JP2018134007A - 細胞培養方法、及び細胞培養システム - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 培養容器の培養面の少なくとも一部を、接触角が84°以下で、かつ、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリメチルペンテン、環状オレフィンポリマー、環状オレフィンコポリマー、ポリ塩化ビニル、ポリウレタン、ポリメタクリル酸メチル、ポリエステル、ポリアミド、アイオノマー、エチレン−酢酸ビニル共重合体、エチレン−ビニルアルコール共重合体、エチレン−アクリル酸共重合体、エチレン−アクリル酸メチル共重合体、エチレン−メタクリル酸共重合体、エチレン−メタクリル酸メチル共重合体等からなる群より選択され、かつ、放射線処理又は親水化処理がなされた基材で形成し、培養容器に、細胞接着因子としてのラミニン又はそのフラグメントを含有する培地と細胞とを収容して、接着細胞を培養する。
【選択図】なし
Description
このような状況において、培養容器に細胞と培地を注入して、細胞を培養することが行われている。
そこで、本発明者らは、培養容器にラミニンをコーティングすることなく、ラミニンを培地に混合させて培養することで、細胞を培養容器に接着させて培養できるかについて、研究を行った。
図1に示すように、培地には雑多なタンパク質が含まれており、培養容器の培養面は、アルブミンなどのタンパク質に覆われた状態となっている。このとき、培養面が親水性材料からなる場合には、ラミニンとアルブミンなどが培養面に交換吸着することで、ラミニンは培養面にコーティングされると考えられる。一方、培養面が疎水性材料からなる場合、アルブミンなどが培養面に疎水結合するためにラミニンと交換吸着できず、ラミニンを培養面にコーティングできなかったと考えられる。
しかしながら、これを実現するための具体的な構成については示されておらず、どのような特性の培養容器を用いれば、ラミニンを添加した培地を用いて細胞を培養することができるのかについては、検討されていなかった。
本実施形態の細胞培養方法は、細胞を培養容器に接着させて培養する細胞培養方法であって、培養容器の培養面の少なくとも一部を、接触角が84°以下で、かつ、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリメチルペンテン、環状オレフィンポリマー、環状オレフィンコポリマー、ポリ塩化ビニル、ポリウレタン、ポリメタクリル酸メチル、ポリエステル、ポリアミド、アイオノマー、エチレン−酢酸ビニル共重合体、エチレン−ビニルアルコール共重合体、エチレン−アクリル酸共重合体、エチレン−アクリル酸メチル共重合体、エチレン−メタクリル酸共重合体、エチレン−メタクリル酸メチル共重合体、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリル酸メチル、ポリメタクリル酸メチル、ポリジメチルシロキサン、フッ素系樹脂からなる群より選択され、かつ、放射線処理又は親水化処理がなされた基材で形成し、培養容器に、細胞接着因子としてのラミニン又はそのフラグメントを含有する培地と細胞とを収容して、細胞を培養することを特徴とする。
接触角とは、静止した液体の表面が固体壁に接するところで液面と固体面がなす角であり、静的接触角とも称する。接触角が大きい場合には表面の疎水性が強く、接触角が小さい場合には表面の親水性が強いという関係がある。
具体的には、培養容器の培養面に対して、エキシマ照射又はコロナ処理による親水化処理、又は放射線処理による滅菌のいずれか、又はこれらの組み合わせを用いて処理することができる。このとき、エキシマ照射は処理速度、コロナ処理は処理回数などの条件を変更することにより、親水化の程度を調整することができる。
また、放射線処理は、電子線処理、又はγ線処理のいずれかを好適に用いることができる。
一方、ポリエチレンテレフタレートに対して親水化処理を行えば、その最表面に水酸基やカルボキシル基が付与されることでアルブミンの疎水結合を妨害できる。また、ポリエチレンテレフタレートに対して放射線処理を行えば、樹脂内部の分子鎖の切断・開裂により分子の運動性が上がるため、親水基が最表面へと移動することができるようになり、アルブミンの疎水結合を妨害できるようになると考えられる。
本実施形態の細胞培養方法によれば、これらの細胞を培養面に接着して好適に培養することが可能である。
このため、細胞培養に先立って、培養容器の培養面にラミニンをコーティングすることなく、細胞を培養容器の培養面に接着させて培養することができるため、従来の煩雑な培養容器へのラミニンのコーティングを省略できると共に、ラミニンコーティング済みの培養容器の製造や品質管理を省略することが可能となる。
培養容器10の培養面では、接着細胞1が接着して培養される。培地容器20にはラミニン入り培地2が充填されており、ポンプ40を駆動させることで、ラミニン入り培地2がチューブ30を介して、培養容器10に供給される。
培養容器10の培養面は、上記の各種基材のいずれか又はその組み合わせを用いて形成され、接触角が84°以下となるように親水化処理等がなされたものである。なお、培養面の一部のみをこのように形成して処理することで、当該一部のみで接着細胞を培養することもできる。
また、培養容器10は、ガス透過性を有する部材からなるものであることが好ましい。具体的には、酸素透過係数が400ml・mm/m2・day・atm(37℃−80%RH)以上、二酸化炭素透過係数が1200ml・mm/m2・day・atm(37℃−80%RH)以上のものであることが好ましく、酸素透過係数が1000ml・mm/m2・day・atm(37℃−80%RH)以上、二酸化炭素透過係数が3000ml・mm/m2・day・atm(37℃−80%RH)以上のものであることがより好ましい。培養容器10がこのようなガス透過性を有すれば、優れた細胞増殖効率を得ることができる。
さらに、培養容器10は、内容物を確認できるように、一部又は全部が透明性を有することが好ましい。また、本実施形態における培養容器10は、可撓性部材を用いて形成されたものとすることが好ましい。
そして、ポンプ40を駆動させることにより、培地容器20aから培地3(ラミニンを含まない)をチューブ30aを介して培養容器10に移送し、またポンプ40aを駆動させることにより、ラミニン供給容器50からラミニン4をチューブ30aを介して培養容器10に移送することによって、培養容器10にラミニン濃度調整培地5を供給する。
また、この面積あたりのラミニンの濃度を変えたくないが、高密度で細胞を培養したい等の理由で、仮に液の厚みを倍にしたいときは、濃度0.1mg/mlに調製されたラミニン溶液を1mlと、培地3を399mlで培養容器10に移送することによって、これを行うことができる。
各種材料を用いて形成された培養容器の培養面の接触角が様々な値となるように処理を行って、本実施形態の細胞培養方法による細胞培養を行った。具体的には、以下の通りである。
培養容器として、ポリエチレン(PE,宇部丸善ポリエチレン株式会社製,品名ユメリット125FN)をフィルムに成膜した後にディッシュ型に加工したもの、環状オレフィンコポリマー(COC,ポリプラスチック株式会社製,品名TOPAS8007F-04)をフィルムに成膜した後にディッシュ型に加工したもの、ポリエチレンテレフタレート(PET,SKケミカル株式会社製,品名BR8040)を射出成形してディッシュ型に形成したものを用意した。PE、COCのフィルムのディッシュ型への加工は、フィルムの端を折り、インパルスシーラーにて溶着することによって行った。
図4及び図5に示されるように、各々の培養容器に対し、エキシマ照射装置(株式会社エム・ディ・コム製)による親水化処理、バッチ式コロナ処理装置(春日電機株式会社製)による親水化処理、又は電子線処理のいずれか、又はそれらの組み合わせを用いて処理を行った。電子線処理は、ラジエ工業株式会社に依頼して行った。
各処理において、エキシマ照射は処理速度、コロナ処理は処理回数などの条件を変更することによって親水化の程度を調整することができる。これらの条件を調整することによって、図4及び図5に示される接触角の培養面を有する培養容器を用意した。
なお、エキシマ照射は12V、照射距離5mm、コロナ処理は電極間距離5mm、印可電流3.5A、テーブル移動速度を5m/minとした。
接触角の測定には、固液界面解析システムDropMaster 700(協和界面科学株式会社製)を使用した。接触角は、フィルム上に純水3μlを滴下して測定した。
使用した接着細胞は、iPS細胞(1231A3株)である。
使用した培地は、StemFit AK02N(品番RCAK02N,味の素株式会社製)である。
各培養容器に、10 mM Y-27632(品番253-00511,和光純薬工業株式会社製)を含む上記培地を注入すると共に、0.5 mg/mlラミニン511-E8(品番892012,株式会社ニッピ製)を各培養容器に0.5 μg/cm2となるように加えた。その後、iPS細胞を含む細胞懸濁液を注入して、37℃で7日間培養を行った。このとき、培地は1.5 ml、細胞懸濁液5 μlであった。播種した細胞数は、およそ1.3×104cellsであった。また、培養開始から1日経過後に、培地をY-27632不含有の培地に交換して、その後毎日培地交換を行った。
培養1日、6日、又は7日後における細胞の接着状態を顕微鏡にて観察して、細胞の接着・伸展が見られるか否かを基準として、細胞の接着性を評価した。
なお、通常、培養容器における培養面に接着細胞を培養可能な適切な処理が行われている場合、細胞は1日で接着する。また、細胞が接着しない場合は、その後日数が経過しても接着しないことから、比較例1〜4では、培養1日後のみで各培養容器の培養適性(細胞接着の可否)を判断した。
ラミニンの濃度が、それぞれ0.125, 0.5, 4.0 μg/cm2となるように各培養容器にラミニン511-E8を添加して、上記の手順で細胞培養を行った。
また、実施例10、11において、ポリエチレン(PE)又はポリエチレンテレフタレート(PET)からなる培養容器であって、その培養面の接触角が84°以下のもので、かつ、放射線処理又は親水化処理がなされたものは、ラミニン濃度が0.125, 0.5, 4.0 μg/cm2のいずれの場合でも、接着細胞を培養することができた。
例えば、上記実施例では接着細胞としてiPS細胞を用いているが、これに限定されるものではなく、接着細胞であればその他の細胞を用いることができる。また、培地の種類等も適宜変更することが可能である。
2 ラミニン入り培地
3 培地(ラミニンを含まない)
4 ラミニン
5 ラミニン濃度調整培地
10 培養容器
20,20a 培地容器
30,30a チューブ
40,40a ポンプ
50 ラミニン供給容器
Claims (7)
- 細胞を培養容器に接着させて培養する細胞培養方法であって、
前記培養容器の培養面の少なくとも一部を、接触角が84°以下で、かつ、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリメチルペンテン、環状オレフィンポリマー、環状オレフィンコポリマー、ポリ塩化ビニル、ポリウレタン、ポリメタクリル酸メチル、ポリエステル、ポリアミド、アイオノマー、エチレン−酢酸ビニル共重合体、エチレン−ビニルアルコール共重合体、エチレン−アクリル酸共重合体、エチレン−アクリル酸メチル共重合体、エチレン−メタクリル酸共重合体、エチレン−メタクリル酸メチル共重合体、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリル酸メチル、ポリメタクリル酸メチル、ポリジメチルシロキサン、フッ素系樹脂からなる群より選択され、かつ、放射線処理又は親水化処理がなされた基材で形成し、
前記培養容器に、細胞接着因子としてのラミニン又はそのフラグメントを含有する培地と前記細胞とを収容して、前記細胞を培養する
ことを特徴とする細胞培養方法。 - 前記基材が、放射線処理又は親水化処理がなされた、ポリエチレン、環状オレフィンコポリマー、又はポリエチレンテレフタレートのいずれかであることを特徴とする請求項1記載の細胞培養方法。
- 前記細胞が、多能性幹細胞、胚性幹細胞、又はそれらの分化細胞であることを特徴とする請求項1又は2記載の細胞培養方法。
- 前記培養容器により閉鎖系で前記細胞を培養することを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の細胞培養方法。
- 細胞を培養容器に接着させて培養する細胞培養システムであって、
前記培養容器の培養面の少なくとも一部を、接触角が84°以下で、かつ、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリメチルペンテン、環状オレフィンポリマー、環状オレフィンコポリマー、ポリ塩化ビニル、ポリウレタン、ポリメタクリル酸メチル、ポリエステル、ポリアミド、アイオノマー、エチレン−酢酸ビニル共重合体、エチレン−ビニルアルコール共重合体、エチレン−アクリル酸共重合体、エチレン−アクリル酸メチル共重合体、エチレン−メタクリル酸共重合体、エチレン−メタクリル酸メチル共重合体、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリル酸メチル、ポリメタクリル酸メチル、ポリジメチルシロキサン、フッ素系樹脂からなる群より選択され、かつ、放射線処理又は親水化処理がなされた基材で形成された培養容器と、
細胞接着因子としてのラミニン又はそのフラグメントを含有する培地を収容する培地容器と、を備え、
前記培地容器からの前記培地の前記培養容器への移送、及び、前記培養容器への前記細胞の注入を行って、前記細胞の培養が行われる
ことを特徴とする細胞培養システム。 - 細胞を培養容器に接着させて培養する細胞培養システムであって、
前記培養容器の培養面の少なくとも一部を、接触角が84°以下で、かつ、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリメチルペンテン、環状オレフィンポリマー、環状オレフィンコポリマー、ポリ塩化ビニル、ポリウレタン、ポリメタクリル酸メチル、ポリエステル、ポリアミド、アイオノマー、エチレン−酢酸ビニル共重合体、エチレン−ビニルアルコール共重合体、エチレン−アクリル酸共重合体、エチレン−アクリル酸メチル共重合体、エチレン−メタクリル酸共重合体、エチレン−メタクリル酸メチル共重合体、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリル酸メチル、ポリメタクリル酸メチル、ポリジメチルシロキサン、フッ素系樹脂からなる群より選択され、かつ、放射線処理又は親水化処理がなされた基材で形成された培養容器と、
培地を収容する培地容器と、
細胞接着因子としてのラミニン又はそのフラグメントを収容するラミニン供給容器と、を備え、
前記培地容器からの前記培地の前記培養容器への移送、前記培養容器への前記細胞の注入、及び、前記ラミニン供給容器からのラミニン又はそのフラグメントの前記培養容器への移送を行って、前記細胞の培養が行われる
ことを特徴とする細胞培養システム。 - 前記ラミニン供給容器に収容されるラミニンの濃度が、0.1mg/ml以下であることを特徴とする請求項6記載の細胞培養システム。
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