JP2018000129A - Plant mutation rate improver and mutation rate improvement method - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、植物の変異率向上剤及び変異率向上方法等に関する。 The present invention relates to a plant mutation rate improver, a mutation rate improvement method, and the like.
放射線又は変異原等を利用する突然変異誘発は、植物の品種改良及び機能解析等のために、広く利用されている。突然変異原の中でも重イオンビームは、他の放射線又は変異原を用いる場合とは異なる形質を有する突然変異体を得ることができるため注目されているが、高率に突然変異を誘発するのに十分なLET（線エネルギー付与、Linear Energy Transfer）をもつ重イオンビームを生じさせるには、これまで特別な装置や設備が必要であった。また、低いLETをもつγ線やX線によって高率に突然変異を誘発することは困難であった。したがって、ガン治療用のプロトンイオンビームや低いLETをもつγ線やX線であっても高率に突然変異を誘発するためには、植物の突然変異率を向上させる必要があったが、簡便に植物の突然変異率を向上させる方法はこれまで知られていなかった。 Mutagenesis using radiation or mutagen is widely used for plant variety improvement and functional analysis. Among mutagens, heavy ion beams are attracting attention because they can obtain mutants with traits different from those using other radiation or mutagens. In order to generate a heavy ion beam with sufficient LET (Linear Energy Transfer), special equipment and facilities have been required so far. In addition, it was difficult to induce mutations at a high rate by γ-rays or X-rays with low LET. Therefore, it was necessary to improve the mutation rate of plants in order to induce mutations at high rates even with proton ion beams for cancer treatment and γ rays and X rays with low LET. In the past, methods for improving the mutation rate of plants have not been known.
動物及び微生物では、DNA二本鎖切断の修復機構の阻害によって突然変異率を高め得ることが知られている。DNA二本鎖切断の修復機構は、HR（相同組換え、Homologous Recombination）、C-NHEJ（古典的非相同末端結合、Classical Non-Homologous End Joining）、及びA-NHEJ（代替非相同末端結合、Alternative Non-Homologous End Joining）の3つに大きく分けられ、動物及び微生物では、HRの阻害が変異率を高め得る一方、C-NHEJの阻害が変異率を低下させ得るとの報告がある。例えば、非特許文献１では、出芽酵母においてHRを阻害すると野生型よりも変異率が増大するものの、HR及びC-NHEJを阻害すると野生型と同程度以下の変異率になることが記載されている。また、非特許文献２では、ヒト培養細胞において、HR及びA-NHEJを阻害すると野生型よりも変異率が増大するものの、HR、A-NHEJ、及びC-NHEJを阻害すると野生型と同程度の変異率になることが記載されている。
In animals and microorganisms, it is known that mutation rates can be increased by inhibiting the repair mechanism of DNA double-strand breaks. The repair mechanism of DNA double-strand breaks is HR (Homologous Recombination), C-NHEJ (Classical Non-Homologous End Joining), and A-NHEJ (Alternative Non-Homologous End Joining, Alternative Non-Homologous End Joining) In animals and microorganisms, there is a report that inhibition of HR can increase the mutation rate while inhibition of C-NHEJ can reduce the mutation rate. For example, Non-Patent
以上の通り、動物及び微生物についてはHR又はA-NHEJの阻害が突然変異率へ影響を与えるとの報告があるが、これまで、植物についてはそのような報告はない。 As described above, it has been reported that inhibition of HR or A-NHEJ affects the mutation rate for animals and microorganisms, but there has been no such report for plants.
本発明は、植物において突然変異率を向上させる薬剤及び方法を提供すること等を課題とする。 An object of the present invention is to provide a drug and a method for improving the mutation rate in plants.
本発明者は、HR及び／又はC-NHEJを阻害した植物に変異誘発を行って変異率を測定した。その結果、驚くべきことに、動物及び微生物とは異なり、植物ではC-NHEJを阻害することで変異率が有意に向上し、またC-NHEJに加えてHRを阻害することによってさらに変異率が向上することを見出した。本願発明は上記知見に基づくものであり、以下の実施形態を包含する。 The present inventor performed mutagenesis on plants that inhibited HR and / or C-NHEJ, and measured the mutation rate. As a result, surprisingly, unlike animals and microorganisms, inhibition of C-NHEJ in plants significantly improves the mutation rate in plants, and inhibition of HR in addition to C-NHEJ further increases the mutation rate. I found it to improve. The present invention is based on the above findings and includes the following embodiments.
（１）古典的非相同末端結合（C-NHEJ、Classical Non-Homologous End Joining）の阻害物質を一以上含む、植物のDNA二本鎖切断の修復時における変異率向上剤。
（２）C-NHEJの阻害物質が：KU70、KU80、LIGIV、及びXRCC4からなる群から選択される遺伝子又は該遺伝子によってコードされるタンパク質の阻害物質；及びDDRI-18からなる群から選択される、（１）に記載の変異率向上剤。
（３）C-NHEJの阻害物質が、KU70遺伝子又はKU70タンパク質の阻害物質である、（２）に記載の変異率向上剤。
（４）前記遺伝子又はタンパク質の阻害物質が、阻害性核酸、中和抗体、及び低分子化合物からなる群から選択される、（２）又は（３）に記載の変異率向上剤。
（５）LIGIV遺伝子によってコードされるタンパク質の阻害物質がSCR7である、（２）に記載の変異率向上剤。
（６）さらに相同組換え（HR、Homologous Recombination）の阻害物質を一以上含む、（１）〜（５）のいずれかに記載の変異率向上剤。
（７）HRの阻害物質が：RAD54、RAD51B、RAD51C、RAD51D、RAD52、BRCA1、BRCA2、XRCC2、XRCC3、MMS2、SMC5、SMC6、MUS81、RECQ4A、RAD5A、RAD50、NBS1、MRE11、及びRAD51からなる群から選択される遺伝子又は該遺伝子によってコードされるタンパク質の阻害物質；イマチニブ；エルロチニブ；PCI-24781；17-AAG；β-ラクタシスチン；MG132；ボルテゾミブ；mirin；及びバルプロ酸からなる群から選択される、（６）に記載の変異率向上剤。
（８）HRの阻害物質が、RAD54遺伝子又はRAD54タンパク質の阻害物質である、（７）に記載の変異率向上剤。
（９）前記遺伝子又はタンパク質の阻害物質が、阻害性核酸、中和抗体、及び低分子化合物からなる群から選択される、（７）又は（８）に記載の変異率向上剤。
（１０）RAD54タンパク質の阻害物質が、ストレプトニグリンである、（８）に記載の変異率向上剤。
（１１）RAD51遺伝子によってコードされるタンパク質の阻害物質が、B02、RI-1、RI-2、及びIBR2からなる群から選択される、（７）に記載の変異率向上剤。
（１２）植物が、双子葉植物又は単子葉植物である、（１）〜（１１）のいずれかに記載の変異率向上剤。
（１３）植物において古典的非相同末端結合（C-NHEJ、Classical Non-Homologous End Joining）を阻害する工程、及び植物に対して二本鎖切断誘発処理を行う工程を含む、植物に突然変異を誘発する方法。
（１４）二本鎖切断誘発処理が、重イオンビーム照射、放射線照射、及びDNA二本鎖切断誘発剤による処理からなる群から選択される、（１３）に記載の方法。
（１５）C-NHEJを阻害する工程が、（１）〜（５）のいずれかに記載の変異率向上剤で植物を処理することを含む、（１３）又は（１４）に記載の方法。
（１６）C-NHEJを阻害する工程が、C-NHEJに関わる一以上の遺伝子を破壊又は発現抑制することを含む、（１３）〜（１５）のいずれかに記載の方法。
（１７）C-NHEJに関わる一以上の遺伝子が、KU70、KU80、LIGIV、及びXRCC4からなる群から選択される一以上の遺伝子を含む、（１６）に記載の方法。
（１８）植物において相同組換え（HR、Homologous Recombination）を阻害する工程をさらに含む、（１３）〜（１７）のいずれかに記載の方法。
（１９）HRを阻害する工程が、一以上のHRの阻害物質で植物を処理することを含む、（１８）に記載の方法。
（２０）HRの阻害物質が：RAD54、RAD51B、RAD51C、RAD51D、RAD52、BRCA1、BRCA2、XRCC2、XRCC3、MMS2、SMC5、SMC6、MUS81、RECQ4A、RAD5A、RAD50、NBS1、MRE11、及びRAD51からなる群から選択される遺伝子又は該遺伝子によってコードされるタンパク質の阻害物質；イマチニブ；エルロチニブ；PCI-24781；17-AAG；β-ラクタシスチン；MG132；ボルテゾミブ；mirin；及びバルプロ酸からなる群から選択される、（１９）に記載の方法。
（２１）前記遺伝子又はタンパク質の阻害物質が、阻害性核酸、中和抗体、及び低分子化合物からなる群から選択される、（２０）に記載の方法。
（２２）RAD51遺伝子によってコードされるタンパク質の阻害物質が、B02、RI-1、RI-2、及びIBR2からなる群から選択される、（２０）に記載の方法。
（２３）HRを阻害する工程が、HRに関わる一以上の遺伝子を破壊又は発現抑制することを含む、（１８）〜（２２）のいずれかに記載の方法。
（２４）HRに関わる一以上の遺伝子が、RAD54、RAD51B、RAD51C、RAD51D、RAD52、BRCA1、BRCA2、XRCC2、XRCC3、MMS2、SMC5、SMC6、MUS81、RECQ4A、RAD5A、RAD50、NBS1、MRE11、及びRAD51からなる群から選択される一以上の遺伝子を含む、（２３）に記載の方法。
（２５）植物が、双子葉植物又は単子葉植物である、（１３）〜（２４）のいずれかに記載の方法。
（２６）（１３）〜（２５）のいずれかに記載の方法により植物に突然変異を誘発する工程、及び突然変異を有する植物を単離する工程を含む、変異体植物を生産する方法。
(1) A mutation rate improving agent for repairing DNA double-strand breaks in plants, comprising one or more inhibitors of classical non-homologous end joining (C-NHEJ).
(2) The inhibitor of C-NHEJ is selected from: a gene selected from the group consisting of KU70, KU80, LIGIV, and XRCC4 or an inhibitor of a protein encoded by the gene; and a group consisting of DRDI-18 The mutation rate improving agent according to (1).
(3) The mutation rate improving agent according to (2), wherein the inhibitor of C-NHEJ is an inhibitor of KU70 gene or KU70 protein.
(4) The mutation rate improving agent according to (2) or (3), wherein the substance or protein inhibitor is selected from the group consisting of inhibitory nucleic acids, neutralizing antibodies, and low molecular weight compounds.
(5) The mutation rate improving agent according to (2), wherein the inhibitor of the protein encoded by the LIGIV gene is SCR7.
(6) The mutation rate improving agent according to any one of (1) to (5), further comprising one or more inhibitors of homologous recombination (HR).
(7) HR inhibitor: RAD54, RAD51B, RAD51C, RAD51D, RAD52, BRCA1, BRCA2, XRCC2, XRCC3, MMS2, SMC5, SMC6, MUS81, RECQ4A, RAD5A, RAD50, NBS1, MRE11, and RAD51 A gene selected from or an inhibitor of a protein encoded by the gene; imatinib; erlotinib; PCI-24781; 17-AAG; β-lactacystine; MG132; bortezomib; mirin; and valproic acid The mutation rate improving agent according to (6).
(8) The mutation rate improving agent according to (7), wherein the HR inhibitor is an inhibitor of the RAD54 gene or RAD54 protein.
(9) The mutation rate improving agent according to (7) or (8), wherein the gene or protein inhibitor is selected from the group consisting of inhibitory nucleic acids, neutralizing antibodies, and low molecular weight compounds.
(10) The mutation rate improving agent according to (8), wherein the inhibitor of RAD54 protein is streptonigrin.
(11) The mutation rate improving agent according to (7), wherein the inhibitor of the protein encoded by the RAD51 gene is selected from the group consisting of B02, RI-1, RI-2, and IBR2.
(12) The mutation rate improving agent according to any one of (1) to (11), wherein the plant is a dicotyledonous plant or a monocotyledonous plant.
(13) Mutation in a plant, including a step of inhibiting classical non-homologous end joining (C-NHEJ, Classical Non-Homologous End Joining) and a step of inducing a double-strand break in the plant. How to trigger.
(14) The method according to (13), wherein the double-strand break induction treatment is selected from the group consisting of heavy ion beam irradiation, radiation irradiation, and treatment with a DNA double-strand break inducer.
(15) The method according to (13) or (14), wherein the step of inhibiting C-NHEJ comprises treating a plant with the mutation rate improving agent according to any one of (1) to (5).
(16) The method according to any one of (13) to (15), wherein the step of inhibiting C-NHEJ comprises destroying or suppressing expression of one or more genes involved in C-NHEJ.
(17) The method according to (16), wherein the one or more genes related to C-NHEJ include one or more genes selected from the group consisting of KU70, KU80, LIGIV, and XRCC4.
(18) The method according to any one of (13) to (17), further comprising a step of inhibiting homologous recombination (HR) in the plant.
(19) The method according to (18), wherein the step of inhibiting HR comprises treating a plant with one or more inhibitors of HR.
(20) The HR inhibitor is a group consisting of: RAD54, RAD51B, RAD51C, RAD51D, RAD52, BRCA1, BRCA2, XRCC2, XRCC3, MMS2, SMC5, SMC6, MUS81, RECQ4A, RAD5A, RAD50, NBS1, MRE11, and RAD51 A gene selected from or an inhibitor of a protein encoded by the gene; imatinib; erlotinib; PCI-24781; 17-AAG; β-lactacystine; MG132; bortezomib; mirin; and valproic acid (19) The method of description.
(21) The method according to (20), wherein the gene or protein inhibitor is selected from the group consisting of inhibitory nucleic acids, neutralizing antibodies, and low molecular weight compounds.
(22) The method according to (20), wherein the inhibitor of the protein encoded by the RAD51 gene is selected from the group consisting of B02, RI-1, RI-2, and IBR2.
(23) The method according to any one of (18) to (22), wherein the step of inhibiting HR comprises destroying or suppressing expression of one or more genes involved in HR.
(24) One or more genes related to HR are RAD54, RAD51B, RAD51C, RAD51D, RAD52, BRCA1, BRCA2, XRCC2, XRCC3, MMS2, SMC5, SMC6, MUS81, RECQ4A, RAD5A, RAD50, NBS1, MRE11, and RAD51. The method according to (23), comprising one or more genes selected from the group consisting of:
(25) The method according to any one of (13) to (24), wherein the plant is a dicotyledonous plant or a monocotyledonous plant.
(26) A method for producing a mutant plant comprising the steps of inducing a mutation in a plant by the method according to any one of (13) to (25), and isolating the plant having the mutation.
本発明により、植物のDNA二本鎖切断の修復時における変異率を向上させ、高効率に突然変異体を生産することができる。 According to the present invention, the mutation rate at the time of repair of DNA double-strand breaks in plants can be improved, and mutants can be produced with high efficiency.
１．用語の定義
本明細書において、「DNA二本鎖切断」とは、DNAの両方の鎖が切断されることを意味する。DNA二本鎖切断は、例えば、重イオンビーム、プロトンイオンビーム、X線、γ線、α線、β線、電子線、陽子線、及び中性子線等の放射線の照射、並びにDNA二本鎖切断誘発剤等により誘発され得る。
1. Definition of Terms As used herein, “DNA double-strand break” means that both strands of DNA are cut. DNA double strand breaks include, for example, heavy ion beam, proton ion beam, X-ray, γ-ray, α-ray, β-ray, electron beam, proton beam and neutron beam radiation, and DNA double-strand break. It can be induced by an inducer or the like.
DNA二本鎖切断の修復機構の基本的メカニズムは、動物、植物、及び細菌等の種を超えて広く保存されており、大きくHR（相同組換え、Homologous Recombination）とNHEJ（非相同末端結合、Non-Homologous End Joining）に分けられる。 The basic mechanism of DNA double-strand break repair mechanism is widely conserved across species such as animals, plants, and bacteria, and is largely HR (Homologous Recombination) and NHEJ (non-homologous end joining, Non-Homologous End Joining).
本明細書において、「HR」とは、切断部の修復に、相同な配列を利用する修復機構を意味する。HRのプロセスには、例えばV. Manova et al., Frontiers in Plant Science, 2015, 6, Article 885に記載されている様に、当業者には良く知られている。具体的には、真核生物におけるHRは、二本鎖切断部位において末端の配列が切除され、3'突出末端を有するDNA鎖が生じることによって始まる。HRは、その後の反応によってSSA（一本鎖アニーリング、Single-Strand Annealing）及びSDSA（合成依存的一本鎖アニーリング、Synthesis-Dependent Strand Annealing）に分けられる。SSAは、二本鎖切断が相同性／相補性を有する配列間で生じた場合に起こり得、二つの一本鎖の3’突出末端が相同性を有する部位でアニーリングすることによって生じる。一方、SDSAでは、3'突出末端を有するDNA鎖が、相同な配列を有するDNA二本鎖に侵入し、相同な配列を鋳型としてDNAの合成及び修復が行われる。 In the present specification, “HR” means a repair mechanism that utilizes a homologous sequence for repair of a cleavage site. HR processes are well known to those skilled in the art, for example as described in V. Manova et al., Frontiers in Plant Science, 2015, 6, Article 885. Specifically, HR in eukaryotes begins by truncating the terminal sequence at the double-strand break site, resulting in a DNA strand having a 3 ′ overhang. HR is divided into SSA (Single-Strand Annealing) and SDSA (Synthesis-Dependent Strand Annealing) by subsequent reactions. SSA can occur when double-strand breaks occur between homologous / complementary sequences, and is caused by annealing the two single-stranded 3 'protruding ends at homologous sites. On the other hand, in SDSA, a DNA strand having a 3 ′ protruding end enters a DNA double strand having a homologous sequence, and DNA synthesis and repair are performed using the homologous sequence as a template.
本明細書において、「NHEJ」とは、切断部の修復に、相同な配列を利用せず、切断された二本鎖を直接連結する修復機構を意味する。NHEJは、さらにC-NHEJ（古典的非相同末端結合、Classical Non- Homologous End Joining）と、C-NHEJによってその機能が抑制され得るA-NHEJ（代替非相同末端結合、Alternative Non-Homologous End Joining）に分けられる。 In the present specification, “NHEJ” means a repair mechanism that directly links the cleaved duplexes without using a homologous sequence for repair of the cleavage site. NHEJ further includes C-NHEJ (Classical Non-Homologous End Joining) and A-NHEJ (Alternative Non-Homologous End Joining) whose function can be suppressed by C-NHEJ. ).
C-NHEJのプロセスは、例えばV. Manova et al.（上掲）に記載されている様に、当業者には良く知られている。具体的には、真核生物におけるNHEJ経路では、まず、KU70/KU80タンパク質複合体が、二本鎖切断が生じた部位において、DNA末端に結合して、DNA依存性プロテインキナーゼ（DNA-PKcs、植物においては同定されていない）を招集する。DNA末端はさらに別の酵素によって処理され、最終的にLIGIVタンパク質及びXRCC4タンパク質を含む複合体等の様々なタンパク質により再結合される。 The process of C-NHEJ is well known to those skilled in the art, for example as described in V. Manova et al. (Supra). Specifically, in the NHEJ pathway in eukaryotes, first, the KU70 / KU80 protein complex binds to the DNA end at the site where double-strand breaks occur, and DNA-dependent protein kinase (DNA-PKcs, Not identified in plants). The DNA ends are further processed by another enzyme and finally recombined by various proteins such as a complex comprising LIGIV protein and XRCC4 protein.
A-NHEJのプロセスは、HR及びC-NHEJに比べて研究が進んでいないが、まず、二本鎖切断が生じた部位で3'突出末端が生じる。続いて、わずかな相同性（マイクロホモロジー）が存在する部位において二つの一本鎖がアニーリングし、接合部が形成される（V. Manova et al.、上掲）。A-NHEJは配列の切除を伴うため、接合部における遺伝的情報が失われることが多い。A-NHEJは、A-EJ（代替EJ、Alternative EJ）、B-NHEJ（バックアップNHEJ、backup NHEJ）、又はMMEJ（マイクロホモロジー媒介末端結合、Microhomology-Mediated End Joining）とも呼ばれる。 The process of A-NHEJ has not been studied as compared to HR and C-NHEJ, but first, a 3 ′ protruding end is generated at the site where double-strand break has occurred. Subsequently, two single strands anneal at a site where there is a slight homology (microhomology) to form a junction (V. Manova et al., Supra). Since A-NHEJ involves excision of sequences, genetic information at the junction is often lost. A-NHEJ is also referred to as A-EJ (alternative EJ), B-NHEJ (backup NHEJ), or MMEJ (Microhomology-Mediated End Joining).
２．植物のDNA二本鎖切断の修復時における変異率向上剤
一態様において、本発明は、植物の突然変異率向上剤に関する。本発明の変異率向上剤は、C-NHEJの阻害物質を一以上含む。C-NHEJの阻害物質は、特に限定されないが、例えば、C-NHEJに関与する遺伝子又はタンパク質の阻害物質、並びにSCR7及びDDRI-18等の低分子化合物、好ましくはSCR7が挙げられる。本発明の変異率向上は、C-NHEJの阻害物質を単独で含んでもよいし、組み合わせて含んでもよい。
2. The mutation rate improving agent at the time of repair of DNA double-strand break of a plant In one aspect, the present invention relates to a plant mutation rate improving agent. The mutation rate improving agent of the present invention contains one or more inhibitors of C-NHEJ. The inhibitor of C-NHEJ is not particularly limited, and examples thereof include inhibitors of genes or proteins involved in C-NHEJ, and low molecular compounds such as SCR7 and DRDI-18, preferably SCR7. The improvement in the mutation rate of the present invention may include a C-NHEJ inhibitor alone or in combination.
C-NHEJに関与する遺伝子又はタンパク質としては、例えばKU70、KU80、LIGIV（DNA ligaseIV）、及びXRCC4、好ましくはKU70及びKU80からなる群から選択される一以上の遺伝子又はこれらの遺伝子によってコードされるタンパク質、さらに好ましくはKU70遺伝子又はKU70タンパク質が挙げられる。これらの遺伝子又はタンパク質の阻害剤としては、阻害性核酸、中和抗体、及び低分子化合物等が挙げられる。 Examples of the gene or protein involved in C-NHEJ are one or more genes selected from the group consisting of KU70, KU80, LIGIV (DNA ligase IV), and XRCC4, preferably KU70 and KU80, or these genes. Examples of the protein include KU70 gene or KU70 protein. Examples of these gene or protein inhibitors include inhibitory nucleic acids, neutralizing antibodies, and low molecular weight compounds.
本明細書において、阻害性核酸にはsiRNA、shRNA、及び核酸アプタマーが含まれる。本明細書において、「siRNA」（低分子干渉RNA:small interference RNA）とは、標的遺伝子の一部に相当する塩基配列を有するセンス鎖（パッセンジャー鎖）、及びそのアンチセンス鎖（ガイド鎖）からなる小分子二本鎖RNAである。 As used herein, inhibitory nucleic acids include siRNA, shRNA, and nucleic acid aptamers. In this specification, “siRNA” (small interference RNA) means a sense strand (passenger strand) having a base sequence corresponding to a part of a target gene, and an antisense strand (guide strand) thereof. It is a small double-stranded RNA.
本明細書において、「shRNA」（short hairpin RNA）とは、適当な配列を有する短いスペーサー配列によって上記のsiRNA又は成熟型二本鎖miRNAのセンス鎖及びアンチセンス鎖が連結された一本鎖RNAをいう。shRNAは、一分子内でセンス領域とアンチセンス領域が互いに塩基対合してステム構造を形成し、同時に前記スペーサー配列がループ構造を形成することによって、分子全体としてヘアピン型のステム−ループ構造を形成している。 In this specification, “shRNA” (short hairpin RNA) is a single-stranded RNA in which the sense strand and the antisense strand of the above siRNA or mature double-stranded miRNA are linked by a short spacer sequence having an appropriate sequence. Say. In shRNA, a sense region and an antisense region are paired with each other in one molecule to form a stem structure, and at the same time, the spacer sequence forms a loop structure, thereby forming a hairpin type stem-loop structure as a whole molecule. Forming.
KU70、KU80、LIGIV、及びXRCC4からなる群から選択される遺伝子に対するsiRNA又はshRNAは、これらの遺伝子の阻害剤として機能し得る。これらの遺伝子に対するsiRNA若しくはshRNAは、KU70、KU80、LIGIV、及びXRCC4遺伝子の配列に基づいて、当業者であれば適宜設計することができる。KU70、KU80、LIGIV、及びXRCC4遺伝子又の配列は、公のデータベース（例えば、NCBI（米国）、DDBJ（日本）、EMBL（欧州））より、入手することができ、またその配列が知られていない場合は当業者に公知の方法により遺伝子をクローニングすることができる。例えば、シロイヌナズナのKU70遺伝子は配列番号6（NCBI Reference Sequence：NM_101558.3）に示される塩基配列を含み、KU70タンパク質は配列番号7（NCBI Reference Sequence：NP_564012.1）に示されるアミノ酸配列を含む。 SiRNA or shRNA against a gene selected from the group consisting of KU70, KU80, LIGIV, and XRCC4 can function as an inhibitor of these genes. The siRNA or shRNA for these genes can be appropriately designed by those skilled in the art based on the sequences of the KU70, KU80, LIGIV, and XRCC4 genes. The KU70, KU80, LIGIV, and XRCC4 genes or sequences can be obtained from public databases (eg, NCBI (US), DDBJ (Japan), EMBL (Europe)), and their sequences are known. If not, the gene can be cloned by methods known to those skilled in the art. For example, the KU70 gene of Arabidopsis thaliana contains the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 (NCBI Reference Sequence: NM_101558.3), and the KU70 protein contains the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 (NCBI Reference Sequence: NP_564012.1).
阻害性核酸は、ベクターに組み込んで対象植物に導入することが好ましく、阻害性核酸の送達に用いることができるベクターとして、例えばレトロウィルスベクターpMKO.1-GFPが挙げられる。 The inhibitory nucleic acid is preferably incorporated into a vector and introduced into a target plant. Examples of a vector that can be used for delivery of the inhibitory nucleic acid include the retroviral vector pMKO.1-GFP.
本明細書において、「核酸アプタマー」（以下、本明細書では単に「アプタマー」とも記載する）とは、DNA又はRNAで構成され、水素結合等に基づいて形成される二次構造又は立体構造によって標的分子と強固、かつ特異的に結合するリガンド分子をいう。アプタマーの標的分子は、遺伝子であってもタンパク質であってもよい。アプタマーが標的分子の生理活性等の機能を特異的に阻害又は抑制する能力を持つ場合には、アプタマーは、標的分子の機能阻害剤となり得る。本明細書において「標的分子の機能阻害」とは、標的分子が有する生物学的機能を阻害又は抑制することをいう。アプタマーは、公知のSELEX（systematic evolution of ligands by exponential enrichment）法を用いて試験管内選別により作製することができる。SELEX法とは、ランダム配列領域とその両末端にプライマー結合領域を有する核酸分子で構成されるプールから標的分子に結合した核酸分子を選択し、回収後に増幅した後、次のラウンドの核酸プールにするという一連のサイクルを数〜数十ラウンド繰り返して、標的分子に対してより結合力の強い核酸を選択する方法である。 In the present specification, “nucleic acid aptamer” (hereinafter, also simply referred to as “aptamer” in the present specification) is composed of DNA or RNA, and is formed by a secondary structure or a three-dimensional structure formed based on hydrogen bonding or the like. A ligand molecule that binds firmly and specifically to a target molecule. The target molecule of the aptamer may be a gene or a protein. When the aptamer has the ability to specifically inhibit or suppress the function such as physiological activity of the target molecule, the aptamer can be a function inhibitor of the target molecule. As used herein, “target molecule function inhibition” refers to inhibiting or suppressing a biological function of a target molecule. Aptamers can be produced by in-vitro sorting using a known SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment) method. In the SELEX method, a nucleic acid molecule bound to a target molecule is selected from a pool consisting of a random sequence region and nucleic acid molecules having primer binding regions at both ends, amplified after recovery, and then transferred to the nucleic acid pool of the next round. This is a method of selecting a nucleic acid having a stronger binding force with respect to a target molecule by repeating a series of cycles of several to several tens of rounds.
本明細書において、「中和抗体」とは、標的分子の生理活性等の機能を特異的に阻害又は抑制する能力を有する抗体を意味する。中和抗体（例えば、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体）は、各種動物に、目的のタンパク質、又はその断片を直接投与することで得ることができる。また、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入したプラスミドを用いて、DNAワクチン法（Raz, E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 9519-9523 (1994); 又はDonnelly, J.J. et al., J. Infect. Dis., 173, 314-320, (1996)）によっても得ることができる。 In the present specification, the “neutralizing antibody” means an antibody having the ability to specifically inhibit or suppress a function such as physiological activity of a target molecule. A neutralizing antibody (for example, a polyclonal antibody or a monoclonal antibody) can be obtained by directly administering a target protein or a fragment thereof to various animals. Alternatively, using a plasmid into which a polynucleotide encoding the protein of interest is introduced, the DNA vaccine method (Raz, E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 9519-9523 (1994); or Donnelly, JJ et al., J. Infect. Dis., 173, 314-320, (1996)).
SCR7は、5,6-ビス((E)-ベンジリデンアミノ)-2-メルカプトピリミジン-4-オールとも記載され、LIGIVタンパク質に結合してC-NHEJを阻害することが知られている。DDRI-18は、3,3'-(1H,3'H-5,5'-ビベンゾ[d]イミダゾル-2,2'-ジイル)ジアニリンとも記載され、C-NHEJを阻害することが知られているが、その標的分子は特定されていない。 SCR7 is also described as 5,6-bis ((E) -benzylideneamino) -2-mercaptopyrimidin-4-ol, and is known to bind to LIGIV protein and inhibit C-NHEJ. DDRI-18 is also described as 3,3 ′-(1H, 3′H-5,5′-bibenzo [d] imidazol-2,2′-diyl) dianiline and is known to inhibit C-NHEJ However, the target molecule has not been identified.
本発明の変異率向上剤は、さらにHRの阻害物質を一以上含んでもよい。HRの阻害物質は、特に限定されないが、例えば、HRに関与する遺伝子又はタンパク質の阻害物質、並びに低分子化合物、例えば、B02、RI-1、RI-2、IBR2、イマチニブ、エルロチニブ、PCI-24781、17-AAG、β-ラクタシスチン、MG132、ボルテゾミブ、mirin、及びバルプロ酸、好ましくはRI-1及びRI-2が挙げられる。本発明の変異率向上剤は、HRの阻害物質を単独で含んでもよいし、組み合わせて含んでもよい。 The mutation rate improving agent of the present invention may further contain one or more inhibitors of HR. Although the inhibitor of HR is not particularly limited, for example, an inhibitor of a gene or protein involved in HR, and a low molecular compound such as B02, RI-1, RI-2, IBR2, imatinib, erlotinib, PCI-24781 , 17-AAG, β-lactacystine, MG132, bortezomib, mirin, and valproic acid, preferably RI-1 and RI-2. The mutation rate improving agent of the present invention may contain an inhibitor of HR alone or in combination.
HRに関与する遺伝子又はタンパク質としては、例えばRAD54、RAD51B、RAD51C、RAD51D、RAD52、BRCA1、BRCA2、XRCC2、XRCC3、MMS2、SMC5、SMC6、MUS81、RECQ4A、RAD5A、RAD50、NBS1、MRE11、及びRAD51、好ましくはRAD54、BRCA2及びXRCC3からなる群から選択される一以上の遺伝子又はこれらの遺伝子によってコードされるタンパク質、さらに好ましくはRAD54遺伝子又はRAD54タンパク質の阻害物質が挙げられる。これらの遺伝子又はタンパク質の阻害剤としては、阻害性核酸、中和抗体、及び低分子化合物等が挙げられる。 Examples of genes or proteins involved in HR include RAD54, RAD51B, RAD51C, RAD51D, RAD52, BRCA1, BRCA2, XRCC2, XRCC3, MMS2, SMC5, SMC6, MUS81, RECQ4A, RAD5A, RAD50, NBS1, MRE11, and RAD51, Preferably, one or more genes selected from the group consisting of RAD54, BRCA2 and XRCC3, or proteins encoded by these genes, more preferably inhibitors of RAD54 gene or RAD54 protein. Examples of these gene or protein inhibitors include inhibitory nucleic acids, neutralizing antibodies, and low molecular weight compounds.
RAD54、RAD51B、RAD51C、RAD51D、RAD52、BRCA1、BRCA2、XRCC2、XRCC3、MMS2、SMC5、SMC6、MUS81、RECQ4A、RAD5A、RAD50、NBS1、MRE11、及びRAD51からなる群から選択される遺伝子に対するsiRNA又はshRNAは、これらの遺伝子の阻害剤として機能し得る。これらの遺伝子に対するsiRNA若しくはshRNAは、これらの遺伝子の配列に基づいて、当業者であれば適宜設計することができる。これらの遺伝子の配列は、公のデータベース（例えば、NCBI（米国）、DDBJ（日本）、EMBL（欧州））より、入手することができ、またその配列が知られていない場合は、当業者に公知の方法により遺伝子をクローニングすることができる。例えば、シロイヌナズナのRAD54遺伝子は配列番号7（GenBank: AB250666.1）に示される塩基配列を含み、RAD54タンパク質は配列番号8（GenBank: BAF03042.1）に示されるアミノ酸配列を含む。また、植物において上記遺伝子又はタンパク質の配列が知られていない場合は、当業者に公知の方法によりクローニングすることができる。 SiRNA or shRNA against a gene selected from the group consisting of RAD54, RAD51B, RAD51C, RAD51D, RAD52, BRCA1, BRCA2, XRCC2, XRCC3, MMS2, SMC5, SMC6, MUS81, RECQ4A, RAD5A, RAD50, NBS1, MRE11, and RAD51 Can function as inhibitors of these genes. The siRNA or shRNA for these genes can be appropriately designed by those skilled in the art based on the sequences of these genes. The sequences of these genes can be obtained from public databases (eg, NCBI (US), DDBJ (Japan), EMBL (Europe)), and if the sequences are not known, those skilled in the art Genes can be cloned by known methods. For example, the RAD54 gene of Arabidopsis thaliana contains the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 (GenBank: AB250666.1), and the RAD54 protein contains the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 (GenBank: BAF03042.1). When the gene or protein sequence is not known in plants, it can be cloned by methods known to those skilled in the art.
RAD54タンパク質を阻害する低分子化合物としては、RAD54に結合し、そのATPase活性を阻害するストレプトニグリンが知られている。上記の遺伝子又はタンパク質に対するアプタマー及び中和抗体については、C-NHEJに関与する遺伝子又はタンパク質の阻害剤について記載したものと同様であるから記載を省略する。 As a low molecular weight compound that inhibits RAD54 protein, streptonigrin that binds to RAD54 and inhibits its ATPase activity is known. The aptamer and neutralizing antibody for the above gene or protein are the same as those described for the inhibitor of the gene or protein involved in C-NHEJ, and thus description thereof is omitted.
B02は3-(フェニルメチル)-2-[(1E)-2-(3-ピリジニル)エテニル]-4(3H)-キナゾリノンとも記載され、RAD51タンパク質に結合しHRを阻害することが知られている。RI-1及びRI-2は、それぞれ3-クロロ-1-(3,4-ジクロロフェニル)-4-(4-モルフォリニル)-1H-ピロール-2,5-ジオン、及び1-(3,4-ジクロロフェニル)-3-(4-メトキシフェニル)-4-モルフォリノ-1H-ピロール-2,5-ジオンとも記載され、RAD51タンパク質のC319（C319は植物においても保存されている）に結合しHRを阻害することが知られている。IBR2は、1-(1H-インドール-3-イル)-2-(ベンジルスルホニル)-1,2-ジヒドロイソキノリンとも記載され、RAD51タンパク質と結合しHRを阻害することが知られている。イマニチブ、エルロチニブ、PCI-24781（アベキシノスタットとも呼ばれる）、17-AAG（タネスピマイシンとも呼ばれる）、β-ラクタシスチン、MG132（ベンジルN-[(2S)-4-メチル-1-[[(2S)-4-メチル-1-[[(2S)-4-メチル-1-オキソペンタン-2-イル]アミノ]-1-オキソペンタン-2-イル]アミノ]-1-オキソペンタン-2-イル]カルバメート）、及びボルテゾミブは、いずれも間接的にRAD51及び／又はBCRA1を阻害することが知られている。mirin（Z-5-(4-ヒドロキシベンジリデン)-2-イミノ-1,3-チアゾリジン-4-オン）は、HRに先立って生じるMRE11-RAD50-NBS複合体を阻害することが知られている。バルプロ酸は、HRの頻度を増加させるとの報告があるが、その標的分子は特定されていない。 B02 is also described as 3- (phenylmethyl) -2-[(1E) -2- (3-pyridinyl) ethenyl] -4 (3H) -quinazolinone and is known to bind to RAD51 protein and inhibit HR Yes. RI-1 and RI-2 are 3-chloro-1- (3,4-dichlorophenyl) -4- (4-morpholinyl) -1H-pyrrole-2,5-dione and 1- (3,4- Dichlorophenyl) -3- (4-methoxyphenyl) -4-morpholino-1H-pyrrole-2,5-dione also described, binds to RAD51 protein C319 (C319 is also conserved in plants) and inhibits HR It is known to do. IBR2 is also described as 1- (1H-indol-3-yl) -2- (benzylsulfonyl) -1,2-dihydroisoquinoline, and is known to bind to RAD51 protein and inhibit HR. Imatinib, erlotinib, PCI-24781 (also called abexinostat), 17-AAG (also called tanespimycin), β-lactacystine, MG132 (benzyl N-[(2S) -4-methyl-1-[[( 2S) -4-Methyl-1-[[(2S) -4-methyl-1-oxopentan-2-yl] amino] -1-oxopentan-2-yl] amino] -1-oxopentane-2- Yl] carbamate) and bortezomib are both known to indirectly inhibit RAD51 and / or BCRA1. mirin (Z-5- (4-hydroxybenzylidene) -2-imino-1,3-thiazolidin-4-one) is known to inhibit the MRE11-RAD50-NBS complex that occurs prior to HR . Although valproic acid has been reported to increase the frequency of HR, its target molecule has not been identified.
C-NHEJの基本的メカニズムは植物種間で保存されていることが知られており（V. Manova et al.、上掲）、特に単子葉植物であるイネと双子葉植物であるシロイヌナズナとの間で高度に保存されていることが知られていることから（例えば、Nishizawa-Yokoi et al. 2012 New phytologist 196:1048-1059を参照されたい）、本発明は広範な植物種に適用し得ると考えられる。 The basic mechanism of C-NHEJ is known to be conserved among plant species (V. Manova et al., Supra), especially between monocotyledonous rice and dicotyledonous plant Arabidopsis thaliana. Since it is known to be highly conserved among others (see, for example, Nishizawa-Yokoi et al. 2012 New phytologist 196: 1048-1059), the present invention can be applied to a wide range of plant species. it is conceivable that.
本明細書において、植物の種類は特に制限されず、単子葉植物及び双子葉植物を含む被子植物、裸子植物、コケ植物、シダ植物等いずれの植物であってもよいが、好ましくは被子植物、さらに好ましくは双子葉植物である。また、植物は草本植物及び木本植物のいずれであってもよい。 In the present specification, the kind of the plant is not particularly limited, and may be any plant such as angiosperm, monocot, moss, fern including monocotyledonous and dicotyledonous plants, preferably angiosperm, More preferred are dicotyledonous plants. Further, the plant may be either a herbaceous plant or a woody plant.
双子葉植物の具体例としては、例えば、ナス科［ナス（Solanum melongena L.）、トマト（Solanum lycopersicum）、ピーマン（Capsicum annuum L. var. angulosum Mill.）、トウガラシ（Capsicum annuum L.）、タバコ（Nicotiana tabacum L.）等］、アブラナ科［シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、アブラナ（Brassica campestris L.）、キャベツ（Brassica oleracea L. var. capitata L.）、ダイコン（Raphanus sativus L.）、ナタネ（Brassica campestris L., B. napus L.）等］、マメ科［ダイズ（Glycine max）、アズキ（Vigna angularis Willd.）、インゲン（Phaseolus vulgaris L.）、ソラマメ（Vicia faba L.）等］、ウリ科［キュウリ（Cucumis sativus L.）、メロン（Cucumis melo L.）、スイカ（Citrullus vulgaris Schrad.）、カボチャ（C. moschata Duch., C. maxima Duch.）等］、ヒルガオ科［サツマイモ（Ipomoea batatas）等］、シソ科［シソ（Perilla frutescens Britt. var. crispa）等］、キク科［キク（Chrysanthemum morifolium）、シュンギク（Chrysanthemum coronarium L.）、レタス（Lactuca sativa L. var. capitata L.）、ハクサイ（Brassica pekinensis Rupr.）等］、バラ科［バラ（Rose hybrida Hort.）、イチゴ（Fragaria x ananassa Duch.）等］、ミカン科［ミカン（Citras unshiu）、サンショウ（Zanthoxylum piperitum DC.）等］、フトモモ科［ユーカリ（Eucalyptus globulus Labill）等］、ヤナギ科［ポプラ（Populas nigra L. var. italica Koehne）等］、アカザ科［ホウレンソウ（Spinacia oleracea L.）、テンサイ（Beta vulgaris L.）等］、リンドウ科［リンドウ（Gentiana scabra Bunge var. buergeri Maxim.）等］、及びナデシコ科［カーネーション（Dianthus caryophyllus L.）等］の植物が挙げられる。単子葉植物の具体例としては、例えばイネ科［イネ（Oryza sativa）、コムギ（Triticum aestivum L.）、オオムギ（Hordeum vulgare L.）、ペレニアルライグラス（Lolium perenne L.）、イタリアンライグラス（Lolium multiflorum Lam.）、メドウフェスク（Festuca pratensis Huds.）、トールフェスク（Festuca arundinacea Schreb.）、オーチャードグラス（Dactylis glomerata L.）、チモシー（Phleum pratense L.）等］及びユリ科［ネギ（Allium fistulosum L.）、タマネギ（Allium cepa L.）、ニラ（Allium tuberosum Rottl.）、ニンニク（Allium sativum L.）、アスパラガス（Asparagus officinalis L.）等］の植物が挙げられる。 Specific examples of dicotyledonous plants include, for example, eggplant family [Solanum melongena L.], tomato (Solanum lycopersicum), pepper (Capsicum annuum L. var. Angulosum Mill.), Pepper (Capsicum annuum L.), tobacco (Nicotiana tabacum L., etc.)], Brassicaceae [Arabidopsis thaliana, Brassica campestris L., Cabbage (Brassica oleracea L. var. Capitata L.), Japanese radish (Raphanus sativus L.), Rapeseed (Brassica) campestris L., B. napus L., etc.], legumes [soybean (Glycine max), azuki bean (Vigna angularis Willd.), green beans (Phaseolus vulgaris L.), broad bean (Vicia faba L.), etc.], cucurbitaceae [Cucumber (Cucumis sativus L.), melon (Cucumis melo L.), watermelon (Citrullus vulgaris Schrad.), Pumpkin (C. moschata Duch., C. maxima Duch.) Etc.], convolvulaceae [Ipomoea batatas] Etc.], Lamiaceae [Perilla fru tescens Britt. var. crispa) etc.], Asteraceae [Chrysanthemum morifolium), Chrysanthemum (Chrysanthemum coronarium L.), lettuce (Lactuca sativa L. var. capitata L.), Chinese cabbage (Brassica pekinensis Rupr.), etc.] Rosaceae [rose (Rose hybrida Hort.), Strawberry (Fragaria x ananassa Duch.), Etc.], citrus (Citras unshiu), salamander (Zanthoxylum piperitum DC., Etc.), peach family [Eucalyptus globulus Labill ), Etc.], Willowaceae [Populas nigra L. var. Italica Koehne, etc.], Rubiaceae [Spinacia oleracea L.], Sugar beet (Beta vulgaris L., etc.), Gentianaceae [Gentiana scabra Bunge var. buergeri Maxim.), etc.], and plants of the family Nadesico (Dianthus caryophyllus L., etc.). Specific examples of monocotyledonous plants include, for example, the grass family [Oryza sativa, wheat (Triticum aestivum L.), barley (Hordeum vulgare L.), perennial ryegrass (Lolium perenne L.), Italian ryegrass (Lolium multiflorum Lam). .), Meadow Fescue (Festuca pratensis Huds.), Tall Fescue (Festuca arundinacea Schreb.), Orchard Grass (Dactylis glomerata L.), Timothy (Phleum pratense L.), etc.] and Lily Family [Allium fistulosum L.], Onion (Allium cepa L.), leek (Allium tuberosum Rottl.), Garlic (Allium sativum L.), asparagus (Asparagus officinalis L., etc.).
本発明の変異率向上剤は、例えば植物の種子、胚、葯、花、及び花粉等の生殖器官又は生殖細胞、好ましくは種子、又はカルスに対して適用することができる。また、本発明の変異率向上剤は、葉、根、根端、さや、及び茎等の植物組織又は培養細胞等の細胞に対して行うこともできる。この場合、これらの組織又は細胞を脱分化させてカルスを得た後、カルスを再分化させて植物を得ることができる。植物及び組織の種類によっては、脱分化及び再分化の工程を省略することもできる。 The mutation rate improving agent of the present invention can be applied to reproductive organs or germ cells such as plant seeds, embryos, cocoons, flowers, and pollen, preferably seeds or callus. The mutation rate improving agent of the present invention can also be applied to plant tissues such as leaves, roots, root tips, pods and stems, or cells such as cultured cells. In this case, these tissues or cells are dedifferentiated to obtain callus, and then callus is redifferentiated to obtain a plant. Depending on the type of plant and tissue, the steps of dedifferentiation and redifferentiation can be omitted.
本発明の変異率向上剤を植物に適用する時期は、DNA二本鎖切断の修復時に変異率向上剤が作用する限り特に限定されない。本発明の変異率向上剤は、例えば二本鎖切断の誘発に先立って、二本鎖切断の誘発と同時に、二本鎖切断の誘発の後に用いることができる。本発明の変異率向上剤が、DNA二本鎖切断の修復時に、有効量又は有効な濃度で存在していることが好ましい。変異率向上剤の有効量は、植物種、処理を行う細胞又は組織の種類、及び二本鎖切断を誘発する処理等に基づいて、当業者であれば適宜決定することができる。 The time when the mutation rate improving agent of the present invention is applied to plants is not particularly limited as long as the mutation rate improving agent acts upon repair of DNA double-strand breaks. The mutation rate improving agent of the present invention can be used, for example, prior to induction of double-strand break, simultaneously with induction of double-strand break, and after induction of double-strand break. It is preferable that the mutation rate improving agent of the present invention is present in an effective amount or an effective concentration when DNA double-strand break is repaired. An effective amount of the mutation rate improving agent can be appropriately determined by those skilled in the art based on the plant species, the type of cells or tissues to be treated, the treatment for inducing double-strand breaks, and the like.
本発明の変異率向上剤は、植物のDNA二本鎖切断の修復時における突然変異率を向上させる。したがって、本発明の変異率向上剤は、植物のDNA二本鎖切断誘発処理を行った場合にその機能を発揮し得る。 The mutation rate improving agent of the present invention improves the mutation rate during repair of DNA double-strand breaks in plants. Therefore, the mutation rate improving agent of the present invention can exert its function when a treatment for inducing DNA double-strand breaks in plants is performed.
二本鎖切断の誘発処理は特に限定されず、例えば重イオンビーム、プロトンイオンビーム、X線、γ線、α線、β線、電子線、陽子線、及び中性子線等の放射線照射、並びにDNA二本鎖切断誘発剤等、好ましくは重イオンビーム照射等が挙げられる。 Treatment for inducing double-strand breaks is not particularly limited. For example, heavy ion beam, proton ion beam, X-ray, γ-ray, α-ray, β-ray, electron beam, proton beam, neutron beam, etc., and DNA Examples include double strand breakage inducers, preferably heavy ion beam irradiation.
重イオンビーム照射を用いる場合、重イオンビームの種類は特に限定されず、例えば、炭素（C）イオンビーム、窒素(N)イオンビーム、アルゴン（Ar）イオンビーム、ネオン（Ne）イオンビーム、鉄（Fe）イオンビーム、好ましくは炭素（C）イオンビームが挙げられる。 When heavy ion beam irradiation is used, the type of heavy ion beam is not particularly limited. For example, carbon (C) ion beam, nitrogen (N) ion beam, argon (Ar) ion beam, neon (Ne) ion beam, iron (Fe) ion beam, preferably carbon (C) ion beam.
重イオンビーム照射におけるLETは、22.5〜80 keV/μmの範囲が好ましく、30〜60 keV/μmの範囲がより好ましい。重イオンビームの照射線量は、用いるイオンビームの種類と対象となる植物種及び組織に応じて決めればよく、照射植物の少なくとも一部が生育可能であり、変異を誘発できる範囲内であれば特に限定されない。本発明の変異率向上剤と併用する場合の重イオンビームの放射線量は、高い頻度で変異を誘発する上で、好ましくは照射植物の8〜9割程度が生存可能である範囲、例えばシロイヌナズナ乾燥種子ではCイオンビーム（LET：30〜50 keV/μm）で30 Gy〜90 Gy、40 Gy〜80 Gy、又は50 Gy〜70 Gy、イネ乾燥種子ではCイオンビーム(LET：30〜60 keV/μm)で10 Gy〜70 Gy、15 Gy〜65 Gy、又は20 Gy〜60 Gy、コムギではCイオンビーム（LET：30〜50 keV/μm）で4 Gy〜40 Gy、5 Gy〜50 Gy、又は6 Gy〜20 Gyが好ましい。 LET in heavy ion beam irradiation is preferably in the range of 22.5 to 80 keV / μm, more preferably in the range of 30 to 60 keV / μm. The irradiation dose of the heavy ion beam may be determined according to the type of ion beam to be used and the target plant species and tissue, and at least a part of the irradiated plant can grow and is particularly within a range where mutation can be induced. It is not limited. The radiation dose of the heavy ion beam when used in combination with the mutation rate improving agent of the present invention is preferably a range in which about 80 to 90% of irradiated plants can survive, for example, dry Arabidopsis thaliana. For seeds, C ion beam (LET: 30 to 50 keV / μm) is 30 Gy to 90 Gy, 40 Gy to 80 Gy, or 50 Gy to 70 Gy. For dry rice seeds, C ion beam (LET: 30 to 60 keV / μm) μm) at 10 Gy to 70 Gy, 15 Gy to 65 Gy, or 20 Gy to 60 Gy, wheat with C ion beam (LET: 30 to 50 keV / μm), 4 Gy to 40 Gy, 5 Gy to 50 Gy, Or 6 Gy-20 Gy are preferable.
放射線照射の種類は特に限定されず、例えばプロトンイオンビーム、X線、γ線、α線、β線、電子線、陽子線、中性子線等でもよい。重イオンビーム以外の放射線照射における好ましい照射線量は、重イオンビームについて記載した通りであるから記載を省略する。 The type of radiation irradiation is not particularly limited, and may be, for example, proton ion beam, X-ray, γ-ray, α-ray, β-ray, electron beam, proton beam, neutron beam, or the like. The preferable irradiation dose in radiation irradiation other than the heavy ion beam is the same as that described for the heavy ion beam, and therefore the description is omitted.
DNA二本鎖切断誘発剤は当業者には知られており、例えばブレオマイシン、ゼオシン、ペプレオマイシン、マイトマイシンC、シスプラチン、メチルメタンスルホネート、及びカンプトテシン等が挙げられる。 DNA double-strand break inducers are known to those skilled in the art and include, for example, bleomycin, zeocin, pepleomycin, mitomycin C, cisplatin, methylmethanesulfonate, and camptothecin.
本発明の変異率向上剤を用いることで、より低いLETの重イオンビーム若しくはプロトンイオンビーム照射、又はより低線量の重イオンビームを含む各種放射線照射、又はより低濃度のDNA二本鎖切断誘発剤で十分に高い突然変異誘発率を達成することができる。これにより、高LETで照射を行うために必要な特別な施設や設備がなくとも効率的に突然変異体植物を作製し得、及び／又は変異体植物の作製のコストを低減し得る。 By using the mutation rate improver of the present invention, irradiation with a lower LET heavy ion beam or proton ion beam, or various irradiations including a lower dose of heavy ion beam, or a lower concentration of DNA double strand break induction A sufficiently high mutagenesis rate can be achieved with the agent. Thereby, a mutant plant can be produced efficiently and / or the cost of producing a mutant plant can be reduced without special facilities and equipment necessary for irradiation with high LET.
本発明の変異率向上剤による突然変異率向上の程度は、特に限定しないが、例えば、本発明の変異率向上剤を用いない場合に比べて、1.5倍以上、2倍以上、2.5倍以上、好ましくは3倍以上、3.5倍以上、4倍以上、4.5倍以上、又は5倍以上であってよく、また20倍以下、15倍以下、又は10倍以下であってよい。植物のDNA二本鎖切断が生じる条件下で本発明の変異率向上剤を用いた場合の植物の突然変異率は、例えば1.5%以上、2%以上、2.5%以上、好ましくは3%以上、3.5%以上、4%以上、4.5%以上、又は5%以上であってよく、また20%以下、15%以下、又は10%以下であってよい。植物の突然変異率は、当業者であれば容易に測定することができる。例えば、本願明細書の実施例に記載の様に、突然変異によりアルビノ等の判別が容易な表現型を生じる植物を用いて、その表現型の出現頻度を調べることで突然変異率を推定することができる。 The degree of mutation rate improvement by the mutation rate improving agent of the present invention is not particularly limited, for example, 1.5 times or more, 2 times or more, 2.5 times or more, compared to the case where the mutation rate improving agent of the present invention is not used, Preferably, it may be 3 times or more, 3.5 times or more, 4 times or more, 4.5 times or more, or 5 times or more, and 20 times or less, 15 times or less, or 10 times or less. The mutation rate of the plant when the mutation rate improving agent of the present invention is used under conditions that cause DNA double-strand breaks in the plant is, for example, 1.5% or more, 2% or more, 2.5% or more, preferably 3% or more, It may be 3.5% or more, 4% or more, 4.5% or more, or 5% or more, and may be 20% or less, 15% or less, or 10% or less. A person skilled in the art can easily determine the mutation rate of a plant. For example, as described in the examples of the present specification, the mutation rate is estimated by examining the frequency of appearance of the phenotype using a plant that produces a phenotype that can be easily discriminated such as albino by mutation. Can do.
３．植物に突然変異を誘発する方法
一態様において、本発明は、植物に突然変異を誘発する方法に関する。本発明の植物に突然変異を誘発する方法は、植物においてC-NHEJを阻害する工程、及び植物に対して二本鎖切断誘発処理を行う工程を含む。
3. Methods for Inducing Mutations in Plants In one aspect, the invention relates to methods for inducing mutations in plants. The method for inducing a mutation in a plant of the present invention comprises a step of inhibiting C-NHEJ in the plant and a step of inducing double-strand breakage on the plant.
C-NHEJを阻害する工程は、例えば本明細書に記載のC-NHEJの阻害物質、又はC-NHEJの阻害物質を含む変異率向上剤で植物を処理することにより行うことができる。本明細書において、「C-NHEJの阻害物質又はC-NHEJの阻害物質を含む変異率向上剤で植物を処理する」とは、例えば、C-NHEJの阻害物質又はC-NHEJの阻害物質を含む変異率向上剤を、好ましくは変異率を向上させるのに有効量で、植物に接触させることを指す。C-NHEJの阻害物質又は変異率向上剤の有効量は、植物種、処理を行う細胞又は組織の種類、二本鎖切断を誘発する処理等に基づいて、当業者であれば適宜決定することができる。あるいは、又はさらに、C-NHEJを阻害する工程は、C-NHEJに関わる遺伝子、例えばKU70、KU80、LIGIV、及びXRCC4、好ましくはKU70及びKU80からなる群から選択される一以上の遺伝子、さらに好ましくはKU70遺伝子を含む一以上の遺伝子を、破壊又は発現抑制することにより行うこともできる。C-NHEJの阻害物質、又はC-NHEJの阻害物質を含む変異率向上剤で植物を処理した場合、変異率の向上は後代植物に及ばず、処理を行った植物に限定されることから、C-NHEJを阻害する工程は、C-NHEJの阻害物質、又はC-NHEJの阻害物質を含む変異率向上剤で植物を処理することにより行うことがより好ましい。 The step of inhibiting C-NHEJ can be carried out, for example, by treating a plant with an inhibitor of C-NHEJ described herein or a mutation rate improving agent containing an inhibitor of C-NHEJ. In the present specification, “treating a plant with a C-NHEJ inhibitor or a mutation rate improving agent containing a C-NHEJ inhibitor” means, for example, a C-NHEJ inhibitor or a C-NHEJ inhibitor It refers to contacting the plant with a mutation rate improver that preferably contains an effective amount to improve the mutation rate. An effective amount of a C-NHEJ inhibitor or mutation rate improving agent is appropriately determined by those skilled in the art based on the plant species, the type of cells or tissues to be treated, the treatment that induces double-strand breaks, etc. Can do. Alternatively or additionally, the step of inhibiting C-NHEJ comprises a gene associated with C-NHEJ, such as one or more genes selected from the group consisting of KU70, KU80, LIGIV, and XRCC4, preferably KU70 and KU80, more preferably Can also be performed by disrupting or suppressing expression of one or more genes including the KU70 gene. When a plant is treated with a C-NHEJ inhibitor or a mutation rate improver containing a C-NHEJ inhibitor, the improvement in the mutation rate is not limited to progeny plants, and is limited to the treated plant. More preferably, the step of inhibiting C-NHEJ is carried out by treating the plant with a C-NHEJ inhibitor or a mutation rate improving agent containing a C-NHEJ inhibitor.
本発明において、遺伝子の破壊又は発現抑制は、当業者に周知の方法により行うことができる。本明細書において、遺伝子の「破壊」は、遺伝子をゲノムから完全に欠失させるものであっても良いし、遺伝子の塩基配列に対して、塩基配列を付加、欠失及び／又は置換することにより、その遺伝子をゲノムに残したまま、その機能を完全に又は部分的に破壊するものであってもよい。遺伝子破壊を生じる塩基配列の変異の例として、フレームシフト変異及びナンセンス変異が挙げられる。遺伝子の発現抑制は、例えばプロモーター及びエンハンサー等の遺伝子の制御配列に対して、塩基配列を付加、欠失及び／又は置換することにより、完全に又は部分的に行うことができる。遺伝子の破壊又は発現抑制は、当業者に周知の方法、例えばアグロバクテリウムを介するT-DNAの挿入、並びにZFN、TALEN、及びCRISPR/Cas9等を利用するゲノム編集技術によって行うことができる。 In the present invention, gene disruption or expression suppression can be performed by methods well known to those skilled in the art. In the present specification, “disruption” of a gene may be one in which the gene is completely deleted from the genome, or addition, deletion, and / or substitution of the base sequence to the base sequence of the gene. Thus, the function may be completely or partially destroyed while leaving the gene in the genome. Examples of nucleotide sequence mutations that cause gene disruption include frameshift mutations and nonsense mutations. Suppression of gene expression can be performed completely or partially by adding, deleting, and / or substituting a base sequence to a gene control sequence such as a promoter and an enhancer. Gene disruption or expression suppression can be performed by methods well known to those skilled in the art, for example, T-DNA insertion via Agrobacterium, and genome editing techniques using ZFN, TALEN, CRISPR / Cas9, and the like.
本方法の二本鎖切断誘発処理工程における二本鎖切断は、特に限定されないが、例えば上記「２．植物のDNA二本鎖切断の修復時における変異率向上剤」に記載の方法を適用することができる。 The double-strand break in the double-strand break inducing treatment step of this method is not particularly limited, but for example, the method described in “2. Mutation rate improving agent during repair of DNA double-strand break in plants” is applied. be able to.
本発明の方法を適用する植物の種類、組織、及び細胞等については上記「２．植物のDNA二本鎖切断の修復時における変異率向上剤」について記載した通りであるからここでは記載を省略する。 The plant types, tissues, cells, etc. to which the method of the present invention is applied are as described above in “2. Mutation rate improving agent at the time of repair of DNA double-strand breaks in plants”. To do.
本発明の突然変異誘発方法は、さらにHRを阻害する工程を含んでよい。HRを阻害する工程は、例えば上記「２．植物のDNA二本鎖切断の修復時における変異率向上剤」に記載のHRの阻害物質、又はHRの阻害物質を含む変異率向上剤で植物を処理することにより行うことができる。本明細書において、「HRの阻害物質又はHRの阻害物質を含む変異率向上剤で植物を処理する」とは、例えば、HRの阻害物質又はHRの阻害物質を含む変異率向上剤を、好ましくは変異率を向上させるのに有効量で、植物に接触させることを指す。HRの阻害物質又は変異率向上剤の有効量は、植物種、処理を行う細胞又は組織の種類、及び二本鎖切断を誘発する処理等に基づいて、当業者であれば容易に決定することができる。あるいは、又はさらに、HRを阻害する工程は、HRに関わる遺伝子、例えばRAD54、RAD51B、RAD51C、RAD51D、RAD52、BRCA1、BRCA2、XRCC2、XRCC3、MMS2、SMC5、SMC6、MUS81、RECQ4A、RAD5A、RAD50、NBS1、MRE11、及びRAD51、好ましくは、RAD54、BRCA2、及びXRCC3からなる群から選択される一以上の遺伝子、さらに好ましくはRAD54遺伝子を含む一以上の遺伝子を破壊又は発現抑制することにより行うこともできる。HRの阻害物質、又はHRの阻害物質を含む変異率向上剤で植物を処理した場合、変異率の向上は後代植物に及ばず、処理を行った植物に限定されることから、HRを阻害する工程は、HRの阻害物質、又はHRの阻害物質を含む変異率向上剤で植物を処理することにより行うことがより好ましい。 The mutagenesis method of the present invention may further comprise a step of inhibiting HR. The step of inhibiting HR is performed by, for example, treating a plant with an inhibitor of HR described in “2. Mutation rate improving agent during repair of DNA double-strand breaks in plants” or a mutation rate improving agent containing an inhibitor of HR. It can be done by processing. In the present specification, “treating a plant with an inhibitor of HR or a mutation rate improving agent containing an inhibitor of HR” preferably refers to, for example, a mutation rate improving agent containing an inhibitor of HR or an inhibitor of HR. Refers to contact with plants in an effective amount to improve the mutation rate. An effective amount of an inhibitor of HR or a mutation rate improving agent can be easily determined by those skilled in the art based on the plant species, the type of cell or tissue to be treated, and the treatment that induces double-strand breaks. Can do. Alternatively, or in addition, the step of inhibiting HR may be performed by using genes associated with HR such as RAD54, RAD51B, RAD51C, RAD51D, RAD52, BRCA1, BRCA2, XRCC2, XRCC3, MMS2, SMC5, SMC6, MUS81, RECQ4A, RAD5A, RAD50, NBS1, MRE11, and RAD51, preferably one or more genes selected from the group consisting of RAD54, BRCA2, and XRCC3, more preferably one or more genes including RAD54 gene may be disrupted or expression suppressed. it can. When a plant is treated with an inhibitor of HR or a mutation rate improver containing an inhibitor of HR, the improvement of the mutation rate does not reach the progeny plant, but is limited to the treated plant, thus inhibiting HR The step is more preferably performed by treating the plant with an inhibitor of HR or a mutation rate improver containing an inhibitor of HR.
本発明の突然変異誘発方法における工程間の順番は、C-NHEJを阻害する工程、及び任意のHRを阻害する工程によって、二本鎖切断誘発処理の後に起こるDNA修復時にC-NHEJ及びHRが阻害される限り、特に限定されない。例えば、C-NHEJを阻害する工程及び任意のHRを阻害する工程は、二本鎖切断誘発処理に先立って、二本鎖切断誘発処理と同時に、二本鎖切断誘発処理の後に行うことができる。HRを阻害する工程が含まれる場合、C-NHEJを阻害する工程とHRを阻害する工程の順番は限定されず、別々に行っても良いし、例えばC-NHEJの阻害物質とHRの阻害物質を含む組成物、例えば本明細書に記載の変異率向上剤で処理することにより同時に行っても良い。 The order between the steps in the mutagenesis method of the present invention is such that C-NHEJ and HR are not damaged during DNA repair following double-strand break induction treatment by inhibiting C-NHEJ and inhibiting any HR. As long as it is inhibited, it is not specifically limited. For example, the step of inhibiting C-NHEJ and the step of inhibiting any HR can be performed prior to the double-strand break induction treatment and simultaneously with the double-strand break induction treatment and after the double-strand break induction treatment. . When the step of inhibiting HR is included, the order of the step of inhibiting C-NHEJ and the step of inhibiting HR is not limited, and may be performed separately. For example, an inhibitor of C-NHEJ and an inhibitor of HR May be performed simultaneously by treating with a composition comprising, for example, a mutation rate improver as described herein.
本発明の突然変異誘発方法により、植物に高率で突然変異を導入することができる。本発明の突然変異誘発方法は、例えば、C-NHEJ及び任意にHRを阻害しない場合に比べて、1.5倍以上、2倍以上、2.5倍以上、好ましくは3倍以上、3.5倍以上、4倍以上、4.5倍以上、又は5倍以上であってよく、また20倍以下、15倍以下、又は10倍以下、高い変異率で植物に突然変異を導入することができる。本発明の突然変異誘発方法における植物の突然変異率は、例えば1.5%以上、2%以上、2.5%以上、好ましくは3%以上、3.5%以上、4%以上、4.5%以上、又は5%以上であってよく、また20%以下、15%以下、又は10%以下であってよい。
本発明の突然変異誘発方法は、植物の品種改良及び機能解析等に利用することができる。
By the mutagenesis method of the present invention, mutations can be introduced into plants at a high rate. The mutagenesis method of the present invention is, for example, 1.5 times or more, 2 times or more, 2.5 times or more, preferably 3 times or more, 3.5 times or more, 4 times as compared with the case where C-NHEJ and optionally HR are not inhibited. As described above, the mutation may be 4.5 times or more, or 5 times or more, and the mutation can be introduced into the plant at a high mutation rate of 20 times or less, 15 times or less, or 10 times or less. The mutation rate of the plant in the mutagenesis method of the present invention is, for example, 1.5% or more, 2% or more, 2.5% or more, preferably 3% or more, 3.5% or more, 4% or more, 4.5% or more, or 5% or more. It may be 20% or less, 15% or less, or 10% or less.
The mutagenesis method of the present invention can be used for plant variety improvement and functional analysis.
４．変異体植物を生産する方法
一態様において、本発明は、上記「３．植物に突然変異を誘発する方法」に記載の方法により植物に突然変異を誘発する工程、及び突然変異を有する植物を単離する工程を含む、変異体植物を生産する方法に関する。
4). Method for Producing Mutant Plant In one aspect, the present invention comprises a step of inducing a mutation in a plant by the method described in “3. Method for Inducing Mutation in a Plant”, and a plant having a mutation. The present invention relates to a method for producing a mutant plant, comprising a step of releasing.
本方法における、突然変異を有する植物を単離する工程は、特に限定しない。例えば、突然変異を有する植物は、突然変異により望ましい形質を示す植物を、その望ましい形質に基づいて選抜することにより単離することができる。望ましい選抜可能な形質は特に限定しないが、除草剤耐性、病害虫耐性、環境ストレス耐性、花の色、及び作物収量等が挙げられる。本単離工程では、異なる遺伝子型を有する複数の変異体植物を単離してもよいし、同一の遺伝子型を有する単一の変異体植物を単離してもよい。 The step of isolating a plant having a mutation in this method is not particularly limited. For example, a plant having a mutation can be isolated by selecting a plant exhibiting a desired trait due to the mutation based on the desired trait. Desirable traits that can be selected are not particularly limited, but include herbicide tolerance, pest tolerance, environmental stress tolerance, flower color, and crop yield. In this isolation step, a plurality of mutant plants having different genotypes may be isolated, or a single mutant plant having the same genotype may be isolated.
＜方法＞
１）植物
重イオンビームを種子に照射後、迅速に変異率を測定するため、照射当代でアルビノ細胞層のセクター変異が観察できる植物を用いた。具体的には、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）のAPG3遺伝子座にビアラホス耐性遺伝子をもつT-DNAが挿入され、ヘテロ接合でAPG3遺伝子を欠損(APG3+/-)する株（CS16118株）をArabidopsis Biological Resource Center (ABRC)から取り寄せた。
<Method>
1) Plant In order to measure the mutation rate quickly after irradiating the heavy ion beam to the seed, a plant that can observe the albino cell layer sector variation was used. Specifically, a strain (CS16118 strain) in which T-DNA having a bialaphos resistance gene is inserted into the APG3 locus of Arabidopsis thaliana and the APG3 gene is deleted heterozygously (APG3 +/- ) (Arabidopsis Biological Resource) Ordered from Center (ABRC).
C-NHEJの欠損株として、C-NHEJに関与するAtKU70遺伝子にT-DNAが挿入されホモ接合でAtKU70遺伝子を欠損する(AtKU70-/-)株(SALK_123114株)をABRCより取り寄せた。 As a C-NHEJ-deficient strain, a strain (AtKU70 − / − ) (SALK_123114 strain) in which T-DNA was inserted into the AtKU70 gene involved in C-NHEJ and homozygous for deletion of the AtKU70 gene (SALK_123114 strain) was ordered from ABRC.
HRの欠損株として、HRに関与するAtRAD54遺伝子にT-DNAが挿入されホモ接合でAtRAD54遺伝子を欠損する(AtRAD54-/-)株(SALK_038057株)をABRCより取り寄せた。 As an HR-deficient strain, a strain (AtRAD54 -/- ) (SALK_038057 strain) in which T-DNA was inserted into the AtRAD54 gene involved in HR and homozygous for deletion of the AtRAD54 gene was obtained from ABRC.
２）交配による植物の作製
SALK_123114株とSALK_038057株とを交配し、後代からAtKU70遺伝子とAtRAD54遺伝子とを供にホモ接合で欠損する株(AtKU70-/-/AtRAD54-/-株)を選抜した。
2) Plant production by crossing
The SALK_123114 strain and the SALK_038057 strain were crossed, and a strain (AtKU70 − / − / AtRAD54 − / − strain) that was homozygous for the AtKU70 gene and the AtRAD54 gene was selected from the progeny.
SALK_123114株とCS16118株とを交配し、後代からAtKU70遺伝子をホモで欠損し、APG3遺伝子をヘテロで欠損する株(AtKU70-/-/APG3+/-株)を選抜し、後代種子を実験に用いた。 SALK_123114 strain and CS16118 strain are crossed, and from the progeny, AtKU70 gene homozygous deficiency and APG3 gene heterozygous deficiency (AtKU70 -/- / APG3 +/- strain) are selected, and progeny seeds are used for experiments It was.
SALK_038057株とCS16118株とを交配し、後代からAtRAD54遺伝子をホモで欠損し、APG3遺伝子をヘテロで欠損する株(AtRAD54-/-/APG3+/-株)を選抜し、後代種子を実験に用いた。 SALK_038057 and CS16118 strains are crossed, and from the progeny, a strain that is deficient in the AtRAD54 gene in homozygote and heterozygous in the APG3 gene (AtRAD54 -/- / APG3 +/- strain) is selected, and progeny seeds are used for experiments It was.
AtKU70-/-/AtRAD54-/-株とCS16118株とを交配し、後代からAtKU70遺伝子及びAtRAD54遺伝子をホモで欠損し、APG3遺伝子をヘテロで欠損する株(AtKU70-/-/AtRAD54-/-/APG3+/-株)を選抜し、後代種子を実験に用いた。 The AtKU70 -/- / AtRAD54 -/- strain and the CS16118 strain are crossed, and from the progeny, the AtKU70 and AtRAD54 genes are homozygous and the APG3 gene is heterozygous (AtKU70 -/- / AtRAD54 -/- / APG3 +/− strain) was selected and progeny seeds were used for the experiment.
各遺伝子へのT-DNAの挿入状況は、以下のようにPCRを行い判定した。
実生の葉から、簡易DNA抽出キット（KaneKa）でDNAを抽出し、表1のプライマーを用いてTks Gflex DNA Polymerase (TaKaRa Bio INC)でPCRを行った。PCR反応サイクルは、94℃3分、(98℃10秒、60℃15秒、68℃30秒)×35サイクルとした。PCR反応産物は、自動電気泳動装置Multina(Shimazu)でDNA2500キット(Shimazu)を用いて解析し、T-DNA Primer Designのホームページ(http://signal.salk.edu/tdnaprimers.2.html)に示されるとおり、900bp程度の断片が検出されれば野生型、410-710bp程度の断片が検出されれば目的の場所にT-DNAが挿入されている遺伝子欠損型として判定した。900bp程度の断片と410-710bp程度の断片が両方検出された場合、野生型とT-DNAが挿入された遺伝子欠損型とのヘテロ接合と判定した。
The insertion status of T-DNA into each gene was determined by PCR as follows.
DNA was extracted from the seedling leaves with a simple DNA extraction kit (KaneKa), and PCR was performed with Tks Gflex DNA Polymerase (TaKaRa Bio INC) using the primers shown in Table 1. The PCR reaction cycle was 94 ° C. for 3 minutes, (98 ° C. for 10 seconds, 60 ° C. for 15 seconds, 68 ° C. for 30 seconds) × 35 cycles. PCR reaction products were analyzed using the DNA2500 kit (Shimazu) with the automated electrophoresis apparatus Multina (Shimazu) and posted on the T-DNA Primer Design website (http://signal.salk.edu/tdnaprimers.2.html). As shown, when a fragment of about 900 bp was detected, it was determined as a wild type, and when a fragment of about 410-710 bp was detected, it was determined as a gene-deficient type in which T-DNA was inserted at the target location. When both a fragment of about 900 bp and a fragment of about 410-710 bp were detected, it was determined that the wild type was heterozygous with the gene-deficient type into which T-DNA was inserted.
３）重イオンビームの照射
種子を1層になるようにプラスティックバッグに密封し、RI beam factory (RIBF)において炭素イオンビーム(LET：30 keV/μm)を60 Gy照射した。
3) Irradiation with heavy ion beam The seed was sealed in a plastic bag so as to be a single layer, and irradiated with 60 Gy of carbon ion beam (LET: 30 keV / μm) at RI beam factory (RIBF).
４）播種、培養
実験に用いた種子には、APG3遺伝子が野生型のもの（APG3+/+)、ヘテロ型のもの（APG3+/-)、ホモ型のもの（APG3-/-)が混在する。変異率測定にAPG3+/-のみを用いるため、以下のようにビアラホスで予備選抜を行った。
4) Seeding and culture Seeds used in the experiment include wild type (APG3 + / + ), heterozygous (APG3 +/- ), and homozygous (APG3 -/- ). To do. Since only APG3 +/- was used for mutation rate measurement, preselection was performed with bialaphos as follows.
重イオンビーム照射後の種子を、3％ショ糖(和光純薬)、0.7%寒天(DUCHEFA Biochemie)、ビアラホスナトリウム(10μg/mL)(和光純薬)を含む1/2MS培地(Murashige and Skoog 1962)に播種し、3日間4℃で静置した後、23℃、16時間明期/8時間暗期、光量約100μmol/m2/secで培養した。 Seeds after irradiation with heavy ion beam were added to 1 / 2MS medium (Murashige and Skoog 1962) containing 3% sucrose (Wako Pure Chemical), 0.7% agar (DUCHEFA Biochemie), bialaphos sodium (10 μg / mL) (Wako Pure Chemical) ), And allowed to stand at 4 ° C. for 3 days, and then cultured at 23 ° C., 16 hours light period / 8 hours dark period, and light intensity of about 100 μmol / m 2 / sec.
培養5日後、ビアラホス耐性を有しかつアルビノでない個体をAPG3+/-として選抜し、ビアラホスナトリウムを含まない培地に移植した。 After 5 days of culturing, individuals having resistance to bialaphos and not albino were selected as APG3 +/- and transferred to a medium not containing bialaphos sodium.
５）変異率の測定
移植8日後に、本葉を観察しアルビノの細胞セクターを有する植物の出現率を変異率として求めた(図1)。変異率測定には、CS16118株を4124個体、AtKU70-/-/APG3+/-株を2982個体、AtRAD54-/-/APG3+/-株を2309個体、AtKU70-/-/AtRAD54-/-/APG3+/-株を2779個体用いた。
5) Measurement of mutation rate Eight days after transplantation, the true leaves were observed, and the appearance rate of plants having an albino cell sector was determined as the mutation rate (FIG. 1). The mutation rate measurement, 4124 individuals CS16118 shares, AtKU70 - / - / APG3 +/- strain 2982 individuals, AtRAD54 - / - / APG3 +/- 2309 individual stocks, AtKU70 - / - / AtRAD54 - / - / 2779 APG3 +/− strains were used.
６）結果の比較と有意差検定
各変異体の変異率を比較し、正規分布に近似した比率の差の検定にて有意差があるかを求めた。
6) Comparison of results and significant difference test The mutation rate of each mutant was compared, and it was determined whether or not there was a significant difference by a ratio difference approximation to a normal distribution.
＜結果＞
C-NHEJ及びHRを抑制しないCS16118株（対照株）の変異率が1.1%であったのに対し、驚くべきことに、C-NHEJを抑制した場合(AtKU70-/-)の変異率は3.7%に有意に上昇し、HRを抑制した場合(AtRAD54-/-）の変異率である2.1%よりも高かった。また、C-NHEJ及びHRの両方を抑制した場合(AtKU70-/-/AtRAD54-/-)には変異率はさらに向上し、5.5%を示した（図1）。
<Result>
The mutation rate of CS16118 strain (control strain) that does not suppress C-NHEJ and HR was 1.1%, but surprisingly, the mutation rate when C-NHEJ was suppressed (AtKU70 -/- ) was 3.7. Significantly increased to 2.1%, higher than the 2.1% mutation rate when HR was suppressed (AtRAD54 -/- ). In addition, when both C-NHEJ and HR were suppressed (AtKU70 − / − / AtRAD54 − / − ), the mutation rate further improved, showing 5.5% (FIG. 1).
本発明により、植物のDNA二本鎖切断の修復時における変異率を向上させ、高効率に突然変異体を生産することができる。本発明は、植物の品種改良及び植物の機能解析等に利用することができる。 According to the present invention, the mutation rate at the time of repair of DNA double-strand breaks in plants can be improved, and mutants can be produced with high efficiency. The present invention can be used for plant variety improvement and plant function analysis.
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|---|---|---|---|---|
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-
2016
- 2016-07-05 JP JP2016133444A patent/JP2018000129A/en active Pending
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