JP2018012675A - 細菌増殖抑制剤 - Google Patents
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Abstract
Description
1)黒麹菌培養物の加熱処理物又はその抽出物を有効成分とする細菌増殖抑制剤。
2)黒麹菌培養物の加熱処理物又はその抽出物を有効成分とする食品用日持ち向上剤。
3)加熱処理物が、60〜90℃で1〜12時間、又は100〜120℃で20〜60分間の加熱処理物である上記1)の細菌増殖抑制剤又は上記2)の食品用日持ち向上剤。
4)上記1の細菌増殖抑制剤又は上記2)の食品用日持ち向上剤を用いて食品を処理することを特徴とする食品の日持ち向上方法。
5)穀類を含む液体培地で黒麹菌を培養し、得られた培養物を60〜90℃で1〜12時間又は100〜120℃で20〜60分間加熱処理することを特徴とする黒麹菌培養物の加熱処理物の製造方法。
本発明において用いられる「黒麹菌」としては、アスペルギルス・ルチュエンシス(Aspergillus luchuensis)、アスペルギルス・ウサミ(Aspergillus usamii)、アスペルギルス・サイトイ(Aspergillus saitoi)、アスペルギルス・ニーガ(Aspergillus niger)、アスペルギルス・グラウカス(Aspergillus glaucus)等が挙げられ、このうち、アスペルギルス・ルチュエンシスが好ましい。アスペルギルス・ルチュエンシスは、旧分類では、アスペルギルス・アワモリ(Aspergillus awamori)とされていたもので、一般にアワモリコウジカビ(焼酎用コウジカビ)として広く知られているものである。
また、アスペルギルス・ルチュエンシスとしては、例えばAspergillus luchuensis SH―41株(株式会社樋口松之助商店)を好適に用いることができる。
ここで、「穀類」としては、米、大麦、小麦、そば、ヒエ、アワ、キビ、コウリャン、トウモロコシ等を挙げられ、このうち米が好ましい。
当該穀類は、未精白の穀類から、穀皮が穀粒の表面にある程度残されているのが好ましく、精白歩合(穀類を精白して残った穀類の割合)が、3〜30%であるのが好ましい。穀類として米を用いる場合、精米歩合は、3〜30%が好ましく、約30%であることがより好ましい。尚、30%精米歩合とは、玄米の周囲を30%削り落とした米粒のことである。
斯かる液体培地には、無機塩、有機物等の麹菌の培養に一般に使用されている栄養源を添加することができ、無機塩としてはアンモニウム塩、硝酸塩、カリウム塩、酸性リン酸塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等の水溶性の化合物の1種又は2種以上を挙げることができる。ここで、無機塩としては0.1〜1%(w/vol)添加するのが好ましい。
なお、有機物としては米糠、小麦麩、コーンスティープリカー、大豆粕、脱脂大豆等が挙げられる。
好適な培地としては、例えば、2(w/v)%炭素源(精米歩合3〜30%の米粒)を添加したミネラル添加培地(NaNO3 0.3(w/v)%,K2HPO4 0.1(w/v)%,MgSO4 0.05(w/v)%,KCl 0.05%(w/v)%,FeSO4・7H2O 0.001(w/v)%)が挙げられる。
黒麹菌の液体培地への接種量には特に制限はないが、液体培地1ml当り、胞子であれば1×104〜1×106個程度、菌糸であれば前培養液を0.1〜10%程度接種することが好ましい。
加熱処理条件としては、60〜120℃で行うことができ、例えば60〜90℃で1〜12時間、好ましくは6〜12時間、100〜120℃で20〜60分間、好ましくは100℃で20〜60分間、120℃で20〜30分間である。
抽出に用いる溶媒は、黒麹菌培養物の加熱処理物に含有される抗菌物質を抽出できる溶媒である限り、特に限定されるものではなく、例えば、水、メタノール、エタノール、エーテル、酢酸エチル、クロロホルム、ヘキサン、又はこれらの混合物(例えば、クロロホルムとメタノールとの混合液)等を挙げることができるが、酢酸エチル、クロロホルム、ヘキサン等の非プロトン性溶媒であるのが好ましく、低極性溶媒であるのがより好ましい。
好適な抽出法としては、Bligh-Dyer法又はこれに準ずる方法が採用できる。すなわち、加熱処理物に対し、適量のNaClを加え、クロロホルム−メタノール溶液を加えて撹拌した後、さらにクロロホルムを加えて撹拌し、クロロホルム層を回収することにより黒麹菌培養物の加熱処理物の抽出物を得ることができる。
抽出条件は、使用する溶剤によっても異なるが、例えば、加熱処理物1質量部に対して1〜10質量部の溶剤を用い、0〜50℃、好ましくは25〜37℃の温度で、10〜120分抽出するのが好ましい。
クロマトグラフィーに用いる担体としては、特に限定されないが、充填剤としてシリカゲルが好ましく、シリカゲル60がより好ましい。カラムのサイズは、特に限定されない。
上記で得られた加熱処理物の溶媒抽出物をシリカゲルカラムに吸着後、溶媒としてn−ヘキサン:ジエチルエーテル:酢酸=40:60:1で、ベッドボリームごとに溶出させ、画分1から画分6までを得、さらにアセトニトリルを用いてシリカゲルカラムを洗浄したものを画分7とする。このうち、画分3と4を合わせたものを、抗菌活性を示す画分(「活性画分」と称する)として回収し、濃縮することにより純度の高い黒麹菌培養物の加熱処理物の抽出物を得ることができる。
また、黒麹菌培養物の加熱処理物又はその抽出物は、バチルス・セレウスに対する栄養細胞増殖阻害作用のほか、芽胞発芽阻害作用を有する。バチルス・セレウスは芽胞形成細菌であり、物理化学的抵抗性が非常に強く、加熱調理食品においても保存や取扱いに欠陥があると発芽・増殖し、食中毒発症菌量に達することがあることから、発芽阻害作用有することは、食中毒発症抑制に有用である。
本発明において、「食品用日持向上剤」とは、微生物の増殖を抑制するためのものであって、食品に添加されて使用され、該食品の日持ちを、即ち該食品を安全に食することができる期間を数日間程度延長可能とする食品添加剤(日持ち保存料)を意味する。
(1)30%精米2g(100粒)に100mLの純水を添加し、さらに、NaNO3(0.3w/v%)、K2HPO4(0.1w/v%)、MgSO4(0.05w/v%)、KCl(0.05w/v%)、FeSO4・7H2O(0.01w/v%)を所定の濃度となるように添加して液体培地を作製した。
作製した液体培地に対し、1白金耳(2mg)の黒麹菌(Aspergillus luchuensis SH-41株)の分生子を接種後、往復振機培養装置を用いて100rpm、37℃で、120時間培養した。
培養終了後、pHを7.0に調整し、0.2μmポアサイズのメンブランフィルターにて濾過し、その濾液を120℃、20分の高圧滅菌(オートクレーブ)処理に供し、黒麹菌培養物の加熱処理物を得た。
(2)(1)で得られた加熱処理物160mLに対し、最終濃度が5MになるようにNaClを加えた。その混合液にクロロホルム:メタノール(1:2)溶液を750mL加え、分液ロートを用いて10分間撹拌した。さらにクロロホルム250mLを加えた後、分液ロートを用いて1分間撹拌を行ない、クロロホルム層を回収した。溶媒を留去し、黒麹菌培養物の加熱処理物の抽出物を得た。
供試菌として、Staphylococcus aureus IFO 12732、Staphylococcus epidermidis NBRC 12993、Listeria monocytogenes ATCC 7644、Bacillus cereus ATCC 11778、Bacillus cereus HK 51-16-1838、Bacillus coagulans IFO 12583、Bacillus subtilis ATCC 6633を用い、実施例1(2)で得られた加熱処理物の抽出物を10%DMSOに溶解後、50μLを寒天ウェルに入れ、寒天拡散法により、供試菌に対する抗菌活性を評価した。結果を表1に示す。尚、加熱処理を行わない黒麹菌培養物の抽出物には、抗菌作用は認められなかった。
(1)シリカゲルカラムに対して、実施例1で得られた抽出物を吸着させた後、溶媒としてn−ヘキサン:ジエチルエーテル:酢酸=40:60:1で、ベッドボリームごとに溶出させ、画分1から6を得た。さらに、アセトニトリルを用いてシリカゲルカラムを洗浄したものを画分7とした。その際、抗菌活性は画分3と4に認められた。この両画分を合わせて抗菌活性を示す画分(活性画分)として算出したところ、培養液1リットルから35.8mgの活性物質を得ることができた。
供試菌として、Bacillus coagulans IFO12583を用い、試験例1と同様の方法により、(1)で得られた画分1〜7について、それぞれの抗菌活性を測定した。結果を図1に示す。
その結果、画分4に最も強い抗菌活性があり、次が画分3であった。それ以外の画分には抗菌活性が認められなかった。
(1)で得られた活性画分について、限外濾過膜及び高速液体クロマトグラフィー法を用いて精製を行った。すなわち、10Kフィルターで限外濾過した際の濾液を、YMC Hydroshere C18を用いたHPLCに適用し、以下の条件で溶出させた。
カラム:YMC hydrosphere C18(株式会社ワイエムシー)
溶出:水+0.1%トリフルオロ酢酸、およびアセトニトリル+0.1%トリフルオロ酢酸を用いたリニアグラジエント(0−30%)、
流量:1.0 mL/min
その結果、図2に示すように、1.67分後に溶出されるピークが認められ、そのピーク画分のみに抗菌活性が認められた。
尚、限外濾過を3Kのメンブランフィルターを用いて行った場合には、濾液とフィルター上の両者に抗菌活性が認められた。
(3)で得られた精製活性画分について、飛行時間型質量分析計((MALDI-TOF MS))「AutoFlex-T2」(BRUKER DALTONICS)を用いて分子量を測定したところ、600Da〜1300Da付近に主ピークが確認された。また、その際のm/zは、1279.852、1070.532、860.858、651.235の規則的な等間隔のピークが観測された(図3)。
供試菌として、Staphylococcus aureus IFO 12732、Staphylococcus epidermidis NBRC 12993、Listeria monocytogenes ATCC 7644、Bacillus cereus ATCC 11778、Bacillus cereus HK 51-16-1838、Bacillus coagulans IFO 12583、Bacillus subtilis ATCC 6633を用い、実施例2(3)で得られた精製活性画分を、10%DMSOに溶解後、50μLを寒天ウェルに入れ、寒天ウェル拡散法により、供試菌に対する抗菌活性を評価した。
抗菌効果を評価するために、タイム−キリング−アッセイ(time-killing-assay)法を用いて栄養細胞の増殖に与える影響を評価した。
得られた実施例2(3)で得られた精製活性画分を、10%DMSOを含むPBS(−)緩衝液に溶解して培地とした。
37℃で一晩培養したB.cereus ATCC11778をPBS(−)緩衝液で2回洗浄後、OD600 mm=0.75になるように調整して菌液とした。上記培養液にその菌液を10μL添加し37℃でインキュベートした。それを、一定時間ごとに一定量を採取し、LB寒天平板培地上に塗布し、37℃、24時間培養後、観察されるコロニー数から生菌数を測定した。図4より、活性画分の濃度依存的に栄養増殖阻害活性が認められた。
B.cereus ATCC11778株を芽胞形成培地(DSM:Difco sporulation用培地)にて4日間振盪培養し、最終的に成熟芽胞を抽出した。実施例2(3)で得られた精製活性画分及び発芽誘発物質(L−Alanine)を添加したリン酸緩衝液(pH7.0)に、65℃で30分間加温した芽胞を懸濁し、吸光度600nmにて細胞数の変動を経時的に測定した(図5)。なお、芽胞を分離できたか否かはウイルツ法に従って芽胞染色し確認した。
その結果,無添加培地では2時間後に濁度が20%程度低下するが、精製活性画分を添加した場合、その低下率が減少した。このことから、当該画分が芽胞の発芽過程に何らかの影響を与え、芽胞の発芽を阻害することが推測された。
Claims (5)
- 黒麹菌培養物の加熱処理物又はその抽出物を有効成分とする細菌増殖抑制剤。
- 黒麹菌培養物の加熱処理物又はその抽出物を有効成分とする食品用日持ち向上剤。
- 加熱処理物が、60〜90℃で1〜12時間、又は100〜120℃で20〜60分間の加熱処理物である請求項1の細菌増殖抑制剤又は請求項2の食品用日持ち向上剤。
- 請求項1の細菌増殖抑制剤又は請求項2の食品用日持ち向上剤を用いて食品を処理することを特徴とする食品の日持ち向上方法。
- 穀類を含む液体培地で黒麹菌を培養し、得られた培養物を60〜90℃で1〜12時間、又は100〜120℃で20〜60分間加熱処理することを特徴とする黒麹菌培養物の加熱処理物の製造方法。
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醗酵工学雑誌, vol. 第27巻、第12号, JPN6020009824, 1949, pages 320 - 328, ISSN: 0004231766 * |
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