JP2018048139A - 治療用ペプチド - Google Patents
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Abstract
【課題】治療能を持つ抗体に関係する組成物および方法の提供。【解決手段】MHCクラスI型ポリペプチド関連性配列A(MICA)に免疫特異的に結合するペプチドを含む組成物であって、前記ペプチドが、5以下の保存的アミノ酸置換を有する、特定の抗体のVHの相補性決定領域(CDR)3と、5以下の保存的アミノ酸置換を有する、特定の抗体のVLのCDR3と、を含む、組成物。前記ペプチドは、相補性領域に関係する相補性決定領域を含む。【選択図】図56
Description
(関連出願の相互参照)
本出願は、米国特許仮出願番号第61/541,921号(2011年9月30日出願)の利益を主張するものであり、この出願のすべては、参照により本明細書に取り込まれる。
本出願は、米国特許仮出願番号第61/541,921号(2011年9月30日出願)の利益を主張するものであり、この出願のすべては、参照により本明細書に取り込まれる。
(政府の支援)
本発明は、米国国立衛生研究所助成金番号第PO1 AI045757号の下、政府により支援を受けた。政府は本発明において一定の権利を有する。
本発明は、米国国立衛生研究所助成金番号第PO1 AI045757号の下、政府により支援を受けた。政府は本発明において一定の権利を有する。
(配列リスト)
本出願は、EFS−Webを通じASCII形式で提出した、参照により本明細書にすべてが取り込まれる、配列リストを包含する。前記ASCII形式の複製ファイルは、文書名53293WO1.txt(文書サイズ90,411バイト)として2012年9月27日に作成した。
本出願は、EFS−Webを通じASCII形式で提出した、参照により本明細書にすべてが取り込まれる、配列リストを包含する。前記ASCII形式の複製ファイルは、文書名53293WO1.txt(文書サイズ90,411バイト)として2012年9月27日に作成した。
(発明の分野)
本発明は、ヒトを対象とする治療用組成物(例えば、ペプチド)に関する。
本発明は、ヒトを対象とする治療用組成物(例えば、ペプチド)に関する。
ヒトは、状態または疾患に曝露されることにより、治療能を持つ抗体源を産生する。当該技術分野においては、このような抗体を得る際に一般的な手法が知られている。しかしながら、治療能を持つ抗体を特異的に得るための方法は、一般に、低頻度、緩慢な増殖速度、および抗体を産生するB細胞の抗体分泌濃度の低さにより制限を受ける。例えば、特定の特異性を有する記憶B細胞が占める割合は、典型的には、末梢血の単核細胞100万個につき、または血液約1mLにつき、わずか1個のみである(Lanzavecchia et al.,Curr.Opin.Immunol.,21:298〜304(2009):Yoshida et al.,Immunol.Rev.,237:117〜139(2010))。治療能を持つ抗体の頻度は、癌患者においてはさらに低くなるものと考えられ、細胞を高感度および高効率に単離することのできる新規アプローチを開発する必要がある。
従来の方法は、概して、in vitroでの培養による記憶B細胞の抗体分泌細胞への分化、および/または免疫したモデル動物(例えば、マウス)の使用に依存するものである(Crotty et al.,J.Immunol.,171:4969〜4973(2003):Fecteau et al.,Immunology,128:e353〜e365(2009):Buisman et al.,Vaccine,28:179〜186(2009):Corti et al.,PLoS One,5:e8805(2010))。例えば、最大で一週間in vitroで培養後、培養上清中に含まれる抗体を測定し、酵素結合免疫吸着スポット(ELISPOT)アッセイにより抗体分泌細胞の頻度を調べることができる。このような方法には制限があることが報告されている(Henn et al.,J.Immunol.,183:31777〜3187(2009):Cao et al.,J.Immunol.,Methods,358:56〜65(2010))。例えば、記憶B細胞をin vitroで培養すると、記憶B細胞の表現型は変化し、異なる機能特性を有する形質細胞と似た表現型を有するようになる(Jiang et al.,Eur.J.Immunol.,37:2205〜2213(2007):Huggins et al.,Blood,109:1611〜1619(2007):Jourdan et al.,Blood,114:5173〜5181(2009))。蛍光抗原に基づく方法にまつわる制限も報告されている(Hofer et al.,Immunol.Rev.,211:295〜302(2006):Odendahl et al.,Blood,105:1614〜1621(2005);Kunkel et al.,Nat.Rev.Immunol.,3:822〜829(2003):Scheid et al.,Nature,458:636〜640(2009):Wu et al.,Science,329:856〜861(2010))。
治療能を持つ抗体を特異的に得るまたは標的とする改良法が必要とされている。
MICAは、ほとんどのヒトNK細胞、γδ T細胞、およびCD8+T細胞上に発現しているC型レクチン様II型膜貫通受容体NKG2Dのリガンドである。NKG2Dは、リガンドの結合により、アダプタータンパク質のDAP10を介してシグナル伝達を行い、パーフォリン依存性の細胞溶解を惹起し、同時刺激をもたらす。ヒトにおいては、NKG2Dリガンドには、MHCクラスI型鎖関連タンパク質A(MICA)、これと密接に関連するMICB、UL−16結合タンパク質(ULBP)1〜4およびRAE−1Gが包含される。通常、正常組織ではNKG2Dリガンドは観察されないものの、DNA損傷などの各種細胞ストレスにより発現が上方制御され、黒色腫などの様々な固形悪性腫瘍および血液系腫瘍において高頻度に検出されるようになる。NKG2D欠損型マウスおよび抗NKG2D遮断抗体により処理した野生型マウスでは、腫瘍易罹患性が著しく上昇することから、リガンドの発現が陽性の形質転換細胞によるNKG2Dの活性化は、腫瘍抑制に外因的に寄与する。しかしながら、患者においては、腫瘍細胞から脱離したNKG2Dリガンドが、表面NKG2Dの内部移行と、細胞傷害性リンパ球の機能を損なわせるトリガーとなり、免疫逃避が成立する恐れがある。可溶性NKG2Dリガンドは、Fasリガンド、IL−10、およびTGF−βを介し、抗腫瘍細胞傷害性に拮抗し得る、NKG2D+CD4+Foxp3−制御性T細胞の増殖も刺激し得る。MICAは、腫瘍細胞から脱離した、すなわち、細胞表面から周囲の媒質に放出されたNKG2Dリガンドであり、癌患者由来の血清は、典型的には可溶型(sMICA)を高濃度で含有している。MICAの脱離は、部分的にタンパク質ジスルフィド異性化酵素ERp5との相互作用を通じてなされ、すなわち、ERp5がMICAの重要なシステインとジスルフィド結合を形成し、結果としてα3ドメインをアンフォールディングさせ、ADAM−10/17およびMMP14によるタンパク質分解を受けやすくさせることを通じてなされる。
血管新生は、既存の血管から新しい細血管が形成される過程であり、腫瘍の増殖および転移において重要な役割を担うことが明らかになっている。腫瘍は、必要とされる多量の酸素および栄養素を得るために、すなわち、それらを単に拡散させた場合と比較して上回る量の酸素および栄養素を得るために、血管新生を促す。結果として、腫瘍は既存の血管を取り込み、再構築、および拡大させ、必要とされる代謝を得る。腫瘍の増殖は新しい血管の形成に依存して生じることから、血管新生は抗癌治療に魅力的な標的とされている。血管内皮増殖因子(VEGF)ファミリーメンバーおよびアンジオポエチンといった多くのサイトカインは、血管新生の制御において機能するものと考えられてきた。アンジオポエチンは、血管内皮において選択的に発現されるチロシンキナーゼファミリーTieのリガンドとして発見された。アンジオポエチン−1(「Ang−1」)〜アンジオポエチン−4(「Ang−4」)までの4種のアンジオポエチンが知られている。これまでの研究により、アンジオポエチン群(例えば、Ang−1およびAng−2)が腫瘍血管新生に関与し得ることが示唆されている。この情報を元に、アンジオポエチンは、癌の免疫療法に有望な標的として同定された。
現在、癌の免疫療法の標的(例えば、MICAおよびアンジオポエチン)を特異的に認識および結合する新規薬剤を同定することが求められている。このような薬剤は、腫瘍の進行と関連付けられる病態に関する診断用スクリーニングおよび治療介入に有用である。
本開示は、治療能を持つ抗体に関係する組成物および方法を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、MHCクラスI型ポリペプチド関連配列A(MICA)、またはそれらのエピトープに免疫特異的に結合するペプチドを含む組成物を提供する。一部の態様では、組成物のペプチドは、表1に示す抗体ID1、6、7、8、または9のVHの、保存的アミノ酸置換を5つ以下で有する相補性決定領域(CDR)3と、表1に示す抗体ID1、6、7、8、または9のVLの、保存的アミノ酸置換を5つ以下で有するCDR3と、を含む。一部の態様では、このようなペプチドは、表1に示す抗体ID1、6、7、8、または9のVHの相補性決定領域(CDR)3と、表1に示す抗体ID1、6、7、8、または9のVLのCDR3と、を含む。一部の態様では、ペプチドは、表1に示す抗体ID1、6、7、8、または9のVHの、保存的アミノ酸置換を5つ以下で有するCDR2、あるいは表1に示す抗体ID1、6、7、8、または9のVLの、保存的アミノ酸置換を5つ以下で有するCDR2、あるいはこれらの両方をさらに含む。一部の態様では、このようなペプチドは、表1に示す抗体ID1、6、7、8、または9のVHの相補性決定領域CDR2、あるいは表1に示す抗体ID1、6、7、8、または9のVLのCDR2、あるいはこれらの両方を含む。一部の態様では、ペプチドは、表1に示す抗体ID1、6、7、8、または9のVHの、保存的アミノ酸置換を5つ以下で有するCDR1、あるいは表1に示す抗体ID1、6、7、8、または9のVLの、保存的アミノ酸置換を5つ以下で有するCDR1、あるいはこれらの両方をさらに含む。一部の態様では、このようなペプチドは、表1に示す抗体ID1、6、7、8、または9のVHの相補性決定領域CDR1、あるいは表1に示す抗体ID1、6、7、8、または9のVLのCDR1、あるいはこれらの両方を含む。
一部の態様では、ペプチドは、配列番号2と同一性を有するVH鎖、および配列番号11と同一性を有するVL鎖を含む、抗体または抗体断片であり、前記VH鎖の、CDR1、CDR2、およびCDR3に相当する領域は、表1に示す抗体ID1のVHの、保存的アミノ酸置換を5つ以下で有するCDR1、CDR2、およびCDR3を含み、かつ配列番号2内のFR1、FR2、FR3、FR4に相当する領域は、表1に示す抗体ID1のVHのFR1、FR2、FR3、FR4に対し少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98、99%、または100%同一性を有するアミノ酸配列を含み、並びに前記VL鎖の、CDR1、CDR2、およびCDR3に相当する領域は、表1に示す抗体ID1のVLの、保存的アミノ酸置換を5つ以下で有するCDR1、CDR2、およびCDR3を含み、かつ配列番号11内のFR1、FR2、FR3、FR4に相当する領域は、表1に示す抗体ID1のVLのFR1、FR2、FR3、FR4に対し少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98、99%、または100%同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ペプチドは、配列番号2を含むVH鎖および配列番号11を含むVL鎖を含む、抗体または抗体断片を含む。一部の態様では、ペプチドに加え、組成物には、さらに1つ以上の(例えば、1 2、3、4、5、6、7、8、9、10、または20未満)抗癌剤を含有させる。一部の態様では、組成物は医薬組成物(例えば、対象に投与するためのもの)として処方される。
一部の態様では、ペプチドは、配列番号149と同一性を有するVH鎖、および配列番号151と同一性を有するVL鎖を含む、抗体または抗体断片であり、前記VH鎖の、CDR1、CDR2、およびCDR3に相当する領域は、表1に示す抗体ID6のVHの、保存的アミノ酸置換を5つ以下で有するCDR1、CDR2、およびCDR3を含み、かつ配列番号149内のFR1、FR2、FR3、FR4に相当する領域は、表1に示す抗体ID6のVHのFR1、FR2、FR3、FR4に対し少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98、99%、または100%同一性を有するアミノ酸配列を含み、並びに前記VL鎖の、CDR1、CDR2、およびCDR3に相当する領域は、表1に示す抗体ID6のVLの、保存的アミノ酸置換を5つ以下で有するCDR1、CDR2、およびCDR3を含み、かつ配列番号151内のFR1、FR2、FR3、FR4に相当する領域は、表1に示す抗体ID6のVLのFR1、FR2、FR3、FR4に対し少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98、99%、または100%同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ペプチドは、配列番号149を含むVH鎖および配列番号151を含むVL鎖を含む、抗体または抗体断片を含む。一部の態様では、ペプチドに加え、組成物には、さらに1つ以上の(例えば、1 2、3、4、5、6、7、8、9、10、または20未満)抗癌剤を含有させる。一部の態様では、組成物は医薬組成物(例えば、対象に投与するためのもの)として処方される。
一部の態様では、ペプチドは、配列番号168と同一性を有するVH鎖、および配列番号170と同一性を有するVL鎖を含む、抗体または抗体断片であり、前記VH鎖の、CDR1、CDR2、およびCDR3に相当する領域は、表1に示す抗体ID7のVHの、保存的アミノ酸置換を5つ以下で有するCDR1、CDR2、およびCDR3を含み、かつ配列番号168内のFR1、FR2、FR3、FR4に相当する領域は、表1に示す抗体ID7のVHのFR1、FR2、FR3、FR4に対し少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98、99%、または100%同一性を有するアミノ酸配列を含み、並びに前記VL鎖の、CDR1、CDR2、およびCDR3に相当する領域は、表1に示す抗体ID7のVLの、保存的アミノ酸置換を5つ以下で有するCDR1、CDR2、およびCDR3を含み、かつ配列番号170内のFR1、FR2、FR3、FR4に相当する領域は、表1に示す抗体ID7のVLのFR1、FR2、FR3、FR4に対し少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98、99%、または100%同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ペプチドは、配列番号168を含むVH鎖および配列番号170を含むVL鎖を含む、抗体または抗体断片を含む。一部の態様では、ペプチドに加え、組成物には、さらに1つ以上の(例えば、1 2、3、4、5、6、7、8、9、10、または20未満)抗癌療法を含有させる。一部の態様では、組成物は医薬組成物(例えば、対象に投与するためのもの)として処方される。
一部の態様では、ペプチドは、配列番号186と同一性を有するVH鎖、および配列番号188と同一性を有するVL鎖を含む、抗体または抗体断片であり、前記VH鎖の、CDR1、CDR2、およびCDR3に相当する領域は、表1に示す抗体ID8のVHの、保存的アミノ酸置換を5つ以下で有するCDR1、CDR2、およびCDR3を含み、かつ配列番号186内のFR1、FR2、FR3、FR4に相当する領域は、表1に示す抗体ID8のVHのFR1、FR2、FR3、FR4に対し少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98、99%、または100%同一性を有するアミノ酸配列を含み、並びに前記VL鎖の、CDR1、CDR2、およびCDR3に相当する領域は、表1に示す抗体ID8のVLの、保存的アミノ酸置換を5つ以下で有するCDR1、CDR2、およびCDR3を含み、かつ配列番号188内のFR1、FR2、FR3、FR4に相当する領域は、表1に示す抗体ID8のVLのFR1、FR2、FR3、FR4に対し少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98、99%、または100%同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ペプチドは、配列番号186を含むVH鎖および配列番号188を含むVL鎖を含む、抗体または抗体断片を含む。一部の態様では、ペプチドに加え、組成物には、さらに1つ以上の(例えば、1 2、3、4、5、6、7、8、9、10、または20未満)抗癌療法を含有させる。一部の態様では、組成物は医薬組成物(例えば、対象に投与するためのもの)として処方される。
一部の態様では、ペプチドは、配列番号204と同一性を有するVH鎖、および配列番号206と同一性を有するVL鎖を含む、抗体または抗体断片であり、前記VH鎖の、CDR1、CDR2、およびCDR3に相当する領域は、表1に示す抗体ID9のVHの、保存的アミノ酸置換を5つ以下で有するCDR1、CDR2、およびCDR3を含み、かつ配列番号204内のFR1、FR2、FR3、FR4に相当する領域は、表1に示す抗体ID9のVHのFR1、FR2、FR3、FR4に対し少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98、99%、または100%同一性を有するアミノ酸配列を含み、並びに前記VL鎖の、CDR1、CDR2、およびCDR3に相当する領域は、表1に示す抗体ID9のVLの、保存的アミノ酸置換を5つ以下で有するCDR1、CDR2、およびCDR3を含み、かつ配列番号206内のFR1、FR2、FR3、FR4に相当する領域は、表1に示す抗体ID9のVLのFR1、FR2、FR3、FR4に対し少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98、99%、または100%同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ペプチドは、配列番号204を含むVH鎖および配列番号206を含むVL鎖を含む、抗体または抗体断片を含む。一部の態様では、ペプチドに加え、組成物には、さらに1つ以上の(例えば、1 2、3、4、5、6、7、8、9、10、または20未満)抗癌剤を含有させる。一部の態様では、組成物は医薬組成物(例えば、対象に投与するためのもの)として処方される。
一部の実施形態では、本開示は、アンジオポエチンまたはそれらのエピトープに結合する1つ以上のペプチドを含有する組成物を提供する。一部の態様では、組成物のペプチドは、表1に示す抗体ID2、3、4、5、または10のVHの、保存的アミノ酸置換を5つ以下で有する相補性決定領域(CDR)3、並びに表1に示す、CDR1、CDR2、およびCDR3領域内に保存的アミノ酸置換を5つ以下で有する抗体ID2、3、4、5、または10のVLのCDR3を含む。一部の態様では、ペプチドは、表1に示す抗体ID2、3、4、若しくは5、若しくは10のVHの相補性決定領域(CDR)3と、表1に示す抗体ID2、3、4、若しくは5、若しくは10のVLのCDR3と、を含有させることができる。一部の態様では、ペプチドは、表1に示す抗体ID2、3、4、若しくは5、若しくは10のVHの、保存的アミノ酸置換を5つ以下で有するCDR2、または表1に示す抗体ID2、3、4、若しくは5、若しくは10のVLの、保存的アミノ酸置換を5つ以下で有するCDR2、またはこれらの両方をさらに含有させることができる。一部の態様では、このようなペプチドは、表1に示す抗体ID2、3、4、若しくは5、若しくは10のVHの相補性決定領域CDR2、または表1に示す抗体ID2、3、4、若しくは5、若しくは10のVLのCDR2、またはこれらの両方を含む。一部の態様では、ペプチドは、表1に示す抗体ID2、3、4、若しくは5、若しくは10のVHの、保存的アミノ酸置換を5つ以下で有するCDR1、または表1に示す抗体ID2、3、4、若しくは5のVLの、保存的アミノ酸置換を5つ以下で有するCDR1、またはこれらの両方をさらに含有させることができる。一部の態様では、このようなペプチドは、表1に示す抗体ID2、3、4、若しくは5、若しくは10のVHの相補性決定領域CDR1、または表1に示す抗体ID2、3、4、若しくは5、若しくは10のVLのCDR1、またはこれらの両方を含む。
一部の態様では、ペプチドは、配列番号20と同一性を有するVH鎖、および配列番号29と同一性を有するVL鎖を含む、抗体または抗体断片であり、前記VH鎖の、CDR1、CDR2、およびCDR3に相当する領域は、表1に示す抗体ID2のVHの、保存的アミノ酸置換を5つ以下で有するCDR1、CDR2、およびCDR3を含み、かつ配列番号20内のFR1、FR2、FR3、FR4に相当する領域は、表1に示す抗体ID2のVHのFR1、FR2、FR3、FR4に対し少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98、99%、または100%同一性を有するアミノ酸配列を含み、並びに前記VL鎖の、CDR1、CDR2、およびCDR3に相当する領域は、表1に示す抗体ID2のVLの、保存的アミノ酸置換を5つ以下で有するCDR1、CDR2、およびCDR3を含み、かつ配列番号29内のFR1、FR2、FR3、FR4に相当する領域は、表1に示す抗体ID2のVLのFR1、FR2、FR3、FR4に対し少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98、99%、または100%同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ペプチドは、配列番号20を含むVH鎖および配列番号29を含むVL鎖を含む、抗体または抗体断片を含む。
一部の態様では、ペプチドは、配列番号38と同一性を有するVH鎖、および配列番号47と同一性を有するVL鎖を含む、抗体または抗体断片であり、前記VH鎖の、CDR1、CDR2、およびCDR3に相当する領域は、表1に示す抗体ID3のVHの、保存的アミノ酸置換を5つ以下で有するCDR1、CDR2、およびCDR3を含み、かつ配列番号38内のFR1、FR2、FR3、FR4に相当する領域は、表1に示す抗体ID3のVHのFR1、FR2、FR3、FR4に対し少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98、99%、または100%同一性を有するアミノ酸配列を含み、並びに前記VL鎖の、CDR1、CDR2、およびCDR3に相当する領域は、表1に示す抗体ID3のVLの、保存的アミノ酸置換を5つ以下で有するCDR1、CDR2、およびCDR3を含み、かつ配列番号47内のFR1、FR2、FR3、FR4に相当する領域は、表1に示す抗体ID3のVLのFR1、FR2、FR3、FR4に対し少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98、99%、または100%同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ペプチドは、配列番号38を含むVH鎖および配列番号47を含むVL鎖を含む、抗体または抗体断片を含む。
一部の態様では、ペプチドは、配列番号56と同一性を有するVH鎖、および配列番号65と同一性を有するVL鎖を含む、抗体または抗体断片であり、前記VH鎖の、CDR1、CDR2、およびCDR3に相当する領域は、表1に示す抗体ID4のVHの、保存的アミノ酸置換を5つ以下で有するCDR1、CDR2、およびCDR3を含み、かつ配列番号56内のFR1、FR2、FR3、FR4に相当する領域は、表1に示す抗体ID4のVHのFR1、FR2、FR3、FR4に対し少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98、99%、または100%同一性を有するアミノ酸配列を含み、並びに前記VL鎖の、CDR1、CDR2、およびCDR3に相当する領域は、表1に示す抗体ID4のVLの、保存的アミノ酸置換を5つ以下で有するCDR1、CDR2、およびCDR3を含み、かつ配列番号65内のFR1、FR2、FR3、FR4に相当する領域は、表1に示す抗体ID4のVLのFR1、FR2、FR3、FR4に対し少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98、99%、または100%同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ペプチドは、配列番号56を含むVH鎖および配列番号65を含むVL鎖を含む、抗体または抗体断片を含む。
一部の態様では、ペプチドは、配列番号74と同一性を有するVH鎖、および配列番号83と同一性を有するVL鎖を含む、抗体または抗体断片であり、前記VH鎖の、CDR1、CDR2、およびCDR3に相当する領域は、表1に示す抗体ID5のVHの、保存的アミノ酸置換を5つ以下で有するCDR1、CDR2、およびCDR3を含み、かつ配列番号74内のFR1、FR2、FR3、FR4に相当する領域は、表1に示す抗体ID5のVHのFR1、FR2、FR3、FR4に対し少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98、99%、または100%同一性を有するアミノ酸配列を含み、並びに前記VL鎖の、CDR1、CDR2、およびCDR3に相当する領域は、表1に示す抗体ID5のVLの、保存的アミノ酸置換を5つ以下で有するCDR1、CDR2、およびCDR3を含み、かつ配列番号83内のFR1、FR2、FR3、FR4に相当する領域は、表1に示す抗体ID5のVLのFR1、FR2、FR3、FR4に対し少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98、99%、または100%同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ペプチドは、配列番号74を含むVH鎖および配列番号83を含むVL鎖を含む、抗体または抗体断片を含む。一部の態様では、ペプチドは、少なくともアンジオポエチン−2に免疫特異的に結合する。一部の態様では、組成物にはさらに、1つ以上の抗癌剤を含有させる。一部の態様では、組成物は、医薬組成物として処方される。
一部の態様では、ペプチドは、配列番号222と同一性を有するVH鎖、および配列番号224と同一性を有するVL鎖を含む、抗体または抗体断片であり、前記VH鎖の、CDR1、CDR2、およびCDR3に相当する領域は、表1に示す抗体ID10のVHの、保存的アミノ酸置換を5つ以下で有するCDR1、CDR2、およびCDR3を含み、かつ配列番号222内のFR1、FR2、FR3、FR4に相当する領域は、表1に示す抗体ID10のVHのFR1、FR2、FR3、FR4に対し少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98、99%、または100%同一性を有するアミノ酸配列を含み、並びに前記VL鎖の、CDR1、CDR2、およびCDR3に相当する領域は、表1に示す抗体ID10のVLの、保存的アミノ酸置換を5つ以下で有するCDR1、CDR2、およびCDR3を含み、かつ配列番号224内のFR1、FR2、FR3、FR4に相当する領域は、表1に示す抗体ID10のVLのFR1、FR2、FR3、FR4に対し少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98、99%、または100%同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ペプチドは、配列番号222を含むVH鎖および配列番号224を含むVL鎖を含む、抗体または抗体断片を含む。一部の態様では、ペプチドは、少なくともアンジオポエチン−2に免疫特異的に結合する。一部の態様では、組成物にはさらに、1つ以上の抗癌剤を含有させる。一部の態様では、組成物は、医薬組成物として処方される。
一部の実施形態では、本開示は、対象において癌を処置する方法を包含する。一部の態様では、方法は、請求項1〜27のいずれか一項に記載の組成物を対象に投与することを包含する。
本開示は、免疫療法後に癌患者からヒト抗体を単離する方法も提供する。
一部の実施形態では、本開示は、対象由来の自己抗原に対する免疫細胞を得る方法を包含し、方法は、自己抗原に対し正の免疫応答を示す対象を特定すること、自己抗原の多量体を提供すること、自己抗原の多量体を、自己抗原に対し正の免疫応答を示す対象由来のサンプルと接触させること、および自己抗原の多量体と結合する免疫細胞を得ること、を包含する。
一部の実施形態では、本開示は、自己抗原に対する癌患者由来の免疫細胞を得る方法を包含し、方法は、自己抗原に対し正の免疫応答を示す対象を特定すること;自己抗原の多量体を提供すること;自己抗原の多量体を、自己抗原に対し正の免疫応答を示す対象由来のサンプルと接触させること;および自己抗原の多量体と結合する免疫細胞を得ること、を包含する。
本明細書において定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、本発明の属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同様の意味を持つ。本発明に使用する方法および材料は本明細書に記載されるものの、当該技術分野において既知である、その他の好適な方法および材料も使用できる。材料、方法、および例は、例示目的のためのみのものであり、制限を意図するものではない。すべての刊行物、特許出願、特許、配列、データベース登録物、並びに本明細書において言及されるその他の参照は、その全体が本明細書に参考として組み込まれる。相反する場合には、定義などの、本発明における記載を参照する。
本発明のその他の特徴および利点は、以降の発明を実施するための形態および図面、並びに特許請求の範囲から明らかである。
本開示は、対象とする抗原の四量体を用いB細胞を標識することで、疾患に罹患したヒト対象から、疾患において重要な治療標的を直接対象にする抗体を得ることができるという観察に一部基づく。上記背景技術の項で記載した通り、従来法には、少なくとも、ヒト対象において適切なB細胞を同定するのは非効率的であり、および/すなわち捕捉した任意のB細胞の表現型が変化し、ひいては有用性が低減されてしまうという制限がある。対照的に、本明細書に記載の方法は、疾患に関連する抗原を特異的に対象とする希少な記憶B細胞を捕捉することが可能である。以下に記載する通り、この方法は疾患に関連する抗原の四量体化を要するものであり、以下の実施例に記載する通りの工程により、適切な記憶B細胞の同定が強化される。詳細には、本明細書に記載の方法により、抗原に対する対象の初回曝露後、より長期間にわたって、適切な記憶B細胞をより効率的に捕捉できるようになる。本明細書に記載の方法は、本明細書で開示される方法を使用し捕捉した記憶B細胞から得られた遺伝子材料を使用して生成した抗体(およびこのような抗体の配列から生成されたペプチド)も包含する。
本明細書には、MHCクラスI型ポリペプチド関連性配列A(MICA)に対するヒト抗体、並びにアンジオポエチン−2を標的としたヒト抗体が記載される。いずれの種類のヒト抗体も、四量体抗原の使用を伴う方法により、細胞性癌ワクチン(GM−CSFを形質導入した自己腫瘍細胞)を接種した患者から同定された。
一部の例では、本開示は、選別されたヒト対象、および対象から得られる治療用組成物から、治療能を持つ抗体を特異的に得るまたは標的とする方法を提供する。これらの方法には、ヒト対象において免疫細胞を得るまたは標的とすること(ここで、免疫細胞には、限定するものではないが例えば、B細胞および/または記憶B細胞が含まれる)、得られたまたは標的とした免疫細胞から遺伝子材料(例えば、DNAおよび/またはmRNA)を単離または精製すること、単離または精製された遺伝子材料を使用して治療用組成物、例えば、本明細書に開示される治療用組成物を製造すること、を包含させることができる。この方法についての詳細は、以下「方法」の項に提供する。
一部の例では、本開示は、状態または疾患を有するまたは有していた、および状態または疾患に対する正の免疫応答を示した対象において存在する抗体に関係する、治療用組成物(例えば、抗体、抗体断片、抗体誘導体、および/または抗体複合体などの治療用ペプチドを含む)を提供する。
治療用組成物
一部の例では、本明細書に記載の治療用組成物は、疾患または状態に関連する結合パートナー(例えば、免疫原(複数可)、抗原(複数可)、および/またはエピトープ(複数可))と相互作用(例えば、結合、特異的結合、および/または免疫特異的結合)することができ、治療用組成物および結合パートナー間の相互作用により、状態または疾患に対し正の免疫応答が生じる(例えば、対象において疾患または症状の程度が軽減する)。
一部の例では、本明細書に記載の治療用組成物は、疾患または状態に関連する結合パートナー(例えば、免疫原(複数可)、抗原(複数可)、および/またはエピトープ(複数可))と相互作用(例えば、結合、特異的結合、および/または免疫特異的結合)することができ、治療用組成物および結合パートナー間の相互作用により、状態または疾患に対し正の免疫応答が生じる(例えば、対象において疾患または症状の程度が軽減する)。
一部の例では、治療用組成物は、表1に示す抗体ID1、2、3、4、または5、6、7、8、9、または10の重鎖可変領域(VH)および/または軽鎖可変領域(VL)の少なくとも1つ(例えば、1、2、3、4、5、および/または6)の相補性決定領域(CDR)を含む(例えば、含む、これから本質的になる、またはこれからなる)ペプチドを含有し得る。
一部の例では、治療用組成物は、表1に示す抗体ID1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10の重鎖可変領域(VH)および/または軽鎖可変領域(VL)の少なくとも1つ(例えば、1、2、3、4、5、および/または6)の相補性決定領域(CDR)を含み(例えば、含み、これから本質的になり、またはこれからなり)、かつこれらのエピトープを含むMHCクラスI型ポリペプチド関連性配列A(MICA(例えば、UniGene Hs.130838))(例えば、可溶性MICA(sMICA))および/またはアンジオポエチン−2(例えば、UniGene Hs.583870)と相互作用(例えば、結合、特異的結合、および/または免疫特異的結合)する、ペプチドを含有し得る。
一部の例では、治療用組成物は、表1に示す抗体ID1、6、7、8、および/または9のVHおよび/またはVLの少なくとも1つのCDRを含むペプチドを含有し得るものであり、ペプチドはMICA(例えば、ヒトMICA(例えば、可溶性MICA(sMICA)))に結合(例えば、特異的結合、および/または免疫特異的結合)する。一部の例では、ペプチドは少なくとも2つのCDRを含んでよく、少なくとも2つのCDRは、表1に示される異なる抗体のCDRである。換言すれば、抗体ID1、6、7、8、および9に関し表1に示す、CDR(並びにFRおよび/またはAA配列)は互換可能であり、かつペプチドがMICA(例えば、ヒトMICA(例えば、可溶性MICA(sMICA)))に対し結合(例えば、特異的結合および/または免疫特異的結合)するのであれば、組み合わせてペプチドを生成することができる。一部の例では、このようなペプチドは、表1に示す抗体ID1、6、7、8、および/または9のVHおよび/またはVLのCDR3を含む。一部の例では、このようなペプチドは、表1に示す抗体ID1、6、7、8、および/または9のVHおよびVLのCDR3と、抗体ID1、6、7、8、および/または9のVHおよび/またはVLのCDR1および/またはCDR2と、を含む。一部の例では、このようなペプチドは、抗体ID1、6、7、8、および/または9のVHおよび/またはVLのCDR1、CDR2、およびCDR3を含む。一部の例では、このようなペプチドは、表1に示す、抗体ID1、6、7、8、および/または9のVHおよび/またはVLのCDR1、CDR2、およびCDR3と、抗体ID1、6、7、8、および/または9のVHおよび/またはVLのFR1、FR2、FR3、および/またはFR4のうち少なくとも1つと、を含む。一部の例では、このようなペプチドは、配列番号2、149、168、186、若しくは204のうちの1つ、および/または配列番号11、151、170、188、若しくは206のうちの1つを含む。各例において、ペプチドは、MICA(例えば、ヒトMICA(例えば、可溶性MICA(sMICA)))に結合(例えば、特異的結合および/または免疫特異的結合)し得る。一部の例では、ペプチドおよびMICA間の結合親和性は、約0.1nM〜1μMの間であってよく、例えば、約10nMであってよい。
一部の例では、治療用組成物は、表1に示す抗体ID6のVHおよび/またはVLの少なくとも1つのCDRを含むペプチドを含有し得るものであり、ペプチドはMICA(例えば、ヒトMICA(例えば、可溶性MICA(sMICA)))に結合(例えば、特異的結合、および/または免疫特異的結合)する。一部の例では、このようなペプチドは、表1に示す抗体ID6のVHおよび/またはVLのCDR3を含む。一部の例では、このようなペプチドは、表1に示す、抗体ID6のVHおよびVLのCDR3と、抗体ID6のVHおよび/またはVLのCDR1および/またはCDR2と、を含む。一部の例では、このようなペプチドは、抗体ID6のVHおよび/またはVLのCDR1、CDR2、およびCDR3を含む。一部の例では、このようなペプチドは、表1に示す、抗体ID6のVHおよび/またはVLのCDR1、CDR2、およびCDR3と、抗体ID6のVHおよび/またはVLのFR1、FR2、FR3、および/またはFR4のうち少なくとも1つと、を含む。一部の例では、このようなペプチドは、配列番号149および/または配列番号151を含む。各例において、ペプチドは、MICA(例えば、ヒトMICA(例えば、可溶性MICA(sMICA)))に結合(例えば、特異的結合および/または免疫特異的結合)し得る。一部の例では、ペプチドおよびMICA間の結合親和性は、約0.1nM〜1μMの間であってよく、例えば、約10nMであってよい。
一部の例では、治療用組成物は、表1に示す抗体ID7のVHおよび/またはVLの少なくとも1つのCDRを含むペプチドを含有し得るものであり、ペプチドはMICA(例えば、ヒトMICA(例えば、可溶性MICA(sMICA)))に結合(例えば、特異的結合、および/または免疫特異的結合)する。一部の例では、このようなペプチドは、表1に示す抗体ID7のVHおよび/またはVLのCDR3を含む。一部の例では、このようなペプチドは、表1に示す、抗体ID7のVHおよびVLのCDR3と、抗体ID7のVHおよび/またはVLのCDR1および/またはCDR2と、を含む。一部の例では、このようなペプチドは、抗体ID7のVHおよび/またはVLのCDR1、CDR2、およびCDR3を含む。一部の例では、このようなペプチドは、表1に示す、抗体ID7のVHおよび/またはVLのCDR1、CDR2、およびCDR3と、抗体ID7のVHおよび/またはVLのFR1、FR2、FR3、および/またはFR4のうち少なくとも1つと、を含む。一部の例では、このようなペプチドは、配列番号168および/または配列番号170を含む。各例において、ペプチドは、MICA(例えば、ヒトMICA(例えば、可溶性MICA(sMICA)))に結合(例えば、特異的結合および/または免疫特異的結合)し得る。一部の例では、ペプチドおよびMICA間の結合親和性は、約0.1nM〜1μMの間であってよく、例えば、約10nMであってよい。
一部の例では、治療用組成物は、表1に示す抗体ID8のVHおよび/またはVLの少なくとも1つのCDRを含むペプチドを含有し得るものであり、ペプチドはMICA(例えば、ヒトMICA(例えば、可溶性MICA(sMICA)))に結合(例えば、特異的結合、および/または免疫特異的結合)する。一部の例では、このようなペプチドは、表1に示す抗体ID8のVHおよび/またはVLのCDR3を含む。一部の例では、このようなペプチドは、表1に示す、抗体ID8のVHおよびVLのCDR3と、抗体ID8のVHおよび/またはVLのCDR1および/またはCDR2と、を含む。一部の例では、このようなペプチドは、抗体ID8のVHおよび/またはVLのCDR1、CDR2、およびCDR3を含む。一部の例では、このようなペプチドは、表1に示す、抗体ID8のVHおよび/またはVLのCDR1、CDR2、およびCDR3と、抗体ID8のVHおよび/またはVLのFR1、FR2、FR3、および/またはFR4のうち少なくとも1つと、を含む。一部の例では、このようなペプチドは、配列番号186および/または配列番号188を含む。各例において、ペプチドは、MICA(例えば、ヒトMICA(例えば、可溶性MICA(sMICA)))に結合(例えば、特異的結合および/または免疫特異的結合)し得る。一部の例では、ペプチドおよびMICA間の結合親和性は、約0.1nM〜1μMの間であってよく、例えば、約10nMであってよい。
一部の例では、治療用組成物は、表1に示す抗体ID9のVHおよび/またはVLの少なくとも1つのCDRを含むペプチドを含有し得るものであり、ペプチドはMICA(例えば、ヒトMICA(例えば、可溶性MICA(sMICA)))に結合(例えば、特異的結合、および/または免疫特異的結合)する。一部の例では、このようなペプチドは、表1に示す抗体ID9のVHおよび/またはVLのCDR3を含む。一部の例では、このようなペプチドは、表1に示す、抗体ID9のVHおよびVLのCDR3と、抗体ID9のVHおよび/またはVLのCDR1および/またはCDR2と、を含む。一部の例では、このようなペプチドは、抗体ID9のVHおよび/またはVLのCDR1、CDR2、およびCDR3を含む。一部の例では、このようなペプチドは、表1に示す、抗体ID9のVHおよび/またはVLのCDR1、CDR2、およびCDR3と、抗体ID9のVHおよび/またはVLのFR1、FR2、FR3、および/またはFR4のうち少なくとも1つと、を含む。一部の例では、このようなペプチドは、配列番号204および/または配列番号206を含む。各例において、ペプチドは、MICA(例えば、ヒトMICA(例えば、可溶性MICA(sMICA)))に結合(例えば、特異的結合および/または免疫特異的結合)し得る。一部の例では、ペプチドおよびMICA間の結合親和性は、約0.1nM〜1μMの間であってよく、例えば、約10nMであってよい。
一部の例では、治療用組成物は、表1に示す抗体ID2、3、4、5、および/または10のVHおよび/またはVLの少なくとも1つのCDRを含むペプチドを含有し得るものであり、ペプチドはアンジオポエチン−2(例えば、ヒトアンジオポエチン−2)に結合(例えば、特異的結合、および/または免疫特異的結合)する。一部の例では、ペプチドは少なくとも2つのCDRを含んでよく、少なくとも2つのCDRは、表1に示される異なる抗体のCDRである。換言すれば、抗体ID2、3、4、5、および10に関し表1に示す、CDR(並びにFRおよび/またはAA配列)は互換可能であり、かつペプチドがアンジオポエチン−2(例えば、ヒトアンジオポエチン−2)に対し結合(例えば、特異的結合および/または免疫特異的結合)するのであれば、組み合わせてペプチドを生成することができる。一部の例では、このようなペプチドは、表1に示す抗体ID2、3、4、5、および/または10のVHおよび/またはVLのCDR3を含む。一部の例では、このようなペプチドは、表1に示す抗体ID2、3、4、5、および/または10のVHおよびVLのCDR3と、抗体ID2、3、4、5、および/または10のVHおよび/またはVLのCDR1および/またはCDR2と、を含む。一部の例では、このようなペプチドは、抗体ID2、3、4、5、および/または10のVHおよび/またはVLのCDR1、CDR2、およびCDR3を含む。一部の例では、このようなペプチドは、表1に示す、抗体ID2、3、4、5、および/または10のVHおよび/またはVLのCDR1、CDR2、およびCDR3と、抗体ID2、3、4、5、および/または10のVHおよび/またはVLのFR1、FR2、FR3、および/またはFR4のうち少なくとも1つと、を含む。一部の例では、このようなペプチドは、配列番号20、38、56、74、若しくは222のうちの1つ、および/または配列番号29、47、65、83、若しくは224のうちの1つを含む。一部の例では、ペプチドは、配列番号20、38、56、74、または222のうちの1つ、および/または配列番号29、47、65、83、または224のうちの1つを含む。各例において、ペプチドは、アンジオポエチン−2(例えば、ヒトアンジオポエチン−2(例えば、UniGene Hs.583870))に結合(例えば、特異的結合および/または免疫特異的結合)し得る。
一部の例では、治療用組成物は、表1に示す抗体ID2のVHおよび/またはVLの少なくとも1つのCDRを含むペプチドを含有し得るものであり、ペプチドはアンジオポエチン−2(例えば、ヒトアンジオポエチン−2)に結合(例えば、特異的結合、および/または免疫特異的結合)する。一部の例では、このようなペプチドは、表1に示す抗体ID2のVHおよび/またはVLのCDR3を含む。一部の例では、このようなペプチドは、表1に示す、抗体ID2のVHおよびVLのCDR3と、抗体ID2のVHおよび/またはVLのCDR1および/またはCDR2と、を含む。一部の例では、このようなペプチドは、抗体ID2のVHおよび/またはVLのCDR1、CDR2、およびCDR3を含む。一部の例では、このようなペプチドは、表1に示す、抗体ID2のVHおよび/またはVLのCDR1、CDR2、およびCDR3と、抗体ID2のVHおよび/またはVLのFR1、FR2、FR3、および/またはFR4のうち少なくとも1つと、を含む。一部の例では、このようなペプチドは、配列番号20および/または配列番号29を含む。各例において、ペプチドは、アンジオポエチン−2(例えば、ヒトアンジオポエチン−2)に結合(例えば、特異的結合および/または免疫特異的結合)し得る。一部の例では、ペプチドおよびアンジオポエチン−2間の結合親和性は、約0.1nM〜1μMの間であってよく、例えば、約10nMであってよい。
一部の例では、治療用組成物は、表1に示す抗体ID3のVHおよび/またはVLの少なくとも1つのCDRを含むペプチドを含有し得るものであり、ペプチドはアンジオポエチン−2(例えば、ヒトアンジオポエチン−2)に結合(例えば、特異的結合、および/または免疫特異的結合)する。一部の例では、このようなペプチドは、表1に示す抗体ID3のVHおよび/またはVLのCDR3を含む。一部の例では、このようなペプチドは、表1に示す、抗体ID3のVHおよびVLのCDR3と、抗体ID3のVHおよび/またはVLのCDR1および/またはCDR2と、を含む。一部の例では、このようなペプチドは、抗体ID3のVHおよび/またはVLのCDR1、CDR2、およびCDR3を含む。一部の例では、このようなペプチドは、表1に示す、抗体ID3のVHおよび/またはVLのCDR1、CDR2、およびCDR3と、抗体ID3のVHおよび/またはVLのFR1、FR2、FR3、および/またはFR4のうち少なくとも1つと、を含む。一部の例では、このようなペプチドは、配列番号38および/または配列番号47を含む。各例において、ペプチドは、アンジオポエチン−2(例えば、ヒトアンジオポエチン−2)に結合(例えば、特異的結合および/または免疫特異的結合)し得る。一部の例では、ペプチドおよびアンジオポエチン−2間の結合親和性は、約0.1nM〜1μMの間であってよく、例えば、約10nMであってよい。
一部の例では、治療用組成物は、表1に示す抗体ID4のVHおよび/またはVLの少なくとも1つのCDRを含むペプチドを含有し得るものであり、ペプチドはアンジオポエチン−2(例えば、ヒトアンジオポエチン−2)に結合(例えば、特異的結合、および/または免疫特異的結合)する。一部の例では、このようなペプチドは、表1に示す抗体ID4のVHおよび/またはVLのCDR3を含む。一部の例では、このようなペプチドは、表1に示す、抗体ID4のVHおよびVLのCDR3と、抗体ID4のVHおよび/またはVLのCDR1および/またはCDR2と、を含む。一部の例では、このようなペプチドは、抗体ID4のVHおよび/またはVLのCDR1、CDR2、およびCDR3を含む。一部の例では、このようなペプチドは、表1に示す、抗体ID4のVHおよび/またはVLのCDR1、CDR2、およびCDR3と、抗体ID4のVHおよび/またはVLのFR1、FR2、FR3、および/またはFR4のうち少なくとも1つと、を含む。一部の例では、このようなペプチドは、配列番号56および/または配列番号65を含む。各例において、ペプチドは、アンジオポエチン−2(例えば、ヒトアンジオポエチン−2)に結合(例えば、特異的結合および/または免疫特異的結合)し得る。場合によっては、ペプチドおよびアンジオポエチン−2間の結合親和性は、X−Y間のものであり、例えば、X−Y、X−Yであり得る。一部の例では、ペプチドおよびアンジオポエチン−2間の結合親和性は、約0.1nM〜1μMの間であってよく、例えば、約10nMであってよい。
一部の例では、治療用組成物は、表1に示す抗体ID5のVHおよび/またはVLの少なくとも1つのCDRを含むペプチドを含有し得るものであり、ペプチドはアンジオポエチン−2(例えば、ヒトアンジオポエチン−2)に結合(例えば、特異的結合、および/または免疫特異的結合)する。一部の例では、このようなペプチドは、表1に示す抗体ID5のVHおよび/またはVLのCDR3を含む。一部の例では、このようなペプチドは、表1に示す、抗体ID5のVHおよびVLのCDR3と、抗体ID5のVHおよび/またはVLのCDR1および/またはCDR2と、を含む。一部の例では、このようなペプチドは、抗体ID5のVHおよび/またはVLのCDR1、CDR2、およびCDR3を含む。一部の例では、このようなペプチドは、表1に示す、抗体ID5のVHおよび/またはVLのCDR1、CDR2、およびCDR3と、抗体ID5のVHおよび/またはVLのFR1、FR2、FR3、および/またはFR4のうち少なくとも1つと、を含む。一部の例では、このようなペプチドは、配列番号74および/または配列番号83を含む。各例において、ペプチドは、アンジオポエチン−2(例えば、ヒトアンジオポエチン−2)に結合(例えば、特異的結合および/または免疫特異的結合)し得る。一部の例では、ペプチドおよびアンジオポエチン−2間の結合親和性は、約0.1nM〜1μMの間であってよく、例えば、約10nMであってよい。
一部の例では、治療用組成物は、表1に示す抗体ID10のVHおよび/またはVLの少なくとも1つのCDRを含むペプチドを含有し得るものであり、ペプチドはアンジオポエチン−2(例えば、ヒトアンジオポエチン−2)に結合(例えば、特異的結合、および/または免疫特異的結合)する。一部の例では、このようなペプチドは、表1に示す抗体ID10のVHおよび/またはVLのCDR3を含む。一部の例では、このようなペプチドは、表1に示す、抗体ID10のVHおよびVLのCDR3と、抗体ID10のVHおよび/またはVLのCDR1および/またはCDR2と、を含む。一部の例では、このようなペプチドは、抗体ID10のVHおよび/またはVLのCDR1、CDR2、およびCDR3を含む。一部の例では、このようなペプチドは、表1に示す、抗体ID10のVHおよび/またはVLのCDR1、CDR2、およびCDR3と、抗体ID10のVHおよび/またはVLのFR1、FR2、FR3、および/またはFR4のうち少なくとも1つと、を含む。一部の例では、このようなペプチドは、配列番号222および/または配列番号224を含む。各例において、ペプチドは、アンジオポエチン−2(例えば、ヒトアンジオポエチン−2)に結合(例えば、特異的結合および/または免疫特異的結合)し得る。一部の例では、ペプチドおよびアンジオポエチン−2間の結合親和性は、約0.1nM〜1μMの間であってよく、例えば、約10nMであってよい。
一部の例では、アンジオポエチン−2に結合するペプチドは、アンジオポエチン−1(例えば、Unigene Hs.369675)および/またはアンジオポエチン−4(例えば、Unigene Hs.278973)にも結合し得る。例えば、一部の例では、アンジオポエチン−2に結合するペプチドは、他の抗原(アンジオポエチン−1以外のもの)およびアンジオポエチン−1にも、特異的におよび/または免疫特異的に結合し得る。例えば、一部の例では、アンジオポエチン−2に結合するペプチドは、他の抗原(アンジオポエチン−4以外のもの)およびアンジオポエチン−4にも、特異的におよび/または免疫特異的に結合し得る。
一部の例では、治療用組成物は、配列番号2および/または配列番号11;配列番号149および/または配列番号151;配列番号168および/または配列番号170;配列番号186および/または配列番号188;配列番号204および/または配列番号206;配列番号20および/または配列番号29;配列番号38および/または配列番号47;配列番号56および/または配列番号65;配列番号74および/または配列番号83;並びに、配列番号222および/または配列番号224を含むペプチドを含有するものであり得る。
** 配列は、1、2、3、4、5、5未満、または10未満で保存的なアミノ酸の改変を含有し得る。
# 配列は、記載の配列、例えば、FR1、FR2、FR3、および/またはFR4の相当する領域内に対し(例えば、少なくとも)80%、85%、90%、95%、96%、97%、98、99%、および/または100%配列同一性を有し、並びに/あるいはCDR 1、2、および/または3の相当する領域内に1、2、3、4、5、5未満、または10未満で保存的なアミノ酸の改変を有する、配列または変異体を含む。
## 配列は、記載の配列に対し(例えば、少なくとも)80%、85%、90%、95%、96%、97%、98、99%、および/または100%配列同一性を有する配列または変異体を含み、配列は対応するアミノ酸(AA)をコードする。
AA#は、VHまたはVLアミノ酸配列を示す。
核酸##は、VHまたはVL核酸配列を示す。
CDRおよびFR領域を上記に示したが、このような領域はカバットの手法に従って定義することもできる(「免疫対象となるタンパク質配列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)」(National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1987および1991年))。同様に、抗体または抗原結合断片に対するアミノ酸付番も、カバットの手法に従う。
一部の例では、治療用組成物には、例えば、完全長の抗体および/若しくはインタクトな抗体、または抗体断片などといった抗体を含むペプチドが含有され得る。「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも1つの抗原認識部位を介し、糖、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどの標的に特異的に結合することのできる、免疫グロブリン分子である。本明細書で使用するとき、用語「抗体」は、インタクトなポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体だけではなく、任意の抗原結合断片(すなわち「抗原結合部分」)またはそれらの一本鎖、抗体を含む融合タンパク質、および任意のその他の改変を受けた、抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の構成成分も包含する。抗体には、IgG、IgA、またはIgM(またはこれらのサブクラス)などの任意のクラスの抗体を包含し、特定のクラスの抗体である必要はない。抗体の重鎖定常領域のアミノ酸配列によって、免疫グロブリンは異なるクラスに分類することができる。免疫グロブリンには5つの主要なクラス:IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMが存在し、これらのうちの幾種類かは、さらにサブクラス(アイソタイプ)、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2に分けることもできる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常領域は、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。各クラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および3次元構造は公知である。代表的な抗体および抗体断片としては、限定するものではないが、モノクローナル抗体(完全長のモノクローナル抗体を含む)、ポリクローナル抗体、少なくとも2つの異なるエピトープ結合断片から形成された多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、ラクダ化(camelised)抗体、キメラ抗体、一本鎖Fvs(scFv)、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン抗体、Fabフラグメント、F(ab’)2フラグメント、所望の生物活性(例えば、抗原結合部分)を示す抗体断片、ジスルフィド結合させたFvs(dsFv)、および抗イディオタイプ(抗Id)抗体(例えば、本発明の抗体に対する抗Id抗体など)、細胞内抗体、並びに上記の任意のエピトープ結合断片が挙げられる。抗体または抗体断片はヒト型またはヒト化抗体であってよい。
抗体断片は、完全長の抗体に所望される親和性および特異性を保持しているものであれば、本方法への使用に好適である。したがって、抗MICA抗体または抗アンジオポエチン抗体の断片は、それぞれFv部位においてMICAまたはアンジオポエチンに対する結合能を保持しており、かつFC部位において樹状細胞上のFc受容体への結合能を保持している。このような断片は、対応する完全長の抗MICA抗体または抗アンジオポエチン抗体と同様の特性により特徴づけられ、すなわち、断片は、ヒト細胞の表面に発現したヒトMICA抗原若しくはアンジオポエチン抗原、または媒質中の脱離した対応するsMICA抗原に、それぞれ特異的に結合する。
Fv断片は完全な抗原認識部位および結合部位を含有している抗体断片である。これらの領域は、1つの重鎖可変ドメインおよび1つの軽鎖可変ドメインが緊密に会合した2量体から構成され、これらのドメインは、天然では、例えばscFvにて共有結合し得る。このドメインの立体構造中で、各可変ドメインの3箇所のCDRが相互作用し、VH−VL二量体表面の抗原結合部位を形成する。総じて、抗体には、6つのCDRまたはこれらのサブセットにより、抗原に対する結合特異性が付与される。単一の可変ドメイン(すなわち、Fvのうち、抗原に特異的な3つのCDRのみを含む片鎖)であっても、抗原に対する認識能および結合能を有する場合もあるものの、通常は、完全な結合部位と比較して親和性が低くなる。
一本鎖Fvまたは(scFv)抗体断片は、抗体のVHおよびVLドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖中に存在する。一般的に、FvポリペプチドはVHおよびVLドメイン間にポリペプチドリンカーをさらに含み、これにより、scFvは抗原を結合するのに望ましい構造を形成することができる。
Fabフラグメントは、軽鎖の可変および定常ドメイン、並びに重鎖の可変ドメインおよび第1定常ドメイン(CH1)を含有する。F(ab’)2抗体断片は、断片分子同士が、一般的に、カルボキシ末端近傍においてシステイン残基からなるヒンジ部位により共有結合している、一対のFabフラグメントを含む。抗体断片のその他の化学的カップリング法も当該技術分野において既知である。
二重特異性抗体は、抗原結合部位を2つ有する小型の抗体断片であり、この断片は、同様のポリペプチド鎖(VHおよびVL)中でVHがVLに連結している。同一鎖上の2つのドメインを対形成させるのには短すぎるリンカーを使用すると、ドメインは別の鎖の相補的ドメインと対形成し、抗原結合部位を2つ生成する。
線状抗体は、一対の抗原結合領域を形成する、タンデムに連結したFd断片対(VH−CH1−VH−CH1)と相補的な軽鎖ポリペプチドとをともに含む。線状抗体は、二重特異的または単一特異的なものであり得る。
本開示の抗体および抗体断片には、所望のエフェクター機能または血清半減期を得るためFc領域において改変を加えることができる。一部の例では、Fc領域は、血清半減期を延長するためにPEGまたはアルブミンと結合させることができ、あるいは所望の効果が得られる何らかのその他の複合体とすることができる。あるいは、副作用または治療による合併症を最小限に抑えるためにエフェクター機能を除去または抑制するのが望ましい場合には、何らかの他のFc領域を使用することもできる。
ヒトおよびヒト化抗体には、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する(すなわちこれらの由来するものと同じアミノ酸配列を有する)抗体が含まれる。ヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列にはコードされていないアミノ酸残基を、例えば、CDR中、特にCDR3中に含有し得る(例えば、in vitroにおいてランダム変異または部位特異的変異により、あるいはin vivoにおいて体細胞変異により、変異が導入され得る)。
可変ドメインの「CDR」は、超可変領域内のアミノ酸残基であり、カバット(Kabat)、コチア(Chothia)の定義に従って同定される。カバットおよびコチアの両方の蓄積、AbM、接触性、および/または立体構造の定義、またはCDR決定に関わる何らかの手法は、当該技術分野で公知である。抗体CDRは、もともとはカバットらにより定義された超可変領域として同定することもできる。例えば、Kabat et al.,1992,「免疫対象となるタンパク質配列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)」,第5版,Public Health Service,NIH,Washington D.C.を参照されたい。CDRの位置は、元々コチアおよびその他の著者らにより報告されているループ構造としても同定することができる。例えば、Chothia et al.,1989,Nature 342:877〜883を参照されたい。CDRを同定するその他の手法としては、「AbMの定義」が挙げられる。AbMは、カバットおよびコチアの定義に含まれ、かつOxford MolecularのAbM抗体モデリング用ソフトウェア(現Accelrys(登録商標))、または抗原の接触性についての観察に基づくMacCallum et al.,1996,J.Mol.Biol.,262:732〜745に記載のCDRの「接触性の定義(contact definition)」を使用して導くことができる。本明細書においてCDRの「立体構造の定義」として参照される、別のアプローチでは、CDRの配置は、抗原を結合するようエンタルピーを作用させる残基配置として同定することができる。例えば、Makabe et al.,2008,Journal of Biological Chemistry,283:1156〜1166を参照されたい。さらに別の、CDRの境界についての定義は、上記の手法のいずれかに固執するものではないがカバットのCDRと少なくとも一部重なるものの、特定の残基、若しくは残基群、またはさらには完全なCDRが、抗原の結合性に著しく影響を与えないという予測または実験による所見を考慮して、短縮または延長することができる。本明細書で使用するとき、CDRは、当該技術分野において既知の任意の手法(手法の組み合わせを包含する)により定義されたCDRを指す。本明細書で使用する方法では、これらのアプローチのうちのいずれかに従って規定されたCDRを利用することができる。1つ以上のCDRを含有する任意の所与の実施形態に際し、CDRは、カバット、コチア、伸長、AbM、接触法、および/または立体構造の定義のうちのいずれかに従って規定することができる。
一部の例では、例えば、未改変のペプチドと比較して、ペプチド変異体の抗原結合特性が維持されるかまたは改善されるのであれば、本明細書で開示されるペプチドのアミノ酸配列に改変および変更を加え、ペプチド変異体(例えば、本明細書で開示されるペプチドに対し規定の配列相同性を有するペプチド)を作製してもよい(任意の改変ペプチドの抗原結合特性は、本明細書に記載されるin vitroおよび/またはin vivoアッセイ並びに/あるいは当該技術分野において既知の手法を使用して評価することができる)。
一般的に、ペプチド変異体はアミノ酸レベルで観察されかつ考察される一方で、実際の改変は、典型的には核酸レベルで導入されまたは実施される。例えば、表1に示すペプチドに対し80%、85%、90%、95%、96%、97%、98、または99%アミノ酸配列同一性を有する変異体は、配列番号1、10、19、28、37、46、55、64、73、および/または82をコードしている核酸、またはこれらの部分/断片を、当該技術分野において既知の手法(例えば、クローニング法)、および/または本明細書で開示される手法を用い改変することにより作成できる。
アミノ酸配列の改変は、典型的には、置換、挿入、または欠失による改変の3種類のうちの1つ以上に当てはまる。挿入には、アミノおよび/または末端の融合、並びに配列中への単一または複数のアミノ酸残基の挿入が含まれる。通常、挿入は、アミノまたはカルボキシ末端の融合と比較して、より小さな挿入であり、例えば、約1〜4残基ほどである。欠失は、タンパク質配列からの1つ以上のアミノ酸残基の除去により特徴づけられる。典型的には、タンパク質分子内のいずれか一箇所にて約2〜6未満の残基が欠失している。アミノ酸置換は、典型的には単一残基のものであるが、一度に複数の異なる位置に生じる場合もある;挿入は、通常、約1〜10個のアミノ酸残基である;欠失は、約1〜30残基の範囲である。欠失または挿入は隣接する対になすことができ、すなわち、2残基の欠失または2残基の挿入をなすことができる。置換、欠失、挿入、またはこれらの任意の組み合わせを合わせて、最終的なコンストラクトを得ることもできる。変異は、読み枠外の配列に配置すべきではなく、および好ましくは、mRNAの二次構造を生成し得る相補性決定領域に作成すべきではない。置換による改変は、少なくとも1つの残基が除去され、異なる残基がその部位に挿入されるというものである。一部の例では、置換は、保存的アミノ酸置換であり得る。一部の例では、本明細書に記載のペプチドには、表1に示すペプチドに対する1つ以上の保存的アミノ酸置換を含有させることができる。例えば、変異体は、表1に示すペプチドに対し、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、20〜30、30〜40、または40〜50個の保存的アミノ酸置換を含有し得る。あるいは、変異体は、表1に示すペプチドに対する50個以下、40個以下、30個以下、20個以下、10個以下、9個以下、8個以下、7個以下、6個以下、5個以下、4個以下、3個以下、または2個以下の保存的アミノ酸置換を含有し得る。このような置換は、概して以降の表2に従ってなされ、かつ保存的置換と呼ばれる。タンパク質の改変に対する許容性を予測する方法は、当該技術分野において既知である(例えば、Guo et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,101(25):9205〜9210(2004)を参照されたい)。
一部の例では、置換は非保存的なものである。例えば、表1に示すペプチド中のアミノ酸は、ペプチドの何らかの特性または態様を変更し得るアミノ酸により置換することができる。一部の例では、非保存的アミノ酸置換は、例えば、ペプチドの構造を変化させ、ペプチドの結合特性を変化する(例えば、抗原に対するペプチドの結合親和性を増加または減少させる、並びに/あるいは、抗原に対するペプチドの結合特異性を増加または減少させる)ためになすことができる。
一部の例では、ペプチドおよび/またはペプチド変異体には、表1に示すペプチドの断片を含有させることができ、あるいは断片であってよい。このような断片には、例えば、断片が、完全長のペプチドの結合特性を少なくとも一部保有するのであれば、例えば、表1に示すCDR、FR、および/またはAAと比較して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36 37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、50〜100、101〜150個少ないアミノ酸を含有させ得る(例えば、完全長のペプチドの結合特性の少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、または100%)。切断はアミノ末端、カルボキシ末端、および/または本明細書に記載のペプチド内に行うことができる。
一部の例では、ペプチド変異体の相互作用面は、例えば、未改変のペプチドに対するペプチド変異体の結合特性を、変更(例えば、増強または減弱)、保存、または維持するための改変を受けていないペプチドのものと同様(例えば、ほぼ同様)であり得る。ペプチドの相互作用面を同定する手法は当該技術分野において既知である(Gong et al.,BMC:Bioinformatics,6:1471〜2105(2007);Andrade and Wei et al.,Pure and Appl.Chem.,64(11):1777〜1781(1992);Choi et al.,Proteins:Structure,Function,and Bioinformatics,77(1):14〜25(2009);Park et al.,BMC:並びにBioinformatics,10:1471〜2105(2009)。
当業者であれば、2つのポリペプチド(例えば、未改変のペプチドおよびペプチド変異体)の同一性を評価する方法については容易に判断する。例えば、同一性は、同一度が最も高くなるように2つの配列を整列させた後に算出することができる。同一性を算出する別の方法は、公開されているアルゴリズムにより実施することができる。配列比較の最適なアラインメントは、Smith and Waterman,Adv.Appl.Math,2:482(1981)の局所同一性アルゴリズム(local identity algorithm)、Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)の同一性アラインメントアルゴリズム、Pearson and Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)と同様の検索方法、コンピュータへのこれらのアルゴリズムの実装(Wisconsin Geneticsソフトウェア・パッケージ(Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,WI)におけるGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA)、または観察により実施することができる。
同様の種類の同定は、例えば、Zuker,Science 244:48〜52(1989);Jaeger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:7706〜10(1989);Jaeger et al.,Methods Enzymol.183:281〜306(1989)に開示されるアルゴリズムにより、核酸についても得ることができ、これらの文献は、少なくとも、核酸アラインメントに関係する要素を参照することにより、本明細書に組み込まれる。典型的には任意の方法を使用できること、並びに特定の例においてはこれらの各種方法により得られる結果が異なっていることは理解されるが、当業者であれば、これらの方法のうち少なくとも1つにより同一性が認められた場合、配列は記載の同一性を有するものとされ、かつ本明細書で開示される配列であるとみなされることは理解するであろう。
一部の例では、以降の方法の項においてより詳細に記載される通り、本明細書で開示される治療用組成物は、本明細書で開示される方法を使用して得られた免疫細胞(例えば、記憶B細胞などのB細胞)から単離および/または精製された遺伝子材料(例えば、DNAおよび/またはmRNA)を使用して作製することができる。このような遺伝子材料が得られた場合に、本明細書で開示される治療用組成物をこのような遺伝子材料を使用して作製する方法は当該技術分野において既知であり、および/または以下に要約される。
一部の例では、ペプチドには検出可能な標識を含有させ得る。本明細書で使用するとき、「標識」は、標識を取り付けられるペプチドの検出を可能にする部位に組み込まれた、少なくとも1つのエレメント、同位体、または官能基を指す。標識は直接取り付けることができ(すなわち、結合を介して)、またはリンカー(例えば、環状または非環状、分岐状または非分岐状、置換または非置換アルキレン;環状または非環状、分岐状または非分岐状、置換または非置換アルケニレン;環状または非環状、分岐状または非分岐状、置換または非置換アルキニレン;環状または非環状、分岐状または非分岐状、置換または非置換ヘテロアルキレン;環状または非環状、分岐状または非分岐状、置換または非置換ヘテロアルケニレン;環状または非環状、分岐状または非分岐状、置換または非置換ヘテロアルキニレン;置換または非置換アリーレン;置換または非置換ヘテロアリーレン;あるいは置換または非置換アシレン(acylene)、あるいはこれらのうちの、リンカーを構成させることのできる任意の組み合わせ)により取り付けることができる。標識は、生物活性または検出される本発明のポリペプチドの特性に干渉しない任意の位置にて、ペプチドに取り付けることができる。
標識としては、限定するものではないが、2H、3H、13C、14C、15N、31P、32P、35S、67Ga、99mTc(Tc−99m)、111In、123I、125I、169Yb、および186Reといった放射性同位体または重同位体などであり得る同位体部位を含有する標識;酵素(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ)と結合し得る抗体または抗原であり得る免疫性部分または免疫反応性部分を含有する標識;着色、冷光、リン光などの標識、または蛍光部分(例えば、蛍光標識FITCなど)を含有する標識;1つ以上の光親和性部分を有する標識;1つ以上の既知の結合パートナー(ビオチン−ストレプトアビジン、FK506−FKBPなど)を有するリガンド部分を有する標識を挙げることができる。
一部の例では、標識には、生物システムにおいて分子間相互作用を直接的に解明するために、1つ以上の光親和性部分を含有させることができる。各種既知の発光分子を使用することができ、殆どの場合、ジアゾ化合物類、アジド類、ジアジリニン類のナイトレン類またはカルベン類への光分解(photoconversion)を利用する(例えば、Bayley,H.,Photogenerated Reagents in Biochemistry and Molecular Biology(1983),Elsevier,Amsterdamを参照されたい。この非特許文献は、全体が参照により本明細書に組み込まれる)。本発明の特定の実施形態では、光親和性の標識としては、限定するものではないが、4−アジド−2,3,5,6−テトラフルオロ安息香酸などといった、1つ以上のハロゲン部分により置換されたo−、m−、およびp−アジゾベンゾイル類が使用される。
標識は撮像剤であってもよく、または撮像剤として利用することもできる。撮像剤の例としては、限定するものではないが、陽電子放出断層撮影法(PET)、コンピューター断層撮影法(CAT)、単一光子放射断層撮影法、X線法、蛍光透視法、および磁気共鳴映像法(MRI);制吐薬;並びに造影剤に使用されるものが挙げられる。診断薬の例としては、限定するものではないが、蛍光分子、冷光分子、磁気分子;ガドリニウム系キレート剤(例えば、DTPA、DTPA−BMA、DOTA、およびHP−DO3Aを併用したガドリニウム系キレート剤)、鉄キレート剤、マグネシウムキレート剤、マンガンキレート剤、銅キレート剤、クロムキレート剤、CATおよびX線撮像に有用なヨウ素系化合物、並びに放射性核種が挙げられる。好適な放射性核種としては、限定するものではないが、123I、125I、130I、131I、133I、135I、47Sc、72As、72Se、90Y、88Y、97Ru、100Pd、101mRh、119Sb、128Ba、197Hg、211At、212Bi、212Pb、109Pd、111In、67Ga、68Ga、67Cu、75Br、77Br、99mTc、14C、13N、150、32P、33P、および18Fが挙げられる。
蛍光および冷光分子としては、限定するものではないが、「染料」、「標識」、または「指示薬」として一般に呼ばれる異なる各種有機または無機小分子が挙げられる。例としては、限定するものではないが、フルオレセイン、ローダミン、アクリジン染料、Alexa、シアニン染料などが挙げられる。蛍光および冷光分子としては、天然に生じる各種タンパク質およびその誘導体、例えば、遺伝子組み換えされた変異体を挙げることができる。例えば、蛍光タンパク質としては、緑色蛍光タンパク質(GFP)、高感度GFP、赤色、青色、黄色、シアン色、およびサファイア色蛍光タンパク質、造礁サンゴ蛍光タンパク質などが挙げられる。冷光タンパク質としては、ルシフェラーゼ、エクオリン、およびこれらの誘導体が挙げられる。当該技術分野においては、数多くの蛍光および冷光染料並びにタンパク質が知られている(例えば、米国特許出願公開第2004/0067503号;Valeur,B.,「分子蛍光:原理および応用(Molecular Fluorescence: Principles and Applications),」John Wiley and Sons,2002;並びに「蛍光プローブおよび探索分子、分子プローブハンドブック(Handbook of Fluorescent Probes and Research Products, Molecular Probes)」,第9版,2002)。
本明細書で使用するとき、用語「精製された」は、他の分子、例えば、ポリペプチド、核酸分子が、その天然の環境成分から識別されかつ分離されおよび/または回収されていることを指す。したがって、一実施形態では、本発明の抗体は精製抗体であり、自然環境の1つ以上の成分から分離されている。
本明細書で使用するとき、用語「エピトープ」は、抗体が結合し得るタンパク質の抗原決定基を指す。エピトープは、通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基から構成され、かつ通常、特異的な立体構造特性、並びに特異的な電荷特性を有する。立体構造および非立体構造エピトープは、変性溶媒の存在下において、前者に対する結合は失われるのに対し、後者に対する結合は失われないという点で区別される。
一部の例では、本開示は、本開示のペプチド(例えば、表1に開示される)に相当する(例えば、本開示のペプチドをコードする)ヌクレオチド配列を提供する。これらの配列には、本開示のペプチドに関係するすべての縮重配列を包含し、すなわち、特定のペプチドおよび変異体並びにその誘導体を1つコードする配列を有するすべての核酸を包含する。したがって、具体的な各核酸配列は記載されないものの、各配列およびすべての配列は、実際のところ本開示のポリペプチド配列により本明細書に開示されかつ記載される。
一部の例では、本開示の核酸には、発現ベクターを含む。適切なベクターの例としては、限定するものではないが、プラスミド、人工染色体、例えば、BAC、YAC、またはPAC、並びにウイルスベクターが挙げられる。
提供されるベクターには、例えば、複製起点および/またはマーカーを含有させることもできる。マーカー遺伝子は、選択可能な表現型、例えば、抗生物質耐性を細胞に付与し得る。マーカー産物は、ベクターが細胞に入り、かつ入った後に発現しているかを判断するために使用する。哺乳類細胞用の選択可能なマーカーの例は、ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)、チミジンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシン類似体G418、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、およびブラストサイジンである。このような選択可能なマーカーが哺乳類の宿主細胞に首尾よく移行された場合、形質転換した哺乳類宿主細胞は、選択圧下に置いた場合に生存し得る。他のマーカーの例としては、例えば、大腸菌(E. coli)lacZ遺伝子、緑色蛍光タンパク質(GFP)、およびルシフェラーゼが挙げられる。加えて、発現ベクターには、発現したポリペプチドの操作または検出(例えば、精製または局在化)を促進するよう設計したタグ配列を含有させることができる。GFP、グルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)、ポリヒスチジン、c−myc、赤血球凝集、またはFLAG(商標)タグ(Kodak;New Haven,CT)配列などのタグ配列は、典型的には、コードされているポリペプチドを有する融合体として発現させることができる。このようなタグは、カルボキシまたはアミノ末端のいずれかを含む、ポリペプチド内のどこにでも挿入することができる。
一部の例では、本開示は、本明細書で開示される核酸(例えば、ベクター)および/またはペプチドを含む細胞を包含する。細胞には、例えば、真核生物および/または原核細胞が包含され得る。一般的に、本明細書において使用され得る細胞は、例えば、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関(ATCC),P.O.Box 1549,Manassas,VA 20108から市販のものである。同様に、F.Ausubel et al.,「分子生物学標準プロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)」,John Wiley & Sons,New York,NY,(1998)も参照されたい。本明細書で開示される細胞の生成に有用な形質転換および遺伝子導入方法は、例えば、F.Ausubel et al.,「分子生物学標準プロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)」,John Wiley & Sons,New York,NY,(1998)に記載されている。
医薬組成物
一部の例では、本明細書で開示される治療用組成物には、癌の処置に使用される他の化合物、薬剤、および/または剤を含有させることができる。このような化合物、薬剤、および/または剤としては、例えば、化学療法剤、低分子抗癌剤または所定の癌に対する免疫応答を刺激する抗体を挙げることができる。一部の例では、治療用組成物には、例えば、本明細書で開示される1つ以上のペプチド、および1つ以上の抗CTLA−4抗体若しくはペプチド、抗PD−1抗体若しくはペプチド、および/または抗PDL−1抗体若しくはペプチドが挙げられる。例えば、一部の例では、本明細書で開示される治療用組成物は、1つ以上(例えば、1、2、3、4、5、または10未満)の化合物と組み合わせることができる。
一部の例では、本明細書で開示される治療用組成物には、癌の処置に使用される他の化合物、薬剤、および/または剤を含有させることができる。このような化合物、薬剤、および/または剤としては、例えば、化学療法剤、低分子抗癌剤または所定の癌に対する免疫応答を刺激する抗体を挙げることができる。一部の例では、治療用組成物には、例えば、本明細書で開示される1つ以上のペプチド、および1つ以上の抗CTLA−4抗体若しくはペプチド、抗PD−1抗体若しくはペプチド、および/または抗PDL−1抗体若しくはペプチドが挙げられる。例えば、一部の例では、本明細書で開示される治療用組成物は、1つ以上(例えば、1、2、3、4、5、または10未満)の化合物と組み合わせることができる。
一部の例では、本明細書で開示される治療用組成物には、ヒストン脱アセチル化酵素(「HDAC」)阻害剤などの他の化合物を含有させ得る。HDAC阻害剤の例としては、例えば、ヒドロキサム酸、ボリノスタット(Zolinza);スベロイルアニリドヒドロキサム酸(SAHA)(Merck)、トリコスタチンA(TSA)、LAQ824(Novartis)、パノビノスタット(LBH589)(Novartis)、ベリノスタット(PXD101)(CuraGen)、ITF2357 Italfarmaco SpA(Cinisello)、環状テトラペプチド;デプシペプチド(ロミデプシン、FK228)(Gloucester Pharmaceuticals)、ベンズアミド;Entinostat(SNDX−275/MS−275)(Syndax Pharmaceuticals)、MGCD0103(Celgene)、短鎖脂肪酸、バルプロ酸、フェニル酪酸、AN−9、pivanex(Titan Pharmaceutical)、CHR−3996(Chroma Therapeutics)、およびCHR−2845(Chroma Therapeutics)が挙げられる。
一部の例では、本明細書で開示される治療用組成物には、例えば、ボルテゾミブ(Millennium Pharmaceuticals)、NPI−0052(Nereus Pharmaceuticals)、カーフィルゾミブ(PR−171)(Onyx Pharmaceuticals)、CEP 18770、およびMLN9708といったプロテアソーム阻害剤などの、その他の化合物を含有させることができる。
一部の例では、本明細書で開示される治療用組成物には、これまでに、抗MICAモノクローナル抗体の有効性を増強させ得るMICAの発現を増大させることが示されている、メルファランなどのアルキル化剤、およびアドリアマイシン(ドキソルビシン)などのトポイソメラーゼ阻害薬を含有させることができる。
一部の例では、本明細書で開示される治療用組成物は、医薬組成物として、または医薬組成物に使用するために処方することができる。このような組成物は、任意の経路、例えば、米国食品医薬品局(FDA)に認可された任意の経路により対象に投与するために処方または調節することができる。方法例は、FDAのCDERデータ標準マニュアル(CDER Data Standards Manual),ver.004(fda.give/cder/dsm/DRG/drg00301.htmから入手可能)に記載されている。
一部の例では、医薬組成物には、有効な量の1つ以上のペプチドを含有させることができる。本明細書で使用するとき、用語「有効な量」および「処置に有効な」は、所望される効果または生理学的結果を得る際の投与という文脈において、一定時間(急性または慢性投与および定期または継続投与など)にわたって有効である1つ以上のペプチドの量または濃度を指す。
一部の例では、医薬組成物には、1つ以上のペプチド並びに任意の製薬上許容可能な担体、補助剤および/または賦形剤を含有させることができる。一部の例では、医薬組成物には、さらに1つ以上の追加の治療剤を、疾患または病徴の調節を達成するのに有効な量で含有させることができる。
用語「製薬上許容可能な担体または補助剤」は、本発明のペプチドとともに患者に投与することができ、かつ本発明のペプチドの薬理活性を損なわず、かつ治療量の化合物を送達するのに十分な投与量で投与した場合に非毒性である基剤または助剤を指す。
本発明の医薬組成物に使用することのできる製薬上許容可能な基材、補助剤および賦形剤としては、限定するものではないが、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、d−α−トコフェロールポリエチレングリコール1000コハク酸塩などの自己乳化薬物送達システム(SEDDS)、Tween若しくは他の同様の高分子系送達マトリックスなどの薬物剤形において使用される界面活性剤、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、緩衝成分、例えば、リン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、植物性飽和脂肪酸と、水と、塩類とまたは電解質、例えば、硫酸プロタミン、リン酸一水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩との、部分グリセリド混合物、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系材料、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコール、並びに羊毛脂が挙げられる。本明細書に記載の処方の化合物の送達性を増強させるために、α−、β−、およびγ−シクロデキストリンなどのシクロデキストリンを有利に使用することもできる。
本発明の医薬組成物には、製薬上許容できる任意の一般的な非毒性基材、補助剤、または賦形剤を含有させることができる。場合によっては、処方のpHは、製薬上許容可能な酸、塩基、または緩衝剤により調整して、処方された化合物またはその送達形態の安定性を向上させることができる。本明細書で使用するとき、用語「非経口」は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑膜内、胸骨内、髄腔内、病巣内、および頭蓋内注射または輸液による手法を包含する。
医薬組成物は、吸入および/または経鼻投与用の溶液または粉末の形態であり得る。このような組成物は、好適な分散剤または湿潤剤(例えば、Tween 80など)および懸濁剤を使用して、当該技術分野において既知の手法に従って処方することもできる。無菌注射製剤は、非毒性非経口投与可能な希釈剤または溶媒を用いた無菌注射製剤または懸濁液(例えば、1,3−ブタンジオール溶液)であってもよい。利用することのできる投与可能な賦形剤および溶媒としては、マンニトール、水、リンガー液および生理食塩水が挙げられる。加えて、無菌硬化油は、一般的に、溶媒または懸濁媒質として利用される。この目的に関し、合成モノまたはジグリセリドなどの任意の低刺激性硬化油が利用され得る。例えば、オリーブ油またはヒマシ油、特に、これらのポリオキシエチル化化合物などといった、オレイン酸およびそのグリセリド誘導体などの脂肪酸は、製薬上許容できる天然油として、注射剤の調製に有用である。これらの油溶液または懸濁液には、乳濁液およびまたは懸濁液など、製薬上許容可能な剤形の処方に一般的に使用される、長鎖アルコール希釈剤若しくは分散剤、またはカルボキシメチルセルロース若しくは同様の分散剤を含有させることができる。その他の一般的に使用されるTween若しくはSpanなどの界面活性剤、および/または他の類似の乳化剤、または製薬上許容可能な固体、液体若しくは他の剤形の製造に一般に使用される生物学的利用能増強剤なども、製剤目的で使用することができる。
医薬組成物は、限定するものではないが、カプセル剤、錠剤、乳濁液および水性懸濁液、分散液および溶液などといった、経口投与可能な任意の投与形態で経口投与することができる。経口用途用の錠剤の場合、一般に使用される基材としては乳糖およびトウモロコシデンプンが挙げられる。典型的には、ステアリン酸マグネシウムなどの粘滑剤も添加される。カプセル形態での経口投与の際に有用な希釈剤としては、乳糖および乾燥トウモロコシデンプンが挙げられる。水性懸濁液および/または乳濁液を経口投与する場合、有効成分は、乳化剤および/または懸濁剤と組み合わせた油相に懸濁または溶解させることもできる。必要に応じて、特定の甘味料および/または香料および/または着色料を添加することもできる。
あるいは、またはこれに加え、医薬組成物は、点鼻剤(エアゾール)または経鼻吸入により投与することができる。このような組成物は、製剤処方の技術分野で公知の手法に従って調製され、かつベンジルアルコールまたは他の好適な保存料、生物学的利用能を増強させる吸収促進剤、フッ化炭素、および/または当該技術分野において既知の他の溶解剤若しくは分散剤を利用して、生理食塩水溶液として調製することができる。
一部の実施形態では、本開示は、本明細書で開示される任意の1つ以上のペプチドまたは医薬組成物(以降「X」として記載)を、以降の方法において使用するための方法を提供する。
本明細書で開示される1つ以上の疾患または状態(例えば、「Y」として以降の実施例において参照される癌)の処置において薬剤として使用するための物質X。Yの処置用薬剤を製造する際の物質Xの使用;およびYの処置において使用するための物質X。
一部の例では、本明細書で開示される治療用組成物は、米国での販売、米国への輸入、および/または米国からの輸出用に製剤することができる。
方法
一部の例では、方法には、状態または疾患を有するまたは有したヒト対象、および状態または疾患に対し正の免疫応答を示すまたは示したヒト対象を選別することが包含され得る。一部の例では、好適な対象には、例えば、状態または疾患を有するまたは有していたものの、疾患またはそれらの病態から回復している対象、現在では疾患の症状が(例えば、同様の状態または疾患を有する他の対象(例えば、大多数の対象)と比較して)軽減している対象、並びに/あるいは、例えば、無症候期(例えば、同様の状態または疾患を有する他の対象(例えば、大多数の対象)と比較して)において、状態または疾患を有するまたは有していたものの、状態または疾患を有しつつ(例えば、同様の状態または疾患を有する他の対象(例えば、大多数の対象)と比較して)より長期間生存している対象、が包含される。一部の例では、状態または疾患に対してワクチンを接種している(例えば、ワクチン接種歴があるおよび/またはワクチンを接種されたことがあるおよびワクチンを再接種されている(例えば、免疫補助剤入りワクチンを接種されている))対象を選別することができる。
一部の例では、方法には、状態または疾患を有するまたは有したヒト対象、および状態または疾患に対し正の免疫応答を示すまたは示したヒト対象を選別することが包含され得る。一部の例では、好適な対象には、例えば、状態または疾患を有するまたは有していたものの、疾患またはそれらの病態から回復している対象、現在では疾患の症状が(例えば、同様の状態または疾患を有する他の対象(例えば、大多数の対象)と比較して)軽減している対象、並びに/あるいは、例えば、無症候期(例えば、同様の状態または疾患を有する他の対象(例えば、大多数の対象)と比較して)において、状態または疾患を有するまたは有していたものの、状態または疾患を有しつつ(例えば、同様の状態または疾患を有する他の対象(例えば、大多数の対象)と比較して)より長期間生存している対象、が包含される。一部の例では、状態または疾患に対してワクチンを接種している(例えば、ワクチン接種歴があるおよび/またはワクチンを接種されたことがあるおよびワクチンを再接種されている(例えば、免疫補助剤入りワクチンを接種されている))対象を選別することができる。
本明細書で使用するとき、用語「対象」は、任意の動物を指す。一部の例では、対象は哺乳類である。本明細書で使用するとき、一部の例では、用語「対象」はヒト(例えば、男性、女性、または子供)を指す。本方法に使用する試料には、血清試料が包含され、例えば、選別された対象から得られた血清試料が包含される。
一部の例では、対象の選別には、対象から試料を得ること(例えば、候補となる対象)、および対象が選択に適するかを示す指標について試料を試験することを包含させることができる。一部の例では、対象は、状態または疾患を有していたかまたは有しているものとして、例えば、医療従事者により、確認または特定することができる。一部の例では、状態または疾患に対する正の免疫応答の提示は、病歴、家族歴、および/または正の免疫応答に関する指標の検出からなされる。場合によっては、患者の選別には複数名の患者を包含させることができる。例えば、第1施設により候補となる対象から試料を得て、第2施設により試料を試験することができる。一部の例では、対象は、医師(例えば、一般開業医)により選別および/または参照することができる。一部の例では、対象の選別には、選別した対象から試料を得ること、および試料を保管すること、および/または本明細書で開示される方法を使用すること、を包含させることができる。試料は、例えば、細胞または細胞集団を含有し得る。
一部の例では、免疫細胞を得ることまたは標的とすることには、例えば、標的とする免疫細胞に結合(例えば、特異的に結合)することができる免疫原四量体を得ること、または提供すること;免疫原四量体と試料とを接触させること;免疫原四量体を検出すること;免疫原四量体が標的免疫細胞に結合するか否か判定すること;並びに、標的とする免疫細胞に免疫原四量体が結合する場合には、標的とする免疫細胞を得ること、のうちの1つ以上および/または組み合わせを包含させることができる。
免疫原四量体には、状態または疾患に関連する、および/または標的とする免疫細胞に結合(例えば、特異的に結合)する免疫原を含有させることができ、例えば、標的免疫細胞は、選択された状態または疾患に関連するものである。状態または疾患に関連する免疫原および標的免疫細胞としては、例えば、特定の状態または疾患を有する対象には存在するが、この状態または疾患を有さない対象には存在しない、免疫原または免疫細胞;並びに/あるいは特定の状態または疾患を有する対象と、この状態または疾患を有さない対象とで程度が異なる(例えば、増加している)免疫原または免疫細胞が挙げられる。一部の例では、免疫原または免疫細胞は癌特異的なものであり得る。免疫原は可溶性であり得る。免疫原四量体には、四量体(例えば、免疫原性抗原(例えば、抗原および/またはエピトープ)の単量体、二量体、および/または三量体を含む)が含有され得る。一部の例では、免疫原四量体は、同様の条件下での、細胞に対する非四量体型の免疫原の結合性と比較して、細胞に対する結合性が増大している。一部の例では、四量体抗原は、検出可能な部分、例えば、ストレプトアビジン部分を含有する。四量体化の方法は、当該技術分野において既知でありかつ本明細書で開示される。
免疫原四量体を検出すること、および/または免疫原四量体が標的細胞に結合するか否かを判定することは、当該技術分野において既知のおよび/または本明細書で開示される方法を使用して実施することができる。例えば、方法はフローサイトメトリーを包含し得る。フローサイトメトリー(ソーティングおよびゲーティング法を含む)を最適化する方法は、当該技術分野において既知であり、および/または本明細書で開示される。一部の例では、方法には、標的とする免疫細胞に結合する抗原四量体間の結合性、結合親和性、および/または結合特異性の度合いの解析が包含され得る。例えば、免疫原四量体と標的免疫細胞と間に、規定の結合度が測定された場合に(例えば、このような場合に限り)、標的とする免疫細胞を得ることができる。規定の結合度は、特定の度合いであってよく、および/または相対的な度合いであってよい。標的とする免疫細胞を得ることには、標的とする免疫細胞を得ること、提供すること、同定すること、選別すること、精製すること、および/または単離すること、を包含させることができる。このような方法には、例えば、セルソーティング法、細胞濃縮法、および/またはバックグラウンド減少法を含有させることができる。
一部の例では、自己抗原に対する免疫細胞を得ることは、例えば、自己抗原に対し正の免疫応答を示す対象を特定すること;自己抗原の多量体を得ることまたは提供すること;自己抗原の多量体を、自己抗原に対し正の免疫応答を示す対象由来のサンプルと接触させること;自己抗原の多量体と結合する免疫細胞を得ることのうちの1つ以上および/またはこれらの組み合わせを包含し得る。
一部の例では、方法には、癌患者由来の自己抗原に対する免疫細胞を得ることを包含させることができ、例えば、自己抗原に対し正の免疫応答を示す対象を特定すること;自己抗原の多量体を提供すること;自己抗原の多量体を、自己抗原に対し正の免疫応答を示す対象由来のサンプルと接触させること;並びに自己抗原の多量体と結合する免疫細胞を得ることのうちの1つ以上および/またはこれらの組み合わせを包含させ得る。
多量体型の自己抗原には、状態または疾患に関連する、および/または標的とする免疫細胞に結合(例えば、特異的に結合)する自己抗原を含有させることができ、例えば、標的免疫細胞は、選択された状態または疾患に関連するものである。状態または疾患に関連する自己抗原および標的免疫細胞としては、例えば、特定の状態または疾患を有する対象には存在するが、この状態または疾患を有さない対象には存在しない、抗原または免疫細胞;および/あるいは特定の状態または疾患を有する対象と、この状態または疾患を有さない対象とで程度が異なる(例えば、増加している)免疫原または免疫細胞が挙げられる。一部の例では、状態または疾患は癌であり得る。一部の実施形態では、癌は、黒色腫、肺癌、乳癌、腎臓癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、並びに結腸癌、リンパ腫または白血病である。一部の例では、自己抗原または免疫細胞は、癌特異的なものであり得る。自己抗原は可溶性であり得る。多量体型の自己抗原には、自己抗原(例えば、抗原および/またはエピトープ)の四量体(例えば、単量体、二量体、および/または三量体型抗原を四量体化させたものなど)が包含され得る。一部の例では、自己抗原の多量体は、検出可能な部位、例えば、ストレプトアビジン部位を含有する。多量体化の方法は、当該技術分野において既知でありかつ本明細書で開示される。
得られた標的免疫細胞からの遺伝子材料(例えば、DNAおよび/またはmRNA)の単離または精製方法は、当該技術分野において既知であり、かつ本明細書において例示される。このような遺伝子材料が得られた場合に、本明細書で開示される治療用組成物をこのような遺伝子材料を使用して作製する方法は当該技術分野において既知であり、および/または以下に要約される。上述のように、当該技術分野において既知の手法を用いて遺伝子材料に変更を加え、本明細書で開示されるペプチド変異体を作製することができる。
標的細胞内に含有されるまたは標的細胞から得られる核酸(例えば、cDNA)からペプチドを作製することは、例えば、解析法、例えば、標的とする免疫細胞(例えば、単一のまたは単離され、同定された標的免疫細胞)由来の重鎖および軽鎖可変ドメインの配列決定をすることを包含し得る。一部の例では、方法には、完全型ヒト抗体、またはそれらの断片(例えば、上記の通りのもの)を生成すること、並びに非ヒト抗体をヒト化することが包含され得る。DNAは、得られた免疫細胞から、一般的な手法を用い(例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合することのできるオリゴヌクレオチドプローブを使用することで)容易に単離および/または配列決定することができる。
単離したDNAは、発現ベクター中に配置し、次に、本来であれば抗体タンパク質を産生しない大腸菌(Escherichia coli)細胞、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、または骨髄腫細胞などの宿主細胞に遺伝子導入し、組み換え宿主細胞においてモノクローナル抗体を合成させることができる。抗体をコードしているDNAの、細菌における組換え発現についての総説としては、Skerra et al.,Curr.Opinion in Immunol.,5:256〜262(1993)およびPluckthun,Immunol.Revs.,130:151〜188(1992)が挙げられる。
抗体またはそれらの変異体の組換え発現には、一般的に、抗体をコードするポリヌクレオチドを含有している発現ベクターの構築が必要とされる。したがって、本発明は、抗体分子、抗体重鎖または軽鎖、抗体またはこれらの部分の重鎖または軽鎖可変ドメイン、あるいは重鎖または軽鎖CDR、操作可能に連結したプロモーター、をコードしているヌクレオチド配列を含む、複製可能なベクターを提供する。このようなベクターには、抗体分子の定常部をコードしているヌクレオチド配列(例えば、米国特許第5,981,216号;同第5,591,639号;同第5,658,759号および同第5,122,464号を参照されたい)を含有させることができ、並びに完全な重鎖、完全な軽鎖、または完全な重鎖および軽鎖の両方を発現させるために、抗体の可変ドメインをこのようなベクターにクローニングすることもできる。
一般的な手法により、発現ベクターを宿主細胞に移行させたならば、次に、遺伝子導入した細胞を一般的な手法により培養し、抗体を産生させる。したがって、本発明は、操作可能に異種プロモーターに連結された、本発明の抗体若しくはそれらの断片、またはそれらの重鎖若しくは軽鎖、またはそれらの部分、または本発明の単鎖抗体、をコードしているポリヌクレオチドを含有している、宿主細胞を含む。特定の実施形態では、二本鎖抗体の発現にあたり、以降に記載の通りに、完全な免疫グロブリン分子を発現させるための重鎖および軽鎖の両方をコードしているベクターを宿主細胞において同時発現させることもできる。
組換え抗体の発現の際に宿主として入手可能な哺乳類細胞株は、当該技術分野において公知であり、かつアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関(ATCC)から入手可能な、限定するものではないが、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、HeLa細胞、ベビーハムスター腎臓(BHK)細胞、サル腎臓細胞(COS)、ヒト肝細胞癌細胞(例えば、Hep G2)、ヒト腎臓上皮細胞293、および数多くのその他の細胞株などの数多くの不死化細胞株を包含する。異なる宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後のプロセシングおよび修飾に関し、特徴的でかつ特異的な機序を有する。適切な細胞株または宿主系を選択することで、発現させた抗体またはそれらの部分の正しい修飾およびプロセシングが保証されることになる。この目的を達成するために、一次転写産物の適切なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化、およびリン酸化のための細胞機序を保有している真核生物を宿主細胞として使用することができる。このような哺乳類宿主細胞としては、限定するものではないが、CHO、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293、3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2OおよびT47D、NS0(なんらかの機能性免疫グロブリン鎖を内因的に産生しないマウス骨髄腫細胞株)、SP20、CRL7O3O並びにHsS78Bst細胞が挙げられる。一実施形態では、ヒトリンパ球を不死化させることにより展開されるヒト細胞株を使用して、遺伝子組み換え法によりモノクローナル抗体を産生させることができる。一実施形態では、遺伝子組み換え法によるモノクローナル抗体の産生には、ヒト細胞株PER.C6.(Crucell,オランダ)を使用することができる。
一部の例では、本明細書で開示されるペプチドは合成により生成することができる。本明細書に記載のペプチドの合成に有用な、合成による化学的な変換および保護基による方法論(保護および脱保護)は、当該技術分野において既知であり、このようなものとしては、例えば、R.Larock,包括的有機分子変換法(Comprehensive Organic Transformations),VCH Publishers(1989);T.W.GreeneおよびP.G.M.Wuts,「有機合成における保護基(Protective Groups in Organic Synthesis)」,第3版,John Wiley and Sons(1999);L.FieserおよびM.Fieser,「有機合成用フィッシャーおよびフィッシャー試薬(Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis)」,John Wiley and Sons(1994);並びにL.Paquette,ed.,「有機合成用試薬辞典(Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis)」,John Wiley and Sons(1995)、並びにこれらの改訂版に記載のものなどが挙げられる。
ペプチドは、当業者により公知の化学合成法により製造することもできる。例えば、Fields et al.,「合成ペプチド(Synthetic Peptides)」第3章:ユーザーズガイド(User's Guide),ed.Grant,W.H.Freeman & Co.,(ニューヨーク市,N.Y.),1992,p.77を参照されたい。したがって、ペプチドは、自動化したメリーフィールド固相合成法を使用して、例えば、アプライドバイオシステムズのモデル430Aまたは431のペプチド合成装置において、側鎖保護されたアミノ酸を使用し、t−Boc若しくはFmoc化学法のいずれかにより保護したα−NH2により合成することができる。
本明細書に記載のペプチドを製造する際の一つの手法には、ペプチド固相合成法(SPPS)が使用される。リンカー分子を用い酸に不安定な結合を介し、C末端アミノ酸をポリスチレン樹脂と結合させる。この樹脂は、合成に使用される溶媒に不溶性であることから、過剰な試薬および副産物は比較的簡単かつ迅速に洗い流される。N末端は、酸には安定であるものの塩基により除去することのできるFmoc基により保護される。任意の側鎖官能基は、塩基に安定で酸には不安定な基により保護される。
天然の化学連結法を使用し、個々の合成ペプチドを結合させることにより、より長鎖のペプチド鎖を合成することができる。別の方法としては、より長鎖の合成ペプチドは、公知の組換えDNA法により合成することができる。このような手法は、詳細なプロトコルを備える公知の一般的な手法により提供される。本発明のペプチドをコードしている遺伝子を構築するため、アミノ酸配列を逆翻訳して、アミノ酸配列をコードしている核酸配列、好ましくは、遺伝子を発現させる生物に関し最適化されたコドンを有する核酸配列を得る。次に、合成遺伝子を、典型的にはペプチドおよび必要に応じて任意の制御エレメントをコードするオリゴヌクレオチドを合成することにより作製する。合成遺伝子を適切なクローニングベクターに挿入し、宿主細胞に形質移入させる。次に、選択された発現系および宿主に合った、好適な条件下でペプチドを発現させる。このペプチドを、一般的な手法により精製し、および特徴づける。
ペプチドは、ハイスループットでコンビナトリアルな方法、例えば、アドバンスドケムテックから入手可能な、ハイスループットなマルチチャンネルシンセサイザーで合成することができる。
ペプチド結合は、例えば、ペプチドの生理学的安定性を向上させるために、レトロ・インベルソ(retro-inverso)結合(C(O)−NH);還元型アミド結合(NH−CH2);チオメイレン結合(S−CH2またはCH2−S);オキソメチレン結合(O−CH2またはCH2−O);エチレン結合(CH2−CH2);チオアミド結合(C(S)−NH);トランス型オレフィン結合(CH=CH);フッ素置換されたトランス型オレフィン結合(CF=CH);ケトメチレン結合(C(O)−CHR)またはCHR−C(O)(式中、RはHまたはCH3である);およびフッ素−ケトメチレン結合(C(O)−CFRまたはCFR−C(O)(式中、RはHまたはFまたはCH3である)により置き換えることができる。
ペプチドは、アセチル化、アミド化、ビオチン化、シンナモイル化、ファルネシル化、フルオレセイン化、ホルミル化、ミリストイル化、パルミトイル化、リン酸化(Ser、TyrまたはThr)、ステアロイル化、スクシニル化およびスルフリル化によりさらに修飾することができる。上記の通り、ペプチドを例えば、ポリエチレングリコール(PEG);アルキル基(例えば、C1〜C20線状または分岐状アルキル基);脂肪酸ラジカル;およびこれらの組み合わせと結合させることができる。
一部の例では、ペプチドは、免疫グロブリン分子の精製に関し、当該技術分野において既知の任意の方法、例えば、クロマトグラフ(例えば、イオン交換、アフィニティ(特にプロテインAまたはプロテインG特異的抗原に対する親和性をもとにしたもの)、およびサイズ排除クロマトグラフィー)、遠心分離、溶解度の違い、あるいはタンパク質の精製に関する任意のその他の一般的な手法により精製することができる。さらに、本発明の抗体またはそれらの断片は、精製を容易にするため、上記のまたは当該技術分野において既知の異種ポリペプチド配列(本明細書において「タグ」と参照される)と融合させることもできる。
代表的な、非限定的な方法の概略を図21に示す。この概略は、順序を指定するものではない。
使用方法
一部の例では、本開示は、本明細書で開示される組成物を対象に投与することを包含する処置方法を提供する。
一部の例では、本開示は、本明細書で開示される組成物を対象に投与することを包含する処置方法を提供する。
本明細書においては、対象における癌または癌の症状の処置および/または予防方法も提供され、方法は、MHCクラスI型ポリペプチド関連性配列A(MICA)に免疫特異的に結合する、治療に有効な量のペプチドを、前記対象に投与することを包含し、前記ペプチドは、5以下の保存的アミノ酸置換を有する、表1に示す抗体ID1、6、7、8または9のVHの相補性決定領域(CDR)3と、5以下の保存的アミノ酸置換を有する、表1に示す抗体ID1、6、7、8または9のVLのCDR3と、を含む。一部の実施例では、癌は、MICAの過剰発現を伴う癌である。一部の実施形態では、癌は、黒色腫、肺癌、乳癌、腎臓癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、並びに結腸癌、リンパ腫または白血病である。一部の実施形態では、癌は黒色腫である。一部の実施形態では、癌は、形質細胞の悪性腫瘍であり、例えば、多発性骨髄腫(MM)または形質細胞の前癌性状態である。一部の実施例では、対象は、それまでに癌を有するものとして診断されているか、または癌になりやすいものとして診断されている。
一部の例では、本開示は、対象における癌または癌の症状の処置および/または予防方法を提供し、方法は、MHCクラスI型ポリペプチド関連性配列A(MICA)に特異的に結合する単離抗体を含む治療に有効な量の組成物を、前記対象に投与することを包含し、前記抗体は、配列番号11、149、168、186、または204のVH配列として示される、VH CDR1、VH CDR2、およびVH CDR3を含む重鎖可変領域(VH)と、配列番号4、151、170、189、または206の軽鎖可変領域(VL)配列と、を含む。
本明細書においては、対象における癌または癌の症状の処置および/または予防方法も提供され、方法は、アンジオポエチンに免疫特異的に結合する、治療に有効な量のペプチドを、前記対象に投与することを包含し、前記ペプチドは、5以下の保存的アミノ酸置換を有する、表1に示す抗体ID2、3、4、または5、または10のVHの相補性決定領域(CDR)3と、5以下の保存的アミノ酸置換を有する、表1に示す抗体ID2、3、4、または5のVLのCDR3と、を含む。一部の実施例では、癌は、MICAの過剰発現を伴う癌である。一部の実施形態では、癌は、黒色腫、肺癌、乳癌、腎臓癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、並びに結腸癌、リンパ腫または白血病である。一部の実施形態では、癌は黒色腫である。一部の実施形態では、癌は、形質細胞の悪性腫瘍であり、例えば、多発性骨髄腫(MM)または形質細胞の前癌性状態である。一部の実施例では、対象は、それまでに癌を有するものとして診断されているか、または癌になりやすいものとして診断されている。
一部の例では、本開示は、対象における癌または癌の症状の処置および/または予防方法を提供し、方法は、アンジオポエチン(例えば、アンジオポエチン−2)に特異的に結合する単離抗体を含む治療に有効な量の組成物を、前記対象に投与することを包含し、前記抗体は、配列番号20、38、56、74、または222のVH配列として示される、VH CDR1、VH CDR2、およびVH CDR3を含む重鎖可変領域(VH)と、配列番号29、47、65、83、または224の軽鎖可変領域(VL)の配列と、を含む。
当業者により公知の癌の症状としては、限定するものではないが、異常な分子特徴、非対称性、境界、色、および/または直径など分子外見の変化、新規色素沈着を生じた皮膚面積、異常なほくろ、爪下暗色化領域、***腫瘤、乳頭変化、***嚢胞、***痛、死亡、体重減少、脱力感、過剰な倦怠感、食欲低下、食欲不振、慢性咳嗽、息切れの悪化、喀血、血尿、血便、悪心、嘔吐、肝転移、肺転移、骨転移、腹部膨満、鼓腸、腹腔内液体貯留、膣出血、便秘、腹部膨隆、結腸の穿孔、急性腹膜炎(感染、発熱、疼痛)、疼痛、吐血、大量の発汗、発熱、高血圧、貧血症、下痢、黄疸、目眩、悪寒、筋痙攣、大腸癌転移、肺転移、膀胱転移、肝転移、骨転移、腎転移、および膵転移、嚥下障害、および同様の症状が挙げられる。
本明細書で開示される方法は、広範な種、例えば、ヒト、非ヒト霊長類(例えば、サル)、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、シカ、エルク、ヤギ、イヌ、ネコ、イタチ、ウサギ、モルモット、ハムスター、ラット、およびマウスに適用することができる。
本明細書で使用するとき、用語「処置」または「処置する」は、対象が罹患している疾患または状態を、一部または完全に軽減、阻害、寛解、および/または軽減することを指す。一部の例では、処置により、患者が罹患している疾患または状態が持続的に消失し得る。
一般的に、方法は、状態または疾患に関連するリスクを有する、あるいは状態または疾患を有する対象を選別することを包含する。一部の例では、対象の状態または疾患は、本明細書で開示される医薬組成物により処置することができる。例えば、一部の例では、方法には、癌を有する対象を選別することが包含され、例えば、対象の癌は、MICAおよび/またはアンジオポエチン−2のいずれかまたは両方を標的とすることにより処置することができる。
一部の例では、処置方法には、必要に応じて、患者が罹患している疾患または病状を予防または処置するための、単回投与、複数回投与、および反復投与が包含される。場合によっては、処置方法には、処置前、処置中、および/または処置後に対象において疾患の程度を評価することを包含させることができる。一部の例では、処置は、対象において検出される疾患の度合いが低減するまで継続することができる。
本明細書で使用するとき、用語「投与する」、「投与すること」、または「投与」は、形態にかかわらず本発明のペプチドを、埋め込むこと、吸収させること、摂取させること、注入すること、または吸入させることを指す。一部の例では、本明細書で開示される1つ以上のペプチドは、対象に局所的に(例えば、経鼻的に)、および/または経口的に投与することができる。例えば、本明細書に記載の方法には、有効な量の化合物または化合物の組成物を投与して、所望のまたは記載の効果を得ることが包含される。任意の特定の患者に対する具体的な投与法および処置レジメンは、使用する具体的な化合物の活性、年齢、体重、通常の健康状態、性別、体重、投与時間、***速度、合剤、疾患、状態、または症状の重症度および経過、疾患、状態、または症状に対する患者の性質、並びに処置を行う医師の判断などといった多様な因子に応じ変化し得る。
投与後に、対象を、疾患の程度を検出、診断、または判定するために評価することができる。一部の例では、処置を、対象において検出される疾患の程度が変化(例えば、低減)するまで継続することができる。
患者の状態の改善に応じ(例えば、対象における疾患の程度の変化(例えば、低減))、必要に応じて、本発明の化合物、組成物または組み合わせの維持量を投与することができる。続いて、症状の変化に応じ、改善された状態が維持される程度にまで、投与量または投与頻度あるいはこの両方を減少させることもできる。しかしながら、患者は、何らかの疾患の症状の再発に応じて、長期にわたって断続的に処置する必要がある場合もある。
一部の例では、本開示は、ヒト対象由来の、免疫細胞、例えば、B細胞および/または記憶B細胞を検出する方法を提供する。例えば、このような方法を使用して、ヒト対象において、免疫細胞、例えば、B細胞および/または記憶B細胞の程度を、例えばイベントを追跡して、モニターすることができる。イベント例としては、限定するものではないが、疾患、感染症の検出;本明細書で開示される治療用組成物の投与、治療薬または処置レジメンの投与、ワクチンの投与、免疫応答の誘導が挙げられる。このような方法は、臨床的におよび/または研究用に使用することができる。
本発明は、以降の実施例でさらに説明される。これらの実施例は、請求項に記載される本発明の範囲を制限するものではない。
本明細書に記載される方法は、所定の抗原に対し特異性を有する希少な記憶B細胞を、限られた量の末梢血から、高感度に、特異的におよび高信頼度で検出可能なものである。本方法は、抗原の排除後数カ月から数年間にわたり記憶B細胞の可視化および単離を可能にする。
本明細書で開示される方法の原理の証明は、Franz et al.(Blood,118(2):348〜357(2011))に詳細に報告される通り、破傷風毒素のC末断片(TTCF)の四量体を使用してなされている。この参考文献は、参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。
ほとんどの個体は破傷風トキソイドによりワクチン接種を受け、ワクチンによりIgG抗体の持続性力価を誘導されることから、TTCF(すなわち、TTCFの、52kDa、非毒性のC末断片)をモデル抗原として選択した(Amanna et al.,N.Engl.J.Med.,357:1903〜1915,2007)。したがって、本明細書で開示される方法において、TTCFを使用し、対象の大規模なプールを検証することができた。しかしながら、当業者であれば、一般的な手法を用い、任意の疾患に関連する抗原を包含するよう、本方法を改変することができることは理解するであろう。以降に例示される通り、このような改変は、癌関連抗原であるMICAおよびアンジオポエチン−2を抗原とする抗体を獲得することにより示される。
実施例1:抗原の発現および四量体の形成
以下にさらに詳細に記載される通り、TTCFは大腸菌(Eschericia coli)において発現させ、BirA酵素による部位特異的モノビオチン化のためBirA部位をN末端に取り付けた。タンパク質とビオチン化部位の間に可動性リンカーを配置し、抗体の結合に関係する立体障害を回避した。TTCFは、アニオン交換クロマトグラフィーにより精製し、BirAによりビオチン化し、ゲル濾過クロマトグラフィーにより、未結合のビオチンおよびBirAから分離した。蛍光標識したストレプトアビジンを、モル比1:4でビオチン化TTCF抗原とインキュベートし、TTCF四量体を生成した。これらの四量体を、次に一連のmAbとともに使用して、破傷風トキソイドに特異的な記憶B細胞を同定した。
以下にさらに詳細に記載される通り、TTCFは大腸菌(Eschericia coli)において発現させ、BirA酵素による部位特異的モノビオチン化のためBirA部位をN末端に取り付けた。タンパク質とビオチン化部位の間に可動性リンカーを配置し、抗体の結合に関係する立体障害を回避した。TTCFは、アニオン交換クロマトグラフィーにより精製し、BirAによりビオチン化し、ゲル濾過クロマトグラフィーにより、未結合のビオチンおよびBirAから分離した。蛍光標識したストレプトアビジンを、モル比1:4でビオチン化TTCF抗原とインキュベートし、TTCF四量体を生成した。これらの四量体を、次に一連のmAbとともに使用して、破傷風トキソイドに特異的な記憶B細胞を同定した。
TTCFをpET−15b(Novagen)にクローニングした。BL21(DE3)大腸菌(Eschericia coli)において、1mMのイソプロピルβ−D−1−チオガラクトピラノシド(IPTG)により28℃で4時間タンパク質発現を誘導した。細胞を洗浄し、溶解し、得られる上清を回収した。HIS−選択親和性カラム(Sigma)を使用して、TTCFを精製した。タンパク質分解によりHisタグを除去した。同様の方法を用い、マウスCD80膜近位ドメインを産生した。タンパク質をモノビオチン化した。特定の実験に際し、Alexa−488染料分子(Molecular Probes)を、ビオチン化TTCFまたはCD80の一級アミンに連結した。
ビオチン化抗原を、モル比4:1で特級PE標識ストレプトアビジン(Molecular Probes)と少なくとも20分間氷上でインキュベートし、抗原四量体を調製した。使用に先立ち、四量体抗原を遠心分離し、凝集体を除去した。一部の実施例では、四量体は、4:1比のAlexa−fluor−488標識抗原と非蛍光ストレプトアビジンとにより形成させた。
実施例2:特定方法
Franz et al.,Blood,118(2):348〜357(2011)に記載の通りに方法を実施した。
Franz et al.,Blood,118(2):348〜357(2011)に記載の通りに方法を実施した。
細胞は、BD FACS Aria II細胞選別機で分取した。細胞は単一細胞として分取した。サンプルからは、最初に、一連の除外マーカー(CD3、CD14、CD16、7AAD)が陰性のCD19+細胞をゲーティングし、次に、CD27を高発現しかつCD19を即時的に(immediate level)発現していると同定された形質芽球をゲーティングし、最後に四量体+ CD19+細胞をゲーティングした。
記憶B細胞は低頻度であることから、注意深く、可能な限りバックグラウンドを減少させる必要があった。B細胞は、最初はネガティブ選別により濃縮し(CD2、CD3、CD14、CD16、CD56およびグリコホリンAに対する抗体カクテル)、四量体に非特異的に結合し得る大部分の細胞を除去した。濃縮細胞を均一に分注し、TTCFまたは対照四量体により染色した後、CD19、CD27およびIgMにより標識して、クラススイッチした記憶B細胞を特異的に選択した。ゲーティング戦略では、CD19を発現し、一連の除外マーカー(CD3、CD14、CD16、7AAD)による標識を欠き、メモリーマーカーCD27を発現し、かつIgMの発現を欠くことをクラススイッチのエビデンスとしてみなした。対象とする抗原に特異的な記憶B細胞を可視化するため、四量体の染色をCD27染色に対しプロットした。mRNA抽出緩衝液3μLを入れたPCR用ストリップチューブに、四量体陽性のB細胞を直接分取した。
分取の間チューブは冷温に維持し、分取した細胞は凍結し、−80℃で保管した。CD19+ CD27+ IgM−B細胞を陽性対照として使用した。
既存のネステッドPCRプロトコルを使用して、重鎖および軽鎖可変領域を増幅した(Wang et al.,J.Immunol.Methods.,244:217〜225,2000)。混入を最小限に抑えるのに適切な条件下でmRNAの増幅を行った。使用したプライマーは次のものを含む:
TAATACGACTCACTATAGGTTCGGGGAAGTAGTCCTTGACCAGG(配列番号:91);
TAATACGACTCACTATAGGGATAGAAGTTATTCAGCAGGCACAC(配列番号:92);
TAATACGACTCACTATAGGCGTCAGGCTCAGRTAGCTGCTGGCCGC(配列番号:93)。
TAATACGACTCACTATAGGTTCGGGGAAGTAGTCCTTGACCAGG(配列番号:91);
TAATACGACTCACTATAGGGATAGAAGTTATTCAGCAGGCACAC(配列番号:92);
TAATACGACTCACTATAGGCGTCAGGCTCAGRTAGCTGCTGGCCGC(配列番号:93)。
Franz et al.,Blood,118(2):348〜357(2011)に記載の通りにネステッドRT−PCRを実施した。
混入をモニターし、予防するため、陰性対照を包含させた。TTCF四量体により標識した計35の単一細胞から、32の重鎖および30の軽鎖断片を増幅させ、PCR産物をゲルから精製し直接配列決定したところ、最終的なPCR効率は89%に相当した。配列解析により、TTCF四量体+細胞では、特定の遺伝子配列が優先されることはなく、異なる多様なVHD−JH遺伝子配列が選択されていたことが明らかになった。観察された配列により、クローンにおいて、体細胞突然変異により細胞が多様化していることが支持された。
抗体産生および精製には、重鎖および軽鎖可変ドメインのDNAを、ウシプロラクチンシグナルペプチド配列並びに完全長のIgG1またはκ軽鎖定常ドメインを含有している別個のpcDNA3.3発現ベクターにクローニングすることを包含させた。抗体は、37℃、8% CO2下で、100mL培養フラスコを用い、8mMのGlutamax(Gibco)を添加したCHO−S培地(Invitrogen)中で発現させた。遺伝子導入の一日前に、細胞は6×105個/mLとして分取した。遺伝子導入の当日に、必要があれば細胞は1×106個/mLに調整した。MAX transfection reagent(Invitrogen)を使用して、25μgの重鎖および軽鎖プラスミドDNAを同時導入し、遺伝子導入した細胞を6〜8日間培養した。プロテインGセファロースビーズを用いてタンパク質を得て、100mMグリシン(pH2.5)を使用して抗体を溶出し、Spin−X遠心チューブを使用してビーズから分離した。マイクロバイオスピンカラム(BioRad)を使用して、精製抗体をリン酸緩衝食塩水(PBS)に移した。タンパク質濃度は吸光度(280nm)により評価した。
飽和結合アッセイに関し、非ビオチン化、MonoQ精製TTCFをユーロピウムにより標識し、未結合のユーロピウムを除去した。96ウェル平底プレートの各ウェルを、20ngの抗体を含む100mMのNaHCO3緩衝液(pH9.6)により一晩コーティングした。ウシ血清アルブミン(BSA)およびウシγグロブリンを添加したアッセイ緩衝液を用い、ブロッキングを行った。アッセイ緩衝液によりTTCF−ユーロピウムを希釈し(100nM〜4pM)、3ウェル1組で各ウェルに200μLずつ分注した。プレートを37℃で2時間インキュベートし、200μLの洗浄緩衝液(50mMのTris(pH8)、150mMのNaCl、20μMのEDTA、0.05% Tween)で3回洗浄した。各ウェルに100μLの増感液を加え、Victor3プレートリーダーを615nmで使用して、蛍光をカウントした。
ソフトウェアIMGT/V−QuestおよびJIONSOLVERを使用し、重鎖および軽鎖可変ドメイン配列を解析した。FlowJo解析ソフトウェアを使用し、フローサイトメトリーデータを評価した。ソフトウェアGraphPad Prism 5を使用し、独立t検定により統計解析を実施した。抗体のKD値を測定するため、ソフトウェアGraphPad Prism 5を使用して、非線形回帰分析により飽和結合データを当てはめた。
実施例3:多量体化により記憶B細胞の識別が促進される
TTCF四量体および単量体を比較した。Alexa−488によりTTCFを蛍光標識し、次に単量体形態で使用するか、あるいは未標識のストレプトアビジンを使用して四量体に変換した(上記を参照されたい)。次に、濃縮B細胞を、同濃度のTTCF−Alexa−488四量体または単量体とインキュベートした。対照タンパク質(CD80膜近位ドメイン)を同様の方法で標識し、同様に四量体として使用した。
TTCF四量体および単量体を比較した。Alexa−488によりTTCFを蛍光標識し、次に単量体形態で使用するか、あるいは未標識のストレプトアビジンを使用して四量体に変換した(上記を参照されたい)。次に、濃縮B細胞を、同濃度のTTCF−Alexa−488四量体または単量体とインキュベートした。対照タンパク質(CD80膜近位ドメイン)を同様の方法で標識し、同様に四量体として使用した。
図22Aおよび22Bに示す通り、3つのドナー由来の細胞を使用したところ、TTCF単量体では一部の記憶B細胞が標識されていたのに対し、四量体では識別頻度は大幅に増大した(1.6〜7.3倍)。3つのTTCF特異的記憶B細胞のドナーのうちの1つは四量体により検出されたが、単量体では検出されなかった。
これらの結果から、末梢血に存在する記憶B細胞は非常にわずかであるにもかかわらず、抗原四量体により、BCRの抗原特異性に基づき、記憶B細胞を高感度に検出することが可能になることが示される。TTCF特異的にクラススイッチした記憶B細胞は、適切なTTCF抗原四量体により高感度に標識されたのに対し、四量体型の対照により標識されたバックグラウンドは一貫して低かった。
実施例4:方法/抗体の確認
オーバーラップPCRにより、IgG重鎖およびκ鎖の定常部を、単離された可変配列と連結して、完全ヒト型抗体を生成した。CHO−S細胞を使用し、無血清哺乳類発現系により、6〜8日間にわたって抗体を一過性に発現させた。プロテインGおよびゲル濾過クロマトグラフィーを使用して、抗体を精製した。
オーバーラップPCRにより、IgG重鎖およびκ鎖の定常部を、単離された可変配列と連結して、完全ヒト型抗体を生成した。CHO−S細胞を使用し、無血清哺乳類発現系により、6〜8日間にわたって抗体を一過性に発現させた。プロテインGおよびゲル濾過クロマトグラフィーを使用して、抗体を精製した。
図23に示す通り、TTCF特異的形質芽球から単離された抗体は、TTCF抗原に対し、KD=2.2nM(TTCF Ab 1)および323pM(TTCF Ab 2)の高結合親和性を示した(図23B)。記憶B細胞から単離した抗体は、他の抗体に対しても、KD=382pM、228pM、および1.4nMの高結合親和性を示した(TTCF Abs 3、4および5)(図23B)。
これらのデータにより、本明細書で開示される方法の特異性が支持される。さらには、本明細書に記載の方法の特異性は、3の異なるドナーから5種の抗TTCF抗体を構築することによっても実証され、これらのすべての抗体は高親和性でTTCFと結合した。
本明細書に示すデータは、宿主由来の抗原が排除されてから長時間が経過した後でも、抗原四量体により、記憶B細胞を高感度に検出することができることも実証する。
実施例5:抗MICA抗体の取得
本明細書に記載の方法を使用して、MICAに対し免疫特異的に結合する抗体を作製した。
本明細書に記載の方法を使用して、MICAに対し免疫特異的に結合する抗体を作製した。
簡潔に述べると、抗原のモノビオチン化を可能にするC末端BirAタグ(GLNDIFEAQKIEWHE(配列番号238))とともに、MICA抗原(UniGene Hs.130838)を発現させた。R−フィコエリトリン(PE)で標識したストレプトアビジン(SA)により、抗原を四量体化した(MICA:SAのモル比4:1)。GM−CSF発現ベクター(GVAX)(PNAS 103:9190、2006)により遺伝子導入した自己腫瘍細胞をワクチン接種した進行期黒色腫患者から末梢血単核細胞を得て、次に抗CTLA−4モノクローナル抗体イピリムマブ(YERVOY(商標)(Bristol Myers Squibから入手可能))により処理した。末梢血単核細胞を迅速に解凍し、洗浄し、2%のウシ胎児血清を添加したリン酸緩衝食塩水(pH7.2)により5×106にて再懸濁し、約0.1ug/mLの四量体により氷上で30分間染色した。クラススイッチした記憶B細胞(CD19+、CD27+、かつIgM−)を識別するため、抗体を加えた。T細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、および死細胞を標識する一連の排除抗体をインキュベートして、四量体によるバックグラウンドの染色を軽減させた(CD3、CD14、CD16、7−AAD)。BD FACS Aria IIを使用し、MICA四量体と結合する単一のB細胞をPCR用8連ストリップチューブに分取した。以下に記載の遺伝子特異的なプライマーを使用して、Epicentre Biotechnologiesから市販のキット(カタログ番号MBCL90310)により、B細胞受容体(BCR)のmRNAを増幅した。
mRNAの増幅
IgG−T7:AATACGACTCACTATAGGTTCGGGGAAGTAGTCCTTGACCAGG(配列番号:94)
κ−T7:TAATACGACTCACTATAGGGATAGAAGTTATTCAGCAGGCACAC(配列番号:95)
λ−T7:TAATACGACTCACTATAGGCGTCAGGCTCAGRTAGCTGCTGGCCGC(配列番号:96)
mRNAの増幅
IgG−T7:AATACGACTCACTATAGGTTCGGGGAAGTAGTCCTTGACCAGG(配列番号:94)
κ−T7:TAATACGACTCACTATAGGGATAGAAGTTATTCAGCAGGCACAC(配列番号:95)
λ−T7:TAATACGACTCACTATAGGCGTCAGGCTCAGRTAGCTGCTGGCCGC(配列番号:96)
第1回目のPCR
VHL−1:TCACCATGGACTG(C/G)ACCTGGA(配列番号:97)
VHL−2:CCATGGACACACTTTG(C/T)TCCAC(配列番号:98)
VHL−3:TCACCATGGAGTTTGGGCTGAGC(配列番号:99)
VHL−4:AGAACATGAAACA(C/T)CTGTGGTTCTT(配列番号:100)
VHL−5:ATGGGGTCAACCGCCATCCT(配列番号:101)
VHL−6:ACAATGTCTGTCTCCTTCCTCAT(配列番号:102)
VkL−1:GCTCAGCTCCTGGGGCTCCTG(配列番号:103)
VkL−2:CTGGGGCTGCTAATGCTCTGG(配列番号:104)
VkL−3:TTCCTCCTGCTACTCTGGCTC(配列番号:105)
VkL−4:CAGACCCAGGTCTTCATTTCT(配列番号:106)
VlL−1:CCTCTCCTCCTCACCCTCCT(配列番号:107)
VlL−2:CTCCTCACTCAGGGCACA(配列番号:108)
VlL−3:ATGGCCTGGA(T/C)C(C/G)CTCTCC(配列番号:109)
CgII:GCCAGGGGGAAGAC(C/G)GATG(配列番号:110)
CkII:TTTCAACTGCTCATCAGATGGCGG(配列番号:111)
ClII:AGCTCCTCAGAGGAGGG(C/T)GG(配列番号:112)
VHL−1:TCACCATGGACTG(C/G)ACCTGGA(配列番号:97)
VHL−2:CCATGGACACACTTTG(C/T)TCCAC(配列番号:98)
VHL−3:TCACCATGGAGTTTGGGCTGAGC(配列番号:99)
VHL−4:AGAACATGAAACA(C/T)CTGTGGTTCTT(配列番号:100)
VHL−5:ATGGGGTCAACCGCCATCCT(配列番号:101)
VHL−6:ACAATGTCTGTCTCCTTCCTCAT(配列番号:102)
VkL−1:GCTCAGCTCCTGGGGCTCCTG(配列番号:103)
VkL−2:CTGGGGCTGCTAATGCTCTGG(配列番号:104)
VkL−3:TTCCTCCTGCTACTCTGGCTC(配列番号:105)
VkL−4:CAGACCCAGGTCTTCATTTCT(配列番号:106)
VlL−1:CCTCTCCTCCTCACCCTCCT(配列番号:107)
VlL−2:CTCCTCACTCAGGGCACA(配列番号:108)
VlL−3:ATGGCCTGGA(T/C)C(C/G)CTCTCC(配列番号:109)
CgII:GCCAGGGGGAAGAC(C/G)GATG(配列番号:110)
CkII:TTTCAACTGCTCATCAGATGGCGG(配列番号:111)
ClII:AGCTCCTCAGAGGAGGG(C/T)GG(配列番号:112)
第2回目のPCR
VH−1:CAGGT(G/C)CAGCTGGT(G/A)CAGTC(配列番号:113)
VH−2:CAG(A/G)TCACCTTGAAGGAGTC(配列番号:114)
VH−3:(G/C)AGGTGCAGCTGGTGGAGTC(配列番号:115)
VH−4:CAGGTGCAGCTGCAGGAGTC(配列番号:116)
VH−5:GA(G/A)GTGCAGCTGGTGCAGTC(配列番号:117)
VH−6:CAGGTACAGCTGCAGCAGTC(配列番号:118)
Vk−1:CG(A/C)CATCC(A/G)G(A/T)TGACCCAGT(配列番号:119)
Vk−2:CGAT(A/G)TTGTGATGAC(C/T)CAG(配列番号:120)
Vk−3:CGAAAT(T/A)GTG(T/A)TGAC(G/A)CAGTCT(配列番号:121)
Vk−4:CGACATCGTGATGACCCAGT(配列番号:122)
Vl−1:CCAGTCTGTGCTGACTCAGC(配列番号:123)
Vl−2:CCAGTCTGCCCTGACTCAGC(配列番号:124)
Vl−3:CTCCTATGAGCTGAC(T/A)CAGC(配列番号:125)
CgIII:GAC(C/G)GATGGGCCCTTGGTGGA(配列番号:126)
CkIII:AAGATGAAGACAGATGGTGC(配列番号:127)
ClIII:GGGAACAGAGTGACCG(配列番号:128)
VH−1:CAGGT(G/C)CAGCTGGT(G/A)CAGTC(配列番号:113)
VH−2:CAG(A/G)TCACCTTGAAGGAGTC(配列番号:114)
VH−3:(G/C)AGGTGCAGCTGGTGGAGTC(配列番号:115)
VH−4:CAGGTGCAGCTGCAGGAGTC(配列番号:116)
VH−5:GA(G/A)GTGCAGCTGGTGCAGTC(配列番号:117)
VH−6:CAGGTACAGCTGCAGCAGTC(配列番号:118)
Vk−1:CG(A/C)CATCC(A/G)G(A/T)TGACCCAGT(配列番号:119)
Vk−2:CGAT(A/G)TTGTGATGAC(C/T)CAG(配列番号:120)
Vk−3:CGAAAT(T/A)GTG(T/A)TGAC(G/A)CAGTCT(配列番号:121)
Vk−4:CGACATCGTGATGACCCAGT(配列番号:122)
Vl−1:CCAGTCTGTGCTGACTCAGC(配列番号:123)
Vl−2:CCAGTCTGCCCTGACTCAGC(配列番号:124)
Vl−3:CTCCTATGAGCTGAC(T/A)CAGC(配列番号:125)
CgIII:GAC(C/G)GATGGGCCCTTGGTGGA(配列番号:126)
CkIII:AAGATGAAGACAGATGGTGC(配列番号:127)
ClIII:GGGAACAGAGTGACCG(配列番号:128)
第1のPCRおよび第2のPCRに使用したプライマーおよびPCRのサイクル条件は、Wang and Stollar et al.(journal of immunological methods2000)に記載の方法をもとに最適化した。
上記のプライマーセットにより十分に網羅されていない可能性のあった重鎖可変領域配列を網羅するよう、代替となる重鎖可変領域の順方向プライマーのセットを開発した。以降の代替的なプライマーを作成した:
第1回目のPCR
VHL1−58:TCACTATGGACTGGATTTGGA(配列番号:129)
VHL2−5:CCATGGACA(C/T)ACTTTG(C/T)TCCAC(配列番号:130)
VHL3−7:GTAGGAGACATGCAAATAGGGCC(配列番号:131)
VHL3−11:AACAAAGCTATGACATATAGATC(配列番号:132)
VHL3−13.1:ATGGAGTTGGGGCTGAGCTGGGTT(配列番号:133)
VHL3−13.2:AGTTGTTAAATGTTTATCGCAGA(配列番号:134)
VHL3−23:AGGTAATTCATGGAGAAATAGAA(配列番号:135)
VHL4−39:AGAACATGAAGCA(C/T)CTGTGGTTCTT(配列番号:136)
VHL4−61:ATGGACTGGACCTGGAGCATC(配列番号:137)
VHL−9:CCTCTGCTGATGAAAACCAGCCC(配列番号:138)
第1回目のPCR
VHL1−58:TCACTATGGACTGGATTTGGA(配列番号:129)
VHL2−5:CCATGGACA(C/T)ACTTTG(C/T)TCCAC(配列番号:130)
VHL3−7:GTAGGAGACATGCAAATAGGGCC(配列番号:131)
VHL3−11:AACAAAGCTATGACATATAGATC(配列番号:132)
VHL3−13.1:ATGGAGTTGGGGCTGAGCTGGGTT(配列番号:133)
VHL3−13.2:AGTTGTTAAATGTTTATCGCAGA(配列番号:134)
VHL3−23:AGGTAATTCATGGAGAAATAGAA(配列番号:135)
VHL4−39:AGAACATGAAGCA(C/T)CTGTGGTTCTT(配列番号:136)
VHL4−61:ATGGACTGGACCTGGAGCATC(配列番号:137)
VHL−9:CCTCTGCTGATGAAAACCAGCCC(配列番号:138)
第2回目のPCR
VH1−3/18:CAGGT(C/T)CAGCT(T/G)GTGCAGTC(配列番号:139)
VH1−45/58:CA(A/G)ATGCAGCTGGTGCAGTC(配列番号:140)
VH2−5:CAG(A/G)TCACCTTGA(A/G)GGAGTCTGGT(配列番号:141)
VH3−9/23/43:GA(A/G)GTGCAGCTG(T/G)TGGAGTC(配列番号:142)
VH3−16:GAGGTACAACTGGTGGAGTC(配列番号:143)
VH3−47:GAGGATCAGCTGGTGGAGTC(配列番号:144)
V4−34:CAGGTGCAGCTACAGCAGTG(配列番号:145)
V4−30−2/39:CAGCTGCAGCTGCAGGAGTC(配列番号:146)
VH7−4−1:CAGGTGCAGCTGGTGCAATC(配列番号:147)
VH1−3/18:CAGGT(C/T)CAGCT(T/G)GTGCAGTC(配列番号:139)
VH1−45/58:CA(A/G)ATGCAGCTGGTGCAGTC(配列番号:140)
VH2−5:CAG(A/G)TCACCTTGA(A/G)GGAGTCTGGT(配列番号:141)
VH3−9/23/43:GA(A/G)GTGCAGCTG(T/G)TGGAGTC(配列番号:142)
VH3−16:GAGGTACAACTGGTGGAGTC(配列番号:143)
VH3−47:GAGGATCAGCTGGTGGAGTC(配列番号:144)
V4−34:CAGGTGCAGCTACAGCAGTG(配列番号:145)
V4−30−2/39:CAGCTGCAGCTGCAGGAGTC(配列番号:146)
VH7−4−1:CAGGTGCAGCTGGTGCAATC(配列番号:147)
簡潔に述べると、初回のPCRには、mRNA増幅により生成したcDNA 2uLをテンプレートとして使用し、次のサイクル条件を用いた:前増幅3サイクル(94℃/45秒、45℃/45秒、72℃/105秒);増幅30サイクル(94℃/45秒、50℃/45秒、72℃/105秒);最終的な伸長、72℃/10分。
初回のPCR産物3uLを、第2回目のネステッドPCRのテンプレートとして使用した。3サイクルの前増幅を省略したことを除き、初回のPCRと同様のサイクル条件を使用した。いずれのPCR工程も、クローン化したPfuポリメラーゼAD(Agilent Technologies)を使用して実施した。PCR産物を1%アガロースゲルで分離し、Zymoclean DNAゲル回収キット(Zymo Research)を使用して、大きさにして300〜400ヌクレオチドを単離した。第2回目のネステッドPCR用の順方向および逆方向プライマーを使用して、配列決定を実施した。2段階ネステッドPCRにより、重鎖および軽鎖のBCR可変ドメインを増幅する(上記を参照のこと)。GM−CSF発現ベクター(GVAX)により遺伝子導入した自己腫瘍細胞をワクチン接種した進行期黒色腫患者から、末梢血単核細胞を得た(PNAS 103:9190,2006)。完全長のIgG1抗体として、CHO−S発現系において抗体を発現させた。
2つの独立したビーズ系アッセイにより、MICAに結合する抗MICA抗体を検証した。初回アッセイには、各種MICA対立遺伝子産物(One Lambda、カタログ番号LSMICA001)に対し、抗MICA抗体の検出用に設計された市販の溶液系ビーズアッセイキットを使用した。各種濃度のMICA抗体をビーズとともにインキュベートし、次に洗浄し、フィコエリトリンと結合させた抗ヒトIgG抗体とともにインキュベートした。2次洗浄工程後に、装置Luminexでビーズを解析した。陰性対照は、フィコエリトリンのみ(抗MICA抗体は含まない)と結合させた抗ヒトIgG抗体を備えるビーズをインキュベートしたものから構成された。陽性対照は、フィコエリトリンと直接結合させた市販の抗MICA/MICBモノクローナル抗体(クローン6D4)(BioLegendカタログ番号320906)とビーズとをインキュベートしたものから構成された。第2のアッセイは、ストレプトアビジンと結合させたポリスチレンビーズを使用して、社内で開発した。ビーズはモノビオチン化MICAタンパク質によりコーティングし、各種濃度の抗MICA抗体、抗TTCF抗体(アイソタイプ陰性対照)、またはフィコエリトリンと直接結合させたBioLegend抗MICA/MICB抗体(陽性対照)とともにインキュベートした。抗MICA抗体または抗TTCF抗体とインキュベートしたビーズを洗浄し、次にAlexa488を結合させた抗ヒトIgG抗体とともにインキュベートした。ビーズに結合するバックグラウンドを測定するため、比較のためMICAタンパク質によりコーティングしていないストレプトアビジン結合ビーズを使用して、同様のインキュベートを実施した。抗体に対する結合について、FACS Caliberフローサイトメーターによりビーズを解析した。
図24および25に示す通り、抗MICA抗体(MICA−Ab12およびMICA−Ab20)は高親和性でMICAと結合する。MICA−Ab20は、表1に記載の抗MICA抗体ID−1に相当する。
実施例6:抗MICA抗体
本明細書に記載の方法を使用して、生物学的特性と臨床的な相関を有するさらなる抗MICA抗体を開発した。癌の細胞ワクチン(GM−CSF形質導入された癌細胞、GVAXとして参照)と、T細胞上のCTLA−4受容体に対するイピリムマブ(YERVOY(商標)(Bristol Myers Squibから入手可能))による阻害を遮断する抗体との接種を受けた患者において、共通の対立遺伝子産物と反応するMICA特異的抗体を同定した。次に、MICA四量体を使用して、血清MICAの反応が最も高かった患者の末梢血単核細胞からB細胞を単離した。実施例5において概説する通り、単一細胞PCRにより、これらのB細胞から、重鎖および軽鎖配列を決定した。この試行により、北アメリカの人口集団において共通する対立遺伝子産物を認識する抗体を同定した。
本明細書に記載の方法を使用して、生物学的特性と臨床的な相関を有するさらなる抗MICA抗体を開発した。癌の細胞ワクチン(GM−CSF形質導入された癌細胞、GVAXとして参照)と、T細胞上のCTLA−4受容体に対するイピリムマブ(YERVOY(商標)(Bristol Myers Squibから入手可能))による阻害を遮断する抗体との接種を受けた患者において、共通の対立遺伝子産物と反応するMICA特異的抗体を同定した。次に、MICA四量体を使用して、血清MICAの反応が最も高かった患者の末梢血単核細胞からB細胞を単離した。実施例5において概説する通り、単一細胞PCRにより、これらのB細胞から、重鎖および軽鎖配列を決定した。この試行により、北アメリカの人口集団において共通する対立遺伝子産物を認識する抗体を同定した。
CM24002 Ab2(表1に記載される抗MICA抗体ID−6)は、GVAX+イピリムマブ併用療法に対し臨床的に有意な応答を示し、かつ血漿がMICAと強力に反応した、急性骨髄性白血病(AML)患者から単離された抗体である。CM24002 Ab2軽鎖(図30および31)および重鎖(図28および29)のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、CDR1、CDR2およびCDR3配列に下線を引き、示す。同様の患者から、強力な結合性を有するさらなる抗体を得て、CM24002 Ab4(表1に記載の抗MICA抗体ID−7)と標識した。CDR1、CDR2およびCDR3配列に下線を引き、CM24002 Ab4軽鎖(図34および35)および重鎖(図23および32)のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。
CM33322 Ab11(表1に記載の抗MICA抗体ID−8)およびCM33322 Ab29(表1に記載の抗MICA抗体ID−9)は、GVAX+イピリムマブ併用療法に対し長期にわたって(>15年)応答を示す、転移性黒色腫患者から単離された抗体である。CDR1、CDR2およびCDR3配列に下線を引き、CM33322 Ab11軽鎖((図38および39)および重鎖(図36および37)のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。CDR1、CDR2およびCDR3配列に下線を引き、CM33322 Ab29軽鎖(図42および43)および重鎖(図40および41)のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。この患者が長期にわたって臨床応答を示したため、これらの抗体を特に対象とする。
最初に、対象とする抗体を同定、クローニング、および発現させた後、異なるMICA対立遺伝子産物に対するこれらの抗体の特異性を、細胞数測定ビーズアッセイにより評価した。簡潔に述べると、可溶性の組換えMICA対立遺伝子産物002、008、009と、単一のBirAビオチン化部位を有するMICBとを発現させ、精製し、およびストレプトアビジンビーズで捕捉した。次に、記載の抗MICA抗体を、組換えMICAによりコーティングした異なる濃度のビーズとともに1時間インキュベートし、次に洗浄し、FITCで標識した抗ヒトIgG二次抗体とともにインキュベートした。2回目の洗浄工程後、フローサイトメトリーにより、ビーズの結合したFITCの蛍光の定量を完了した。北アメリカの人口集団における有病率に基づき、MICA対立遺伝子産物002、008、009並びに関連するMICBタンパク質を選択した(図48)。世界的に見て一般に罹患率が高いことから、MICA対立遺伝子産物002、008、009並びに関連するMICBタンパク質も選択した。重要なことに、CM24002 Ab2およびCM33322 Ab29は、すべてのMICA対立遺伝子産物並びにMICBに強力に結合した。他に2つの抗体が対立遺伝子産物のサブセットに結合した:CM24002 Ab4はMICA*009およびMICBに強力に結合し、CM33322 Ab11はMICA*002、MICA*008、およびMICBに強力に結合した(図48A〜F)。同様の手法により生成したヒト陰性対象抗体(破傷風トキソイドC末端断片、すなわちTTCF特異的抗体)、並びに抗MICA陽性対照抗体(MICAを抗原とする、BioLegendから市販のマウス抗体)を使用し、特異性を実証した。これらの試験により、CM24002 Ab2およびCM33322 Ab29を、臨床応用に有望な候補として同定した。
実施例7:自己腫瘍細胞に対する抗MICA抗体の結合
フローサイトメトリーにより、単離した抗MICA抗体CM24002 Ab2の自己腫瘍細胞への結合能を評価した(図49)。患者CM24002から骨髄を得て、CM24002 Ab2により、腫瘍細胞への結合を試験した。次に、骨髄試料から、CD33+ CD34+細胞として腫瘍細胞を同定した。次に、腫瘍細胞を、10μg/mLの、抗MICA抗体CM24002 Ab2、陽性対照の市販のMICA抗体(BioLegend)、または陰性対照抗体(TTCF特異性)により染色した。図49に示す通り、CM24002 Ab2はこれらの細胞に強力に結合した。CM24002 Ab2は非腫瘍細胞(CD16+およびCD3+細胞)に対し結合を示さず、バックグラウンドの結合のみがCD14+細胞にみられたことから、抗腫瘍特異性が実証された(データ不掲載)。
フローサイトメトリーにより、単離した抗MICA抗体CM24002 Ab2の自己腫瘍細胞への結合能を評価した(図49)。患者CM24002から骨髄を得て、CM24002 Ab2により、腫瘍細胞への結合を試験した。次に、骨髄試料から、CD33+ CD34+細胞として腫瘍細胞を同定した。次に、腫瘍細胞を、10μg/mLの、抗MICA抗体CM24002 Ab2、陽性対照の市販のMICA抗体(BioLegend)、または陰性対照抗体(TTCF特異性)により染色した。図49に示す通り、CM24002 Ab2はこれらの細胞に強力に結合した。CM24002 Ab2は非腫瘍細胞(CD16+およびCD3+細胞)に対し結合を示さず、バックグラウンドの結合のみがCD14+細胞にみられたことから、抗腫瘍特異性が実証された(データ不掲載)。
実施例8.抗MICA抗体によるNK細胞上のNKG2D受容体の阻害
単離された抗MICA抗体CM24002 Ab2が、同族受容体であるNKG2Dによる可溶性MICA介在性の下方制御を妨げる能力を評価した。患者由来の血清CM24002を1:10希釈して使用して、ヒトNK細胞とともに48時間インキュベートした。これらの培養物に、CM24002 Ab2(濃度10μg/mL)、市販の陽性対照MICA抗体(BioLegend)または陰性対照抗体(TTCF特異的)を加えた。48時間の時点で、NKG2Dの発現をフローサイトメトリーにより評価した(図50)。患者由来の血清CM24002は、NKG2Dの発現を強力に下方制御した(したがって、この受容体の機能を不能にした)。CM24002 Ab2および陽性対照MICA抗体は、NK細胞によるNKG2Dの細胞表面での発現を部分的に回復した。特異性を実証するために、患者の血清の代わりに組換えMICA 2ng/mLとともに細胞をインキュベートして、上記の実験を繰り返した(図51)。CM24002 Ab2はNKG2D発現のMICA介在性の下方制御を完全に妨げたのに対し、陰性対照抗体(TTCF特異的)は効果を有さなかった(図51)。これらのデータは、ヒトNK細胞上の重要なNKG2D受容体の阻害は、ヒトMICA抗体により妨げられることを実証する。
単離された抗MICA抗体CM24002 Ab2が、同族受容体であるNKG2Dによる可溶性MICA介在性の下方制御を妨げる能力を評価した。患者由来の血清CM24002を1:10希釈して使用して、ヒトNK細胞とともに48時間インキュベートした。これらの培養物に、CM24002 Ab2(濃度10μg/mL)、市販の陽性対照MICA抗体(BioLegend)または陰性対照抗体(TTCF特異的)を加えた。48時間の時点で、NKG2Dの発現をフローサイトメトリーにより評価した(図50)。患者由来の血清CM24002は、NKG2Dの発現を強力に下方制御した(したがって、この受容体の機能を不能にした)。CM24002 Ab2および陽性対照MICA抗体は、NK細胞によるNKG2Dの細胞表面での発現を部分的に回復した。特異性を実証するために、患者の血清の代わりに組換えMICA 2ng/mLとともに細胞をインキュベートして、上記の実験を繰り返した(図51)。CM24002 Ab2はNKG2D発現のMICA介在性の下方制御を完全に妨げたのに対し、陰性対照抗体(TTCF特異的)は効果を有さなかった(図51)。これらのデータは、ヒトNK細胞上の重要なNKG2D受容体の阻害は、ヒトMICA抗体により妨げられることを実証する。
実施例9:抗MICA抗体の細胞介在性細胞傷害
CM24002 Ab2が細胞介在性細胞傷害を可能にするか評価するため、10μg/mLのCM24002 Ab2、陰性対照抗体(TTCF特異的)、または陽性対照抗体(BioLegend)の存在下で、ヒトNK細胞(エフェクター細胞)を、組換えMICA(2ng/mL)とともに48時間インキュベートした。48時間後、細胞を洗浄し、エフェクター:標的比20:1、10:1、および5:1で、K562腫瘍細胞とともに4時間インキュベートした。NK細胞による標的細胞の特異的な溶解は、K562腫瘍細胞からの細胞質タンパク質(LDH)の放出により測定した。MICA抗体の非存在下においては、NK細胞によるK562腫瘍細胞の殺傷は観察されなかった。しかしながら、CM24002 Ab2は、NK細胞介在性のK562腫瘍細胞の溶解を非常に促進させ、かつすべてのエフェクター:標的比において、マウスMICAの陽性対照抗体よりも効果的であった(図52)。(Fc受容体によりというよりは)NKG2D経路によりK562腫瘍細胞の殺傷が実際に介在されることがさらに実証された。さらに2つの実験群(NKG2DおよびヒトFcブロック用の遮断抗体による)を加え、上記の実験を繰り返した。加えて、CM33322 Ab29も試験した。データから、CM24002 Ab2およびCM33322 Ab29を加えることで、NK細胞介在性細胞傷害が可能になることが示される。NKG2D遮断抗体を加えた場合にはK562細胞の殺傷は生じなかったのに対し、Fc遮断試薬の場合にはわずかに効果が示された(図53)。これらのデータは、CM24002 Ab2およびCM33322 Ab29がNKG2D経路の抗腫瘍機能を回復させることを示す。
CM24002 Ab2が細胞介在性細胞傷害を可能にするか評価するため、10μg/mLのCM24002 Ab2、陰性対照抗体(TTCF特異的)、または陽性対照抗体(BioLegend)の存在下で、ヒトNK細胞(エフェクター細胞)を、組換えMICA(2ng/mL)とともに48時間インキュベートした。48時間後、細胞を洗浄し、エフェクター:標的比20:1、10:1、および5:1で、K562腫瘍細胞とともに4時間インキュベートした。NK細胞による標的細胞の特異的な溶解は、K562腫瘍細胞からの細胞質タンパク質(LDH)の放出により測定した。MICA抗体の非存在下においては、NK細胞によるK562腫瘍細胞の殺傷は観察されなかった。しかしながら、CM24002 Ab2は、NK細胞介在性のK562腫瘍細胞の溶解を非常に促進させ、かつすべてのエフェクター:標的比において、マウスMICAの陽性対照抗体よりも効果的であった(図52)。(Fc受容体によりというよりは)NKG2D経路によりK562腫瘍細胞の殺傷が実際に介在されることがさらに実証された。さらに2つの実験群(NKG2DおよびヒトFcブロック用の遮断抗体による)を加え、上記の実験を繰り返した。加えて、CM33322 Ab29も試験した。データから、CM24002 Ab2およびCM33322 Ab29を加えることで、NK細胞介在性細胞傷害が可能になることが示される。NKG2D遮断抗体を加えた場合にはK562細胞の殺傷は生じなかったのに対し、Fc遮断試薬の場合にはわずかに効果が示された(図53)。これらのデータは、CM24002 Ab2およびCM33322 Ab29がNKG2D経路の抗腫瘍機能を回復させることを示す。
実施例10:MICAドメインα3に対する抗MICA抗体の結合
NKG2D受容体は、MICAのα1およびα2ドメイン頂部に結合するため、同じ部位に結合する抗体は、NKG2D受容体と競合し、NK細胞による腫瘍細胞の殺傷を妨げる可能性がある。α3ドメインに結合する抗体は、NKG2D受容体の結合を遮断できないため、特に対象となる。同時に、このような抗体は、タンパク質分解による腫瘍細胞表面からのMICAの切断に干渉し得る。MICA α3ドメインに対する抗MICA抗体の性能を、前述の細胞数測定ビーズアッセイにより評価した。ビオチン化組換えタンパク質をストレプトアビジンビーズ上に捕捉した。次に、ビーズを、10μg/mLの抗体CM24002 Ab2、CM24002 Ab4、CM33322 Ab11、CM33322 AB29、陰性対照の抗体(TTCF特異的)、または陽性対照の抗体(BioLegend)とともにインキュベートし、続いてFITCにより標識した抗ヒトIgG二次抗体とともにインキュベートし、ビーズに結合したFITC蛍光をフローサイトメトリーにより定量した(図54)。図54に示す通り、CM33322 Ab29はMICA α3ドメインに結合するため、治療応用に関し非常に興味を引く。
NKG2D受容体は、MICAのα1およびα2ドメイン頂部に結合するため、同じ部位に結合する抗体は、NKG2D受容体と競合し、NK細胞による腫瘍細胞の殺傷を妨げる可能性がある。α3ドメインに結合する抗体は、NKG2D受容体の結合を遮断できないため、特に対象となる。同時に、このような抗体は、タンパク質分解による腫瘍細胞表面からのMICAの切断に干渉し得る。MICA α3ドメインに対する抗MICA抗体の性能を、前述の細胞数測定ビーズアッセイにより評価した。ビオチン化組換えタンパク質をストレプトアビジンビーズ上に捕捉した。次に、ビーズを、10μg/mLの抗体CM24002 Ab2、CM24002 Ab4、CM33322 Ab11、CM33322 AB29、陰性対照の抗体(TTCF特異的)、または陽性対照の抗体(BioLegend)とともにインキュベートし、続いてFITCにより標識した抗ヒトIgG二次抗体とともにインキュベートし、ビーズに結合したFITC蛍光をフローサイトメトリーにより定量した(図54)。図54に示す通り、CM33322 Ab29はMICA α3ドメインに結合するため、治療応用に関し非常に興味を引く。
実施例11:腫瘍細胞に対する抗MICA抗体の結合
広範な癌を標的とした際のCM24002 Ab2およびCM33322 Ab29の使用可能性を評価した。CM24002 Ab2およびCM33322 Ab29による標識性について、多発性骨髄腫(RPMI 8226およびXg−1)、卵巣癌(OVCAR3)、急性骨髄性白血病(U937)、黒色腫(K028)、肺癌(1792および827)、および乳癌(MCF7)細胞をひと通り試験した。1% BSAを添加したPBSに、腫瘍細胞を1×106個/mLの濃度で再懸濁し、10μg/mLの、CM24002 Ab2およびCM33322 Ab29、並びに陽性および陰性対照(それぞれマウスMICA抗体およびTTCF−特異的抗体)(直接的に結合させたもの)により4℃で1時間染色した。フローサイトメトリーにより標識を評価した(図55)。試験した細胞株の大部分に関し、CM24002 Ab2およびCM33322 Ab29は、いずれも、市販の陽性対照により標識した場合と比較してより良好に各腫瘍細胞型に結合した。
広範な癌を標的とした際のCM24002 Ab2およびCM33322 Ab29の使用可能性を評価した。CM24002 Ab2およびCM33322 Ab29による標識性について、多発性骨髄腫(RPMI 8226およびXg−1)、卵巣癌(OVCAR3)、急性骨髄性白血病(U937)、黒色腫(K028)、肺癌(1792および827)、および乳癌(MCF7)細胞をひと通り試験した。1% BSAを添加したPBSに、腫瘍細胞を1×106個/mLの濃度で再懸濁し、10μg/mLの、CM24002 Ab2およびCM33322 Ab29、並びに陽性および陰性対照(それぞれマウスMICA抗体およびTTCF−特異的抗体)(直接的に結合させたもの)により4℃で1時間染色した。フローサイトメトリーにより標識を評価した(図55)。試験した細胞株の大部分に関し、CM24002 Ab2およびCM33322 Ab29は、いずれも、市販の陽性対照により標識した場合と比較してより良好に各腫瘍細胞型に結合した。
実施例11:抗MICA抗体のMICA対立遺伝子産物特異性
市販のLuminexアッセイを用い、CM33322 Ab29の対立遺伝子産物特異性を評価した。市販の試験キットは、単一のサンプルにおいて結合性を評価することを可能にする、それぞれ固有の蛍光特性を有するLuminexビーズに直接結合した組換えMICA対立遺伝子産物(MICA*001、*002、*007、*012、*017、*018、*027、*004、*009、および*015)を含有する。記載のMICA対立遺伝子産物によりコーティングしたLuminexビーズを、10μg/mLの、CM33322 Ab29、BioLegend陽性対照、および陰性対照(TTCF)とともに1時間インキュベートし、続いて、PEを結合させた抗ヒトIgG二次抗体とともにインキュベートした。記載の抗体とともに60分間インキュベートし、続いてPE結合抗ヒト二次抗体とともにインキュベートした後、装置Luminex 200を用い蛍光を測定した(図56)。CM33322 Ab29が市販のアッセイに存在するすべての対立遺伝子産物に結合し得たことから、この抗体はMICAの遺伝子型とは関係なく患者に使用できることが示唆された。
市販のLuminexアッセイを用い、CM33322 Ab29の対立遺伝子産物特異性を評価した。市販の試験キットは、単一のサンプルにおいて結合性を評価することを可能にする、それぞれ固有の蛍光特性を有するLuminexビーズに直接結合した組換えMICA対立遺伝子産物(MICA*001、*002、*007、*012、*017、*018、*027、*004、*009、および*015)を含有する。記載のMICA対立遺伝子産物によりコーティングしたLuminexビーズを、10μg/mLの、CM33322 Ab29、BioLegend陽性対照、および陰性対照(TTCF)とともに1時間インキュベートし、続いて、PEを結合させた抗ヒトIgG二次抗体とともにインキュベートした。記載の抗体とともに60分間インキュベートし、続いてPE結合抗ヒト二次抗体とともにインキュベートした後、装置Luminex 200を用い蛍光を測定した(図56)。CM33322 Ab29が市販のアッセイに存在するすべての対立遺伝子産物に結合し得たことから、この抗体はMICAの遺伝子型とは関係なく患者に使用できることが示唆された。
これらのデータにより、CM24002 Ab2およびCM33322 Ab29の高生物活性と、これらの抗体の、NK細胞介在性の腫瘍細胞溶解能とが実証される。これらのデータは、免疫療法に応答性の癌患者が、NK細胞の抗腫瘍活性を回復したMICA抗体を産生したことを実証する。あわせて、これらの結果により、癌患者において免疫抑制を克服する際に、および腫瘍崩壊を促進する際に、抗MICA抗体が持ち得る治療能が強調された。
実施例12:抗アンジオポエチン−2抗体の入手
本明細書に記載の方法を用い、アンジオポエチン−2に結合する抗体を開発した。簡潔に述べると、R&D Systemsからビオチン化アンジオポエチン−2(UniGene Hs.583870)を購入した。末梢血単核細胞を迅速に解凍し、洗浄し、2%ウシ胎児血清を添加したリン酸緩衝食塩水(pH7.2)に5×106で再懸濁し、約0.5ug/mLのアンジオポエチン−2により氷上で30分間染色した。2% FCS含有PBS 4mLにより、細胞を2回洗浄した。次に、抗体を加え、クラススイッチした記憶B細胞(CD19+、CD27+、およびIgM−)、並びにSA−PEを同定し、B細胞表面に対しビオチン化アンジオポエチンにより標識を行った。四量体によるバックグラウンドの染色を軽減させるため、T細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、および死細胞を標識する一連の排除抗体を含有させた(CD3、CD14、CD16、7−AAD)。BD FACS Aria IIを使用し、アンジオポエチン−2と結合する単一のB細胞をPCR用8連ストリップチューブに分取した。遺伝子特異的なプライマー(上記を参照のこと)を使用して、Epicentre Biotechnologiesから市販のキット(カタログ番号MBCL90310)により、B細胞受容体(BCR)のmRNAを増幅した。2段階ネステッドPCRにより、重鎖および軽鎖のBCR可変ドメインを増幅する(上記を参照のこと)。GM−CSF発現ベクター(GVAX)により遺伝子導入した自己腫瘍細胞をワクチン接種した悪性非小細胞肺癌患者から、末梢血単核細胞を得た(Cancer Res.70:10150,2010)。完全長のIgG1抗体として、CHO−S発現系において抗体を発現させた。
本明細書に記載の方法を用い、アンジオポエチン−2に結合する抗体を開発した。簡潔に述べると、R&D Systemsからビオチン化アンジオポエチン−2(UniGene Hs.583870)を購入した。末梢血単核細胞を迅速に解凍し、洗浄し、2%ウシ胎児血清を添加したリン酸緩衝食塩水(pH7.2)に5×106で再懸濁し、約0.5ug/mLのアンジオポエチン−2により氷上で30分間染色した。2% FCS含有PBS 4mLにより、細胞を2回洗浄した。次に、抗体を加え、クラススイッチした記憶B細胞(CD19+、CD27+、およびIgM−)、並びにSA−PEを同定し、B細胞表面に対しビオチン化アンジオポエチンにより標識を行った。四量体によるバックグラウンドの染色を軽減させるため、T細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、および死細胞を標識する一連の排除抗体を含有させた(CD3、CD14、CD16、7−AAD)。BD FACS Aria IIを使用し、アンジオポエチン−2と結合する単一のB細胞をPCR用8連ストリップチューブに分取した。遺伝子特異的なプライマー(上記を参照のこと)を使用して、Epicentre Biotechnologiesから市販のキット(カタログ番号MBCL90310)により、B細胞受容体(BCR)のmRNAを増幅した。2段階ネステッドPCRにより、重鎖および軽鎖のBCR可変ドメインを増幅する(上記を参照のこと)。GM−CSF発現ベクター(GVAX)により遺伝子導入した自己腫瘍細胞をワクチン接種した悪性非小細胞肺癌患者から、末梢血単核細胞を得た(Cancer Res.70:10150,2010)。完全長のIgG1抗体として、CHO−S発現系において抗体を発現させた。
ELISAアッセイを用い、アンジオポエチン−2に結合する抗アンジオポエチン−2抗体の評価を行った。簡潔に述べると、4℃下で、96ウェル平底プレート(PerkinElmer)を、アンジオポエチン−2を4μg/mL含む100mMの重炭酸ナトリウム緩衝液(pH9.6)によりコーティングした。ウシ血清アルブミンおよびウシγグロブリン(PerkinElmer)を含有させたアッセイ緩衝液により、室温で3時間プレートをブロッキングした。抗体を20ug/mL〜0.16ug/mLでアッセイ緩衝液に希釈し、4℃で1時間インキュベートした。プレートを200μL洗浄緩衝液(50mMのTris(pH8)、150mMのNaCl、20mMのEDTA、0.05% Tween)により3回洗浄した。各ウェルに増感液(PerkinElmer)を100μL加え、Victor3プレートリーダー(PerkinElmer)を用い615nmの波長で蛍光強度を測定した。ヒトアンジオポエチン−1および−4を結合性について試験した所、これらについても同様の反応性が示された。
相関データを図27A〜27Cに示す。これらの図では、肺癌患者からのアンジオポエチン特異的抗体の単離についてのグラフおよびゲルが提供される。(A)肺癌患者(L19)の血清(1:1000希釈)のアンジオポエチン−2の反応性をELISAにより評価。血清の採取日をX軸に示す。対照タンパク質のウシ血清アルブミン(BSA)は陰性対照として包含させた。(B)FACSプロットは、CD19を有する、CD19+、CD27+IgM−B細胞をX軸に、蛍光タグを付したアンジオポエチン−2をY軸にゲーティングしたPBMCサンプル(タイムポイント−10/98)を示す。このゲートにより、選別のカットオフを行ったおおよその位置を示す。このサンプルから10種のB細胞を選別した。(C)患者L19から単離したアンジオポエチン−2反応性記憶B細胞10種からの重鎖、軽鎖、およびヒンジ領域のPCR産物。第2回目のネステッドPCR後の重鎖(上図)および軽鎖(下図)PCR産物(約350bp)。
実施例13:ヒト組換え型アンジオポエチンファミリーメンバーに対する抗アンジオポエチン−2抗体の結合
4μg/mLの組換え型アンジオポエチン−1、−2、および−4(R&D Systems)を含む重炭酸ナトリウム緩衝液(pH9.6)により、96ウェルプレートを一晩コーティングした。続いて、ウシ血清アルブミン(BSA)とウシγ−グロブリンを含有させたアッセイ緩衝液(Perkin Elmer)により、プレートを室温で3時間インキュベートした。20μg/mL〜0.16μg/mLで希釈した抗体ID2、3、4、および5(表1を参照のこと)をプレートに入れ、4℃で1時間、振盪しながらインキュベートした。続いて、プレートを洗浄した後、抗ヒトIgG−ユーロピウム抗体(Perkin Elmer)とともにインキュベートした。プレートリーダーにより、615nmでの蛍光強度を得た。陰性対照抗体(クローン8.18.C5)を使用して、特異性を評価した。データは2ウェル1組で測定して評価した。
4μg/mLの組換え型アンジオポエチン−1、−2、および−4(R&D Systems)を含む重炭酸ナトリウム緩衝液(pH9.6)により、96ウェルプレートを一晩コーティングした。続いて、ウシ血清アルブミン(BSA)とウシγ−グロブリンを含有させたアッセイ緩衝液(Perkin Elmer)により、プレートを室温で3時間インキュベートした。20μg/mL〜0.16μg/mLで希釈した抗体ID2、3、4、および5(表1を参照のこと)をプレートに入れ、4℃で1時間、振盪しながらインキュベートした。続いて、プレートを洗浄した後、抗ヒトIgG−ユーロピウム抗体(Perkin Elmer)とともにインキュベートした。プレートリーダーにより、615nmでの蛍光強度を得た。陰性対照抗体(クローン8.18.C5)を使用して、特異性を評価した。データは2ウェル1組で測定して評価した。
図26A〜26Cに示す通り、抗体ID2、3、4、および5(表1を参照のこと)は、高特異性でアンジオポエチン−1、−2、および−4と結合する。抗体は、構造的に関連するタンパク質Ang−like−3には結合しない(図26Dを参照のこと)。
本明細書に記載の方法を用い、生物学的特性に臨床的に相関を有するよう設計された、その他の抗アンジオポエチン抗体、すなわち抗Ang2 Ab6(表1に記載の抗MICA抗体ID−10)を開発した。抗Ang2 Ab6のヒト組換え型アンジオポエチンファミリーメンバーへの結合性を上記の通り解析した。簡潔に述べると、4μg/mLのアンジオポエチン群、すなわち、Ang−1、Ang−2、Ang−4、およびAng−like−3を結合させてELISAプレートをコーティングし、20μg/mL、4μg/mL、0.8μg/mL、および0.16μg/mL濃度の抗Ang2 Ab6により検出した。ユーロピウム複合抗ヒトIgG二次抗体を使用し、45分後にユーロピウム数を測定した。図57に示す通り、抗Ang2 Ab6は、用量依存的な様式ですべてのアンジオポエチンに結合する。
その他の実施の形態
本発明は、発明を実施するための形態と組み合わせて記載したが、前述の記載は、例示目的のものであり、本発明の範囲を制限するものではないことは理解されるであろう。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲により定義される。以降の特許請求の範囲内に含まれるその他の態様、利点、および改変も存在する。
本発明は、発明を実施するための形態と組み合わせて記載したが、前述の記載は、例示目的のものであり、本発明の範囲を制限するものではないことは理解されるであろう。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲により定義される。以降の特許請求の範囲内に含まれるその他の態様、利点、および改変も存在する。
Claims (47)
- MHCクラスI型ポリペプチド関連性配列A(MICA)に免疫特異的に結合するペプチドを含む組成物であって、前記ペプチドが、5以下の保存的アミノ酸置換を有する、表1に示す抗体ID1、6、7、8、または9のVHの相補性決定領域(CDR)3と、5以下の保存的アミノ酸置換を有する、表1に示す抗体ID1、6、7、8、または9のVLのCDR3と、を含む、組成物。
- 前記ペプチドが、表1に示す抗体ID1、6、7、8、または9のVHの相補性決定領域(CDR)3と、表1に示す抗体ID1、6、7、8、または9のVLのCDR3と、を含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記ペプチドが、5以下の保存的アミノ酸置換を有する、表1に示す抗体ID1、6、7、8、若しくは9のVHのCDR2、または5以下の保存的アミノ酸置換を有する、表1に示す抗体ID1、6、7、8、若しくは9のVLのCDR2、またはこれらの両方を含む、請求項1または2に記載の組成物。
- 前記ペプチドが、表1に示す抗体ID1、6、7、8、若しくは9のVHの相補性決定領域CDR2、または表1に示す抗体ID1、6、7、8、または9のVLのCDR2、またはこれらの両方を含む、請求項3に記載の組成物。
- 前記ペプチドが、5以下の保存的アミノ酸置換を有する、表1に示す抗体ID1、6、7、8、若しくは9のVHのCDR1、または5以下の保存的アミノ酸置換を有する、表1に示す抗体ID1、6、7、8、または9のVLのCDR1、またはこれらの両方を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ペプチドが、表1に示す抗体ID1、6、7、8、若しくは9のVHの相補性決定領域CDR1、または表1に示す抗体ID1、6、7、8、若しくは9のVLのCDR1、またはこれらの両方を含む、請求項5に記載の組成物。
- 前記ペプチドが、配列番号2、149、168、186、または204と同一性を有するVH鎖、および配列番号11、151、170、189、または206と同一性を有するVL鎖を含む、抗体または抗体断片であり、
前記VH鎖の、CDR1、CDR2、およびCDR3に相当する領域は、表1に示す抗体ID1、6、7、8、または9のVHの、保存的アミノ酸置換を5つ以下で有するCDR1、CDR2、およびCDR3を含み、かつ配列番号2、149、168、186、または204内のFR1、FR2、FR3、FR4に相当する領域は、表1に示す抗体ID1、6、7、8、または9のVHのFR1、FR2、FR3、FR4に対し少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98、99%、または100%同一性を有するアミノ酸配列を含み、
並びに前記VL鎖の、CDR1、CDR2、およびCDR3に相当する領域は、表1に示す抗体ID1のVLの、保存的アミノ酸置換を5つ以下で有するCDR1、CDR2、およびCDR3を含み、かつ配列番号11、151、170、189、または206内のFR1、FR2、FR3、FR4に相当する領域は、表1に示す抗体ID1のVLのFR1、FR2、FR3、FR4に対し少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98、99%、または100%同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の組成物。 - 前記ペプチドが、配列番号2、149、168、186、または204を含むVH鎖と、配列番号11、151、170、189、または206を含むVL鎖と、を含む抗体または抗体断片である、請求項7に記載の組成物。
- 抗癌剤をさらに含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の組成物。
- 医薬組成物として処方された、請求項1〜9のいずれか一項に記載の組成物。
- アンジオポエチンに免疫特異的に結合するペプチドを含む組成物であって、前記ペプチドが、5以下の保存的アミノ酸置換を有する、表1に示す抗体ID2、3、4、5、または10のVHの相補性決定領域(CDR)3と、5以下の保存的アミノ酸置換を有する、表1に示す抗体ID2、3、4、または5のVLのCDR3と、を含む、組成物。
- 前記ペプチドが、表1に示す抗体ID2、3、4、5、または10のVHの相補性決定領域(CDR)3と、表1に示す抗体ID2、3、4、5、または10のVLのCDR3と、を含む、請求項11に記載の組成物。
- 前記ペプチドが、5以下の保存的アミノ酸置換を有する、表1に示す抗体ID2、3、4、若しくは10のVHのCDR2、または5以下の保存的アミノ酸置換を有する、表1に示す抗体ID2、3、4、若しくは10のVLのCDR2、またはこれらの両方を含む、請求項11または12に記載の組成物。
- 前記ペプチドが、表1に示す抗体ID2、3、4、5若しくは10のVHの相補性決定領域CDR2、または表1に示す抗体ID2、3、4、5若しくは10のVLのCDR2、またはこれらの両方を含む、請求項13に記載の組成物。
- 前記ペプチドが、5以下の保存的アミノ酸置換を有する、表1に示す抗体ID2、3、4、5、若しくは10のVHのCDR1、または5以下の保存的アミノ酸置換を有する、表1に示す抗体ID2、3、4、5、若しくは10のVLのCDR1、またはこれらの両方を含む、請求項11〜14のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ペプチドが、表1に示す抗体ID2、3、4、5若しくは10のVHの相補性決定領域CDR1、または表1に示す抗体ID2、3、4、5若しくは10のVLのCDR1、またはこれらの両方を含む、請求項15に記載の組成物。
- 前記ペプチドが、配列番号20と同一性を有するVH鎖、および配列番号29と同一性を有するVL鎖を含む、抗体または抗体断片であり、
前記VH鎖の、CDR1、CDR2、およびCDR3に相当する領域は、表1に示す抗体ID2のVHの、保存的アミノ酸置換を5つ以下で有するCDR1、CDR2、およびCDR3を含み、かつ配列番号20内のFR1、FR2、FR3、FR4に相当する領域は、表1に示す抗体ID2のVHのFR1、FR2、FR3、FR4に対し少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98、99%、または100%同一性を有するアミノ酸配列を含み、
並びに前記VL鎖の、CDR1、CDR2、およびCDR3に相当する領域は、表1に示す抗体ID2のVLの、保存的アミノ酸置換を5つ以下で有するCDR1、CDR2、およびCDR3を含み、かつ配列番号29内のFR1、FR2、FR3、FR4に相当する領域は、表1に示す抗体ID2のVLのFR1、FR2、FR3、FR4に対し少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98、99%、または100%同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項11〜16のいずれか一項に記載の組成物。 - 前記ペプチドが、配列番号20を含むVH鎖と、配列番号29を含むVL鎖と、を含む抗体または抗体断片である、請求項17に記載の組成物。
- 前記ペプチドが、配列番号38と同一性を有するVH鎖、および配列番号47と同一性を有するVL鎖を含む、抗体または抗体断片であり、
前記VH鎖の、CDR1、CDR2、およびCDR3に相当する領域は、表1に示す抗体ID3のVHの、保存的アミノ酸置換を5つ以下で有するCDR1、CDR2、およびCDR3を含み、かつ配列番号38内のFR1、FR2、FR3、FR4に相当する領域は、表1に示す抗体ID3のVHのFR1、FR2、FR3、FR4に対し少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98、99%、または100%同一性を有するアミノ酸配列を含み、
並びに前記VL鎖の、CDR1、CDR2、およびCDR3に相当する領域は、表1に示す抗体ID3のVLの、保存的アミノ酸置換を5つ以下で有するCDR1、CDR2、およびCDR3を含み、かつ配列番号47内のFR1、FR2、FR3、FR4に相当する領域は、表1に示す抗体ID3のVLのFR1、FR2、FR3、FR4に対し少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98、99%、または100%同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項11〜16のいずれか一項に記載の組成物。 - 前記ペプチドが、配列番号38を含むVH鎖と、配列番号47を含むVL鎖と、を含む抗体または抗体断片である、請求項19に記載の組成物。
- 前記ペプチドが、配列番号56と同一性を有するVH鎖、および配列番号65と同一性を有するVL鎖を含む、抗体または抗体断片であり、
前記VH鎖の、CDR1、CDR2、およびCDR3に相当する領域は、表1に示す抗体ID4のVHの、保存的アミノ酸置換を5つ以下で有するCDR1、CDR2、およびCDR3を含み、かつ配列番号56内のFR1、FR2、FR3、FR4に相当する領域は、表1に示す抗体ID4のVHのFR1、FR2、FR3、FR4に対し少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98、99%、または100%同一性を有するアミノ酸配列を含み、
並びに前記VL鎖の、CDR1、CDR2、およびCDR3に相当する領域は、表1に示す抗体ID4のVLの、保存的アミノ酸置換を5つ以下で有するCDR1、CDR2、およびCDR3を含み、かつ配列番号65内のFR1、FR2、FR3、FR4に相当する領域は、表1に示す抗体ID4のVLのFR1、FR2、FR3、FR4に対し少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98、99%、または100%同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項11〜16のいずれか一項に記載の組成物。 - 前記ペプチドが、配列番号56を含むVH鎖と、配列番号65を含むVL鎖と、を含む抗体または抗体断片である、請求項21に記載の組成物。
- 前記ペプチドが、配列番号74と同一性を有するVH鎖、および配列番号83と同一性を有するVL鎖を含む、抗体または抗体断片であり、
前記VH鎖の、CDR1、CDR2、およびCDR3に相当する領域は、表1に示す抗体ID5のVHの、保存的アミノ酸置換を5つ以下で有するCDR1、CDR2、およびCDR3を含み、かつ配列番号74内のFR1、FR2、FR3、FR4に相当する領域は、表1に示す抗体ID5のVHのFR1、FR2、FR3、FR4に対し少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98、99%、または100%同一性を有するアミノ酸配列を含み、
並びに前記VL鎖の、CDR1、CDR2、およびCDR3に相当する領域は、表1に示す抗体ID5のVLの、保存的アミノ酸置換を5つ以下で有するCDR1、CDR2、およびCDR3を含み、かつ配列番号83内のFR1、FR2、FR3、FR4に相当する領域は、表1に示す抗体ID5のVLのFR1、FR2、FR3、FR4に対し少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98、99%、または100%同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項11〜16のいずれか一項に記載の組成物。 - 前記ペプチドが、配列番号74を含むVH鎖と、配列番号83を含むVL鎖と、を含む抗体または抗体断片である、請求項23に記載の組成物。
- 前記ペプチドが、アンジオポエチン−2に免疫特異的に結合する、請求項11〜24のいずれか一項に記載の組成物。
- 抗癌剤をさらに含む、請求項11〜25のいずれか一項に記載の組成物。
- 医薬組成物として処方された、請求項11〜26のいずれか一項に記載の組成物。
- 対象において癌を処置する方法であって、請求項1〜27のいずれか一項に記載の組成物を対象に投与する工程を含む、方法。
- 前記ペプチドが、配列番号222と同一性を有するVH鎖、および配列番号224と同一性を有するVL鎖を含む、抗体または抗体断片であり、
前記VH鎖の、CDR1、CDR2、およびCDR3に相当する領域は、表1に示す抗体ID10のVHの、保存的アミノ酸置換を5つ以下で有するCDR1、CDR2、およびCDR3を含み、かつ配列番号74内のFR1、FR2、FR3、FR4に相当する領域は、表1に示す抗体ID10のVHのFR1、FR2、FR3、FR4に対し少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98、99%、または100%同一性を有するアミノ酸配列を含み、
並びに前記VL鎖の、CDR1、CDR2、およびCDR3に相当する領域は、表1に示す抗体ID10のVLの、保存的アミノ酸置換を5つ以下で有するCDR1、CDR2、およびCDR3を含み、かつ配列番号224内のFR1、FR2、FR3、FR4に相当する領域は、表1に示す抗体ID10のVLのFR1、FR2、FR3、FR4に対し少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98、99%、または100%同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項11〜16のいずれか一項に記載の組成物。 - 前記ペプチドが、配列番号222を含むVH鎖と、配列番号224を含むVL鎖と、を含む抗体または抗体断片である、請求項23に記載の組成物。
- ヒドロキサム酸、ボリノスタット、スベロイルアニリドヒドロキサム酸(SAHA、トリコスタチンA(TSA)、LAQ824、パノビノスタット(LBH589)、ベリノスタット(PXD101)、ITF2357 italfarmaco SpA、環状テトラペプチド、デペプシペプチド(ロミデプシン、FK228)、ベンズアミド;エンチノスタット(SNDX−275/MS−275)、MGCD0103、短鎖脂肪酸、バルプロ酸、フェニル酪酸、AN−9、ピバネックス(pivanex)、CHR−3996、およびCHR−2845からなる群から選択されるヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)をさらに含む、請求項1〜8および11〜16のいずれか一項に記載の組成物。
- ボルテゾミブ、NPI−0052、カーフィルゾミブ(PR−171)、CEP 18770、およびMLN9708からなる群から選択されるプロテアソーム阻害剤をさらに含む、請求項1〜8および11〜16のいずれか一項に記載の組成物。
- 対象由来の自己抗原に対する免疫細胞を得る方法であって、
前記自己抗原に対し正の免疫応答を示す対象を特定すること;
前記自己抗原の多量体を提供すること;
前記自己抗原の多量体を、該自己抗原に対し正の免疫応答を示す対象由来のサンプルと接触させること;および
前記自己抗原の多量体と結合する免疫細胞を得ること、を含む、方法。 - 自己抗原に対する癌患者から免疫細胞を得る方法であって、
前記自己抗原に対し正の免疫応答を示す対象を特定すること;
前記自己抗原の多量体を提供すること;
前記自己抗原の多量体を、該自己抗原に対し正の免疫応答を示す対象由来のサンプルと接触させること;および
前記自己抗原の多量体と結合する免疫細胞を得ること、を含む、方法。 - 前記自己抗原の多量体が、前記自己抗原の四量体である、請求項33または34に記載の方法。
- 前記自己抗原の多量体が、検出可能な部位を含む、請求項35に記載の方法。
- 前記対象が哺乳類である、請求項33に記載の方法。
- 前記対象がヒトである、請求項37に記載の方法。
- 前記サンプルがヒト対象由来のものである場合のものである、請求項33に記載の方法。
- 前記自己抗原が状態または疾患に関連する、請求項33に記載の方法。
- 前記自己抗原が癌に関連する、請求項33に記載の方法。
- 前記状態または疾患が、黒色腫、肺癌、乳癌、腎臓癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、および結腸癌、リンパ腫、または白血病からなる群から選択される癌である、請求項40に記載の方法。
- 前記自己抗原がMHCクラスI型鎖関連性プロテインA(MICA)である、請求項33または34に記載の方法。
- 前記自己抗原がアンジオポエチンである、請求項33または34に記載の方法。
- 前記免疫細胞が記憶B細胞である、請求項33または34に記載の方法。
- 前記自己抗原が癌特異的自己抗原である、請求項33または34に記載の方法。
- 前記対象が癌患者である、請求項33に記載の方法。
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