JP2018085954A - Method of producing plastic substrate and blood sample - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a technology with which a malaria parasite can be detected without being an expert in an environment without expensive equipment.SOLUTION: Provided is a plastic substrate for observation of a malaria parasite in blood having a contact angle of 7 to 42° when blood with a hematocrit value of 1% is placed thereon.SELECTED DRAWING: None

Description

本発明は、プラスチック基材及び血液標本の作製方法に関する。   The present invention relates to a plastic substrate and a blood specimen preparation method.

マラリアはハマダラカを媒体として人体に注入されたマラリア原虫に感染して発病する感染症であり、ヒトに感染するマラリア原虫には熱帯熱マラリア原虫（Ｐ． ｆａｌｃｉｐａｒｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐ．ｖｉｖａｘ）、四日熱マラリア原虫（Ｐ． ｍａｌａｒｉａｅ）、卵形マラリア原虫（Ｐ．ｏｖａｌｅ）の４種類があり、世界中で年間３〜５億人がマラリアに罹患し、死者１５０〜２７０万人と推定されている。   Malaria is an infectious disease that develops by infecting malaria parasites injected into the human body using anopheles as a medium. The malaria parasites that infect humans include P. falciparum and P. falciparum (P. falciparum). vivax), P. malariae, and oval malaria parasite (P. ovale), with 3 to 500 million people suffering from malaria annually worldwide, and 1.5 to 2.7 million deaths It is estimated that.

マラリア感染症に対しては、重篤症状を回避するため早期発見・早期治療が重要である。マラリアの診断は、血液塗抹標本を光学顕微鏡で観察することにより行われるが、従来の血液塗抹標本では、赤血球の凝集がなくマラリア原虫を観察できる部分が少なく、また、赤血球の形状が細長くなり、マラリア原虫の種類と感染率を正確に検出するために熟練が必要であった。   For malaria infection, early detection and treatment are important to avoid serious symptoms. Diagnosis of malaria is performed by observing a blood smear with an optical microscope, but in conventional blood smears, there are few portions where malaria parasites can be observed without aggregation of red blood cells, and the shape of red blood cells becomes elongated, Skill was required to accurately detect the type and infection rate of malaria parasites.

特許文献１は、マラリア原虫の存在の有無を判定する方法と装置を開示する。   Patent Document 1 discloses a method and apparatus for determining the presence or absence of a malaria parasite.

特開2007-24844JP2007-24844

マラリアはアフリカが主な発生地域であるので、複雑な装置を使用せず、簡便かつ安価な検査法が求められている。   Since malaria is a major outbreak region in Africa, there is a need for a simple and inexpensive test method that does not use complicated equipment.

本発明は、高価な装置のない環境下で熟練者でなくても容易にマラリア原虫を検出できる技術を提供することを目的とする。   An object of this invention is to provide the technique which can detect the malaria parasite easily even if it is not an expert in the environment without an expensive apparatus.

本発明は、以下のプラスチック基材及び血液標本の作製方法を提供するものである。
項１． ヘマトクリット値１％の血液を載せたときの接触角が７〜４２°である、血液中のマラリア原虫観察用のプラスチック基材。
項２． 前記基材が透明基材である、項１に記載のプラスチック基材。
項３． プラスチックがポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレートなどのポリエステル、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ABS樹脂、アクリル、ポリアミド、ポリカーボネート、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂からなる群から選ばれる、項１又は２に記載の透明樹脂。
項４． 以下の工程１〜４を含む、マラリア原虫観察用の血液標本の作製方法：
工程１：項１〜３のいずれかに記載のプラスチック基材に血液サンプルを適用する工程、
工程２：工程１で得られたプラスチック基材を含水アルコール溶液に接触させて重層した赤血球を除去する工程、
工程３：工程２で得られたプラスチック基材を乾燥後、赤血球を固定する工程、
工程４：固定された赤血球を染色する工程。 The present invention provides the following plastic substrate and blood specimen preparation method.
Item 1. A plastic substrate for observing malaria parasites in blood having a contact angle of 7 to 42 ° when blood having a hematocrit value of 1% is placed thereon.
Item 2. Item 2. The plastic substrate according to Item 1, wherein the substrate is a transparent substrate.
Item 3. Item 3. The transparent according to Item 1 or 2, wherein the plastic is selected from the group consisting of polyester such as polyethylene, polypropylene, polyethylene terephthalate, polyvinyl chloride, polystyrene, ABS resin, acrylic, polyamide, polycarbonate, phenol resin, melamine resin, and epoxy resin. resin.
Item 4. A method for preparing a blood specimen for observing protozoan malaria, including the following steps 1 to 4:
Step 1: applying a blood sample to the plastic substrate according to any one of Items 1 to 3,
Step 2: A step of removing the layered red blood cells by bringing the plastic substrate obtained in Step 1 into contact with a hydrous alcohol solution,
Step 3: A step of fixing red blood cells after drying the plastic substrate obtained in Step 2,
Step 4: Staining fixed red blood cells.

本発明のプラスチック基材は、マラリア原虫を観察可能な領域が広く、赤血球が球形であるのでマラリア原虫の鑑別が容易であり、感染率が低い感染者の原虫の発見が容易になる。   The plastic substrate of the present invention has a wide area in which malaria parasites can be observed, and since red blood cells are spherical, it is easy to distinguish malaria parasites, and it is easy to find protozoa of infected persons with low infection rates.

マラリア原虫観察用の血液標本の１つの作製方法を示す。One method for preparing a blood sample for observation of Plasmodium is shown. スライドガラスと本発明のプラスチック基材を用いた標本の比較Comparison of specimens using slide glass and plastic substrate of the present invention 接触角の異なるプラスチック基材の結果を示す。The results for plastic substrates with different contact angles are shown. 本発明のプラズマ処理されたプラスチック基材を用いた結果を示す。矢印は赤血球に寄生するマラリア原虫を示す。2 shows results using a plasma treated plastic substrate of the present invention. The arrow indicates a malaria parasite that parasitizes red blood cells.

本明細書において、基材を構成するプラスチックとしては、透明なプラスチックが好ましい。透明なプラスチックとしては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレートなどのポリエステル、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ABS樹脂、アクリル、ポリアミド、ポリカーボネート、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂が挙げられる。   In the present specification, a transparent plastic is preferable as the plastic constituting the substrate. Examples of the transparent plastic include polyester such as polyethylene, polypropylene, and polyethylene terephthalate, polyvinyl chloride, polystyrene, ABS resin, acrylic, polyamide, polycarbonate, phenol resin, melamine resin, and epoxy resin.

プラスチック基材は、必要に応じて表面を親水化処理することができる。親水化処理としては、プラズマ処理、紫外線処理、電子線処理などの物理的処理、親水性物質のコーティング、オゾン処理などの化学的処理が挙げられる。親水性物質としては、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリウレタン、アクリル酸およびメタクリル酸のホモポリマーおよびコポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、マレイン酸無水物系コポリマー、ポリエチレンイミン、ポリエチレンオキシド、ポリ（カルボン酸）、ポリホスファゼン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヘパリン、デキストラン、コラーゲン、フィブリン、エラスチン、キトサン、ヒアルロン酸、アルギン酸、ゼラチン、キチン、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリカプロラクトン、コラーゲン、アルブミンなどが挙げられる。   The surface of the plastic substrate can be subjected to a hydrophilic treatment as necessary. Examples of the hydrophilic treatment include physical treatment such as plasma treatment, ultraviolet treatment, and electron beam treatment, coating of a hydrophilic substance, and chemical treatment such as ozone treatment. Examples of hydrophilic substances include polyvinylpyrrolidone (PVP), polyurethane, homopolymers and copolymers of acrylic acid and methacrylic acid, polyvinyl alcohol, polyvinyl ether, maleic anhydride copolymer, polyethyleneimine, polyethylene oxide, poly (carboxylic acid), Polyphosphazene, methylcellulose, carboxymethylcellulose, hydroxymethylcellulose, hydroxypropylcellulose, heparin, dextran, collagen, fibrin, elastin, chitosan, hyaluronic acid, alginic acid, gelatin, chitin, polylactide, polyglycolide, polycaprolactone, collagen, albumin, etc. It is done.

本発明の基材は、ヘマトクリット値１％の血液を載せたときの接触角が７〜４２°、好ましくは８〜３８°、より好ましくは１０〜３１°である。   The base material of the present invention has a contact angle of 7 to 42 °, preferably 8 to 38 °, more preferably 10 to 31 ° when blood having a hematocrit value of 1% is placed thereon.

本発明の基材は顕微鏡観察されるので、平らな基材が好ましい。基材の形状は特に限定されないが、例えばスライドガラスのような長方形の基材が好ましい。   Since the substrate of the present invention is observed with a microscope, a flat substrate is preferred. Although the shape of a base material is not specifically limited, For example, a rectangular base material like a slide glass is preferable.

本発明のマラリア原虫観察用の血液標本の作製方法の一例を図１に示す。
（１）プラスチック基材の親水化処理
プラスチック基材は、適度は親水性を有するプラスチックで構成している場合には親水化処理は必ずしも必要ないが、プラスチックの表面が疎水性の場合、親水化処理を行うことが好ましい。親水化処理は、酸素プラズマなどのプラズマ処理、ＵＶ処理、電子線処理などの物理的処理が好ましい。親水化処理は、基材表面の水（ヘマトクリット値１％の血液）の接触角が適切な範囲になるように行う。
（２）血液サンプルのプラスチック基材への適用
本発明のプラスチック基材は、適切な親水性を有しているので、血液サンプルを適用すると基材表面で広がり、広範囲でのマラリア原虫の観察が可能である。血液サンプルは、スポイド、ピペットなどによりプラスチック基材に適用することができる。血液サンプルは、血液を希釈せずに用いてもよいが、好ましくは希釈した血液サンプルを使用する。血液サンプルのヘマトクリット値は、５〜０．１％程度、好ましくは３〜０．５％程度、より好ましくは１％程度である。血液の希釈には、水、生理食塩水、緩衝液、細胞培養液などを用いることができる。ヒトの血液のヘマトクリット値は、３０〜５５％程度であるので、血液サンプルは、１０〜１００倍程度、好ましくは３０倍〜５０倍程度に希釈してプラスチック基材に適用するのが好ましい。
（３）洗浄処理
血液サンプルをプラスチック基材に適用することで、血液サンプルは拡散し、赤血球は基材表面に接着する。血液サンプルは、基材に接着していない赤血球を含み、この余分な赤血球が重層することで顕微鏡観察によるマラリア原虫の検出を妨げるので、重層した赤血球を除去する洗浄処理を行う。洗浄処理後には、重層した赤血球は除去され、単層で非凝集の赤血球がプラスチック基材上に残ることになる。 An example of a method for preparing a blood sample for observation of Plasmodium according to the present invention is shown in FIG.
(1) Hydrophilization treatment of plastic substrate The plastic substrate is not necessarily required to be hydrophilic when it is made of moderately hydrophilic plastic, but is hydrophilic when the plastic surface is hydrophobic. It is preferable to carry out the treatment. The hydrophilic treatment is preferably a plasma treatment such as oxygen plasma, a physical treatment such as UV treatment or electron beam treatment. The hydrophilization treatment is performed so that the contact angle of water (blood having a hematocrit value of 1%) on the substrate surface falls within an appropriate range.
(2) Application of blood sample to plastic substrate Since the plastic substrate of the present invention has appropriate hydrophilicity, it spreads on the surface of the substrate when a blood sample is applied, and observation of malaria parasites in a wide range is possible. Is possible. The blood sample can be applied to the plastic substrate with a spoid, pipette or the like. The blood sample may be used without diluting the blood, but preferably a diluted blood sample is used. The hematocrit value of the blood sample is about 5 to 0.1%, preferably about 3 to 0.5%, more preferably about 1%. For dilution of blood, water, physiological saline, buffer solution, cell culture solution or the like can be used. Since the hematocrit value of human blood is about 30 to 55%, the blood sample is preferably diluted to about 10 to 100 times, preferably about 30 to 50 times and applied to the plastic substrate.
(3) Washing treatment By applying the blood sample to the plastic substrate, the blood sample diffuses and the red blood cells adhere to the substrate surface. The blood sample contains red blood cells that are not adhered to the base material, and the excess red blood cells are layered to prevent the detection of malaria parasites by microscopic observation. Therefore, a washing process is performed to remove the layered red blood cells. After the washing treatment, the layered red blood cells are removed, and monolayered, non-aggregated red blood cells remain on the plastic substrate.

洗浄処理は、含水アルコール溶液にプラスチック基材を接触させることにより行うことができる。含水アルコール溶液とプラスチック基材の接触は、プラスチック基材上に含水アルコールをピペットなどで供給し、余分な赤血球を流出させることで行ってもよいが、好ましくは赤血球が付着したプラスチック基材を含水アルコール溶液に浸漬することが好ましい。浸漬時間は特に限定されないが、例えば３〜３０秒程度、好ましくは５〜２０秒程度であり、浸漬温度は、室温〜４０℃程度が好ましい。   The washing treatment can be performed by bringing a plastic substrate into contact with the hydrous alcohol solution. The contact between the hydrous alcohol solution and the plastic substrate may be performed by supplying the hydrous alcohol onto the plastic substrate with a pipette or the like and allowing excess red blood cells to flow out. It is preferable to immerse in an alcohol solution. Although immersion time is not specifically limited, For example, about 3 to 30 second, Preferably it is about 5 to 20 second, and immersion temperature has preferable room temperature to about 40 degreeC.

含水アルコールのアルコール濃度は５〜２０容量％程度、好ましくは１０容量％程度である。アルコールとしては、メタノール、エタノール、イソプロパノールなどの低級アルコールが挙げられ、好ましくはエタノールである。   The alcohol concentration of the hydrous alcohol is about 5 to 20% by volume, preferably about 10% by volume. Examples of the alcohol include lower alcohols such as methanol, ethanol and isopropanol, and ethanol is preferred.

含水アルコール溶液はこれらアルコールと水、生理食塩水などの溶液であってもよく、アルコールと緩衝液（クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液など）、細胞培養液（D-MEM、E-MEM、RPMI 1640など）を含む溶液であってもよい。
（４）乾燥処理
洗浄処理で得られたプラスチック基材は、乾燥処理し、基材に赤血球を結合させて次の固定処理で赤血球が剥がれないようにする。乾燥処理では、水分をできるだけ蒸発させる。乾燥処理は、例えばドライヤーの熱風を送り、速やかに乾燥させる。ドライヤーを用いた熱風処理の時間は、２０〜６０秒程度、好ましくは２０〜４０秒程度である。
（５）固定処理
乾燥されたプラスチック基材は、赤血球の固定処理を行う。固定処理は、アルデヒド（グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒドなど）、アルコール（メタノール、エタノール、イソプロパノールなど）、酢酸、アセトンなどの固定剤を用いて行うことができる。固定剤は、１種単独でもよく、２種以上を混合してもよい。固定処理は、プラスチック基材を固定剤の溶液に浸漬して行うことができる。固定処理は、１〜５分程度で行うことができる。
（６）染色処理
染色処理としては、ギムザ染色、ロマノフスキー染色、ライト染色、メイギムザ染色、ライトギムザ染色、ペルオキシターザ染色などが挙げられ、ギムザ染色が好ましい。 The hydrous alcohol solution may be a solution of these alcohol and water, physiological saline, etc., alcohol and buffer solution (citrate buffer solution, phosphate buffer solution, Tris-HCl buffer solution, etc.), cell culture solution (D-MEM , E-MEM, RPMI 1640, etc.).
(4) Drying treatment The plastic substrate obtained by the washing treatment is dried, and erythrocytes are bound to the substrate so that the erythrocytes are not detached in the subsequent fixing treatment. In the drying process, water is evaporated as much as possible. In the drying process, for example, hot air from a dryer is sent and dried quickly. The hot air treatment time using a dryer is about 20 to 60 seconds, preferably about 20 to 40 seconds.
(5) Fixing treatment The dried plastic substrate is subjected to red blood cell fixing treatment. The fixing treatment can be performed using a fixing agent such as aldehyde (glutaraldehyde, formaldehyde, etc.), alcohol (methanol, ethanol, isopropanol, etc.), acetic acid, acetone or the like. One fixing agent may be used alone, or two or more fixing agents may be mixed. The fixing treatment can be performed by immersing the plastic substrate in a fixing agent solution. The fixing process can be performed in about 1 to 5 minutes.
(6) Dyeing treatment Examples of the dyeing treatment include Giemsa dyeing, Romanovsky dyeing, Wright dyeing, May Giemsa dyeing, Light Giemsa dyeing, and peroxytaza dyeing, and Giemsa dyeing is preferable.

ギムザ染色は、リン酸緩衝液などの中性付近の緩衝液、生理食塩水、蒸留水などの溶媒1mlにつきギムザ液を1〜2滴の割合で混合し、15分〜90分程度反応させることにより行うことができる。染色が終了したら、染色液を水洗し、風乾させることで、顕微鏡観察用の血液標本を得ることができる。   Giemsa staining involves mixing 1 to 2 drops of Giemsa solution per 1 ml of a neutral buffer solution such as phosphate buffer, physiological saline, or distilled water, and reacting for 15 to 90 minutes. Can be performed. When the staining is completed, the staining solution is washed with water and air-dried to obtain a blood specimen for microscopic observation.

顕微鏡は、光学顕微鏡を使用することができ、倍率は、２００〜１０００倍程度が挙げられる。   As the microscope, an optical microscope can be used, and the magnification is about 200 to 1000 times.

以下に、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
実施例１及び比較例１〜２
基材として、スライドグラス（比較例１）、プラズマ非処理のプラスチックプレート（比較例２）、又は、プラズマ処理プラスチックプレート（実施例１、環状オレフィン・コポリマー（COC））にヘマトクリット値１％の血液サンプルをスポイドで滴下し、基材上に赤血球を拡げた（図２）。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the technical scope of the present invention is not limited to these examples.
Example 1 and Comparative Examples 1-2
As a substrate, blood having a hematocrit value of 1% on a slide glass (Comparative Example 1), a non-plasma-treated plastic plate (Comparative Example 2), or a plasma-treated plastic plate (Example 1, cyclic olefin copolymer (COC)) The sample was dropped with a spoid, and red blood cells were spread on the substrate (FIG. 2).

プラスチック基材を１０％エタノールを含むＲＰＭＩ１６４０溶液に１０秒間浸漬し、取り出した後ドライヤーで２０〜３０秒間、乾燥した。次いで常法に従いメタノールで赤血球を固定後、ギムザ染色、水洗、風乾して血液標本を作製した。   The plastic substrate was dipped in an RPMI 1640 solution containing 10% ethanol for 10 seconds, taken out, and then dried with a dryer for 20 to 30 seconds. Subsequently, red blood cells were fixed with methanol according to a conventional method, then stained with Giemsa, washed with water and air-dried to prepare a blood sample.

得られた血液標本（実施例１，比較例２）、血液塗抹標本（比較例１）を各倍率で光学顕微鏡により観察した。結果を図２〜４に示す。   The obtained blood specimen (Example 1, Comparative Example 2) and blood smear (Comparative Example 1) were observed with an optical microscope at each magnification. The results are shown in FIGS.

本発明のプラズマ処理されたプラスチック基材は円形に近い赤血球の形状であり、かつ、凝集していないので、マラリア原虫の感染率と種類を用意に鑑別できる。また、感染率が低い血液サンプルであってもマラリア感染を鑑別できる。   Since the plasma-treated plastic substrate of the present invention has a shape of red blood cells close to a circle and is not aggregated, the infection rate and type of malaria parasite can be easily distinguished. Moreover, malaria infection can be distinguished even in a blood sample with a low infection rate.

一方、スライドガラスを基材として用いた血液塗抹標本の場合、赤血球の形状が細長くなり、マラリア原虫の種類を検出するのが難しかった。さらに、標本上の赤血球を観察できる部分が非常に少ない。さらに、赤血球の密度が低いところでも凝集しているので、マラリア原虫の十分な検査ができなかった。   On the other hand, in the case of a blood smear using a slide glass as a base material, the shape of erythrocytes is elongated and it is difficult to detect the type of malaria parasite. Furthermore, there are very few portions on the specimen where the red blood cells can be observed. Furthermore, since the density of erythrocytes is also agglomerated, sufficient examination of malaria parasites was not possible.

Claims (4)

ヘマトクリット値１％の血液を載せたときの接触角が７〜４２°である、血液中のマラリア原虫観察用のプラスチック基材。 A plastic substrate for observing malaria parasites in blood having a contact angle of 7 to 42 ° when blood having a hematocrit value of 1% is placed thereon. 前記基材が透明基材である、請求項１に記載のプラスチック基材。 The plastic substrate according to claim 1, wherein the substrate is a transparent substrate. プラスチックがポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレートなどのポリエステル、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ABS樹脂、アクリル、ポリアミド、ポリカーボネート、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂からなる群から選ばれる、請求項１又は２に記載の透明樹脂。 The plastic according to claim 1 or 2, wherein the plastic is selected from the group consisting of polyester such as polyethylene, polypropylene, polyethylene terephthalate, polyvinyl chloride, polystyrene, ABS resin, acrylic, polyamide, polycarbonate, phenol resin, melamine resin, and epoxy resin. Transparent resin. 以下の工程１〜４を含む、マラリア原虫観察用の血液標本の作製方法：
工程１：請求項１〜３のいずれかに記載のプラスチック基材に血液サンプルを適用する工程、
工程２：工程１で得られたプラスチック基材を含水アルコール溶液に接触させて重層した赤血球を除去する工程、
工程３：工程２で得られたプラスチック基材を乾燥後、赤血球を固定する工程、
工程４：固定された赤血球を染色する工程。 A method for preparing a blood specimen for observing protozoan malaria, including the following steps 1 to 4:
Step 1: applying a blood sample to the plastic substrate according to claim 1,
Step 2: A step of removing the layered red blood cells by bringing the plastic substrate obtained in Step 1 into contact with a hydrous alcohol solution,
Step 3: A step of fixing red blood cells after drying the plastic substrate obtained in Step 2,
Step 4: Staining fixed red blood cells.