JP2018021797A - In-vitro vascular endothelial function inspection - Google Patents
In-vitro vascular endothelial function inspection Download PDFInfo
- Publication number
- JP2018021797A JP2018021797A JP2016152151A JP2016152151A JP2018021797A JP 2018021797 A JP2018021797 A JP 2018021797A JP 2016152151 A JP2016152151 A JP 2016152151A JP 2016152151 A JP2016152151 A JP 2016152151A JP 2018021797 A JP2018021797 A JP 2018021797A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- vascular endothelial
- glycocalyx
- endothelial cells
- antibody
- test compound
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
本発明は、血管内皮機能改善剤のスクリーニング方法、血管内皮細胞に対する被検化合物の血管内皮機能障害性を評価するための方法、循環器疾患を有する被検体における疾病管理による血管内皮機能の改善効果を評価するための方法、及びそれらのキットに関する。 The present invention relates to a screening method for an agent for improving vascular endothelial function, a method for evaluating the vascular endothelial dysfunction of a test compound against vascular endothelial cells, and an effect of improving vascular endothelial function by disease management in a subject having cardiovascular disease. The present invention relates to a method for evaluating the above and a kit thereof.
虚血性心疾患、脳血管疾患、閉塞性動脈硬化症等の循環器疾患の原因となる動脈硬化、心不全、及び心房細動は、高血圧、糖尿病、脂質異常症、肥満等の生活習慣病を基盤として発症するが、これらの病態では早期から血管内皮機能の低下が認められる。また、深部静脈血栓症又は心房細動による心原性脳塞栓症等の血栓形成性疾患においては、血管内皮機能障害が血栓形成の重要な因子とされている。血管内皮機能は独立した心血管病予後予測因子として知られており（例えば、非特許文献１参照。）、循環器疾患発症リスクの評価や、循環器疾患二次予防のための疾病管理における効果判定指標として臨床的に血管内皮機能測定が行われている。
血管内皮機能の測定方法として、例えば、血流依存性血管拡張反応（Ｆｌｏｗ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｄｉｌａｔｉｏｎ；ＦＭＤ）による非侵襲的検査方法（例えば、非特許文献２参照。）や、ＥｎｄｏＰＡＴによる検査方法（例えば、非特許文献３参照。）等が挙げられる。
ＦＭＤ検査法は、まず、カフで腕を締めた後の血流増大によるずり応力により、血管拡張物質である一酸化窒素（ＮＯ）が血管内皮より放出され、血管は拡張する。ＦＭＤ検査では血管がどれくらい拡張したかを、超音波を用いて計測する。
また、ＥｎｄｏＰＡＴによる検査法は、まず、両手の人差し指の指先に指先脈波を測定するための専用のプローベを装着し、安静状態を５分間測定した後、５分間駆血し、開放後の５分間測定する。駆血側の腕だけを測定分析対象とするのではなく、両手の指にプローベを装着し、両腕の血流量変化を同時に測定し、駆血しない側（対側）をコントロールとして使うため、交感神経系の変化からもたらされる駆血側腕の血流量変化をキャンセルすることができる。さらに、ＥｎｄｏＰＡＴによる検査法では、血管内皮機能（ＲＨＩ）及び血管のしなやかさ（ＡＩ）の両方を観察することができる。
Arteriosclerosis, heart failure, and atrial fibrillation that cause cardiovascular diseases such as ischemic heart disease, cerebrovascular disease, obstructive arteriosclerosis are based on lifestyle-related diseases such as hypertension, diabetes, dyslipidemia, obesity In these pathological conditions, a decrease in vascular endothelial function is observed from an early stage. Further, in thrombogenic diseases such as deep vein thrombosis or cardiogenic cerebral embolism caused by atrial fibrillation, vascular endothelial dysfunction is regarded as an important factor for thrombus formation. Vascular endothelial function is known as an independent cardiovascular disease prognostic predictor (see, for example, Non-Patent Document 1), and is effective in evaluating the risk of developing cardiovascular disease and managing disease for secondary prevention of cardiovascular disease. As a determination index, vascular endothelial function is measured clinically.
As a method for measuring vascular endothelial function, for example, a non-invasive test method (for example, see Non-Patent Document 2) using a blood-mediated dilation (FMD) or an endo-PAT test method (for example, a non-test method) (See Patent Document 3).
In the FMD inspection method, first, nitric oxide (NO), which is a vasodilator, is released from the vascular endothelium due to shear stress due to increased blood flow after the arm is tightened with a cuff, and the blood vessel expands. In the FMD test, how much the blood vessel has expanded is measured using ultrasound.
Also, the EndoPAT test method is as follows. First, a dedicated probe for measuring the fingertip pulse wave is attached to the fingertips of the index fingers of both hands, the resting state is measured for 5 minutes, the blood is then driven for 5 minutes, and the 5 Measure for minutes. Rather than using only the arm on the blood-feeding side as the target for measurement and analysis, the probe is attached to the fingers of both hands, and blood flow changes in both arms are measured simultaneously. It is possible to cancel the blood flow change in the side arm that is caused by the change in the sympathetic nervous system. Furthermore, with EndoPAT testing, both vascular endothelial function (RHI) and suppleness of blood vessels (AI) can be observed.
また、血管内皮機能障害は、血管内皮細胞表面を覆う血管内皮グリコカリックス層の障害によって引き起こされると考えられており（例えば、非特許文献４参照。）、アルブミン尿を呈する腎機能障害、重篤な糖尿病、又は高尿酸血症において血管内皮グリコカリックスの血中濃度が増加することが知られている（例えば、非特許文献５参照）。 In addition, vascular endothelial dysfunction is considered to be caused by a disorder of the vascular endothelial glycocalyx layer covering the surface of vascular endothelial cells (see, for example, Non-Patent Document 4), renal dysfunction exhibiting albuminuria, severe It is known that the blood concentration of vascular endothelial glycocalyx increases in severe diabetes or hyperuricemia (see, for example, Non-Patent Document 5).
非特許文献２に記載のＦＭＤ検査法は、再現性が低く、臨床の現場で手技が煩雑であるため、血管内皮機能の測定法として推奨されていない。
また、非特許文献３に記載のＥｎｄｏＰＡＴによる検査法は、再現性が高く、臨床の現場でも導入されているが、測定に１５分程度かかり、患者の拘束時間が長く、効率的でないという課題を有する。
さらに、血管内皮グリコカリックスの血中濃度と相関がみられる疾患は、上記に挙げたアルブミン尿を呈する腎機能障害、重篤な糖尿病、又は高尿酸血症に限定されているため、その他多くの循環器疾患と血管内皮グリコカリックスとの相関関係を評価可能な系が求められていた。
The FMD test method described in Non-Patent
In addition, the EndoPAT test method described in Non-Patent
Furthermore, diseases that correlate with blood levels of vascular endothelial glycocalyx are limited to renal dysfunction, severe diabetes, or hyperuricemia with albuminuria listed above, and many other There has been a need for a system that can evaluate the correlation between cardiovascular disease and vascular endothelial glycocalyx.
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、１回の採血のみで完了し、且つ、高い再現性を有する血管内皮機能の測定方法を用いた血管内皮機能改善剤のスクリーニング方法、血管内皮細胞に対する被検化合物の血管内皮機能障害性の評価方法、及び循環器疾患を有する被検体における疾病管理による血管内皮機能の改善効果の評価方法を提供する。 The present invention has been made in view of the above circumstances, and is completed by only one blood collection, and a screening method for a vascular endothelial function improving agent using a method for measuring vascular endothelial function having high reproducibility, Provided are a method for evaluating vascular endothelial dysfunction of a test compound against vascular endothelial cells, and a method for evaluating an effect of improving vascular endothelial function by disease management in a subject having a cardiovascular disease.
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、血管内皮細胞表面上にグリコカリックス層を構築したインビトロ系を用いることにより、血管内皮機能を１回の採血のみで完了し、且つ、高い再現性で評価できることを見出し、本発明を完成させるに至った。 As a result of diligent research to solve the above problems, the present inventor completed vascular endothelial function by only one blood collection by using an in vitro system in which a glycocalyx layer was constructed on the surface of vascular endothelial cells, and The inventors have found that evaluation can be performed with high reproducibility, and have completed the present invention.
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
［１］血管内皮機能改善剤のスクリーニング方法であって、血管内皮細胞をコンフルエントの状態となるように培養し、準備する準備工程と、前記準備工程後の前記血管内皮細胞を、被検化合物の添加、又は無添加条件にて培養する培養工程と、前記培養工程後の前記血管内皮細胞に血管内皮障害リスク因子を添加し、グリコカリックスの遊離を誘導する誘導工程と、前記誘導工程後の前記被検化合物の添加、又は無添加条件での培養液中に含まれるグリコカリックス濃度を測定し、前記被検化合物による血管内皮機能の改善効果を評価する評価工程と、を備えることを特徴とする方法。
［２］血管内皮機能改善剤をスクリーニングするためのキットであって、血管内皮細胞と、 血管内皮障害リスク因子と、グリコカリックス検出試薬と、を備えることを特徴とするキット。
［３］血管内皮細胞に対する被検化合物の血管内皮機能障害性を評価するための方法であって、 血管内皮細胞をコンフルエントの状態となるように培養し、準備する準備工程と、前記準備工程後の前記血管内皮細胞を、被検化合物の添加、又は無添加条件にて培養する培養工程と、前記培養工程後の前記被検化合物の添加、又は無添加条件での培養液中に含まれるグリコカリックス濃度を測定し、血管内皮細胞に対する前記被検化合物の血管内皮機能障害性を評価する評価工程と、を備えることを特徴とする方法。
［４］血管内皮細胞に対する被検化合物の血管内皮機能障害性を評価するためのキットであって、血管内皮細胞と、グリコカリックス検出試薬と、を備えることを特徴とするキット。
［５］循環器疾患を有する被検体における疾病管理による血管内皮機能の改善効果を評価するための方法であって、血管内皮細胞をコンフルエントの状態となるように培養し、準備する準備工程と、前記準備工程後の前記血管内皮細胞を、循環器疾患を有する被検体の疾病管理前、又は疾病管理後の血清を添加し、培養する培養工程と、前記培養工程後の前記血管内皮細胞に血管内皮障害リスク因子を添加し、グリコカリックスの遊離を誘導する誘導工程と、前記誘導工程後の前記循環器疾患を有する被検体の疾病管理前、又は疾病管理後の血清を添加した条件での培養液中に含まれるグリコカリックス濃度を測定し、前記疾病管理による血管内皮機能の改善効果を評価する評価工程と、を備えることを特徴とする方法。
［６］循環器疾患を有する被検体における疾病管理による血管内皮機能の改善効果を評価するためのキットであって、血管内皮細胞と、血管内皮障害リスク因子と、グリコカリックス検出試薬と、を備えることを特徴とするキット。
That is, the present invention includes the following aspects.
[1] A screening method for an agent for improving vascular endothelial function, comprising culturing and preparing vascular endothelial cells in a confluent state, and preparing the vascular endothelial cells after the preparation step with a test compound A culture step of culturing under the addition or non-addition conditions, a vascular endothelial disorder risk factor added to the vascular endothelial cells after the culture step, and inducing a release of glycocalyx, and the step after the induction step And an evaluation step of measuring the glycocalyx concentration contained in the culture solution under the addition or non-addition conditions of the test compound, and evaluating the effect of improving the vascular endothelial function by the test compound. Method.
[2] A kit for screening a vascular endothelial function improving agent, comprising a vascular endothelial cell, a vascular endothelial disorder risk factor, and a glycocalyx detection reagent.
[3] A method for evaluating the vascular endothelial dysfunction of a test compound against vascular endothelial cells, comprising culturing and preparing vascular endothelial cells in a confluent state, and after the preparation step A culturing step of culturing the vascular endothelial cells in the condition of addition or non-addition of a test compound, and glyco contained in the culture solution in the addition or non-addition of the test compound after the culturing step An evaluation step of measuring calix concentration and evaluating vascular endothelial dysfunction of the test compound against vascular endothelial cells.
[4] A kit for evaluating vascular endothelial dysfunction of a test compound against vascular endothelial cells, comprising a vascular endothelial cell and a glycocalyx detection reagent.
[5] A method for evaluating the improvement effect of vascular endothelial function by disease management in a subject having a cardiovascular disease, comprising culturing and preparing vascular endothelial cells in a confluent state, A culturing step of adding and culturing the vascular endothelial cells after the preparation step before or after disease management of a subject having a cardiovascular disease and culturing, and blood vessels on the vascular endothelial cells after the culturing step Culturing under conditions of adding an endothelial risk factor and inducing the release of glycocalyx, and adding serum before or after disease management of a subject having the cardiovascular disease after the induction step An evaluation step of measuring the concentration of glycocalyx contained in the liquid and evaluating the improvement effect of vascular endothelial function by the disease management.
[6] A kit for evaluating an effect of improving vascular endothelial function by disease management in a subject having a cardiovascular disease, comprising a vascular endothelial cell, a vascular endothelial disorder risk factor, and a glycocalyx detection reagent Kit characterized by that.
本発明によれば、１回の採血のみで完了し、且つ、高い再現性を有する血管内皮機能の測定方法を用いた血管内皮機能改善剤のスクリーニング方法、血管内皮細胞に対する被検化合物の血管内皮機能障害性の評価方法、及び循環器疾患を有する被検体における疾病管理による血管内皮機能の改善効果の評価方法を提供することができる。 According to the present invention, a screening method for a vascular endothelial function improving agent using a method for measuring vascular endothelial function, which is completed by only one blood collection and has high reproducibility, a vascular endothelium of a test compound against vascular endothelial cells A method for evaluating dysfunction and a method for evaluating an effect of improving vascular endothelial function by disease management in a subject having a cardiovascular disease can be provided.
＜＜血管内皮機能改善剤のスクリーニング方法＞＞
一実施形態において、本発明は、血管内皮機能改善剤のスクリーニング方法であって、血管内皮細胞をコンフルエントの状態となるように培養し、準備する準備工程と、前記準備工程後の前記血管内皮細胞を、被検化合物の添加、又は無添加条件にて培養する培養工程と、前記培養工程後の前記血管内皮細胞に血管内皮障害リスク因子を添加し、グリコカリックスの遊離を誘導する誘導工程と、前記誘導工程後の前記被検化合物の添加、又は無添加条件での培養液中に含まれるグリコカリックス濃度を測定し、前記被検化合物による血管内皮機能の改善効果を評価する評価工程と、を備える方法を提供する。
<< Screening method for vascular endothelial function improving agent >>
In one embodiment, the present invention is a screening method for a vascular endothelial function improving agent, comprising culturing and preparing vascular endothelial cells in a confluent state, and the vascular endothelial cells after the preparation step A culture step of culturing under the condition of addition or non-addition of a test compound, a vascular endothelial disorder risk factor added to the vascular endothelial cells after the culture step, and an induction step of inducing release of glycocalyx, An evaluation step of measuring the glycocalyx concentration contained in the culture medium under the addition of the test compound after the induction step or without the addition, and evaluating the effect of improving the vascular endothelial function by the test compound; A method for providing is provided.
本実施形態のスクリーニング方法によれば、簡便且つ１回の採血のみで完了し、且つ、有効な血管内皮機能改善剤をスクリーニングすることができる。また、本実施形態のスクリーニング方法は、動物実験の代替法として活用でき、よりヒトの生体内に近いインビトロ条件下において、血管内皮機能に対する被検化合物の効果を評価することができる。 According to the screening method of the present embodiment, it is possible to screen for an effective vascular endothelial function improving agent that is completed simply and with a single blood collection. In addition, the screening method of this embodiment can be used as an alternative method for animal experiments, and the effect of a test compound on vascular endothelial function can be evaluated under in vitro conditions that are closer to the human body.
一般に、血管内皮機能障害は、血管内皮細胞表面を覆う内皮グリコカリックス層の障害によって引き起こされると考えられている。よって、本明細書において、「血管内皮機能の改善効果」とは、内皮グリコカリックス層の生成促進効果、又は内皮グリコカリックス層の遊離抑制効果を意味する。
よって、本実施形態のスクリーニング方法によれば、血管内皮機能の改善効果、すなわち、内皮グリコカリックス層の生成促進効果、又は内皮グリコカリックス層の遊離抑制効果を有する被検化合物を得ることができる。
In general, vascular endothelial dysfunction is believed to be caused by an impairment of the endothelial glycocalyx layer that covers the surface of vascular endothelial cells. Therefore, in this specification, “the effect of improving the vascular endothelial function” means the effect of promoting the formation of the endothelial glycocalyx layer or the effect of suppressing the release of the endothelial glycocalyx layer.
Therefore, according to the screening method of the present embodiment, a test compound having an effect of improving the vascular endothelial function, that is, an effect of promoting the formation of the endothelial glycocalyx layer or an effect of suppressing the release of the endothelial glycocalyx layer can be obtained.
一般に、「グリコカリックス」とは、細胞高分子化合物の総称であり、糖タンパク質、又は糖鎖を含む。また、本明細書においては、「グリコカリックス」は、血管内皮細胞表面上に形成される「内皮グリコカリックス」を意味し、内皮グリコカリックス層は血漿層又は内皮表面層（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｌａｙｅｒ：ＥＳＬ）とも呼ばれる。
グリコカリックスは、血流の制御において重要な役割を果たし、血液の血球及び分子量の大きい溶質を遮断し、これらが内皮細胞膜に接触しない状態を確保することができる。したがって、グリコカリックスは、血管緊張の調節、血液及び組織間の流体及び溶質の交換、白血球遊走、止血の調節、さらには、凝固及び炎症の反応の調節に能動的に関与する。
また、内皮グリコカリックス層は血漿又は内皮に由来する可溶性分子が組み込まれたネットワークを形成している。この可溶性分子を含む層と、血流との間には動的平衡が存在し、内皮グリコカリックス層の組成及び厚さに継続的に影響する。また、細胞表面に固定されているグリコカリックスも、組織損傷、炎症、流体投与、虚血、遊離酸素ラジカル等を原因としたせん断により脱落し、損傷すると考えられている。
よって、グリコカリックスの減少は、血小板凝集、白血球粘着、毛細血管漏出及び組織浮腫を発生させる内皮透過性の増加につながる。
従って、内皮グリコカリックス層の生成を促進する、又は内皮グリコカリックス層の遊離を抑制することで、血管内皮機能は改善され、正常な血管内皮環境を保つことができる。
In general, “glycocalix” is a general term for cellular macromolecular compounds and includes glycoproteins or sugar chains. Further, in the present specification, “glycocalix” means “endothelial glycocalyx” formed on the surface of vascular endothelial cells, and the endothelial glycocalyx layer is a plasma layer or an endothelium surface layer (ESL). Also called.
Glycocalix plays an important role in the control of blood flow, blocks blood cells and solutes with high molecular weight, and ensures that they do not contact the endothelial cell membrane. Thus, glycocalyx is actively involved in the regulation of vascular tone, fluid and solute exchange between blood and tissues, leukocyte migration, regulation of hemostasis, as well as regulation of coagulation and inflammatory responses.
The endothelial glycocalyx layer forms a network in which soluble molecules derived from plasma or endothelium are incorporated. There is a dynamic equilibrium between this soluble molecule-containing layer and the bloodstream, which continuously affects the composition and thickness of the endothelial glycocalyx layer. In addition, glycocalyx fixed on the cell surface is thought to fall off due to tissue damage, inflammation, fluid administration, ischemia, shearing due to free oxygen radicals, etc., and be damaged.
Thus, a decrease in glycocalyx leads to an increase in endothelial permeability that causes platelet aggregation, leukocyte adhesion, capillary leakage and tissue edema.
Therefore, by promoting the generation of the endothelial glycocalyx layer or suppressing the release of the endothelial glycocalyx layer, the vascular endothelial function is improved and the normal vascular endothelial environment can be maintained.
グリコカリックスは、主に糖タンパク質（プロテオグリカン）及びグリコサミノグリカンから構成される。
前記糖タンパク質（プロテオグリカン）としては、例えば、シンデカン−１（ＣＤ１３８）、シンデカン−２、シンデカン−３、シンデカン−４等のシンデカン；グリピカン１（ＧＰＣ１）、グリピカン２（ＧＰＣ２）、グリピカン３（ＧＰＣ３）、グリピカン４（ＧＰＣ４）、グリピカン５（ＧＰＣ５）、グリピカン６（ＧＰＣ６）等のグリピカン；ミメカン、ペルレカン、及びビグリカン等が挙げられ、これらに限定されない。
また、前記グリコサミノグリカンとしては、例えば、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、デルマンタン硫酸、ケラタン硫酸、ヒアルロン酸、及びこれらの塩等が挙げられ、これらに限定されない。
Glycocalix is mainly composed of glycoprotein (proteoglycan) and glycosaminoglycan.
Examples of the glycoprotein (proteoglycan) include syndecan-1 (CD138), syndecan-2, syndecan-3, syndecan-4, and other syndecans; glypican 1 (GPC1), glypican 2 (GPC2), glypican 3 (GPC3) , Glypican 4 (GPC4), glypican 5 (GPC5), glypican 6 (GPC6), and the like; mimecan, perlecan, biglycan, and the like, but are not limited thereto.
Examples of the glycosaminoglycan include, but are not limited to, heparin, heparan sulfate, chondroitin, chondroitin sulfate, dermantan sulfate, keratan sulfate, hyaluronic acid, and salts thereof.
また、血管内皮機能障害を引き起こす疾患としては、主に、生活習慣病及び該生活習慣病が基盤となり発症する循環器疾患が挙げられる。血管内皮機能障害を引き起こす疾患としてより具体的には、例えば、高血圧、糖尿病、慢性腎臓病、腎不全、高尿酸血症（痛風）、脂質異常症（高脂血症）、肥満症（メタボリックシンドローム）、虚血性心疾患（例えば、心筋梗塞、狭心症、虚血性心不全、虚血性心疾患の致死性不整脈）、心臓弁膜症、心不全、周期性心筋症、不整脈、脳梗塞、脳出血（脳卒中）、脳血管疾患、脂肪肝、アルコール性肝炎、慢性閉塞性肺疾患、原発性肺高血圧症、肺癌、大腸癌、腹部大動脈瘤、胸部大動脈瘤、閉塞性動脈硬化症、閉塞性血栓症血管炎、動脈硬化、大動脈解離等が挙げられ、これらに限定されない。よって、本実施形態のスクリーニング方法において、使用する血管内皮細胞の種類を適宜選択することによって、上記疾患のインビトロ系モデルを構築することができ、血管内皮機能改善剤、すなわち上記疾患に有効な治療薬をスクリーニングすることができる。
本実施形態のスクリーニング方法の各工程について、以下に詳細を説明する。
Examples of diseases that cause vascular endothelial dysfunction include lifestyle-related diseases and cardiovascular diseases that develop based on the lifestyle-related diseases. More specifically, diseases causing vascular endothelial dysfunction include, for example, hypertension, diabetes, chronic kidney disease, renal failure, hyperuricemia (gout), dyslipidemia (hyperlipidemia), obesity (metabolic syndrome) ), Ischemic heart disease (eg, myocardial infarction, angina pectoris, ischemic heart failure, fatal arrhythmia of ischemic heart disease), valvular heart disease, heart failure, periodic cardiomyopathy, arrhythmia, cerebral infarction, cerebral hemorrhage (stroke) Cerebrovascular disease, fatty liver, alcoholic hepatitis, chronic obstructive pulmonary disease, primary pulmonary hypertension, lung cancer, colon cancer, abdominal aortic aneurysm, thoracic aortic aneurysm, obstructive arteriosclerosis, occlusive thrombotic vasculitis, Examples include, but are not limited to, arteriosclerosis and aortic dissection. Therefore, in the screening method of the present embodiment, an in vitro system model of the above disease can be constructed by appropriately selecting the type of vascular endothelial cell to be used, and the vascular endothelial function improving agent, that is, an effective treatment for the above disease. Drugs can be screened.
Details of each step of the screening method of the present embodiment will be described below.
［準備工程］
まず、細胞培養用容器に血管内皮細胞を播種し、コンフルエントの状態となるように培養する。
なお、本明細書において、「コンフルエントの状態」とは、細胞同士が非常に接近し、密集した状態を意味する。コンフルエントの状態における細胞密度としては、使用する血管内皮細胞の種類及び大きさにもよるが、例えば、１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以上２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下であればよい。
[Preparation process]
First, vascular endothelial cells are seeded in a cell culture vessel and cultured so as to be in a confluent state.
In the present specification, the “confluent state” means a state in which cells are very close and dense. The cell density in the confluent state depends on the type and size of the vascular endothelial cell to be used, but may be, for example, 1.0 × 10 5 cells / cm 2 or more and 2.0 × 10 5 cells / cm 2 or less. That's fine.
使用する細胞培養用容器は、血管内皮細胞を培養するために通常用いられるものであればよい。前記細胞培養用容器としては、例えば、任意の数のウェルが配置されたマルチウェルプレート、シャーレ等が挙げられる。ウェルの数としては、プレート１枚当たり、例えば、６、１２、２４、９６、３８４、１，５３６個等が挙げられる。
播種する細胞数は、コンフルエントの状態となるように、培養時間、並びに使用する血管内皮細胞の種類及び増殖速度に応じて適宜調整すればよい。
The cell culture vessel to be used may be any one that is usually used for culturing vascular endothelial cells. Examples of the cell culture container include a multi-well plate in which an arbitrary number of wells are arranged, and a petri dish. The number of wells includes, for example, 6, 12, 24, 96, 384, 1,536, etc. per plate.
The number of cells to be seeded may be appropriately adjusted according to the culture time and the type and growth rate of the vascular endothelial cells to be used so as to be confluent.
（血管内皮細胞）
使用する血管内皮細胞としては、例えば、初代培養細胞、継代培養細胞、不死化培養細胞等が挙げられ、中でも、初代培養細胞、又は６回まで継代培養を行った継代培養細胞若しくは不死化培養細胞であることが好ましく、初代培養細胞であることがより好ましい。
一方、７回以上継代培養を繰り返し、増殖速度が低下した継代培養細胞、若しくは不死化培養細胞を用いる場合は、例えば、細胞老化モデルを構築することができる。
前記血管内皮細胞としては、例えば、大動脈血管内皮細胞（Ａｏｒｔｉｃ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ）、膀胱微小血管内皮細胞（Ｂｌａｄｄｅｒ Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ）、脳微小血管内皮細胞（Ｂｒａｉｎ Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ）、心臓微小血管内皮細胞（Ｃａｒｄｉａｃ Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ）、冠動脈内皮細胞（Ｃｏｒｏｎａｒｙ Ａｒｔｅｒｙ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ）、皮膚リンパ管内皮細胞（Ｄｅｒｍａｌ Ｌｙｍｐｈａｔｉｃ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ）、皮膚微小血管内皮細胞（Ｄｅｒｍａｌ Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ）、腸間膜血管内皮細胞（Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ ）、腎臓内皮細胞（Ｋｉｄｎｅｙ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ）、腎臓糸球体内皮細胞（Ｒｅｎａｌ Ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ）、肝臓類洞内皮細胞（Ｌｉｖｅｒ Ｓｉｎｕｓｏｉｄａｌ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ）、肺微小血管内皮細胞（Ｌｕｎｇ Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ）、肺動脈内皮細胞（Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ Ａｒｔｅｒｙ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ）、肺静脈内皮細胞（Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ Ｖｅｉｎ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ）、リンパ管内皮細胞（Ｌｙｍｐｈａｔｉｃ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ）、***微小血管内皮細胞（Ｍａｍｍａｒｙ Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ）、卵巣微小血管内皮細胞（Ｏｖａｒｉａｎ Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ）、胎盤微小血管内皮細胞（Ｐｌａｃｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ）、前立腺微小血管内皮細胞（Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ）、子宮微小血管内皮細胞（Ｕｔｅｒｉｎｅ Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ）、網膜微小血管内皮細胞（Ｒｅｔｉｎａｌ Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ）、小腸微小血管内皮細胞（Ｓｍａｌｌ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ）、脾臓内皮細胞（Ｓｐｌｅｅｎ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ）、甲状腺微小血管内皮細胞（Ｔｈｙｒｏｉｄ Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ）、臍帯静脈内皮細胞（Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ Ｖｅｉｎ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ）、臍帯動脈内皮細胞（Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ Ａｒｔｅｒｙ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ）、伏在静脈内皮細胞（Ｓａｐｈｅｎｏｕｓ Ｖｅｉｎ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ）等が挙げられ、これらに限定されない。
また、血管内皮細胞は、幹細胞又は前駆細胞から分化誘導された細胞であってもよい。前記幹細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞、胚性生殖幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、間葉系幹細胞等が挙げられ、これらに限定されない。
なお、本明細書において、「前駆細胞」とは、前記幹細胞から特定の体細胞又は生殖細胞に分化する途中の段階にある細胞を意味する。
(Vascular endothelial cells)
Examples of vascular endothelial cells to be used include primary cultured cells, subcultured cells, immortalized cultured cells, etc. Among them, primary cultured cells, subcultured cells that have been subcultured up to 6 times, or immortalized cells. It is preferably a cultured cell, and more preferably a primary cultured cell.
On the other hand, when a subcultured cell having a reduced growth rate or an immortalized cultured cell is used after repeated subculture for 7 or more times, for example, a cell aging model can be constructed.
Examples of the vascular endothelial cells include aortic vascular endothelial cells, bladder microvascular endothelial cells, brain microvascular endothelial cells, brain microvascular endothelial cells, and cardiac microvascular endothelial cells. Microvascular Endothelial Cell), Coronary Arterial Endothelial Cell, Skin Lymphatic Endothelial Cell, Dermal Microvascular Endothelial Cell, Dermal Microvascular Intestinal Cell Cells (Intestinal Messential Vascular Endothelial Cell), kidney endothelial cells (Kidney Endothelial Cell), kidney glomerular endothelial cells (Renal Glomeral Endocellular Cell), hepatic sinusoidal endothelial cells (Liver sinus endothelial cells (Liver sinus endothelial cells) Endothelial Cell, Pulmonary Arterial Endothelial Cell, Pulmonary Vein Endothelial Cell, Lymphatic Endothelial Cell, Intramammary Microvascular Skin cells (Mammary Microvascular Endothelial Cell), Ovarian microvascular endothelial cells (Ovarian Microvascular Endothelial Cell), Placental microvascular endothelial cells (Placental Microvascular Endothelial cells), Placental microvascular endothelial cells (Placental microvascular endothelial cells) (Uterine Microvascular Endothelial Cell), Retinal Microvascular Endothelial Cell, Small Intestinal Microvascular Endothelial Cell (Small Internal Microvascular Endothelial Cell) othelial cells), splenic endothelial cells (Spleen Endothelial Cell), thyroid microvascular endothelial cells (Thyroid Microcellular Endothelial Cells), umbilical vein endothelial cells (Umbilical vein Endothelial cells), umbilical vein Endothelial cells (Umbilical vein Endothelial cells) Examples thereof include, but are not limited to, endothelial cells (Saphenous Vein Endothelial Cell).
Vascular endothelial cells may be cells derived from stem cells or progenitor cells. Examples of the stem cells include, but are not limited to, embryonic stem cells (ES cells), embryonic tumor cells, embryonic germ stem cells, induced pluripotent stem cells (iPS cells), mesenchymal stem cells, and the like.
In the present specification, the “progenitor cell” means a cell in the stage of differentiation from the stem cell into a specific somatic cell or germ cell.
また、使用する血管内皮細胞の由来となる動物としては、哺乳動物であることが好ましい。前記哺乳動物としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、マーモセット、サル等が挙げられ、これらに限定されない。中でも、哺乳動物としては、ヒトであることが好ましい。 The animal from which the vascular endothelial cells to be used are derived is preferably a mammal. Examples of the mammal include, but are not limited to, human, mouse, rat, hamster, guinea pig, rabbit, dog, cat, horse, cow, sheep, pig, goat, marmoset, monkey and the like. Among them, the mammal is preferably a human.
よって、使用する血管内皮細胞としては、例えば、ヒト臍帯静脈内皮細胞（Ｈｕｍａｎ Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ Ｖｅｉｎ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ：ＨＵＶＥＣ）、ヒト冠動脈内皮細胞（Ｈｕｍａｎ Ｃｏｒｏｎａｒｙ Ａｒｔｅｒｙ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ：ＨＣＡＥＣ）、ヒト大動脈内皮細胞（Ｈｕｍａｎ Ａｏｒｔｉｃ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ：ＨＡｏＥＣ）、ヒト肺動脈内皮細胞（Ｈｕｍａｎ Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ Ａｒｔｅｒｙ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ：ＨＰＡＥＣ）、ヒト肺微小血管内皮細胞（Ｈｕｍａｎ Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ：ＨＰＭＥＣ）、ヒト伏在静脈内皮細胞（Ｈｕｍａｎ Ｓａｐｈｅｎｏｕｓ Ｖｅｉｎ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ：ＨＳａＶＥＣ）等の市販の初代培養細胞を用いればよい。 Therefore, examples of the vascular endothelial cells to be used include human umbilical vein endothelial cells (Human Umbilical Vein Endothelial Cell: HUVEC), human coronary artery endothelial cells (Human Coronary Endothelial Cell: HCAEC), and human aorta endothelial cells (Human Aortic Cell). : HAoEC), Human Pulmonary Artery Endothelial Cell (HPAEC), Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cell (HPMEC), Human Saphenous Vein Endothelial Endothelial Cell (HUMENS) thelial Cell: HSaVEC) may be used commercially available primary cells, such as.
本実施形態のスクリーニング方法において、例えば、ＨＵＶＥＣを用いた場合、ヒトにおける血管内皮機能を評価する汎用モデルを構築することができ、例えば、ＨＣＡＥＣ又はＨＡｏＥＣを用いた場合、ヒトにおける動脈硬化モデルを構築することができ、例えば、ＨＰＡＥＣを用いた場合、ヒトにおける肺高血圧モデルを構築することができ、例えば、ＨＰＭＥＣを用いた場合、ヒトにおける血管新生モデルを構築することができ、例えば、ＨＳａＶＥＣを用いた場合、深部静脈血栓症モデルを構築することができる。
よって、使用する血管内皮細胞の種類を適宜選択することによって、特定の疾患のインビトロ系モデルを構築することができ、血管内皮機能改善剤、すなわち特定の疾患に有効な治療薬をスクリーニングすることができる。
In the screening method of this embodiment, for example, when HUVEC is used, a general-purpose model for evaluating vascular endothelial function in humans can be constructed. For example, when HCAEC or HAoEC is used, an arteriosclerosis model in humans is constructed. For example, when HPAEC is used, a pulmonary hypertension model in humans can be constructed. For example, when HPMEC is used, an angiogenesis model in humans can be constructed, for example, using HSaVEC. If so, a deep vein thrombosis model can be constructed.
Therefore, an in vitro system model of a specific disease can be constructed by appropriately selecting the type of vascular endothelial cell to be used, and a vascular endothelial function improving agent, that is, a therapeutic agent effective for a specific disease can be screened. it can.
（細胞培養用培地）
使用する細胞培養用培地としては、血管内皮細胞の培養に適した組成であればよく、以下に例示するアミノ酸、ビタミン類、ミネラルを含有するものであればよい。
(Cell culture medium)
The cell culture medium to be used may be any composition suitable for culturing vascular endothelial cells, and any medium containing amino acids, vitamins and minerals exemplified below.
細胞培養用培地に含まれるアミノ酸としては、例えば、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン等が挙げられる。これらのアミノ酸を単独で含んでいてもよく、複数組み合わせて含んでいてもよい。細胞培養用培地に含まれるアミノ酸の濃度は、特別な限定はなく、例えば１ｍｇ／ｍＬ以上１５００ｍｇ／ｍＬ以下であればよい。 Examples of amino acids contained in the cell culture medium include L-alanine, L-arginine, L-asparagine, L-aspartic acid, L-cysteine, L-glutamic acid, L-glutamine, glycine, L-histidine, L- Examples include isoleucine, L-leucine, L-lysine, L-methionine, L-phenylalanine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-valine and the like. These amino acids may be included singly or in combination. The concentration of the amino acid contained in the cell culture medium is not particularly limited and may be, for example, 1 mg / mL or more and 1500 mg / mL or less.
細胞培養用培地に含まれるビタミン類としては、例えば、Ｄ−ビオチン、フォリニック酸、ＤＬ−α−リポ酸、ニコチンアミド、Ｄ−パントテン酸、ピリドキシン、リボフラビンン、チアミン、シアノコバラミン（ビタミンＢ１２）、アデニン、コリン、ｍｙｏ−イノシトール、プトレッシン、ピルビン酸、チミジン等が挙げられる。これらのビタミン類を単独で含んでいてもよく、複数組み合わせて含んでいてもよい。細胞培養用培地に含まれるビタミン類の濃度は、特別な限定はなく、例えば０．５μｇ／ｍＬ以上１５０ｍｇ／ｍＬ以下であればよい。 Examples of vitamins contained in the cell culture medium include D-biotin, folinic acid, DL-α-lipoic acid, nicotinamide, D-pantothenic acid, pyridoxine, riboflavin, thiamine, cyanocobalamin (vitamin B12), Examples include adenine, choline, myo-inositol, putrescine, pyruvic acid, thymidine and the like. These vitamins may be included singly or in combination. The concentration of vitamins contained in the cell culture medium is not particularly limited, and may be, for example, from 0.5 μg / mL to 150 mg / mL.
細胞培養用培地に含まれるミネラルとしては、例えば、カルシウム、カリウム、マグネシウム、リン、ナトリウム、銅、鉄、セレン、マンガン、ケイ素、モリブデン、バナジウム、ニッケル、亜鉛等が挙げられる。これらのミネラルを単独で含んでいてもよく、複数組み合わせて含んでいてもよい。細胞培養用培地に含まれるミネラルの濃度は、特別な限定はなく、例えば０．０５μｇ／ｍＬ以上１００００ｍｇ／ｍＬ以下であればよい。 Examples of the mineral contained in the cell culture medium include calcium, potassium, magnesium, phosphorus, sodium, copper, iron, selenium, manganese, silicon, molybdenum, vanadium, nickel, and zinc. These minerals may be contained alone or in combination. The concentration of the mineral contained in the cell culture medium is not particularly limited, and may be, for example, 0.05 μg / mL or more and 10,000 mg / mL or less.
上記成分を含む細胞培養用培地としては、例えば、最小基本培地（ｍｉｎｉｍａｌ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ：ＭＥＭ）、イーグル最小基本培地（Ｅａｇｌｅ’ｓ ＭＥＭ）、改変イーグルダルベッコ最小基本培地（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ＭＥＭ）、改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ：ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ハムＦ１２培地（Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２ Ｍｅｄｉｕｍ）、ウエイマウス培地、Ｍ１９９培地、ＩＭＥＭ培地、ＲＩＴＣ８０−７培地、ＲＩＴＣ５７−１培地、イスエフ培地、ＨＢ１０１培地、ＭＣＤＢ１０７培地、改変ＭＣＤＢ１３１培地等が挙げられる。 Examples of the cell culture medium containing the above components include a minimal basic medium (MEM), an Eagle's minimum basic medium (Eagle's MEM), a modified Eagle Dulbecco's minimum basic medium (Modified Eagle's MEM), and a modification. Eagle medium (Dulbecco's Modified Eagle Medium: DMEM), RPMI-1640 medium, Ham F12 medium (Ham's F12 Medium), Way mouse medium, M199 medium, IMEM medium, RITC80-7 medium, RITC57-1 medium, ISFC Examples of the medium include HB101 medium, MCDB107 medium, and modified MCDB131 medium.
使用する細胞培養用培地は、さらに、以下に例示する血清、成長因子、ホルモン、抗生物質等のその他の添加物を含有していてもよい。 The cell culture medium to be used may further contain other additives such as serum, growth factors, hormones, and antibiotics exemplified below.
細胞培養用培地に含まれる血清としては、例えば、ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）；Ｆｅｔａｌ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ（ＦＣＳ））等が挙げられる。細胞培養用培地に含まれる血清の濃度は、例えば２質量％以上１０質量％以下であればよい。 Examples of the serum contained in the cell culture medium include fetal bovine serum (FBS) and the like. The concentration of serum contained in the cell culture medium may be, for example, 2% by mass or more and 10% by mass or less.
細胞培養用培地に含まれる成長因子としては、例えば、血管内皮成長因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）、内皮細胞成長因子（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ＥＣＧＦ）、内皮細胞増殖因子（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ：ＥＣＧＳ）、内皮細胞由来成長因子（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ＥＣＤＧＦ）、上皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ＥＧＦ）、酸性繊維芽細胞成長因子（ａｃｉｄｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ａＦＧＦ）、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ｂＦＧＦ）、インスリン様成長因子−１（Ｉｎｓｕｌｉｎ―ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−１：ＩＧＦ−１）、マクロファージ由来成長因子（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ＭＤＧＦ）、血小板由来成長因子（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ＰＤＧＦ）、腫瘍血管新生因子（Ｔｕｍｏｒ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ：ＴＡＦ）等が挙げられる。これらの成長因子を単独で含んでいてもよく、複数組み合わせて含んでいてもよい。細胞培養用培地に含まれる成長因子の濃度は、特別な限定はなく、例えば１ｎｇ／ｍＬ以上１０μｇ／ｍＬ以下であればよい。 Examples of the growth factor contained in the cell culture medium include a vascular endothelial growth factor (VEGF), an endothelial cell growth factor (ECGF), and an endothelial cell growth factor (Endothelial cell). ECGS), Endothelial cell-derived growth factor (ECDGF), Epidermal growth factor (EGF), Acidic fibroblast growth factor, Acid fibroblast growth factor Growth factor (basic fibrob as growth factor (bFGF), insulin-like growth factor-1 (IGF-1), macrophage-derived growth factor (MDGF), platelet-derived growth factor (Platelet-growth factor) factor: PDGF), tumor angiogenesis factor (TAF), and the like. These growth factors may be included singly or in combination. The concentration of the growth factor contained in the cell culture medium is not particularly limited, and may be, for example, 1 ng / mL or more and 10 μg / mL or less.
細胞培養用培地に含まれるホルモンとしては、例えば、インシュリン、グルカゴン、トリヨードチロニン、副腎皮質ホルモン等が挙げられる。これらのホルモンを単独で含んでいてもよく、複数組み合わせて含んでいてもよい。細胞培養用培地に含まれるホルモンの濃度は、特別な限定はなく、例えば１ｎｇ／ｍＬ以上１０μｇ／ｍＬ以下であればよい。 Examples of hormones contained in the cell culture medium include insulin, glucagon, triiodothyronine, and adrenocortical hormone. These hormones may be included singly or in combination. The concentration of the hormone contained in the cell culture medium is not particularly limited and may be, for example, from 1 ng / mL to 10 μg / mL.
細胞培養用培地に含まれる抗生物質としては、例えば、ゲンタマイシン、アンフォテリシン、アンピシリン、ミノマイシン、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタシン、タイロシン、オーレオマイシン等、通常の動物細胞の培養に用いられるものが挙げられる。これらの抗生物質を単独で含んでいてもよく、複数組み合わせて含んでいてもよい。細胞培養用培地に含まれる抗生物質の濃度は、特別な限定はなく、例えば０．１μｇ／ｍＬ以上１００μｇ／ｍＬ以下であればよい。 Examples of antibiotics contained in the cell culture medium include those used for normal animal cell culture such as gentamicin, amphotericin, ampicillin, minomycin, kanamycin, penicillin, streptomycin, gentacin, tylosin, and aureomycin. . These antibiotics may be contained alone or in combination of two or more. The concentration of the antibiotic contained in the cell culture medium is not particularly limited, and may be, for example, from 0.1 μg / mL to 100 μg / mL.
（培養条件）
培養条件としては、通常の血管内皮細胞を培養する条件であればよい。培養温度は、例えば２５℃以上４０℃以下であればよく、例えば３０℃以上３９℃以下であればよく、例えば３５℃以上３９℃以下であればよい。
また、必要に応じて培養環境を著しく変化させなければ還流等の流体力学的な付加を加えてもよい。
また、培養環境は、例えば、約５％のＣＯ２条件下であってもよい。
また、培養時間としては、細胞がコンフルエントの状態になるように、細胞の種類及び細胞数に応じて、適宜設定すればよい。培養時間は、例えば１２時間以上２４時間以下であればよい。
(Culture conditions)
The culture conditions may be any conditions as long as normal vascular endothelial cells are cultured. The culture temperature may be, for example, 25 ° C. or more and 40 ° C. or less, for example, 30 ° C. or more and 39 ° C. or less, for example, 35 ° C. or more and 39 ° C. or less.
If necessary, a hydrodynamic addition such as reflux may be added as long as the culture environment is not significantly changed.
The culture environment may be, for example, about 5% CO 2 condition.
Moreover, what is necessary is just to set suitably as culture | cultivation time according to the kind and number of cells so that a cell may be in a confluent state. The culture time may be, for example, 12 hours or more and 24 hours or less.
［培養工程］
次いで、準備工程後の血管内皮細胞を、被検化合物の添加、又は無添加条件にて培養する。
被検化合物としては、血管内皮機能改善効果を有する、すなわち、上述の［準備工程］において例示された疾患に対する治療効果を有すると推定されるものであればよく、特別な限定はない。また、被検化合物は、予め細胞培養用培地に混合し、培地交換の際に被検化合物含有細胞培養用培地を添加すればよい。また、被検化合物の有効量を推定するために、細胞培養用培地中の被検化合物の濃度をふったものを用意して、用いてもよい。
被検化合物を添加したサンプル、及び被検化合物を添加していないサンプルを準備し、続く誘導工程を経て、評価工程において比較することで、血管内皮機能の改善効果を評価することができる。
[Culture process]
Next, the vascular endothelial cells after the preparation step are cultured under the condition where the test compound is added or not.
The test compound is not particularly limited as long as it has a vascular endothelial function improving effect, that is, it is estimated to have a therapeutic effect on the diseases exemplified in the above [Preparation Step]. Further, the test compound may be mixed in advance with a cell culture medium, and the test compound-containing cell culture medium may be added when the medium is replaced. Further, in order to estimate the effective amount of the test compound, a test compound containing the concentration of the test compound in the cell culture medium may be prepared and used.
A sample to which the test compound is added and a sample to which the test compound is not added are prepared, and the effect of improving the vascular endothelial function can be evaluated by comparing in the evaluation step through the subsequent induction step.
使用する細胞培養用培地としては、上述の［準備工程］において例示されたものと同様のものが挙げられる。また、使用する細胞培養培地は、成長因子を実質的に含まないものであることが好ましい。
なお、本明細書において、「成長因子を実質的に含まない」とは、上述の［準備工程］において例示された成長因子を全く含まない、又は、前記成長因子を単独で用いた場合において、成長因子として細胞を成長させる効果を有さない程度の量を含む状態を意味する。
Examples of the cell culture medium to be used include the same ones as exemplified in the above [Preparation step]. Moreover, it is preferable that the cell culture medium to be used is a thing which does not contain a growth factor substantially.
In the present specification, “substantially free of growth factor” means that the growth factor exemplified in the above [Preparation step] is not included at all, or when the growth factor is used alone, It means a state containing an amount that does not have the effect of growing cells as a growth factor.
また、培養条件としては、通常の血管内皮細胞を培養する条件であればよい。培養温度は、例えば２５℃以上４０℃以下であればよく、例えば３０℃以上３９℃以下であればよく、例えば３５℃以上３９℃以下であればよい。
また、必要に応じて培養環境を著しく変化させなければ還流等の流体力学的な付加を加えてもよい。
また、培養環境は、例えば、約５％のＣＯ２条件下であってもよい。
また、培養方法は、例えば、水平振盪培養、静置培養等が挙げられ、中でも、水平振盪培養であることが好ましい。振盪速度については、例えば、ヒトの生理的な毛細血管から細動脈までの流れずり応力とされる２．５ｄｙｎｅｓ／ｃｍ２以上５ｄｙｎｅｓ／ｃｍ２以下となるように調整すればよい。
また、培養時間としては、被検化合物が血管内皮細胞に作用し、血管内皮機能改善効果（内皮グリコカリックス層の生成促進効果、又は内皮グリコカリックス層の遊離抑制効果）を奏するのに有効な時間であればよく、例えば３０分以上２時間以下であればよく、例えば、１時間程度であればよい。
Moreover, the culture conditions may be any conditions as long as normal vascular endothelial cells are cultured. The culture temperature may be, for example, 25 ° C. or more and 40 ° C. or less, for example, 30 ° C. or more and 39 ° C. or less, for example, 35 ° C. or more and 39 ° C. or less.
If necessary, a hydrodynamic addition such as reflux may be added as long as the culture environment is not significantly changed.
The culture environment may be, for example, about 5% CO 2 condition.
In addition, examples of the culture method include horizontal shaking culture and stationary culture, and among them, horizontal shaking culture is preferable. The shaking speed may be adjusted to be, for example, 2.5 dynes / cm 2 or more and 5 dynes / cm 2 or less, which is a flow shear stress from a human physiological capillary to arteriole.
In addition, as the culture time, the test compound acts on the vascular endothelial cells and is effective for the effect of improving the vascular endothelial function (the effect of promoting the formation of the endothelial glycocalyx layer or the effect of inhibiting the release of the endothelial glycocalyx layer). For example, it may be 30 minutes or more and 2 hours or less, for example, about 1 hour.
［誘導工程］
次いで、培養工程後の血管内皮細胞に血管内皮障害リスク因子を添加し培養することで、グリコカリックスの遊離を誘導する。
[Induction process]
Subsequently, the release of glycocalyx is induced by adding a vascular endothelial disorder risk factor to the vascular endothelial cells after the culturing step and culturing.
上述のとおり、血管内皮機能障害を引き起こす疾患としては、主に、生活習慣病及び該生活習慣病が基盤となり発症する循環器疾患であり、血管内皮障害リスク因子を培養工程後の血管内皮細胞に添加することで、血管内皮機能障害、すなわち、グリコカリックスの生成抑制、又はグリコカリックスの遊離促進を引き起こすことができる。 As described above, diseases that cause vascular endothelial dysfunction are mainly lifestyle-related diseases and cardiovascular diseases that develop based on the lifestyle-related diseases, and risk factors for vascular endothelial failure are applied to vascular endothelial cells after the culture process. By adding, vascular endothelial dysfunction, that is, production of glycocalyx can be suppressed, or release of glycocalyx can be promoted.
（血管内皮障害リスク因子）
使用する血管内皮障害リスク因子としては、所望の疾患モデルを構築可能なものであればよい。
例えば糖尿病モデルを構築する場合は、Ｎε−カルボキシメチルリシン、Ｎε−カルボキシエチルリシン、アルグピリミジン、ペントシジン、ピラリン、クロスリン、ＧＡ−ピリジン、グルコスパン等の終末糖化産物；インスリン；血中濃度換算で５００ｍｇ／ｄＬ以上の高濃度の糖類等が挙げられ、これらに限定されない。
前記糖類としては、例えば、デンプン、グリコーゲン等の多糖類；ラフィノース、スタキオース等の少糖類；スクロース、マルトース等の二糖類；六炭糖、五炭糖等の単糖類等が挙げられる。前記六炭糖としては、例えば、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース等のアルドヘキソース；プリコース、フルクトース、ソルボース、タガロース等のケトヘキトース；フコース、フクロース、ラムノース等のデオキシ糖等が挙げられる。
例えば、脂質異常症のうち、高ＬＤＬコレステロール血症モデルを構築する場合は、血中濃度換算で１４０ｍｇ／ｄＬ以上の酸化ＬＤＬ（ｌｏｗ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）コレステロール；バクセン酸、エライジン酸等のトランス脂肪酸等が挙げられ、これらに限定されない。
例えば、脂質異常症のうち、低ＨＤＬコレステロール血症モデルを構築する場合は、プロブコール、サイアザイド、β−ｂｌｏｃｋｅｒ等が挙げられ、これらに限定されない。
例えば、脂質異常症のうち、高トリグリセライド（中性脂肪）血症モデルを構築する場合は、血中濃度換算で１５０ｍｇ／ｄＬ以上の遊離脂肪酸等が挙げられる。前記遊離脂肪酸としては、例えば、パルミチン酸、パルミトレイン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、オレイン酸、バクセン酸、リノール酸、エレオステアリン酸、アラキジン酸、ミード酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸等が挙げられる。
例えば、酸化ストレス亢進モデルを構築する場合は、スーパーオキシドアニオンラジカル、ヒドロキシルラジカル、過酸化水素、一重項酸素等の活性酸素；一酸化窒素、二酸化窒素、オゾン、過酸化脂質等が挙げられ、これらに限定されない。
例えば、心不全モデルを構築する場合は、イソプロテレノール、メタプロテレノール、 トリメトキノール、フェノテロール、プロカテロール、サルブタモール、ホルモテロール、サルメテロール、インダカテロール等のβ２刺激薬；カテコラミン、エンドセリン等が挙げられ、これらに限定されない。
例えば、肥満モデルを構築する場合は、血中濃度換算で５００ｍｇ／ｄＬ以上の高濃度の糖類；遊離脂肪酸；アンジオテンシン（ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ）ＩＩ、アンジオテンシンＩＩＩ、アンジオテンシンＩＶ等が挙げられ、これらに限定されない。前記糖類としては、上述の糖尿病モデルについて例示されたものと同様のものが挙げられる。前記遊離脂肪酸としては、上述の肥満モデルについて例示されたものと同様のものが挙げられる。
例えば、高尿酸血症モデルを構築する場合は、血中濃度換算で７ｍｇ／ｄＬ以上の高濃度の尿酸等が挙げられる。
例えば、炎症モデルを構築する場合は、インターロイキン−６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６；ＩＬ−６）、ＩＬ−１８、腫瘍壊死因子−α（Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ−α；ＴＮＦ−α）、リポ多糖（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ；ＬＰＳ）等が挙げられ、これらに限定されない。
例えば、肺高血圧モデルを構築する場合は、エンドセリン等が挙げられ、これらに限定されない。
例えば、血栓形成モデルを構築する場合は、トロンボキサＡ２（ＴＸＡ２）、プラスミノゲンアクチベーターインヒビター−１（ＰＡＩ−１）、等が挙げられ、これらに限定されない。さらに、培養方法として、静置培養又は低速振盪培養を用いることで、血栓形成を促進することができる。
例えば、多量飲酒モデルを構築する場合は、血中濃度換算で０．４質量％以上のエタノール等が挙げられる。
これらの血管内皮障害リスク因子を単独で含んでいてもよく、異なる疾患モデルを構築可能なこれらの血管内皮障害リスク因子を複数組み合わせて含んでいてもよい。また、これらの血管内皮障害リスク因子を１種類含んでいてもよく、同じ疾患モデルを構築可能なこれらの血管内皮障害リスク因子を複数種類組み合わせて含んでいてもよい。
また、細胞培養用培地に含まれる血管内皮障害リスク因子の濃度は、所望の疾患モデルを構築することができるように、適宜調整すればよい。
(Risk factor for vascular endothelial injury)
Any vascular endothelial disorder risk factor may be used as long as it can construct a desired disease model.
For example, when constructing a diabetes model, advanced glycation end products such as N ε -carboxymethyl lysine, N ε -carboxyethyl lysine, argpyrimidine, pentosidine, pyralin, croslin, GA-pyridine, glucospan; insulin; Examples include, but are not limited to, saccharides having a high concentration of 500 mg / dL or more.
Examples of the saccharide include polysaccharides such as starch and glycogen; oligosaccharides such as raffinose and stachyose; disaccharides such as sucrose and maltose; monosaccharides such as hexose and pentose. Examples of the hexose include aldohexoses such as allose, altrose, glucose, mannose, gulose, idose, galactose, and talose; ketohexoses such as precose, fructose, sorbose, and tagarose; Examples include sugars.
For example, in the case of constructing a high LDL cholesterolemia model among dyslipidemias, oxidized LDL (low density lipoprotein) cholesterol of 140 mg / dL or more in terms of blood concentration; trans fatty acids such as vaccenic acid and elaidic acid, etc. But are not limited to these.
For example, among dyslipidemias, when a low HDL cholesterolemia model is constructed, examples include, but are not limited to, probucol, thiazide, β-blocker and the like.
For example, when a hypertriglyceride (neutral fat) blood model is constructed among dyslipidemias, examples include free fatty acids of 150 mg / dL or more in terms of blood concentration. Examples of the free fatty acid include palmitic acid, palmitoleic acid, margaric acid, stearic acid, oleic acid, vaccenic acid, linoleic acid, eleostearic acid, arachidic acid, mead acid, arachidonic acid, eicosapentaenoic acid, and the like. .
For example, when building an oxidative stress enhancement model, superoxide anion radical, hydroxyl radical, hydrogen peroxide, singlet oxygen, and other active oxygens; nitric oxide, nitrogen dioxide, ozone, lipid peroxide, etc. It is not limited to.
For example, when constructing a heart failure model, β2 stimulants such as isoproterenol, metaproterenol, trimethoquinol, fenoterol, procaterol, salbutamol, formoterol, salmeterol, indacaterol; catecholamine, endothelin, etc. It is not limited to.
For example, when an obesity model is constructed, saccharides having a high concentration of 500 mg / dL or more in terms of blood concentration; free fatty acids; angiotensin II, angiotensin III, angiotensin IV and the like can be mentioned, but the invention is not limited thereto. Examples of the saccharide include those similar to those exemplified for the above-mentioned diabetes model. Examples of the free fatty acid include those exemplified for the obesity model described above.
For example, when a hyperuricemia model is constructed, uric acid with a high concentration of 7 mg / dL or more in terms of blood concentration can be mentioned.
For example, when constructing an inflammation model, interleukin-6 (IL-6), IL-18, tumor necrosis factor-α (TNF-α), lipopolysaccharide (Lipopolysaccharide; LPS) and the like, but not limited thereto.
For example, when constructing a pulmonary hypertension model, endothelin and the like can be mentioned, but are not limited thereto.
For example, when constructing a thrombus formation model, examples include, but are not limited to, thromboxa A2 (TXA2), plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1), and the like. Furthermore, thrombus formation can be promoted by using stationary culture or low-speed shaking culture as a culture method.
For example, when constructing a large drinking model, ethanol of 0.4% by mass or more in terms of blood concentration can be mentioned.
These vascular endothelial disorder risk factors may be included alone, or a plurality of these vascular endothelial disorder risk factors capable of constructing different disease models may be included. One kind of these vascular endothelial disorder risk factors may be included, or a plurality of these vascular endothelial disorder risk factors capable of constructing the same disease model may be included.
Further, the concentration of the vascular endothelial injury risk factor contained in the cell culture medium may be appropriately adjusted so that a desired disease model can be constructed.
（培養条件）
また、血管内皮障害リスク因子の添加後の培養条件としては、通常の血管内皮細胞を培養する条件であればよい。培養温度は、例えば２５℃以上４０℃以下であればよく、例えば３０℃以上３９℃以下であればよく、例えば３５℃以上３９℃以下であればよい。
また、必要に応じて培養環境を著しく変化させなければ還流等の流体力学的な付加を加えてもよい。
また、培養環境は、例えば、約５％のＣＯ２条件下であってもよい。
また、培養方法は、例えば、水平振盪培養、静置培養等が挙げられる。
また、培養時間としては、血管内皮障害リスク因子が血管内皮細胞に作用し、所望の疾患モデルを構築し、それに対する被検化合物の作用を確認するのに有効な時間であればよく、例えば５分以上１時間以下であればよく、例えば、１５分以上３０分以下であればよい。
(Culture conditions)
In addition, the culture conditions after the addition of the vascular endothelial disorder risk factor may be any conditions as long as normal vascular endothelial cells are cultured. The culture temperature may be, for example, 25 ° C. or more and 40 ° C. or less, for example, 30 ° C. or more and 39 ° C. or less, for example, 35 ° C. or more and 39 ° C. or less.
If necessary, a hydrodynamic addition such as reflux may be added as long as the culture environment is not significantly changed.
The culture environment may be, for example, about 5% CO 2 condition.
Examples of the culture method include horizontal shaking culture and stationary culture.
The culture time may be any time that is effective for the risk factor of vascular endothelial injury to act on vascular endothelial cells, construct a desired disease model, and confirm the action of the test compound on the disease model. It may be from 1 minute to 1 hour, for example, from 15 minutes to 30 minutes.
［評価工程］
次いで、誘導工程後の被検化合物の添加、又は無添加条件での培養液中に含まれるグリコカリックス濃度を測定し、被検化合物による血管内皮機能の改善効果を評価する。
[Evaluation process]
Subsequently, the glycocalyx concentration contained in the culture solution under the condition of addition or no addition of the test compound after the induction step is measured, and the effect of improving the vascular endothelial function by the test compound is evaluated.
グリコカリックス濃度の測定方法としては、当該技術分野において用いられる公知の方法であればよく、例えば、グリコカリックスに特異的に結合する抗体を用いた方法等が挙げられる。
グリコカリックスに特異的に結合する抗体を用いた方法として、より具体的には、例えば、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）法（好ましくは、サンドイッチＥＬＩＳＡ法）、ＣＬＥＩＡ（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏ Ａｓｓａｙ）法（化学発光酵素免疫測定法）、ウエスタンブロッティング法、免疫沈降法、免疫染色法等が挙げられる。グリコカリックスに特異的に結合する抗体としては、検出したグリコカリックスの種類に応じて、適宜選択して用いればよい。
The method for measuring the glycocalyx concentration may be a known method used in the art, and examples thereof include a method using an antibody that specifically binds to glycocalyx.
As a method using an antibody that specifically binds to glycocalyx, more specifically, for example, ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) method (preferably sandwich ELISA method), CLEIA (Chemiluminescent Enzyme Immuno Assay) method Chemiluminescent enzyme immunoassay), Western blotting, immunoprecipitation, immunostaining, and the like. An antibody that specifically binds to glycocalyx may be appropriately selected and used depending on the type of glycocalyx detected.
また、ＥＬＩＳＡ法を用いてグリコカリックス濃度を測定する場合において、グリコカリックスがシンデカン−１であるとき、例えば、Ｈｕｍａｎ Ｓｙｎｄｅｃａｎ―１／ＣＤ１３８ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（ＣｅｌｌＳｃｉｅｎｃｅｓ社製）等の従来のＥＬＩＳＡキットを用いて測定すればよい。
グリコカリックスがヒアルロン酸であるとき、例えば、ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ Ａｃｉｄ（ＨＡ）（カタログ番号：ＵＳＣＮ−Ｅ９０１８２Ｈｕ、Ｃｌｏｕｄ−Ｃｌｏｎｅ社製）等の従来のＥＬＩＳＡキットを用いて測定すればよい。
グリコカリックスがグリピカン−１であるとき、例えば、ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｇｌｙｐｉｃａｎ１（ＧＰＣ１）（カタログ番号：ＵＳＣＮ−Ｅ９１０３２Ｈｕ、Ｃｌｏｕｄ−Ｃｌｏｎｅ社製）等の従来のＥＬＩＳＡキットを用いて測定すればよい。
Further, when the glycocalyx concentration is measured using the ELISA method, when the glycocalyx is syndecan-1, for example, a conventional ELISA kit such as Human Syndecan-1 / CD138 ELISA Kit (manufactured by Cell Sciences) is used. Just measure.
When the glycocalyx is hyaluronic acid, measurement may be performed using a conventional ELISA kit such as ELISA Kit for Human Hyaluronic Acid (HA) (catalog number: USCN-E90182Hu, manufactured by Cloud-Clone).
When the glycocalyx is glypican-1, for example, it may be measured using a conventional ELISA kit such as ELISA Kit for Glypican 1 (GPC1) (catalog number: USCN-E91032Hu, manufactured by Cloud-Clone).
グリコカリックスに特異的に結合する抗体を用いた方法を用いてグリコカリックス濃度を測定する方法について、詳細な手順を以下に示す。
まず、誘導工程後の被検化合物の添加、又は無添加条件での培養液と、グリコカリックスに特異的に結合する抗体とを接触させて、培養液中の抗原（遊離のグリコカリックス）と前記グリコカリックスに特異的に結合する抗体とによる抗原抗体反応（以下、「１次抗原抗体反応」と称する場合がある。）を行う。この抗原抗体反応は、４℃以上３７℃以下にて行うことが好ましい。反応時間については、前記グリコカリックスに特異的に結合する抗体の抗体価及び培養液中の抗原（遊離のグリコカリックス）の量によって、適宜調整することができる。
A detailed procedure for the method of measuring the glycocalyx concentration using a method using an antibody that specifically binds to glycocalyx is shown below.
First, after adding the test compound after the induction step, or by bringing the culture solution under non-addition conditions into contact with an antibody that specifically binds to glycocalyx, the antigen (free glycocalyx) in the culture solution and the aforementioned An antigen-antibody reaction with an antibody that specifically binds to glycocalyx (hereinafter sometimes referred to as “primary antigen-antibody reaction”) is performed. This antigen-antibody reaction is preferably performed at 4 ° C. or higher and 37 ° C. or lower. About reaction time, it can adjust suitably with the antibody titer of the antibody couple | bonded specifically with the said glycocalyx, and the quantity of the antigen (free glycocalyx) in a culture solution.
前記グリコカリックスに特異的に結合する抗体は、例えば、緩衝液等を用いて溶解又は希釈して用いればよい。使用する緩衝液としては、当該分野において公知のものから適宜選択でき、例えば、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、クエン酸緩衝液、炭酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、コハク酸緩衝液、酢酸緩衝液等が挙げられる。緩衝液は、必要に応じて、ＮａＣｌ、界面活性剤(例えば、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００等)及び防腐剤（例えば、アジ化ナトリウム等）のうち少なくともいずれか一方を含んでいてもよい。緩衝液の具体例としては、リン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ）、ＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ２０）、トリス緩衝生理食塩水（Ｔｒｉｓ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ；ＴＢＳ）、又はＴＢＳ−Ｔ（ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ２０）等が挙げられる。
The antibody that specifically binds to the glycocalyx may be used after being dissolved or diluted using, for example, a buffer solution. The buffer to be used can be appropriately selected from those known in the art, for example, phosphate buffer, Tris-HCl buffer, citrate buffer, carbonate buffer, borate buffer, succinate buffer, acetic acid. Examples include a buffer solution. The buffer may contain at least one of NaCl, a surfactant (for example,
前記グリコカリックスに特異的に結合する抗体がマイクロタイタープレート、チューブ、スライドグラス又はチップ等の支持体に固定されている場合、前記グリコカリックスに特異的に結合する抗体が固定されている支持体に、培養液を滴下し、接触させればよい。また、前記グリコカリックスに特異的に結合する抗体がビーズ、粒子等の支持体に固定されている場合、前記グリコカリックスに特異的に結合する抗体が固定されている支持体を緩衝液等に懸濁し、前記グリコカリックスに特異的に結合する抗体が固定されている支持体を含む溶液と、培養液とを混合して接触させればよい。使用する緩衝液としては、上述において例示したものと同様のものが挙げられる。 When an antibody that specifically binds to the glycocalyx is immobilized on a support such as a microtiter plate, tube, slide glass, or chip, the antibody that specifically binds to the glycocalyx is immobilized on the support. The culture solution may be dropped and brought into contact. In addition, when an antibody that specifically binds to the glycocalyx is immobilized on a support such as a bead or particle, the support on which the antibody that specifically binds to the glycocalyx is immobilized is suspended in a buffer or the like. What is necessary is just to mix and contact the solution containing the support body in which the antibody which becomes cloudy and specifically binds to the glycocalyx is fixed, and the culture solution. Examples of the buffer solution to be used include the same ones as exemplified above.
前記グリコカリックスに特異的に結合する抗体に標識物質が結合したものを用いる場合、１次抗原抗体反応を検出してもよい。
また、前記グリコカリックスに特異的に結合する抗体がマイクロタイタープレート、チューブ、スライドグラス又はチップ等の支持体に固定されている場合、前記グリコカリックスに特異的に結合する抗体に結合した際に、センサー等により１次抗原抗体反応を検出してもよい。
検出感度及び反応特異性の観点から、２次抗体を用いて、グリコカリックスを検出及び定量することが好ましい。２次抗体を用いた場合の検出方法について、以下に詳細に説明する。
When an antibody that specifically binds to the glycocalyx is used in which a labeling substance is bound, a primary antigen-antibody reaction may be detected.
In addition, when the antibody that specifically binds to the glycocalyx is fixed to a support such as a microtiter plate, tube, slide glass, or chip, when bound to the antibody that specifically binds to the glycocalyx, The primary antigen-antibody reaction may be detected by a sensor or the like.
From the viewpoint of detection sensitivity and reaction specificity, it is preferable to detect and quantify glycocalyx using a secondary antibody. The detection method using a secondary antibody will be described in detail below.
まず、１次抗原抗体反応後、培養液を取り除き、洗浄する。この洗浄は、例えば、緩衝液等を用いて行えばよい。使用する緩衝液としては、上述において例示したものと同様のものが挙げられる。 First, after the primary antigen-antibody reaction, the culture solution is removed and washed. This washing may be performed using, for example, a buffer solution or the like. Examples of the buffer solution to be used include the same ones as exemplified above.
次いで、前記グリコカリックスに特異的に結合する抗体と、２次抗体を接触させ、グリコカリックス、又は前記グリコカリックスに特異的に結合する抗体と、２次抗体（前記グリコカリックスに特異的に結合する抗体に標識物質が結合したもの、又は前記グリコカリックスに特異的に結合する抗体に対する抗体に標識物質が結合したもの）と、による抗原抗体反応（以下、「２次抗原抗体反応」と称する場合がある。）を行う。２次抗原抗体反応についても、４℃以上３７℃以下にて行うことが好ましい。反応時間については、使用する２次抗体の抗体価によって、適宜調整することができる。 Next, an antibody that specifically binds to the glycocalyx is brought into contact with a secondary antibody, and the glycocalyx or an antibody that specifically binds to the glycocalyx and a secondary antibody (specifically binds to the glycocalyx) An antigen-antibody reaction (hereinafter referred to as “secondary antigen-antibody reaction”) by a labeling substance bound to an antibody or a labeling substance bound to an antibody against an antibody that specifically binds to the glycocalix. Yes.) The secondary antigen-antibody reaction is also preferably performed at 4 ° C. or higher and 37 ° C. or lower. About reaction time, it can adjust suitably with the antibody titer of the secondary antibody to be used.
使用する２次抗体としては、後述の＜＜血管内皮機能改善剤をスクリーニングするためのキット＞＞の＜グリコカリックス検出試薬＞の（２次抗体）において例示したものと同様のものが挙げられる。
また、使用する２次抗体は、例えば、緩衝液等を用いて溶解又は希釈して用いればよい。使用する緩衝液としては、上述において例示したものと同様のものが挙げられる。
Examples of the secondary antibody to be used include the same antibodies as those exemplified in (Secondary antibody) of <Glycocalix detection reagent> in << Kit for screening vascular endothelial function improving agent >> described later.
Further, the secondary antibody to be used may be used after being dissolved or diluted with, for example, a buffer solution. Examples of the buffer solution to be used include the same ones as exemplified above.
前記グリコカリックスに特異的に結合する抗体がマイクロタイタープレート、チューブ、スライドグラス又はチップ等の支持体に固定されている場合、２次抗体を含む溶液を滴下し、接触させればよい。また、前記グリコカリックスに特異的に結合する抗体がビーズ、粒子等の支持体に固定されている場合、前記グリコカリックスに特異的に結合する抗体が固定されている支持体を含む溶液と、２次抗体を含む溶液とを混合して接触させればよい。 When the antibody that specifically binds to the glycocalyx is immobilized on a support such as a microtiter plate, a tube, a slide glass, or a chip, a solution containing a secondary antibody may be dropped and contacted. In addition, when the antibody that specifically binds to the glycocalyx is immobilized on a support such as beads or particles, a solution containing a support on which the antibody that specifically binds to the glycocalyx is immobilized; What is necessary is just to mix and contact the solution containing a next antibody.
また、２次抗原抗体反応後に、１次抗原抗体反応後と同様に洗浄を行ってもよい。また、２次抗体の標識物質が酵素である場合、酵素基質と接触させる工程、反応停止液を添加して反応を停止させる工程等をさらに備えていてもよい。 Further, after the secondary antigen-antibody reaction, washing may be performed in the same manner as after the primary antigen-antibody reaction. Further, when the labeling substance of the secondary antibody is an enzyme, it may further comprise a step of contacting with the enzyme substrate, a step of stopping the reaction by adding a reaction stop solution, and the like.
次いで、２次抗体を検出することにより、グリコカリックスを検出することができる。さらに、２次抗体を検出することにより、培養液中に含まれるグリコカリックスを定量することができる。検出方法としては、標識物質の種類により、当業者が適宜選択することができる。例えば、標識物質が蛍光物質である２次抗体を検出する場合、蛍光スキャナー又は２光子励起スキャナー等により検出することができる。 Subsequently, glycocalix can be detected by detecting the secondary antibody. Furthermore, glycocalix contained in the culture medium can be quantified by detecting the secondary antibody. The detection method can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the type of labeling substance. For example, when detecting a secondary antibody whose labeling substance is a fluorescent substance, it can be detected by a fluorescent scanner or a two-photon excitation scanner.
前記グリコカリックスに特異的に結合する抗体がマイクロタイタープレート、チューブ、スライドグラス又はチップ等の支持体に固定されている場合、検出機構やサンプル分注機構等の解析に必要な周辺装置と組み合わせることによって、全自動あるいは半自動の培養液中のグリコカリックスの検出システムとして提供することができる。この検出システムによれば、培養液中に含まれるグリコカリックスを全自動あるいは半自動で簡便に検出することができる。さらに、培養液中に含まれるグリコカリックスを定量することができる。 When the antibody that specifically binds to the glycocalyx is fixed to a support such as a microtiter plate, tube, slide glass, or chip, combine it with peripheral devices necessary for analysis such as detection mechanism and sample dispensing mechanism. Can be provided as a system for detecting glycocalyx in a fully automatic or semi-automatic culture solution. According to this detection system, glycocalyx contained in the culture solution can be easily detected fully automatically or semi-automatically. Furthermore, glycocalyx contained in the culture solution can be quantified.
本実施形態の評価工程において、得られたグリコカリックス濃度から、被検化合物の添加条件での培養液中に含まれるグリコカリックス濃度が、被検化合物の無添加条件での培養液中に含まれるグリコカリックス濃度と比較して低かった場合に、前記被検化合物は血管内皮機能の改善効果を有し、血管内皮機能改善剤として有用であると評価することができる。
一方、被検化合物の添加条件での培養液中に含まれるグリコカリックス濃度が、被検化合物の無添加条件での培養液中に含まれるグリコカリックス濃度と比較して同程度、又は高かった場合に、前記被検化合物は血管内皮機能の改善効果を有さないと評価することができる。
In the evaluation step of the present embodiment, from the obtained glycocalyx concentration, the glycocalyx concentration contained in the culture solution under the test compound addition condition is contained in the culture solution under the test compound non-addition condition. When the concentration is lower than the glycocalyx concentration, the test compound has an effect of improving vascular endothelial function and can be evaluated as useful as a vascular endothelial function improving agent.
On the other hand, when the concentration of glycocalyx contained in the culture solution under the test compound addition condition is the same or higher than the concentration of glycocalyx contained in the culture solution under the test compound non-addition condition Moreover, it can be evaluated that the test compound does not have an effect of improving vascular endothelial function.
＜＜血管内皮機能改善剤をスクリーニングするためのキット＞＞
一実施形態において、本発明は、血管内皮細胞と、血管内皮障害リスク因子と、グリコカリックス検出試薬と、を備えるキットを提供する。
<< Kit for screening for vascular endothelial function improving agent >>
In one embodiment, the present invention provides a kit comprising vascular endothelial cells, a vascular endothelial disorder risk factor, and a glycocalyx detection reagent.
本実施形態のキットによれば、簡便且つ１回の採血のみで完了し、有効な血管内皮機能改善剤をスクリーニングすることができる。また、本実施形態のキットによれば、動物実験の代替法として活用でき、よりヒトの生体内に近いインビトロ条件下において、血管内皮機能に対する被検化合物の効果を評価することができる。 According to the kit of this embodiment, it can be completed simply and with one blood sampling, and an effective vascular endothelial function improving agent can be screened. Moreover, according to the kit of the present embodiment, it can be used as an alternative method for animal experiments, and the effect of a test compound on vascular endothelial function can be evaluated under in vitro conditions that are closer to the human body.
＜血管内皮細胞＞
本実施形態のキットが備える血管内皮細胞としては、上述の＜＜血管内皮機能改善剤のスクリーニング方法＞＞の［準備工程］の（血管内皮細胞）に例示されたものと同様のものが挙げられる。本実施形態のキットが備える血管内皮細胞は１種類であってもよく、２種類以上であってもよく、所望の疾患のインビトロ系モデルを構築できるものであればよい。
<Vascular endothelial cells>
Examples of the vascular endothelial cells provided in the kit of the present embodiment include the same vascular endothelial cells as those exemplified in (vascular endothelial cells) in [Preparation step] of <<<< Method for screening vascular endothelial function improving agent >>>> described above. . The number of vascular endothelial cells provided in the kit of this embodiment may be one, two or more, and any one that can construct an in vitro system model of a desired disease.
＜血管内皮障害リスク因子＞
本実施形態のキットが備える血管内皮障害リスク因子としては、上述の＜＜血管内皮機能改善剤のスクリーニング方法＞＞の［誘導工程］の（血管内皮障害リスク因子）に例示されたものと同様のものが挙げられる。本実施形態のキットが備える血管内皮障害リスク因子は１種類であってもよく、２種類以上であってもよく、所望の疾患のインビトロ系モデルを構築できるものであればよい。
<Risk factor for vascular endothelial disorder>
Examples of the risk factor for vascular endothelial injury provided in the kit of the present embodiment are the same as those exemplified in (Rule for risk of vascular endothelial injury) in [Induction step] of <<< Method for screening for improving vascular endothelial function >>> above. Things. The risk factor for vascular endothelial injury provided in the kit of the present embodiment may be one type or two or more types as long as an in vitro system model of a desired disease can be constructed.
＜グリコカリックス検出試薬＞
（グリコカリックスに特異的に結合する抗体）
本実施形態のキットが備えるグリコカリックス検出試薬としては、特別な限定はなく、例えば、グリコカリックスに特異的に結合する抗体等であればよい。
本実施形態のキットが備えるグリコカリックスに特異的に結合する抗体は、１種類であってもよく、２種類以上であってもよく、所望の疾患のインビトロ系モデルでのグリコカリックス濃度を測定できるものであればよい。
本実施形態におけるグリコカリックスに特異的に結合する抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよく、さらに抗体の機能的断片であってもよい。中でも、特異性が高く、定量性が優れていることから、グリコカリックスに特異的に結合する抗体は、モノクローナル抗体であることが好ましい。
また、抗体には、免疫グロブリンのすべてのクラスおよびサブクラスが含まれる。
<Glycocalix detection reagent>
(Antibodies that specifically bind to glycocalyx)
The glycocalix detection reagent provided in the kit of this embodiment is not particularly limited, and may be any antibody that specifically binds to glycocalix, for example.
The antibody that specifically binds to glycocalix provided in the kit of this embodiment may be one type or two or more types, and the glycocalix concentration in an in vitro system model of a desired disease can be measured. Anything is acceptable.
The antibody that specifically binds to glycocalyx in this embodiment may be a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, or a functional fragment of an antibody. Among them, the antibody that specifically binds to glycocalyx is preferably a monoclonal antibody because of its high specificity and excellent quantitativeness.
Antibodies also include all classes and subclasses of immunoglobulins.
本明細書中において、「特異的に結合」とは、抗体が標的タンパク質（抗原）にのみ結合することを意味し、例えば試験管内におけるアッセイ、好ましくは精製した野生型抗原を用いたプラズモン共鳴アッセイ（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ、ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ等）における抗体の抗原のエピトープへの結合等により定量することができる。結合の親和性は、ｋａ（抗体−抗原複合体からの抗体結合に関する速度定数）、ｋＤ（解離定数）、及びＫＤ（ｋＤ／ｋａ）によって規定することができる。抗体が抗原に特異的に結合している場合の結合親和性（ＫＤ）は、１０−８ｍｏｌ／Ｌ以下であることが好ましく、１０−９Ｍ〜１０−１３ｍｏｌ／Ｌであることがより好ましい。 As used herein, “specifically binding” means that an antibody binds only to a target protein (antigen), for example, in vitro assay, preferably plasmon resonance assay using purified wild-type antigen It can be quantified by, for example, binding of an antibody antigen to an epitope in BIAcore, GE-Healthcare Uppsala, Sweden, etc. The affinity of binding can be defined by ka (rate constant for antibody binding from antibody-antigen complex), kD (dissociation constant), and KD (kD / ka). The binding affinity (KD) when the antibody specifically binds to the antigen is preferably 10 −8 mol / L or less, and more preferably 10 −9 M to 10 −13 mol / L. preferable.
本実施形態において、「ポリクローナル抗体」とは、異なるエピトープに対する異なる抗体を含む抗体調製物を意味する。すなわち、本実施形態の抗体がポリクローナル抗体である場合、Ｏ結合型ＧｌｃＮＡｃ化したセリン４０残基を含み、且つ、異なるアミノ酸配列からなるエピトープに対し、特異的に結合する異なる抗体を含み得る。
また、「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体（抗体断片を含む）を意味する。
また、ポリクローナル抗体とは対照的に、モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を認識するものを意味する。すなわち、本実施形態の抗体がモノクローナル抗体である場合、自然環境の成分から単離された抗体である。
本実施形態において、抗体の「機能的断片」とは、抗体の一部分（部分断片）であって、標的タンパク質を特異的に認識するものを意味する。具体的には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、可変領域断片（Ｆｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）２、ダイアボディー、多特異性抗体、およびこれらの重合体等が挙げられる。
In this embodiment, “polyclonal antibody” means an antibody preparation comprising different antibodies against different epitopes. That is, when the antibody of the present embodiment is a polyclonal antibody, it may contain a different antibody that specifically binds to an epitope comprising 40 residues of O-linked GlcNAc serine and having a different amino acid sequence.
The “monoclonal antibody” means an antibody (including an antibody fragment) obtained from a substantially homogeneous antibody population.
Also, in contrast to polyclonal antibodies, monoclonal antibodies mean those that recognize a single determinant on an antigen. That is, when the antibody of this embodiment is a monoclonal antibody, it is an antibody isolated from components of the natural environment.
In the present embodiment, the “functional fragment” of an antibody means a part (partial fragment) of an antibody that specifically recognizes a target protein. Specifically, Fab, Fab ′, F (ab ′) 2, variable region fragment (Fv), disulfide bond Fv, single chain Fv (scFv), sc (Fv) 2, diabody, multispecific antibody, And polymers thereof.
また、本実施形態のグリコカリックスに特異的に結合する抗体は標識物質が結合していてもよい。
前記抗体の標識物質としては、例えば、安定同位体、放射性同位体、蛍光物質、酵素、磁性体等が挙げられる。中でも、前記抗体の標識物質としては、検出が容易且つ高感度であることから、蛍光物質又は酵素であることが好ましい。上記標識物質を備えることで、培養液中に含まれる遊離のグリコカリックスを簡便且つ高感度に検出及び定量することができる。
Further, the labeling substance may be bound to the antibody that specifically binds to the glycocalyx of the present embodiment.
Examples of the antibody labeling substance include stable isotopes, radioisotopes, fluorescent substances, enzymes, and magnetic substances. Among these, the labeling substance for the antibody is preferably a fluorescent substance or an enzyme because it is easy to detect and highly sensitive. By providing the labeling substance, free glycocalyx contained in the culture solution can be detected and quantified easily and with high sensitivity.
安定同位体としては、例えば１３Ｃ、１５Ｎ、２Ｈ、１７Ｏ、１８Ｏが挙げられ、これらに限定されない。
放射性同位体としては、例えば３Ｈ、１４Ｃ、１３Ｎ、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓが挙げられ、これらに限定されない。
蛍光物質としては、例えばシアニン色素（例えばＣｙ３、Ｃｙ５等）、ローダミン６Ｇ試薬、その他公知の蛍光色素（例えば、ＧＦＰ、ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、ＴＡＭＲＡ等）等が挙げられ、これらに限定されない。
Examples of stable isotopes include, but are not limited to, 13 C, 15 N, 2 H, 17 O, and 18 O.
Examples of radioactive isotopes include, but are not limited to, 3 H, 14 C, 13 N, 32 P, 33 P, and 35 S.
Examples of the fluorescent substance include, but are not limited to, cyanine dyes (for example, Cy3 and Cy5), rhodamine 6G reagent, and other known fluorescent dyes (for example, GFP, FITC (Fluorescein), TAMRA, and the like).
酵素としては、例えばアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）等が挙げられる。標識物質が酵素である場合、酵素基質を使用することが好ましい。酵素基質としては、アルカリホスファターゼの場合、ｐ−ニトロフェニルリン酸（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙ ｐｈｏｓｐｈａｓｅ；ｐＮＰＰ）、４−メチルウンベリフェリルリン酸（４−ＭＵＰ）等を用いることができ、酵素がペルオキシダーゼの場合、３，３’−ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＤＡＢ）、３，３’，５，５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＴＭＢ）、ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ（ＯＰＤ）、２，２−アジノ−ジ−（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、１０−アセチル−３，７−ジヒドロキシフェノキサジン（ＡＤＨＰ）等を用いることができる。 Examples of the enzyme include alkaline phosphatase and peroxidase (HRP). When the labeling substance is an enzyme, it is preferable to use an enzyme substrate. In the case of alkaline phosphatase, p-nitrophenyl phosphate (pNPP), 4-methylumbelliferyl phosphate (4-MUP), etc. can be used as the enzyme substrate, and the enzyme is peroxidase. 3,3′-diaminobenzidine (DAB), 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine (TMB), o-phenylenediamine (OPD), 2,2-azino-di- (3-ethylbenzothiazoline-6 Sulfonic acid (ABTS), 10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine (ADHP) and the like can be used.
磁性体としては、例えばガドリニウム、Ｇｄ−ＤＴＰＡ、Ｇｄ−ＤＴＰＡ−ＢＭＡ、Ｇｄ−ＨＰ−ＤＯ３Ａ、ヨード、鉄、酸化鉄、クロム、マンガン、又はその錯体、或いはキレート錯体等が挙げられ、これらに限定されない。 Examples of the magnetic material include gadolinium, Gd-DTPA, Gd-DTPA-BMA, Gd-HP-DO3A, iodo, iron, iron oxide, chromium, manganese, or a complex thereof, or a chelate complex. Not.
（抗体の製造方法）
本実施形態のグリコカリックスに特異的に結合する抗体がポリクローナル抗体である場合、抗原（例えば、シンデカン−１、ヒアルロン酸等のグリコカリックス、該グリコカリックスの断片、又はこれらを発現する細胞等）で免疫動物を免疫し、その抗血清から、従来の手段（例えば、塩析、遠心分離、透析、カラムクロマトグラフィー等）によって、精製して取得することができる。
また、本実施形態のグリコカリックスに特異的に結合する抗体がモノクローナル抗体である場合は、ハイブリドーマ法や組換えＤＮＡ法によって作製することができる。
(Method for producing antibody)
When the antibody that specifically binds to the glycocalyx of this embodiment is a polyclonal antibody, an antigen (for example, a glycocalyx such as syndecan-1, hyaluronic acid, a fragment of the glycocalyx, or a cell that expresses these) The immunized animal can be immunized and purified from the antiserum by conventional means (eg, salting out, centrifugation, dialysis, column chromatography, etc.).
In addition, when the antibody that specifically binds to the glycocalyx of this embodiment is a monoclonal antibody, it can be produced by a hybridoma method or a recombinant DNA method.
ハイブリドーマ法としては、例えば、コーラーおよびミルスタインの方法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６：４９５（１９７５）参照）等が挙げられる。この方法における細胞融合工程に使用される抗体産生細胞としては、例えば抗原（例えば、シンデカン−１、ヒアルロン酸等のグリコカリックス、該グリコカリックスの断片、又はこれらを発現する細胞等）で免疫された動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、サル、ヤギ等）の脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血白血球等が挙げられる。また、免疫されていない動物から予め単離された上記の細胞またはリンパ球などに対して、抗原を培地中で作用させることによって得られた抗体産生細胞も使用することができる。ミエローマ細胞としては、公知の種々の細胞株を使用することができる。抗体産生細胞及びミエローマ細胞は、それらが融合可能であれば、異なる動物種起源のものでもよいが、同一の動物種起源のものであることが好ましい。ハイブリドーマを得る方法としては、例えば、抗原で免疫されたマウスから得られた脾臓細胞と、マウスミエローマ細胞との間の細胞融合により産生され、その後のスクリーニングにより、標的蛋白質に特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る方法等が挙げられる。ハイブリドーマにより産生されたモノクローナル抗体を得る方法としては、例えば標的蛋白質に対するモノクローナル抗体は、ハイブリドーマを培養することにより、また、ハイブリドーマを投与した哺乳動物の腹水から、取得する方法等が挙げられる。 Examples of the hybridoma method include the method of Kohler and Milstein (see, for example, Kohler & Milstein, Nature, 256: 495 (1975)). The antibody-producing cells used in the cell fusion step in this method were immunized with, for example, an antigen (for example, a glycocalix such as syndecan-1, hyaluronic acid, a fragment of the glycocalix, or a cell expressing these). Spleen cells, lymph node cells, peripheral blood leukocytes and the like of animals (for example, mice, rats, hamsters, rabbits, monkeys, goats, etc.) can be mentioned. In addition, antibody-producing cells obtained by allowing an antigen to act in a medium on the cells or lymphocytes previously isolated from an unimmunized animal can also be used. Various known cell lines can be used as the myeloma cells. The antibody-producing cells and myeloma cells may be derived from different animal species as long as they can be fused, but are preferably derived from the same animal species. As a method for obtaining a hybridoma, for example, a spleen cell obtained from a mouse immunized with an antigen and a mouse myeloma cell are produced, and a monoclonal antibody specific to the target protein is obtained by subsequent screening. The method of obtaining the hybridoma to produce is mentioned. Examples of a method for obtaining a monoclonal antibody produced by a hybridoma include a method in which a monoclonal antibody against a target protein is obtained by culturing the hybridoma or from ascites of a mammal to which the hybridoma has been administered.
組換えＤＮＡ法としては、例えば上記本実施形態の抗体又は抗体の機能的断片をコードするＤＮＡをハイブリドーマやＢ細胞等からクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主細胞（例えば哺乳類細胞株、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞等）に導入し、本実施形態の抗体を組換え抗体として産生させる手法等が挙げられる（例えば、Ｐ．Ｊ．Ｄｅｌｖｅｓ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９７ ＷＩＬＥＹ、Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ｃ．Ｄｅａｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，２０００ ＯＸＦＯＲＤ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＰＲＥＳＳ、Ｖａｎｄａｍｍｅ Ａ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９２：７６７−７７５（１９９０）参照）。
本実施形態の抗体をコードするＤＮＡの発現においては、重鎖又は軽鎖をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換してもよく、重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換してもよい（例えば、国際特許出願第９４／１１５２３号参照）。本実施形態の抗体は、上記宿主細胞を培養し、宿主細胞内又は培養液から分離及び精製し、実質的に純粋で均一な形態で取得することができる。抗体の分離及び精製は、通常のポリペプチドの精製で使用されている方法を使用することができる。トランスジェニック動物作製技術を用いた方法では、例えば、抗体遺伝子が組み込まれたトランスジェニック動物（例えば、ウシ、ヤギ、ヒツジまたはブタ等）を作製し、そのトランスジェニック動物のミルクから、抗体遺伝子に由来するモノクローナル抗体を大量に取得する方法等が挙げられる。
As a recombinant DNA method, for example, a DNA encoding the antibody or the functional fragment of the antibody of the present embodiment is cloned from a hybridoma, a B cell or the like, and incorporated into an appropriate vector, which is then used as a host cell (eg, a mammalian cell line) , Escherichia coli, yeast cells, insect cells, plant cells, etc.) and producing the antibody of this embodiment as a recombinant antibody (for example, PJ Delves, Antibody Production: Essential Techniques, 1997). WILEY, P. Shepherd and C. Dean Monoclonal Antibodies, 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS, Vandame AM et al., Eur. J. Biochem. 192: 767-775. 1990)).
In the expression of the DNA encoding the antibody of the present embodiment, DNA encoding heavy chain or light chain may be separately incorporated into an expression vector to transform a host cell. DNA encoding heavy chain and light chain May be incorporated into a single expression vector to transform host cells (see, eg, International Patent Application No. 94/11523). The antibody of the present embodiment can be obtained in a substantially pure and uniform form by culturing the above host cell, separating and purifying it from the host cell or culture medium. Separation and purification of the antibody can be performed by a method used in usual polypeptide purification. In the method using the transgenic animal production technique, for example, a transgenic animal (for example, cow, goat, sheep or pig etc.) in which the antibody gene is incorporated is produced, and the antibody gene is derived from the milk of the transgenic animal. And a method for obtaining a large amount of monoclonal antibodies to be used.
本実施形態の抗体は、グリコカリックスに特異的に結合できるものであれば、アミノ酸配列変異体であってもかわない。
アミノ酸配列変異体は、抗体鎖をコードするＤＮＡへの変異導入によって、またはペプチド合成によって作製することができる。抗体のアミノ酸配列が改変される部位は、改変される前の抗体と同等の活性を有する限り、抗体の重鎖または軽鎖の定常領域であってもよく、また、可変領域（フレームワーク領域及びＣＤＲ）であってもよい。また、ＣＤＲのアミノ酸を改変して、抗原へのアフィニティーが高められた抗体をスクリーニングする手法等を用いてもよい（例えば、ＰＮＡＳ，１０２：８４６６−８４７１（２００５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２１：４８５−４９３（２００８）、国際公開第２００２／０５１８７０号、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０：２４８８０−２４８８７（２００５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２１：３４５−３５１（２００８）参照）。
The antibody of this embodiment may be an amino acid sequence variant as long as it can specifically bind to glycocalix.
Amino acid sequence variants can be made by introducing mutations into the DNA encoding the antibody chain or by peptide synthesis. The site where the amino acid sequence of the antibody is modified may be the constant region of the heavy chain or light chain of the antibody as long as it has an activity equivalent to that of the antibody before modification, and the variable region (framework region and CDR). In addition, a method of screening an antibody having an increased affinity for an antigen by modifying the amino acid of CDR may be used (for example, PNAS, 102: 8466-8471 (2005), Protein Engineering, Design & Selection, 21: 485-493 (2008), International Publication No. 2002/051870, J. Biol. Chem., 280: 24880-24888 (2005), Protein Engineering, Design & Selection, 21: 345-351 (2008)).
改変されるアミノ酸数は、好ましくは、１０アミノ酸以内、より好ましくは５アミノ酸以内、最も好ましくは３アミノ酸以内（例えば、２アミノ酸以内、１アミノ酸）である。アミノ酸の改変は、好ましくは、保存的な置換である。
本明細書中において「保存的な置換」とは、化学的に同様な側鎖を有する他のアミノ酸残基で置換することを意味する。化学的に同様なアミノ酸側鎖を有するアミノ酸残基のグループは、本発明の属する技術分野でよく知られている。例えば、酸性アミノ酸（アスパラギン酸およびグルタミン酸）、塩基性アミノ酸（リシン・アルギニン・ヒスチジン）、中性アミノ酸においては、炭化水素鎖を持つアミノ酸（グリシン・アラニン・バリン・ロイシン・イソロイシン・プロリン）、ヒドロキシ基を持つアミノ酸（セリン・スレオニン）、硫黄を含むアミノ酸（システイン・メチオニン）、アミド基を持つアミノ酸（アスパラギン・グルタミン）、イミノ基を持つアミノ酸（プロリン）、芳香族基を持つアミノ酸（フェニルアラニン・チロシン・トリプトファン）等で分類することができる。アミノ酸配列変異体は、抗原への結合活性が対照抗体（例えば、後述の実施例に記載のＯ−ＧｌｃＮＡｃ（ＲＬ２）抗体等）よりも高いことが好ましい。
本実施形態の抗体（上述の抗体の機能的断片、アミノ酸配列変異体等も含む）の抗原への結合活性は、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロッティング法、免疫沈降法、免疫染色法等により評価することができる。
The number of amino acids to be modified is preferably within 10 amino acids, more preferably within 5 amino acids, and most preferably within 3 amino acids (eg, within 2 amino acids, 1 amino acid). The amino acid modification is preferably a conservative substitution.
As used herein, “conservative substitution” means substitution with another amino acid residue having a chemically similar side chain. Groups of amino acid residues having chemically similar amino acid side chains are well known in the technical field to which the present invention belongs. For example, acidic amino acids (aspartic acid and glutamic acid), basic amino acids (lysine, arginine, histidine), neutral amino acids, amino acids with hydrocarbon chains (glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline), hydroxy groups Amino acids with amino acids (serine / threonine), amino acids with sulfur (cysteine / methionine), amino acids with amide groups (asparagine / glutamine), amino acids with imino groups (proline), amino acids with aromatic groups (phenylalanine / tyrosine / And tryptophan). The amino acid sequence variant preferably has a higher antigen-binding activity than a control antibody (for example, the O-GlcNAc (RL2) antibody described in Examples described later).
The binding activity to the antigen of the antibody of the present embodiment (including the functional fragment of the above-mentioned antibody, amino acid sequence variant, etc.) is evaluated by, for example, ELISA, Western blotting, immunoprecipitation, immunostaining, etc. be able to.
（２次抗体）
本実施形態のグリコカリックス検出試薬は、前記グリコカリックスに特異的に結合する抗体に加えて、さらに、前記グリコカリックスに特異的に結合する抗体に標識物質が結合したもの、又は前記グリコカリックスに特異的に結合する抗体に対する抗体に標識物質が結合したものを２次抗体として備えていてもよい。
前記グリコカリックスに特異的に結合する抗体に標識物質が結合したものを２次抗体として備える場合、サンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）法や抗原測定系による化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ法）等を用いて、特定のグリコカリックスを検出及び定量することができる。
また、前記グリコカリックスに特異的に結合する抗体に対する抗体に標識物質が結合したものを２次抗体として備える場合、抗体測定系によるＥＬＩＳＡ法、間接蛍光抗体法、抗体測定系によるＣＬＥＩＡ法等を用いて、特定のグリコカリックスを検出及び定量することができる。
(Secondary antibody)
In addition to the antibody that specifically binds to the glycocalyx, the glycocalyx detection reagent of the present embodiment further has a labeling substance bound to an antibody that specifically binds to the glycocalyx, or is specific to the glycocalyx. Alternatively, a secondary antibody may be prepared by binding a labeling substance to an antibody against an antibody that binds specifically.
When a secondary antibody is prepared by binding a labeling substance to an antibody that specifically binds to the glycocalyx, a sandwich ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) method or a chemiluminescent enzyme immunoassay method (CLEIA method) using an antigen measurement system Can be used to detect and quantify specific glycocalyx.
When a secondary antibody is prepared by binding a labeling substance to an antibody against an antibody that specifically binds to the glycocalyx, an ELISA method using an antibody measurement system, an indirect fluorescent antibody method, a CLEIA method using an antibody measurement system, or the like is used. Specific glycocalyx can be detected and quantified.
前グリコカリックスに特異的に結合する抗体に対する抗体に標識物質が結合したものとしては、前記グリコカリックスに特異的に結合する抗体の由来動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、サル、ヤギ等）に対する抗体であることが好ましい。例えば、前記グリコカリックスに特異的に結合する抗体の由来がマウスである場合、抗マウス抗体であることが好ましい。また、前記グリコカリックスに特異的に結合する抗体に対する抗体に標識物質が結合したものには、免疫グロブリンのすべてのクラス及びサブクラスが含まれる。
標識物質としては、上述の（グリコカリックスに特異的に結合する抗体）において、例示されたものと同様のものが挙げられる。
Examples of the antibody that specifically binds to the pre-glycocalyx with a labeling substance bound thereto include the animal derived from the antibody that specifically binds to the glycocalyx (eg, mouse, rat, hamster, rabbit, monkey, goat, etc.) ) Is preferred. For example, when the origin of the antibody that specifically binds to the glycocalyx is a mouse, it is preferably an anti-mouse antibody. Moreover, all the classes and subclasses of immunoglobulins are included in those in which a labeling substance is bound to an antibody against an antibody that specifically binds to the glycocalix.
Examples of the labeling substance are the same as those exemplified in the above-mentioned (an antibody that specifically binds to glycocalyx).
（支持体）
本実施形態のグリコカリックス検出試薬において、前記グリコカリックスに特異的に結合する抗体は支持体上に固定化された状態であってもよい。
(Support)
In the glycocalyx detection reagent of this embodiment, the antibody that specifically binds to the glycocalyx may be immobilized on a support.
支持体の形態としては、当該分野において公知のものから適宜選択でき、例えば、マイクロタイタープレート、チューブ、キャピラリチューブ、ビーズ、粒子、濾紙、フィルター、膜、ディスク、スティック、ストリップ、スライドグラス、チップ等が挙げられる。 The form of the support can be appropriately selected from those known in the art, for example, microtiter plate, tube, capillary tube, bead, particle, filter paper, filter, membrane, disk, stick, strip, slide glass, chip, etc. Is mentioned.
支持体の材料としては、当該分野において公知のものをいずれも使用でき、例えば、ガラス、樹脂（例えば、ポリスチレン、ポリエステル、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリプロピレン、ポリビニルブチレート、ポリ塩化ビニル、ポリテトラフルオロエチレン、ポリフッ化ビニリデン、ナイロン、レーヨン等）、セルロース及びその誘導体（例えば、ニトロセルロース等）等が挙げられる。
支持体への前記グリコカリックスに特異的に結合する抗体の固定方法は、例えば、物理的吸着、共有結合又は非共有結合（例えば、イオン結合、静電結合、疎水性相互作用等）等が挙げられる。
As the material for the support, any materials known in the art can be used. For example, glass, resin (for example, polystyrene, polyester, polyacrylamide, polyacrylate, polymethacrylate, polypropylene, polyvinyl butyrate, polyvinyl chloride, Polytetrafluoroethylene, polyvinylidene fluoride, nylon, rayon, etc.), cellulose and its derivatives (for example, nitrocellulose, etc.).
Examples of the method for immobilizing an antibody that specifically binds to the glycocalyx on a support include physical adsorption, covalent bond, or non-covalent bond (eg, ionic bond, electrostatic bond, hydrophobic interaction, etc.). It is done.
支持体は非特異的吸着を防止するためにブロッキング処理されていることが好ましい。ブロッキング剤は、当該分野において公知のものをいずれも使用でき、例えば、検出対象の哺乳動物以外の哺乳動物の血清アルブミン（例えば、対象がヒトである場合、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））、脱脂粉乳、カゼイン等が挙げられる。
前記グリコカリックスに特異的に結合する抗体が固定され、ブロッキング処理された支持体の表面は、水溶性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、或いはヒドロキシプロピルメチルセルロース及びヒドロキシエチルセルロースのようなセルロースエステル等）、又は非還元多糖類（例えば、スクロース、トレハロース、ラフィノース等）等でコーディングされていてもよい。このようなコーディングにより、支持体上の前記グリコカリックスに特異的に結合する抗体を含む固相は非常に安定化し、長期間の保存に適する。
The support is preferably subjected to a blocking treatment to prevent nonspecific adsorption. Any blocking agent known in the art can be used. For example, serum albumin of a mammal other than the mammal to be detected (for example, bovine serum albumin (BSA) when the subject is a human), delipidation, etc. Examples include powdered milk and casein.
The surface of the support on which the antibody that specifically binds to the glycocalyx is immobilized and subjected to blocking treatment is a water-soluble polymer (for example, polyvinyl pyrrolidone, polyvinyl alcohol, or cellulose esters such as hydroxypropylmethylcellulose and hydroxyethylcellulose). Or non-reducing polysaccharides (eg, sucrose, trehalose, raffinose, etc.). By such coding, the solid phase containing the antibody that specifically binds to the glycocalyx on the support is very stabilized and suitable for long-term storage.
（その他）
本実施形態のグリコカリックス検出試薬は、必要に応じて、さらに反応停止液を備えていてもよい。反応停止液としては、例えば、硫酸、水酸化ナトリウム等が挙げられる。
(Other)
The glycocalyx detection reagent of this embodiment may further include a reaction stop solution as necessary. Examples of the reaction stop solution include sulfuric acid and sodium hydroxide.
本実施形態のグリコカリックス検出試薬は、さらに、緩衝液を備えていてもよい。緩衝液としては、上述の＜＜血管内皮機能改善剤のスクリーニング方法＞＞の［評価工程］に例示されたものと同様のものが挙げられる。 The glycocalix detection reagent of this embodiment may further include a buffer solution. Examples of the buffer include the same ones as those exemplified in [Evaluation step] in the above << Screening method for vascular endothelial function improving agent >>.
本実施形態のグリコカリックス検出試薬において、前記グリコカリックスに特異的に結合する抗体、及び２次抗体は、乾燥状態であってもよく、上述の緩衝液に溶解した上であってもよい。中でも、これらの抗体は、保存安定性から、乾燥状態であることが好ましい。 In the glycocalyx detection reagent of the present embodiment, the antibody that specifically binds to the glycocalyx and the secondary antibody may be in a dry state or may be dissolved in the above-described buffer. Among these, these antibodies are preferably in a dry state in view of storage stability.
本実施形態のグリコカリックス検出試薬は、さらに、標準曲線（検量線）作成用の標準溶液、標準溶液希釈剤（例えば、上述の緩衝液等）を備えていてもよい。
本実施形態のグリコカリックス検出試薬は、さらに、洗浄液（例えば、上述の緩衝液等）や、インキュベーションの間に支持体をシールするシーリング材（例えば、支持体がプレートである場合、プレートシール等）を備えていてもよい。
The glycocalix detection reagent of this embodiment may further include a standard solution for preparing a standard curve (calibration curve) and a standard solution diluent (for example, the above-described buffer solution).
The glycocalix detection reagent of the present embodiment further includes a washing solution (for example, the above-described buffer solution) and a sealing material that seals the support during incubation (for example, a plate seal when the support is a plate). May be provided.
＜その他構成＞
（細胞培養用培地）
本実施形態のキットは、さらに細胞培養用培地を備えていてもよい。本実施形態のキットが備える細胞培養用培地としては、上述の＜＜血管内皮機能改善剤のスクリーニング方法＞＞の［準備工程］の（細胞培養用培地）に例示されたものと同様のものが挙げられる。本実施形態のキットが備える細胞培養用培地は１種類であってもよく、２種類以上であってもよく、所望の疾患のインビトロ系モデルを構築できるものであればよい。
<Other configuration>
(Cell culture medium)
The kit of this embodiment may further include a cell culture medium. Examples of the cell culture medium provided in the kit of the present embodiment are the same as those exemplified in (Cell culture medium) in [Preparation step] of the above << Screening method for vascular endothelial function improving agent >>. Can be mentioned. The cell culture medium provided in the kit of this embodiment may be one type or two or more types as long as an in vitro system model of a desired disease can be constructed.
（検出装置）
本実施形態のキットは、さらに、検出装置を備えていてもよい。検出装置としては、当該分野において公知のものから適宜選択でき、例えば、マイクロプレートリーダー、蛍光スキャナー、２光子励起スキャナー等が挙げられる。
(Detection device)
The kit of this embodiment may further include a detection device. As a detection apparatus, it can select suitably from what is known in the said field | area, for example, a microplate reader, a fluorescence scanner, a two-photon excitation scanner, etc. are mentioned.
＜＜血管内皮細胞に対する被検化合物の血管内皮機能障害性を評価するための方法＞＞
一実施形態において、本発明は、血管内皮細胞に対する被検化合物の血管内皮機能障害性を評価するための方法であって、血管内皮細胞をコンフルエントの状態となるように培養し、準備する準備工程と、前記準備工程後の前記血管内皮細胞を、被検化合物の添加、又は無添加条件にて培養する培養工程と、前記培養工程後の前記被検化合物の添加、又は無添加条件での培養液中に含まれるグリコカリックス濃度を測定し、血管内皮細胞に対する前記被検化合物の血管内皮機能障害性を評価する評価工程と、を備える方法を提供する。
<< Method for Evaluating Vascular Endothelial Dysfunction of Test Compound on Vascular Endothelial Cells >>
In one embodiment, the present invention relates to a method for evaluating the vascular endothelial dysfunction of a test compound against vascular endothelial cells, comprising culturing and preparing vascular endothelial cells in a confluent state. And a culture step of culturing the vascular endothelial cells after the preparation step with or without the addition of a test compound, and addition or addition of the test compound after the culturing step. An evaluation step of measuring the concentration of glycocalyx contained in the liquid and evaluating the vascular endothelial dysfunction of the test compound against vascular endothelial cells.
本実施形態の評価方法によれば、１回の採血のみで完了し、簡便に被検化合物の血管内皮機能障害性を評価することができる。また、本実施形態の評価方法によれば、動物実験の代替法として活用でき、よりヒトの生体内に近いインビトロ条件下において、被検化合物の細胞毒性（特に、血管内皮機能障害性）を評価することができる。 According to the evaluation method of this embodiment, it is completed by only one blood collection, and the vascular endothelial dysfunction of the test compound can be easily evaluated. Further, according to the evaluation method of the present embodiment, it can be used as an alternative method for animal experiments, and the cytotoxicity (especially, vascular endothelial dysfunction) of a test compound is evaluated under in vitro conditions closer to the human body. can do.
本明細書において、「血管内皮機能障害性」とは、内皮グリコカリックス層の生成抑制効果、又は内皮グリコカリックス層の遊離促進効果を意味する。
よって、本実施形態の評価方法によれば、血管内皮機能障害性、すなわち、内皮グリコカリックス層の生成抑制効果、又は内皮グリコカリックス層の遊離促進効果を有する被検化合物を判別することができる。
本実施形態の評価方法の各工程について、以下に詳細を説明する。
In the present specification, “vascular endothelial dysfunction” means an effect of inhibiting the formation of an endothelial glycocalyx layer or an effect of promoting the release of an endothelial glycocalyx layer.
Therefore, according to the evaluation method of the present embodiment, it is possible to discriminate a test compound having vascular endothelial dysfunction, that is, an effect of inhibiting the formation of the endothelial glycocalyx layer or the effect of promoting the release of the endothelial glycocalyx layer.
Details of each step of the evaluation method of the present embodiment will be described below.
［準備工程］
上述の＜＜血管内皮機能改善剤のスクリーニング方法＞＞の［準備工程］と同様の方法を用いて、血管内皮細胞をコンフルエントの状態となるように培養する。
[Preparation process]
Using the same method as in [Preparation step] of <<<< Screening method for vascular endothelial function improving agent >> described above, vascular endothelial cells are cultured so as to be in a confluent state.
［培養工程］
次いで、準備工程後の血管内皮細胞を、被検化合物の添加、又は無添加条件にて培養する。
被検化合物としては、血管内皮細胞に対する細胞毒性（特に、血管内皮機能障害性）を評価したいものであればよく、特別な限定はない。また、被検化合物は、予め細胞培養用培地に混合し、培地交換の際に被検化合物含有細胞培養用培地を添加すればよい。また、被検化合物の有効量を推定するために、細胞培養用培地中の被検化合物の濃度をふったものを用意して、用いてもよい。
被検化合物を添加したサンプル、及び被検化合物を添加していないサンプルを準備し、続く評価工程において比較することで、血管内皮機能障害性を評価することができる。
[Culture process]
Next, the vascular endothelial cells after the preparation step are cultured under the condition where the test compound is added or not.
The test compound is not particularly limited as long as it is desired to evaluate cytotoxicity against vascular endothelial cells (particularly, vascular endothelial dysfunction). Further, the test compound may be mixed in advance with a cell culture medium, and the test compound-containing cell culture medium may be added when the medium is replaced. Further, in order to estimate the effective amount of the test compound, a test compound containing the concentration of the test compound in the cell culture medium may be prepared and used.
By preparing a sample to which a test compound is added and a sample to which no test compound is added, and comparing in a subsequent evaluation step, vascular endothelial dysfunction can be evaluated.
使用する細胞培養用培地としては、上述の＜＜血管内皮機能改善剤のスクリーニング方法＞＞の［準備工程］において例示されたものと同様のものが挙げられる。また、使用する細胞培養培地は、成長因子を実質的に含まないものであることが好ましい。 Examples of the cell culture medium to be used include the same ones as exemplified in [Preparation step] of the above << Screening method for vascular endothelial function improving agent >>. Moreover, it is preferable that the cell culture medium to be used is a thing which does not contain a growth factor substantially.
また、培養条件としては、通常の血管内皮細胞を培養する条件であればよい。培養温度は、例えば２５℃以上４０℃以下であればよく、例えば３０℃以上３９℃以下であればよく、例えば３５℃以上３９℃以下であればよい。
また、必要に応じて培養環境を著しく変化させなければ還流等の流体力学的な付加を加えてもよい。
また、培養環境は、例えば、約５％のＣＯ２条件下であってもよい。
また、培養方法は、例えば、水平振盪培養、静置培養等が挙げられ、中でも、水平振盪培養であることが好ましい。振盪速度については、例えば、ヒトの生理的な毛細血管から細動脈までの流れずり応力とされる２．５ｄｙｎｅｓ／ｃｍ２以上５ｄｙｎｅｓ／ｃｍ２以下となるように調整すればよい。
また、培養時間としては、被検化合物が血管内皮細胞に作用し、血管内皮機能障害性、（内皮グリコカリックス層の生成抑制効果、又は内皮グリコカリックス層の遊離促進効果）を奏するのに有効な時間であればよく、例えば５分以上１時間以下であればよく、例えば、１５分以上３０分以下であればよい。
Moreover, the culture conditions may be any conditions as long as normal vascular endothelial cells are cultured. The culture temperature may be, for example, 25 ° C. or more and 40 ° C. or less, for example, 30 ° C. or more and 39 ° C. or less, for example, 35 ° C. or more and 39 ° C. or less.
If necessary, a hydrodynamic addition such as reflux may be added as long as the culture environment is not significantly changed.
The culture environment may be, for example, about 5% CO 2 condition.
In addition, examples of the culture method include horizontal shaking culture and stationary culture, and among them, horizontal shaking culture is preferable. The shaking speed may be adjusted to be, for example, 2.5 dynes / cm 2 or more and 5 dynes / cm 2 or less, which is a flow shear stress from a human physiological capillary to arteriole.
In addition, as the culture time, the test compound acts on vascular endothelial cells and is effective for exerting vascular endothelial dysfunction (the effect of inhibiting the formation of endothelial glycocalyx layer or the effect of promoting the release of endothelial glycocalyx layer). It may be a time, for example, 5 minutes or more and 1 hour or less, for example, 15 minutes or more and 30 minutes or less.
［評価工程］
次いで、培養工程後の被検化合物の添加、又は無添加条件での培養液中に含まれるグリコカリックス濃度を測定し、血管内皮細胞に対する被検化合物の血管内皮機能障害性を評価する。
[Evaluation process]
Subsequently, the glycocalyx concentration contained in the culture solution under the condition where the test compound is added or not added after the culturing step is measured, and the vascular endothelial dysfunction of the test compound against vascular endothelial cells is evaluated.
グリコカリックス濃度の測定方法としては、上述の＜＜血管内皮機能改善剤のスクリーニング方法＞＞の［評価工程］において例示されたものと同様のものが挙げられる。 Examples of the method for measuring the glycocalyx concentration include the same methods as those exemplified in [Evaluation step] in the above << Screening method for vascular endothelial function improving agent >>.
本実施形態の評価工程において、得られたグリコカリックス濃度から、被検化合物の添加条件での培養液中に含まれるグリコカリックス濃度が、被検化合物の無添加条件での培養液中に含まれるグリコカリックス濃度と比較して同程度、又は低かった場合に、前記被検化合物は血管内皮機能障害性を有さず、各種疾患の候補薬剤として有用であると評価することができる。
一方、被検化合物の添加条件での培養液中に含まれるグリコカリックス濃度が、被検化合物の無添加条件での培養液中に含まれるグリコカリックス濃度と比較して高かった場合に、前記被検化合物は血管内皮機能障害性、すなわち細胞毒性を有すると評価することができる。
In the evaluation step of the present embodiment, from the obtained glycocalyx concentration, the glycocalyx concentration contained in the culture solution under the test compound addition condition is contained in the culture solution under the test compound non-addition condition. When the concentration is the same or lower than the glycocalyx concentration, the test compound does not have vascular endothelial dysfunction and can be evaluated as useful as a candidate drug for various diseases.
On the other hand, when the glycocalyx concentration contained in the culture solution under the test compound addition condition is higher than the glycocalyx concentration contained in the culture solution under the test compound non-addition condition, The test compound can be evaluated as having vascular endothelial dysfunction, ie, cytotoxicity.
＜＜血管内皮細胞に対する被検化合物の血管内皮機能障害性を評価するためのキット＞＞
一実施形態において、本発明は、血管内皮細胞に対する被検化合物の血管内皮機能障害性を評価するためのキットであって、血管内皮細胞と、グリコカリックス検出試薬と、を備えるキットを提供する。
<< Kit for evaluating vascular endothelial dysfunction of a test compound against vascular endothelial cells >>
In one embodiment, the present invention provides a kit for evaluating vascular endothelial dysfunction of a test compound against vascular endothelial cells, the kit comprising vascular endothelial cells and a glycocalix detection reagent.
本実施形態のキットによれば、１回の採血のみで完了し、簡便に被検化合物の血管内皮機能障害性を評価することができる。また、本実施形態のキットによれば、動物実験の代替法として活用でき、よりヒトの生体内に近いインビトロ条件下において、被検化合物の細胞毒性（特に、血管内皮機能障害性）を評価することができる。 According to the kit of this embodiment, it is completed by only one blood collection, and the vascular endothelial dysfunction of the test compound can be easily evaluated. In addition, according to the kit of this embodiment, it can be used as an alternative method for animal experiments, and the cytotoxicity (especially, vascular endothelial dysfunction) of a test compound is evaluated under in vitro conditions that are closer to the human body. be able to.
＜血管内皮細胞＞
本実施形態のキットが備える血管内皮細胞としては、上述の＜＜血管内皮機能改善剤のスクリーニング方法＞＞の［準備工程］の（血管内皮細胞）に例示されたものと同様のものが挙げられる。本実施形態のキットが備える血管内皮細胞は１種類であってもよく、２種類以上であってもよく、所望の血管内皮細胞による内皮グリコカリックス層を構築できるものであればよい。
<Vascular endothelial cells>
Examples of the vascular endothelial cells provided in the kit of the present embodiment include the same vascular endothelial cells as those exemplified in (vascular endothelial cells) in [Preparation step] of <<<< Method for screening vascular endothelial function improving agent >>>> described above. . The vascular endothelial cells provided in the kit of this embodiment may be one type or two or more types as long as an endothelial glycocalyx layer can be constructed from desired vascular endothelial cells.
＜グリコカリックス検出試薬＞
本実施形態のキットが備えるグリコカリックス検出試薬としては、上述の＜＜血管内皮機能改善剤をスクリーニングするためのキット＞＞の＜グリコカリックス検出試薬＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。
<Glycocalix detection reagent>
Examples of the glycocalix detection reagent provided in the kit of the present embodiment include the same reagents as those exemplified in <Glycocalix detection reagent> in the above << Kit for screening vascular endothelial function improving agent >>. .
＜その他構成＞
（細胞培養用培地）
本実施形態のキットは、さらに細胞培養用培地を備えていてもよい。本実施形態のキットが備える細胞培養用培地としては、上述の＜＜血管内皮機能改善剤のスクリーニング方法＞＞の［準備工程］の（細胞培養用培地）に例示されたものと同様のものが挙げられる。本実施形態のキットが備える細胞培養用培地は１種類であってもよく、２種類以上であってもよく、所望の血管内皮細胞による内皮グリコカリックス層を構築できるものであればよい。
<Other configuration>
(Cell culture medium)
The kit of this embodiment may further include a cell culture medium. Examples of the cell culture medium provided in the kit of the present embodiment are the same as those exemplified in (Cell culture medium) in [Preparation step] of the above << Screening method for vascular endothelial function improving agent >>. Can be mentioned. The culture medium for cell culture provided in the kit of this embodiment may be one type or two or more types as long as it can construct an endothelial glycocalyx layer of desired vascular endothelial cells.
（検出装置）
本実施形態のキットは、さらに、検出装置を備えていてもよい。検出装置としては、当該分野において公知のものから適宜選択でき、例えば、マイクロプレートリーダー、蛍光スキャナー、２光子励起スキャナー等が挙げられる。
(Detection device)
The kit of this embodiment may further include a detection device. As a detection apparatus, it can select suitably from what is known in the said field | area, for example, a microplate reader, a fluorescence scanner, a two-photon excitation scanner, etc. are mentioned.
＜＜循環器疾患を有する被検体における疾病管理による血管内皮機能の改善効果を評価するための方法＞＞
一実施形態において、本発明は、循環器疾患を有する被検体における疾病管理による血管内皮機能の改善効果を評価するための方法であって、血管内皮細胞をコンフルエントの状態となるように培養し、準備する準備工程と、前記準備工程後の前記血管内皮細胞を、循環器疾患を有する被検体の疾病管理前、又は疾病管理後の血清を添加し、培養する培養工程と、前記培養工程後の前記血管内皮細胞に血管内皮障害リスク因子を添加し、グリコカリックスの遊離を誘導する誘導工程と、前記誘導工程後の前記循環器疾患を有する被検体の疾病管理前、又は疾病管理後の血清を添加した条件での培養液中に含まれるグリコカリックス濃度を測定し、前記疾病管理による血管内皮機能の改善効果を評価する評価工程と、を備える方法を提供する。
<< Method for evaluating the improvement effect of vascular endothelial function by disease management in a subject with cardiovascular disease >>
In one embodiment, the present invention is a method for evaluating an effect of improving vascular endothelial function by disease management in a subject having a cardiovascular disease, wherein vascular endothelial cells are cultured to be in a confluent state, A preparatory step to prepare, a culturing step of adding and culturing the vascular endothelial cells after the preparatory step, before or after disease management of a subject having cardiovascular disease, and after the culture step, A vascular endothelial injury risk factor is added to the vascular endothelial cells to induce release of glycocalyx, and a serum before or after disease management of a subject having the circulatory disease after the induction step. And an evaluation step of measuring the glycocalyx concentration contained in the culture medium under the added conditions and evaluating the improvement effect of the vascular endothelial function by the disease management.
本実施形態の評価方法によれば、１回の採血のみで完了し、簡便に循環器疾患を有する被検体における疾病管理による血管内皮機能の改善効果を評価することができる。 According to the evaluation method of this embodiment, it is completed by only one blood collection, and the effect of improving vascular endothelial function by disease management in a subject having a cardiovascular disease can be easily evaluated.
一般に、「疾病管理」とは、費用対効果に着目し、費用をコントロールしながら質の高い医療を提供するアウトカムマネジメントの手法の１つであり、主に、慢性疾患のコントロールに活用され、総合的に管理する方法である。疾病管理は、退院前教育、食事療法の指導、生活習慣の指導、服薬指導、カウンセリング、退院後の電話及び訪問、退院後のリハビリテーション等を含む。中でも、本実施形態の評価方法における疾病管理は、食事療法の指導、生活習慣の指導、服薬指導、リハビリテーションを示し、それらの疾病管理による血管内皮機能の改善効果を評価することができる。
また、本実施形態の評価方法が適用される循環器疾患としては、上述の＜＜血管内皮機能改善剤のスクリーニング方法＞＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。
本実施形態の評価方法の各工程について、以下に詳細を説明する。
In general, “disease management” is one of the outcome management methods that focus on cost-effectiveness and provide high-quality medical care while controlling costs, and is mainly used for the control of chronic diseases. It is a way to manage it. Disease management includes pre-discharge education, dietary guidance, lifestyle guidance, medication guidance, counseling, post-discharge telephone calls and visits, post-discharge rehabilitation, and the like. Especially, the disease management in the evaluation method of this embodiment shows the instruction | indication of a diet therapy, the instruction | indication of a lifestyle, a medication instruction | indication, and rehabilitation, and the improvement effect of the vascular endothelial function by those disease management can be evaluated.
Further, examples of the cardiovascular disease to which the evaluation method of the present embodiment is applied include the same as those exemplified in the above <<< Screening method for vascular endothelial function improving agent >>.
Details of each step of the evaluation method of the present embodiment will be described below.
［準備工程］
上述の＜＜血管内皮機能改善剤のスクリーニング方法＞＞の［準備工程］と同様の方法を用いて、血管内皮細胞をコンフルエントの状態となるように培養する。
[Preparation process]
Using the same method as in [Preparation step] of <<<< Screening method for vascular endothelial function improving agent >> described above, vascular endothelial cells are cultured so as to be in a confluent state.
［培養工程］
次いで、準備工程後の血管内皮細胞を、循環器疾患を有する被検体の疾病管理前、又は疾病管理後の血清を添加し、培養する。
循環器疾患を有する被検体の疾病管理前の血清は、疾病管理前に採取した血液試料から調製し、使用するまで冷凍保存しておけばよい。また、循環器疾患を有する被検体の疾病管理後の血清は、疾病管理後に採取した血液試料から調製すればよい。また、疾病管理後の血液試料を採取するタイミングとしては、疾病の種類に応じて適宜選択することができ、例えば、疾病管理開始から、１ヶ月以上１２ヶ月以下の期間であればよく、定期健診の際に血液試料を採取すればよい。また、継続的に血液試料を採取し、調整した血清を用いた評価を行うことで、疾病管理後の血管内皮機能の改善効果の経時的な変化を評価することができる。
また、循環器疾患を有する被検体の疾病管理前、又は疾病管理後の血清は、予め細胞培養用培地に混合し、培地交換の際に血清含有細胞培養用培地を添加すればよい。細胞培養用培地における血清の含有量は、例えば５質量％以上２０質量％以下であればよく、例えば１０質量％程度であればよい。
循環器疾患を有する被検体の疾病管理前の血清を添加したサンプル、及び循環器疾患を有する被検体の疾病管理後の血清を添加したサンプルを準備し、続く誘導工程を経て、評価工程において比較することで、疾病管理による血管内皮機能の改善効果を評価することができる。
[Culture process]
Subsequently, the vascular endothelial cells after the preparation step are cultured by adding serum before or after disease management of a subject having cardiovascular disease.
Serum prior to disease management of a subject having cardiovascular disease may be prepared from a blood sample collected before disease management and stored frozen until use. In addition, serum after disease management of a subject having cardiovascular disease may be prepared from a blood sample collected after disease management. The timing of collecting a blood sample after disease management can be appropriately selected according to the type of disease. For example, it can be a period of from 1 month to 12 months from the start of disease management. A blood sample may be collected at the time of diagnosis. In addition, by continuously collecting blood samples and performing evaluation using the adjusted serum, it is possible to evaluate changes over time in the effect of improving vascular endothelial function after disease management.
In addition, serum before or after disease management of a subject having a cardiovascular disease may be mixed in advance with a cell culture medium, and a serum-containing cell culture medium may be added at the time of medium exchange. The serum content in the cell culture medium may be, for example, 5% by mass or more and 20% by mass or less, for example, about 10% by mass.
Prepare a sample with added serum before disease control of a subject with cardiovascular disease and a sample with serum added after disease control of a subject with cardiovascular disease, and compare in the evaluation step through the following induction step By doing so, the improvement effect of the vascular endothelial function by disease management can be evaluated.
使用する細胞培養用培地としては、上述の＜＜血管内皮機能改善剤のスクリーニング方法＞＞の［準備工程］において例示されたものと同様のものが挙げられる。また、使用する細胞培養培地は、成長因子を実質的に含まないものであることが好ましい。 Examples of the cell culture medium to be used include the same ones as exemplified in [Preparation step] of the above << Screening method for vascular endothelial function improving agent >>. Moreover, it is preferable that the cell culture medium to be used is a thing which does not contain a growth factor substantially.
また、培養条件としては、通常の血管内皮細胞を培養する条件であればよい。培養温度は、例えば２５℃以上４０℃以下であればよく、例えば３０℃以上３９℃以下であればよく、例えば３５℃以上３９℃以下であればよい。
また、必要に応じて培養環境を著しく変化させなければ還流等の流体力学的な付加を加えてもよい。
また、培養環境は、例えば、約５％のＣＯ２条件下であってもよい。
また、培養方法は、例えば、水平振盪培養、静置培養等が挙げられ、中でも、水平振盪培養であることが好ましい。振盪速度については、例えば、ヒトの生理的な毛細血管から細動脈までの流れずり応力とされる２．５ｄｙｎｅｓ／ｃｍ２以上５ｄｙｎｅｓ／ｃｍ２以下となるように調整すればよい。
また、培養時間としては、被検化合物が血管内皮細胞に作用し、血管内皮機能改善効果（内皮グリコカリックス層の生成促進効果、又は内皮グリコカリックス層の遊離抑制効果）を奏するのに有効な時間であればよく、例えば３０分以上２時間以下であればよく、例えば、１時間程度であればよい。
Moreover, the culture conditions may be any conditions as long as normal vascular endothelial cells are cultured. The culture temperature may be, for example, 25 ° C. or more and 40 ° C. or less, for example, 30 ° C. or more and 39 ° C. or less, for example, 35 ° C. or more and 39 ° C. or less.
If necessary, a hydrodynamic addition such as reflux may be added as long as the culture environment is not significantly changed.
The culture environment may be, for example, about 5% CO 2 condition.
In addition, examples of the culture method include horizontal shaking culture and stationary culture, and among them, horizontal shaking culture is preferable. The shaking speed may be adjusted to be, for example, 2.5 dynes / cm 2 or more and 5 dynes / cm 2 or less, which is a flow shear stress from a human physiological capillary to arteriole.
In addition, as the culture time, the test compound acts on the vascular endothelial cells and is effective for the effect of improving the vascular endothelial function (the effect of promoting the formation of the endothelial glycocalyx layer or the effect of inhibiting the release of the endothelial glycocalyx layer). For example, it may be 30 minutes or more and 2 hours or less, for example, about 1 hour.
［誘導工程］
次いで、培養工程後の血管内皮細胞に血管内皮障害リスク因子を添加し培養することで、グリコカリックスの遊離を誘導する。
血管内皮障害リスク因子としては、上述の＜＜血管内皮機能改善剤のスクリーニング方法＞＞の［誘導工程］の（血管内皮障害リスク因子）において例示されたものと同様のものが挙げられる。
また、誘導工程における培養条件としては、上述の＜＜血管内皮機能改善剤のスクリーニング方法＞＞の［誘導工程］の（培養条件）において例示されたものと同様のものが挙げられる。
[Induction process]
Subsequently, the release of glycocalyx is induced by adding a vascular endothelial disorder risk factor to the vascular endothelial cells after the culturing step and culturing.
Examples of the risk factor for vascular endothelial disorder include those exemplified in (Induction Step) (Risk Factor for Vascular Endothelial Disease) in [Induction Step] of << Method for Screening Vascular Endothelial Function Improvement >> described above.
In addition, examples of the culture conditions in the induction process include the same culture conditions as those exemplified in (Cultivation conditions) of [Induction process] in the above << Screening method for vascular endothelial function improving agent >>.
［評価工程］
次いで、誘導工程後の循環器疾患を有する被検体の疾病管理前、又は疾病管理後の血清を添加した条件での培養液中に含まれるグリコカリックス濃度を測定し、疾病管理による血管内皮機能の改善効果を評価する。
[Evaluation process]
Next, the concentration of glycocalyx contained in the culture solution of the subject having cardiovascular disease after the induction process before or after the disease management under the condition of adding serum after the disease management is measured, and the vascular endothelial function by the disease management is measured. Evaluate the improvement effect.
グリコカリックス濃度の測定方法としては、上述の＜＜血管内皮機能改善剤のスクリーニング方法＞＞の［評価工程］において例示されたものと同様のものが挙げられる。 Examples of the method for measuring the glycocalyx concentration include the same methods as those exemplified in [Evaluation step] in the above << Screening method for vascular endothelial function improving agent >>.
本実施形態の評価工程において、得られたグリコカリックス濃度から、循環器疾患を有する被検体の疾病管理後の血清を添加した条件での培養液中に含まれるグリコカリックス濃度が、循環器疾患を有する被検体の疾病管理前の血清を添加した条件での培養液中に含まれるグリコカリックス濃度と比較して低かった場合に、前記疾病管理は血管内皮機能の改善効果を有し、当該疾病管理（例えば、食事療法の指導、生活習慣の指導、服薬指導、リハビリテーション）が循環器疾患に有効であると評価することができる。
一方、循環器疾患を有する被検体の疾病管理後の血清を添加した条件での培養液中に含まれるグリコカリックス濃度が、循環器疾患を有する被検体の疾病管理前の血清を添加した条件での培養液中に含まれるグリコカリックス濃度と比較して同程度、又は高かった場合に、前記疾病管理は血管内皮機能の改善効果を有さないと評価することができる。
In the evaluation step of this embodiment, from the obtained glycocalyx concentration, the glycocalyx concentration contained in the culture solution under the condition of adding serum after disease control of a subject having a cardiovascular disease, The disease management has an effect of improving the vascular endothelial function when the concentration is lower than the glycocalyx concentration contained in the culture medium under the condition of adding serum before disease management of the subject having the disease management, (For example, diet therapy guidance, lifestyle guidance, medication guidance, rehabilitation) can be evaluated as effective for cardiovascular diseases.
On the other hand, the glycocalyx concentration contained in the culture medium under the condition of adding serum after disease control of a subject having cardiovascular disease is the condition of adding serum before disease control of a subject having cardiovascular disease. It can be evaluated that the disease management does not have an effect of improving vascular endothelial function when the concentration is the same or higher than the glycocalix concentration contained in the culture solution.
＜＜循環器疾患を有する被検体における疾病管理による血管内皮機能の改善効果を評価するためのキット＞＞
一実施形態において、本発明は、循環器疾患を有する被検体における疾病管理による血管内皮機能の改善効果を評価するためのキットであって、血管内皮細胞と、血管内皮障害リスク因子と、グリコカリックス検出試薬と、を備えるキットを提供する。
<< Kit for evaluating the effect of improving vascular endothelial function by disease management in subjects with cardiovascular disease >>
In one embodiment, the present invention is a kit for evaluating an effect of improving vascular endothelial function by disease management in a subject having a cardiovascular disease, comprising vascular endothelial cells, vascular endothelial disorder risk factor, glycocalyx And a detection reagent.
本実施形態のキットによれば、１回の採血のみで完了し、簡便に循環器疾患を有する被検体における疾病管理による血管内皮機能の改善効果を評価することができる。 According to the kit of this embodiment, it is completed by only one blood collection, and the effect of improving vascular endothelial function by disease management in a subject having a cardiovascular disease can be easily evaluated.
＜血管内皮細胞＞
本実施形態のキットが備える血管内皮細胞としては、上述の＜＜血管内皮機能改善剤のスクリーニング方法＞＞の［準備工程］の（血管内皮細胞）に例示されたものと同様のものが挙げられる。本実施形態のキットが備える血管内皮細胞は１種類であってもよく、２種類以上であってもよく、所望の疾患のインビトロ系モデルを構築できるものであればよい。
<Vascular endothelial cells>
Examples of the vascular endothelial cells provided in the kit of the present embodiment include the same vascular endothelial cells as those exemplified in (vascular endothelial cells) in [Preparation step] of <<<< Method for screening vascular endothelial function improving agent >>>> described above. . The number of vascular endothelial cells provided in the kit of this embodiment may be one, two or more, and any one that can construct an in vitro system model of a desired disease.
＜血管内皮障害リスク因子＞
本実施形態のキットが備える血管内皮細胞としては、上述の＜＜血管内皮機能改善剤のスクリーニング方法＞＞の［誘導工程］の（血管内皮障害リスク因子）に例示されたものと同様のものが挙げられる。本実施形態のキットが備える血管内皮障害リスク因子は１種類であってもよく、２種類以上であってもよく、所望の疾患のインビトロ系モデルを構築できるものであればよい。
<Risk factor for vascular endothelial disorder>
Examples of the vascular endothelial cells provided in the kit of the present embodiment are the same as those exemplified in (Risk factor of vascular endothelial disorder) in [Inducing step] of the above << Method for screening vascular endothelial function improving agent >>. Can be mentioned. The risk factor for vascular endothelial injury provided in the kit of the present embodiment may be one type or two or more types as long as an in vitro system model of a desired disease can be constructed.
＜グリコカリックス検出試薬＞
本実施形態のキットが備えるグリコカリックス検出試薬としては、上述の＜＜血管内皮機能改善剤をスクリーニングするためのキット＞＞の＜グリコカリックス検出試薬＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。
<Glycocalix detection reagent>
Examples of the glycocalix detection reagent provided in the kit of the present embodiment include the same reagents as those exemplified in <Glycocalix detection reagent> in the above << Kit for screening vascular endothelial function improving agent >>. .
＜その他構成＞
（細胞培養用培地）
本実施形態のキットは、さらに細胞培養用培地を備えていてもよい。本実施形態のキットが備える細胞培養用培地としては、上述の＜＜血管内皮機能改善剤のスクリーニング方法＞＞の［準備工程］の（細胞培養用培地）に例示されたものと同様のものが挙げられる。本実施形態のキットが備える細胞培養用培地は１種類であってもよく、２種類以上であってもよく、所望の疾患のインビトロ系モデルを構築できるものであればよい。
<Other configuration>
(Cell culture medium)
The kit of this embodiment may further include a cell culture medium. Examples of the cell culture medium provided in the kit of the present embodiment are the same as those exemplified in (Cell culture medium) in [Preparation step] of the above << Screening method for vascular endothelial function improving agent >>. Can be mentioned. The cell culture medium provided in the kit of this embodiment may be one type or two or more types as long as an in vitro system model of a desired disease can be constructed.
（検出装置）
本実施形態のキットは、さらに、検出装置を備えていてもよい。検出装置としては、当該分野において公知のものから適宜選択でき、例えば、マイクロプレートリーダー、蛍光スキャナー、２光子励起スキャナー等が挙げられる。
(Detection device)
The kit of this embodiment may further include a detection device. As a detection apparatus, it can select suitably from what is known in the said field | area, for example, a microplate reader, a fluorescence scanner, a two-photon excitation scanner, etc. are mentioned.
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention, this invention is not limited to a following example.
［実施例１］グルコース添加によるグリコカリックスの遊離試験
（１）準備工程
ヒト臍帯静脈内皮細胞（Ｈｕｍａｎ Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ Ｖｅｉｎ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ；ＨＵＶＥＣ）を用いて、試験を行った。９６ウェルプレートにＨＵＶＥＣを１×１０５細胞／ｍＬとなるように播種した。次いで、血管内皮細胞成長因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ；ＶＥＧＦ）含有改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ：ＤＭＥＭ）を用いて、ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で一晩静置培養した。次いで、１００％コンフルエントとなったことを確認し、試験に用いた。
（２）誘導工程
血管内皮障害リスク因子として、グルコースを用いて、試験を行った。次いで、（１）で準備した細胞の培地をＶＥＧＦ不含のＤＭＥＭに交換し、グルコース濃度が０．０５ｍＭ、５ｍＭ、１５ｍＭ、及び３０ｍＭとなるようにそれぞれ添加し、グリコカリックスの遊離を誘導した。次いで、ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で培養した。
[Example 1] Glycocalix release test by addition of glucose (1) Preparatory step A test was carried out using human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). A 96-well plate was seeded with HUVEC at 1 × 10 5 cells / mL. Subsequently, the cells were statically cultured overnight at 37 ° C. in a CO 2 incubator using a modified eagle medium (Dulbecco's Modified Eagle Medium: DMEM) containing a vascular endothelial growth factor (VEGF). Next, it was confirmed that it became 100% confluent and used for the test.
(2) Induction process A test was performed using glucose as a risk factor for vascular endothelial injury. Next, the cell culture medium prepared in (1) was replaced with VEGF-free DMEM and added so that the glucose concentrations were 0.05 mM, 5 mM, 15 mM, and 30 mM, respectively, to induce release of glycocalix. Then incubated at 37 ° C. at a CO 2 incubator.
（３）評価工程
次いで、グルコースの添加から２０分後、２時間後、６時間後、１２時間後、２４時間後において、培養上清を採取し、４℃、１，５００ｒｐｍ、５分で遠心し、上清を採取した。次いで、グリコカリックスの一つであるＣＤ１３８を検出した。具体的には、Ｈｕｍａｎ Ｓｙｎｄｅｃａｎ−１ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（ＣＤ１３８）（アブカム社製）を用いて、サンドイッチＥＬＩＳＡ法により検出を行った。まず、抗Ｓｙｎｄｅｃａｎ−１モノクローナル抗体がコーティングされた９６ウェルプレートに上清、又は既知の濃度のＳｙｎｄｅｃａｎ−１を含む標準試薬を滴下し、室温で６０分間インキュベーションした。このとき、上清、又は標準試薬には、ビオチン化抗Ｓｙｎｄｅｃａｎ−１モノクローナル抗体を混合し、用いた。次いで、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒを用いて洗浄後、ビオチン化抗Ｓｙｎｄｅｃａｎ−１モノクローナル抗体に特異的に結合するストレプトアビジン結合ＨＲＰを滴下し、室温で３０分間インキュベートした。次いで、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒを用いて洗浄後、ＴＭＢ基質溶液を滴下し、室温及び遮光条件下で１２分間インキュベートし、反応停止液を滴下した。次いで、マイクロプレートリーダーを用いて、染色されたＳｙｎｄｅｃａｎ−１（ＣＤ１３８）を検出した。結果を図１に示す。
(3) Evaluation step Next, 20 minutes, 2 hours, 6 hours, 12 hours and 24 hours after the addition of glucose, the culture supernatant was collected and centrifuged at 4 ° C., 1,500 rpm for 5 minutes. The supernatant was collected. Subsequently, CD138 which is one of glycocalyx was detected. Specifically, detection was performed by sandwich ELISA using Human Syndecan-1 ELISA Kit (CD138) (manufactured by Abcam). First, a supernatant or a standard reagent containing Syndecan-1 at a known concentration was dropped into a 96-well plate coated with anti-Syndecan-1 monoclonal antibody, and incubated at room temperature for 60 minutes. At this time, a biotinylated anti-Syndecan-1 monoclonal antibody was mixed and used for the supernatant or the standard reagent. Next, after washing with Wash Buffer, streptavidin-binding HRP that specifically binds to biotinylated anti-Syndecan-1 monoclonal antibody was added dropwise and incubated at room temperature for 30 minutes. Next, after washing with a Wash Buffer, a TMB substrate solution was added dropwise, incubated for 12 minutes at room temperature and under light-shielded conditions, and a reaction stop solution was added dropwise. The stained Syndecan-1 (CD138) was then detected using a microplate reader. The results are shown in FIG.
図１から、３０ｍＭという高グルコース濃度において、２０分という短時間で遊離したグリコカリックスを検出できることが明らかとなった。 From FIG. 1, it was revealed that glycocalyx released in a short time of 20 minutes can be detected at a high glucose concentration of 30 mM.
［実施例２］異なる血管内皮障害リスク因子の添加によるグリコカリックスの遊離比較試験
（１）準備工程
実施例１の（１）と同様の方法を用いて、ＨＵＶＥＣを培養し、１００％コンフルエントとなったことを確認し、試験に用いた。
[Example 2] Glycocalix release comparison test by adding different risk factors for vascular endothelial injury (1) Preparatory step HUVEC was cultured using the same method as in (1) of Example 1, and became 100% confluent. This was confirmed and used for the test.
（２）誘導工程
次いで、血管内皮障害リスク因子として、濃度をふったグルコースの代わりに、５０ｍＭ及び１００ｍＭグルコース、５０ｍＭ及び１００ｍＭ過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、０．５％エタノール、１００μＭ酸化ＬＤＬを用いた以外は、実施例１の（２）と同様の方法を用いて、グリコカリックスの遊離を誘導した。
(2) Induction step Next, as a risk factor for vascular endothelial damage, 50 mM and 100 mM glucose, 50 mM and 100 mM hydrogen peroxide (H 2 O 2 ), 0.5% ethanol, 100 μM oxidized LDL are used instead of glucose with a high concentration. The release of glycocalyx was induced using the same method as in (2) of Example 1 except that was used.
（３）評価工程
次いで、各血管内皮障害リスク因子の添加から０分後、１０分後、２０分後、３０分後において、培養上清を採取し、実施例１の（３）と同様の方法を用いて、サンドイッチＥＬＩＳＡ法によりグリコカリックスの一つであるＣＤ１３８を検出した。結果を図２に示す。
(3) Evaluation Step Next, the culture supernatant was collected at 0 minutes, 10 minutes, 20 minutes, and 30 minutes after the addition of each vascular endothelial disorder risk factor, and the same as in (3) of Example 1 Using this method, CD138, which is one of the glycocalyxes, was detected by sandwich ELISA. The results are shown in FIG.
（４）結果
図２から、いずれの血管内皮障害リスク因子においても、添加から２０分後にグリコカリックスの遊離がピークを迎えることが明らかとなった。
(4) Results From FIG. 2, it was clarified that glycocalyx release reaches a peak 20 minutes after addition in any vascular endothelial disorder risk factor.
［実施例３］糖尿病患者血清を用いたグリコカリックス形成能評価試験
（１）準備工程
実施例１の（１）と同様の方法を用いて、ＨＵＶＥＣを培養し、１００％コンフルエントとなったことを確認し、試験に用いた。
[Example 3] Glycocalix-forming ability evaluation test using diabetic patient serum (1) Preparatory step Using the same method as in (1) of Example 1, HUVEC was cultured to be 100% confluent. Confirmed and used for testing.
（２）培養工程
準備工程後のＨＵＶＥＣから培地を捨てて、健常者２名、又は糖尿病患者３名由来の血清を１０％含むＶＥＧＦ不含のＤＭＥＭに交換し、１時間培養した。また、コントロールとして、血清及びＶＥＧＦ不含のＤＭＥＭに交換したサンプルも準備し、１時間培養した。培養方法としては、静置培養又は振盪培養にて行った。振盪培養では、ヒトの生理的な毛細血管から細動脈までの流れずり応力とされる２．５〜５ｄｙｎｅｓ／ｃｍ２に相当する振盪にて行った。
(2) Culture process The medium was discarded from the HUVEC after the preparation process, replaced with VEGF-free DMEM containing 10% of serum from 2 healthy subjects or 3 diabetic patients, and cultured for 1 hour. As a control, a sample exchanged with serum and VEGF-free DMEM was also prepared and cultured for 1 hour. As a culture method, static culture or shaking culture was performed. The shaking culture was performed with shaking corresponding to 2.5 to 5 dynes / cm 2, which is considered to be a flow shear stress from human physiological capillaries to arterioles.
（３）誘導工程
次いで、血管内皮障害リスク因子として、濃度をふったグルコースの代わりに、５０ｍＭ過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を用いた以外は、実施例１の（２）と同様の方法を用いて、グリコカリックスの遊離を誘導した。
(3) Inducing step Next, the same method as (2) of Example 1 except that 50 mM hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) was used instead of glucose with a high concentration as a risk factor for vascular endothelial injury. Was used to induce the release of glycocalyx.
（４）評価工程
次いで、添加から２０分後において、培養上清を採取し、実施例１の（３）と同様の方法を用いて、サンドイッチＥＬＩＳＡ法によりグリコカリックスの一つであるＣＤ１３８を検出した。また、健常者２名、又は糖尿病患者３名由来の血清に含まれるＣＤ１３８についても検出した。結果を図３に示す。図３において、「Ｃｏｎｔｒｏｌ１」及び「Ｃｏｎｔｒｏｌ２」が健常者２名の血清を用いたサンプルであり、「Ｐａｔｉｅｎｔ１」、「Ｐａｔｉｅｎｔ２」、及び「Ｐａｔｉｅｎｔ３」が糖尿病患者３名の血清を用いたサンプルである。
(4) Evaluation step Next, 20 minutes after the addition, the culture supernatant was collected, and CD138, one of the glycocalyxes, was detected by sandwich ELISA using the same method as in (1) of Example 1. did. Moreover, it detected also about CD138 contained in the serum from 2 healthy persons or 3 diabetic patients. The results are shown in FIG. In FIG. 3, “
（５）結果
図３から、健常者２名の血清を用いたサンプルでは、糖尿病患者３名の血清を用いたサンプルと比較して、血清中濃度に対する静置培養及び振盪培養後のグリコカリックスの濃度が有意に上昇することが明らかとなった。この結果から、健常者２名のほうが糖尿病患者３名よりもグリコカリックスの形成能が高いこと示唆された。
また、図３から、いずれのサンプルにおいても、静置培養よりも振盪培養のほうがグリコカリックスの濃度が高くなることが明らかとなった。
(5) Results From FIG. 3, in the sample using the serum of 2 healthy subjects, compared to the sample using the serum of 3 diabetic patients, the glycocalix after stationary culture and shaking culture with respect to the serum concentration It was revealed that the concentration increased significantly. From these results, it was suggested that 2 healthy subjects had higher glycocalyx formation ability than 3 diabetic patients.
Further, from FIG. 3, it was revealed that in any sample, the concentration of glycocalyx was higher in shaking culture than in stationary culture.
［実施例４］Ｄ−グルコースを用いたグリコカリックス形成能評価試験
（１）準備工程
実施例１の（１）と同様の方法を用いて、ＨＵＶＥＣを培養し、１００％コンフルエントとなったことを確認し、試験に用いた。
[Example 4] Glycocalix-forming ability evaluation test using D-glucose (1) Preparatory step Using the same method as in (1) of Example 1, HUVECs were cultured to be 100% confluent. Confirmed and used for testing.
（２）培養工程
準備工程後のＨＵＶＥＣから培地を捨てて、０．０５ｍＭ、５ｍＭ、又は１５ｍＭの各濃度のＤ−グルコース及びウシ胎児血清を１０％含むＶＥＧＦ含有のＥＣＭに交換し、１時間震蘯培養した。
(2) Culture process The medium is discarded from the HUVEC after the preparation process and replaced with an ECM containing VEGF containing 10% of D-glucose and fetal calf serum at 0.05 mM, 5 mM, or 15 mM, and shaken for 1 hour. Koji was cultured.
（３）誘導工程
次いで、血管内皮障害リスク因子として、濃度をふったグルコースの代わりに、５０ｍＭ、又は１００ｍＭの過酸化水素を用いて、グリコカリックスの遊離を誘導した。
(3) Induction step Next, as a risk factor for vascular endothelial injury, release of glycocalyx was induced using 50 mM or 100 mM hydrogen peroxide instead of glucose with a high concentration.
（４）評価工程
次いで、添加から２０分後において、培養上清を採取し、実施例１の（３）と同様の方法を用いて、サンドイッチＥＬＩＳＡ法によりグリコカリックスの一つであるＣＤ１３８を検出した。結果を図４に示す。
(4) Evaluation step Next, 20 minutes after the addition, the culture supernatant was collected, and CD138, one of the glycocalyxes, was detected by sandwich ELISA using the same method as in (1) of Example 1. did. The results are shown in FIG.
（５）結果
図４から、０．０５ｍＭのグルコースを用いたサンプルと比較して、５ｍＭ、又は１５ｍＭのグルコース存在下で震蘯培養を行ったサンプルにおいて、グリコカリックスの濃度が有意に上昇することが明らかとなった。この結果から、グリコカリックス形成過程において５ｍＭ及び１５ｍＭグルコース存在下での震蘯培養は０．０５ｍＭグルコース存在下と比較し、グリコカリックス産生能が高いことが示唆された。
(5) Results From FIG. 4, the concentration of glycocalyx is significantly increased in the sample cultured in the presence of 5 mM or 15 mM glucose compared to the sample using 0.05 mM glucose. Became clear. From this result, it was suggested that shaking culture in the presence of 5 mM and 15 mM glucose in the glycocalyx formation process has higher glycocalyx production ability than in the presence of 0.05 mM glucose.
［実施例５］経口抗凝固薬リバーロキサバン（ＦＸａ阻害薬）を用いた血管内皮機能障害軽減効果評価試験
（１）準備工程
実施例１の（１）と同様の方法を用いて、ＨＵＶＥＣを培養し、１００％コンフルエントとなったことを確認し、試験に用いた。
[Example 5] Vascular endothelial dysfunction reduction effect evaluation test using oral anticoagulant rivaroxaban (FXa inhibitor) (1) Preparatory step Using the same method as (1) of Example 1, HUVEC The cells were cultured and confirmed to be 100% confluent, and used for the test.
（２）培養工程
準備工程後のＨＵＶＥＣから培地を捨てて、１５ｍＭのＤ−グルコース、又は０．１μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、若しくは１０μｇ／ｍＬの各濃度のリバーロキサバンを含むＶＥＧＦ不含のＥＣＭに交換し、１時間震蘯培養した。リバーロキサバンは、第Ｘａ因子の働きを阻害することによって、血液凝固能を低下させる薬物である。
(2) Culture process The medium is discarded from HUVEC after the preparation process, and VEGF-free containing 15 mM D-glucose or rivaroxaban of 0.1 μg / mL, 1 μg / mL, or 10 μg / mL in each concentration It changed to ECM and shake-cultured for 1 hour. Rivaroxaban is a drug that reduces blood coagulation ability by inhibiting the action of factor Xa.
（３）誘導工程
次いで、血管内皮障害リスク因子として、濃度をふったグルコースの代わりに、０ｍＭ（過酸化水素無添加）、５０ｍＭ、又は１００ｍＭ過酸化水素を用いて、グリコカリックスの遊離を誘導した。
(3) Induction step Next, glycocalix release was induced using 0 mM (no hydrogen peroxide added), 50 mM, or 100 mM hydrogen peroxide as a risk factor for vascular endothelial injury instead of glucose with a high concentration. .
（４）評価工程
次いで、添加から２０分後において、培養上清を採取し、実施例１の（３）と同様の方法を用いて、サンドイッチＥＬＩＳＡ法によりグリコカリックスの一つであるＣＤ１３８を検出した。結果を図５に示す。図５において、「Ｒｉｖａｒｏｘａｂａｎ（−）」とは、リバーロキサバンを含有せず、１５ｍＭのＤ−グルコースを用いて、培養工程を行ったサンプルを示す。
(4) Evaluation step Next, 20 minutes after the addition, the culture supernatant was collected, and CD138, one of the glycocalyxes, was detected by sandwich ELISA using the same method as in (1) of Example 1. did. The results are shown in FIG. In FIG. 5, “Rivaloxaban (−)” indicates a sample that did not contain rivaroxaban and was subjected to a culturing step using 15 mM D-glucose.
（５）結果
図５から、リバーロキサバンを含む培地で培養することにより、グリコカリックスの遊離が抑制されることが明らかとなった。この結果から、リバーロキサバンには何らかのグリコカリックス保護作用があることが示唆された。
(5) Results From FIG. 5, it was revealed that the release of glycocalyx is suppressed by culturing in a medium containing rivaroxaban. From these results, it was suggested that rivaroxaban has some glycocalix protective action.
［実施例６］各パッセージのＨＵＶＥＣを用いた過酸化水素刺激によるグリコカリックス（ＣＤ１３８）の産生能評価試験
（１）準備工程
実施例１の（１）と同様の方法を用いて、細胞の***回数が異なるＨＵＶＥＣ（パッセージ３〜７）を培養し、１００％コンフルエントとなったことを確認し、試験に用いた。ＨＵＶＥＣは初代培養を用い、１回の継代で１：３〜４となるように細胞数を調整したうえで播種し、パッセージ３〜７の各パッセージになるまで繰り返し培養増殖させた細胞を使用した。また、次の継代は９０〜９５％コンフルエントの時点で行った。
[Example 6] Glycocalix (CD138) productivity evaluation test by hydrogen peroxide stimulation using HUVEC of each passage (1) Preparatory step Cell division using the same method as in (1) of Example 1 HUVECs (
（２）培養工程
準備工程後のＨＵＶＥＣから培地を捨てて、０．０５ｍＭ、又は１５ｍＭのＤ−グルコースと１０％ＦＢＳとを含むＶＥＧＦ含有のＥＣＭに交換し、１時間震蘯培養した。
(2) Culture process The medium was discarded from the HUVEC after the preparation process, and replaced with VEGF-containing ECM containing 0.05 mM or 15 mM D-glucose and 10% FBS, followed by shaking culture for 1 hour.
（３）誘導工程
次いで、血管内皮障害リスク因子として、５０ｍＭ、又は１００ｍＭ過酸化水素を用いて、グリコカリックスの遊離を誘導した。
（４）評価工程
(3) Induction step Next, release of glycocalix was induced using 50 mM or 100 mM hydrogen peroxide as a risk factor for vascular endothelial injury.
(4) Evaluation process
次いで、添加から２０分後において、培養上清を採取し、実施例１の（３）と同様の方法を用いて、サンドイッチＥＬＩＳＡ法によりグリコカリックスの一つであるＣＤ１３８を検出した。結果を図６に示す。図６において、横軸の「ＰＮ（Ｎは１以上の任意の整数）」とは、Ｎ回の継代培養細胞を用いたサンプルを示す。 Then, 20 minutes after the addition, the culture supernatant was collected, and CD138, one of glycocalyxes, was detected by sandwich ELISA using the same method as in Example 1, (3). The results are shown in FIG. In FIG. 6, “PN (N is an arbitrary integer greater than or equal to 1)” on the horizontal axis indicates a sample using N subculture cells.
（５）結果
図６から、パッセージ３〜６においては十分なグリコカリックス濃度が得られたが、パッセージ７においては、同条件におけるグリコカリックス濃度は低下しており、細胞老化によるグリコカリックス産生低下が明らかとなった。この結果から、グリコカリックス産生及び遊離の評価においては、パッセージ６までのＨＵＶＥＣを使用すべきであることが示唆された。
(5) Results From FIG. 6, a sufficient glycocalyx concentration was obtained in
本発明によれば、１回の採血のみで完了し、且つ、高い再現性を有する血管内皮機能の測定方法を用いた血管内皮機能改善剤のスクリーニング方法、血管内皮細胞に対する被検化合物の血管内皮機能障害性の評価方法、及び循環器疾患を有する被検体における疾病管理による血管内皮機能の改善効果の評価方法を提供することができる。 According to the present invention, a screening method for a vascular endothelial function improving agent using a method for measuring vascular endothelial function, which is completed by only one blood collection and has high reproducibility, a vascular endothelium of a test compound against vascular endothelial cells A method for evaluating dysfunction and a method for evaluating an effect of improving vascular endothelial function by disease management in a subject having a cardiovascular disease can be provided.
Claims (6)
血管内皮細胞をコンフルエントの状態となるように培養し、準備する準備工程と、
前記準備工程後の前記血管内皮細胞を、被検化合物の添加、又は無添加条件にて培養する培養工程と、
前記培養工程後の前記血管内皮細胞に血管内皮障害リスク因子を添加し、グリコカリックスの遊離を誘導する誘導工程と、
前記誘導工程後の前記被検化合物の添加、又は無添加条件での培養液中に含まれるグリコカリックス濃度を測定し、前記被検化合物による血管内皮機能の改善効果を評価する評価工程と、
を備えることを特徴とする方法。 A screening method for a vascular endothelial function improving agent,
A preparatory step for culturing and preparing vascular endothelial cells in a confluent state;
A culturing step of culturing the vascular endothelial cells after the preparatory step under the addition or non-addition condition of a test compound;
Adding an vascular endothelial injury risk factor to the vascular endothelial cells after the culturing step, and inducing a release of glycocalyx;
The evaluation step of measuring the glycocalyx concentration contained in the culture solution under the addition of the test compound after the induction step or in the non-addition condition, and evaluating the effect of improving the vascular endothelial function by the test compound;
A method comprising the steps of:
血管内皮細胞と、
血管内皮障害リスク因子と、
グリコカリックス検出試薬と、
を備えることを特徴とするキット。 A kit for screening an agent for improving vascular endothelial function,
Vascular endothelial cells,
Vascular endothelial disorder risk factors,
A glycocalix detection reagent;
A kit comprising:
血管内皮細胞をコンフルエントの状態となるように培養し、準備する準備工程と、
前記準備工程後の前記血管内皮細胞を、被検化合物の添加、又は無添加条件にて培養する培養工程と、
前記培養工程後の前記被検化合物の添加、又は無添加条件での培養液中に含まれるグリコカリックス濃度を測定し、血管内皮細胞に対する前記被検化合物の血管内皮機能障害性を評価する評価工程と、
を備えることを特徴とする方法。 A method for evaluating the vascular endothelial dysfunction of a test compound against vascular endothelial cells, comprising:
A preparatory step for culturing and preparing vascular endothelial cells in a confluent state;
A culturing step of culturing the vascular endothelial cells after the preparatory step under the addition or non-addition condition of a test compound;
An evaluation step of measuring the glycated endocrine dysfunction of the test compound with respect to vascular endothelial cells by measuring the concentration of glycocalyx contained in the culture solution under the condition where the test compound is added or not added after the culturing step. When,
A method comprising the steps of:
血管内皮細胞と、
グリコカリックス検出試薬と、
を備えることを特徴とするキット。 A kit for evaluating vascular endothelial dysfunction of a test compound against vascular endothelial cells,
Vascular endothelial cells,
A glycocalix detection reagent;
A kit comprising:
血管内皮細胞をコンフルエントの状態となるように培養し、準備する準備工程と、
前記準備工程後の前記血管内皮細胞を、循環器疾患を有する被検体の疾病管理前、又は疾病管理後の血清を添加し、培養する培養工程と、
前記培養工程後の前記血管内皮細胞に血管内皮障害リスク因子を添加し、グリコカリックスの遊離を誘導する誘導工程と、
前記誘導工程後の前記循環器疾患を有する被検体の疾病管理前、又は疾病管理後の血清を添加した条件での培養液中に含まれるグリコカリックス濃度を測定し、前記疾病管理による血管内皮機能の改善効果を評価する評価工程と、
を備えることを特徴とする方法。 A method for evaluating the improvement effect of vascular endothelial function by disease management in a subject having a cardiovascular disease,
A preparatory step for culturing and preparing vascular endothelial cells in a confluent state;
A culturing step of adding and culturing the vascular endothelial cells after the preparatory step before or after disease management of a subject having a cardiovascular disease;
Adding an vascular endothelial injury risk factor to the vascular endothelial cells after the culturing step, and inducing a release of glycocalyx;
Measuring the glycocalyx concentration contained in the culture medium under the condition of adding serum after the disease management before or after the disease management of the subject having the cardiovascular disease, and the vascular endothelial function by the disease management An evaluation process for evaluating the improvement effect of
A method comprising the steps of:
血管内皮細胞と、
血管内皮障害リスク因子と、
グリコカリックス検出試薬と、
を備えることを特徴とするキット。 A kit for evaluating the improvement effect of vascular endothelial function by disease management in a subject having a cardiovascular disease,
Vascular endothelial cells,
Vascular endothelial disorder risk factors,
A glycocalix detection reagent;
A kit comprising:
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2016152151A JP2018021797A (en) | 2016-08-02 | 2016-08-02 | In-vitro vascular endothelial function inspection |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2016152151A JP2018021797A (en) | 2016-08-02 | 2016-08-02 | In-vitro vascular endothelial function inspection |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2018021797A true JP2018021797A (en) | 2018-02-08 |
Family
ID=61165564
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2016152151A Pending JP2018021797A (en) | 2016-08-02 | 2016-08-02 | In-vitro vascular endothelial function inspection |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2018021797A (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11143659B2 (en) | 2015-01-27 | 2021-10-12 | Arterez, Inc. | Biomarkers of vascular disease |
| WO2022066745A1 (en) * | 2020-09-22 | 2022-03-31 | Ohio State Innovation Foundation | Methods, compositions, and kits for detecting and measuring endothelial injury in normal and diseased human central nervous system (cns) |
-
2016
- 2016-08-02 JP JP2016152151A patent/JP2018021797A/en active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11143659B2 (en) | 2015-01-27 | 2021-10-12 | Arterez, Inc. | Biomarkers of vascular disease |
| US11821905B2 (en) | 2015-01-27 | 2023-11-21 | Arterez, Inc. | Biomarkers of vascular disease |
| WO2022066745A1 (en) * | 2020-09-22 | 2022-03-31 | Ohio State Innovation Foundation | Methods, compositions, and kits for detecting and measuring endothelial injury in normal and diseased human central nervous system (cns) |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2673455C2 (en) | Adrenomedullin to guide therapy of blood pressure decline | |
| Grisar et al. | Endothelial progenitor cells in cardiovascular disease and chronic inflammation: from biomarker to therapeutic agent | |
| Martina et al. | Tenascin-W is a specific marker of glioma-associated blood vessels and stimulates angiogenesis in vitro | |
| Sankiewicz et al. | SPR imaging biosensor for the quantitation of fibronectin concentration in blood samples | |
| JP5979683B2 (en) | Sugar chain isoform detection method and sugar chain isoform detection apparatus | |
| Ma et al. | Elevation of serum CXCL16 level correlates well with atherosclerotic ischemic stroke | |
| Lu et al. | LC–MS analysis of polyclonal human anti-Neu5Gc xeno-autoantibodies immunoglobulin G Subclass and partial sequence using multistep intravenous immunoglobulin affinity purification and multienzymatic digestion | |
| Lewandowska et al. | Antiendothelial cells antibodies in patients with systemic sclerosis in relation to pulmonary hypertension and lung fibrosis | |
| Hermansson et al. | Macrophage CD14 expression in human carotid plaques is associated with complicated lesions, correlates with thrombosis, and is reduced by angiotensin receptor blocker treatment | |
| JP2018021797A (en) | In-vitro vascular endothelial function inspection | |
| JP2015529633A5 (en) | ||
| JP6078845B2 (en) | Method for measuring platelet activation based on soluble CLEC-2 | |
| Matsui et al. | Development of a monoclonal antibody-based ELISA system for glyceraldehyde-derived advanced glycation end products | |
| Hornum et al. | High levels of mannose-binding lectin are associated with lower pulse wave velocity in uraemic patients | |
| JP2016040540A (en) | Specific determination of drebrin a and drebrin e | |
| BR112019024966A2 (en) | METHOD FOR DIAGNOSING OR MONITORING KIDNEY FUNCTION OR DIAGNOSING KIDNEY DYSFUNCTION | |
| JP2018151162A (en) | Diagnostic agent for diagnosing progression of alzheimer's disease in subject, and method for diagnosing progression of alzheimer's disease in subject | |
| JP2019529335A (en) | Monoclonal antibody specific for gamma-glutamyl-L-epsilon-lysine for monitoring apoptosis | |
| Boguslawski et al. | Conduct unbecoming: C-reactive protein interactions with a broad range of protein molecules | |
| JP6405549B2 (en) | Acute coronary syndrome marker and its use | |
| JP2016070798A (en) | Method for assisting determination of behcet's disease and method for assisting evaluation of activity of behcet's disease | |
| JP5229866B2 (en) | Method for detecting colorectal cancer, arteriosclerosis, or metabolic syndrome | |
| JP6876676B2 (en) | Methods for determining the concentration of epithelial cells in a blood or aspirated sample | |
| Ono et al. | Accumulation of C-reactive protein in basal keratinocytes of normal skins | |
| JP2009288219A (en) | Diagnostic method of cardiovascular event onset risk |