JP2017531437A - プシコースエピメラーゼの発現システムおよびこれを用いたプシコースの生産 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明の一例は、前記プロモーターを含み、コリネバクテリウム属菌株でプシコースエピメラーゼの発現を調節する調節配列を提供するものである。
本発明の他の例は、前記プロモーターまたは調節配列とプシコースエピメラーゼのコーディング配列を含む遺伝子発現カセットを提供するものである。
本発明の他の例は、前記プロモーターまたは調節配列とプシコースエピメラーゼのコーディング配列を含む、コリネバクテリウム属菌株用発現カセットを含むベクターを提供するものである。
本発明の他の例は、前記コリネバクテリウム属菌株を用いて得られたプシコースエピメラーゼ、前記菌株の菌体、前記菌株の培養物、前記菌株の破砕物、および前記破砕物または培養物の抽出物からなる群より選択された1種以上を含む、プシコース生産用組成物を提供する。
他の例は、前記コリネバクテリウム属菌株を用いて得られたプシコースエピメラーゼ、前記菌株の菌体、前記菌株の培養物、前記菌株の破砕物、および前記破砕物または培養物の抽出物からなる群より選択された1種以上を用いて、果糖−含有原料からプシコースを生産する方法を提供する。
大腸菌由来のプロモーターは発現誘導因子の低い透過性と遺伝子発現抑制物質の不在などの理由でコリネバクテリウム属菌株で相対的に低い活性を示し、またコリネバクテリウム属菌株で生産しようとするプシコースエピメラーゼの発現に適した発現システムを提供しようとする。
本発明の一例はコリネバクテリウム属菌株発現用調節配列の核酸分子に関するものであって、高い安定性と活性を有するプシコースエピメラーゼを、GRAS菌株で高い安定性を有しながらも高収率に生産することができるようにする。
前記リボソーム結合領域配列は、少なくとも1回以上、例えば少なくとも1回乃至5回、または2回で含まれてもよい。
前記調節配列は、第1RBS配列および第1スペーサ配列を含むか、第1RBS配列および第1スペーサ配列と第1スペーサの3'−末端に直接またはリンカーを通じて連結される第2リボソーム結合領域を含むか、第1RBS配列および第1スペーサ配列と、第1スペーサの3'−末端に直接またはリンカーを通じて連結される第2RBS配列と第2スペーサ配列を含むことができる。
具体的に、前記調節配列が一つのRBS配列を含む場合、例えば前記調節配列は配列番号1のヌクレオチド配列を含むプロモーター、配列番号2のヌクレオチド配列を含む第1RBS配列および配列番号3乃至配列番号6のヌクレオチド配列から選択されたいずれか一つのヌクレオチド配列を含む第1スペーサを含む核酸分子であってもよい(プロモーター−第1RBS−第1スペーサ)。また、選択的に前記調節配列の第1スペーサの3'末端に連結される1個乃至100個の塩基からなるリンカー配列を含む核酸分子であってもよい(プロモーター−第1RBS−第1スペーサ−リンカー)。
(1)プロモーターの3'末端に直接またはリンカーを通じて連結されたRBSとスペーサ配列を含むもの(例、プロモーター−第1リンカー−第1RBS−第1スペーサ、またはプロモーター−第1RBS−第1スペーサ)、
(2)プロモーターの3'末端に連結されたRBSとスペーサ配列を2回以上繰り返して含むもの(例、プロモーター−第1RBS−第1スペーサ−第2RBS−第2スペーサ)、および
(3)プロモーターの3'末端に連結されたRBSとスペーサ配列を2回以上繰り返して含み、第1スペーサ配列と第2RBSの間に第2リンカーを追加的に含むもの(例、プロモーター−第1RBS−第1スペーサ−第2リンカー配列−第2RBS−第2スペーサ)。
本発明の一例で、前記調節配列に含まれるリボソーム結合領域(RBS)は配列番号2のヌクレオチド配列を含む7乃至20個の塩基からなるものであってもよく、例えば配列番号2の核酸配列である。
例えば、前記変形調節配列が一つのRBS配列を含む場合、前記変形調節配列はプロモーター、第1RBSおよび第1スペーサを含み、前記第1スペーサのヌクレオチド配列の一番目および二番目塩基のTTが、GA、GTまたはGC塩基に置換されたものである変形調節配列であってもよい。
実施例1−1:sodプロモーターを用いたベクター製造
クロストリジウムシンデンス(Clostridium scindens ATCC 35704)に由来したプシコースエピメラーゼの暗号化遺伝子(DPE gene;Gene bank:EDS06411.1)を、大腸菌に最適化して変形した形態のポリヌクレオチドを合成してCDPEと命名した。大腸菌に最適化されたポリヌクレオチド(配列番号36)、コリネバクテリウムのgDNAから確保したsod調節配列(配列番号17:sod promoter−RBS−SPACER R1TT−LINKER)、およびpET21aベクターから確保したT7ターミネーターを含む配列をPCRを通じてそれぞれの鋳型として確保し、これをオーバーラップPCR法で一つの鋳型として連結して、T−ベクタークローニング(T−vector cloning)を通じてpGEM T−easy vectorにクローニングしてポリヌクレオチドの配列を確認し、具体的に前記ポリヌクレオチドは配列番号17のsod調節配列、配列番号36のE.coliに最適化配列であるCDPE配列、およびT7−ターミネーターを含む。
s飽和突然変異誘発(Saturation mutagenesis)を用いたベクター製造を行うために標的部位(target site)を−NN−にしたプライマーを製作した。具体的に、標的部位(Target site)は、クローニングする時追加的に添加した第2RBSとsodプロモーターに前側に位置した第1RBS(GAAGGA)の3'側後部分に位置するTTに定め、この部分を−NN−にしたプライマーを製作した(ゼノテック依頼)。プライマーの配列および飽和突然変異誘発部位(saturation mutagenesis site)、プライマー結合部位(primer binding site)は下記表5に示した。
実施例2−1:大腸菌の形質転換
実施例1で製作したプラスミドを電気穿孔法(electroporation)を用いてE.coli DH10bストレインを形質転換させた。その後、E.coliセルで全体突然変異を対象にスクリーニングを行った。具体的に、1.5mlチューブにカナマイシン(kanamycin)を最終濃度15μg/mlで入れた1ml LB(トリプトン(tryptone)10mg/L、NaCl10mg/L、酵母エキス(yeast extract)5mg/L)を分注した後、プレートから無作為に選別したコロニーを接種し、37℃で約16時間培養した。その後、細胞収穫(cell harvest)を通じて培地を除去し、50mM PIPES緩衝液(pH7.0)に溶かした50%果糖(基質)、1mM Mn2+を添加して60℃で30分間転換反応後、100℃で5分間沸かして反応中止させた。
その後、LC分析を通じてpCES_sodCDPEとのプシコース転換率を比較して、転換率がさらに高い突然変異のみ選定した。具体的に、基質(果糖)と生産物質(プシコース)のピーク確認およびピークのエリア(area)を通じた定量分析する方法で行った。
突然変異を起こさないpCES_sodCDPEのプラスミドに含まれている配列番号3のヌクレオチド配列を基準に、R1−1は1番および2番目の塩基がTTからGAに置換されたものであり、R1−4はTTからGGに置換されたものである。
また、突然変異を起こさないpCES_sodCDPEのプラスミドに含まれている配列番号7のヌクレオチド配列を基準に、R2−5およびR2−11は1番目および2番目の塩基がTTからGGに置換されたものである。
実施例2で選定した4つの突然変異でコリネバクテリウム(corynebacterium)に形質転換を行った後、100ml LBに培養して細胞を確保し、細胞を溶解させた後、His−tag精製を行ってSDS−PAGE上でCDPEの発現率を確認した。
実施例2による4つの突然変異であるR1−1、R1−4、R2−5、およびR2−11でコリネバクテリウム(corynebacterium)に形質転換を行った後、100ml LBに培養して細胞を確保し、精製しない助酵素を用いて、50mM果糖を含有する原料からプシコース生産量を分析した。
転換率(%)=プシコース生産量(g/l)/(プシコース生産量+残っている果糖)(g/l)*100
実施例2による4つの突然変異であるR1−1、R1−4、R2−5およびR2−11でコリネバクテリウム(corynebacterium)に形質転換を行った後、100ml LBに培養して細胞を確保し、細胞反応を用いて固形分含量基準に50重量%果糖を含有する原料からプシコースを生産してプシコース転換率を比較した。
転換率(%)=プシコース生産量(g/l)/(プシコース生産量+残っている果糖)(g/l)*100
プシコースエピメラーゼを高発現率で生産する菌株も重要であるが、安定的に生産する菌株が産業的に有用であるので、プシコースエピメラーゼを生産する菌株自体の熱安定性を確認するために本実験を行った。
7−1:変異調節配列を含むベクター製造
前記変異調節配列を含むプラスミドでコリネバクテリウム(corynebacterium)に形質転換を行った後、100ml LBに培養して細胞を確保し、細胞を溶解させた後、Ni−NTA樹脂でHis−tag精製を行って、総蛋白質の濃度と精製蛋白質(CDPE)の濃度をブラッドフォードアッセイ(Bradford assay)法で測定した後、目的蛋白質の発現率を計算した。具体的に、ビードビーター(Bead beater)を用いて培養した細胞を溶解(lysis)させた後、上澄み液のみ取得してサンプル緩衝液と1:1で混合後、100℃で5分間加熱した。準備したサンプルは12%SDS−PAGEゲル(組成:分離ゲル(running gel)−3.3ml H2O、4.0ml 30%アクリルアミド、2.5ml 1.5Mトリス緩衝液(pH8.8)、100μl 10% SDS、100μl、10% APS、4μl TEMED/スタッキングゲル(stacking gel)−1.4ml H2O、0.33ml 30%アクリルアミド、0.25ml 1.0Mトリス緩衝液(pH6.8)、20μl 10% SDS、20μl 10% APS、2μl TEMED)に180Vで50分程度電気泳動した。図2は本発明の一実施形態によってビードビーター(Bead beater)を用いて培養したコリネバクテリウム(corynebacterium)細胞を溶解させた後、SDS−PAGEを通じて蛋白質の発現量を比較した写真である。
実施例4と実質的に同様な方法で、コリネバクテリウム(corynebacterium)に形質転換を行った後、100ml LBに培養して細胞を確保し、細胞反応を行ってプシコース転換率を比較した。その結果を下記表13に示した。
プシコースエピメラーゼを高発現率で生産する菌株も重要であるが、安定的に生産する菌株が産業的に有用であるので、プシコースエピメラーゼを生産する菌株自体の熱安定性を確認するために本実験を行った。
8−1:変異調節配列を含むベクター製造
第1RBSと第2RBSの部位を指定して飽和突然変異誘発(Saturation mutagenesis)実験を行った結果、第1RBSのTTがCDPEの発現に影響を与える部位とのことを確認し、これに基づいて第1RBSのTTがGT、GC、またはGGに突然変異、および機能が向上した突然変異であるR1−1(第1RBSのTTのGA突然変異)を鋳型にして、第2RBSのTTをGA、GT、GC、またはGGに突然変異させて比較実験を行った。
実施例7−2と実質的に同様な方法で、前記変異調節配列を含むプラスミドでコリネバクテリウム(corynebacterium)に形質転換し、CDPE発現率を測定し、その結果を下記表16に示した。
実施例8−2による二重突然変異体(double mutant)をコリネバクテリウム(corynebacterium)に形質転換を行った後、100ml LBに培養して細胞を確保し、細胞反応を行ってプシコース転換率を比較した。下記表17に示した。
プシコースエピメラーゼを高発現率で生産する菌株も重要であるが、安定的に生産する菌株が産業的に有用であるので、プシコースエピメラーゼを生産する菌株自体の熱安定性を確認するために本実験を行った。
実施例9−1:sodプロモーターを用いたベクター製造
クロストリジウムシンデンス(Clostridium scindens ATCC 35704)に由来したプシコースエピメラーゼの暗号化遺伝子(DPE gene;Gene bank:EDS06411.1)を、大腸菌に最適化して変形した形態のポリヌクレオチドに合成してCDPEと命名した。大腸菌に最適化されたポリヌクレオチド(配列番号36)とコリネバクテリウム(corynebacterium)gDNAとpET21aベクターから確保したsodプロモーター(配列番号17)とT7ターミネーターをPCRを通じてそれぞれの鋳型に確保し、これをオーバーラップPCR法で一つの鋳型に連結してT−ベクタークローニング(T−vector cloning)を通じてpGEM T−easy vectorにクローニングしてポリヌクレオチドの配列を確認し、具体的に前記ポリヌクレオチドは配列番号6のsodプロモーター、配列番号21のE.coliに最適化された配列であるCDPE配列およびT7−ターミネーターを含む。
pCES_sodCDPEII以外び目的蛋白質の発現および活性比較のためにクローニングを行うために次のようなプラスミドも製造した:
pET21a_CDPEからCDPE(配列番号36)をPCRして確保し、pKDベクターにNcoI、SalIでクローニングしてpKD_CDPEを製造し、pKD_CDPEを鋳型ににしてtac2プロモーター(配列番号72)からrrnBターミネーターまでPCRでインサート(insert)を確保した後、pCES208プラスミドにXbaI部位でクローニングしてpCES_tac2CDPEを製造した。前記製造された組換えベクター(pCES_tac2CDPE)の開裂地図を図4に開示した。
pET21a_CDPEからCDPE(配列番号36)をPCRして確保し、pTrc99aベクターにXmaI、HindIIIでクローニングしてpTrc_CDPEを製造し、pTrc_CDPEを鋳型にしてtrcプロモーター(配列番号73)からrrnBターミネーターまでPCRでインサート(insert)を確保した後、pCES208プラスミドにXbaI部位でクローニングしてpCES_trcCDPEを製造した。前記製造された組換えベクター(pCES_trcCDPE)の開裂地図を図5に開示した。
実施例9で製作した4種類のプラスミドを電気穿孔法(electroporation)を用いてコリネバクテリウムグルタミクムを形質転換させた。コロニーを採取(picking)してカナマイシン(Kanamycin)を最終濃度15ug/mlで添加したLB培地(トリプトーン10g/L、NaCl10g/L、酵母抽出物5g/L)4mlに接種した後、培養条件30℃および250rpmで約16時間培養した。その後、前記培養液のうちの1mlを収得して15ug/mlのカナマイシンを含んでいる100ml LB培地に接種して、本培養を16時間以上行った。具体的に、前記実施例9−1の組換えベクター(pCES_sodCDPE)でコリネバクテリウムグルタミクムを形質転換して得られた組換え菌株を大韓民国ソウル市西大門区弘済内2ガギル25に住所をおいた韓国微生物保存センター(Korea Culture Center of Microorganisms、KCCM)に2014年10月29日寄託して寄託番号KCCM11593Pを受けた。
ビードビーター(Bead beater)を用いて培養した細胞を溶解(lysis)させた後、上澄み液のみ取得してサンプル緩衝液と1:1で混合後、100℃で5分間加熱する。準備したサンプルは、12%SDS−PAGEゲル(組成:分離ゲル(running gel)−3.3ml H2O、4.0ml 30%アクリルアミド、2.5ml 1.5Mトリス緩衝液(pH8.8)、100μl 10%SDS、100μl、10%APS、4μl TEMED/スタッキングゲル(stacking gel)−1.4ml H2O、0.33ml 30%アクリルアミド、0.25ml 1.0Mトリス緩衝液(pH6.8)、20μl 10%SDS、20μl 10%APS、2μl TEMED)に180Vで50分程度電気泳動して蛋白質発現を確認する。その結果を図6に示した。
固形分含量基準に50重量%果糖を含有する原料に1mM Mn2+添加した高濃度基質条件に、実施例2で得られたCDPE発現細胞を0.5乃至2mg/mlの濃度でpH7.0PIPES 50mMおよび60℃条件で反応を行った後に100℃で5分間沸かして反応中止した。それぞれの細胞を用いて前記条件で細胞反応を行い、反応時間別にサンプリングした後に、各組換え菌株別プシコース生産量と細胞初期反応速度を計算した。プシコース転換率が直線である区間で単位細胞当り初期反応速度を計算(計算式:単位細胞当り初期反応速度=プシコース生産量(g/l)/時間(min)/反応に使用した細胞の量(g))して次の表20および図7に示した。
プシコースエピメラーゼを高発現率で生産する菌株も重要であるが、安定的に生産する菌株が産業的に有用であるので、プシコースエピメラーゼを生産する菌株自体の熱安定性を確認するために本実験を行った。
実施例9−1:sodプロモーターを用いたベクター製造
クロストリジウムシンデンス(Clostridium scindens ATCC 35704)に由来したプシコースエピメラーゼの暗号化遺伝子(DPE gene;Gene bank:EDS06411.1)を、大腸菌に最適化して変形した形態のポリヌクレオチドに合成してCDPEと命名した。大腸菌に最適化されたポリヌクレオチド(配列番号38)とコリネバクテリウム(corynebacterium)gDNAとpET21aベクターから確保したsodプロモーター(配列番号17)とT7ターミネーターをPCRを通じてそれぞれの鋳型に確保し、これをオーバーラップPCR法で一つの鋳型に連結してT−ベクタークローニング(T−vector cloning)を通じてpGEM T−easy vectorにクローニングしてポリヌクレオチドの配列を確認し、具体的に前記ポリヌクレオチドは配列番号6のsodプロモーター、配列番号38のE.coliに最適化された配列であるCDPE配列およびT7−ターミネーターを含む。
pET21a_CDPEからCDPE(配列番号38)をPCRして確保し、pKDベクターにNcoI、SalIでクローニングしてpKD_CDPEを製造し、pKD_CDPEを鋳型ににしてtac2プロモーター(配列番号72)からrrnBターミネーターまでPCRでインサート(insert)を確保した後、pCES208プラスミドにXbaI部位でクローニングしてpCES_tac2CDPEを製造した。前記製造された組換えベクター(pCES_tac2CDPE)の開裂地図を図4に開示した。
pET21a_CDPEからCDPE(配列番号38)をPCRして確保し、pTrc99aベクターにXmaI、HindIIIでクローニングしてpTrc_CDPEを製造し、pTrc_CDPEを鋳型にしてtrcプロモーター(配列番号73)からrrnBターミネーターまでPCRでインサート(insert)を確保した後、pCES208プラスミドにXbaI部位でクローニングしてpCES_trcCDPEを製造した。前記製造された組換えベクター(pCES_trcCDPE)の開裂地図を図5に開示した。
Claims (40)
- プシコースエピメラーゼを暗号化するヌクレオチド配列;およびその上流(upstream)に作動可能なように連結され、コリネバクテリウム属菌株でプシコースエピメラーゼの発現を調節する調節配列;を含み、
前記調節配列は、配列番号1、63、64または65のヌクレオチド配列を含むプロモーターを含むものである、コリネバクテリウム属菌株でプシコースエピメラーゼを発現する遺伝子発現カセット。 - 前記調節配列は、リボソーム結合領域(ribosome binding region、RBS)配列、スペーサ配列およびリンカー配列からなる群より選択された1種以上の追加配列を含むものである、請求項1に記載の遺伝子発現カセット。
- 前記リボソーム結合領域配列は、配列番号2のヌクレオチド配列を含む7乃至20個の塩基からなるものである、請求項2に記載の遺伝子発現カセット。
- 前記調節配列は、追加的にリボソーム結合領域配列を少なくとも1回乃至5回含むものである、請求項2に記載の遺伝子発現カセット。
- 前記リンカー配列は、5個乃至100個塩基からなるヌクレオチド配列である、請求項2に記載の遺伝子発現カセット。
- 前記第1スペーサ配列は、配列番号3乃至配列番号6のヌクレオチド配列からなる群より選択されるものである、請求項2に記載の遺伝子発現カセット。
- 前記第2スペーサ配列は、配列番号7乃至配列番号11のヌクレオチド配列からなる群より選択されるものである、請求項2に記載の遺伝子発現カセット。
- 前記調節配列は、プロモーター、第1リボソーム結合領域(ribosome binding region、RBS)配列および第1スペーサ配列を含むものである、請求項2に記載の遺伝子発現カセット。
- 前記調節配列は、プロモーター、第1リボソーム結合領域(ribosome binding region、RBS)配列および第1スペーサ配列と、
第1スペーサの3'−末端に直接またはリンカーを通じて連結される第2リボソーム結合領域を含むものである、請求項2に記載の遺伝子発現カセット。 - 前記調節配列は、第1リボソーム結合領域(ribosome binding region、RBS)配列および第1スペーサ配列と、
第1スペーサの3'−末端に直接またはリンカーを通じて連結される第2リボソーム結合領域と第2スペーサ配列を含むものである、請求項2に記載の遺伝子発現カセット。 - 前記調節配列は、
配列番号1のプロモーターヌクレオチド配列、
配列番号2のRBSヌクレオチド配列、および
配列番号3乃至配列番号6のヌクレオチド配列からなる群より選択される第1スペーサ配列を含む、請求項8に記載の遺伝子発現カセット。(promoter−RBS1−Spacer1:TT、GA、GT、GC−RBS) - 前記調節配列は、配列番号13乃至配列番号16からなる配列から選択されたヌクレオチド配列を含むものである、請求項11に記載の遺伝子発現カセット。(promoter−RBS1−Spacer1:TT、GA、GT、GC)
- 前記調節配列は、配列番号13乃至配列番号16からなる配列から選択されたヌクレオチド配列および配列番号12のリンカー配列を含む、請求項9に記載の遺伝子発現カセット。(promoter−RBS1−Spacer1−TT、GA、GT、GC−linker1)
- 前記調節配列は、
配列番号1のプロモーターヌクレオチド配列、
配列番号2のRBSヌクレオチド配列、
配列番号3乃至配列番号6のヌクレオチド配列からなる群より選択される第1スペーサ配列、
配列番号2のRBSヌクレオチド配列、および
配列番号7乃至配列番号11のヌクレオチド配列からなる群より選択される第2スペーサ配列を含む、請求項10に記載の遺伝子発現カセット。(promoter−RBS1−Spacer1:TT、GA、GT、GC−RBS2−spacer2−TT、GA、GT、GC、GG) - 前記調節配列は、配列番号63、64、または65のヌクレオチド配列からなるプロモーター、および前記プロモーターの3'−末端に直接またはリンカーを通じて連結される第1リボソーム結合領域(ribosome binding region、RBS)配列および第2スペーサ配列を含むものである、請求項2に記載の遺伝子発現カセット。
- 前記リンカー配列は配列番号66、67または68のヌクレオチド配列からなる配列であり、第2スペーサ配列は配列番号7乃至11からなる群より選択されたヌクレオチド配列である、請求項15に記載の遺伝子発現カセット。
- 前記コリネバクテリウム属菌株は、コリネバクテリウムグルタミクム(Corynebacterium glutamicum)、コリネバクテリウムアセトグルタミクム(acetoglutamicum)、コリネバクテリウムアセトアシドフィルム(acetoacidophilum)、コリネバクテリウムサーモアミノゲネス(thermoaminogenes)、コリネバクテリウムメラセコラ(melassecola)およびコリネバクテリウムエフィシエンス(efficiens)からなる群より選択された1種以上である、請求項1に記載の遺伝子発現カセット。
- 前記プシコースエピメラーゼは、クロストリジウムシンデンス(Clostridium scidens)、トレポネーマプリミティア(Treponema primitia)、エンシフェルアダエレンス(Ensifer adhaerens)またはルミノコッカストルクエス(Ruminococcus torques)に由来したものである、請求項1に記載の遺伝子発現カセット。
- 前記プシコースエピメラーゼを暗号化するヌクレオチド配列は、配列番号33乃至配列番号36のアミノ酸配列からなる群より選択されたアミノ酸配列を含むペプチドをコーディングするヌクレオチド配列である、請求項18に記載の遺伝子発現カセット。
- 前記プシコースエピメラーゼを暗号化するヌクレオチド配列は、配列番号37乃至配列番号44のヌクレオチド配列からなる群より選択されたヌクレオチド配列である、請求項19に記載の遺伝子発現カセット。
- 請求項1による発現カセットを含むベクター。
- 目的ポリヌクレオチド配列の上流に位置し、前記目的ポリヌクレオチド配列の発現を調節する調節配列を含み、
前記調節配列は、配列番号1、63、64または65のヌクレオチド配列を含むプロモーター、第1リボソーム結合領域(ribosome binding region、RBS)配列および第1スペーサ配列を含むものである、ベクター。 - 前記リボソーム結合領域配列は、配列番号2のヌクレオチド配列を含む7乃至20個の塩基からなり、リボソーム結合領域配列を少なくとも1回乃至5回含むものである、請求項22に記載のベクター。
- 前記調節配列は、プロモーター、第1リボソーム結合領域(ribosome binding region、RBS)配列および第1スペーサ配列と、第1スペーサの3'−末端に直接またはリンカーを通じて連結される第2リボソーム結合領域を含むものである、請求項22に記載のベクター。
- 前記調節配列は、第1リボソーム結合領域(ribosome binding region、RBS)配列および第1スペーサ配列と、
第1スペーサの3'−末端に直接またはリンカーを通じて連結される第2リボソーム結合領域と第2スペーサ配列を含むものである、請求項22に記載のベクター。 - 前記第1スペーサ配列は、配列番号3のヌクレオチド配列中の一番目および二番目の塩基がGA、GTまたはGCに置換された塩基を含むものである、請求項22乃至24のうちのいずれか一項に記載のベクター。
- 前記第1スペーサ配列は配列番号3のヌクレオチド配列中の一番目および二番目の塩基がTTであり、第2スペーサ配列は配列番号7のヌクレオチド配列中の一番目および二番目の塩基がGA、GT、GCまたはGGに置換された塩基を含むものである、請求項25に記載のベクター。
- 前記第1スペーサ配列は配列番号3のヌクレオチド配列中の一番目および二番目の塩基がGA、GTおよびGCからなる群より選択される塩基に置換され、第2スペーサ配列は配列番号7のヌクレオチド配列中の一番目および二番目の塩基がTT、GA、GT、GCおよびGGからなる群より選択される塩基に置換されたものである、請求項25に記載のベクター。
- 前記調節配列は、配列番号14、15または16のヌクレオチド配列を有するものである、請求項26に記載のベクター。
- 前記調節配列は、配列番号18乃至32からなる群より選択されるものである、請求項28に記載のベクター。
- 前記リンカー配列は、5個乃至100個の塩基からなるヌクレオチド配列である、請求項24または25に記載の遺伝子発現カセット。
- 前記ベクターは、複製起点、リーダー(leader)、選択可能なマーカ、クローニング部位および制限酵素認識部位からなる群より選択された1種以上の配列を追加的に含むものである、請求項22に記載のベクター。
- 請求項1による遺伝子発現カセットまたは前記発現カセットを含むベクターで形質転換されたものである、組換えコリネバクテリウム属宿主細胞。
- 前記コリネバクテリウム属宿主細胞は、コリネバクテリウムグルタミクム(glutamicum)、コリネバクテリウムアセトグルタミクム(acetoglutamicum)、コリネバクテリウムアセトアシドフィルム(acetoacidophilum)、コリネバクテリウムサーモアミノゲネス(thermoaminogenes)、コリネバクテリウムメラセコラ(melassecola)およびコリネバクテリウムエフィシエンス(efficiens)からなる群より選択された1種以上であるものである、請求項33に記載の組換えコリネバクテリウム属宿主細胞。
- 請求項1による遺伝子発現カセットまたは前記発現カセットを含むベクターで形質転換されたものである組換えコリネバクテリウム属宿主細胞を用いて得られたプシコースエピメラーゼ、前記細胞の菌体、前記細胞の培養物、前記細胞の破砕物、および前記破砕物または培養物の抽出物からなる群より選択された1種以上を含むものである、プシコース生産用組成物。
- 請求項1による遺伝子発現カセットを含むベクターで形質転換された組換えコリネバクテリウム属宿主細胞を培養し、
前記細胞の培養物から得られたプシコースエピメラーゼ、前記細胞の菌体、前記細胞の培養物、前記細胞の破砕物、および前記破砕物または培養物の抽出物からなる群より選択された1種以上を果糖−含有原料と反応してプシコースを生産する方法。 - 前記プシコースエピメラーゼまたは前記細胞の菌体が固定化された担体に、果糖−含有原料を接触させてプシコースを生産するものである、請求項36に記載の方法。
- 前記方法は、銅、マンガン、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、ニッケル、コバルト、鉄およびアルミニウムからなる群より選択された1種以上の金属イオンを添加する段階を追加的に含むものである、請求項36に記載のプシコースを生産する方法。
- 前記果糖−含有原料は、果糖を40乃至75%(w/w)の濃度で含むものである、請求項36に記載のプシコースを生産する方法。
- 前記方法は、pH6乃至9および40乃至80℃の条件下で行われるものである、請求項36に記載のプシコースを生産する方法。
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CN108588149B (zh) * | 2017-10-29 | 2022-06-10 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一种阿果糖浆及其制备方法 |
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CN114350699B (zh) * | 2021-12-02 | 2024-03-26 | 江南大学 | 一株产d-阿洛酮糖3-差向异构酶的菌株及其应用 |
Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2008126896A1 (ja) * | 2007-04-10 | 2008-10-23 | Ajinomoto Co., Inc. | 有機酸の製造方法 |
JP2009501547A (ja) * | 2005-07-18 | 2009-01-22 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア | 微生物におけるメチオニン生産を改善するためのバチルス属metI遺伝子の使用 |
KR20110041910A (ko) * | 2009-10-16 | 2011-04-22 | 경상대학교산학협력단 | 사이코스 3-에피머라제 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 대장균 및 그를 이용하여 사이코스를 생산하는 방법 |
JP2013501519A (ja) * | 2009-09-30 | 2013-01-17 | シージェイ チェルジェダン コーポレイション | プシコースエピメラーゼの固定化及びそれを用いたプシコースの製造方法 |
KR101318422B1 (ko) * | 2013-04-09 | 2013-10-15 | 주식회사 삼양제넥스 | D-사이코스 에피머화 효소, 및 이를 이용하는 사이코스 생산방법 |
KR20130130377A (ko) * | 2012-05-22 | 2013-12-02 | 백광산업 주식회사 | 코리네형 세균 유래 sod 유전자의 프로모터 변이체 및 상기 프로모터 변이체를 이용한 L-라이신의 생산 방법 |
KR20140021974A (ko) * | 2012-08-10 | 2014-02-21 | 주식회사 삼양제넥스 | 사이코스 에피머화 효소 및 이를 이용한 사이코스로 전환용 조성물 |
KR20140080282A (ko) * | 2012-12-20 | 2014-06-30 | 주식회사 삼양제넥스 | D-사이코스 3-에피머화 효소를 이용한 과당으로부터 사이코스의 제조방법 |
Family Cites Families (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3053884A (en) * | 1959-10-09 | 1962-09-11 | Eastman Kodak Co | Esterification by means of methane disulfonic acid and methane trisulfonic acid catalysts |
US5629189A (en) * | 1983-10-03 | 1997-05-13 | Chiron Corporation | DNA encoding human cytoplasmic Cu/Zn superoxide dismutase |
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KR100620092B1 (ko) | 2004-12-16 | 2006-09-08 | 씨제이 주식회사 | 코리네박테리움 속 세포로부터 유래된 신규한 프로모터서열, 그를 포함하는 발현 카세트 및 벡터, 상기 벡터를포함하는 숙주 세포 및 그를 이용하여 유전자를 발현하는방법 |
KR100744479B1 (ko) | 2005-06-01 | 2007-08-01 | 씨제이 주식회사 | 사이코스 에피머화 효소에 의한 사이코스의 생산 방법 |
WO2009112587A2 (en) * | 2008-03-14 | 2009-09-17 | Merck Serono S.A. | Variation of recombinant expression titres by optimising bacterial ribosome binding sites |
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WO2013085361A2 (ko) | 2011-12-07 | 2013-06-13 | 한국과학기술원 | 4-하이드록시부티릭산 고생성능을 가지는 변이 미생물 및 이를 이용한 4-하이드록시부티릭산의 제조방법 |
KR101504900B1 (ko) | 2013-06-27 | 2015-03-23 | 백광산업 주식회사 | 트랜스케톨라아제 유전자 프로모터 변이체 및 이의 용도 |
KR101473918B1 (ko) | 2014-05-28 | 2014-12-17 | 대상 주식회사 | 사이코스 에피머화 효소, 이의 제조방법 및 이를 이용한 사이코스의 제조방법 |
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2019
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Patent Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009501547A (ja) * | 2005-07-18 | 2009-01-22 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア | 微生物におけるメチオニン生産を改善するためのバチルス属metI遺伝子の使用 |
WO2008126896A1 (ja) * | 2007-04-10 | 2008-10-23 | Ajinomoto Co., Inc. | 有機酸の製造方法 |
JP2013501519A (ja) * | 2009-09-30 | 2013-01-17 | シージェイ チェルジェダン コーポレイション | プシコースエピメラーゼの固定化及びそれを用いたプシコースの製造方法 |
KR20110041910A (ko) * | 2009-10-16 | 2011-04-22 | 경상대학교산학협력단 | 사이코스 3-에피머라제 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 대장균 및 그를 이용하여 사이코스를 생산하는 방법 |
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