JP2017523813A - Hlaをコードする遺伝子のヌクレアーゼ媒介編集により作製される免疫適合性細胞 - Google Patents
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Abstract
Description
以下において、本発明を実施例により詳細に説明する。しかしながら、実施例は本発明を例示することのみが意図され、本発明を限定することは意図されない。
細胞培養
hESCおよびiPSCを、Geltrex(Invitrogen社)コーティングしたプレート上で、10μM ROCK阻害剤Y27632(Santa Cruz社)を添加したE8培地(Invitrogen社)中にて24時間維持した。細胞を、4日間〜5日間毎にEDTAを用いて継代した。
RNAを、製造業者のマニュアルに従って、MEGAshortscript T7キット(Ambion社)を用いてin vitroで転写させた。sgRNAのための鋳型は、2種類の相補的オリゴヌクレオチドのアニーリングおよび伸長により生成させた。ガイドRNA配列は、標的DNAの同じ配列を有し、かつその配列の3'末端が「NGG」である23nt配列である。
hESCおよびiPSCを、製造業者のプロトコールに従ってプログラムCB-150を用いてAmaxa P3 Primary Cell 4DNucleofector Kitによりトランスフェクトした。簡潔には、2×105個の細胞に、in vitroで転写したsgRNA(40μg)と予め混合したToolgen社からのCas9タンパク質(30μg)をトランスフェクトした。Cas9タンパク質を、ヌクレアーゼ不含水に溶解させたsgRNAと混合し、室温で10分間インキュベートした。10μL以下のCas0-sgRNA混合物を100μLのNucleofection溶液に添加した。細胞を、トランスフェクションの3日後に分析した。
ゲノムDNAを、DNeasy Blood & Tissue Kit(QIAGEN社)を用いて抽出した。Cas9標的部位を含むPCRアンプリコンを、PicoMaxx High Fidelity PCR system(Agilent社)を用いて生成させた。PCRアンプリコンを加熱により変性させ、サーマルサイクラーを用いて、ヘテロ二重鎖DNAを形成させるためにアニーリングさせ、続いてT7エンドヌクレアーゼ1(New England Biolabs社)を用いて37℃で20分間消化し、次にアガロースゲル電気泳動を用いて分析した。配列決定分析のために、PCR産物を、TAクローニングベクター(pGEM-T Easy Vector;Promega社)を用いるサブクローニングのために用いた。再構築されたプラスミドを精製し、個々のクローンを配列決定した(Macrogen社)。
アルカリホスファターゼ染色は、Alkaline Phosphatasees Staining Kit II(Stemgent社)を製造業者の使用説明書に従って用いて行なった。細胞を、4%パラホルムアルデヒド中で固定し、Tris緩衝生理食塩液/0.05%Tween 20(Sigma社)を用いて洗浄し、AP染色溶液を用いて染色した。
hESCを、4%ホルムアルデヒドを用いて固定し、リン酸緩衝生理食塩液(PBS;Invitrogen社)中の0.1%Triton X-100を用いて室温にて30分間透過処理した。続いて、細胞を、PBS中の0.03%Triton X-100(洗浄バッファー)を用いて洗浄した。固定したサンプルを、洗浄バッファー中に溶解させた5%ウシ血清アルブミン溶液を用いて1時間ブロッキングし、それから一次抗体と共に4℃にて24時間インキュベートした。サンプルを、洗浄バッファーを用いて洗浄し、続いて FITCコンジュゲート化二次抗体(Molecular Probes社)と共に2時間インキュベートした。スライドを、細胞核を染色するためにDAPI(Vector Laboratories社)を用いて対比染色した。
標的結合(on-target)部位および考えられる標的解離(off-target)部位に及ぶゲノムDNAセグメントを、Phusionポリメラーゼ(New England BioLabs社)を用いて増幅した。生じたPCRアンプリコンを、Illumina MiSeqを用いるペアエンドシーケンス(paired-end sequencing)に供した。
核型決定は、GenDix社により分析した。
ヒト白血球抗原(HLA)-A遺伝子、HLA-B遺伝子およびHLA-DR遺伝子がヘテロ接合遺伝子型を有する単離細胞中でのゲノム編集を通じて、HLA-A遺伝子、HLA-B遺伝子およびHLA-DRB1遺伝子の単一対立遺伝子ノックアウトを、ヌクレアーゼを用いて行ない、それにより、HLA-A遺伝子、HLA-B遺伝子およびHLA-DRB1遺伝子がホモ接合様特性を有する8種類の細胞を構築した。上記のプロセスは、図2の模式図に示した。
HLA-A遺伝子、HLA-B遺伝子およびHLA-DRB1遺伝子がヘテロ接合遺伝子型を有する単離細胞中でのゲノム編集を通じて、HLA-DRB1遺伝子の1対の対立遺伝子を除去し、HLA-A遺伝子およびHLA-B遺伝子の単一対立遺伝子ノックアウトを、ヌクレアーゼを用いて行ない、それにより、HLA-A遺伝子およびHLA-B遺伝子がホモ接合様特性を有する4種類の細胞を構築した。上記のプロセスは、図3の模式図に示した。
Cas9タンパク質およびDRB1 gRNAを発現するプラスミドDNAを、エレクトロポレーションによりヒト誘導型多能性幹細胞#12(iPSC#12)に送達した。続いて、iPSC#12由来の得られたコロニーのゲノムDNAを抽出した。その後、DRB1遺伝子内の標的配列でindel(挿入または欠失)が誘導されたかを、T7エンドヌクレアーゼI(T7E1)突然変異検出アッセイにより分析して、結果を図4に示す。
プラスミドDNAではなく、Cas9タンパク質およびHLA-DRB1 gRNAを、エレクトロポレーションによりヒト誘導型多能性幹細胞#8(iPSC#8)に送達した。続いて、iPSC#8由来の得られたコロニーのゲノムDNAを抽出した。その後、HLA-DRB1遺伝子内の標的配列でindel(挿入または欠失)が誘導されたかを、T7エンドヌクレアーゼI(T7E1)突然変異検出アッセイにより分析して、結果を図5に示す。
クラスIIタンパク質は、主にBリンパ球、マクロファージ、および樹状細胞で発現される。クラスIとは異なり、その欠損は、NK細胞媒介細胞溶解を惹起しない。したがって、本発明者らは、完全ノックアウト型Drb1 hESCを作製した。
4種類のHLA-AおよびBホモ接合体細胞株を得るために、本発明者らは次に、Dr1b KOクローンでHLA-AおよびHLA-Bを標的化した。
Claims (25)
- ヒト白血球抗原(HLA)-A、HLA-BおよびHLA-DRから選択される免疫適合性抗原遺伝子のうちの少なくとも1種がヘテロ接合遺伝子型を有する、単離された細胞中での遺伝子欠失または改変により、1種以上の免疫適合性抗原遺伝子の1個または2個の対立遺伝子を編集するステップを含む、免疫適合性細胞の作製方法。
- 免疫適合性抗原遺伝子HLA-AおよびHLA-Bのうちの少なくとも1種がヘテロ接合遺伝子型を有する、単離された細胞中での遺伝子欠失または改変により、1種以上の免疫適合性抗原遺伝子の1個または2個の対立遺伝子を編集するステップを含む、請求項1に記載の免疫適合性細胞の作製方法。
- 遺伝子欠失が遺伝子ノックアウトにより行われる、請求項1に記載の免疫適合性細胞の作製方法。
- 遺伝子改変が遺伝子ノックインを介して行われる、請求項1に記載の免疫適合性細胞の作製方法。
- 遺伝子編集が、HLA-A特異的遺伝子操作ヌクレアーゼ、HLA-B特異的遺伝子操作ヌクレアーゼ、またはHLA-DR特異的遺伝子操作ヌクレアーゼを用いて行われる、請求項1に記載の免疫適合性細胞の作製方法。
- 遺伝子操作ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、およびRNA誘導型遺伝子操作ヌクレアーゼ(RGEN)からなる群より選択される、請求項5に記載の免疫適合性細胞の作製方法。
- RGENが、HLA-A遺伝子、HLA-B遺伝子、またはHLA-DR遺伝子の特定の配列に特異的に結合するガイドRNA、およびCasタンパク質を含む、請求項6に記載の免疫適合性細胞の作製方法。
- 遺伝子編集が、HLA-A遺伝子、HLA-B遺伝子、もしくはHLA-DR遺伝子の特定の配列に特異的に結合するガイドRNA、またはガイドRNAをコードするDNA;およびCasタンパク質をコードする核酸またはCasタンパク質それ自体を細胞に導入するステップにより行われる、請求項7に記載の免疫適合性細胞の作製方法。
- ガイドRNAが、crRNAおよびtracrRNAを含む二重RNA、または一本鎖ガイドRNAの形態である、請求項8に記載の免疫適合性細胞の作製方法。
- Casタンパク質がCas9タンパク質である、請求項8に記載の免疫適合性細胞の作製方法。
- Casタンパク質がストレプトコッカス属(Streptococcus)に由来する、請求項8に記載の免疫適合性細胞の作製方法。
- 免疫適合性細胞中の免疫適合性抗原遺伝子がホモ接合様または半接合である、請求項1に記載の免疫適合性細胞の作製方法。
- HLA-A遺伝子、HLA-B遺伝子、およびHLA-DR遺伝子すべてがヘテロ接合遺伝子型を有する、単離された細胞中での遺伝子編集により、HLA-A遺伝子、HLA-B遺伝子およびHLA-DR遺伝子のいずれかの単一対立遺伝子ノックアウトを行なうステップを含む、請求項1に記載の免疫適合性細胞の作製方法。
- HLA-DR遺伝子の1対の対立遺伝子のノックアウトを行なうステップ、ならびにHLA-A遺伝子およびHLA-B遺伝子の一方または両方がヘテロ接合である単離された細胞中での遺伝子編集によりHLA-A遺伝子およびHLA-B遺伝子のいずれかの1個もしくは2個の対立遺伝子を除去または改変するステップを含む、請求項1または2に記載の免疫適合性細胞の作製方法。
- 細胞が幹細胞または体細胞である、請求項1に記載の免疫適合性細胞の作製方法。
- 幹細胞が、誘導型多能性幹細胞、胚性幹細胞、体細胞核移植由来胚性幹細胞、または成体幹細胞である、請求項15に記載の免疫適合性細胞の作製方法。
- 遺伝子編集により、HLA-C、HLA-DP、およびHLA-DQから選択される1種以上の遺伝子の対立遺伝子を除去するステップをさらに含む、請求項1に記載の免疫適合性細胞の作製方法。
- 免疫適合性細胞を含む細胞集団を作製するためのものである、請求項1に記載の免疫適合性細胞の作製方法。
- 作製された細胞のHLA型を分析するステップをさらに含む、請求項1に記載の免疫適合性細胞の作製方法。
- 請求項1〜19のいずれか1項に記載の方法により作製される免疫適合性細胞を含む細胞集団。
- 以下のステップ:
(a) ヒト白血球抗原(HLA)-A、HLA-BおよびHLA-DRから選択される免疫適合性抗原遺伝子のうちの少なくとも1種がヘテロ接合遺伝子型を有する、単離された細胞中での遺伝子欠失または改変により、1種以上の免疫適合性抗原遺伝子の1個または2個の対立遺伝子を編集するステップ;および
(b) ステップ(a)で作製される細胞を収集するステップ
を含む、免疫適合性細胞集団の作製方法。 - ステップ(a)を行なった後でステップ(b)を行なう前に、以下のステップ:
(a’) ステップ(a)から取得される単離細胞のHLA遺伝子型を特定するステップ
をさらに含む、請求項21に記載の免疫適合性細胞集団の作製方法。 - ヒト白血球抗原(HLA)-A、HLA-BおよびHLA-DRから選択される免疫適合性抗原遺伝子のうちの少なくとも1種を含む単離された細胞での遺伝子欠失または改変により、1種以上の免疫適合性抗原遺伝子の1個または2個の対立遺伝子を編集するステップを含む、免疫適合性細胞の作製方法。
- 単離された細胞が、ヘテロ接合またはホモ接合である免疫適合性抗原遺伝子を含むことができる、請求項23に記載の免疫適合性細胞の作製方法。
- 編集ステップが2個の対立遺伝子の編集を含むことができる、請求項23に記載の免疫適合性細胞の作製方法。
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