JP2018091649A - Oxidation stress marker and use of the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、酸化ストレスマーカー及びその使用に関する。より詳細には、酸化ストレスマーカー、酸化ストレスレベルの測定方法、酸化ストレスレベルの測定用キット及び生体の酸化ストレスレベルに影響を与える物質のスクリーニング方法に関する。 The present invention relates to oxidative stress markers and uses thereof. More specifically, the present invention relates to an oxidative stress marker, a method for measuring an oxidative stress level, a kit for measuring an oxidative stress level, and a method for screening a substance that affects the oxidative stress level of a living body.
酸化ストレスは、老化現象のみならず、癌・糖尿病・心血管病・神経変性疾患等の様々な疾患の発症・進展に関連することが明らかになりつつある。特に、罹患率が増加している糖尿病等の生活習慣病においては、酸化ストレスの亢進が重要な臓器障害の進展因子として注目されている。 It is becoming clear that oxidative stress is related not only to the aging phenomenon but also to the onset and progression of various diseases such as cancer, diabetes, cardiovascular disease, and neurodegenerative diseases. In particular, in lifestyle-related diseases such as diabetes whose morbidity is increasing, increased oxidative stress is attracting attention as an important organ failure progression factor.
このため、生体の酸化ストレスレベルを正確に評価できるバイオマーカーの開発が求められている。従来、生体の酸化ストレスレベルを評価する方法としては、生体試料中の活性酸素種又は活性窒素種の定量、活性酸素種又は活性窒素種により傷害された生体分子の定量等が試みられてきた（例えば、非特許文献１を参照。）。
For this reason, development of the biomarker which can evaluate the oxidative stress level of a biological body correctly is calculated | required. Conventionally, as a method for evaluating the level of oxidative stress in a living body, attempts have been made to quantify reactive oxygen species or reactive nitrogen species in biological samples, quantify biomolecules damaged by reactive oxygen species or reactive nitrogen species, and the like ( For example, see Non-Patent
しかしながら、活性酸素種及び活性窒素種は、半減期が非常に短く高い化学反応性を有しているため、測定が困難な場合がある。このため、生体の酸化ストレスレベルの評価は、活性酸素種又は活性窒素種により傷害された生体分子の定量により行われる場合が多い。しかしながら、従来のバイオマーカーでは、生体の酸化ストレスレベルを正確に捉えることが困難である。そこで、本発明は、生体の酸化ストレスレベルを正確に測定する技術を提供することを目的とする。 However, the active oxygen species and the active nitrogen species have a very short half-life and high chemical reactivity, and thus may be difficult to measure. For this reason, evaluation of the oxidative stress level in a living body is often performed by quantifying a biomolecule damaged by reactive oxygen species or reactive nitrogen species. However, it is difficult for the conventional biomarker to accurately capture the oxidative stress level of the living body. Then, an object of this invention is to provide the technique which measures correctly the oxidative stress level of a biological body.
本発明は、以下の態様を含む。
［１］生体試料中のタンパク質の酸化されたメチオニン残基からなる酸化ストレスマーカー。
［２］前記生体試料が、血液、尿、脳脊髄液、唾液、汗、組織、細胞培養上清又は細胞破砕物である、［１］に記載の酸化ストレスマーカー。
［３］前記タンパク質が血清アルブミン又はイムノグロブリンである、［１］又は［２］に記載の酸化ストレスマーカー。
［４］前記タンパク質が血清アルブミンであり、前記メチオニン残基が前記血清アルブミンの第１１１番目又は第１４７番目のメチオニン残基である、［１］〜［３］のいずれかに記載の酸化ストレスマーカー。
［５］前記タンパク質がイムノグロブリンであり、前記イムノグロブリンがイムノグロブリンＧ１、イムノグロブリンＧ２、イムノグロブリンＧ３又はイムノグロブリンＧ４であり、前記メチオニン残基が、前記イムノグロブリンＧ１の定常領域の第１３５番目のメチオニン残基、前記イムノグロブリンＧ２の定常領域の第１３１番目のメチオニン残基、前記イムノグロブリンＧ３の定常領域の第１８２番目のメチオニン残基、又は前記イムノグロブリンＧ４の定常領域の第１３２番目のメチオニン残基である、［１］〜［３］のいずれかに記載の酸化ストレスマーカー。
［６］被験者由来の生体試料中の対象タンパク質の対象メチオニン残基について、酸化されていないメチオニン残基と酸化されたメチオニン残基との量比、又は酸化されたメチオニン残基の濃度を測定する工程を備え、前記量比又は前記濃度が、前記被験者の酸化ストレスレベルを示す、前記被験者の酸化ストレスレベルの測定方法。
［７］前記生体試料が、血液、尿、脳脊髄液、唾液、汗又は生検組織である、［６］に記載の測定方法。
［８］前記対象タンパク質が血清アルブミン又はイムノグロブリンである、［６］又は［７］に記載の測定方法。
［９］前記対象タンパク質が血清アルブミンであり、前記対象メチオニン残基が前記血清アルブミンの第１１１番目又は第１４７番目のメチオニン残基である、［６］〜［８］のいずれかに記載の測定方法。
［１０］前記対象タンパク質がイムノグロブリンであり、前記イムノグロブリンがイムノグロブリンＧ１、イムノグロブリンＧ２、イムノグロブリンＧ３又はイムノグロブリンＧ４であり、前記メチオニン残基が、前記イムノグロブリンＧ１の定常領域の第１３５番目のメチオニン残基、前記イムノグロブリンＧ２の定常領域の第１３１番目のメチオニン残基、前記イムノグロブリンＧ３の定常領域の第１８２番目のメチオニン残基、又は前記イムノグロブリンＧ４の定常領域の第１３２番目のメチオニン残基である、［６］〜［８］のいずれかに記載の測定方法。
［１１］前記量比又は前記濃度が、質量分析、又は対象タンパク質の酸化された対象メチオニン残基を特異的に認識する抗体により測定される、［６］〜［１０］のいずれかに記載の測定方法。
［１２］前記濃度が質量分析により測定され、前記測定する工程において、前記生体試料に、対象タンパク質の対象メチオニン残基を含む安定同位体標識ペプチドが添加される、［６］〜［１１］のいずれかに記載の測定方法。
［１３］被験者由来の生体試料中の対象タンパク質の対象メチオニン残基について、酸化されていないメチオニン残基と酸化されたメチオニン残基との量比、又は酸化されたメチオニン残基の濃度を測定するための試薬を備える、前記被験者の酸化ストレスレベルの測定用キット。
［１４］前記試薬が、対象タンパク質を質量分析するための試薬、対象タンパク質の対象メチオニン残基を含む安定同位体標識ペプチド又は対象タンパク質の酸化された対象メチオニン残基を特異的に認識する抗体である、［１３］に記載のキット。
［１５］被験物質の投与下及び非投与下の対象からそれぞれ採取された生体試料中の対象タンパク質の対象メチオニン残基について、酸化されていないメチオニン残基と酸化されたメチオニン残基との量比、又は酸化されたメチオニン残基の濃度を測定する工程と、前記量比又は前記濃度が、前記被験物質の投与下及び非投与下で有意に異なる場合に、前記被験物質は生体の酸化ストレスレベルに影響を与える物質であると判定する工程と、を備える、生体の酸化ストレスレベルに影響を与える物質のスクリーニング方法。
The present invention includes the following aspects.
[1] An oxidative stress marker comprising an oxidized methionine residue of a protein in a biological sample.
[2] The oxidative stress marker according to [1], wherein the biological sample is blood, urine, cerebrospinal fluid, saliva, sweat, tissue, cell culture supernatant, or cell lysate.
[3] The oxidative stress marker according to [1] or [2], wherein the protein is serum albumin or immunoglobulin.
[4] The oxidative stress marker according to any one of [1] to [3], wherein the protein is serum albumin, and the methionine residue is the 111th or 147th methionine residue of the serum albumin. .
[5] The protein is an immunoglobulin, the immunoglobulin is immunoglobulin G1, immunoglobulin G2, immunoglobulin G3, or immunoglobulin G4, and the methionine residue is the 135th position of the constant region of immunoglobulin G1. The 131st methionine residue of the constant region of the immunoglobulin G2, the 182nd methionine residue of the constant region of the immunoglobulin G3, or the 132nd position of the constant region of the immunoglobulin G4. The oxidative stress marker according to any one of [1] to [3], which is a methionine residue.
[6] For the target methionine residue of the target protein in the subject-derived biological sample, the quantitative ratio of the unoxidized methionine residue to the oxidized methionine residue or the concentration of the oxidized methionine residue is measured. A method for measuring an oxidative stress level of a subject, comprising a step, wherein the quantitative ratio or the concentration indicates an oxidative stress level of the subject.
[7] The measurement method according to [6], wherein the biological sample is blood, urine, cerebrospinal fluid, saliva, sweat, or biopsy tissue.
[8] The measurement method according to [6] or [7], wherein the target protein is serum albumin or immunoglobulin.
[9] The measurement according to any one of [6] to [8], wherein the target protein is serum albumin, and the target methionine residue is the 111th or 147th methionine residue of the serum albumin. Method.
[10] The target protein is an immunoglobulin, the immunoglobulin is immunoglobulin G1, immunoglobulin G2, immunoglobulin G3, or immunoglobulin G4, and the methionine residue is the 135th constant region of the immunoglobulin G1. The 131st methionine residue of the constant region of the immunoglobulin G2, the 182nd methionine residue of the constant region of the immunoglobulin G3, or the 132nd position of the constant region of the immunoglobulin G4 The measurement method according to any one of [6] to [8], which is a methionine residue.
[11] The method according to any one of [6] to [10], wherein the quantitative ratio or the concentration is measured by mass spectrometry or an antibody that specifically recognizes an oxidized target methionine residue of a target protein. Measuring method.
[12] The concentration is measured by mass spectrometry, and in the measuring step, a stable isotope-labeled peptide containing a target methionine residue of a target protein is added to the biological sample. [6] to [11] The measuring method in any one.
[13] For the target methionine residue of the target protein in the subject-derived biological sample, the quantitative ratio of the unoxidized methionine residue to the oxidized methionine residue, or the concentration of the oxidized methionine residue is measured. A kit for measuring the oxidative stress level of the subject, comprising a reagent for the purpose.
[14] The reagent is a reagent for mass spectrometry of the target protein, a stable isotope-labeled peptide containing the target methionine residue of the target protein, or an antibody that specifically recognizes the oxidized target methionine residue of the target protein. The kit according to [13].
[15] For the target methionine residue of the target protein in the biological sample collected from the subject under administration and non-administration of the test substance, the quantitative ratio of the unoxidized methionine residue to the oxidized methionine residue Or the step of measuring the concentration of oxidized methionine residue, and the test substance has a level of oxidative stress in a living body when the quantitative ratio or the concentration is significantly different between administration and non-administration of the test substance. A method for screening a substance that affects the level of oxidative stress in a living body.
本発明により、生体の酸化ストレスレベルを正確に測定する技術を提供することができる。 The present invention can provide a technique for accurately measuring the oxidative stress level of a living body.
［酸化ストレスマーカー］
１実施形態において、本発明は、生体試料中のタンパク質の酸化されたメチオニン残基からなる酸化ストレスマーカーを提供する。
[Oxidative stress marker]
In one embodiment, the present invention provides an oxidative stress marker consisting of an oxidized methionine residue of a protein in a biological sample.
タンパク質のメチオニン残基の酸化は可逆的な酸化反応であり、微弱な酸化ストレスを鋭敏に反映し得る。しかしながら、血液等の生体試料中には膨大な種類と量のタンパク質がダイナミックに存在している。このため、従来、生体試料中のタンパク質のメチオニン残基の酸化レベルを定量することは、未知の多くの酵素反応等の影響により不可能であると考えられてきた。 Oxidation of a methionine residue of a protein is a reversible oxidation reaction and can sensitively reflect weak oxidative stress. However, enormous types and amounts of proteins are dynamically present in biological samples such as blood. For this reason, conventionally, it has been considered that it is impossible to quantify the oxidation level of a methionine residue of a protein in a biological sample due to the influence of many unknown enzyme reactions and the like.
これに対し、実施例において後述するように、発明者らは、生体試料中のタンパク質のメチオニン残基の酸化レベルを安定的に測定することが可能であり、メチオニン残基の酸化レベルを、生体の酸化ストレスレベルを示す指標として用いることができることを明らかにした。したがって、生体試料中のタンパク質の酸化されたメチオニン残基は酸化ストレスマーカーであるということができる。 On the other hand, as will be described later in the Examples, the inventors can stably measure the oxidation level of a methionine residue of a protein in a biological sample. It was clarified that it can be used as an index to show the level of oxidative stress in potato. Therefore, it can be said that the oxidized methionine residue of the protein in the biological sample is an oxidative stress marker.
生体試料としては、特に制限されず、生体由来の試料であってもよく、培養細胞由来の試料であってもよい。より具体的には、例えば、血液、尿、脳脊髄液、唾液、汗等の体液、生検組織等の組織、細胞培養上清、細胞破砕物等が挙げられる。また、生体試料は、タンパク質抽出液、組織又は細胞の薄切切片、ろ紙等の素材に吸着させたタンパク質抽出液又は体液等の形態であってもよい。また、メチオニン残基の酸化レベルを測定する対象のタンパク質としては、血清アルブミン、イムノグロブリン等を好適に用いることができるがこれらに限定されない。 The biological sample is not particularly limited, and may be a biological sample or a cultured cell-derived sample. More specifically, examples thereof include body fluids such as blood, urine, cerebrospinal fluid, saliva and sweat, tissues such as biopsy tissues, cell culture supernatants, and cell lysates. The biological sample may be in the form of a protein extract, a protein extract or a body fluid adsorbed on a material such as a tissue or cell slice or filter paper. Moreover, serum albumin, immunoglobulin, etc. can be used suitably as protein of the object which measures the oxidation level of a methionine residue, However It is not limited to these.
対象タンパク質が血清アルブミンである場合、酸化レベルを測定する対象のメチオニン残基は、血清アルブミンの第１１１番目又は第１４７番目のメチオニン残基であってもよい。 When the target protein is serum albumin, the methionine residue for which the oxidation level is measured may be the 111th or 147th methionine residue of serum albumin.
また、対象タンパク質がイムノグロブリンである場合、イムノグロブリンは、イムノグロブリンＧ１、イムノグロブリンＧ２、イムノグロブリンＧ３又はイムノグロブリンＧ４であってもよい。 When the target protein is an immunoglobulin, the immunoglobulin may be an immunoglobulin G1, an immunoglobulin G2, an immunoglobulin G3, or an immunoglobulin G4.
また、酸化レベルを測定する対象のメチオニン残基は、イムノグロブリンＧ１の定常領域の第１３５番目のメチオニン残基であってもよく、イムノグロブリンＧ２の定常領域の第１３１番目のメチオニン残基であってもよく、イムノグロブリンＧ３の定常領域の第１８２番目のメチオニン残基であってもよく、イムノグロブリンＧ４の定常領域の第１３２番目のメチオニン残基であってもよい。 In addition, the methionine residue whose oxidation level is to be measured may be the 135th methionine residue in the constant region of immunoglobulin G1, or the 131st methionine residue in the constant region of immunoglobulin G2. Alternatively, it may be the 182nd methionine residue of the constant region of immunoglobulin G3, or the 132nd methionine residue of the constant region of immunoglobulin G4.
血清アルブミンのアミノ酸配列を配列番号１に示す。また、イムノグロブリンＧ１の定常領域のアミノ酸配列を配列番号２に示し、イムノグロブリンＧ２の定常領域のアミノ酸配列を配列番号３に示し、イムノグロブリンＧ３の定常領域のアミノ酸配列を配列番号４に示し、イムノグロブリンＧ４の定常領域のアミノ酸配列を配列番号５に示す。 The amino acid sequence of serum albumin is shown in SEQ ID NO: 1. In addition, the amino acid sequence of the constant region of immunoglobulin G1 is shown in SEQ ID NO: 2, the amino acid sequence of the constant region of immunoglobulin G2 is shown in SEQ ID NO: 3, the amino acid sequence of the constant region of immunoglobulin G3 is shown in SEQ ID NO: 4, The amino acid sequence of the constant region of immunoglobulin G4 is shown in SEQ ID NO: 5.
実施例において後述するように、発明者らは、血清アルブミンの第１１１番目及び第１４７番目のメチオニン残基、並びにイムノグロブリンＧ１の定常領域の第１３５番目のメチオニン残基、イムノグロブリンＧ２の定常領域の第１３１番目のメチオニン残基、イムノグロブリンＧ３の定常領域の第１８２番目のメチオニン残基、イムノグロブリンＧ４の定常領域の第１３２番目のメチオニン残基の酸化レベルを、生体の酸化ストレスレベルのマーカーとして用いることができることを明らかにした。 As will be described later in the Examples, the inventors of the present invention have described the 111th and 147th methionine residues of serum albumin, the 135th methionine residue of the constant region of immunoglobulin G1, and the constant region of immunoglobulin G2. The oxidation level of the 131st methionine residue, the 182nd methionine residue of the constant region of immunoglobulin G3, and the 132nd methionine residue of the constant region of immunoglobulin G4, It was clarified that it can be used as.
メチオニン残基の酸化レベルは、例えば、対象タンパク質の酵素消化ペプチドを液体クロマトグラフィー質量分析計（ＬＣ−ＭＳ）で解析し、対象メチオニン残基を含むペプチドにおいて、メチオニン残基が酸化されていないペプチドの信号強度とメチオニン残基が酸化されているペプチドの信号強度とを比較することにより求めることができる。以下、対象メチオニン残基が酸化されているペプチドと対象メチオニン残基が酸化されていないペプチドとの量比、又は酸化されていない対象メチオニン残基と酸化された対象メチオニン残基との量比のことを「酸化比」という場合がある。 The oxidation level of the methionine residue is analyzed by, for example, an enzyme digestion peptide of the target protein with a liquid chromatography mass spectrometer (LC-MS), and the peptide in which the methionine residue is not oxidized in the peptide containing the target methionine residue And the signal intensity of the peptide in which the methionine residue is oxidized can be obtained. Hereinafter, the quantitative ratio between the peptide in which the target methionine residue is oxidized and the peptide in which the target methionine residue is not oxidized, or the quantitative ratio between the non-oxidized target methionine residue and the oxidized target methionine residue. This is sometimes referred to as “oxidation ratio”.
なお、質量分析計を用いてペプチドを測定する場合、ペプチドによってイオン化効率が違うため、正確なモル比を求めることが困難な場合がある。本明細書において、「量比」とは、ＭＳクロマトグラムにおける信号強度の比（ピーク面積の比）を意味する。 In addition, when measuring a peptide using a mass spectrometer, since ionization efficiency changes with peptides, it may be difficult to obtain | require an exact molar ratio. In this specification, the “quantity ratio” means a ratio of signal intensities (a ratio of peak areas) in an MS chromatogram.
あるいは、酸化されたメチオニン残基の濃度を定量し、当該濃度を生体の酸化ストレスレベルの指標として用いることもできる。 Or the density | concentration of the oxidized methionine residue can be quantified and the said density | concentration can also be used as a parameter | index of the oxidative stress level of a biological body.
具体的には、まず、生体試料に、内部標準として対象タンパク質の対象メチオニン残基を含む安定同位体標識ペプチドを添加する。ここで、安定同位体標識ペプチドは、対象メチオニン残基が酸化されていても酸化されていなくてもよいが、対象メチオニン残基が酸化されたペプチドの標準であることから、対象メチオニン残基が酸化されているものであることが好ましい。続いて、生体試料を酵素消化し、対象タンパク質の酵素消化ペプチドをＬＣ−ＭＳで解析する。なお、安定同位体標識ペプチドを添加するタイミングはこれに限られず、試料調製のいずれかの段階で添加すればよい。例えば、生体試料の酵素消化後であってもよいし、試料をＬＣ−ＭＳに供する直前であってもよい。 Specifically, first, a stable isotope labeled peptide containing the target methionine residue of the target protein is added as an internal standard to the biological sample. Here, the stable isotope-labeled peptide may or may not be oxidized in the target methionine residue. However, since the target methionine residue is an oxidized peptide standard, It is preferably oxidized. Subsequently, the biological sample is enzymatically digested, and the enzyme-digested peptide of the target protein is analyzed by LC-MS. The timing for adding the stable isotope labeled peptide is not limited to this, and it may be added at any stage of sample preparation. For example, it may be after enzymatic digestion of the biological sample, or may be just before the sample is subjected to LC-MS.
そして、メチオニン残基が酸化されているペプチドと内部標準の信号強度を比較することにより、メチオニン残基が酸化されているペプチドの濃度を定量することができる。 Then, by comparing the signal intensity of the internal standard and the peptide in which the methionine residue is oxidized, the concentration of the peptide in which the methionine residue is oxidized can be quantified.
上記の安定同位体標識ペプチドは、生体試料の酵素消化に用いる酵素と同じ酵素で得られるペプチド断片のアミノ酸配列を有しているか、あるいは、生体試料を酵素消化する時に、対象タンパク質と同時に酵素消化され、対象タンパク質の酵素消化ペプチドと同じアミノ酸配列を有するペプチド断片となるペプチドである必要がある。 The above stable isotope-labeled peptide has the amino acid sequence of a peptide fragment obtained with the same enzyme as the enzyme used for enzymatic digestion of the biological sample, or when the biological sample is enzymatically digested, enzymatic digestion is performed simultaneously with the target protein. The peptide must be a peptide fragment having the same amino acid sequence as the enzyme-digested peptide of the target protein.
［酸化ストレスレベルの測定方法］
１実施形態において、本発明は、被験者由来の生体試料中の対象タンパク質の対象メチオニン残基について、酸化されていないメチオニン残基と酸化されたメチオニン残基との量比、又は酸化されたメチオニン残基の濃度を測定する工程を備え、前記量比又は前記濃度が、前記被験者の酸化ストレスレベルを示す、前記被験者の酸化ストレスレベルの測定方法を提供する。
[Measurement method of oxidative stress level]
In one embodiment, the present invention relates to a target methionine residue of a target protein in a subject-derived biological sample, a quantitative ratio of an unoxidized methionine residue to an oxidized methionine residue, or an oxidized methionine residue. A method for measuring the oxidative stress level of the subject, comprising the step of measuring the concentration of a group, wherein the quantitative ratio or the concentration indicates the oxidative stress level of the subject.
本実施形態の測定方法において、生体試料としては、例えば、血液、尿、脳脊髄液、唾液、汗、生検組織等が挙げられる。また、生体試料は、タンパク質抽出液、組織又は細胞の薄切切片、ろ紙等の素材に吸着させたタンパク質抽出液又は体液等の形態であってもよい。また、対象タンパク質は、血清アルブミン又はイムノグロブリンであってもよい。対象タンパク質が血清アルブミンである場合、対象メチオニン残基は血清アルブミンの第１１１番目又は第１４７番目のメチオニン残基であってもよい。 In the measurement method of the present embodiment, examples of the biological sample include blood, urine, cerebrospinal fluid, saliva, sweat, biopsy tissue, and the like. The biological sample may be in the form of a protein extract, a protein extract or a body fluid adsorbed on a material such as a tissue or cell slice or filter paper. The target protein may be serum albumin or immunoglobulin. When the target protein is serum albumin, the target methionine residue may be the 111th or 147th methionine residue of serum albumin.
また、前記タンパク質がイムノグロブリンである場合、イムノグロブリンは、イムノグロブリンＧ１、イムノグロブリンＧ２、イムノグロブリンＧ３又はイムノグロブリンＧ４であってもよい。 When the protein is an immunoglobulin, the immunoglobulin may be an immunoglobulin G1, an immunoglobulin G2, an immunoglobulin G3, or an immunoglobulin G4.
また、対象メチオニン残基は、イムノグロブリンＧ１の定常領域の第１３５番目のメチオニン残基であってもよく、イムノグロブリンＧ２の定常領域の第１３１番目のメチオニン残基であってもよく、イムノグロブリンＧ３の定常領域の第１８２番目のメチオニン残基であってもよく、イムノグロブリンＧ４の定常領域の第１３２番目のメチオニン残基であってもよい。 The target methionine residue may be the 135th methionine residue of the constant region of immunoglobulin G1, or the 131st methionine residue of the constant region of immunoglobulin G2. It may be the 182nd methionine residue of the constant region of G3 or the 132nd methionine residue of the constant region of immunoglobulin G4.
本実施形態の測定方法において、前記量比又は前記濃度は、質量分析、又は対象タンパク質の酸化された対象メチオニン残基を特異的に認識する抗体等により測定することができる。質量分析は、液体クロマトグラフィー質量分析計（ＬＣ−ＭＳ）で行うことが好ましい。 In the measurement method of the present embodiment, the quantitative ratio or the concentration can be measured by mass spectrometry or an antibody that specifically recognizes the oxidized target methionine residue of the target protein. Mass spectrometry is preferably performed with a liquid chromatography mass spectrometer (LC-MS).
より具体的には、メチオニン残基の酸化レベルは、例えば、対象タンパク質の酵素消化ペプチドをＬＣ−ＭＳで解析し、対象メチオニン残基を含むペプチドにおいて、メチオニン残基が酸化されているペプチド及びメチオニン残基が酸化されていないペプチドの信号強度をそれぞれ比較し、上述した酸化比を算出することにより求めることができる。 More specifically, the level of oxidation of methionine residues can be determined, for example, by analyzing an enzyme-digested peptide of the target protein by LC-MS, and in a peptide containing the target methionine residue, the peptide in which the methionine residue is oxidized and methionine It can be obtained by comparing the signal intensities of peptides whose residues are not oxidized and calculating the oxidation ratio described above.
あるいは、被験者由来の生体試料中の対象タンパク質の対象メチオニン残基について、酸化されたメチオニン残基の濃度を定量し、被験者の酸化ストレスレベルの指標として用いることもできる。 Alternatively, the concentration of the oxidized methionine residue can be quantified for the target methionine residue of the target protein in the subject-derived biological sample and used as an index of the subject's oxidative stress level.
酸化されたメチオニン残基の濃度の定量方法は上述したものと同様である。具体的には、まず、生体試料に、内部標準として対象タンパク質の対象メチオニン残基を含む安定同位体標識ペプチドを添加する。続いて、生体試料を酵素消化し、対象タンパク質の酵素消化ペプチドをＬＣ−ＭＳで解析する。なお、安定同位体標識ペプチドを添加するタイミングはこれに限られず、試料調製のいずれかの段階で添加すればよい。例えば、生体試料の酵素消化後であってもよいし、試料をＬＣ−ＭＳに供する直前であってもよい。 The method for quantifying the concentration of the oxidized methionine residue is the same as described above. Specifically, first, a stable isotope labeled peptide containing the target methionine residue of the target protein is added as an internal standard to the biological sample. Subsequently, the biological sample is enzymatically digested, and the enzyme-digested peptide of the target protein is analyzed by LC-MS. The timing for adding the stable isotope labeled peptide is not limited to this, and it may be added at any stage of sample preparation. For example, it may be after enzymatic digestion of the biological sample, or may be just before the sample is subjected to LC-MS.
そして、メチオニン残基が酸化されているペプチドと内部標準の信号強度を比較することにより、メチオニン残基が酸化されているペプチドの濃度を定量することができる。 Then, by comparing the signal intensity of the internal standard and the peptide in which the methionine residue is oxidized, the concentration of the peptide in which the methionine residue is oxidized can be quantified.
被験者由来の生体試料中の対象タンパク質の対象メチオニン残基について、酸化されていないメチオニン残基と酸化されたメチオニン残基との量比又は濃度を測定する場合、対象タンパク質に特異的な抗体を用いて、生体試料中の対象タンパク質を精製する工程を実施してもよい。これにより、夾雑タンパク質を除去し、より信頼性の高い測定を行うことが可能になる。 When measuring the quantitative ratio or concentration of non-oxidized methionine residues and oxidized methionine residues for the target methionine residue of the target protein in a biological sample derived from a subject, use an antibody specific for the target protein. Then, the step of purifying the target protein in the biological sample may be performed. This makes it possible to remove contaminating proteins and perform more reliable measurement.
具体的には、対象タンパク質に特異的な抗体を結合したビーズを生体試料に添加し、対象タンパク質を抗体に結合させて回収することが挙げられる。ビーズの回収は、遠心分離、又は磁気ビーズを使用した場合にはマグネティックスタンド等を用いて行うことができる。この場合、対象タンパク質に特異的な抗体は、対象タンパク質の酸化された対象メチオニン残基を特異的に認識する抗体であってもよく、対象メチオニン残基が酸化されているか否かに関わらず対象タンパク質を特異的に認識する抗体であってもよい。 Specifically, a bead in which an antibody specific to the target protein is bound is added to the biological sample, and the target protein is bound to the antibody and recovered. The beads can be collected by centrifugation, or when using magnetic beads, a magnetic stand or the like can be used. In this case, the antibody specific for the target protein may be an antibody that specifically recognizes the oxidized target methionine residue of the target protein, regardless of whether the target methionine residue is oxidized or not. It may be an antibody that specifically recognizes a protein.
あるいは、対象タンパク質を特異的に認識する抗体と、対象タンパク質の酸化された対象メチオニン残基を特異的に認識する抗体を用いて、ウエスタンブロッティング法、ドットブロット法、ＥＬＩＳＡ法等を行うことにより、生体試料中の対象タンパク質の存在量と、生体試料中の、対象メチオニン残基が酸化された対象タンパク質の存在量を定量し、対象タンパク質の対象メチオニン残基について、酸化されていないメチオニン残基と酸化されたメチオニン残基との量比（酸化比）を求めてもよい。 Alternatively, by using an antibody that specifically recognizes the target protein and an antibody that specifically recognizes the oxidized target methionine residue of the target protein, by performing a Western blotting method, a dot blot method, an ELISA method, etc., The amount of the target protein in the biological sample and the amount of the target protein in which the target methionine residue is oxidized in the biological sample are quantified, and the target methionine residue of the target protein is compared with the non-oxidized methionine residue. You may obtain | require the quantitative ratio (oxidation ratio) with the oxidized methionine residue.
あるいは、対象タンパク質の酸化された対象メチオニン残基を特異的に認識する抗体を用いて、ウエスタンブロッティング法、ドットブロット法、ＥＬＩＳＡ法等を行うことにより、生体試料中の対象タンパク質の酸化された対象メチオニン残基の濃度を定量し、当該濃度を生体の酸化ストレスレベルの指標として用いてもよい。 Alternatively, the target protein in the biological sample is oxidized by performing Western blotting, dot blotting, ELISA, etc., using an antibody that specifically recognizes the target methionine residue oxidized. The concentration of the methionine residue may be quantified, and the concentration may be used as an index of the oxidative stress level of the living body.
［酸化ストレスレベルの測定用キット］
１実施形態において、本発明は、被験者由来の生体試料中の対象タンパク質の対象メチオニン残基について、酸化されていないメチオニン残基と酸化されたメチオニン残基との量比、又は酸化されたメチオニン残基の濃度を測定するための試薬を備える、前記被験者の酸化ストレスレベルの測定用キットを提供する。
[Measurement kit for oxidative stress level]
In one embodiment, the present invention relates to a target methionine residue of a target protein in a subject-derived biological sample, a quantitative ratio of an unoxidized methionine residue to an oxidized methionine residue, or an oxidized methionine residue. Provided is a kit for measuring the oxidative stress level of the subject, comprising a reagent for measuring the concentration of the group.
本実施形態のキットにより、生体の酸化ストレスレベルを測定することができる。本実施形態のキットが備える試薬としては、例えば、タンパク質を質量分析するための試薬、内部標準物質として使用する、対象タンパク質の対象メチオニン残基を含む安定同位体標識ペプチド、対象タンパク質の酸化された対象メチオニン残基を特異的に認識する抗体、対象メチオニン残基が酸化されているか否かに関わらず対象タンパク質を特異的に認識する抗体等が挙げられる。 The kit of this embodiment can measure the oxidative stress level of a living body. Examples of the reagent provided in the kit of this embodiment include a reagent for mass spectrometry of a protein, a stable isotope labeled peptide containing a target methionine residue of the target protein used as an internal standard substance, and an oxidized target protein. Examples thereof include an antibody that specifically recognizes a target methionine residue, and an antibody that specifically recognizes a target protein regardless of whether the target methionine residue is oxidized.
タンパク質を質量分析するための試薬としては、例えばタンパク質のシステイン残基の還元剤、システイン残基のアルキル化剤、タンパク質をペプチドに分解する酵素等が挙げられる。 Examples of reagents for mass spectrometry of proteins include reducing agents for cysteine residues in proteins, alkylating agents for cysteine residues, and enzymes that decompose proteins into peptides.
タンパク質のシステイン残基の還元剤としては、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩、ジチオスレイトール、β−メルカプトエタノール等が挙げられる。また、システイン残基のアルキル化剤としては、ヨードアセトアミド等が挙げられる。また、タンパク質をペプチドに分解する酵素としては、トリプシン、キモトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、エンドプロテアーゼＧｌｕ−Ｃ等が挙げられる。 Examples of the reducing agent for the cysteine residue of the protein include tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride, dithiothreitol, β-mercaptoethanol and the like. Moreover, iodoacetamide etc. are mentioned as an alkylating agent of a cysteine residue. Examples of enzymes that decompose proteins into peptides include trypsin, chymotrypsin, lysyl endopeptidase, and endoprotease Glu-C.
すなわち、本実施形態のキットは、システイン残基の還元剤、システイン残基のアルキル化剤、及びタンパク質をペプチドに分解する酵素を備えるものであってもよい。 That is, the kit of this embodiment may include a cysteine residue reducing agent, a cysteine residue alkylating agent, and an enzyme that degrades proteins into peptides.
本実施形態のキットは、対象タンパク質の対象メチオニン残基を含む安定同位体標識ペプチドを含んでいてもよい。安定同位体としては、例えば、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ等が挙げられるがこれらに限定されない。安定同位体標識ペプチドは、配列番号６、７又は８に記載のアミノ酸配列からなるペプチドであってもよい。安定同位体標識ペプチドは、対象メチオニン残基が酸化されていても酸化されていなくてもよいが、対象メチオニン残基が酸化されたペプチドの標準であることから、対象メチオニン残基が酸化されているものであることが好ましい。上述したように、これらのペプチドは、生体の酸化ストレスレベルの測定用に好適に用いることができる。 The kit of this embodiment may contain a stable isotope-labeled peptide containing the target methionine residue of the target protein. Examples of stable isotopes include, but are not limited to, 2 H, 13 C, 15 N, 18 O, and the like. The stable isotope labeled peptide may be a peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6, 7 or 8. The stable isotope-labeled peptide may or may not be oxidized to the target methionine residue. However, since the target methionine residue is an oxidized peptide standard, the target methionine residue is oxidized. It is preferable that As described above, these peptides can be suitably used for measuring the oxidative stress level of a living body.
対象タンパク質の酸化された対象メチオニン残基を特異的に認識する抗体、対象メチオニン残基が酸化されているか否かに関わらず対象タンパク質を特異的に認識する抗体としては、血清アルブミンを特異的に認識する抗体、血清アルブミンの第１１１番目の酸化されたメチオニン残基を特異的に認識する抗体、血清アルブミンの第１４７番目の酸化されたメチオニン残基を特異的に認識する抗体、イムノグロブリンＧを特異的に認識する抗体、イムノグロブリンＧ１を特異的に認識する抗体、イムノグロブリンＧ２を特異的に認識する抗体、イムノグロブリンＧ３を特異的に認識する抗体、イムノグロブリンＧ４を特異的に認識する抗体、イムノグロブリンＧ１の第１３５番目の酸化されたメチオニン残基を特異的に認識する抗体、イムノグロブリンＧ２の第１３１番目の酸化されたメチオニン残基を特異的に認識する抗体、イムノグロブリンＧ３の第１８２番目の酸化されたメチオニン残基を特異的に認識する抗体、イムノグロブリンＧ４の第１３２番目の酸化されたメチオニン残基を特異的に認識する抗体、メチオニン残基が酸化されているか否かに関わらず、配列番号６、７又は８に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを特異的に認識する抗体等が挙げられるがこれらに限定されない。 As an antibody specifically recognizing the oxidized target methionine residue of the target protein, an antibody specifically recognizing the target protein regardless of whether the target methionine residue is oxidized, serum albumin specifically An antibody that specifically recognizes the 111th oxidized methionine residue of serum albumin, an antibody that specifically recognizes the 147th oxidized methionine residue of serum albumin, and immunoglobulin G Antibodies that specifically recognize, antibodies that specifically recognize immunoglobulin G1, antibodies that specifically recognize immunoglobulin G2, antibodies that specifically recognize immunoglobulin G3, antibodies that specifically recognize immunoglobulin G4 An antibody specifically recognizing the 135th oxidized methionine residue of immunoglobulin G1, An antibody that specifically recognizes the 131st oxidized methionine residue of Robrin G2, an antibody that specifically recognizes the 182nd oxidized methionine residue of immunoglobulin G3, and the 132nd of immunoglobulin G4 An antibody that specifically recognizes the oxidized methionine residue, and specifically recognizes the peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6, 7 or 8 regardless of whether the methionine residue is oxidized or not Examples include but are not limited to antibodies.
すなわち、本実施形態のキットは、これらの抗体のうちのいずれか１つ以上を備えるものであってもよい。 That is, the kit of this embodiment may be provided with any one or more of these antibodies.
［酸化ストレスレベルに影響を与える物質のスクリーニング方法］
１実施形態において、本発明は、被験物質の投与下及び非投与下の対象からそれぞれ採取された生体試料中の対象タンパク質の対象メチオニン残基について、酸化されていないメチオニン残基と酸化されたメチオニン残基との量比、又は酸化されたメチオニン残基の濃度を測定する工程と、前記量比又は前記濃度が、前記被験物質の投与下及び非投与下で有意に異なる場合に、前記被験物質は生体の酸化ストレスレベルに影響を与える物質であると判定する工程と、を備える、生体の酸化ストレスレベルに影響を与える物質のスクリーニング方法を提供する。
[Method of screening for substances that affect oxidative stress level]
In one embodiment, the present invention relates to a non-oxidized methionine residue and an oxidized methionine for a target methionine residue of a target protein in a biological sample collected from a subject under administration and non-administration of a test substance, respectively. A step of measuring a quantitative ratio with a residue, or a concentration of an oxidized methionine residue, and the test substance when the quantitative ratio or the concentration is significantly different between administration and non-administration of the test substance. Providing a screening method for a substance that affects the oxidative stress level of a living body, comprising the step of determining that the substance is a substance that affects the oxidative stress level of the living body.
生体の酸化ストレスレベルに影響を与える物質としては、生体の酸化ストレスレベルを低下させる物質、生体の酸化ストレスレベルを上昇させる物質等が挙げられる。 Examples of substances that affect the oxidative stress level of the living body include substances that lower the oxidative stress level of the living body, substances that increase the oxidative stress level of the living body, and the like.
本実施形態のスクリーニング方法において、対象タンパク質の対象メチオニン残基について、酸化されていないメチオニン残基と酸化されたメチオニン残基との量比、又は酸化されたメチオニン残基の濃度を低下させる被験物質は、生体の酸化ストレスレベルを低下させる物質であるということができる。 In the screening method of the present embodiment, for the target methionine residue of the target protein, the test substance that reduces the quantitative ratio of the unoxidized methionine residue to the oxidized methionine residue or the concentration of the oxidized methionine residue Can be said to be a substance that lowers the level of oxidative stress in the living body.
また、対象タンパク質の対象メチオニン残基について、酸化されていないメチオニン残基と酸化されたメチオニン残基との量比、又は酸化されたメチオニン残基の濃度を上昇させる被験物質は、生体の酸化ストレスレベルを上昇させる物質であるということができる。 In addition, for the target methionine residue of the target protein, the test substance that increases the quantitative ratio of the unoxidized methionine residue to the oxidized methionine residue or the concentration of the oxidized methionine residue is oxidative stress in the living body. It can be said that it is a substance that raises the level.
例えば、投与することにより生体の酸化ストレスレベルを低下させる物質は、老化現象、癌・糖尿病・心血管病・神経変性疾患等の様々な疾患の発症・進展を抑制又は改善する医薬として用いることができる。 For example, a substance that lowers the level of oxidative stress in a living body when administered can be used as a medicament for suppressing or improving the onset / progress of various diseases such as aging phenomenon, cancer, diabetes, cardiovascular disease, and neurodegenerative diseases. it can.
また、投与することにより生体の酸化ストレスレベルを上昇させる物質は、上述した各種疾患を憎悪させる物質であると考えられる。このため、例えば、このような物質を含む飲食物の摂取を控えるべきである等の判断の指標とすることができる。 Moreover, it is thought that the substance which raises the oxidative stress level of a biological body by administering is a substance which exacerbates the various diseases mentioned above. For this reason, for example, it can be used as an index for judgment that intake of foods and drinks containing such substances should be refrained.
本実施形態のスクリーニング方法は、インビトロで細胞レベルで行ってもよいし、ヒト又は非ヒト動物に被験物質を投与して生体レベルで行ってもよい。 The screening method of this embodiment may be performed at the cellular level in vitro, or may be performed at the biological level by administering a test substance to a human or non-human animal.
本実施形態のスクリーニング方法において、生体試料としては、生検組織を含む各種組織、臓器、細胞培養上清、細胞破砕物、血液、尿、脳脊髄液、唾液、汗等が挙げられるがこれらに限定されない。また、生体試料は、タンパク質抽出液、組織又は細胞の薄切切片、ろ紙等の素材に吸着させたタンパク質抽出液又は体液等の形態であってもよい。 In the screening method of the present embodiment, examples of biological samples include various tissues including biopsy tissues, organs, cell culture supernatants, cell debris, blood, urine, cerebrospinal fluid, saliva, sweat, and the like. It is not limited. The biological sample may be in the form of a protein extract, a protein extract or a body fluid adsorbed on a material such as a tissue or cell slice or filter paper.
また、対象タンパク質及び対象メチオニン残基としては上述したものと同様のものを用いることができる。すなわち、対象タンパク質は、血清アルブミン又はイムノグロブリンであってもよい。また、対象タンパク質が血清アルブミンである場合、対象メチオニン残基は血清アルブミンの第１１１番目又は第１４７番目のメチオニン残基であってもよい。 Moreover, the thing similar to what was mentioned above can be used as object protein and object methionine residue. That is, the target protein may be serum albumin or immunoglobulin. When the target protein is serum albumin, the target methionine residue may be the 111th or 147th methionine residue of serum albumin.
また、前記タンパク質がイムノグロブリンである場合、イムノグロブリンは、イムノグロブリンＧ１、イムノグロブリンＧ２、イムノグロブリンＧ３又はイムノグロブリンＧ４であってもよい。また、対象メチオニン残基は、イムノグロブリンＧ１の定常領域の第１３５番目のメチオニン残基であってもよく、イムノグロブリンＧ２の定常領域の第１３１番目のメチオニン残基であってもよく、イムノグロブリンＧ３の定常領域の第１８２番目のメチオニン残基であってもよく、イムノグロブリンＧ４の定常領域の第１３２番目のメチオニン残基であってもよい。 When the protein is an immunoglobulin, the immunoglobulin may be an immunoglobulin G1, an immunoglobulin G2, an immunoglobulin G3, or an immunoglobulin G4. The target methionine residue may be the 135th methionine residue of the constant region of immunoglobulin G1, or the 131st methionine residue of the constant region of immunoglobulin G2. It may be the 182nd methionine residue of the constant region of G3 or the 132nd methionine residue of the constant region of immunoglobulin G4.
本実施形態のスクリーニング方法において、対象タンパク質の対象メチオニン残基について、酸化されていないメチオニン残基と酸化されたメチオニン残基との量比、又は酸化されたメチオニン残基の濃度を測定する工程は、上述したものと同様の方法により実施することができ、例えば、質量分析、対象タンパク質の酸化された対象メチオニン残基を特異的に認識する抗体等により測定することができる。質量分析は、液体クロマトグラフィー質量分析計（ＬＣ−ＭＳ）で行うことが好ましい。 In the screening method of the present embodiment, for the target methionine residue of the target protein, the step of measuring the quantitative ratio of the unoxidized methionine residue to the oxidized methionine residue or the concentration of the oxidized methionine residue The method can be carried out by the same method as described above. For example, it can be measured by mass spectrometry, an antibody that specifically recognizes the oxidized target methionine residue of the target protein, or the like. Mass spectrometry is preferably performed with a liquid chromatography mass spectrometer (LC-MS).
次に実験例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。 Next, although an experiment example is shown and this invention is demonstrated in detail, this invention is not limited to the following experiment examples.
［実験例１］
（生体試料中の対象タンパク質の対象メチオニン残基の酸化レベルの検討）
健常非喫煙者（Ｃ）１８名と２型糖尿病患者（ＤＭ）２３名、腎不全合併２型糖尿病患者（ＲＦ）１２名、健常喫煙者（Ｓ）９名の血清を対象に、血清アルブミンの第１１１番目のメチオニン（Ｍｅｔ−１１１）、血清アルブミンの第１４７番目のメチオニン（Ｍｅｔ−１４７）、イムノグロブリンＧの定常領域の後述するメチオニン残基における、酸化されていないメチオニン残基と酸化されたメチオニン残基との量比（Ｍｅｔ（Ｏ）／Ｍｅｔ（％）、以下「酸化比」という。）をＬＣ−ＭＳ分析により測定した。
[Experimental Example 1]
(Examination of oxidation level of target methionine residue of target protein in biological sample)
Serum albumin was administered to sera of 18 healthy non-smokers (C), 23
なお、イムノグロブリンＧには、イムノグロブリンＧ１、イムノグロブリンＧ２、イムノグロブリンＧ３及びイムノグロブリンＧ４の４種類のアイソフォームが存在する。本実験例では、イムノグロブリンＧ１の定常領域の第１３５番目のメチオニン（Ｍｅｔ−１３５）、イムノグロブリンＧ２の定常領域の第１３１番目のメチオニン（Ｍｅｔ−１３１）、イムノグロブリンＧ３の定常領域の第１８２番目のメチオニン（Ｍｅｔ−１８２）、及びイムノグロブリンＧ４の定常領域の第１３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ−１３２）を対象メチオニン残基とした。これらのイムノグロブリンのメチオニン残基は、後述する酵素消化後に、同一のアミノ酸配列を有するペプチド上に存在することになるため、混合物として測定した。 Immunoglobulin G has four isoforms: immunoglobulin G1, immunoglobulin G2, immunoglobulin G3, and immunoglobulin G4. In this experimental example, the 135th methionine (Met-135) of the constant region of immunoglobulin G1, the 131st methionine (Met-131) of the constant region of immunoglobulin G2, and the 182nd of the constant region of immunoglobulin G3 were used. The methionine residue (Met-182) and the 132nd methionine (Met-132) of the constant region of immunoglobulin G4 were used as the target methionine residues. Since these methionine residues of immunoglobulins existed on peptides having the same amino acid sequence after enzymatic digestion described later, they were measured as a mixture.
表１に、被験者の医学的特徴を示す。実験は、北里大学医学部の倫理委員会に承認を得（Ｂ１５−１８１）、全ての被験者から書面で同意を得たうえで行った。 Table 1 shows the medical characteristics of the subjects. The experiment was conducted after obtaining approval from the Ethics Committee of Kitasato University School of Medicine (B15-181) and obtaining written consent from all subjects.
（血清試料の採取）
まず、各被験者から血液試料を採取した。血液は肘正中静脈から採取し、凝血促進剤を含む容器に入れて室温で凝固させた後、２，０００×ｇで１５分間、室温で遠心した。続いて、血清を回収し、使用するまで−３０℃で保存した。
(Collecting serum samples)
First, blood samples were collected from each subject. The blood was collected from the median cubital vein, allowed to clot at room temperature in a container containing a procoagulant, and then centrifuged at 2,000 × g for 15 minutes at room temperature. Subsequently, serum was collected and stored at −30 ° C. until use.
（血清試料の還元アルキル化）
続いて、凍結保存していた血清を融解し、融解した血清２μＬに、２００ｍＭ重炭酸トリエチルアンモニウム／１２ｍＭデオキシコール酸ナトリウム／１２ｍＭラウリル硫酸ナトリウムを２０μＬ添加し、更に２００ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩／１２０ｍＭ重炭酸トリエチルアンモニウムを２μＬ添加し、５０℃で３０分間インキュベートした。この結果、還元剤であるトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩により、血清試料中のタンパク質のチオール基が還元された。
(Reductive alkylation of serum samples)
Subsequently, the cryopreserved serum was thawed, and 20 μL of 200 mM triethylammonium bicarbonate / 12 mM sodium deoxycholate / 12 mM sodium lauryl sulfate was added to 2 μL of the thawed serum, and further 200 mM tris (2-carboxyethyl) phosphine. 2 μL of hydrochloride / 120 mM triethylammonium bicarbonate was added and incubated at 50 ° C. for 30 minutes. As a result, the thiol group of the protein in the serum sample was reduced by tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride as a reducing agent.
続いて、３７５ｍＭヨードアセトアミドを２μＬ添加し、得られた混合液を暗所で３０分間インキュベートした。この結果、アルキル化剤であるヨードアセトアミドにより、血清試料中のタンパク質のチオール基がアルキル化された。 Subsequently, 2 μL of 375 mM iodoacetamide was added, and the resulting mixture was incubated in the dark for 30 minutes. As a result, the thiol group of the protein in the serum sample was alkylated with iodoacetamide, an alkylating agent.
（血清試料のトリプシン消化）
続いて、１００ｎｇ／μＬのリシルエンドペプチダーゼを２μＬ及び１００ｎｇ／μＬのトリプシンを２μＬ添加し、３７℃で２４時間インキュベートした。この結果、血清試料中のタンパク質がペプチドに分解された。続いて、アセトニトリル５０μＬと５％トリフルオロ酢酸５０μＬを添加し、１９，０００×ｇで１５分間遠心し、上清をＬＣ−ＭＳ解析に供した。
(Trypsin digestion of serum samples)
Subsequently, 2 μL of 100 ng / μL lysyl endopeptidase and 2 μL of 100 ng / μL trypsin were added and incubated at 37 ° C. for 24 hours. As a result, the protein in the serum sample was decomposed into peptides. Subsequently, 50 μL of acetonitrile and 50 μL of 5% trifluoroacetic acid were added and centrifuged at 19,000 × g for 15 minutes, and the supernatant was subjected to LC-MS analysis.
（酸化比の解析）
Ｍｅｔ（Ｏ）／Ｍｅｔ（％）（酸化比）を測定するためには、まず、トリプシン消化した血清試料を、ＨＰＬＣ装置（型式「Ｎａｎｏｓｐａｃｅ ＳＩ−２ ＨＰＬＣ ｓｙｓｔｅｍ」、資生堂）に取り付けた内径２．０ｍｍ×５０ｍｍのカラム（型式「ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＣＫ ＭＧＩＩＩ−Ｈ Ｓ３」、資生堂）に注入した。カラム温度は４５℃に維持した。
(Oxidation ratio analysis)
In order to measure Met (O) / Met (%) (oxidation ratio), first, an inner diameter of a serum sample digested with trypsin was attached to an HPLC apparatus (type “Nanospace SI-2 HPLC system”, Shiseido). It inject | poured into the column (model "CAPCELL PACK MGIII-HS3", Shiseido) of 0 mm x 50 mm. The column temperature was maintained at 45 ° C.
移動相Ａとして０．０５％ギ酸を使用し、移動相Ｂとして０．０５％ギ酸／９０％アセトニトリルを使用した。移動相の流速を２００μＬ／分とし、移動相のグラジエントを次のようにプログラムした。０％Ｂ（０〜３分）、０〜５５．５％Ｂ（３〜４０分）、５５．５〜８０％Ｂ（４０〜４０．１分）、８０％Ｂ（４０．１〜４５分）。 0.05% formic acid was used as mobile phase A and 0.05% formic acid / 90% acetonitrile was used as mobile phase B. The mobile phase flow rate was 200 μL / min and the mobile phase gradient was programmed as follows. 0% B (0-3 minutes), 0-55.5% B (3-40 minutes), 55.5-80% B (40-40.1 minutes), 80% B (40.1-45 minutes) ).
続いて、ペプチドを、ＨＰＬＣからイオントラップ・フーリエ変換ハイブリッド質量分析装置（型式「ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ」、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）に導入し、ｍ／ｚ ４００における質量分解能３０，０００でフルスキャンＭＳスペクトル（ｍ／ｚ ３００〜２，０００）を取得し、目的のペプチドのメチオニン残基のＭｅｔ（Ｏ）／Ｍｅｔ（％）（酸化比）を解析した。 Subsequently, the peptide was introduced from the HPLC into an ion trap / Fourier transform hybrid mass spectrometer (model “LTQ-Orbitrap Discover”, Thermo Fisher Scientific) and fully scanned at a mass resolution of 30,000 at m / z 400. An MS spectrum (m / z 300 to 2,000) was obtained, and Met (O) / Met (%) (oxidation ratio) of the methionine residue of the target peptide was analyzed.
血清アルブミンの第１１１番目のメチオニンの酸化比は、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの酸化型及び非酸化型の量比に基づいて算出した。また、血清アルブミンの第１４７番目のメチオニンの酸化比は、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの酸化型及び非酸化型の量比に基づいて算出した。また、イムノグロブリンＧ１の定常領域の第１３５番目のメチオニンの酸化比は、配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの酸化型及び非酸化型の量比に基づいて算出した。 The oxidation ratio of the 111th methionine of serum albumin was calculated based on the quantitative ratio of the oxidized and non-oxidized forms of the peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3. The oxidation ratio of the 147th methionine in serum albumin was calculated based on the quantitative ratio of the oxidized and non-oxidized forms of the peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4. The oxidation ratio of the 135th methionine in the constant region of immunoglobulin G1 was calculated based on the quantitative ratio of the oxidized and non-oxidized forms of the peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5.
図１（ａ）は、各被験者の血清アルブミンの第１１１番目のメチオニンにおける酸化比の解析結果を示すグラフである。また、図１（ｂ）は、各被験者の血清アルブミンの第１４７番目のメチオニンにおける酸化比の解析結果を示すグラフである。また、図１（ｃ）は、各被験者のイムノグロブリンＧ１の定常領域の第１３５番目のメチオニンにおける酸化比の解析結果を示すグラフである。 FIG. 1 (a) is a graph showing the analysis results of the oxidation ratio of the 111th methionine of serum albumin of each subject. Moreover, FIG.1 (b) is a graph which shows the analysis result of the oxidation ratio in the 147th methionine of each test subject's serum albumin. Moreover, FIG.1 (c) is a graph which shows the analysis result of the oxidation ratio in the 135th methionine of the constant region of immunoglobulin G1 of each test subject.
図１中、「Ｃ」は健常非喫煙者の結果であることを表し、「ＤＭ」は２型糖尿病患者の結果であることを表し、「ＲＦ」は腎不全合併２型糖尿病患者の結果であることを表し、「Ｓ」は健常喫煙者の結果であることを表す。
In FIG. 1, “C” represents the result of a healthy non-smoker, “DM” represents the result of a
また、各群の酸化比のレベルを比較するために、Ｏｎｅ ｗａｙ ＡＮＯＶＡ及びそれに続くＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ ｐｏｓｔ ｈｏｃテストを行った。図１中、「＊」は相関係数（ｐ値）５％未満で有意差があることを表し、「＊＊」はｐ値０．５％未満で有意差があることを表し、「＊＊＊」はｐ値０．０１％未満で有意差があることを表す。 Moreover, in order to compare the level of the oxidation ratio of each group, the One way ANOVA and the following Mann-Whitney U post hoc test were done. In FIG. 1, “*” indicates that there is a significant difference when the correlation coefficient (p value) is less than 5%, and “**” indicates that there is a significant difference when the p value is less than 0.5%. “**” indicates that there is a significant difference when the p value is less than 0.01%.
その結果、血清アルブミンの２種類のメチオニン残基（Ｍｅｔ−１１１、Ｍｅｔ−１４７）の酸化比は、健常非喫煙者群より２型糖尿病の両群（腎不全なし、腎不全合併）で有意に高値を示すことが明らかとなった。また、健常喫煙者群の酸化比も、健常非喫煙群と比較して有意に高値を示すことが明らかとなった。また、イムノグロブリンＧ１の定常領域のメチオニン残基（Ｍｅｔ−１３５）の酸化比も、糖尿病患者群では健常者群に比べて有意に高値を示すことが明らかとなった。
As a result, the oxidation ratio of two types of methionine residues (Met-111, Met-147) in serum albumin was significantly higher in both types of
また、この結果から、血清アルブミンの２種類のメチオニン残基（Ｍｅｔ−１１１、Ｍｅｔ−１４７）及びイムノグロブリンＧ１の定常領域のメチオニン残基（Ｍｅｔ−１３５）の酸化比を、２型糖尿病の診断に応用できることが明らかとなった。
Further, from this result, the oxidation ratio of two kinds of methionine residues (Met-111, Met-147) of serum albumin and the methionine residue (Met-135) of the constant region of immunoglobulin G1 was determined as a diagnosis of
また、血清アルブミンの２種類のメチオニン残基（Ｍｅｔ−１１１、Ｍｅｔ−１４７）の酸化比により、糖尿病と腎不全の病態を区別できることが明らかとなった。 Moreover, it became clear that the pathological condition of diabetes and renal failure can be distinguished by the oxidation ratio of two kinds of methionine residues (Met-111, Met-147) of serum albumin.
［実験例２］
（血糖値の変動が酸化ストレスレベルに与える影響の検討）
糖尿病では血糖値の変動が大きくなると酸化ストレスレベルを上昇させることが知られている。そこで、血糖値の変動と酸化比との関連を検討した。
[Experiment 2]
(Examination of the effect of fluctuations in blood glucose level on oxidative stress level)
In diabetes, it is known that the level of oxidative stress increases when the fluctuation of blood glucose level increases. Therefore, the relationship between the fluctuation of blood glucose level and the oxidation ratio was examined.
まず、持続血糖計測装置を用いて、糖尿病患者の血糖値を４８時間にわたって測定した。続いて、血糖値の変動の最も正確な指標として、全ての血糖値のデータの標準偏差（４８時間血糖標準偏差）を求めた。 First, the blood glucose level of a diabetic patient was measured over 48 hours using a continuous blood glucose measuring device. Subsequently, the standard deviation (48-hour blood sugar standard deviation) of all blood sugar data was determined as the most accurate index of blood sugar level fluctuation.
続いて、得られた４８時間血糖標準偏差の数値に基づいて、糖尿病患者を、血糖標準偏差低値群（ｎ＝１１）、中間群、高値群（ｎ＝１２）の３群に分類し、低値群と高値群を比較した。 Subsequently, based on the obtained 48-hour blood glucose standard deviation value, diabetic patients are classified into three groups: a blood glucose standard deviation low value group (n = 11), an intermediate group, and a high value group (n = 12), The low value group and high value group were compared.
図２（ａ）は、低値群及び高値群の糖尿病患者の平均血糖値を表すＨｂＡ１ｃ（％）を示すグラフである。また、図２（ｂ）は、低値群及び高値群の糖尿病患者の血清アルブミン（Ｍｅｔ−１１１）の酸化比の測定結果を示すグラフである。図２中、「＊」は相関係数（ｐ値）５％未満で有意差があることを表す。 FIG. 2A is a graph showing HbA1c (%) representing the average blood glucose level of diabetic patients in the low value group and the high value group. Moreover, FIG.2 (b) is a graph which shows the measurement result of the oxidation ratio of serum albumin (Met-111) of the diabetic patient of a low value group and a high value group. In FIG. 2, “*” indicates that there is a significant difference when the correlation coefficient (p value) is less than 5%.
その結果、低値群及び高値群の糖尿病患者の間で、ＨｂＡ１ｃの値には有意差が認められなかったにもかかわらず、高値群では血清アルブミン（Ｍｅｔ−１１１）の酸化比（Ｍｅｔ（Ｏ）／Ｍｅｔ値）が低値群より有意に高値を示すことが明らかとなった。 As a result, the serum albumin (Met-111) oxidation ratio (Met (Ot)) was observed in the high value group, although there was no significant difference in the value of HbA1c between the diabetic patients in the low value group and the high value group. ) / Met value) was significantly higher than the low value group.
以上の結果から、血清アルブミン（Ｍｅｔ−１１１）の酸化比（Ｍｅｔ（Ｏ）／Ｍｅｔ（％））を測定することにより、血糖値の変動による酸化ストレスレベルの上昇も検出することができることが明らかとなった。この結果は、実験例１の方法により、生体の酸化ストレスレベルを正確に測定できることを更に支持するものである。 From the above results, it is clear that by measuring the oxidation ratio of serum albumin (Met-111) (Met (O) / Met (%)), it is possible to detect an increase in oxidative stress level due to fluctuations in blood glucose level. It became. This result further supports that the oxidative stress level of the living body can be accurately measured by the method of Experimental Example 1.
［実験例３］
（メチオニン残基の酸化レベルの安定性の検討１）
メチオニン残基の酸化レベルは多くの実験条件下で変動しやすいと考えられている。そこで、試料中のタンパク質の還元アルキル化工程及び酵素消化工程において、メチオニン残基の酸化レベルが変動するか否かについて検討した。
[Experiment 3]
(Examination of stability of oxidation level of methionine residue 1)
It is believed that the oxidation level of methionine residues is likely to vary under many experimental conditions. Therefore, whether or not the oxidation level of the methionine residue fluctuates in the reductive alkylation step and the enzyme digestion step of the protein in the sample was examined.
モニター用のペプチドとして、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼのトリプシン消化物を使用し、これに含まれる、配列番号６に記載のペプチド及び配列番号７に記載のペプチドを解析の対象とした。 As a monitoring peptide, a tryptic digest of β-galactosidase derived from E. coli was used, and the peptide shown in SEQ ID NO: 6 and the peptide shown in SEQ ID NO: 7 contained therein were analyzed.
β−ガラクトシダーゼのトリプシン消化物を、そのまま、又はヒト血清に血清１μＬあたり２．５μｇ添加し、実験例１と同様にして還元アルキル化及びトリプシン消化した後に、それぞれＬＣ−ＭＳ解析した。 The tryptic digest of β-galactosidase was added as it was or 2.5 μg per 1 μL of serum was added to human serum and subjected to reductive alkylation and trypsin digestion in the same manner as in Experimental Example 1, followed by LC-MS analysis.
図３（ａ）は、β−ガラクトシダーゼのトリプシン消化物を、そのままＬＣ−ＭＳ解析し、酸化状態及び非酸化状態の配列番号９に記載のペプチドを定量した結果を示すＭＳクロマトグラムである。 Fig. 3 (a) is an MS chromatogram showing the results of LC-MS analysis of a tryptic digest of β-galactosidase as it is, and quantifying the peptide of SEQ ID NO: 9 in an oxidized state and a non-oxidized state.
また、図３（ｂ）は、β−ガラクトシダーゼのトリプシン消化物を、血清に添加して還元アルキル化及びトリプシン消化した後にＬＣ−ＭＳ解析し、酸化状態及び非酸化状態の配列番号９に記載のペプチドを定量した結果を示すＭＳクロマトグラムである。 FIG. 3 (b) shows that the tryptic digest of β-galactosidase was added to serum, subjected to reductive alkylation and trypsin digestion, and then subjected to LC-MS analysis. It is MS chromatogram which shows the result of having quantified the peptide.
また、図３（ｃ）は、β−ガラクトシダーゼのトリプシン消化物を、そのままＬＣ−ＭＳ解析し、酸化状態及び非酸化状態の配列番号１０に記載のペプチドを定量した結果を示すＭＳクロマトグラムである。 FIG. 3 (c) is an MS chromatogram showing the result of directly analyzing the tryptic digest of β-galactosidase by LC-MS analysis and quantifying the peptide of SEQ ID NO: 10 in an oxidized state and a non-oxidized state. .
また、図３（ｄ）は、β−ガラクトシダーゼのトリプシン消化物を、血清に添加して還元アルキル化及びトリプシン消化した後にＬＣ−ＭＳ解析し、酸化状態及び非酸化状態の配列番号１０に記載のペプチドを定量した結果を示すＭＳクロマトグラムである。 FIG. 3 (d) shows that the tryptic digest of β-galactosidase was added to serum, subjected to reductive alkylation and trypsin digestion, and then subjected to LC-MS analysis. It is MS chromatogram which shows the result of having quantified the peptide.
図３中、酸化されたメチオニン残基を「（Ｏ）」で示す。また、図３中、酸化されたメチオニン残基を含む各ペプチドのピークの上に、縦軸を１０倍に拡大したピークを示す。
In FIG. 3, the oxidized methionine residue is indicated by “(O)”. Moreover, the peak which expanded the vertical axis |
その結果、図３（ａ）及び図３（ｂ）を比較して、酸化状態と非酸化状態の配列番号９に記載のペプチドのＭＳクロマトグラムのピーク面積の比がほぼ同じであることが明らかとなった。 As a result, comparing FIG. 3 (a) and FIG. 3 (b), it is clear that the ratio of the peak area of the MS chromatogram of the peptide of SEQ ID NO: 9 in the oxidized state and the non-oxidized state is almost the same. It became.
また、同様に、図３（ｃ）及び図３（ｄ）を比較して、酸化状態と非酸化状態の配列番号１０に記載のペプチドのＭＳクロマトグラムのピーク面積の比がほぼ同じであることが明らかとなった。 Similarly, when comparing FIG. 3 (c) and FIG. 3 (d), the ratio of the peak area of the MS chromatogram of the peptide of SEQ ID NO: 10 in the oxidized state and the non-oxidized state is almost the same. Became clear.
この結果から、還元アルキル化工程及び酵素消化工程を含む試料調製工程では、メチオニン残基の酸化レベルがあまり変動しないことが明らかとなった。この結果は、メチオニン残基の酸化レベルは変動しやすいと考えられていることから意外なものであった。この結果は、実験例１の方法により、生体の酸化ストレスレベルを正確に測定できることを更に支持するものである。 From this result, it became clear that the oxidation level of the methionine residue does not vary much in the sample preparation process including the reductive alkylation process and the enzyme digestion process. This result was surprising because the oxidation level of the methionine residue is thought to be variable. This result further supports that the oxidative stress level of the living body can be accurately measured by the method of Experimental Example 1.
［実験例４］
（メチオニン残基の酸化レベルの安定性の検討２）
試料調製時間、血清調製条件、試料の凍結融解により、メチオニン残基の酸化レベルが変動するか否かについて検討した。
[Experimental Example 4]
(Examination of stability of oxidation level of methionine residue 2)
It was examined whether the oxidation level of methionine residue fluctuates depending on sample preparation time, serum preparation conditions, and sample freeze-thawing.
《試料調製時間の検討》
メチオニン残基の酸化比を正確に測定するためには、試料中のタンパク質を完全に酵素消化することが必要である。そこで、４人の健常非喫煙者由来の血清試料のトリプシン消化時間を、１８、２１及び２４時間と変化させた以外は実験例１と同様にして、血清アルブミンの第１１１番目のメチオニン（Ｍｅｔ−１１１）、血清アルブミンの第１４７番目のメチオニン（Ｍｅｔ−１４７）、イムノグロブリンＧの定常領域のメチオニン（イムノグロブリンＧ１のＭｅｔ−１３５、イムノグロブリンＧ２のＭｅｔ−１３１、イムノグロブリンＧ３のＭｅｔ−１８２及びイムノグロブリンＧ４のＭｅｔ−１３２の合計）における、酸化されていないメチオニン残基と酸化されたメチオニン残基との量比（Ｍｅｔ（Ｏ）／Ｍｅｔ（％））（酸化比）をＬＣ−ＭＳ分析により測定した。
<< Examination of sample preparation time >>
In order to accurately measure the oxidation ratio of methionine residues, it is necessary to completely digest the protein in the sample. Therefore, the 111th methionine (Met−) of serum albumin was obtained in the same manner as in Experimental Example 1 except that the trypsin digestion time of serum samples from 4 healthy non-smokers was changed to 18, 21 and 24 hours. 111), 147th methionine of serum albumin (Met-147), methionine of immunoglobulin G constant region (Met-135 of immunoglobulin G1, Met-131 of immunoglobulin G2, Met-182 of immunoglobulin G3, and LC-MS analysis of the amount ratio (Met (O) / Met (%)) (oxidation ratio) of non-oxidized methionine residues to oxidized methionine residues in (total of Met-132 of immunoglobulin G4) It was measured by.
図４（ａ）は、血清アルブミンの第１１１番目のメチオニン（Ｍｅｔ−１１１）、血清アルブミンの第１４７番目のメチオニン（Ｍｅｔ−１４７）及びイムノグロブリンＧの定常領域のメチオニンの酸化比の測定結果を示すグラフである。 FIG. 4 (a) shows the measurement results of the oxidation ratio of the 111th methionine (Met-111) of serum albumin, the 147th methionine (Met-147) of serum albumin, and the methionine in the constant region of immunoglobulin G. It is a graph to show.
その結果、酵素消化時間を変化させても、メチオニン残基の酸化レベルがあまり変動しないことが明らかとなった。 As a result, it became clear that the oxidation level of the methionine residue did not vary much even when the enzyme digestion time was changed.
《血清調製条件の検討》
血清調製時の血液凝固時間を変えることにより、血清中のタンパク質のメチオニン残基の酸化レベルが変動するか否かについて検討した。
<Examination of serum preparation conditions>
It was examined whether or not the oxidation level of methionine residues of proteins in serum varied by changing the blood coagulation time during serum preparation.
６人の健常非喫煙者由来の血液の凝固時間を、０、０．５、１、２及び６時間と変化させて血清試料を調製し、実験例１と同様にして、血清アルブミンの第１１１番目のメチオニン（Ｍｅｔ−１１１）、血清アルブミンの第１４７番目のメチオニン（Ｍｅｔ−１４７）、イムノグロブリンＧの定常領域のメチオニン（イムノグロブリンＧ１のＭｅｔ−１３５、イムノグロブリンＧ２のＭｅｔ−１３１、イムノグロブリンＧ３のＭｅｔ−１８２及びイムノグロブリンＧ４のＭｅｔ−１３２の合計）における、酸化されていないメチオニン残基と酸化されたメチオニン残基との量比（Ｍｅｔ（Ｏ）／Ｍｅｔ（％））（酸化比）をＬＣ−ＭＳ分析により測定した。 Serum samples were prepared by changing the clotting time of blood from six healthy non-smokers to 0, 0.5, 1, 2 and 6 hours. Methionine (Met-111), serum albumin 147th methionine (Met-147), immunoglobulin G constant region methionine (immunoglobulin G1 Met-135, immunoglobulin G2 Met-131, immunoglobulin) Met-182 of G3 and Met-132 of immunoglobulin G4) (Met (O) / Met (%)) (oxidation ratio) of unoxidized methionine residue and oxidized methionine residue ) Was measured by LC-MS analysis.
図４（ｂ）は、血清アルブミンの第１１１番目のメチオニン（Ｍｅｔ−１１１）、血清アルブミンの第１４７番目のメチオニン（Ｍｅｔ−１４７）及びイムノグロブリンＧの定常領域のメチオニンの酸化比の測定結果を示すグラフである。 FIG. 4B shows the measurement results of the oxidation ratio of the 111th methionine of serum albumin (Met-111), the 147th methionine of serum albumin (Met-147), and the methionine in the constant region of immunoglobulin G. It is a graph to show.
その結果、血清調製時の血液凝固時間を変化させても、メチオニン残基の酸化レベルがあまり変動しないことが明らかとなった。 As a result, it became clear that the oxidation level of the methionine residue did not vary much even when the blood clotting time during serum preparation was changed.
《試料の凍結融解の検討》
試料を繰り返し凍結融解することにより、血清中のタンパク質のメチオニン残基の酸化レベルが変動するか否かについて検討した。
<< Examination of Freezing and Thawing of Sample >>
It was examined whether the oxidation level of methionine residues of proteins in serum was changed by repeatedly freezing and thawing samples.
４人の健常非喫煙者由来の血清試料を、０、１及び４回凍結融解し、実験例１と同様にして、血清アルブミンの第１１１番目のメチオニン（Ｍｅｔ−１１１）、血清アルブミンの第１４７番目のメチオニン（Ｍｅｔ−１４７）、イムノグロブリンＧの定常領域のメチオニン（イムノグロブリンＧ１のＭｅｔ−１３５、イムノグロブリンＧ２のＭｅｔ−１３１、イムノグロブリンＧ３のＭｅｔ−１８２及びイムノグロブリンＧ４のＭｅｔ−１３２の合計）における、酸化されていないメチオニン残基と酸化されたメチオニン残基との量比（Ｍｅｔ（Ｏ）／Ｍｅｔ（％））（酸化比）をＬＣ−ＭＳ分析により測定した。 Serum samples from 4 healthy non-smokers were frozen and thawed 0, 1 and 4 times, and in the same manner as in Experimental Example 1, the 111th methionine of serum albumin (Met-111), the 147th of serum albumin The second methionine (Met-147), the constant region methionine of immunoglobulin G (Met-135 of immunoglobulin G1, Met-131 of immunoglobulin G2, Met-182 of immunoglobulin G3 and Met-132 of immunoglobulin G4). The amount ratio (Met (O) / Met (%)) (oxidation ratio) of non-oxidized methionine residues to oxidized methionine residues was measured by LC-MS analysis.
図４（ｃ）は、血清アルブミンの第１１１番目のメチオニン（Ｍｅｔ−１１１）、血清アルブミンの第１４７番目のメチオニン（Ｍｅｔ−１４７）及びイムノグロブリンＧの定常領域のメチオニンの酸化比の測定結果を示すグラフである。 FIG. 4 (c) shows the measurement results of the oxidation ratio of the 111th methionine of serum albumin (Met-111), the 147th methionine of serum albumin (Met-147), and the methionine in the constant region of immunoglobulin G. It is a graph to show.
その結果、試料の凍結融解を繰り返しても、メチオニン残基の酸化レベルがあまり変動しないことが明らかとなった。 As a result, it was revealed that the oxidation level of the methionine residue did not vary much even when the sample was repeatedly freeze-thawed.
以上の結果は、様々な条件下においても生体試料中のタンパク質のメチオニン残基の酸化レベルがあまり変動しないことを更に支持するものである。この結果は、メチオニン残基の酸化レベルは変動しやすいと考えられていることから意外なものであった。この結果は、実験例１の方法により、生体の酸化ストレスレベルを正確に測定できることを更に支持するものである。 The above results further support that the oxidation level of the methionine residue of the protein in the biological sample does not vary greatly even under various conditions. This result was surprising because the oxidation level of the methionine residue is thought to be variable. This result further supports that the oxidative stress level of the living body can be accurately measured by the method of Experimental Example 1.
［実験例５］
（メチオニン残基の酸化レベルの安定性の検討３）
採血時間、喫煙、ビタミンＣの摂取により、血清試料中のメチオニン残基の酸化レベルが変動するか否かについて検討した。
[Experimental Example 5]
(Examination of stability of oxidation level of methionine residue 3)
It was examined whether the oxidation level of methionine residues in serum samples varies depending on blood sampling time, smoking, and vitamin C intake.
《採血時間の検討》
４人の健常非喫煙者から、１日に９回（午前３時、午前６時、午前７時、午前８時、午前９時、午後４時、午後６時、午後８時及び午後１１時）採血して血清試料を調製し、実験例１と同様にして、血清アルブミンの第１１１番目のメチオニン（Ｍｅｔ−１１１）、血清アルブミンの第１４７番目のメチオニン（Ｍｅｔ−１４７）、イムノグロブリンＧの定常領域のメチオニン（イムノグロブリンＧ１のＭｅｔ−１３５、イムノグロブリンＧ２のＭｅｔ−１３１、イムノグロブリンＧ３のＭｅｔ−１８２及びイムノグロブリンＧ４のＭｅｔ−１３２の合計）における、酸化されていないメチオニン残基と酸化されたメチオニン残基との量比（Ｍｅｔ（Ｏ）／Ｍｅｔ（％））（酸化比）をＬＣ−ＭＳ分析により測定した。
<Examination of blood sampling time>
9 times a day from 4 healthy non-smokers (3 am, 6 am, 7 am, 8 am, 9 am, 4 pm, 6 pm, 8 pm and 11 pm ) Blood samples were collected to prepare serum samples, and in the same manner as in Experimental Example 1, serum albumin 111th methionine (Met-111), serum albumin 147th methionine (Met-147), immunoglobulin G Non-oxidized methionine residue and oxidation in constant region methionine (Met-135 of immunoglobulin G1, Met-131 of immunoglobulin G2, Met-182 of immunoglobulin G3 and Met-132 of immunoglobulin G4) The quantitative ratio (Met (O) / Met (%)) (oxidation ratio) to the methionine residue was measured by LC-MS analysis.
図５（ａ）は、血清アルブミンの第１１１番目のメチオニン（Ｍｅｔ−１１１）、血清アルブミンの第１４７番目のメチオニン（Ｍｅｔ−１４７）及びイムノグロブリンＧの定常領域のメチオニンの酸化比の測定結果を示すグラフである。 FIG. 5 (a) shows the measurement results of the oxidation ratio of the 111th methionine (Met-111) of serum albumin, the 147th methionine (Met-147) of serum albumin, and the methionine of the constant region of immunoglobulin G. It is a graph to show.
その結果、メチオニン残基の酸化レベルが日内であまり変動しないことが明らかとなった。 As a result, it became clear that the oxidation level of the methionine residue does not vary much within the day.
《喫煙の検討》
６人の健常喫煙者から、喫煙直前、喫煙後１５分、喫煙後３０分及び喫煙後６０分に採血して血清試料を調製し、実験例１と同様にして、血清アルブミンの第１１１番目のメチオニン（Ｍｅｔ−１１１）、血清アルブミンの第１４７番目のメチオニン（Ｍｅｔ−１４７）、イムノグロブリンＧ１の定常領域の第１３５番目のメチオニン（Ｍｅｔ−１３５）における、酸化されていないメチオニン残基と酸化されたメチオニン残基との量比（Ｍｅｔ（Ｏ）／Ｍｅｔ（％））（酸化比）をＬＣ−ＭＳ分析により測定した。
《Consideration of smoking》
Serum samples were prepared from 6 healthy smokers immediately before smoking, 15 minutes after smoking, 30 minutes after smoking, and 60 minutes after smoking to prepare serum samples. Oxidized with unoxidized methionine residues in methionine (Met-111), 147th methionine (Met-147) of serum albumin, and 135th methionine (Met-135) of immunoglobulin G1 constant region The amount ratio (Met (O) / Met (%)) (oxidation ratio) to methionine residue was measured by LC-MS analysis.
図５（ｂ）は、血清アルブミンの第１１１番目のメチオニン（Ｍｅｔ−１１１）、血清アルブミンの第１４７番目のメチオニン（Ｍｅｔ−１４７）及びイムノグロブリンＧの定常領域のメチオニン（イムノグロブリンＧ１のＭｅｔ−１３５、イムノグロブリンＧ２のＭｅｔ−１３１、イムノグロブリンＧ３のＭｅｔ−１８２及びイムノグロブリンＧ４のＭｅｔ−１３２の合計）の酸化比の測定結果を示すグラフである。図５（ｂ）中、矢印は喫煙した時間を示す。 FIG. 5 (b) shows the 111th methionine of serum albumin (Met-111), the 147th methionine of serum albumin (Met-147), and the methionine of the constant region of immunoglobulin G (Met- of immunoglobulin G1). 135 is a graph showing the measurement results of the oxidation ratio of Met-131 of immunoglobulin G2, Met-182 of immunoglobulin G3, and Met-132 of immunoglobulin G4). In FIG.5 (b), the arrow shows the time which smoked.
その結果、喫煙によりメチオニン残基の酸化レベルがあまり急激には変動しないことが明らかとなった。 As a result, it became clear that the oxidation level of methionine residues did not change very rapidly by smoking.
《ビタミンＣの摂取の検討》
６人の健常非喫煙者に１０００ｍｇのビタミンＣを含有するタブレットを１日１個、４日間摂取させ、ビタミンＣの摂取開始の直前、摂取開始の２、４、６、２４及び９６時間後に採血して血清試料を調製し、実験例１と同様にして、血清アルブミンの第１１１番目のメチオニン（Ｍｅｔ−１１１）、血清アルブミンの第１４７番目のメチオニン（Ｍｅｔ−１４７）、イムノグロブリンＧの定常領域のメチオニン（イムノグロブリンＧ１のＭｅｔ−１３５、イムノグロブリンＧ２のＭｅｔ−１３１、イムノグロブリンＧ３のＭｅｔ−１８２及びイムノグロブリンＧ４のＭｅｔ−１３２の合計）における、酸化されていないメチオニン残基と酸化されたメチオニン残基との量比（Ｍｅｔ（Ｏ）／Ｍｅｔ（％））（酸化比）をＬＣ−ＭＳ分析により測定した。
<Examination of vitamin C intake>
Six healthy non-smokers were allowed to take a tablet containing 1000 mg of vitamin C once a day for 4 days, and blood was collected immediately before the start of vitamin C intake, 2, 4, 6, 24 and 96 hours after the start of intake. A serum sample was prepared, and in the same manner as in Experimental Example 1, the 111th methionine of serum albumin (Met-111), the 147th methionine of serum albumin (Met-147), and the constant region of immunoglobulin G Of methionine (the sum of Met-135 of immunoglobulin G1, Met-131 of immunoglobulin G2, Met-182 of immunoglobulin G3 and Met-132 of immunoglobulin G4) was oxidized with an unoxidized methionine residue. The amount ratio (Met (O) / Met (%)) (oxidation ratio) to methionine residue was determined by LC-MS analysis. It was measured.
図５（ｃ）は、血清アルブミンの第１１１番目のメチオニン（Ｍｅｔ−１１１）、血清アルブミンの第１４７番目のメチオニン（Ｍｅｔ−１４７）及びイムノグロブリンＧの定常領域のメチオニンの酸化比の測定結果を示すグラフである。図５（ｃ）中、矢印はビタミンＣを１０００ｍｇ摂取した時間を示す。 FIG. 5 (c) shows the measurement results of the oxidation ratio of the 111th methionine (Met-111) of serum albumin, the 147th methionine (Met-147) of serum albumin, and the methionine of the constant region of immunoglobulin G. It is a graph to show. In FIG.5 (c), the arrow shows the time which 1000 mg of vitamin C was ingested.
その結果、ビタミンＣの摂取によりメチオニン残基の酸化レベルがあまり急激には変動しないことが明らかとなった。 As a result, it was revealed that the level of oxidation of methionine residues does not fluctuate very rapidly by ingestion of vitamin C.
以上の結果は、様々な条件下においても生体試料中のタンパク質のメチオニン残基の酸化レベルがあまり変動しないことを更に支持するものである。この結果は、メチオニン残基の酸化レベルは変動しやすいと考えられていることから意外なものであった。この結果は、実験例１の方法により、生体の酸化ストレスレベルを正確に測定できることを更に支持するものである。 The above results further support that the oxidation level of the methionine residue of the protein in the biological sample does not vary greatly even under various conditions. This result was surprising because the oxidation level of the methionine residue is thought to be variable. This result further supports that the oxidative stress level of the living body can be accurately measured by the method of Experimental Example 1.
［実験例６］
（生体試料中の対象タンパク質の酸化されたメチオニン残基の定量分析）
健常非喫煙者の血清を対象に、血清アルブミンの第１１１番目のメチオニン（Ｍｅｔ−１１１）、血清アルブミンの第１４７番目のメチオニン（Ｍｅｔ−１４７）における、酸化されたメチオニン残基の濃度を、酸化された上記のメチオニン残基を含む安定同位体標識ペプチドを内部標準として利用してＬＣ−ＭＳ分析により測定した。
[Experimental Example 6]
(Quantitative analysis of oxidized methionine residues of target proteins in biological samples)
For the serum of healthy non-smokers, the concentration of oxidized methionine residue in the 111th methionine of serum albumin (Met-111) and the 147th methionine of serum albumin (Met-147) The stable isotope-labeled peptide containing the above methionine residue was used as an internal standard and measured by LC-MS analysis.
内部標準用のペプチドとして、配列番号６に記載のペプチドの第１１番目のアラニン残基及び第１２番目のリジン残基の全ての炭素原子並びに窒素原子を安定同位体原子（１３Ｃ及び１５Ｎ）に置換した安定同位体標識ペプチド、及び配列番号７に記載のペプチドに含まれる２つのフェニルアラニン残基の全ての炭素原子及び窒素原子を安定同位体原子（１３Ｃ及び１５Ｎ）に置換した安定同位体標識ペプチドを調製した。 As the peptide for internal standard, all the carbon atoms and nitrogen atoms of the 11th alanine residue and the 12th lysine residue of the peptide shown in SEQ ID NO: 6 are stable isotope atoms ( 13 C and 15 N). And a stable isotope in which all the carbon atoms and nitrogen atoms of two phenylalanine residues contained in the peptide of SEQ ID NO: 7 are substituted with stable isotope atoms ( 13 C and 15 N). Body labeled peptides were prepared.
血清を実験例１と同様にして還元アルキル化及びトリプシン消化した後に、上述した２種類の安定同位体標識ペプチドを血清１μＬあたり１００ｐｍｏｌ（配列番号６）又は２００ｐｍｏｌ（配列番号７）添加した。すなわち、血清中の濃度がそれぞれ１００μＭ又は２００μＭとなるように添加し、実験例１と同様にして、界面活性剤の除去処理を行った後にＬＣ−ＭＳ分析した。 After the serum was reductively alkylated and digested with trypsin in the same manner as in Experimental Example 1, 100 pmol (SEQ ID NO: 6) or 200 pmol (SEQ ID NO: 7) of the above-mentioned two kinds of stable isotope-labeled peptides were added per 1 μL of serum. That is, it added so that the density | concentration in serum might be 100 micromol or 200 micromol, respectively, It carried out similarly to Experimental example 1, and performed LC-MS analysis after performing the removal process of surfactant.
図６（ａ）は、血清中に存在していた、酸化されたメチオニン残基を含む配列番号６のペプチドのＭＳクロマトグラムである。また、図６（ｂ）は、内部標準として血清中の濃度が１００μＭとなるように血清に添加した、酸化されたメチオニン残基を含む配列番号６の安定同位体標識ペプチドのＭＳクロマトグラムである。図６（ａ）のＭＳクロマトグラムのピークは、図６（ｂ）のＭＳクロマトグラムのピークに比べて非常に強度が小さかったため、図６（ａ）のピークの上に、縦軸を２０倍に拡大したピークを示した。 FIG. 6 (a) is an MS chromatogram of the peptide of SEQ ID NO: 6 containing an oxidized methionine residue that was present in serum. FIG. 6B is an MS chromatogram of the stable isotope-labeled peptide of SEQ ID NO: 6 containing an oxidized methionine residue added to the serum so that the concentration in the serum becomes 100 μM as an internal standard. . Since the peak of the MS chromatogram in FIG. 6 (a) was much less intense than the peak of the MS chromatogram in FIG. 6 (b), the vertical axis was 20 times above the peak in FIG. 6 (a). Shows an enlarged peak.
また、図６（ｃ）は、血清中に存在していた、酸化されたメチオニン残基を含む配列番号７のペプチドのＭＳクロマトグラムである。また、図６（ｄ）は、内部標準として血清中の濃度が２００μＭとなるように血清に添加した、酸化されたメチオニン残基を含む配列番号７の安定同位体標識ペプチドのＭＳクロマトグラムである。図６（ｃ）のＭＳクロマトグラムのピークは、図６（ｄ）に比べて非常に強度が小さかったため、図６（ｃ）のピークの上に、縦軸を４０倍に拡大したピークを示した。 FIG. 6 (c) is an MS chromatogram of the peptide of SEQ ID NO: 7 containing an oxidized methionine residue present in serum. FIG. 6D is an MS chromatogram of the stable isotope-labeled peptide of SEQ ID NO: 7 containing an oxidized methionine residue added to the serum so that the concentration in the serum becomes 200 μM as an internal standard. . Since the intensity of the MS chromatogram peak in FIG. 6 (c) was much smaller than that in FIG. 6 (d), the peak of the vertical axis was expanded 40 times above the peak in FIG. 6 (c). It was.
その結果、図６（ａ）及び図６（ｂ）を比較して、配列番号６のペプチドと配列番号６の安定同位体標識ペプチドのＭＳクロマトグラムのピーク面積の比から、酸化されたＭｅｔ−１１１を含むトリプシン消化血清アルブミン由来ペプチドの血清中の濃度が、約２．７μＭであることが明らかとなった。 As a result, comparing FIG. 6 (a) and FIG. 6 (b), the ratio of the peak area in the MS chromatogram of the peptide of SEQ ID NO: 6 and the stable isotope-labeled peptide of SEQ ID NO: 6 It was revealed that the concentration of trypsin-digested serum albumin-derived peptide containing 111 in the serum was about 2.7 μM.
また、図６（ｃ）及び図６（ｄ）を比較して、配列番号７のペプチドと配列番号７の安定同位体標識ペプチドのＭＳクロマトグラムのピーク面積の比から、酸化されたＭｅｔ−１４７を含むトリプシン消化血清アルブミン由来ペプチドの血清中の濃度が、約１．３μＭであることが明らかとなった。 In addition, comparing FIG. 6 (c) and FIG. 6 (d), from the ratio of the peak area of the MS chromatogram of the peptide of SEQ ID NO: 7 and the stable isotope-labeled peptide of SEQ ID NO: 7, the oxidized Met-147 It was revealed that the concentration of the trypsin-digested serum albumin-derived peptide containing 1 in the serum was about 1.3 μM.
この結果から、酸化されたＭｅｔ−１１１及びＭｅｔ−１４７を含むそれぞれのトリプシン消化血清アルブミン由来ペプチドの濃度が明らかとなった。この結果は、酸化されたメチオニン残基の絶対量を求めるものであり、実験例１〜実験例５で示した、酸化されていないメチオニン残基と酸化されたメチオニン残基との量比を求める実験とは異なり、生体の酸化ストレスレベルをより直接的に測定することが可能であることを示すものである。 This result revealed the concentration of each trypsin-digested serum albumin-derived peptide containing oxidized Met-111 and Met-147. This result is to obtain the absolute amount of the oxidized methionine residue, and the amount ratio of the unoxidized methionine residue to the oxidized methionine residue shown in Experimental Examples 1 to 5 is obtained. Unlike the experiment, it shows that the oxidative stress level of the living body can be measured more directly.
本発明により、生体の酸化ストレスレベルを正確に測定する技術を提供することができる。 The present invention can provide a technique for accurately measuring the oxidative stress level of a living body.
Claims (15)
前記量比又は前記濃度が、前記被験者の酸化ストレスレベルを示す、前記被験者の酸化ストレスレベルの測定方法。 For a target methionine residue of a target protein in a biological sample derived from a subject, a step of measuring a quantitative ratio of an unoxidized methionine residue to an oxidized methionine residue or a concentration of an oxidized methionine residue is provided. ,
The method for measuring the oxidative stress level of the subject, wherein the quantitative ratio or the concentration indicates the oxidative stress level of the subject.
前記量比又は前記濃度が、前記被験物質の投与下及び非投与下で有意に異なる場合に、前記被験物質は生体の酸化ストレスレベルに影響を与える物質であると判定する工程と、
を備える、生体の酸化ストレスレベルに影響を与える物質のスクリーニング方法。 For the target methionine residues of the target protein in biological samples collected from subjects with and without the test substance administered, the quantitative ratio of oxidized methionine residues to oxidized methionine residues, or oxidation Measuring the concentration of the generated methionine residue;
Determining that the test substance is a substance that affects the level of oxidative stress in a living body when the quantitative ratio or the concentration is significantly different between administration and non-administration of the test substance;
A screening method for a substance that affects the oxidative stress level of a living body.
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