した。マウスを実験の7日前にプレ放血し、そして群当り6マウスの群に割り当てた。抗体H4H1726S、4.9.1、及び無関係な特異性のイソタイプ適合陰性対照(それぞれヒトIgG4及びマウスIgG1)を、10mg/kg用量で、試験の0日目に皮下注射によって投与した。マウスを抗体投与の1、7、11及び20日後に4時間の絶食後に放血し、そして血清脂質レベル(トリグリセリド、総コレステロール、非HDLコレステロール、LDLコレステロール及びHDLコレステロール)を、ADVIA(登録商標)1800 Chemistry System (Siemens)を用いて血清で測定した。各抗体に対してそれぞれの時点での平均脂質濃度を算出した。(平均±SEM)の血清脂質濃度で表した結果を表16〜20に示した。
のインビボ効果
血清脂質レベルに対する抗hANGPTL3抗体H4H1276Sの効果を、ApoE-/-マウスで測定した。これらのマウスは、VLDL及びLDLの形態で見出される大部
分のそれらの循環コレステロールにより高脂血症性である。マウスを実験の7日前にプレ放血し、そして群当り6マウスの群に割り当てた。抗体、H4H1276S及び無関係な特異性のイソタイプ適合(hIgG4)対照を、10mg/kg用量で試験の0日目に皮下注射によって投与した。マウスを抗体の注射の1、4、7及び11日後に4時間の絶食後に放血し;そして血清脂質レベル(トリグリセリド、総コレステロール、非HDLコレステロール、LDLコレステロール及びHDLコレステロール)を、ADVIA(登録商標)1800 Chemistry System (Siemens)を用いて血清中で測定した。各抗体処置群に対してそれぞれの時点で平均脂質濃度を算出した。(平均±SEM)の血清脂質濃度で表した結果を表21〜25に示した。
7日に循環トリグリセリドの〜72%(平均)減少(表21)及びLDLコレステロールの〜46%(平均)減少(表24)をもたらした(イソタイプ適合対照Ab、即ち、hIgG4と比べて)。H4H1276Sの投与はまた、総コレステロール(表22)及び非HDLコレステロール(表23)の減少をもたらした。
に示した(対照:イソタイプ適合対照Ab、即ち、hIgG4を受けたマウス)。
のインビボ効果
血清脂質レベルに対する抗hANGPTL3抗体H4H1276Sの効果をLdlr-/-マウスで測定した。これらのマウスは、LDLコレステロール取込の主要受容体、LD
LRの欠乏に因りLDLの形態で見出される大部分の循環コレステロールにより高脂血症性である。
1276S及びイソタイプ適合(hIgG4)陰性対照を、10mg/kg用量で試験の0日目に皮下注射によって投与した。抗体の注射の1、4、7及び11日後に4時間の絶食後に放血し;そして血清脂質レベル(トリグリセリド、総コレステロール、非HDLコレステロール、LDLコレステロール及びHDLコレステロール)を、ADVIA(登録商標
)1800 Chemistry System (Siemens)臨床化学分析計を用いて測定した。各抗体に対しそ
れぞれの時点で平均値を算出した。(平均±SEM)の血清脂質濃度(トリグリセリド、総コレステロール、非HDLコレステロール、LDLコレステロール及びHDLコレステロール)で表した結果を、それぞれ表27〜31に示した。(対照=イソタイプ適合対照抗体を受けたマウス)。
は、44%の最大実測減少で血漿トリグリセリドの顕著な減少をもたらした(平均値ベース)。LDLコレステロール(23%まで)、並びに総コレステロール、非HDLコレステロール及びHDLコレステロールの顕著な減少もH4H1276S処置被検体で認められた。LDLコレステロール取込の主要受容体(LDLR)欠乏マウスにおけるLDLコレステロールの減少は、ANGPTL3阻害によるLDLコレステロール減少に対するLDLR非依存性機構を示唆する。
に示した。(対照=イソタイプ適合対照抗体を受けたマウス)。
Claims (35)
- 配列番号161のヒトアンギオポエチン様タンパク質3(hANGPTL3)と特異的に結合し、そしてhANGPTL3の少なくとも1つの活性を中和し、減少させ、又は干渉する単離されたヒト抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 抗体又はそのフラグメントは、配列番号161の残基17〜209のN末端コイルドコイル領域内に位置するエピトープに結合する、請求項1に記載の抗体又はフラグメント。
- 抗体又はそのフラグメントは、配列番号170のANGPTL3ペプチドに結合しない、請求項1又は2に記載の抗体又はフラグメント。
- エピトープは、配列番号161の残基17〜200、17〜100、17〜70、17〜65、17〜60、17〜57、17〜50、40〜200、40〜100、40〜70、50〜200、50〜100、50〜70、58〜200、58〜100、58〜70、58〜68、又は61〜66内に位置する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の抗体又はフラグメント。
- 抗体又はフラグメントは、キメラ抗体若しくは完全ヒト抗体、又は抗体フラグメントである、請求項1〜4のいずれか1項に記載の抗体又はフラグメント。
- 配列番号2、18、34、50、66、82、98、114、130、146及び180から成る群から選択される重鎖可変領域(HCVR);及び/又は配列番号10、26、42、58、74、90、106、122、138、154及び188から成る群から選択される軽鎖可変領域(LCVR)を含んでなる、請求項1〜5のいずれか1項に記載の抗体又はフラグメント。
- 抗体又はそのフラグメントは、配列番号2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154及び180/188から成る群から選択されるHCVR及びLCVR配列ペア(HCVR/LCVR)を含む、請求項6に記載の抗体又はフラグメント。
- 抗体又はそのフラグメントは、配列番号2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154及び180/188から成る群から選択される、重鎖可変領域(HCVR)及び軽鎖可変領域(LCVR)配列ペア(HCVR/LCVR)内に含有される、重鎖相補性決定領域(CDR)配列、HCDR1、HCDR2及びHCDR3、並びに軽鎖CDR配列、LCDR1、LCDR2及びLCDR3を含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の抗体又はフラグメント。
- HCDR1/HCDR2/HCDR3配列組み合わせは、配列番号4/6/8、20/22/24、36/38/40、52/54/56、68/70/72、84/86/88、100/102/104、116/118/120、132/134/136、148/150/152及び182/184/186から成る群から選択され;及び/又はL
CDR1/LCDR2/LCDR3配列組み合わせは、配列番号12/14/16、28/30/32、44/46/48、60/62/64、76/78/80、92/94/96、108/110/112、124/126/128、140/142/144、156/158/160及び190/192/194から成る群から選択される、請求項8に記載の抗体又はフラグメント。 - 抗体又はフラグメントは、4/6/8/12/14/16、20/22/24/28/30/32、36/38/40/44/46/48、52/54/56/60/62/64、68/70/72/76/78/80、84/86/88/92/94/96、100/102/104/108/110/112、116/118/120/124/126/128、132/134/136/140/142/144、148/150/152/156/158/160及び182/184/186/190/192/194から成る群から選択される、HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3配列組み合わせを含む、請求項8又は9に記載の抗体又はフラグメント。
- 4/6/8/12/14/16、20/22/24/28/30/32、36/38/40/44/46/48、52/54/56/60/62/64、68/70/72/76/78/80、84/86/88/92/94/96、100/102/104/108/110/112、116/118/120/124/126/128、132/134/136/140/142/144、148/150/152/156/158/160及び182/184/186/190/192/194から成る群から選択される、重鎖及び軽鎖相補性決定領域(CDR)配列組み合わせを含んでなる抗体又は抗原結合フラグメントと、hANGPTL3への結合を競合し、又はそれと同一の、hANGPTL3上のエピトープに結合する、抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 抗体又は抗原結合フラグメントは、カニクイザルANGPTL3と交差反応する、請求項1〜11のいずれか1項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
- 抗体又は抗原結合フラグメントは、マウス又はラットのANGPTL3と交差反応する、請求項1〜12のいずれか1項に記載の抗体又はフラグメント。
- 抗体又はフラグメントは、カニクイザルANGPTL3、マウスANGPTL3、及びラットANGPTL3のいずれかと交差反応する、請求項1〜13のいずれか1項に記載の抗体又はフラグメント。
- 抗体フラグメントは単鎖抗体、Fab、又はF(ab’)2である、請求項1〜14の
いずれか1項に記載の抗体又はフラグメント。 - 請求項1〜15のいずれか1項に記載の抗体又はそのフラグメントをコードする単離された核酸分子。
- 請求項16に記載の核酸分子を含んでなる発現ベクター。
- 請求項17に記載の発現ベクターを含んでなる単離された宿主細胞。
- 抗体又はそのフラグメントの生産を可能にする条件下で請求項18に記載の宿主細胞を増殖する工程、及びそのようにして生産された抗体又はそのフラグメントを回収する工程を含んでなる、抗hANGPTL3抗体又はその抗原結合フラグメントを生産する方法。
- 請求項1〜15のいずれか1項に記載の1つ又はそれ以上の抗体又はそのフラグメント、及び薬学的に許容される担体を含んでなる医薬組成物。
- 抗体又はそのフラグメントは、配列番号68/70/72/76/78/80の重鎖及び軽鎖相補性決定領域(CDR)配列組み合わせ、又は配列番号66/74を含んでなる重鎖可変領域及び軽鎖可変領域HCVR/LCVRペアを含む、請求項20に記載の医薬組成物。
- (i)配列番号82/90及び180/188;
(ii)配列番号114/122及び180/188;
(iii)配列番号82/90及び18/26;及び
(iv)配列番号114/122及び18/26:
の重鎖可変領域(HCVR)及び軽鎖可変領域(LCVR)配列ペア(HCVR/LCVR)から成る群から選択される抗体又はそのフラグメントの組み合わせを含んでなる、請求項20に記載の医薬組成物。 - HMG−CoAレダクターゼ阻害剤;コレステロール取込又は胆汁酸再吸収、又は両方の阻害剤;リポタンパク質異化を増強する薬剤;非致死的心臓発作の数を減少させる薬剤;及びLXR転写因子のアクチベータから成る群から選択される1つ又はそれ以上の更なる治療剤を更に含んでなる、請求項20〜22のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- スタチン、ナイアシン、フィブラート、抗hANGPTL4抗体及び抗PCSK9抗体から成る群から選択される1つ又はそれ以上の更なる治療剤を更に含んでなる、請求項20〜22のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- ANGPTL3活性の減少又は阻害によって予防され、軽減され、改善され又は阻害される疾患又は障害を予防又は処置する方法であって、それを必要とする対象に請求項20〜24のいずれか1項に記載の医薬組成物の治療的有効量を投与することを含んでなる、上記方法。
- ANGPTL3活性の減少又は阻害によって予防され、軽減され、改善され又は阻害される疾患又は障害を予防又は処置する方法であって、それを必要とする対象に請求項1〜15のいずれか1項に記載の1つ又はそれ以上の抗体又はそのフラグメントの治療的有効量を投与することを含んでなる、上記方法。
- HMG−CoAレダクターゼ阻害剤;コレステロール取込又は胆汁酸再吸収、又は両方の阻害剤;リポタンパク質異化を増強する薬剤;非致死的心臓発作の数を減少させる薬剤;及びLXR転写因子のアクチベータから成る群から選択される1つ又はそれ以上の更なる治療剤を対象に投与することを更に含んでなる、請求項26に記載の方法。
- スタチン、ナイアシン、フィブラート、抗hANGPTL4抗体及び抗PCSK9抗体から成る群から選択される1つ又はそれ以上の更なる治療剤を対象に投与することを更に含んでなる、請求項26に記載の方法。
- 1つ又はそれ以上の抗体又はそのフラグメント及び1つ又はそれ以上の更なる治療剤を同時又は逐次的に投与する、請求項27又は28に記載の方法。
- 前記疾患又は障害は、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、カイロミクロン血症、アテローム性脂質異常症、心血管疾患又は障害、急性膵炎、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、糖尿病及び肥満から成る群から選択される、請求項25〜29のいずれか1項に記載の方法。
- 必要とする対象の循環からhANGPTL3のクリアランスを強化する方法であって、hANGPTL3への結合について互いと競合せず、そしてhANGPTL3の少なくとも1つの活性をブロックしない、少なくとも2つの抗体又はその抗原結合フラグメントを対象に投与することを含んでなる、上記方法。
- hANGPTL3の1つの活性はリポタンパク質リパーセ(LPL)活性の阻害である、請求項31に記載の方法。
- 2つの抗体は、
(i)配列番号82/90及び180/188;
(ii)配列番号82/90及び18/26;
(iii)配列番号114/122及び180/188;及び
(iv)配列番号114/122及び18/26:
の重鎖可変領域(HCVR)及び軽鎖可変領域(LCVR)配列ペア(HCVR/LCVR)から成る群から選択される、請求項31又は32に記載の方法。 - ANGPTL3活性の減少又は阻害によって予防され、軽減され、改善され又は阻害される疾患又は障害を処置するのに用いるための、請求項20〜24のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 疾患又は障害は、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、カイロミクロン血症、アテローム性脂質異常症、心血管疾患及び障害、急性膵炎、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、糖尿病及び肥満から成る群から選択される、請求項34に記載の医薬組成物。
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