JP2017522861A - Anti-GPC3 antibody and immunoconjugate - Google Patents

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Abstract

本発明は、抗ＧＰＣ３抗体及びイムノコンジュゲートならびにその使用方法を提供する。【選択図】図８The present invention provides anti-GPC3 antibodies and immunoconjugates and methods of use thereof. [Selection] Figure 8

Description

本発明は、抗ＧＰＣ３抗体及びイムノコンジュゲートならびにその使用方法に関する。   The present invention relates to anti-GPC3 antibodies and immunoconjugates and methods of use thereof.

グリピカン−３（ＧＰＣ３）は、グリピカンファミリーのメンバーであり、グリコシルホスファチジルイノシトールアンカーを介して細胞表面に結合したヘパラン硫酸プロテオグリカンである。ＧＰＣ３は、肝細胞癌生検の７０％超に高く発現するが、隣接した非腫瘍組織に発現しないことが示されている。ＧＰＣ３−陰性ＨＣＣ患者よりＧＰＣ３−陽性ＨＣＣ患者の無病生存率の方が、有意に低い。   Glypican-3 (GPC3) is a member of the glypican family and is a heparan sulfate proteoglycan linked to the cell surface via a glycosylphosphatidylinositol anchor. GPC3 has been shown to be highly expressed in over 70% of hepatocellular carcinoma biopsies but not in adjacent non-tumor tissues. The disease-free survival rate of GPC3-positive HCC patients is significantly lower than that of GPC3-negative HCC patients.

ＧＰＣ３−関連状態、例えば、癌の診断及び治療のためにＧＰＣ３を標的とする安全で効果的な薬剤の技術が必要である。本発明は、その必要性を満たし、他の利益を提供する。   There is a need for safe and effective drug technologies that target GPC3 for the diagnosis and treatment of GPC3-related conditions such as cancer. The present invention fulfills that need and provides other benefits.

本発明は、抗ＧＰＣ３抗体及びイムノコンジュゲートならびにその使用方法を提供する。   The present invention provides anti-GPC3 antibodies and immunoconjugates and methods of use thereof.

いくつかの実施形態では、ＧＰＣ３に結合する分離抗体が提供される。いくつかの実施形態では、抗体が、ＧＰＣ３に結合し、以下の特性の１つ以上を有する。
ａ）遺伝子組換えヒトＧＰＣ３に結合する；
ｂ）遺伝子組換えシノモルグスサルＧＰＣ３に結合する；
ｃ）ＨｅｐＧ２細胞の表面上の内因性ＧＰＣ３に結合する；
ｄ）２９３細胞の表面上に発現したシノモルグスサルＧＰＣ３に結合する；
ｅ）癌細胞の表面上の内因性ＧＰＣ３に結合する；
ｆ）肝細胞癌細胞の表面上の内因性ＧＰＣ３に結合する；
ｇ）ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ、Ｈｕｈ７、及びＪＨＨ−７から選択される細胞株の細胞の表面上の内因性ＧＰＣ３に結合する；
ｈ）ヒトＧＰＣ３のアミノ酸２５〜１３７内のエピトープに結合する；
ｉ）ヒトＧＰＣ３のアミノ酸Ｒ３５８／Ｓ３５９でフーリン切断部位にまたがるエピトープに結合する；
ｊ）完全長成熟ヒトＧＰＣ３（例えば、配列番号：１のアミノ酸２５〜５６０またはアミノ酸２５〜５８０）に結合するが、ヒトＧＰＣ３（配列番号：１のアミノ酸２５〜３５８）のＮ−末端フラグメントまたはヒトＧＰＣ３（配列番号：１のアミノ酸３５９〜５６０またはアミノ酸３５９〜５８０）のＣ−末端フラグメントに結合しない；
ｋ）ヒトＧＰＣ３のアミノ酸４２０〜４７０内のエピトープに結合する；
ｌ）ヒトＧＰＣ３のアミノ酸４７０〜５０９内のエピトープに結合する；
ｍ）抗体７Ｈ１によりヒトＧＰＣ３への結合と競合する；
ｎ）抗体４Ｇ７によりヒトＧＰＣ３への結合と競合する；
ｏ）抗体１５Ｇ１によりヒトＧＰＣ３への結合と競合する；及び／または
ｐ）抗体４Ａ１１によりヒトＧＰＣ３への結合と競合する。 In some embodiments, an isolated antibody that binds to GPC3 is provided. In some embodiments, the antibody binds to GPC3 and has one or more of the following properties.
a) binds to recombinant human GPC3;
b) binds to recombinant Cynomolgus monkey GPC3;
c) binds to endogenous GPC3 on the surface of HepG2 cells;
d) binds to Cynomolgus monkey GPC3 expressed on the surface of 293 cells;
e) binds to endogenous GPC3 on the surface of cancer cells;
f) binds to endogenous GPC3 on the surface of hepatocellular carcinoma cells;
g) binds to endogenous GPC3 on the surface of cells of a cell line selected from HepG2, Hep3B, Huh7, and JHH-7;
h) binds to an epitope within amino acids 25-137 of human GPC3;
i) binds to an epitope spanning the furin cleavage site at amino acids R358 / S359 of human GPC3;
j) N-terminal fragment of human GPC3 (amino acids 25-358 of SEQ ID NO: 1) or human that binds to full-length mature human GPC3 (eg, amino acids 25-560 of SEQ ID NO: 1 or amino acids 25-580) Does not bind to the C-terminal fragment of GPC3 (amino acids 359 to 560 or amino acids 359 to 580 of SEQ ID NO: 1);
k) binds to an epitope within amino acids 420-470 of human GPC3;
l) binds to an epitope within amino acids 470-509 of human GPC3;
m) competes with antibody 7H1 for binding to human GPC3;
n) competes with antibody 4G7 for binding to human GPC3;
o) compete with binding to human GPC3 by antibody 15G1; and / or p) compete with binding to human GPC3 by antibody 4A11.

いくつかの実施形態では、ヒトＧＰＣ３が、配列番号：１の配列（完全長ＧＰＣ３前駆体）を含む、または配列番号：１のアミノ酸２５〜５８０（完全長成熟ＧＰＣ３）を含む。   In some embodiments, human GPC3 comprises the sequence of SEQ ID NO: 1 (full length GPC3 precursor), or comprises amino acids 25-580 of SEQ ID NO: 1 (full length mature GPC3).

いくつかの実施形態では、ヒトＧＰＣ３を結合する分離抗体が提供され、抗体が、以下から選択されるエピトープに結合する。
ａ）ヒトＧＰＣ３のアミノ酸２５〜１３７内のエピトープ；
ｂ）ヒトＧＰＣ３のアミノ酸Ｒ３５８／Ｓ３５９でフーリン切断部位にまたがるエピトープ；
ｃ）ヒトＧＰＣ３のアミノ酸４２０〜４７０内のエピトープ；及び
ｄ）ヒトＧＰＣ３のアミノ酸４７０〜５０９内のエピトープ。 In some embodiments, an isolated antibody that binds human GPC3 is provided, wherein the antibody binds to an epitope selected from:
a) an epitope within amino acids 25-137 of human GPC3;
b) an epitope spanning the furin cleavage site at amino acids R358 / S359 of human GPC3;
c) an epitope within amino acids 420-470 of human GPC3; and d) an epitope within amino acids 470-509 of human GPC3.

いくつかの実施形態では、ヒトＧＰＣ３を結合する分離抗体が提供され、抗体が、ヒトＧＰＣ３のアミノ酸２５〜１３７内のエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、抗体が、シノモルグスサル、マウス、及びラットから選択される少なくとも１つの種に由来するＧＰＣ３に結合する。いくつかの実施形態では、抗体が、シノモルグスサル、マウス、及びラットに由来するＧＰＣ３に結合する。いくつかの実施形態では、抗体が、配列番号：６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号：９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２を含む。いくつかの実施形態では、抗体が、配列番号：４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び配列番号：６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体が、配列番号：７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号：８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号：９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体が、（ａ）配列番号：２のアミノ酸配列と少なくとも９５％配列同一性を有するＶＨ配列；（ｂ）配列番号：３のアミノ酸配列と少なくとも９５％配列同一性を有するＶＬ配列；または（ｃ）ａ）と同様のＶＨ及び（ｂ）と同様のＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗体が、（ａ）配列番号：２のアミノ酸配列を有するＶＨ配列；（ｂ）配列番号：３のアミノ酸配列を有するＶＬ配列；（ｃ）配列番号：２のアミノ酸配列に基づくヒト化ＶＨ；（ｄ）配列番号：３のアミノ酸配列に基づくヒト化ＶＬ配列；または（ｅ）（ａ）または（ｃ）と同様のＶＨ及び（ｂ）または（ｄ）と同様のＶＬを含む。   In some embodiments, an isolated antibody that binds human GPC3 is provided, wherein the antibody binds to an epitope within amino acids 25-137 of human GPC3. In some embodiments, the antibody binds to GPC3 from at least one species selected from Cynomolgus monkeys, mice, and rats. In some embodiments, the antibody binds to GPC3 from Cynomolgus monkeys, mice, and rats. In some embodiments, the antibody comprises HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, and HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5. Including. In some embodiments, the antibody comprises HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. Including. In some embodiments, the antibody comprises HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, and HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9. Including. In some embodiments, the antibody has (a) a VH sequence having at least 95% sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; (b) at least 95% sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3. Or (c) a VH similar to a) and a VL similar to (b). In some embodiments, the antibody comprises (a) a VH sequence having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; (b) a VL sequence having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; (c) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. (D) a humanized VL sequence based on the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; or (e) a VH similar to (a) or (c) and a VL similar to (b) or (d) including.

いくつかの実施形態では、ヒトＧＰＣ３を結合する分離抗体が提供され、抗体が、ヒトＧＰＣ３のアミノ酸Ｒ３５８／Ｓ３５９でフーリン切断部位にまたがるエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、ヒトＧＰＣ３を結合する分離抗体が提供され、抗体が、完全長成熟ヒトＧＰＣ３に結合するが、配列番号：１のアミノ酸２５〜３５８からなるヒトＧＰＣ３のＮ−末端フラグメントに結合せず、配列番号：１のアミノ酸３５９〜５６０またはアミノ酸３５９〜５８０からなるヒトＧＰＣ３のＣ−末端フラグメントに結合しない。いくつかの実施形態では、抗体が、配列番号：３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号：３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び配列番号：２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２を含む。いくつかの実施形態では、抗体が、配列番号：２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号：２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び配列番号：３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体が、配列番号：３１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号：３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号：３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体が、（ａ）配列番号：２６のアミノ酸配列と少なくとも９５％配列同一性を有するＶＨ配列；（ｂ）配列番号：２７のアミノ酸配列と少なくとも９５％配列同一性を有するＶＬ配列；または（ｃ）ａ）と同様のＶＨ及び（ｂ）と同様のＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗体が、（ａ）配列番号：２６のアミノ酸配列を有するＶＨ配列；（ｂ）配列番号：２７のアミノ酸配列を有するＶＬ配列；（ｃ）配列番号：２６のアミノ酸配列に基づくヒト化ＶＨ；（ｄ）配列番号：２７のアミノ酸配列に基づくヒト化ＶＬ配列；または（ｅ）（ａ）または（ｃ）と同様のＶＨ及び（ｂ）または（ｄ）と同様のＶＬを含む。   In some embodiments, an isolated antibody that binds human GPC3 is provided, wherein the antibody binds to an epitope spanning the furin cleavage site at amino acids R358 / S359 of human GPC3. In some embodiments, an isolated antibody that binds human GPC3 is provided, wherein the antibody binds to full-length mature human GPC3 but to an N-terminal fragment of human GPC3 consisting of amino acids 25-358 of SEQ ID NO: 1. It does not bind and does not bind to the C-terminal fragment of human GPC3 consisting of amino acids 359 to 560 or amino acids 359 to 580 of SEQ ID NO: 1. In some embodiments, the antibody comprises HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30, HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33, and HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29. Including. In some embodiments, the antibody comprises HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28, HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29, and HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30. Including. In some embodiments, the antibody comprises HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31, HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 32, and HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33. Including. In some embodiments, the antibody has (a) a VH sequence having at least 95% sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26; (b) at least 95% sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27. Or (c) a VH similar to a) and a VL similar to (b). In some embodiments, the antibody comprises (a) a VH sequence having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26; (b) a VL sequence having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27; (c) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26. (D) a humanized VL sequence based on the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27; or (e) a VH similar to (a) or (c) and a VL similar to (b) or (d) including.

いくつかの実施形態では、ヒトＧＰＣ３を結合する分離抗体が提供され、抗体が、ヒトＧＰＣ３のアミノ酸４２０〜４７０内のエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、抗体が、シノモルグスサル、アカゲザル、マウス、及びラットから選択される少なくとも１つの種に由来するＧＰＣ３に結合する。いくつかの実施形態では、抗体が、シノモルグスサル、アカゲザル、マウス、及びラットに由来するＧＰＣ３に結合する。いくつかの実施形態では、抗体が、配列番号：２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号：２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び配列番号：２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２を含む。いくつかの実施形態では、抗体が、配列番号：２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号：２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び配列番号：２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体が、配列番号：２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号：２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号：２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体が、（ａ）配列番号：１８のアミノ酸配列と少なくとも９５％配列同一性を有するＶＨ配列；（ｂ）配列番号：１９のアミノ酸配列と少なくとも９５％配列同一性を有するＶＬ配列；または（ｃ）ａ）と同様のＶＨ及び（ｂ）と同様のＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗体が、（ａ）配列番号：１８のアミノ酸配列を有するＶＨ配列；（ｂ）配列番号：１９のアミノ酸配列を有するＶＬ配列；（ｃ）配列番号：１８のアミノ酸配列に基づくヒト化ＶＨ；（ｄ）配列番号：１９のアミノ酸配列に基づくヒト化ＶＬ配列；または（ｅ）（ａ）または（ｃ）と同様のＶＨ及び（ｂ）または（ｄ）と同様のＶＬを含む。   In some embodiments, an isolated antibody that binds human GPC3 is provided, wherein the antibody binds to an epitope within amino acids 420-470 of human GPC3. In some embodiments, the antibody binds to GPC3 from at least one species selected from Cynomolgus monkeys, rhesus monkeys, mice, and rats. In some embodiments, the antibody binds to GPC3 from Cynomolgus monkeys, rhesus monkeys, mice, and rats. In some embodiments, the antibody comprises HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22, HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25, and HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21. Including. In some embodiments, the antibody comprises HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20, HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, and HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22. Including. In some embodiments, the antibody comprises HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23, HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24, and HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25. Including. In some embodiments, the antibody has (a) a VH sequence having at least 95% sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18; (b) at least 95% sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19. Or (c) a VH similar to a) and a VL similar to (b). In some embodiments, the antibody comprises (a) a VH sequence having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18; (b) a VL sequence having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19; (c) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 (D) a humanized VL sequence based on the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19; or (e) a VH similar to (a) or (c) and a VL similar to (b) or (d) including.

いくつかの実施形態では、ヒトＧＰＣ３を結合する分離抗体が提供され、抗体が、ヒトＧＰＣ３のアミノ酸４７０〜５０９内のエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、抗体が、シノモルグスサルＧＰＣ３に結合する。いくつかの実施形態では、抗体が、ラットＧＰＣ３に結合しない。いくつかの実施形態では、抗体が、配列番号：１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号：１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び配列番号：１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２を含む。いくつかの実施形態では、抗体が、配列番号：１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号：１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び配列番号：１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体が、配列番号：１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号：１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号：１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体が、（ａ）配列番号：１０のアミノ酸配列と少なくとも９５％配列同一性を有するＶＨ配列；（ｂ）配列番号：１１のアミノ酸配列と少なくとも９５％配列同一性を有するＶＬ配列；または（ｃ）ａ）と同様のＶＨ及び（ｂ）と同様のＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗体が、（ａ）配列番号：１０のアミノ酸配列を有するＶＨ配列；（ｂ）配列番号：１１のアミノ酸配列を有するＶＬ配列；（ｃ）配列番号：１０のアミノ酸配列に基づくヒト化ＶＨ；（ｄ）配列番号：１１のアミノ酸配列に基づくヒト化ＶＬ配列；または（ｅ）（ａ）または（ｃ）と同様のＶＨ及び（ｂ）または（ｄ）と同様のＶＬを含む。   In some embodiments, an isolated antibody that binds human GPC3 is provided, wherein the antibody binds to an epitope within amino acids 470-509 of human GPC3. In some embodiments, the antibody binds to Cynomolgus monkey GPC3. In some embodiments, the antibody does not bind to rat GPC3. In some embodiments, the antibody comprises HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, and HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13. Including. In some embodiments, the antibody comprises HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, and HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14. Including. In some embodiments, the antibody comprises HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, and HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17. Including. In some embodiments, the antibody has (a) a VH sequence having at least 95% sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10; (b) at least 95% sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11. Or (c) a VH similar to a) and a VL similar to (b). In some embodiments, the antibody comprises (a) a VH sequence having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10; (b) a VL sequence having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11; (c) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 (D) a humanized VL sequence based on the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11; or (e) a VH similar to (a) or (c) and a VL similar to (b) or (d) including.

いくつかの実施形態では、ＧＰＣ３に結合する分離抗体が提供され、抗体が、（ａ）配列番号：４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号：６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号：７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号：８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号：９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。   In some embodiments, an isolated antibody that binds to GPC3 is provided, wherein the antibody is (a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4; (b) HVR- comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5. (C) HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6; (d) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7; (e) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8; And (f) HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9.

いくつかの実施形態では、ＧＰＣ３に結合する分離抗体が提供され、抗体が、（ａ）配列番号：１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号：１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号：１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号：１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号：１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。   In some embodiments, an isolated antibody that binds to GPC3 is provided, wherein the antibody is (a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12; (b) HVR- comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13. (C) HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14; (d) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15; (e) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16; And (f) HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17.

いくつかの実施形態では、ＧＰＣ３に結合する分離抗体が提供され、抗体が、（ａ）配列番号：２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号：２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号：２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号：２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号：２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。   In some embodiments, an isolated antibody that binds to GPC3 is provided, wherein the antibody is (a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20; (b) HVR- comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21. H2; (c) HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22; (d) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23; (e) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24; And (f) HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25.

いくつかの実施形態では、ＧＰＣ３に結合する分離抗体が提供され、抗体が、（ａ）配列番号：２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号：３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号：３１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号：３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号：３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。   In some embodiments, an isolated antibody that binds to GPC3 is provided, wherein the antibody is (a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28; (b) HVR- comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29. H2; (c) HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30; (d) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31; (e) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 32; And (f) HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33.

本明細書に記載の実施形態のいずれかでは、抗体は、単クローン性抗体としてよい。本明細書に記載の実施形態のいずれかでは、抗体は、ヒト、ヒト化、またはキメラ抗体としてよい。本明細書に記載の実施形態のいずれかでは、抗体は、ＧＰＣ３を結合する抗体フラグメントとしてよい。本明細書に記載の実施形態のいずれかでは、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａまたはＩｇＧ２ｂ抗体としてよい。   In any of the embodiments described herein, the antibody may be a monoclonal antibody. In any of the embodiments described herein, the antibody may be a human, humanized, or chimeric antibody. In any of the embodiments described herein, the antibody may be an antibody fragment that binds GPC3. In any of the embodiments described herein, the antibody may be an IgG1, IgG2a or IgG2b antibody.

本明細書に記載の実施形態のいずれかでは、ＧＰＣ３は、配列番号：１のアミノ酸２５〜５８０を含むヒトＧＰＣ３としてよい。   In any of the embodiments described herein, GPC3 may be human GPC3 comprising amino acids 25-580 of SEQ ID NO: 1.

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体をコードする分離核酸が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体をコードする核酸を含む宿主細胞が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養することを含む抗体の生成方法が提供され、その結果、抗体が生成される。   In some embodiments, an isolated nucleic acid encoding an antibody described herein is provided. In some embodiments, host cells comprising nucleic acids encoding the antibodies described herein are provided. In some embodiments, a method of producing an antibody is provided that comprises culturing a host cell comprising a nucleic acid encoding an antibody described herein, resulting in the production of the antibody.

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体及び細胞毒性薬剤を含むイムノコンジュゲートが提供される。いくつかの実施形態では、イムノコンジュゲートが、式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｐを有し、式中、（ａ）Ａｂが、請求項１から４１のいずれか一項に記載の抗体である；（ｂ）Ｌがリンカーである；（ｃ）Ｄが細胞毒性薬剤である；及び（ｄ）ｐが１〜８の範囲である。いくつかの実施形態では、ｐが、２〜５の範囲である。いくつかの実施形態では、細胞毒性薬剤が、マイタンシノイド、カリケアミシン、ピロロベンゾジアゼピン、及びネモルビシン誘導体から選択される。   In some embodiments, an immunoconjugate comprising an antibody described herein and a cytotoxic agent is provided. In some embodiments, the immunoconjugate has the formula Ab- (LD) p, wherein (a) Ab is an antibody according to any one of claims 1-41. (B) L is a linker; (c) D is a cytotoxic agent; and (d) p is in the range of 1-8. In some embodiments, p ranges from 2-5. In some embodiments, the cytotoxic agent is selected from maytansinoids, calicheamicins, pyrrolobenzodiazepines, and nemorubicin derivatives.

いくつかの実施形態では、Ｄが式Ａのピロロベンゾジアゼピンであり、
Ａ；
式中、点線が、Ｃ１及びＣ２またはＣ２及びＣ３間の二重結合任意の存在を示す；
Ｒ２が、Ｈ、ＯＨ、＝Ｏ、＝ＣＨ２、ＣＮ、Ｒ、または、＝ＣＨ−ＲＤ、＝Ｃ（ＲＤ）２、Ｏ−ＳＯ２−Ｒ、ＣＯ２Ｒ及びＣＯＲから独立して選択され、さらに任意でハロまたはジハロから選択され、式中、ＲＤが、Ｒ、ＣＯ２Ｒ、ＣＯＲ、ＣＨＯ、ＣＯ２Ｈ、及びハロから独立して選択される；
Ｒ６及びＲ９が、Ｈ、Ｒ、ＯＨ、または、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、Ｍｅ３Ｓｎ及びハロから独立して選択される；
Ｒ７が、Ｈ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、Ｍｅ３Ｓｎ及びハロから独立して選択される；
Ｑが、Ｏ、Ｓ及びＮＨから独立して選択される；
Ｒ１１が、Ｈ、またはＲのいずれかであり、または、Ｑが、Ｏ、ＳＯ３Ｍであり、Ｍが、金属カチオンである；
Ｒ及びＲ’それぞれが、任意で置換Ｃ１−８アルキル、Ｃ３−８ヘテロシクリル及びＣ５−２０アリール基から独立して選択され、任意で基ＮＲＲ’に関して、Ｒ及びＲ’が、これらが結合する窒素原子とともに任意で置換４、５、６または７員の複素環式環を形成する；
Ｒ１２、Ｒ１６、Ｒ１９及びＲ１７が、Ｒ２、Ｒ６、Ｒ９及びＲ７それぞれに対して定義されるとおりである；
Ｒ″が、Ｃ３−１２アルキレン基であり、その鎖が、１つ以上のヘテロ原子及び／または任意で置換されている芳香環によって中断されていてもよく；及び
Ｘ及びＸ’が、Ｏ、Ｓ及びＮ（Ｈ）から独立して選択される。 In some embodiments, D is pyrrolobenzodiazepine of formula A;
A;
In which the dotted line indicates the optional presence of a double bond between C1 and C2 or C2 and C3;
R 2 is independent of H, OH, ═O, ═CH 2 , CN, R, or ═CH—R D , ═C (R D ) 2 , O—SO 2 —R, CO 2 R and COR. Further optionally selected from halo or dihalo, wherein R D is independently selected from R, CO 2 R, COR, CHO, CO 2 H, and halo;
R 6 and R 9 are independently selected from H, R, OH, or SH, SR, NH 2 , NHR, NRR ′, NO 2 , Me 3 Sn and halo;
R 7 is independently selected from H, R, OH, OR, SH, SR, NH 2 , NHR, NRR ′, NO 2 , Me 3 Sn and halo;
Q is independently selected from O, S and NH;
R 11 is either H or R, or Q is O, SO 3 M, and M is a metal cation;
R and R ′ are each independently selected from substituted C 1-8 alkyl, C 3-8 heterocyclyl and C 5-20 aryl groups, and optionally with respect to the group NRR ′, R and R ′ Optionally forming a substituted 4, 5, 6 or 7 membered heterocyclic ring with the nitrogen atom to which it is attached;
R 12 , R 16 , R 19 and R 17 are as defined for R 2 , R 6 , R 9 and R 7 respectively;
R ″ is a C 3-12 alkylene group, the chain of which may be interrupted by one or more heteroatoms and / or optionally substituted aromatic rings; and X and X ′ are O , S and N (H) are independently selected.

いくつかの実施形態では、Ｄが以下の構造を有し：
；
式中、ｎが０または１である。 In some embodiments, D has the following structure:
;
In the formula, n is 0 or 1.

いくつかの実施形態では、Ｄがネモルビシン誘導体である。いくつかの実施形態では、Ｄが以下から選択される構造を有する。
；及び
。 In some embodiments, D is a nemorubicin derivative. In some embodiments, D has a structure selected from:
;as well as
.

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体を含むイムノコンジュゲートが提供され、リンカーが、プロテアーゼによって切断可能である。いくつかの実施形態では、リンカーが、酸不安定性である。いくつかの実施形態では、リンカーが、ヒドラゾンを含む。   In some embodiments, an immunoconjugate comprising an antibody described herein is provided and the linker is cleavable by a protease. In some embodiments, the linker is acid labile. In some embodiments, the linker comprises a hydrazone.

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体を含むイムノコンジュゲートが提供され、イムノコンジュゲートが、以下から選択される式を有する。
；及び
。 In some embodiments, an immunoconjugate comprising an antibody described herein is provided, wherein the immunoconjugate has a formula selected from:
;as well as
.

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のイムノコンジュゲート及び製剤的に許容可能なキャリアを含む医薬製剤が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体及び製剤的に許容可能なキャリアを含む医薬製剤が提供される。いくつかの実施形態では、医薬製剤が、さらに追加の治療薬剤を含む。   In some embodiments, a pharmaceutical formulation is provided comprising an immunoconjugate described herein and a pharmaceutically acceptable carrier. In some embodiments, a pharmaceutical formulation is provided comprising an antibody described herein and a pharmaceutically acceptable carrier. In some embodiments, the pharmaceutical formulation further comprises an additional therapeutic agent.

いくつかの実施形態では、ＧＰＣ３−陽性癌を有する個体の治療方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法が、有効量の本明細書に記載の抗体、本明細書に記載のイムノコンジュゲート、または本明細書に記載の医薬製剤を個体に投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＧＰＣ３−陽性癌が肝臓癌である。いくつかの実施形態では、方法が、さらに追加の治療薬剤を個体に投与することを含む。   In some embodiments, a method of treating an individual having GPC3-positive cancer is provided. In some embodiments, the method comprises administering to an individual an effective amount of an antibody described herein, an immunoconjugate described herein, or a pharmaceutical formulation described herein. In some embodiments, the GPC3-positive cancer is liver cancer. In some embodiments, the method further comprises administering an additional therapeutic agent to the individual.

いくつかの実施形態では、ＧＰＣ３−陽性細胞の増殖の抑制方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法が、抗体またはイムノコンジュゲートが細胞の表面上のＧＰＣ３に結合するのを許容する条件下で、有効量の本明細書に記載の抗体または本明細書に記載のイムノコンジュゲートを個体に投与し、これにより、細胞の増殖を抑制することを含む。いくつかの実施形態では、細胞が、肝臓癌細胞である。   In some embodiments, a method of inhibiting the growth of GPC3-positive cells is provided. In some embodiments, the method provides an effective amount of an antibody described herein or an antibody described herein under conditions that permit the antibody or immunoconjugate to bind to GPC3 on the surface of a cell. Administering the immunoconjugate to an individual, thereby inhibiting cell proliferation. In some embodiments, the cell is a liver cancer cell.

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体が、標識に結合する。いくつかの実施形態では、標識が、陽電子放出体である。いくつかの実施形態では、陽電子放出体が、８９Ｚｒである。 In some embodiments, an antibody described herein binds to a label. In some embodiments, the label is a positron emitter. In some embodiments, the positron emitter is 89 Zr.

いくつかの実施形態では、生体試料中のヒトＧＰＣ３の検出方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法が、抗ＧＰＣ３抗体が自然ヒトＧＰＣ３に結合するのを許容する条件下で、本明細書に記載の抗ＧＰＣ３抗体と生体試料を接触させること、ならびに、複合体が生体試料中の抗ＧＰＣ３抗体及び自然ヒトＧＰＣ３間に、形成されるかどうかを検出することを含む。いくつかの実施形態では、生体試料が、肝臓癌試料である。いくつかの実施形態では、ＧＰＣ３−陽性癌の検出方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法が、（ｉ）ＧＰＣ３−陽性癌を有する、または有する疑いのある被験者に、本明細書に記載の抗ＧＰＣ３抗体を含む標識抗ＧＰＣ３抗体を投与すること、及び（ｉｉ）標識抗ＧＰＣ３抗体の検出が、被験者中のＧＰＣ３−陽性癌を示す、被験者中の標識抗ＧＰＣ３抗体を検出することを含む。いくつかの実施形態では、標識抗ＧＰＣ３抗体が、陽電子放出体に結合する抗ＧＰＣ３抗体を含む。いくつかの実施形態では、陽電子放出体が、８９Ｚｒである。 In some embodiments, a method for detecting human GPC3 in a biological sample is provided. In some embodiments, the method comprises contacting the biological sample with the anti-GPC3 antibody described herein under conditions that allow the anti-GPC3 antibody to bind to native human GPC3, and wherein the complex is Detecting whether it is formed between an anti-GPC3 antibody and natural human GPC3 in a biological sample. In some embodiments, the biological sample is a liver cancer sample. In some embodiments, a method for detecting GPC3-positive cancer is provided. In some embodiments, the method comprises (i) administering a labeled anti-GPC3 antibody comprising an anti-GPC3 antibody described herein to a subject having or suspected of having a GPC3-positive cancer, and ( ii) detecting the labeled anti-GPC3 antibody comprises detecting a labeled anti-GPC3 antibody in the subject indicative of GPC3-positive cancer in the subject. In some embodiments, the labeled anti-GPC3 antibody comprises an anti-GPC3 antibody that binds to a positron emitter. In some embodiments, the positron emitter is 89 Zr.

実施例１に記載したとおり、正常及び疾患及び腫瘍組織中のＧＰＣ３の発現を示す。As described in Example 1, the expression of GPC3 in normal and diseased and tumor tissues is shown. 実施例１に記載したとおり、正常肝臓、肝臓癌、及び疾患肝臓中のＧＰＣ３の発現を示す。As described in Example 1, expression of GPC3 in normal liver, liver cancer, and diseased liver is shown. 実施例１に記載したとおり、種々のステージの肝細胞癌及び他の肝臓疾患中のＧＰＣ３の発現を示す。As described in Example 1, shows the expression of GPC3 in various stages of hepatocellular carcinoma and other liver diseases. 図４Ａ〜Ｂは、抗ＧＰＣ３抗体７Ｈ１、４Ａ１１、１５Ｇ１、及び４Ｇ７の（Ａ）軽鎖可変領域配列及び（Ｂ）重鎖可変領域配列のアラインメントを示す。4A-B show an alignment of (A) light chain variable region sequences and (B) heavy chain variable region sequences of anti-GPC3 antibodies 7H1, 4A11, 15G1, and 4G7. 実施例２に記載したとおり、ＦＡＣＳによって測定され、抗体７Ｈ１が、２９３Ｓ細胞、ＨｅｐＧ２ Ｘ１細胞、及びＧＰＣ３を発現している２９３Ｓ細胞（２９３ＳＧＰＣ３ＦＬ）に結合することを示す。As described in Example 2, antibody 7H1 is shown to bind to 293S cells, HepG2 X1 cells, and 293S cells expressing GPC3 (293SGPC3FL) as measured by FACS. ヒトＧＰＣ３タンパク質配列、ヒトＧＰＣ３の３つのフラグメントの特定の特徴の模式図を示し、実施例２に記載したとおり、ウェスタンブロットが、抗体７Ｈ１のＧＰＣ３フラグメントへの結合を示す。A schematic diagram of the specific features of the human GPC3 protein sequence, three fragments of human GPC3 is shown, and as described in Example 2, Western blot shows binding of antibody 7H1 to the GPC3 fragment. 実施例２に記載したとおり、ＦＡＣＳによって測定され、抗体７Ｈ１及び４Ｇ７、ならびに対照抗体１Ｇ１２（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）が、２９３Ｓ細胞、ＧＰＣ３のＣ−末端フラグメントを発現している２９３Ｓ細胞（Ｃｔ＿ＧＰＣ３）及びＧＰＣ３のＮ−末端フラグメントを発現している２９３Ｓ細胞（Ｎｔ＿ＧＰＣ３）に結合することを示す。As described in Example 2, antibodies 7H1 and 4G7 and control antibody 1G12 (Santa Cruz Biotechnology) measured by FACS were 293S cells, 293S cells expressing C-terminal fragment of GPC3 (Ct_GPC3) and GPC3 Shows binding to 293S cells expressing N-terminal fragments of (Nt_GPC3). 実施例２に記載したとおり、ヒトＧＰＣ３タンパク質配列及びヒトＧＰＣ３の４つのフラグメントの特定の特徴の模式図を示す。As described in Example 2, a schematic representation of the human GPC3 protein sequence and specific features of four fragments of human GPC3 is shown. 実施例２に記載したとおり、ＦＡＣＳによって測定され、抗体４Ａ１１及び１５Ｇ１が、完全長ＦＰＣ３及び２９３Ｓ細胞中に発現した図８のフラグメントのうちの３つに結合することを示す。As described in Example 2, antibodies 4A11 and 15G1, as measured by FACS, show binding to 3 of the fragments of FIG. 8 expressed in full length FPC3 and 293S cells. 実施例２に記載したとおり、抗体１５Ｇ１及び４Ａ１１が、種々の種に由来するＧＰＣ３に結合することを示す。As described in Example 2, antibodies 15G1 and 4A11 are shown to bind to GPC3 derived from various species. 実施例２に記載したとおり、ヒト、シノモルグスサル、アカゲザル、マウス、及びラットに由来するＧＰＣ３のアラインメントを示す。As described in Example 2, an alignment of GPC3 from human, cynomolgus monkey, rhesus monkey, mouse, and rat is shown. 実施例５に記載したとおり、（Ａ）マレイミドアセタールＰＮＵ−１５９６８２抗体−薬剤コンジュゲートの構造及び（Ｂ）モノメチルジスルフィドＮ１０−結合ＰＢＤ抗体−薬剤コンジュゲートの構造を示す。As described in Example 5, (A) the structure of maleimidacetal PNU-159682 antibody-drug conjugate and (B) the structure of monomethyl disulfide N10-linked PBD antibody-drug conjugate are shown. 図１３Ａ〜Ｂは、実施例６に記載したとおり、ＦＡＣＳによって、抗体４Ｇ７、７Ｈ１、及び４Ａ１１を用いて検出する、（Ａ）ＨｅｐＧ２ Ｘ１細胞及び（Ｂ）分離ＨｅｐＧ２ Ｘ１異種移植腫瘍細胞の表面上のＧＰＣ３の発現を示す。FIGS. 13A-B are on the surface of (A) HepG2 X1 cells and (B) isolated HepG2 X1 xenograft tumor cells, detected by FACS using antibodies 4G7, 7H1, and 4A11 as described in Example 6. Shows the expression of GPC3. 実施例６に記載したとおり、種々の抗体−薬剤コンジュゲートによる治療時のＨｅｐＧ２ Ｘ１異種移植モデル中の腫瘍容量（ｍｍ３）の経時的な変化を示す。FIG. 3 shows the change in tumor volume (mm 3 ) over time in a HepG2 X1 xenograft model during treatment with various antibody-drug conjugates as described in Example 6. FIG. 図１５Ａ〜Ｂは、実施例７に記載したとおり、ＦＡＣＳによって、抗体４Ｇ７、７Ｈ１、及び４Ａ１１を用いて検出する、（Ａ）ＪＨＨ７細胞及び（Ｂ）分離ＪＨＨ７異種移植腫瘍細胞の表面上のＧＰＣ３の発現を示す。FIGS. 15A-B show GPC3 on the surface of (A) JHH7 cells and (B) isolated JHH7 xenograft tumor cells detected by FACS using antibodies 4G7, 7H1, and 4A11 as described in Example 7. The expression of is shown. 実施例７に記載したとおり、種々の抗体−薬剤コンジュゲートによる治療時のＪＨＨ７異種移植モデル中の腫瘍容量（ｍｍ３）の経時的な変化を示す。FIG. 3 shows the change in tumor volume (mm 3 ) over time in a JHH7 xenograft model during treatment with various antibody-drug conjugates as described in Example 7. FIG.

Ｉ．定義
本明細書の目的のための「受容体ヒトフレームワーク」は、以下に定義したとおり、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに由来する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワークまたは重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含む、フレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」受容体ヒトフレームワークが、これらの同じアミノ酸配列を含んでよい、またはそれがアミノ酸配列変化を含有してよい。いくつかの実施形態では、アミノ酸変化の数が、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、または２以下である。いくつかの実施形態では、ＶＬ受容体ヒトフレームワークは、配列がＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列またはヒトコンセンサスフレームワーク配列と同一である。 I. Definitions “Receptor human framework” for purposes herein is a light chain variable domain (VL) framework or heavy chain variable derived from a human immunoglobulin framework or a human consensus framework, as defined below. A framework comprising the amino acid sequence of a domain (VH) framework. A receptor human framework “derived from” a human immunoglobulin framework or a human consensus framework may contain these same amino acid sequences, or it may contain amino acid sequence changes. In some embodiments, the number of amino acid changes is 10 or less, 9 or less, 8 or less, 7 or less, 6 or less, 5 or less, 4 or less, 3 or less, or 2 or less. In some embodiments, the VL receptor human framework is identical in sequence to the VL human immunoglobulin framework sequence or human consensus framework sequence.

「親和性」は、分子（例えば、抗体）及びその結合パートナー（例えば、抗原）の単一結合部位間の非共有相互作用の総和の力を指す。「結合親和性」は、特に指示がないかぎり、本発明に用いる場合、結合ペア（例えば、抗体及び抗原）のメンバー間の１：１相互作用を示す内因性結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般に解離定数（Ｋｄ）によって表すことができる。親和性は、本明細書に記載の方法を含む当技術分野で知られている一般的な方法によって測定することができる。結合親和性を測定するための特定の実例となる例示的実施形態が、以下に記載されている。   “Affinity” refers to the combined force of non-covalent interactions between a single binding site of a molecule (eg, an antibody) and its binding partner (eg, an antigen). “Binding affinity”, unless otherwise indicated, refers to endogenous binding affinity, as used in the present invention, that indicates a 1: 1 interaction between members of a binding pair (eg, antibody and antigen). The affinity of a molecule X for its partner Y can generally be represented by a dissociation constant (Kd). Affinity can be measured by common methods known in the art, including the methods described herein. Specific illustrative embodiments for measuring binding affinity are described below.

「親和性成熟」抗体は、変性がない親抗体と比べて１つ以上超可変領域（ＨＶＲ）中に１つ以上の変性がある抗体を指し、かかる変性の結果、抗体の抗原に対する親和性が改善される。   An “affinity matured” antibody refers to an antibody that has one or more denaturations in one or more hypervariable regions (HVRs) compared to a parent antibody that is not denatured, and as a result of such denaturation, the affinity of the antibody for an antigen is increased. Improved.

用語「抗ＧＰＣ３抗体」及び「ＧＰＣ３に結合する抗体」は、抗体が、ＧＰＣ３を標的とする場合、診断薬剤及び／または治療薬剤として有用であるように十分な親和性でＧＰＣ３を結合することができる抗体を指す。１つの実施形態では、類似性のない非ＧＰＣ３タンパク質への抗ＧＰＣ３抗体の結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定したＧＰＣ３への抗体の結合の約１０％未満である。特定の実施形態では、ＧＰＣ３に結合する抗体の解離定数（Ｋｄ）が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦５ｎＭ、≦４ｎＭ、≦３ｎＭ、≦２ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、または≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば、１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）である。特定の実施形態では、抗ＧＰＣ３抗体が、異なる種に由来するＧＰＣ３に保存されているＧＰＣ３のエピトープに結合する。 The terms “anti-GPC3 antibody” and “antibody that binds GPC3” are those that bind GPC3 with sufficient affinity such that when the antibody targets GPC3, it is useful as a diagnostic and / or therapeutic agent. It refers to an antibody that can. In one embodiment, the degree of binding of the anti-GPC3 antibody to a non-similar non-GPC3 protein is less than about 10% of the binding of the antibody to GPC3 as measured, for example, by radioimmunoassay (RIA). In certain embodiments, the dissociation constant (Kd) of an antibody that binds to GPC3 is ≦ 1 μM, ≦ 100 nM, ≦ 10 nM, ≦ 5 nM, ≦ 4 nM, ≦ 3 nM, ≦ 2 nM, ≦ 1 nM, ≦ 0.1 nM, ≦ 0. 0.01 nM, or ≦ 0.001 nM (eg, 10 −8 M or less, eg, 10 −8 M to 10 −13 M, eg, 10 −9 M to 10 −13 M). In certain embodiments, the anti-GPC3 antibody binds to an epitope of GPC3 that is conserved in GPC3 from a different species.

用語「抗体」は、本明細書では、最も広い意味で用いられ、所望の抗原−結合活性を示す限り、これらに限定されないが、単クローン性抗体、多クロ−ン性抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体フラグメントを含むさまざまな抗体構造を包含する。   The term “antibody” is used herein in the broadest sense and includes, but is not limited to, monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, multispecific antibodies, as long as they exhibit the desired antigen-binding activity. (Eg, bispecific antibodies), and various antibody structures including antibody fragments.

「抗体フラグメント」は、インタクト抗体の一部を含み、インタクト抗体が結合する抗原を結合するインタクト抗体以外の分子を指す。抗体フラグメントの例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；二重特異性抗体；直鎖抗体；単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；及び抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が挙げられるこれらに限定されない。 “Antibody fragment” refers to a molecule other than an intact antibody that comprises a portion of an intact antibody and binds an antigen to which the intact antibody binds. Examples of antibody fragments include Fv, Fab, Fab ′, Fab′-SH, F (ab ′) 2 ; bispecific antibodies; linear antibodies; single chain antibody molecules (eg, scFv); and antibody fragments These include but are not limited to multispecific antibodies formed.

タンパク質の定義領域内の「エピトープに結合する抗体」は、タンパク質に結合するためのその領域内に１つ以上のアミノ酸の存在を必要とする抗体である。特定の実施形態では、タンパク質の定義領域内の「エピトープに結合する抗体」が、タンパク質のアミノ酸を欠失または変異させる欠失または変異分析によって同定され、抗体の得られた変化したタンパク質（例えば、エピトープを含む変化したタンパク質）への結合が、変化していないタンパク質への結合の少なくとも２０％であると測定される。いくつかの実施形態では、タンパク質の定義領域内の「エピトープに結合する抗体」が、タンパク質のアミノ酸が欠失または変異する欠失または変異分析によって同定され、抗体の得られた変化したタンパク質（例えば、エピトープを含む変化したタンパク質）への結合が、変化していないタンパク質への結合の少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％であると測定される。例示的欠失（切断）分析が、実施例２に記載されている。特定の実施形態では、抗体の結合が、実施例２に記載したとおり、ＦＡＣＳによって測定される、または好適な結合アッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡまたは表面プラズモン共鳴アッセイによって測定される。   An “antibody that binds to an epitope” within a defined region of a protein is an antibody that requires the presence of one or more amino acids in that region to bind to the protein. In certain embodiments, “antibodies that bind to an epitope” within a defined region of a protein are identified by deletion or mutation analysis that deletes or mutates amino acids of the protein, and the resulting altered protein of the antibody (eg, The binding to the altered protein containing the epitope is determined to be at least 20% of the binding to the unchanged protein. In some embodiments, an “antibody that binds to an epitope” within a defined region of a protein is identified by deletion or mutation analysis in which amino acids of the protein are deleted or mutated, and the resulting altered protein of the antibody (eg, , An altered protein comprising an epitope) is at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, or at least 90% of the binding to the unaltered protein Measured to be An exemplary deletion (truncation) analysis is described in Example 2. In certain embodiments, antibody binding is measured by FACS, as described in Example 2, or by a suitable binding assay, such as an ELISA or surface plasmon resonance assay.

参照抗体によりポリペプチド、例えば、ＧＰＣ３への結合と競合する抗体は、競合アッセイで参照抗体のポリペプチドへの結合を５０％以上ブロックする抗体を指し、逆に言えば、参照抗体が、競合アッセイで抗体のポリペプチドへの結合を５０％以上ブロックする。例示的競合アッセイが、本明細書の実施例２に提供したとおり、エピトープビニングアッセイである。いくつかの実施形態では、競合は、表面プラズモン共鳴アッセイを用いて評価してよい。   An antibody that competes with a reference antibody for binding to a polypeptide, eg, GPC3, refers to an antibody that blocks 50% or more of the binding of the reference antibody to the polypeptide in a competitive assay, or conversely, the reference antibody is a competitive assay. Block 50% or more of antibody binding to the polypeptide. An exemplary competition assay is an epitope binning assay, as provided in Example 2 herein. In some embodiments, competition may be assessed using a surface plasmon resonance assay.

「アミノ酸Ｒ３５８／Ｓ３５９でフーリン切断部位にまたがるエピトープ」は、Ｓ３５９へのＮ−末端である１つ以上のＧＰＣ３アミノ酸残基及びＲ３５８へのＣ−末端である１つ以上のアミノ酸残基を含むエピトープを指す。特定の実施形態では、抗体のかかるエピトープへの結合は、Ｓ３５９へのＮ−末端である１つ以上のＧＰＣ３アミノ酸残基及び／またはＲ３５８へのＣ−末端である１つ以上のアミノ酸残基を欠失または変異させる欠失または変異分析によって測定することができ、抗体の得られた変化したタンパク質（例えば、エピトープを含む変化したタンパク質）への結合が、変化していないタンパク質への結合の少なくとも２０％であると測定される。特定の実施形態では、抗体のかかるエピトープへの結合は、Ｓ３５９へのＮ−末端である１つ以上のＧＰＣ３アミノ酸残基及び／またはＲ３５８へのＣ−末端である１つ以上のアミノ酸残基を欠失または変異させる欠失または変異分析によって測定することができ、抗体の得られた変化したタンパク質（例えば、エピトープを含む変化したタンパク質）への結合が、変化していないタンパク質への結合の少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％であると測定される。いくつかの実施形態では、アミノ酸Ｒ３５８／Ｓ３５９でフーリン切断部位にまたがるエピトープに結合する抗体が、完全長ＧＰＣ３に結合するが、アミノ酸残基Ｒ３５８（例えば、ヒトＧＰＣ３のアミノ酸２５〜３５８）で終わるＧＰＣ３のＮ−末端フラグメントに結合せず、アミノ酸残基Ｓ３５９（例えば、ヒトＧＰＣ３のアミノ酸３５９〜５６０または３５９〜５８０）で始まるＧＰＣ３のＣ−末端フラグメントに結合しない。   “Epitope spanning furin cleavage site at amino acids R358 / S359” is an epitope comprising one or more GPC3 amino acid residues that are N-terminal to S359 and one or more amino acid residues that are C-terminal to R358 Point to. In certain embodiments, the binding of the antibody to such epitope comprises one or more GPC3 amino acid residues that are N-terminal to S359 and / or one or more amino acid residues that are C-terminal to R358. Deletion or mutation can be measured by deletion or mutation analysis, wherein the binding of the antibody to the resulting altered protein (eg, altered protein comprising an epitope) is at least a binding to the unchanged protein. Measured to be 20%. In certain embodiments, the binding of the antibody to such epitope comprises one or more GPC3 amino acid residues that are N-terminal to S359 and / or one or more amino acid residues that are C-terminal to R358. Deletion or mutation can be measured by deletion or mutation analysis, wherein the binding of the antibody to the resulting altered protein (eg, altered protein comprising an epitope) is at least a binding to the unchanged protein. It is measured to be 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, or at least 90%. In some embodiments, an antibody that binds to an epitope spanning the furin cleavage site at amino acids R358 / S359 binds to full-length GPC3 but ends with amino acid residue R358 (eg, amino acids 25-358 of human GPC3). To the N-terminal fragment of GPC3 starting with amino acid residue S359 (eg, amino acids 359-560 or 359-580 of human GPC3).

用語「癌」及び「癌性」は、通常、細胞成長／増殖が制御されないことを特徴とする哺乳動物の生理学的状態を指す、または表す。癌の例としては、癌腫、肝臓癌、肝細胞癌、膵癌、肺癌、結腸癌、乳癌、前立腺癌、リンパ腫（例えば、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫）、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が挙げられるが、これらに限定されない。   The terms “cancer” and “cancerous” refer to or describe the physiological condition in mammals that is typically characterized by unregulated cell growth / proliferation. Examples of cancer include carcinoma, liver cancer, hepatocellular carcinoma, pancreatic cancer, lung cancer, colon cancer, breast cancer, prostate cancer, lymphoma (eg, Hodgkin lymphoma and non-Hodgkin lymphoma), blastoma, sarcoma, and leukemia However, it is not limited to these.

用語「キメラ」抗体は、重鎖及び／または軽鎖の一部が特定のソースまたは種に由来し、重鎖及び／または軽鎖の残りが異なるソースまたは種に由来する抗体を指す。   The term “chimeric” antibody refers to an antibody in which a portion of the heavy and / or light chain is derived from a particular source or species and the remainder of the heavy and / or light chain is derived from a different source or species.

抗体の「クラス」は、その重鎖が有する定常ドメインまたは不変領域の型を指す。抗体の主要な５つのクラス、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、これらのうちいくつかは、さらにサブクラス（イソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γおよびμと呼ばれる。 The “class” of an antibody refers to the type of constant domain or constant region possessed by its heavy chain. There are five major classes of antibodies, IgA, IgD, IgE, IgG, and IgM, some of which are further subclasses (isotypes), eg, IgG 1 , IgG 2 , IgG 3 , IgG 4 , IgA 1 , and it can be divided into IgA 2. The heavy chain constant domains that correspond to the different classes of immunoglobulins are called α, δ, ε, γ, and μ, respectively.

用語「細胞毒性薬剤」は、本明細書に用いる場合、細胞機能を抑制または妨害する、及び／または細胞死または細胞破壊を引き起こす物質を指す。細胞毒性薬剤としては、これらに限定されないが、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体）；化学療法薬または薬剤（例えば、メトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルピシンまたは他のインターカレート剤）；成長阻害剤；これらの酵素及びフラグメント、例えば、核酸分解酵素；抗生物質；毒素、例えば、細菌、真菌、植物または動物由来の小分子毒素または酵素活性毒素（これらのフラグメント及び／または変異型を含む）；及び以下に記載したさまざまな抗腫瘍薬剤または抗癌薬剤が挙げられる。 The term “cytotoxic agent” as used herein refers to a substance that inhibits or prevents cellular function and / or causes cell death or destruction. Cytotoxic agents include, but are not limited to, radioisotopes (eg, At 211 , I 131 , I 125 , Y 90 , Re 186 , Re 188 , Sm 153 , Bi 212 , P 32 , Pb 212 and Lu. Radioisotopes); chemotherapeutic drugs or drugs (eg, methotrexate, adriamycin, vinca alkaloids (vincristine, vinblastine, etoposide), doxorubicin, melphalan, mitomycin C, chlorambucil, daunorpicin or other intercalating agents); growth inhibitors These enzymes and fragments, eg, nucleases; antibiotics; toxins, eg, small molecule toxins or enzyme-active toxins from bacteria, fungi, plants or animals (including fragments and / or variants thereof); and Described below Various anti-tumor drugs or anti-cancer drugs.

「エフェクター機能」は、抗体イソタイプで変化する抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体−依存性細胞−媒介細胞障害（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体のダウンレギュレーション（例えば、Ｂ細胞受容体）；及びＢ細胞活性が挙げられる。   “Effector function” refers to the biological activity attributable to the Fc region of an antibody that varies with the antibody isotype. Examples of antibody effector functions include C1q binding and complement dependent cytotoxicity (CDC); Fc receptor binding; antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC); phagocytosis; down-regulation of cell surface receptors ( For example, B cell receptor); and B cell activity.

「有効量」の薬剤、例えば、医薬製剤は、所望の治療または予防的結果を得るために必要な用量及び必要な期間で効果的な量を指す。   An “effective amount” of an agent, eg, a pharmaceutical formulation, refers to an amount that is effective at the dosage and duration necessary to obtain the desired therapeutic or prophylactic result.

用語「エピトープ」は、抗体が抗原分子に結合する特定の部位を指す。   The term “epitope” refers to a specific site at which an antibody binds to an antigen molecule.

用語「Ｆｃ領域」は、本明細書では、不変領域の少なくとも一部を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ−末端領域を定義するために用いられる。この用語は、天然配列Ｆｃ領域及び変異型Ｆｃ領域を含む。１つの実施形態では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域が、Ｃｙｓ２２６、またはＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端へ伸びる。しかし、Ｆｃ領域のＣ−末端リシン（Ｌｙｓ４４７）が、存在してよい、または存在しなくてよい。本明細書に特に指示がない限り，Ｆｃ領域または不変部領域中のアミノ酸残基の番号付与は、Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版に記載のとおり、ＥＵインデックスとも称されるＥＵ番号付与体系に従う。Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、１９９１。   The term “Fc region” is used herein to define the C-terminal region of an immunoglobulin heavy chain that contains at least a portion of the constant region. The term includes native sequence Fc regions and variant Fc regions. In one embodiment, the human IgG heavy chain Fc region extends from Cys226 or Pro230 to the carboxyl terminus of the heavy chain. However, the C-terminal lysine (Lys447) of the Fc region may or may not be present. Unless otherwise indicated herein, numbering of amino acid residues in the Fc region or constant region is also referred to as the EU index, as described in Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edition. Follow the EU numbering system. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.

「フレームワーク」または「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般に、４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４からなる。それゆえに、ＨＶＲ及びＦＲ配列は、一般に、ＶＨ（またはＶＬ）中の以下の配列：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４に現れる。   “Framework” or “FR” refers to variable domain residues other than hypervariable region (HVR) residues. The FR of a variable domain generally consists of four FR domains: FR1, FR2, FR3, and FR4. Therefore, HVR and FR sequences generally appear in the following sequence in VH (or VL): FR1-H1 (L1) -FR2-H2 (L2) -FR3-H3 (L3) -FR4.

用語「完全長抗体」、「インタクト抗体」及び「全抗体」は、本明細書に交換可能で用いられ、天然抗体の構造と実質的にほぼ同じ構造を有する抗体、または本明細書に定義されるとおりのＦｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を指す。   The terms “full-length antibody”, “intact antibody” and “whole antibody” are used interchangeably herein, and are defined or defined herein as having substantially the same structure as that of a natural antibody. Refers to an antibody having a heavy chain containing the Fc region.

用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養」は、交換可能で用いられ、外因性核酸が導入された細胞を指し、かかる細胞の後代細胞を含む。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換細胞」を含み、一次形質転換細胞及び継代の数に関係なくこれらに由来する後代細胞を含む。後代細胞は、核酸内容物が親細胞と完全に同一でなくてもよく、変異を含有してよい。当初の形質転換細胞中でスクリーニングまたは選択されるものと同じ機能または生物活性を有する変異後代細胞が、本明細書に含まれる。   The terms “host cell”, “host cell line”, and “host cell culture” are used interchangeably and refer to a cell into which an exogenous nucleic acid has been introduced, including progeny of such a cell. Host cells include “transformants” and “transformed cells”, including primary transformed cells and progeny cells derived therefrom regardless of the number of passages. Progeny cells may not contain nucleic acid contents exactly the same as the parent cell and may contain mutations. Mutant progeny cells having the same function or biological activity as screened or selected in the original transformed cell are included herein.

「ヒト抗体」は、ヒトまたはヒト細胞によって生成される抗体またはヒト抗体レパートリーまたは他のヒト抗体をコードする配列を用いる非ヒトソースに由来する抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。特に非ヒト抗原−結合残基を含むヒト化抗体は、ヒト抗体のこの定義から除外される。   A “human antibody” is an antibody having an amino acid sequence corresponding to an antibody produced by a human or human cell or an antibody derived from a non-human source using sequences encoding a human antibody repertoire or other human antibodies. Humanized antibodies, particularly including non-human antigen-binding residues, are excluded from this definition of human antibody.

「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨフレームワーク配列のセクション中に最も一般的に生じるアミノ酸残基を示すフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨ配列のセクションは、可変ドメイン配列のサブグループに由来する。一般に、配列のサブグループは、Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ９１−３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ（１９９１），ｖｏｌｓ．１−３に記載のとおりのサブグループである。１つの実施形態では、ＶＬのサブグループが、前記のＫａｂａｔらに記載のとおり、サブグループカッパＩである。１つの実施形態では、ＶＨのサブグループが、前記のＫａｂａｔらに記載のとおり、サブグループＩＩＩである。   A “human consensus framework” is a framework that indicates the most commonly occurring amino acid residues in a section of a human immunoglobulin VL or VH framework sequence. In general, sections of human immunoglobulin VL or VH sequences are derived from subgroups of variable domain sequences. In general, subgroups of sequences are described in Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. It is a subgroup as described in 1-3. In one embodiment, the subgroup of VL is subgroup kappa I, as described in Kabat et al. In one embodiment, the subgroup of VH is subgroup III, as described in Kabat et al.

「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲに由来するアミノ酸残基及びヒトＦＲに由来するアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。特定の実施形態では、ヒト化抗体が、少なくとも１つ可変ドメイン、及び通常２つの可変ドメインのすべてを実質的に含み、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）のすべてまたは実質的にすべてが、非ヒト抗体の可変ドメインに対応し、ＦＲのすべてまたは実質的にすべてがヒト抗体の可変ドメインに対応する。ヒト化抗体が、任意で、ヒト抗体に由来する抗体不変領域の少なくとも一部を含んでよい。抗体の「ヒト化形態」、例えば、非ヒト抗体は、ヒト化された抗体を指す。   A “humanized” antibody refers to a chimeric antibody comprising amino acid residues derived from non-human HVRs and amino acid residues derived from human FRs. In certain embodiments, the humanized antibody comprises substantially at least one variable domain, and usually all two variable domains, and all or substantially all of the HVR (eg, CDR) is of a non-human antibody. Corresponding to the variable domain, all or substantially all of the FR corresponds to the variable domain of a human antibody. A humanized antibody may optionally comprise at least a portion of an antibody constant region derived from a human antibody. A “humanized form” of an antibody, eg, a non-human antibody, refers to a humanized antibody.

用語「超可変領域」または「ＨＶＲ」は、本明細書に用いる場合、配列中で超可変である、及び／または構造的に定義されるループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの各領域を指す。一般に、天然４鎖抗体は、６つのＨＶＲ：ＶＨ中の３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、及びＶＬ中の３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）を含む。ＨＶＲは、一般に、超可変ループ及び／または「相補性決定領域」（ＣＤＲ）に由来するアミノ酸残基を含み、後者は、配列可変性が最も高く、及び／または抗原認識に関与している。例示的超可変ループは、アミノ酸残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、９１〜９６（Ｌ３）、２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、及び９６〜１０１（Ｈ３）で生じる（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）。例示的ＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３）は、Ｌ１のアミノ酸残基２４〜３４、Ｌ２のアミノ酸残基５０〜５６、Ｌ３のアミノ酸残基８９〜９７、Ｈ１のアミノ酸残基３１〜３５Ｂ、Ｈ２のアミノ酸残基５０〜６５、及びＨ３のアミノ酸残基９５〜１０２で生じる。（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版．Ｐｕｂｌｉｃ ＨｅａｌｔｈＳｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１））。ＶＨ中のＣＤＲ１を除いて、ＣＤＲは、一般に超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。ＣＤＲは、また、抗原に接触する残基である「特異性決定残基」、または「ＳＤＲ」を含む。ＳＤＲは、短縮型ＣＤＲ、またはａ−ＣＤＲと称されるＣＤＲの領域内に含有される。例示的ａ−ＣＤＲ（ａ−ＣＤＲ−Ｌ１、ａ−ＣＤＲ−Ｌ２、ａ−ＣＤＲ−Ｌ３、ａ−ＣＤＲ−Ｈ１、ａ−ＣＤＲ−Ｈ２、及びａ−ＣＤＲ−Ｈ３）は、Ｌ１のアミノ酸残基３１〜３４、Ｌ２のアミノ酸残基５０〜５５、Ｌ３のアミノ酸残基８９〜９６、Ｈ１のアミノ酸残基３１〜３５Ｂ、Ｈ２のアミノ酸残基５０〜５８、及びＨ３のアミノ酸残基９５〜１０２で生じる。（Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−１６３３（２００８）を参照。）特に指示がないかぎり、本明細書では、前記のＫａｂａｔらに従って可変ドメイン中のＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）に番号を付与する。   The term “hypervariable region” or “HVR” as used herein is an antibody variable domain that is hypervariable in sequence and / or forms a structurally defined loop (“hypervariable loop”). Each area. In general, a natural 4-chain antibody comprises 3 in 6 HVR: VH (H1, H2, H3) and 3 in VL (L1, L2, L3). HVRs generally comprise amino acid residues derived from hypervariable loops and / or “complementarity determining regions” (CDRs), the latter being the most sequence variable and / or involved in antigen recognition. Exemplary hypervariable loops include amino acid residues 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), and 96-101 ( (Cothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)) Exemplary CDRs (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2, and CDR) -H3) is amino acid residues 24-34 of L1, amino acid residues 50-56 of L2, amino acid residues 89-97 of L3, amino acid residues 31-35B of H1, amino acid residues 50-65 of H2, And H3 at amino acid residues 95 to 102. (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interes 5th edition, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)) Except for CDR1 in VH, CDRs generally contain amino acid residues that form hypervariable loops. Includes “specificity-determining residues”, or “SDRs,” that are residues that contact antigens, which are contained within a region of a CDR referred to as a truncated CDR, or a-CDR. -CDRs (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2, and a-CDR-H3) are amino acid residues 31 to 34 of L1. , L2 amino acid residues 50-55, L3 amino acid residues 89-96, H1 amino acid residues 31-35B, H2 amino acid residues 50-58 and occurs at amino acid residues 95-102 of H3 (see Almagro and Francesson, Front. Biosci. 13: 1619-1633 (2008)). Numbers are assigned to HVR residues and other residues (eg, FR residues) in the variable domain according to Kabat et al.

「イムノコンジュゲート」は、これらに限定されないが細胞毒性薬剤を含む１つ以上の異種分子（単数及び複数）に結合する抗体である。   An “immunoconjugate” is an antibody that binds to one or more heterologous molecule (s), including but not limited to cytotoxic agents.

「個体」または「被験者」は、哺乳動物である。哺乳動物としては、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長動物（例えば、ヒト及び非ヒト霊長動物、例えば、サル）、ウサギ、及びげっ歯類動物（例えば、マウス及びラット）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、個体または被験者が、ヒトである。   An “individual” or “subject” is a mammal. Mammals include livestock animals (eg, cows, sheep, cats, dogs, and horses), primates (eg, human and non-human primates, eg, monkeys), rabbits, and rodents (eg, mice). And rats), but is not limited thereto. In certain embodiments, the individual or subject is a human.

「分離抗体」は、その自然環境の成分から分離された抗体である。いくつかの実施形態では、抗体が、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点分離法（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）またはロマトグラフ（例えば、イオン交換または逆相ＨＰＬＣ）によって測定したとおり、９５％超または９９％純度に精製される。抗体純度の評価方法の再検討では、例えば、Ｆｌａｔｍａｎら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ８４８：７９−８７（２００７）を参照。   An “isolated antibody” is an antibody that has been separated from components of its natural environment. In some embodiments, the antibody is as measured by, for example, electrophoresis (eg, SDS-PAGE, isoelectric focusing (IEF), capillary electrophoresis) or romatograph (eg, ion exchange or reverse phase HPLC). Purified to greater than 95% or 99% purity. For review of antibody purity assessment methods, see, for example, Flatman et al. Chromatogr. B848: 79-87 (2007).

「分離核酸」は、その自然環境の成分から分離された核酸分子を指す。分離核酸は、核酸分子を当初から含有する細胞中に含有される核酸分子を含むが、核酸分子は、染色体外に存在する、またはその天然染色***置と異なる染色***置に存在する。   An “isolated nucleic acid” refers to a nucleic acid molecule that has been separated from a component of its natural environment. An isolated nucleic acid includes a nucleic acid molecule contained in a cell that originally contains the nucleic acid molecule, but the nucleic acid molecule is present extrachromosomally or at a chromosomal location different from its natural chromosomal location.

「抗ＧＰＣ３抗体をコードする分離核酸」は、抗体重鎖及び軽鎖（またはこれらのフラグメント）をコードする１つ以上の核酸分子を指し、単一ベクターまたは別々のベクター中にかかる核酸分子（単数及び複数）を含み、かかる核酸分子（単数及び複数）は、宿主細胞中の１つ以上の位置に存在している。   An “isolated nucleic acid encoding an anti-GPC3 antibody” refers to one or more nucleic acid molecules encoding antibody heavy and light chains (or fragments thereof), such nucleic acid molecules (singular) in a single vector or separate vectors. And the nucleic acid molecule (s) are present at one or more locations in the host cell.

用語「ＧＰＣ３」、本明細書に用いる場合、細胞中のＧＰＣ３前駆体タンパク質のプロセッシングにより生ずる天然成熟ＧＰＣ３を指す。当該用語は、特に指示がない限り、哺乳動物、例えば、霊長動物（例えば、ヒト及びシノモルグスサル）及びげっ歯類動物（例えば、マウス及びラット）を含む脊椎動物ソースに由来するＧＰＣ３を含む。当該用語は、また、ＧＰＣ３の自然変異体、例えば、スプライス変異体またはアレリック変異体を含む。シグナル配列（シグナル配列、アミノ酸１〜２４を有する）を有する例示的ヒトＧＰＣ３前駆体タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号：１に示している。例示的成熟ヒトＧＰＣ３のアミノ酸配列は、配列番号：１のアミノ酸２５〜５８０である。シグナル配列を有し、非限定例であるシノモルグスサル、アカゲザル、マウス、及びラットのＧＰＣ３前駆体タンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号：３７〜４１に示している。   The term “GPC3”, as used herein, refers to native mature GPC3 that results from processing of GPC3 precursor protein in a cell. The term includes GPC3 from vertebrate sources including mammals, eg, primates (eg, humans and cynomolgus monkeys) and rodents (eg, mice and rats) unless otherwise indicated. The term also includes natural variants of GPC3, such as splice variants or allelic variants. The amino acid sequence of an exemplary human GPC3 precursor protein having a signal sequence (signal sequence, having amino acids 1-24) is shown in SEQ ID NO: 1. The amino acid sequence of an exemplary mature human GPC3 is amino acids 25-580 of SEQ ID NO: 1. The amino acid sequences of GPC3 precursor proteins of Cynomolgus monkey, Rhesus monkey, mouse and rat, which have a signal sequence and are non-limiting examples, are shown in SEQ ID NOs: 37 to 41, respectively.

用語「ＧＰＣ３−陽性癌」は、その表面上にＧＰＣ３を発現する細胞を含む癌を指す。いくつかの実施形態では、細胞表面上のＧＰＣ３の発現が、例えば、免疫組織化学、ＦＡＣＳなどの方法で、例えば、抗体〜ＧＰＣ３を用いて測定される。あるいは、ＧＰＣ３ｍＲＮＡ発現が、細胞表面上のＧＰＣ３発現と関係していると考えられており、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション及びＲＴ−ＰＣＲ（定量的ＲＴ−ＰＣＲを含む）から選択される方法によって測定することができる。   The term “GPC3-positive cancer” refers to a cancer comprising cells that express GPC3 on its surface. In some embodiments, the expression of GPC3 on the cell surface is measured by methods such as immunohistochemistry, FACS, eg, using antibody to GPC3. Alternatively, GPC3 mRNA expression is believed to be related to GPC3 expression on the cell surface and can be measured by a method selected from in situ hybridization and RT-PCR (including quantitative RT-PCR). it can.

用語「ＧＰＣ３−陽性細胞」は、その表面上にＧＰＣ３を発現する細胞を指す。   The term “GPC3-positive cell” refers to a cell that expresses GPC3 on its surface.

用語「単クローン性抗体」は、本明細書に用いる場合、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体を指す。すなわち、当該集団を含む個々の抗体は、例えば、自然に生じる変異または単クローン性抗体調製物の生成中に生じる変異を含有し、生じる可能性がある変異型（かかる変異型は一般に少量で存在する）抗体を除いて、同じものである、及び／または同じエピトープを結合する。通常、異なる決定因子（エピトープ）に向けられた異なる抗体を含む多クロ−ン性抗体調製とは対照的に、単クローン性抗体調製物の各単クローン性抗体は、抗原の単一決定因子に向けられる。したがって、修飾語「単クローン性」は、抗体の実質的に均質な集団から得られているとおりの抗体の特性を示し、任意の特定の方法による抗体の生成を必要とするとは解釈されない。例えば、本発明に従って用いられる単クローン性抗体は、これらに限定されないが、ハイブリドーマ法、遺伝子組み換えＤＮＡ法、ファージ提示法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座のすべてまたは一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含むさまざまな技術によって生成してよく、単クローン性抗体を生成するためのかかる方法及び他の例示的方法が本明細書に記載されている。   The term “monoclonal antibody” as used herein refers to an antibody obtained from a population of substantially homogeneous antibodies. That is, the individual antibodies that comprise the population contain, for example, naturally occurring mutations or mutations that may occur during the production of monoclonal antibody preparations, and such mutants are generally present in small amounts. Except for antibodies) that bind the same and / or the same epitope. In contrast to polyclonal antibody preparations that typically include different antibodies directed against different determinants (epitopes), each monoclonal antibody in a monoclonal antibody preparation is assigned to a single determinant of an antigen. Directed. Thus, the modifier “monoclonal” indicates the character of the antibody as being obtained from a substantially homogeneous population of antibodies, and is not to be construed as requiring production of the antibody by any particular method. For example, monoclonal antibodies used in accordance with the present invention include, but are not limited to, hybridoma methods, recombinant DNA methods, phage display methods, and transgenic animals containing all or part of human immunoglobulin loci. Such methods and other exemplary methods for generating monoclonal antibodies may be generated by various techniques, including methods described herein.

「裸抗体」は、異種部分（例えば、細胞毒性部分）または放射性同位元素標識に結合されない抗体を指す。裸抗体は、医薬製剤中に存在してよい。   “Naked antibody” refers to an antibody that is not bound to a heterologous moiety (eg, a cytotoxic moiety) or radioisotope label. Naked antibody may be present in a pharmaceutical formulation.

「天然抗体」は、構造を変化させる自然免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合している２つの同一軽鎖及び２つの同一重鎖からなる約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各重鎖が、Ｎ−末端からＣ−末端まで、可変領域（ＶＨ）を有し、これは、また、可変重ドメインまたは重鎖可変ドメインと称され、３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）に続く。同様に、各軽鎖が、Ｎ−末端からＣ−末端まで、可変領域（ＶＬ）を有し、これは、また、可変軽ドメインまたは軽鎖可変ドメインと称され、定常軽（ＣＬ）ドメインに続く。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づくカッパ（κ）及びラムダ（λ）と称される２つの型の１つに対応付けしてよい。   “Natural antibody” refers to a natural immunoglobulin molecule that changes structure. For example, a native IgG antibody is a heterotetrameric glycoprotein of approximately 150,000 daltons composed of two identical light chains and two identical heavy chains that are disulfide bonded. Each heavy chain has a variable region (VH) from the N-terminus to the C-terminus, also referred to as a variable heavy domain or heavy chain variable domain, and three constant domains (CH1, CH2, and Continue to CH3). Similarly, each light chain has a variable region (VL), from the N-terminus to the C-terminus, which is also referred to as a variable light domain or light chain variable domain, in the constant light (CL) domain. Continue. The light chain of an antibody may be associated with one of two types called kappa (κ) and lambda (λ) based on the amino acid sequence of its constant domain.

用語「添付文書」は、適応、使用法、用量、投与、組み合わせ治療、禁忌及び／またはかかる治療製品の使用に関わる注意事項についての情報を含有し、治療製品の商業包装に慣例的に含まれる指示書を指すために用いられる。   The term “package insert” contains information about indications, usage, doses, administration, combination therapies, contraindications and / or precautions regarding the use of such therapeutic products and is customarily included in commercial packaging of therapeutic products Used to refer to instructions.

参照ポリペプチド配列に関しての「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列同一性の一部として保存的置換を考慮せず、必要であれば、最大パーセント配列同一性を実現するために、配列をアラインし、ギャップを導入した後の参照リペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージと定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定するためのアラインメントは、当技術分野の技術内にあるさまざまな方法で、例えば、公に入手可能なコンピューターソフトウエア、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアを用いて実現することができる。当業者であれば、比較される配列の完全長を越える最大アラインメントを実現するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインするための好適なパラメーターを決定することができる。しかし、本明細書の目的では、％アミノ酸配列同一性値が、配列比較コンピュータープログラムＡＬＩＧＮ−２を用いて生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータープログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によって作製され、ソースコードは、Ｕ．Ｓ．Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ Ｏｆｆｉｃｅ、ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＤ．Ｃ．、２０５５９にユーザードキュメンテーションとともにファイルされ、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから公に入手可能であり、またはソースコードからコンパイルしてよい。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸＶ４．０Ｄを含むＵＮＩＸオペレーティングシステムで使用するためにコンパイルしなければならない。全配列比較パラメーターは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され、変化しない。   “Percent (%) amino acid sequence identity” with respect to a reference polypeptide sequence does not take into account conservative substitutions as part of sequence identity and, if necessary, to achieve maximum percent sequence identity. Is defined as the percentage of amino acid residues in the candidate sequence that are identical to the amino acid residues in the reference repeptide sequence after the gap is introduced. Alignments for determining percent amino acid sequence identity can be performed in various ways within the skill of the art, for example, publicly available computer software such as BLAST, BLAST-2, ALIGN or Megalign (DNASTAR It can be realized using software. One skilled in the art can determine suitable parameters for aligning sequences, including any algorithms needed to achieve maximal alignment over the full length of the sequences being compared. However, for purposes herein,% amino acid sequence identity values are generated using the sequence comparison computer program ALIGN-2. The ALIGN-2 sequence comparison computer program is available from Genentech, Inc. The source code is U.S. S. Copyright Office, Washington D.C. C. , 20559, with user documentation and registered under US copyright registration number TXU510087. The ALIGN-2 program is available from Genentech, Inc. , South San Francisco, California, or may be compiled from source code. The ALIGN-2 program must be compiled for use on a UNIX operating system, including digital UNIX V4.0D. All sequence comparison parameters are set by the ALIGN-2 program and do not change.

ＡＬＩＧＮ−２がアミノ酸配列比較に用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Ｂとの、所与のアミノ酸配列Ｂによる、または所与のアミノ酸配列Ｂに対する所与のアミノ酸配列Ａ（代わりに所与のアミノ酸配列Ｂとの、所与のアミノ酸配列Ｂによる、または所与のアミノ酸配列Ｂに対する特定の％アミノ酸配列同一性を有する、または含む所与のアミノ酸配列Ａとして表現することができる）の％アミノ酸配列同一性は、以下のとおり、計算される。
フラクションＸ／Ｙの１００倍
Ｘは、プログラムのアラインメントＡ及びＢで配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２によって同一性マッチとスコアされたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂのアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さは、アミノ酸配列Ｂの長さと等しくなく、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性と等しくないと理解される。特に記載しない限り、本明細書に用いられる全％アミノ酸配列同一性値は、直前の段落に記載されるとおり、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータープログラムを用いて得られる。 In situations where ALIGN-2 is used for amino acid sequence comparisons, a given amino acid sequence A with a given amino acid sequence B, by or against a given amino acid sequence B (instead of a given amino acid sequence B) % Amino acids having a specific% amino acid sequence identity with or including a given amino acid sequence B, or with a given amino acid sequence B) Sequence identity is calculated as follows.
Fraction X / Y 100 times X is the number of amino acid residues scored as an identity match by the sequence alignment program ALIGN-2 in program alignments A and B, and Y is the total number of amino acid residues in B is there. It is understood that the length of amino acid sequence A is not equal to the length of amino acid sequence B, and the percent amino acid sequence identity of A to B is not equal to the percent amino acid sequence identity of B to A. Unless stated otherwise, all% amino acid sequence identity values used herein are obtained using the ALIGN-2 computer program as described in the immediately preceding paragraph.

用語「医薬製剤」は、その中に含有される有効成分の生物活性が効果的となるような形態中にあり、製剤が投与される被験者に対して容認できないほど毒性がある追加成分を含有しない調製物を指す。   The term “pharmaceutical formulation” is in a form such that the biological activity of the active ingredient contained therein is effective and does not contain additional ingredients that are unacceptably toxic to the subject to which the formulation is administered. Refers to a preparation.

「製剤的に許容可能なキャリア」は、被験者に対して毒性がなく、有効成分以外の医薬製剤中の成分を指す。製剤的に許容可能なキャリアとしては、緩衝液、賦形剤、安定剤、または防腐剤が挙げられるが、これらに限定されない。   “Pharmaceutically acceptable carrier” refers to an ingredient in a pharmaceutical formulation other than the active ingredient that is not toxic to the subject. Pharmaceutically acceptable carriers include, but are not limited to, buffers, excipients, stabilizers, or preservatives.

本明細書に使用する場合、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」（およびその文法的変化、例えば、「治療する（ｔｒｅａｔ）」または「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」）は、治療される患者の自然経過を変えようとする臨床的介入を意味し、予防のためまたは臨床病理学の経過の間に実施することができるものである。治療の望ましい効果としては、疾患の発症または再発を防ぐこと、症状の軽減、疾患の直接または間接的な病理的結果の減少、転移の阻止、疾患進行率を低下させること、疾患病態の改善または好転、および緩解または改善した予後が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本発明の抗体が疾患の発症を遅らせる、または疾患の進行を遅らせるために用いられる。   As used herein, “treatment” (and grammatical changes thereof, eg, “treat” or “treating”) alter the natural course of the patient being treated. Means clinical intervention to be performed and can be carried out for prevention or during the course of clinical pathology. Desirable effects of treatment include prevention of disease onset or recurrence, reduction of symptoms, reduction of direct or indirect pathological consequences of disease, prevention of metastasis, reduction of disease progression rate, improvement of disease pathology or Improvement, and remission or improved prognosis, including but not limited to. In some embodiments, the antibodies of the invention are used to delay the onset of the disease or delay the progression of the disease.

用語「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与している抗体重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖（それぞれＶＨ及びＶＬ）の可変ドメインは、一般に、ほぼ同じ構造を有し、各ドメインが４つの保存フレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む。（例えば、ＫｉｎｄｔらＫｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第６版，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，ｐａｇｅ ９１（２００７）を参照。）単一ＶＨまたはＶＬドメインは、抗原−結合特異性を与えるのに十分なものとしてよい。さらに、特定の抗原を結合する抗体は、それぞれの相補的ＶＬまたはＶＨドメインのライブラリー、をスクリーニングするためにＶＨまたはＶＬドメインを用いて抗原を結合する抗体から分離してよい。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：８８０−８８７（１９９３）； Ｃｌａｒｋｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８（１９９１）を参照。   The term “variable region” or “variable domain” refers to the domain of an antibody heavy or light chain that is involved in binding an antibody to an antigen. The variable domains of natural antibody heavy and light chains (VH and VL, respectively) generally have approximately the same structure, with each domain comprising four conserved framework regions (FR) and three hypervariable regions (HVR). Including. (See, eg, Kindt et al. Kuby Immunology, 6th edition, WH Freeman and Co., page 91 (2007).) A single VH or VL domain is sufficient to confer antigen-binding specificity. As good as In addition, antibodies that bind a particular antigen may be separated from antibodies that bind the antigen using VH or VL domains to screen a library of respective complementary VL or VH domains. For example, Portolano et al., J. MoI. Immunol. 150: 880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352: 624-628 (1991).

用語「ベクター」は、本明細書に用いる場合、結合しているもう１つの核酸を増殖させることができる核酸分子を指す。当該用語は、自己複製核酸構造としてのベクターならびに導入された宿主細胞のゲノムに組み入れられるベクターを含む。特定のベクターは、機能的に結合している核酸の発現を命令することができる。かかるベクターは、本明細書では「発現ベクター」を指す。   The term “vector” as used herein refers to a nucleic acid molecule capable of propagating another nucleic acid to which it has been linked. The term includes vectors as self-replicating nucleic acid structures as well as vectors that integrate into the genome of an introduced host cell. Certain vectors can direct the expression of functionally linked nucleic acids. Such vectors are referred to herein as “expression vectors”.

「アルキル」は、ノルマル、第二級、第三級または環状炭素原子を含有するＣ１−Ｃ１８炭化水素である。その例は、メチル（Ｍｅ、−ＣＨ３）、エチル（Ｅｔ、−ＣＨ２ＣＨ３）、１−プロピル（ｎ−Ｐｒ、ｎ−プロピル、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、２−プロピル（ｉ−Ｐｒ、ｉ−プロピル、−ＣＨ（ＣＨ３）２）、１−ブチル（ｎ−Ｂｕ、ｎ−ブチル、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、２−メチル−１−プロピル（ｉ−Ｂｕ、ｉ−ブチル、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２）、２−ブチル（ｓ−Ｂｕ、ｓ−ブチル、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３）、２−メチル−２−プロピル（ｔ−Ｂｕ、ｔ−ブチル、−Ｃ（ＣＨ３）３）、１−ペンチル（ｎ−ペンチル、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、２−ペンチル（−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、３−ペンチル（−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２）、２−メチル−２−ブチル（−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ３）、３−メチル−２−ブチル（−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）２）、３−メチル−１−ブチル（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２）、２−メチル−１−ブチル（−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３）、１−ヘキシル（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、２−ヘキシル（−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、３−ヘキシル（−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３））、２−メチル−２−ペンチル（−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、３−メチル−２−ペンチル（−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３）、４−メチル−２−ペンチル（−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２）、３−メチル−３−ペンチル（−Ｃ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）２）、２−メチル−３−ペンチル（−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）２）、２，３−ジメチル−２−ブチル（−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ（ＣＨ３）２）、３，３−ジメチル−２−ブチル（−ＣＨ（ＣＨ３）Ｃ（ＣＨ３）３である。 “Alkyl” is a C 1 -C 18 hydrocarbon containing normal, secondary, tertiary or cyclic carbon atoms. Examples thereof are methyl (Me, —CH 3 ), ethyl (Et, —CH 2 CH 3 ), 1-propyl (n-Pr, n-propyl, —CH 2 CH 2 CH 3 ), 2-propyl (i -pr, i-propyl, -CH (CH 3) 2) , 1- butyl (n-Bu, n- butyl, -CH 2 CH 2 CH 2 CH 3), 2- methyl-1-propyl (i-Bu , i- butyl, -CH 2 CH (CH 3) 2), 2- butyl (s-Bu, s- butyl, -CH (CH 3) CH 2 CH 3), 2- methyl-2-propyl (t- Bu, t-butyl, —C (CH 3 ) 3 ), 1-pentyl (n-pentyl, —CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 3 ), 2-pentyl (—CH (CH 3 ) CH 2 CH 2 CH 3), 3- pentyl (-CH (CH 2 CH 3) 2), 2 - methyl-2-butyl (-C (CH 3) 2 CH 2 CH 3), 3- methyl-2-butyl (-CH (CH 3) CH ( CH 3) 2), 3- methyl-l -butyl ( -CH 2 CH 2 CH (CH 3 ) 2), 2- methyl-1-butyl (-CH 2 CH (CH 3) CH 2 CH 3), 1- hexyl (-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 3), 2-hexyl (-CH (CH 3) CH 2 CH 2 CH 2 CH 3), 3- hexyl (-CH (CH 2 CH 3) (CH 2 CH 2 CH 3)), 2- methyl - 2-pentyl (-C (CH 3) 2 CH 2 CH 2 CH 3), 3- methyl-2-pentyl (-CH (CH 3) CH ( CH 3) CH 2 CH 3), 4- methyl-2- pentyl (-CH (CH 3) CH 2 CH (CH 3) ), 3-methyl-3-pentyl (-C (CH 3) (CH 2 CH 3) 2), 2- methyl-3-pentyl (-CH (CH 2 CH 3) CH (CH 3) 2), 2 , 3-dimethyl-2-butyl (—C (CH 3 ) 2 CH (CH 3 ) 2 ), 3,3-dimethyl-2-butyl (—CH (CH 3 ) C (CH 3 ) 3 .

用語「Ｃ１−Ｃ８アルキル」は、本明細書に用いる場合、１〜８個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖、飽和または不飽和炭化水素を指す。代表的な「Ｃ１−Ｃ８アルキル」基としては、−メチル、−エチル、−ｎ−プロピル、−ｎ−ブチル、−ｎ−ペンチル、−ｎ−ヘキシル、−ｎ−ヘプチル、−ｎ−オクチル、−ｎ−ノニル及び−ｎ−デシルが挙げられるが、これらに限定されない；また、分枝鎖Ｃ１−Ｃ８アルキルとしては、−イソプロピル、−ｓｅｃ−ブチル、−イソブチル、−ｔｅｒｔ−ブチル、−イソペンチル、２−メチルブチルが挙げられるが、これらに限定されない；不飽和Ｃ１−Ｃ８アルキルとしては、−ビニル、−アリル、−１−ブテニル、−２ブテニル、−イソブチレニル、−１−ペンテニル、−２−ペンテニル、−３−メチル−１−ブテニル、−２−メチル−２−ブテニル、−２、３−ジメチル−２−ブテニル、１−ヘキシル、２−ヘキシル、３−ヘキシル、−アセチレニル、−プロピニル、−１−ブチニル、−２−ブチニル、−１−ペンチニル、−２−ペンチニル、−３−メチル−１−ブチニルが挙げられるが、これらに限定されない。Ｃ１−Ｃ８アルキル基は、非置換とする、または、これらに限定されないが、−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）、−アリール、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）または’、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ’、−ＳＯ３Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−ＯＨ、−ハロゲン、−Ｎ３、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｒ’）、−Ｎ（Ｒ’）２及び−ＣＮを含む１つ以上の基で置換することができる；各Ｒ’は、Ｈ、−Ｃ１−Ｃ８アルキル及びアリールから独立して選択される。 The term “C 1 -C 8 alkyl” as used herein refers to a straight or branched chain, saturated or unsaturated hydrocarbon having from 1 to 8 carbon atoms. Representative “C 1 -C 8 alkyl” groups include -methyl, -ethyl, -n-propyl, -n-butyl, -n-pentyl, -n-hexyl, -n-heptyl, -n-octyl. , -N-nonyl and -n-decyl; but also branched C 1 -C 8 alkyl includes -isopropyl, -sec-butyl, -isobutyl, -tert-butyl, - isopentyl, but 2-methylbutyl and the like, but are not limited to, unsaturated C 1 -C 8 alkyl, - vinyl, - allyl, 1-butenyl, -2-butenyl, - isobutylenyl, 1-pentenyl, -2-pentenyl, -3-methyl-1-butenyl, -2-methyl-2-butenyl, -2, 3-dimethyl-2-butenyl, 1-hexyl, 2-hexyl, 3- Cyclohexyl, - acetylenyl, - propynyl, 1-butynyl, 2-butynyl, 1-pentynyl, 2-pentynyl, 3-methyl-1-but-butynyl, and the like. C 1 -C 8 alkyl group, an unsubstituted or, but not limited to, -C 1 -C 8 alkyl, -O- (C 1 -C 8 alkyl), - aryl, -C (O) R ′, —OC (O) R ′, —C (O) or “, —C (O) NH 2 , —C (O) NHR ′, —C (O) N (R ′) 2 —NHC (O ) R ′, —SO 3 R ′, —S (O) 2 R ′, —S (O) R ′, —OH, —halogen, —N 3 , —NH 2 , —NH (R ′), —N (R ′) can be substituted with one or more groups including 2 and —CN; each R ′ is independently selected from H, —C 1 -C 8 alkyl and aryl.

用語「Ｃ１−Ｃ１２アルキル」は、本明細書に用いる場合、１〜１２個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖、飽和または不飽和炭化水素を指す。Ｃ１−Ｃ１２アルキル基は、非置換とする、または、これらに限定されないが、−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）、−アリール、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ’、−ＳＯ３Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−ＯＨ、−ハロゲン、−Ｎ３、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｒ’）、−Ｎ（Ｒ’）２及び−ＣＮを含む１つ以上の基で置換することができる；各Ｒ’は、Ｈ、−Ｃ１−Ｃ８アルキル及びアリールから独立して選択される。 The term “C 1 -C 12 alkyl” as used herein refers to a straight or branched chain, saturated or unsaturated hydrocarbon having from 1 to 12 carbon atoms. C 1 -C 12 alkyl group, an unsubstituted or, but not limited to, -C 1 -C 8 alkyl, -O- (C 1 -C 8 alkyl), - aryl, -C (O) R ′, —OC (O) R ′, —C (O) OR ′, —C (O) NH 2 , —C (O) NHR ′, —C (O) N (R ′) 2 —NHC (O ) R ′, —SO 3 R ′, —S (O) 2 R ′, —S (O) R ′, —OH, —halogen, —N 3 , —NH 2 , —NH (R ′), —N (R ′) can be substituted with one or more groups including 2 and —CN; each R ′ is independently selected from H, —C 1 -C 8 alkyl and aryl.

用語「Ｃ１−Ｃ６アルキル」は、本明細書に用いる場合、１〜６個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖、飽和または不飽和炭化水素を指す。代表的な「Ｃ１−Ｃ６アルキル」基としては、−メチル、−エチル、−ｎ−プロピル、−ｎ−ブチル、−ｎ−ペンチル、−及びｎ−ヘキシルが挙げられるが、これらに限定されない；また、分枝鎖Ｃ１−Ｃ６アルキルとしては、−イソプロピル、−ｓｅｃ−ブチル、−イソブチル、−ｔｅｒｔ−ブチル、−イソペンチル、及び２−メチルブチルが挙げられるが、これらに限定されない；不飽和Ｃ１−Ｃ６アルキルとしては、−ビニル、−アリル、−１−ブテニル、−２−ブテニル、及び−イソブチレニル、−１−ペンテニル、−２−ペンテニル、−３−メチル−１−ブテニル、−２−メチル−２−ブテニル、−２，３−ジメチル−２−ブテニル、１−ヘキシル、２−ヘキシル、及び３−ヘキシルが挙げられるが、これらに限定されない。Ｃ１−Ｃ６アルキル基は、非置換とする、または、Ｃ１−Ｃ８アルキル基について前記に記載したとおり、１つ以上の基で置換することができる。 The term “C 1 -C 6 alkyl” as used herein refers to a straight or branched chain, saturated or unsaturated hydrocarbon having from 1 to 6 carbon atoms. Exemplary “C 1 -C 6 alkyl” groups include, but are not limited to, -methyl, -ethyl, -n-propyl, -n-butyl, -n-pentyl,-, and n-hexyl. Branched chain C 1 -C 6 alkyl also includes, but is not limited to, -isopropyl, -sec-butyl, -isobutyl, -tert-butyl, -isopentyl, and 2-methylbutyl; C 1 -C 6 alkyl includes -vinyl, -allyl, -1-butenyl, -2-butenyl, and -isobutenyl, -1-pentenyl, -2-pentenyl, -3-methyl-1-butenyl, -2 -Methyl-2-butenyl, -2,3-dimethyl-2-butenyl, 1-hexyl, 2-hexyl, and 3-hexyl include, but are not limited to C 1 -C 6 alkyl group, and unsubstituted or, as described above for C 1 -C 8 alkyl group can be substituted with one or more groups.

用語「Ｃ１−Ｃ４アルキル」は、本明細書に用いる場合、１〜４個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖、飽和または不飽和炭化水素を指す。代表的な「Ｃ１−Ｃ４アルキル」基としては、−メチル、−エチル、−ｎ−プロピル、−ｎブチルが挙げられるが、これらに限定されない；また、分枝鎖Ｃ１−Ｃ４アルキルとしては、−イソプロピル、−ｓｅｃ−ブチル、−イソブチル、−ｔｅｒｔ−ブチルが挙げられるが、これらに限定されない不飽和Ｃ１−Ｃ４アルキルとしては、−ビニル、−アリル、−１−ブテニル、−２−ブテニル、及び−イソブチレニルが挙げられるが、これらに限定されない。Ｃ１−Ｃ４アルキル基は、非置換とする、または、Ｃ１−Ｃ８アルキル基について前記に記載したとおり、１つ以上の基で置換することができる。 The term “C 1 -C 4 alkyl” as used herein refers to a straight or branched chain, saturated or unsaturated hydrocarbon having from 1 to 4 carbon atoms. Exemplary “C 1 -C 4 alkyl” groups include, but are not limited to, -methyl, -ethyl, -n-propyl, -n butyl; and branched chain C 1 -C 4 alkyl the, - isopropyl,-sec-butyl, - isobutyl, including but -tert- butyl, as is not limited to these unsaturated C 1 -C 4 alkyl, - vinyl, - allyl, 1-butenyl, - Examples include, but are not limited to, 2-butenyl and -isobutylenyl. A C 1 -C 4 alkyl group can be unsubstituted or substituted with one or more groups as described above for C 1 -C 8 alkyl groups.

「アルコキシ」は、酸素に単結合したアルキル基である。例示的アルコキシ基としては、メトキシ（−ＯＣＨ３）及びエトキシ（−ＯＣＨ２ＣＨ３）が挙げられるが、これらに限定されない。「Ｃ１−Ｃ５アルコキシ」は、１〜５個の炭素原子を有するアルコキシ基である。アルコキシ基は、非置換とする、または、アルキル基について前記に記載したとおり、１つ以上の基で置換することができる。 “Alkoxy” is an alkyl group that is single bonded to oxygen. Exemplary alkoxy groups include, but are not limited to, methoxy (—OCH 3 ) and ethoxy (—OCH 2 CH 3 ). “C 1 -C 5 alkoxy” is an alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms. An alkoxy group can be unsubstituted or substituted with one or more groups as described above for alkyl groups.

「アルケニル」は、不飽和、すなわち、炭素−炭素、ｓｐ２二重結合の少なくとも１つの部位を有するノルマル、第二級、第三級または環状炭素原子を含有するＣ２−Ｃ１８炭化水素である。その例としては、エチレンまたはビニル（-ＣＨ＝ＣＨ２）、アリル（-ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）、シクロペンテニル（-Ｃ５Ｈ７）、及び５−ヘキセニル（-ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）が挙げられるが、これらに限定されない。「Ｃ２−Ｃ８アルケニル」は、不飽和、すなわち、炭素−炭素、ｓｐ２二重結合の少なくとも１つの部位を有する２〜８個のノルマル、第二級、第三級または環状炭素原子を含有する炭化水素である。 “Alkenyl” is an unsaturated, ie C 2 -C 18 hydrocarbon containing normal, secondary, tertiary or cyclic carbon atoms having at least one site of carbon-carbon, sp 2 double bond. is there. Examples include ethylene or vinyl (—CH═CH 2 ), allyl (—CH 2 CH═CH 2 ), cyclopentenyl (—C 5 H 7 ), and 5-hexenyl (—CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH = CH 2) include, but are not limited to. “C 2 -C 8 alkenyl” refers to unsaturated, ie 2-8 normal, secondary, tertiary or cyclic carbon atoms having at least one site of carbon-carbon, sp 2 double bond. Contains hydrocarbons.

「アルキニル」は、不飽和、すなわち、炭素−炭素、ｓｐ三重結合の少なくとも１つの部位を有するノルマル、第二級、第三級または環状炭素原子を含有するＣ２−Ｃ１８炭化水素である。その例としては、アセチレン基（−Ｃ≡ＣＨ）及びプロパルギル基（−ＣＨ２Ｃ≡ＣＨ）が挙げられるが、これらに限定されない。「Ｃ２−Ｃ８アルキニル」は、不飽和、すなわち、炭素−炭素、ｓｐ三重結合の少なくとも１つの部位を有する２〜８個のノルマル、第二級、第三級または環状炭素原子を含有する炭化水素である。 “Alkynyl” is an unsaturated, ie C 2 -C 18 hydrocarbon containing normal, secondary, tertiary or cyclic carbon atoms having at least one site of carbon-carbon, sp triple bond. Examples thereof include, but are not limited to, an acetylene group (—C≡CH) and a propargyl group (—CH 2 C≡CH). “C 2 -C 8 alkynyl” is unsaturated, ie contains 2 to 8 normal, secondary, tertiary or cyclic carbon atoms having at least one site of carbon-carbon, sp triple bond. It is a hydrocarbon.

「アルキレン」は、１〜１８個の炭素原子の飽和、分枝鎖または直鎖または環状炭化水素ラジカルを指し、親アルカンの同じ炭素原子または２個の異なる炭素原子から２個の水素原子を除去することによって誘導される２個の一価ラジカル中心を有する。典型的なアルキレンラジカルとしては、メチレン（−ＣＨ２−）１，２−エチル（−ＣＨ２ＣＨ２−）、１，３−プロピル（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、１，４−ブチル（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）などが挙げられるが、これらに限定されない。 “Alkylene” refers to a saturated, branched or straight chain or cyclic hydrocarbon radical of 1 to 18 carbon atoms, removing two hydrogen atoms from the same carbon atom or from two different carbon atoms of the parent alkane. It has two monovalent radical centers that are induced by Typical alkylene radicals include methylene (—CH 2 —) 1,2-ethyl (—CH 2 CH 2 —), 1,3-propyl (—CH 2 CH 2 CH 2 —), 1,4-butyl. (-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -) but the like, but not limited to.

「Ｃ１−Ｃ１０アルキレン」は、式−（ＣＨ２）１−１０−の直鎖、飽和炭化水素基である。Ｃ１−Ｃ１０アルキレンの例としては、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、ヘキシレン、ヘプチレン、オクチレン、ノニレン及びデカレンが挙げられる。 “C 1 -C 10 alkylene” is a straight chain, saturated hydrocarbon group of the formula — (CH 2 ) 1-10 —. Examples of C 1 -C 10 alkylene include methylene, ethylene, propylene, butylene, pentylene, hexylene, heptylene, octylene, nonylene and decalene.

「アルケニレン」は、２〜１８個の炭素原子の不飽和、分枝鎖または直鎖または環状炭化水素ラジカルを指し、親アルケンの同じ炭素原子または２個の異なる炭素原子から２個の水素原子を除去することによって誘導される２個の一価ラジカル中心を有する。典型的なアルケニレンラジカルとしては、１，２−エチレン（−ＣＨ＝ＣＨ−）が挙げられるが、これらに限定されない。   “Alkenylene” refers to an unsaturated, branched or straight chain or cyclic hydrocarbon radical of 2 to 18 carbon atoms, where two hydrogen atoms from the same carbon atom or from two different carbon atoms of the parent alkene. Has two monovalent radical centers induced by removal. Exemplary alkenylene radicals include, but are not limited to, 1,2-ethylene (—CH═CH—).

「アルキニレン」は、２〜１８個の炭素原子の不飽和、分枝鎖または直鎖または環状炭化水素ラジカルを指し、親アルキンの同じ炭素原子または２個の異なる炭素原子から２個の水素原子を除去することによって誘導される２個の一価ラジカル中心を有する。典型的なアルキニレンラジカルとしては、アセチレン（−Ｃ≡Ｃ−）、プロパルギル（−ＣＨ２Ｃ≡Ｃ−）、及び４−ペンチニル（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｃ≡Ｃ−）が挙げられるが、これらに限定されない。 “Alkynylene” refers to an unsaturated, branched or straight chain or cyclic hydrocarbon radical of 2 to 18 carbon atoms, where two hydrogen atoms from the same carbon atom or from two different carbon atoms of the parent alkyne. Has two monovalent radical centers induced by removal. Typical alkynylene radicals include acetylene (—C≡C—), propargyl (—CH 2 C≡C—), and 4-pentynyl (—CH 2 CH 2 CH 2 C≡C—). However, it is not limited to these.

「アリール」は、炭素環式芳香族基を指す。アリール基の例としては、フェニル、ナフチル及びアントラセニルが挙げられるが、これらに限定されない。炭素環式芳香族基または複素環式芳香族基は、非置換とする、または、これらに限定されないが、−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）、−アリール、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）または’、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−ＯＨ、−ハロゲン、−Ｎ３、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｒ’）、−Ｎ（Ｒ’）２及び−ＣＮ含む１つ以上の基で置換することができる；各Ｒ’は、Ｈ、−Ｃ１−Ｃ８アルキル及びアリールから独立して選択される。 “Aryl” refers to a carbocyclic aromatic group. Examples of aryl groups include, but are not limited to, phenyl, naphthyl and anthracenyl. A carbocyclic aromatic group or heterocyclic aromatic group may be unsubstituted, but not limited to, —C 1 -C 8 alkyl, —O— (C 1 -C 8 alkyl), —aryl , -C (O) R ', - OC (O) R', - C (O) or ', -C (O) NH 2 , -C (O) NHR', - C (O) N (R ' ) 2 —NHC (O) R ′, —S (O) 2 R ′, —S (O) R ′, —OH, —halogen, —N 3 , —NH 2 , —NH (R ′), —N (R ′) 2 and —CN can be substituted with one or more groups; each R ′ is independently selected from H, —C 1 -C 8 alkyl and aryl.

「Ｃ５−Ｃ２０アリール」は、炭素環式芳香環中に５〜２０個の炭素原子を有するアリール基である。Ｃ５−Ｃ２０アリール基の例としては、フェニル、ナフチル及びアントラセニルが挙げられるが、これらに限定されない。Ｃ５−Ｃ２０アリール基は、アリール基について前記に記載したとおり、置換する、または非置換とすることができる。「Ｃ５−Ｃ１４アリール」は、炭素環式芳香環中に５〜１４個の炭素原子を有するアリール基である。Ｃ５−Ｃ１４アリール基の例としては、フェニル、ナフチル及びアントラセニルが挙げられるが、これらに限定されない。Ｃ５−Ｃ１４アリール基は、アリール基について前記に記載したとおり、置換する、または非置換とすることができる。 “C 5 -C 20 aryl” is an aryl group having from 5 to 20 carbon atoms in the carbocyclic aromatic ring. Examples of C 5 -C 20 aryl groups include, but are not limited to, phenyl, naphthyl, and anthracenyl. C 5 -C 20 aryl group as described above for an aryl group, can be substituted for, or unsubstituted. “C 5 -C 14 aryl” is an aryl group having 5 to 14 carbon atoms in the carbocyclic aromatic ring. Examples of C 5 -C 14 aryl groups include, but are not limited to, phenyl, naphthyl and anthracenyl. C 5 -C 14 aryl group as described above for an aryl group, can be substituted for, or unsubstituted.

「アリレン」は、２つの共有結合を有するアリール基であり、以下の構造に示したとおり、オルト、メタ、またはパラ配置とすることができる。
フェニル基は、非置換とする、または、これらに限定されないが、−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）、−アリール、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）または’、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−ＯＨ、−ハロゲン、−Ｎ３、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｒ’）、−Ｎ（Ｒ’）２及び−ＣＮを含む４個までの基で置換することができる；各Ｒ’は、Ｈ、−Ｃ１−Ｃ８アルキル及びアリールから独立して選択される。 “Arylene” is an aryl group having two covalent bonds and can be in the ortho, meta, or para configuration, as shown in the structure below.
Phenyl group, and unsubstituted or, but not limited to, -C 1 -C 8 alkyl, -O- (C 1 -C 8 alkyl), - aryl, -C (O) R ', - OC (O) R ', - C (O) or', -C (O) NH 2 , -C (O) NHR ', - C (O) N (R') 2 -NHC (O) R ', - 4 including S (O) 2 R ′, —S (O) R ′, —OH, —halogen, —N 3 , —NH 2 , —NH (R ′), —N (R ′) 2 and —CN. Each R ′ is independently selected from H, —C 1 -C 8 alkyl and aryl.

「アリールアルキル」は、炭素原子、典型的には末端またはｓｐ３炭素原子に結合した水素原子の１つが、アリールラジカルで置換されている環状アルキルラジカルを指す。典型的なアリールアルキル基としては、ベンジル、２−フェニルエタン−１−イル、２−フェニルエテン−１−イル、ナフチルメチル、２−ナフチルエタン−１−イル、２−ナフチルエテン−１−イル、ナフトベンジル、２−ナフトフェニルエタン−１−イルなどが挙げられるが、これらに限定されない。アリールアルキル基は、６〜２０個の炭素原子、例えば、アルカニル、アルケニルまたはアルキニル基を含むアルキル部分を含み、アリールアルキル基は、１〜６個の炭素原子であり、及びアリール部分は、５〜１４個の炭素原子である。 “Arylalkyl” refers to a cyclic alkyl radical in which one of the hydrogen atoms bonded to a carbon atom, typically a terminal or sp 3 carbon atom, is replaced with an aryl radical. Typical arylalkyl groups include benzyl, 2-phenylethane-1-yl, 2-phenylethen-1-yl, naphthylmethyl, 2-naphthylethane-1-yl, 2-naphthylethen-1-yl, naphtho Examples include, but are not limited to, benzyl and 2-naphthphenylphenyl-1-yl. An arylalkyl group comprises an alkyl moiety comprising 6 to 20 carbon atoms, for example, an alkanyl, alkenyl or alkynyl group, an arylalkyl group is 1 to 6 carbon atoms, and an aryl moiety is 5 to 5 carbon atoms. 14 carbon atoms.

「ヘテロアリールアルキル」は、炭素原子、典型的には末端またはｓｐ３炭素原子に結合した水素原子の１つが、ヘテロアリールラジカルで置換されている環状アルキルラジカルを指す。典型的なヘテロアリールアルキル基としては、２−ベンズイミダゾリルメチル、２−フリルエチルなどが挙げられるが、これらに限定されない。ヘテロアリールアルキル基は、６〜２０個の炭素原子、例えば、アルカニル、アルケニルまたはアルキニル基を含むアルキル部分を含み、ヘテロアリールアルキル基は、１〜６個の炭素原子であり、ヘテロアリール部分は、５〜１４個の炭素原子であり、１〜３個のヘテロ原子は、Ｎ、Ｏ、Ｐ、及びＳから選択される。ヘテロアリールアルキル基のヘテロアリール部分は、３〜７個の環員（２〜６個の炭素原子）を有する単環、または７〜１０個の環員（４〜９個の炭素原子及びＮ、Ｏ、Ｐ、及びＳから選択される１〜３個のヘテロ原子）を有する二環、例えば、ビシクロ［４，５］、［５，５］、［５，６］、または［６，６］系としてよい。 “Heteroarylalkyl” refers to a cyclic alkyl radical in which one of the hydrogen atoms bonded to a carbon atom, typically a terminal or sp 3 carbon atom, is replaced with a heteroaryl radical. Typical heteroarylalkyl groups include, but are not limited to, 2-benzimidazolylmethyl, 2-furylethyl, and the like. A heteroarylalkyl group contains an alkyl moiety containing 6-20 carbon atoms, for example an alkanyl, alkenyl or alkynyl group, a heteroarylalkyl group is 1-6 carbon atoms, and a heteroaryl moiety is 5 to 14 carbon atoms, and 1 to 3 heteroatoms are selected from N, O, P, and S. The heteroaryl portion of the heteroarylalkyl group can be a single ring having 3-7 ring members (2-6 carbon atoms), or 7-10 ring members (4-9 carbon atoms and N, Bicyclic ring having 1 to 3 heteroatoms selected from O, P, and S), for example, bicyclo [4,5], [5,5], [5,6], or [6,6] It may be a system.

「置換アルキル」、「置換アリール」、及び「置換アリールアルキル」それぞれは、１つ以上の水素原子それぞれが、独立して置換基で置換されているアルキル、アリール、及びアリールアルキルを意味する。典型的な置換基としては、−Ｘ、−Ｒ、−Ｏ−、または、−ＳＲ、−Ｓ−、−ＮＲ２、−ＮＲ３、＝ＮＲ、−ＣＸ３、−ＣＮ、−ＯＣＮ、−ＳＣＮ、Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、−ＮＣＳ、−ＮＯ、−ＮＯ２、＝Ｎ２、−Ｎ３、ＮＣ（＝Ｏ）Ｒ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ２、−ＳＯ３ −、−ＳＯ３Ｈ、−Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ、−ＯＳ（＝Ｏ）２ＯＲ、−Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲ、−Ｓ（＝Ｏ）Ｒ、−ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＲ）２、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ）２、−ＰＯ− ３、−ＰＯ３Ｈ２、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｘ、−Ｃ（＝Ｓ）Ｒ、−ＣＯ２Ｒ、−ＣＯ２−、−Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ、−Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ、−Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ２、−Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ２、−Ｃ（＝ＮＲ）ＮＲ２が挙げられるが、これらに限定されない；各Ｘは、独立してハロゲン：Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩである；及び各Ｒは、独立してＨ、Ｃ２−Ｃ１８アルキル、Ｃ６−Ｃ２０アリール、Ｃ３−Ｃ１４複素環、保護基またはプロドラッグ部分である。また、前記のアルキレン、アルケニレン、及びアルキニレン基を同様に置換してよい。 “Substituted alkyl”, “substituted aryl”, and “substituted arylalkyl” each mean alkyl, aryl, and arylalkyl in which one or more hydrogen atoms are each independently substituted with a substituent. Typical substituents, -X, -R, -O -, or, -SR, -S -, -NR 2 , -NR 3, = NR, -CX 3, -CN, -OCN, -SCN , N = C = O, -NCS , -NO, -NO 2, = N 2, -N 3, NC (= O) R, -C (= O) R, -C (= O) NR 2, - SO 3 -, -SO 3 H, -S (= O) 2 R, -OS (= O) 2 OR, -S (= O) 2 NR, -S (= O) R, -OP (= O) (OR) 2, -P (= O) (OR) 2, -PO - 3, -PO 3 H 2, -C (= O) R, -C (= O) X, -C (= S) R , -CO 2 R, -CO 2-, -C (= S) OR, -C (= O) SR, -C (= S) SR, C (= O) NR 2, -C (= S) NR 2 , —C (═NR) NR 2, but are not limited thereto. No; each X is independently a halogen: F, Cl, Br, or some I,; and each R is H independently, C 2 -C 18 alkyl, C 6 -C 20 aryl, C 3 -C 14 Heterocycle, protecting group or prodrug moiety. Also, the alkylene, alkenylene, and alkynylene groups may be similarly substituted.

「ヘテロアリール」及び「複素環」は、１つ以上の環原子が、ヘテロ原子、例えば、窒素、酸素、及び硫黄である環系を指す。複素環ラジカルは、３〜２０個の炭素原子及びＮ、Ｏ、Ｐ、及びＳから選択される１〜３個のヘテロ原子を含む。複素環は、３〜７個の環員（２〜６個の炭素原子及びＮ、Ｏ、Ｐ、及びＳから選択される１〜３個のヘテロ原子）を有する単環または７〜１０個の環員（４〜９個の炭素原子及び１〜３個のヘテロ原子から選択されるＮ、Ｏ、Ｐ、及びＳ）を有する二環、例えば、ビシクロ［４，５］、［５，５］、［５，６］、または［６，６］系としてよい。   “Heteroaryl” and “heterocycle” refer to a ring system in which one or more of the ring atoms is a heteroatom, eg, nitrogen, oxygen, and sulfur. The heterocyclic radical contains 3 to 20 carbon atoms and 1 to 3 heteroatoms selected from N, O, P and S. Heterocycle is a monocycle having 3-7 ring members (2-6 carbon atoms and 1-3 heteroatoms selected from N, O, P, and S) or 7-10 Bicycles having ring members (N, O, P and S selected from 4 to 9 carbon atoms and 1 to 3 heteroatoms), for example, bicyclo [4,5], [5,5] , [5, 6], or [6, 6] system.

例示的複素環が、例えば、Ｐａｑｕｅｔｔｅ，Ｌｅｏ Ａ．，“Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｍｏｄｅｒｎ Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”（Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９６８）、特にＣｈａｐｔｅｒｓ１、３、４、６、７、及び９；“Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，Ａ ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ”（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９５０〜現在）、特にＶｏｌｕｍｅｓ１３、１４、１６、１９、及び２８；及びＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９６０）８２：５５６６に記載されている。   Exemplary heterocycles are described, for example, in Paquette, Leo A. et al. , “Principles of Modern Heterocyclic Chemistry” (WA Benjamin, New York, 1968), in particular Chapters 1, 3, 4, 6, 7 and 9; “The Chemistry of Hec Hes” & Sons, New York, 1950-present), especially Volumes 13, 14, 16, 19, and 28; Am. Chem. Soc. (1960) 82: 5566.

複素環の例としては、例えば、ピリジル、ジヒドロイピリジル（ｄｉｈｙｄｒｏｙｐｙｒｉｄｙｌ）、テトラヒドロピリジル（ピペリジル）、チアゾリル、テトラヒドロチオフェニル、硫黄酸化型テトラヒドロチオフェニル、ピリミジニル、フラニル、チエニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、テトラゾリル、ベンゾフラニル、チアナフタレニル、インドリル、インドレニル、キノリニル、イソキノリニル、ベンズイミダゾリル、ピペリジニル、４−ピペリドニル、ピロリジニル、２−ピロリドニル、ピロリニル、テトラヒドロフラニル、ビス−テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、ビス−テトラヒドロピラニル、テトラヒドロキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、デカヒドロキノリニル、オクタヒドロイソキノリニル、アゾシニル（ａｚｏｃｉｎｙｌ）、トリアジニル、６Ｈ−１，２，５−チアジアジニル、２Ｈ，６Ｈ−１，５，２−ジチアジニル、チエニル、チアントレニル、ピラニル、イソベンゾフラニル、クロメニル、キサンテニル、フェノキサチニル、２Ｈ−ピロリル、イソチアゾリル、イソキサゾリル、ピラジニル、ピリダジニル、インドリジニル、イソインドリル、３Ｈ−インドリル、１Ｈ−インダゾリル、プリニル、４Ｈ−キノリジニル、フタラジニル、ナフチリジニル、キノキサリニル、キナゾリニル、シンノリニル、プテリジニル、４ａＨ−カルバゾリル、カルバゾリル、β−カルボリニル、フェナントリジニル、アクリジニル、ピリミジニル、フェナントロリニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フラザニル、フェノキサジニル、イソクロマニル、クロマニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピペラジニル、インドリニル、イソインドリニル、キヌクリジニル、モルホリニル、オキサゾリジニル、ベンゾトリアゾリル、ベンズイソキサゾリル、オキシンドリル、ベンゾキサゾリニル、及びイサチノイル（ｉｓａｔｉｎｏｙｌ）が挙げられるが、これらに限定されない。   Examples of heterocycles include, for example, pyridyl, dihydropyridyl, tetrahydropyridyl (piperidyl), thiazolyl, tetrahydrothiophenyl, sulfurated tetrahydrothiophenyl, pyrimidinyl, furanyl, thienyl, pyrrolyl, pyrazolyl, imidazolyl, tetrazolyl , Benzofuranyl, thiaphthalenyl, indolyl, indolenyl, quinolinyl, isoquinolinyl, benzimidazolyl, piperidinyl, 4-piperidonyl, pyrrolidinyl, 2-pyrrolidonyl, pyrrolinyl, tetrahydrofuranyl, bis-tetrahydrofuranyl, tetrahydropyranyl, bis-tetrahydropyranyl, tetrahydroxy Nolinyl, tetrahydroisoquinolinyl, decahydroquinolinyl, octahydroisoquinolin , Azocinyl, triazinyl, 6H-1,2,5-thiadiazinyl, 2H, 6H-1,5,2-dithiazinyl, thienyl, thiantenyl, pyranyl, isobenzofuranyl, chromenyl, xanthenyl, phenoxatinyl, 2H-pyrrolyl, isothiazolyl, isoxazolyl, pyrazinyl, pyridazinyl, indolizinyl, isoindolyl, 3H-indolyl, 1H-indazolyl, purinyl, 4H-quinolidinyl, phthalazinyl, naphthyridinyl, quinoxalinyl, quinazolinyl, cinnolinyl, pteridinyl, 4aH-carbazolyl, 4aH-carbazolyl, 4aH-carbazolyl Carborinyl, phenanthridinyl, acridinyl, pyrimidinyl, phenanthrolinyl, phenazinyl, phenothiazinyl, furazanyl, phenoxazinyl , Isochromanyl, chromanyl, imidazolidinyl, imidazolinyl, pyrazolidinyl, pyrazolinyl, piperazinyl, indolinyl, isoindolinyl, quinuclidinyl, morpholinyl, oxazolidinyl, benzotriazolyl, benzisoxazolyl, oxyndolyl, isatinoyl For example, but not limited to.

例えば及びこれらに限定されない、炭素結合複素環は、ピリジンの２、３、４、５、もしくは６位、ピリダジンの３、４、５、もしくは６位、ピリミジンの２、４、５、もしくは６位、ピラジンの２、３、５、もしくは６位、フラン、テトラヒドロフラン、チオフラン、チオフェン、ピロール、もしくはテトラヒドロピロールの２、３、４、もしくは５位、オキサゾール、イミダゾール、もしくはチアゾールの２、４、もしくは５位、イソキサゾール、ピラゾール、もしくはイソチアゾールの３、４、もしくは５位、アジリジンの２もしくは３位、アゼチジンの２、３、もしくは４位、キノリンの２、３、４、５、６、７、もしくは８位、またはイソキノリンの１、３、４、５、６、７、もしくは８位で結合される。さらにより典型的には、炭素結合複素環としては、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、５−ピリジル、６−ピリジル、３−ピリダジニル、４−ピリダジニル、５−ピリダジニル、６−ピリダジニル、２−ピリミジニル、４−ピリミジニル、５−ピリミジニル、６−ピリミジニル、２−ピラジニル、３−ピラジニル、５−ピラジニル、６−ピラジニル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、または５−チアゾリルが挙げられる。   For example and without limitation, a carbon-bonded heterocycle is a 2, 3, 4, 5, or 6 position of pyridine, a 3, 4, 5, or 6 position of pyridazine, a 2, 4, 5, or 6 position of pyrimidine. 2, 3, 5, or 6 of pyrazine, 2, 3, 4, or 5 of furan, tetrahydrofuran, thiofuran, thiophene, pyrrole, or tetrahydropyrrole, 2, 4, or 5 of oxazole, imidazole, or thiazole Position, isoxazole, pyrazole, or isothiazole 3, 4, or 5 position, aziridine 2 or 3 position, azetidine 2, 3, or 4 position, quinoline 2, 3, 4, 5, 6, 7, or It is attached at the 8-position, or at the 1, 3, 4, 5, 6, 7, or 8 position of isoquinoline. Even more typically, the carbon-bonded heterocycle includes 2-pyridyl, 3-pyridyl, 4-pyridyl, 5-pyridyl, 6-pyridyl, 3-pyridazinyl, 4-pyridazinyl, 5-pyridazinyl, 6-pyridazinyl, 2-pyrimidinyl, 4-pyrimidinyl, 5-pyrimidinyl, 6-pyrimidinyl, 2-pyrazinyl, 3-pyrazinyl, 5-pyrazinyl, 6-pyrazinyl, 2-thiazolyl, 4-thiazolyl, or 5-thiazolyl.

窒素結合複素環は、例えば、これらに限定されないが、またはアジリジン、アゼチジン、ピロール、ピロリジン、２−ピロリン、３−ピロリン、イミダゾール、イミダゾリジン、２−イミダゾリン、３−イミダゾリン、ピラゾール、ピラゾリン、２−ピラゾリン、３−ピラゾリン、ピペリジン、ピペラジン、インドール、インドリン、１Ｈ−インダゾールの１位、イソインドール、またはイソインドリンの２位、モルホリンの４位、およびカルバゾールまたはβ−カルボリンの９位で結合される。さらにより典型的には、窒素結合複素環としては１−アジリジル、１−アゼテジル（ａｚｅｔｅｄｙｌ）、１−ピロリル、１−イミダゾリル、１−ピラゾリル、および１−ピペリジニルが挙げられる。   Nitrogen bonded heterocycles include, for example, but are not limited to, aziridines, azetidines, pyrroles, pyrrolidines, 2-pyrrolines, 3-pyrrolines, imidazoles, imidazolidines, 2-imidazolines, 3-imidazolines, pyrazoles, pyrazolines, 2- It is attached at the 1-position of pyrazoline, 3-pyrazolin, piperidine, piperazine, indole, indoline, 1H-indazole, 2-position of isoindole or isoindoline, 4-position of morpholine, and 9-position of carbazole or β-carboline. Even more typically, nitrogen bonded heterocycles include 1-aziridyl, 1-azetedyl, 1-pyrrolyl, 1-imidazolyl, 1-pyrazolyl, and 1-piperidinyl.

「Ｃ３−Ｃ８複素環」は、環炭素原子うちの１〜４個が、独立してＯ、Ｓ及びＮからなる基からのヘテロ原子で置換されている芳香族または非芳香族Ｃ３−Ｃ８炭素環を指す。Ｃ３−Ｃ８複素環の代表的な例としては、ベンゾフラニル、ベンゾチオフェン、インドリル、ベンゾピラゾリル、クマリニル、イソキノリニル、ピロリル、チオフェニル、フラニル、チアゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、キノリニル、ピリミジニル、ピリジニル、ピリドニル、ピラジニル、ピリダジニル、イソチアゾリル、イソキサゾリル、及びテトラゾリルが挙げられるが、これらに限定されない。Ｃ３−Ｃ８複素環は、非置換とする、または、−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）、−アリール、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）または’、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−ＯＨ、−ハロゲン、−Ｎ３、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｒ’）、−Ｎ（Ｒ’）２及び−ＣＮを含む７個までの基で置換することができ；各Ｒ’は、Ｈ、−Ｃ１−Ｃ８アルキル及びアリールから独立して選択される。 A “C 3 -C 8 heterocycle” is an aromatic or non-aromatic C 3 in which 1 to 4 of the ring carbon atoms are independently substituted with heteroatoms from a group consisting of O, S and N. -C 8 refers to a carbon ring. Representative examples of C 3 -C 8 heterocycles include benzofuranyl, benzothiophene, indolyl, benzopyrazolyl, coumarinyl, isoquinolinyl, pyrrolyl, thiophenyl, furanyl, thiazolyl, imidazolyl, pyrazolyl, triazolyl, quinolinyl, pyrimidinyl, pyridinyl, pyridonyl , Pyrazinyl, pyridazinyl, isothiazolyl, isoxazolyl, and tetrazolyl. C 3 -C 8 heterocycle is unsubstituted or —C 1 -C 8 alkyl, —O— (C 1 -C 8 alkyl), —aryl, —C (O) R ′, —OC ( O) R ', - C ( O) or', -C (O) NH 2 , -C (O) NHR ', - C (O) N (R') 2 -NHC (O) R ', - S 7 containing (O) 2 R ′, —S (O) R ′, —OH, —halogen, —N 3 , —NH 2 , —NH (R ′), —N (R ′) 2 and —CN Each R ′ is independently selected from H, —C 1 -C 8 alkyl and aryl.

「Ｃ３−Ｃ８ヘテロシクロ」は、複素環基の水素原子のうちの１個が、結合で置換されている前記で定義したＣ３−Ｃ８複素環基を指す。Ｃ３−Ｃ８ヘテロシクロは、非置換とする、または、−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）、−アリール、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）または’、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−ＯＨ、−ハロゲン、−Ｎ３、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｒ’）、−Ｎ（Ｒ’）２及び−ＣＮを含む６個までの基で置換することができ；各Ｒ’は、Ｈ、−Ｃ１−Ｃ８アルキル及びアリールから独立して選択される。 “C 3 -C 8 heterocyclo” refers to a C 3 -C 8 heterocyclic group as defined above wherein one of the hydrogen atoms of the heterocyclic group is replaced with a bond. C 3 -C 8 heterocyclo is unsubstituted or —C 1 -C 8 alkyl, —O— (C 1 -C 8 alkyl), —aryl, —C (O) R ′, —OC (O ) R ', - C (O ) or', -C (O) NH 2 , -C (O) NHR ', - C (O) N (R') 2 -NHC (O) R ', - S ( Up to 6 including O) 2 R ′, —S (O) R ′, —OH, —halogen, —N 3 , —NH 2 , —NH (R ′), —N (R ′) 2 and —CN Each R ′ is independently selected from H, —C 1 -C 8 alkyl and aryl.

「Ｃ３−Ｃ２０複素環」は、環炭素原子うちの１〜４個が、独立してＯ、Ｓ及びＮからなる基からのヘテロ原子で置換されている芳香族または非芳香族Ｃ３−Ｃ２０炭素環を指す。Ｃ３−Ｃ２０複素環は、非置換とする、または、−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）、−アリール、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）または’、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−ＯＨ、−ハロゲン、−Ｎ３、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｒ’）、−Ｎ（Ｒ’）２及び−ＣＮを含む７個までの基で置換することができ；各Ｒ’は、Ｈ、−Ｃ１−Ｃ８アルキル及びアリールから独立して選択される。 A “C 3 -C 20 heterocycle” is an aromatic or non-aromatic C 3 in which 1 to 4 of the ring carbon atoms are independently substituted with heteroatoms from a group consisting of O, S and N. -C refers to a 20 carbon ring. C 3 -C 20 heterocycle is unsubstituted or —C 1 -C 8 alkyl, —O— (C 1 -C 8 alkyl), —aryl, —C (O) R ′, —OC ( O) R ', - C ( O) or', -C (O) NH 2 , -C (O) NHR ', - C (O) N (R') 2 -NHC (O) R ', - S 7 containing (O) 2 R ′, —S (O) R ′, —OH, —halogen, —N 3 , —NH 2 , —NH (R ′), —N (R ′) 2 and —CN Each R ′ is independently selected from H, —C 1 -C 8 alkyl and aryl.

「Ｃ３−Ｃ２０ヘテロシクロ」は、複素環基の水素原子のうちの１個が、結合で置換されている前記で定義したＣ３−Ｃ２０複素環基を指す。 “C 3 -C 20 heterocyclo” refers to a C 3 -C 20 heterocyclic group as defined above wherein one of the hydrogen atoms of the heterocyclic group is replaced with a bond.

「炭素環」は、単環として３〜７個の炭素原子または二環として７〜１２個の炭素原子を有する飽和または不飽和環を意味する。単環式炭素環は、３〜６個の環原子を有し、さらにより典型的には５または６個の環原子を有する。二環式炭素環は、例えば、ビシクロ［４，５］、［５，５］、［５，６］または［６，６］系として配置される７〜１２個の環原子、またはビシクロ［５，６］または［６，６］系として配置される９または１０個の環原子を有する。単環式炭素環の例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、１−シクロペンタ−１−エニル、１−シクロペンタ−２−エニル、１−シクロペンタ−３−エニル、シクロヘキシル、１−シクロヘキサ−１−エニル、１−シクロヘキサ−２−エニル、１−シクロヘキサ−３−エニル、シクロヘプチル、及びシクロオクチルが挙げられる。   “Carbocycle” means a saturated or unsaturated ring having 3 to 7 carbon atoms as a monocycle or 7 to 12 carbon atoms as a bicycle. Monocyclic carbocycles have 3 to 6 ring atoms, and even more typically have 5 or 6 ring atoms. Bicyclic carbocycles are, for example, 7-12 ring atoms arranged as a bicyclo [4,5], [5,5], [5,6] or [6,6] system, or bicyclo [5 , 6] or 9 or 10 ring atoms arranged as a [6, 6] system. Examples of monocyclic carbocycles include cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, 1-cyclopent-1-enyl, 1-cyclopent-2-enyl, 1-cyclopent-3-enyl, cyclohexyl, 1-cyclohex-1-enyl 1-cyclohex-2-enyl, 1-cyclohex-3-enyl, cycloheptyl, and cyclooctyl.

「Ｃ３−Ｃ８炭素環」は、３−、４−、５−、６−、７−または８−員の飽和または不飽和非芳香族炭素環式環である。代表的なＣ３−Ｃ８炭素環としては、−シクロプロピル、−シクロブチル、−シクロペンチル、−シクロペンタジエニル、−シクロヘキシル、−シクロヘキセニル、−１，３−シクロヘキサジエニル、−１，４−シクロヘキサジエニル、−シクロヘプチル、−１，３−シクロヘプタジエニル、−１，３，５−シクロヘプタトリエニル、−シクロオクチル、及び−シクロオクタジエニルが挙げられるが、これらに限定されない。Ｃ３−Ｃ８炭素環基は、非置換とする、または、これらに限定されないが、−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）、−アリール、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）または’、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−ＯＨ、−ハロゲン、−Ｎ３、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｒ’）、−Ｎ（Ｒ’）２及び−ＣＮを含む１つ以上の基で置換することができる；各Ｒ’は、Ｈ、−Ｃ１−Ｃ８アルキル及びアリールから独立して選択される。 A “C 3 -C 8 carbocycle” is a 3-, 4-, 5-, 6-, 7- or 8-membered saturated or unsaturated non-aromatic carbocyclic ring. Representative C 3 -C 8 carbocycle, - cyclopropyl, - cyclobutyl, - cyclopentyl, - cyclopentadienyl, - cyclohexyl, - cyclohexenyl, 1,3-cyclohexadienyl, 1,4 Examples include, but are not limited to, cyclohexadienyl, -cycloheptyl, -1,3-cycloheptadienyl, -1,3,5-cycloheptatrienyl, -cyclooctyl, and -cyclooctadienyl. C 3 -C 8 carbocycle group, a unsubstituted or, but not limited to, -C 1 -C 8 alkyl, -O- (C 1 -C 8 alkyl), - aryl, -C (O ) R ′, —OC (O) R ′, —C (O) or “, —C (O) NH 2 , —C (O) NHR ′, —C (O) N (R ′) 2 —NHC ( O) R ′, —S (O) 2 R ′, —S (O) R ′, —OH, —halogen, —N 3 , —NH 2 , —NH (R ′), —N (R ′) 2 And can be substituted with one or more groups, including —CN; each R ′ is independently selected from H, —C 1 -C 8 alkyl and aryl.

「Ｃ３−Ｃ８カルボシクロ」は、炭素環基の水素原子のうちの１個が結合で置換されている前記で定義したＣ３−Ｃ８複素環基を指す。 “C 3 -C 8 carbocyclo” refers to a C 3 -C 8 heterocyclic group as defined above wherein one of the hydrogen atoms of the carbocyclic group is substituted with a bond.

「リンカー」は、薬剤部分に抗体を共有結合する原子の共有結合または鎖を含む化学部分を指す。種々の実施形態では、リンカーが、二価ラジカル（例えば、アルキルジイル、アリールジイル、ヘテロアリールジイル）部分、例えば、−（ＣＲ２）ｎＯ（ＣＲ２）ｎ−、アルキルオキシ（例えば、ポリエチレンオキシ、ＰＥＧ、ポリメチレンオキシ）及びアルキルアミノ（例えば、ポリエチレンアミノ、Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ（商標））の反復単位；ならびにコハク酸塩、コハク酸アミド、ジグリコール酸塩、マロン酸塩、及びカプロアミドを含む二酸エステル及びアミドを含む。種々の実施形態では、リンカーは、１つ以上のアミノ酸残基、例えば、バリン、フェニルアラニン、リジン、及びホモリジンを含むことができる。 “Linker” refers to a chemical moiety comprising a covalent bond or chain of atoms that covalently attaches an antibody to a drug moiety. In various embodiments, the linker is a divalent radical (eg, alkyldiyl, aryldiyl, heteroaryldiyl) moiety, eg, — (CR 2 ) n O (CR 2 ) n—, alkyloxy (eg, polyethyleneoxy, PEG, polymethyleneoxy) and alkylamino (eg, polyethyleneamino, Jeffamine ™) repeat units; and diacid esters including succinate, succinamide, diglycolate, malonate, and caproamide and Contains amides. In various embodiments, the linker can include one or more amino acid residues, such as valine, phenylalanine, lysine, and homolysine.

用語「キラル」は鏡像パートナーを重ね合わせることができない特性を有する分子を意味する、一方、用語「アキラル」はその鏡像パートナーに重ね合わせることができる分子を意味する。   The term “chiral” means a molecule that has the property of being unable to superimpose a mirror image partner, while the term “achiral” means a molecule that can be superposed on its mirror image partner.

用語「立体異性体」は化学的組成が同一であるが、空間での原子または基の配置に関しては異なる化合物を意味する。   The term “stereoisomer” means compounds that have the same chemical composition but differ in the arrangement of atoms or groups in space.

「ジアステレオマー」は２つ以上のキラル中心を有し、その分子は互いの鏡像ではない立体異性体を意味する。ジアステレオマーは異なる物理的特性、例えば融点、沸点、スペクトル特性、および反応性を有する。ジアステレオマーの混合物は電気泳動およびクロマトグラフィーなどの高度溶解分析手順下で分離することができる。   “Diastereomer” means a stereoisomer with two or more centers of chirality and whose molecules are not mirror images of one another. Diastereomers have different physical properties, such as melting points, boiling points, spectral properties, and reactivity. Diastereomeric mixtures can be separated under advanced dissolution analysis procedures such as electrophoresis and chromatography.

「鏡像異性体」は互いに重ね合わせることができない鏡像である化合物の２つの立体異性体を意味する。   “Enantiomer” means two stereoisomers of a compound that are non-superimposable mirror images of each other.

本明細書に一般的に用いられる立体化学の定義および約束ごとはＳ．Ｐ．Ｐａｒｋｅｒ，版，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｒｍｓ（１９８４）ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｂｏｏｋ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ； ａｎｄ Ｅｌｉｅｌ，Ｅ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｎ，Ｓ．，Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ（１９９４），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに従う。多くの有機化合物は光学活性形態で存在する、すなわち、これらは平面偏光の面を回転させる能力を有する。光学活性化合物を記載する際に、接頭辞ＤおよびＬ、またはＲおよびＳ、が用いられ、そのキラル中心（単数または複数）についての分子の絶対的配置を示す。接頭辞ｄおよびｌまたは（＋）および（−）が用いられ、化合物による平面偏光の回転の印を示し、（−）またはｌは化合物が左旋性であることを意味する。（＋）またはｄの接頭辞がついた化合物は右旋性である。所与の化学構造については、それらが互いの鏡像であることを除いて、それらの立体異性体は同一である。特定の立体異性体はまた、鏡像異性体と呼ぶことができる、およびかかる異性体の混合物は鏡像異性体混合物と呼ばれることがある。鏡像異性体の５０：５０混合物は、ラセミ混合物またはラセミ化合物と呼ばれ、化学反応または工程において立体選択または立体特異性がない場合に生じさせることができる。用語「ラセミ混合物」および「ラセミ化合物」は、光学活性のない２つの鏡像異性体種の等モル濃度混合物を意味する。   For definitions and conventions of stereochemistry commonly used herein, see S.C. P. Parker, Edition, McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York; and Eliel, E .; and Wilen, S .; , Stereochemistry of Organic Compounds (1994), John Wiley & Sons, Inc. , New York. Many organic compounds exist in optically active forms, i.e. they have the ability to rotate the plane of plane-polarized light. In describing optically active compounds, the prefixes D and L, or R and S, are used to indicate the absolute configuration of the molecule about its chiral center (s). The prefixes d and l or (+) and (-) are used to indicate the sign of rotation of plane polarized light by the compound, (-) or l means that the compound is levorotatory. A compound prefixed with (+) or d is dextrorotatory. For a given chemical structure, their stereoisomers are identical except that they are mirror images of one another. Certain stereoisomers can also be referred to as enantiomers, and mixtures of such isomers may be referred to as enantiomeric mixtures. A 50:50 mixture of enantiomers is referred to as a racemic mixture or a racemate and can occur when there is no stereoselection or stereospecificity in a chemical reaction or process. The terms “racemic mixture” and “racemic compound” mean an equimolar mixture of two enantiomeric species that are not optically active.

「脱離基」は、もう１つの官能基によって置換することができる官能基を指す。特定の脱離基が、当技術分野でよく知られており、例としては、ハロゲン化物（例えば、塩化物、臭化物、ヨウ化物）、メタンスルホニル（メシル）、ｐ−トルエンスルホニル（トシル）、トリフルオロメチルスルホニル（トリフル酸塩）、およびトリフルオロメチルスルホン酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。   “Leaving group” refers to a functional group that can be replaced by another functional group. Certain leaving groups are well known in the art and include, for example, halides (eg, chloride, bromide, iodide), methanesulfonyl (mesyl), p-toluenesulfonyl (tosyl), tris Examples include, but are not limited to, fluoromethylsulfonyl (triflate) and trifluoromethylsulfonate.

用語「保護基」は、化合物上の他の官能基と反応しながら、特定の官能基をブロックまたは保護するために一般に用いられる置換基を指す。例えば、「アミノ保護基」は、化合物中のアミノ官能基をブロックまたは保護するアミノ基に結合する置換基である。好適なアミノ−保護基としては、アセチル、トリフルオロアセチル、ｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）、ベンジルオキシカルボニル（ＣＢＺ）、および９−フルオレニルメチレンオキシカルボニル（ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｅｎｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）（Ｆｍｏｃ）が挙げられるが、これらに限定されない。保護基の一般的な説明およびそれらの使用については、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１、またはより新しい版を参照。   The term “protecting group” refers to a substituent commonly used to block or protect a particular functional group while reacting with other functional groups on the compound. For example, an “amino protecting group” is a substituent attached to an amino group that blocks or protects an amino function in a compound. Suitable amino-protecting groups include acetyl, trifluoroacetyl, t-butoxycarbonyl (BOC), benzyloxycarbonyl (CBZ), and 9-fluorenylmethyleneoxycarbonyl (Fmoc), It is not limited to these. For a general description of protecting groups and their use, see T.W. W. See Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 1991, or newer editions.

ＩＩ．組成物及び方法
１つの態様では、本発明は、部分的に、ＧＰＣ３に結合する抗体及びかかる抗体を含むイムノコンジュゲートに基づいている。本発明の抗体及びイムノコンジュゲートは、例えば、ＧＰＣ３−陽性癌の診断または治療に有用である。 II. Compositions and Methods In one aspect, the invention is based, in part, on antibodies that bind to GPC3 and immunoconjugates comprising such antibodies. The antibodies and immunoconjugates of the present invention are useful, for example, for diagnosis or treatment of GPC3-positive cancer.

Ａ．例示的抗ＧＰＣ３抗体
本明細書では、ＧＰＣ３に結合する分離抗体が提供される。シグナル配列（アミノ酸１〜２４）を有する例示的自然ヒトＧＰＣ３前駆体タンパク質配列が、配列番号：１に提供され、配列番号：１のアミノ酸２５〜５８０に対応する対応成熟ＧＰＣ３タンパク質配列が提供される。 A. Exemplary Anti-GPC3 Antibodies Provided herein are isolated antibodies that bind to GPC3. An exemplary native human GPC3 precursor protein sequence having a signal sequence (amino acids 1-24) is provided in SEQ ID NO: 1 and the corresponding mature GPC3 protein sequence corresponding to amino acids 25-580 of SEQ ID NO: 1 is provided. .

特定の実施形態では、抗ＧＰＣ３抗体が、少なくとも１つ以上の以下の特性を任意の組み合わせで有する。
ａ）遺伝子組換えヒトＧＰＣ３に結合する；
ｂ）遺伝子組換えシノモルグスサルＧＰＣ３に結合する；
ｃ）ＨｅｐＧ２細胞の表面上の内因性ＧＰＣ３に結合する；
ｄ）２９３細胞の表面上に発現したシノモルグスサルＧＰＣ３に結合する；
ｅ）癌細胞の表面上の内因性ＧＰＣ３に結合する；
ｆ）肝細胞癌細胞の表面上の内因性ＧＰＣ３に結合する；
ｇ）ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ、Ｈｕｈ７、及びＪＨＨ−７から選択される細胞株の細胞の表面上の内因性ＧＰＣ３に結合する；
ｈ）ヒトＧＰＣ３のアミノ酸２５〜１３７内のエピトープに結合する；
ｉ）ヒトＧＰＣ３のアミノ酸Ｒ３５８／Ｓ３５９でフーリン切断部位にまたがるエピトープに結合する；
ｊ）完全長成熟ヒトＧＰＣ３（例えば、配列番号：１のアミノ酸２５〜５６０またはアミノ酸２５〜５８０）に結合するが、ヒトＧＰＣ３（配列番号：１のアミノ酸２５〜３５８）のＮ−末端フラグメントまたはヒトＧＰＣ３（配列番号：１のアミノ酸３５９〜５６０（ＧＰＩ結合なし）またはアミノ酸３５９〜５８０（ＧＰＩ結合あり））のＣ−末端フラグメントに結合しない；
ｋ）ヒトＧＰＣ３のアミノ酸４２０〜４７０内のエピトープに結合する；
ｌ）ヒトＧＰＣ３のアミノ酸４７０〜５０９内のエピトープに結合する；
ｍ）抗体７Ｈ１によりヒトＧＰＣ３への結合と競合する；
ｎ）抗体４Ｇ７によりヒトＧＰＣ３への結合と競合する；
ｏ）抗体１５Ｇ１によりヒトＧＰＣ３への結合と競合する；及び／または
ｐ）抗体４Ａ１１によりヒトＧＰＣ３への結合と競合する。 In certain embodiments, the anti-GPC3 antibody has at least one or more of the following properties in any combination.
a) binds to recombinant human GPC3;
b) binds to recombinant Cynomolgus monkey GPC3;
c) binds to endogenous GPC3 on the surface of HepG2 cells;
d) binds to Cynomolgus monkey GPC3 expressed on the surface of 293 cells;
e) binds to endogenous GPC3 on the surface of cancer cells;
f) binds to endogenous GPC3 on the surface of hepatocellular carcinoma cells;
g) binds to endogenous GPC3 on the surface of cells of a cell line selected from HepG2, Hep3B, Huh7, and JHH-7;
h) binds to an epitope within amino acids 25-137 of human GPC3;
i) binds to an epitope spanning the furin cleavage site at amino acids R358 / S359 of human GPC3;
j) N-terminal fragment of human GPC3 (amino acids 25-358 of SEQ ID NO: 1) or human that binds to full-length mature human GPC3 (eg, amino acids 25-560 of SEQ ID NO: 1 or amino acids 25-580) Does not bind to the C-terminal fragment of GPC3 (amino acids 359 to 560 (no GPI binding) or amino acids 359 to 580 (with GPI binding) of SEQ ID NO: 1);
k) binds to an epitope within amino acids 420-470 of human GPC3;
l) binds to an epitope within amino acids 470-509 of human GPC3;
m) competes with antibody 7H1 for binding to human GPC3;
n) competes with antibody 4G7 for binding to human GPC3;
o) compete with binding to human GPC3 by antibody 15G1; and / or p) compete with binding to human GPC3 by antibody 4A11.

いくつかの実施形態では、抗体の特性が、本明細書に記載のとおり、例えば、以下の実施例に記載のとおり測定される。いくつかの実施形態では、エピトープの結合が、例えば、実施例２に記載したとおり、欠失（切断）分析を用いて測定される。いくつかの実施形態では、エピトープの結合が、例えば、実施例２に記載したとおり、ＦＡＣＳによって測定される、または好適な結合アッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡまたは表面プラズモン共鳴アッセイによって測定される。非限定実施例として、いくつかの実施形態では、完全長ＧＰＣ３またはＧＰＣ３フラグメントが、細胞（例えば、２９３細胞）の表面上に発現し、細胞の表面上のＧＰＣ３への抗体結合が、ＦＡＣＳによって検出される。   In some embodiments, antibody properties are measured as described herein, eg, as described in the Examples below. In some embodiments, epitope binding is measured using deletion (truncation) analysis, eg, as described in Example 2. In some embodiments, epitope binding is measured by FACS, eg, as described in Example 2, or by a suitable binding assay, eg, ELISA or surface plasmon resonance assay. As a non-limiting example, in some embodiments, full length GPC3 or GPC3 fragment is expressed on the surface of a cell (eg, 293 cells) and antibody binding to GPC3 on the surface of the cell is detected by FACS. Is done.

抗体７Ｈ１及び他の実施形態
本明細書に提供される特定の実施形態が、部分的に、ヒトＧＰＣ３のアミノ酸２５〜１３７内のエピトープに結合する抗体７Ｈ１の発現に基づく。いくつかの実施形態では、本明細書にヒトＧＰＣ３のアミノ酸２５〜１３７内のエピトープに結合する抗体が提供される。いくつかのかかる実施形態では、本明細書に抗体７Ｈ１の１つ以上のＨＶＲ配列を含む抗体が提供される。 Antibody 7H1 and Other Embodiments Certain embodiments provided herein are based in part on the expression of antibody 7H1 that binds to an epitope within amino acids 25-137 of human GPC3. In some embodiments, provided herein are antibodies that bind to an epitope within amino acids 25-137 of human GPC3. In some such embodiments, provided herein are antibodies that comprise one or more HVR sequences of antibody 7H1.

いくつかの実施形態では、本発明は、（ａ）配列番号：４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号：６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号：７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号：８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号：９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１、２、３、４、５、または６つのＨＶＲを含む抗ＧＰＣ３抗体を提供する。   In some embodiments, the invention provides: (a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4; (b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5; (c) SEQ ID NO: 6 HVR-H3 comprising the amino acid sequence of: (d) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7; (e) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8; and (f) of SEQ ID NO: 9 Anti-GPC3 antibodies comprising at least 1, 2, 3, 4, 5, or 6 HVRs selected from HVR-L3 comprising an amino acid sequence are provided.

１つの態様では、本発明は、（ａ）配列番号：４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号：６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全部のＶＨ ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。１つの実施形態では、抗体が、配列番号：６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。もう１つの実施形態では、抗体が、配列番号：６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３及び配列番号：９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。さらに１つの実施形態では、抗体が、配列番号：６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号：９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２を含む。さらに１つの実施形態では、抗体が、（ａ）配列番号：４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号：６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。   In one aspect, the invention provides (a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4; (b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5; and (c) SEQ ID NO: 6. An antibody comprising at least one, at least two, or all three VH HVR sequences selected from HVR-H3 comprising an amino acid sequence is provided. In one embodiment, the antibody comprises HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. In another embodiment, the antibody comprises HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 and HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9. In yet another embodiment, the antibody comprises HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, and HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5. Including. In a further embodiment, the antibody comprises (a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4; (b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5; and (c) SEQ ID NO: 6. HVR-H3 comprising the amino acid sequence of

もう１つの態様では、本発明は、（ａ）配列番号：７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号：８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号：９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全部のＶＬ ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。１つの実施形態では、抗体が、（ａ）配列番号：７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号：８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号：９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。   In another aspect, the invention provides (a) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7; (b) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8; and (c) SEQ ID NO: 9. An antibody comprising at least one, at least two, or all three VL HVR sequences selected from HVR-L3 comprising the amino acid sequences of: In one embodiment, the antibody comprises (a) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7; (b) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8; and (c) SEQ ID NO: 9. Includes HVR-L3 containing amino acid sequence.

もう１つの態様では、本発明の抗体が、（ａ）（ｉ）配列番号：４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号：６から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つの、少なくとも２つの、または３つ全部のＶＨ ＨＶＲ配列を含むＶＨドメイン；及び（ｂ）（ｉ）配列番号：７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号：８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号：９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全部のＶＬ ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインを含む。   In another aspect, an antibody of the invention comprises (a) (i) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, (ii) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and (iii) ) A VH domain comprising at least one, at least two, or all three VH HVR sequences selected from HVR-H3 comprising an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 6; and (b) (i) SEQ ID NO: At least one selected from: HVR-L1 comprising an amino acid sequence of 7; (ii) HVR-L2 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 8; and (c) HVR-L3 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 9. A VL domain comprising at least two or all three VL HVR sequences.

もう１つの態様では、本発明は、（ａ）配列番号：４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号：６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号：７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号：８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号：９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体を提供する。   In another aspect, the invention provides (a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4; (b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5; (c) of SEQ ID NO: 6 HVR-H3 comprising the amino acid sequence; (d) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7; (e) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8; and (f) the amino acid of SEQ ID NO: 9. An antibody comprising HVR-L3 comprising a sequence is provided.

前記の実施形態のいずれかでは、抗ＧＰＣ３抗体が、ヒト化される。１つの実施形態では、抗ＧＰＣ３抗体が前記の実施形態のいずれかのとおりのＨＶＲを含み、さらにヒト受容体フレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。特定の実施形態では、ヒト受容体フレームワークが、ヒトＶＬカッパＩコンセンサス（ＶＬＫＩ）フレームワーク及び／またはＶＨフレームワークＶＨ１である。特定の実施形態では、ヒト受容体フレームワークが、以下の変異のいずれか１つを含むヒトＶＬカッパＩコンセンサス（ＶＬＫＩ）フレームワーク及び／またはＶＨフレームワークＶＨ１である。 In any of the above embodiments, the anti-GPC3 antibody is humanized. In one embodiment, the anti-GPC3 antibody comprises an HVR as in any of the previous embodiments, and further comprises a human receptor framework, eg, a human immunoglobulin framework or a human consensus framework. In certain embodiments, the human receptor framework is the human VL kappa I consensus (VL KI ) framework and / or the VH framework VH 1 . In certain embodiments, the human receptor framework is a human VL kappa I consensus (VL KI ) framework and / or VH framework VH 1 comprising any one of the following mutations:

もう１つの態様では、抗ＧＰＣ３抗体が、配列番号：２のアミノ酸配列との配列同一性が、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％である重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。特定の実施形態では、配列番号：２のアミノ酸配列との同一性が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％であるＶＨ配列が、参照配列に対して置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含有するが、配列がＧＰＣ３に結合する能力を保持することを含む抗ＧＰＣ３抗体を含有する。特定の実施形態では、計１〜１０個のアミノ酸が、配列番号：２中で置換、挿入及び／または除去される。特定の実施形態では、計１〜５個のアミノ酸が、配列番号：２中で置換、挿入及び／または除去される。特定の実施形態では、置換、挿入、または欠失が、ＨＶＲ（すなわち、ＦＲ）の外の領域で生じる。任意で、抗ＧＰＣ３抗体が、その配列の翻訳後修飾を含む配列番号：２のＶＨ配列を含む。特定の実施形態では、ＶＨが、：（ａ）配列番号：４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される１つ、２つまたは３つのＨＶＲを含む。   In another aspect, the anti-GPC3 antibody has at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. Contains heavy chain variable domain (VH) sequences that are 98%, 99%, or 100%. In certain embodiments, the identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% Certain VH sequences contain substitutions (eg, conservative substitutions), insertions, or deletions relative to a reference sequence, but contain anti-GPC3 antibodies that include retaining the ability of the sequence to bind to GPC3. In certain embodiments, a total of 1-10 amino acids are substituted, inserted, and / or removed in SEQ ID NO: 2. In certain embodiments, a total of 1 to 5 amino acids are substituted, inserted and / or removed in SEQ ID NO: 2. In certain embodiments, substitutions, insertions, or deletions occur in regions outside of HVR (ie, FR). Optionally, the anti-GPC3 antibody comprises the VH sequence of SEQ ID NO: 2, which includes a post-translational modification of that sequence. In certain embodiments, VH comprises: (a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, (b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and (c) SEQ ID NO: 6. One, two or three HVRs selected from HVR-H3 comprising the amino acid sequence of

もう１つの態様では、抗体が配列番号：３のアミノ酸配列との配列同一性が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％である軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗ＧＰＣ３抗体が提供される。特定の実施形態では、配列番号：３のアミノ酸配列との同一性が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％であるＶＬ配列が、参照配列に対して置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含有するが、配列がＧＰＣ３に結合する能力を保持することを含む抗ＧＰＣ３抗体を含有する。特定の実施形態では、計１〜１０個のアミノ酸が、配列番号：３中で置換、挿入及び／または除去される。特定の実施形態では、計１〜５個のアミノ酸が、配列番号：３中で置換、挿入及び／または除去される。特定の実施形態では、置換、挿入、または欠失が、ＨＶＲ（すなわち、ＦＲ）の外の領域で生じる。任意で、抗ＧＰＣ３抗体が、その配列の翻訳後修飾を含む配列番号：３のＶＬ配列を含む。特定の実施形態では、ＶＬが、（ａ）配列番号：７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号：８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号：９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される１つ、２つまたは３つのＨＶＲを含む。   In another embodiment, the antibody has at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99 sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3. An anti-GPC3 antibody comprising a light chain variable domain (VL) that is 100% or 100% is provided. In certain embodiments, the identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 is at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% Certain VL sequences contain anti-GPC3 antibodies that contain substitutions (eg, conservative substitutions), insertions, or deletions relative to a reference sequence, but that retain the ability of the sequence to bind to GPC3. In certain embodiments, a total of 1-10 amino acids are substituted, inserted, and / or removed in SEQ ID NO: 3. In certain embodiments, a total of 1 to 5 amino acids are substituted, inserted and / or removed in SEQ ID NO: 3. In certain embodiments, substitutions, insertions, or deletions occur in regions outside of HVR (ie, FR). Optionally, the anti-GPC3 antibody comprises the VL sequence of SEQ ID NO: 3 that includes a post-translational modification of that sequence. In certain embodiments, VL comprises (a) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7; (b) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8; and (c) of SEQ ID NO: 9 Includes one, two or three HVRs selected from HVR-L3 comprising amino acid sequences.

もう１つの態様では、抗体前記に提供した実施形態のいずれかのとおりのＶＨ、及び前記に提供した実施形態のいずれかのとおりのＶＬを含む抗ＧＰＣ３抗体が提供される。１つの実施形態では、抗体が、配列番号：２及び配列番号：３中のＶＨ及びＶＬ配列を含み、それぞれが、これらの配列の翻訳後修飾を含む。もう１つの実施形態では、抗ＧＰＣ３抗体が、配列番号：２及び配列番号：３中のそれぞれのＶＨ及びＶＬ配列を含む抗体のヒト化形態を含む。   In another aspect, there is provided an anti-GPC3 antibody comprising an antibody VH as in any of the embodiments provided above and VL as in any of the embodiments provided above. In one embodiment, the antibody comprises the VH and VL sequences in SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3, each containing post-translational modifications of these sequences. In another embodiment, the anti-GPC3 antibody comprises a humanized form of an antibody comprising the respective VH and VL sequences in SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3.

さらに１つの態様では、本明細書に提供される抗ＧＰＣ３抗体と同じエピトープに結合する抗体が、本明細書に提供される。例えば、特定の実施形態では、配列番号：２のＶＨ配列及び配列番号：３のそれぞれのＶＬ配列を含む抗ＧＰＣ３抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。   In yet another aspect, provided herein is an antibody that binds to the same epitope as an anti-GPC3 antibody provided herein. For example, in certain embodiments, an antibody is provided that binds to the same epitope as an anti-GPC3 antibody comprising the VH sequence of SEQ ID NO: 2 and the respective VL sequence of SEQ ID NO: 3.

図４Ｂに示したとおり、Ｋａｂａｔナンバリングに従ったＨＶＲ１−ＬＣ、ＨＶＲ２−ＬＣ及びＨＶＲ３−ＬＣ配列を含む軽鎖可変ドメイン、及び、図４Ａに示したとおり、Ｋａｂａｔナンバリングに従ったＨＶＲ１−ＨＣ、ＨＶＲ２−ＨＣ及びＨＶＲ３−ＨＣ配列を含む重鎖可変ドメインを含む抗体が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、抗体が、図４Ｂに示したとおり、ＨＶＲ１−ＬＣ、ＨＶＲ２−ＬＣ及び／またはＨＶＲ３−ＬＣ配列、及びＦＲ１−ＬＣ、ＦＲ２−ＬＣ、ＦＲ３−ＬＣ及び／またはＦＲ４−ＬＣ配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗体が、図４Ａに示したとおり、ＨＶＲ１−ＨＣ、ＨＶＲ２−ＨＣ及び／またはＨＶＲ３−ＨＣ配列、及びＦＲ１−ＨＣ、ＦＲ２−ＨＣ、ＦＲ３−ＨＣ及び／またはＦＲ４−ＨＣ配列を含む重鎖可変ドメインを含む。   As shown in FIG. 4B, a light chain variable domain comprising HVR1-LC, HVR2-LC and HVR3-LC sequences according to Kabat numbering, and HVR1-HC, HVR2 according to Kabat numbering as shown in FIG. 4A. Provided herein are antibodies comprising heavy chain variable domains comprising HC and HVR3-HC sequences. In some embodiments, the antibody is an HVR1-LC, HVR2-LC and / or HVR3-LC sequence, and FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC and / or FR4-LC, as shown in FIG. 4B. A light chain variable domain comprising the sequence. In some embodiments, the antibody is an HVR1-HC, HVR2-HC and / or HVR3-HC sequence, and FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC and / or FR4-HC, as shown in FIG. 4A. Contains a heavy chain variable domain containing sequence.

本発明のさらに１つの態様では、前記の実施形態のいずれかに従った抗ＧＰＣ３抗体が、ヒト抗体を含む単クローン性抗体である。１つの実施形態では、抗ＧＰＣ３抗体が、抗体フラグメント、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体、またはＦ（ａｂ’）２フラグメントである。もう１つの実施形態では、抗体が、完全長抗体、例えば、本明細書に定義されるとおり、ＩｇＧ１もしくはＩｇＧ２ａ抗体または他の抗体クラスまたはイソタイプである。 In a further aspect of the invention, the anti-GPC3 antibody according to any of the previous embodiments is a monoclonal antibody comprising a human antibody. In one embodiment, the anti-GPC3 antibody is an antibody fragment, eg, an Fv, Fab, Fab ′, scFv, bispecific antibody, or F (ab ′) 2 fragment. In another embodiment, the antibody is a full length antibody, eg, an IgG1 or IgG2a antibody or other antibody class or isotype, as defined herein.

さらに１つの態様では、前記の実施形態のいずれかに従った抗ＧＰＣ３抗体が、単独で、または組み合わせて、以下に記載したとおり、特徴のいずれかを組み入れてよい。   In a further aspect, an anti-GPC3 antibody according to any of the above embodiments, alone or in combination, may incorporate any of the features as described below.

抗体４Ａ１１及び他の実施形態
本明細書に提供される特定の実施形態が、部分的に、ヒトＧＰＣ３のアミノ酸４７０〜５０９内のエピトープに結合する抗体４Ａ１１の発現に基づく。いくつかの実施形態では、本明細書にヒトＧＰＣ３のアミノ酸４７０〜５０９内のエピトープに結合する抗体が提供される。いくつかのかかる実施形態では、本明細書に抗体４Ａ１１の１つ以上のＨＶＲ配列を含む抗体が提供される。 Antibody 4A11 and Other Embodiments Certain embodiments provided herein are based, in part, on the expression of antibody 4A11 that binds to an epitope within amino acids 470-509 of human GPC3. In some embodiments, provided herein are antibodies that bind to an epitope within amino acids 470-509 of human GPC3. In some such embodiments, provided herein are antibodies that comprise one or more HVR sequences of antibody 4A11.

いくつかの実施形態では、本発明は、（ａ）配列番号：１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号：１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号：１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号：１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号：１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１、２、３、４、５、または６つのＨＶＲを含む抗ＧＰＣ３抗体を提供する。   In some embodiments, the invention provides: (a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12; (b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13; (c) SEQ ID NO: 14 HVR-H3 comprising the amino acid sequence of: (d) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15; (e) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16; and (f) of SEQ ID NO: 17. Anti-GPC3 antibodies comprising at least 1, 2, 3, 4, 5, or 6 HVRs selected from HVR-L3 comprising an amino acid sequence are provided.

１つの態様では、本発明は、（ａ）配列番号：１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号：１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全部のＶＨ ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。１つの実施形態では、抗体が、配列番号：１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。もう１つの実施形態では、抗体が、配列番号：１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３及び配列番号：１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。さらに１つの実施形態では、抗体が、配列番号：１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号：１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び配列番号：１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２を含む。さらに１つの実施形態では、抗体が、（ａ）配列番号：１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号：１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。   In one aspect, the invention provides (a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12; (b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13; and (c) SEQ ID NO: 14. An antibody comprising at least one, at least two, or all three VH HVR sequences selected from HVR-H3 comprising an amino acid sequence is provided. In one embodiment, the antibody comprises HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14. In another embodiment, the antibody comprises HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 and HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17. In yet another embodiment, the antibody comprises HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, and HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13. Including. In a further embodiment, the antibody comprises (a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12; (b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13; and (c) SEQ ID NO: 14. HVR-H3 comprising the amino acid sequence of

もう１つの態様では、本発明は、（ａ）配列番号：１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号：１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号：１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全部のＶＬ ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。１つの実施形態では、抗体が、（ａ）配列番号：１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号：１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号：１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。   In another aspect, the invention provides (a) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15; (b) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16; and (c) SEQ ID NO: 17. An antibody comprising at least one, at least two, or all three VL HVR sequences selected from HVR-L3 comprising the amino acid sequences of: In one embodiment, the antibody comprises (a) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15; (b) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16; and (c) SEQ ID NO: 17. Includes HVR-L3 containing amino acid sequence.

もう１つの態様では、本発明の抗体が、（ａ）（ｉ）配列番号：１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号：１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号：１４から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つの、少なくとも２つの、または３つ全部のＶＨ ＨＶＲ配列を含むＶＨドメイン；及び（ｂ）（ｉ）配列番号：１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号：１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号：１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全部のＶＬ ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインを含む。   In another aspect, an antibody of the invention comprises (a) (i) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, (ii) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, and (iii) ) A VH domain comprising at least one, at least two, or all three VH HVR sequences selected from HVR-H3 comprising an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 14; and (b) (i) SEQ ID NO: At least one selected from: HVR-L1 comprising the amino acid sequence of 15; (ii) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16; and (c) HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17. A VL domain comprising at least two or all three VL HVR sequences.

もう１つの態様では、本発明は、（ａ）配列番号：１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号：１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号：１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号：１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号：１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体を提供する。   In another aspect, the invention provides (a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12; (b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13; (c) of SEQ ID NO: 14 HVR-H3 comprising the amino acid sequence; (d) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15; (e) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16; and (f) the amino acid of SEQ ID NO: 17. An antibody comprising HVR-L3 comprising a sequence is provided.

前記の実施形態のいずれかでは、抗ＧＰＣ３抗体が、ヒト化される。１つの実施形態では、抗ＧＰＣ３抗体が前記の実施形態のいずれかのとおりのＨＶＲを含み、さらにヒト受容体フレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。特定の実施形態では、ヒト受容体フレームワークが、ヒトＶＬカッパＩコンセンサス（ＶＬＫＩ）フレームワーク及び／またはＶＨフレームワークＶＨ１である。特定の実施形態では、ヒト受容体フレームワークが、以下の変異のいずれか１つを含むヒトＶＬカッパＩコンセンサス（ＶＬＫＩ）フレームワーク及び／またはＶＨフレームワークＶＨ１である。 In any of the above embodiments, the anti-GPC3 antibody is humanized. In one embodiment, the anti-GPC3 antibody comprises an HVR as in any of the previous embodiments, and further comprises a human receptor framework, eg, a human immunoglobulin framework or a human consensus framework. In certain embodiments, the human receptor framework is the human VL kappa I consensus (VL KI ) framework and / or the VH framework VH 1 . In certain embodiments, the human receptor framework is a human VL kappa I consensus (VL KI ) framework and / or VH framework VH 1 comprising any one of the following mutations:

もう１つの態様では、抗ＧＰＣ３抗体が、配列番号：１０のアミノ酸配列との配列同一性が、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％である重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。特定の実施形態では、配列番号：１０のアミノ酸配列との同一性が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％であるＶＨ配列が、参照配列に対して置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含有するが、配列がＧＰＣ３に結合する能力を保持することを含む抗ＧＰＣ３抗体を含有する。特定の実施形態では、計１〜１０個のアミノ酸が、配列番号：１０中で置換、挿入及び／または除去される。特定の実施形態では、計１〜５個のアミノ酸が、配列番号：１０中で置換、挿入及び／または除去される。特定の実施形態では、置換、挿入、または欠失が、ＨＶＲ（すなわち、ＦＲ）の外の領域で生じる。任意で、抗ＧＰＣ３抗体が、その配列の翻訳後修飾を含む配列番号：１０のＶＨ配列を含む。特定の実施形態では、ＶＨが、：（ａ）配列番号：１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される１つ、２つまたは３つのＨＶＲを含む。   In another aspect, the anti-GPC3 antibody has a sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 of at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, Contains heavy chain variable domain (VH) sequences that are 98%, 99%, or 100%. In certain embodiments, the identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 is at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% Certain VH sequences contain substitutions (eg, conservative substitutions), insertions, or deletions relative to a reference sequence, but contain anti-GPC3 antibodies that include retaining the ability of the sequence to bind to GPC3. In certain embodiments, a total of 1-10 amino acids are substituted, inserted, and / or removed in SEQ ID NO: 10. In certain embodiments, a total of 1 to 5 amino acids are substituted, inserted and / or removed in SEQ ID NO: 10. In certain embodiments, substitutions, insertions, or deletions occur in regions outside of HVR (ie, FR). Optionally, the anti-GPC3 antibody comprises the VH sequence of SEQ ID NO: 10 comprising post-translational modifications of that sequence. In certain embodiments, VH comprises: (a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, (b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, and (c) SEQ ID NO: 14 One, two or three HVRs selected from HVR-H3 comprising the amino acid sequence of

もう１つの態様では、抗体が配列番号：１１のアミノ酸配列との配列同一性が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％である軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗ＧＰＣ３抗体が提供される。特定の実施形態では、配列番号：１１のアミノ酸配列との同一性が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％であるＶＬ配列が、参照配列に対して置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含有するが、配列がＧＰＣ３に結合する能力を保持することを含む抗ＧＰＣ３抗体を含有する。特定の実施形態では、計１〜１０個のアミノ酸が、配列番号：１１中で置換、挿入及び／または除去される。特定の実施形態では、計１〜５個のアミノ酸が、配列番号：１１中で置換、挿入及び／または除去される。特定の実施形態では、置換、挿入、または欠失が、ＨＶＲ（すなわち、ＦＲ）の外の領域で生じる。任意で、抗ＧＰＣ３抗体が、その配列の翻訳後修飾を含む配列番号：１１のＶＬ配列を含む。特定の実施形態では、ＶＬが、（ａ）配列番号：１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号：１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号：１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される１つ、２つまたは３つのＨＶＲを含む。   In another aspect, the antibody has at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99 sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11. An anti-GPC3 antibody comprising a light chain variable domain (VL) that is 100% or 100% is provided. In certain embodiments, the identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 is at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% Certain VL sequences contain anti-GPC3 antibodies that contain substitutions (eg, conservative substitutions), insertions, or deletions relative to a reference sequence, but that retain the ability of the sequence to bind to GPC3. In certain embodiments, a total of 1-10 amino acids are substituted, inserted, and / or removed in SEQ ID NO: 11. In certain embodiments, a total of 1 to 5 amino acids are substituted, inserted and / or removed in SEQ ID NO: 11. In certain embodiments, substitutions, insertions, or deletions occur in regions outside of HVR (ie, FR). Optionally, the anti-GPC3 antibody comprises the VL sequence of SEQ ID NO: 11 comprising a post-translational modification of that sequence. In certain embodiments, VL comprises (a) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15; (b) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16; and (c) of SEQ ID NO: 17. Includes one, two or three HVRs selected from HVR-L3 comprising amino acid sequences.

もう１つの態様では、抗体前記に提供した実施形態のいずれかのとおりのＶＨ、及び前記に提供した実施形態のいずれかのとおりのＶＬを含む抗ＧＰＣ３抗体が提供される。１つの実施形態では、抗体が、配列番号：１０及び配列番号：１１中のＶＨ及びＶＬ配列を含み、それぞれが、これらの配列の翻訳後修飾を含む。もう１つの実施形態では、抗ＧＰＣ３抗体が、配列番号：１０及び配列番号：１１中のそれぞれのＶＨ及びＶＬ配列を含む抗体のヒト化形態を含む。   In another aspect, there is provided an anti-GPC3 antibody comprising an antibody VH as in any of the embodiments provided above and VL as in any of the embodiments provided above. In one embodiment, the antibody comprises the VH and VL sequences in SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11, each containing post-translational modifications of these sequences. In another embodiment, the anti-GPC3 antibody comprises a humanized form of an antibody comprising the respective VH and VL sequences in SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11.

さらに１つの態様では、本明細書に提供される抗ＧＰＣ３抗体と同じエピトープに結合する抗体が、本明細書に提供される。例えば、特定の実施形態では、配列番号：１０のＶＨ配列及び配列番号：１１のそれぞれのＶＬ配列を含む抗ＧＰＣ３抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。   In yet another aspect, provided herein is an antibody that binds to the same epitope as an anti-GPC3 antibody provided herein. For example, in certain embodiments, an antibody is provided that binds to the same epitope as an anti-GPC3 antibody comprising the VH sequence of SEQ ID NO: 10 and the respective VL sequence of SEQ ID NO: 11.

図４Ｂに示したとおり、Ｋａｂａｔナンバリングに従ったＨＶＲ１−ＬＣ、ＨＶＲ２−ＬＣ及びＨＶＲ３−ＬＣ配列を含む軽鎖可変ドメイン、及び、図４Ａに示したとおり、Ｋａｂａｔナンバリングに従ったＨＶＲ１−ＨＣ、ＨＶＲ２−ＨＣ及びＨＶＲ３−ＨＣ配列を含む重鎖可変ドメインを含む抗体が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、抗体が、図４Ｂに示したとおり、ＨＶＲ１−ＬＣ、ＨＶＲ２−ＬＣ及び／またはＨＶＲ３−ＬＣ配列、及びＦＲ１−ＬＣ、ＦＲ２−ＬＣ、ＦＲ３−ＬＣ及び／またはＦＲ４−ＬＣ配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗体が、図４Ａに示したとおり、ＨＶＲ１−ＨＣ、ＨＶＲ２−ＨＣ及び／またはＨＶＲ３−ＨＣ配列、及びＦＲ１−ＨＣ、ＦＲ２−ＨＣ、ＦＲ３−ＨＣ及び／またはＦＲ４−ＨＣ配列を含む重鎖可変ドメインを含む。   As shown in FIG. 4B, a light chain variable domain comprising HVR1-LC, HVR2-LC and HVR3-LC sequences according to Kabat numbering, and HVR1-HC, HVR2 according to Kabat numbering as shown in FIG. 4A. Provided herein are antibodies comprising heavy chain variable domains comprising HC and HVR3-HC sequences. In some embodiments, the antibody is an HVR1-LC, HVR2-LC and / or HVR3-LC sequence, and FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC and / or FR4-LC, as shown in FIG. 4B. A light chain variable domain comprising the sequence. In some embodiments, the antibody is an HVR1-HC, HVR2-HC and / or HVR3-HC sequence, and FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC and / or FR4-HC, as shown in FIG. 4A. Contains a heavy chain variable domain containing sequence.

本発明のさらに１つの態様では、前記の実施形態のいずれかに従った抗ＧＰＣ３抗体が、ヒト抗体を含む単クローン性抗体である。１つの実施形態では、抗ＧＰＣ３抗体が、抗体フラグメント、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体、またはＦ（ａｂ’）２フラグメントである。もう１つの実施形態では、抗体が、完全長抗体、例えば、本明細書に定義されるとおり、ＩｇＧ１もしくはＩｇＧ２ａ抗体または他の抗体クラスまたはイソタイプである。 In a further aspect of the invention, the anti-GPC3 antibody according to any of the previous embodiments is a monoclonal antibody comprising a human antibody. In one embodiment, the anti-GPC3 antibody is an antibody fragment, eg, an Fv, Fab, Fab ′, scFv, bispecific antibody, or F (ab ′) 2 fragment. In another embodiment, the antibody is a full length antibody, eg, an IgG1 or IgG2a antibody or other antibody class or isotype, as defined herein.

さらに１つの態様では、前記の実施形態のいずれかに従った抗ＧＰＣ３抗体が、単独で、または組み合わせて、以下に記載したとおり、特徴のいずれかを組み入れてよい。   In a further aspect, an anti-GPC3 antibody according to any of the above embodiments, alone or in combination, may incorporate any of the features as described below.

抗体１５Ｇ１及び他の実施形態
本明細書に提供される特定の実施形態が、部分的に、ヒトＧＰＣ３のアミノ酸４２０〜４７０内のエピトープに結合する抗体１５Ｇ１の発現に基づく。いくつかの実施形態では、本明細書にヒトＧＰＣ３のアミノ酸４２０〜４７０内のエピトープに結合する抗体が提供される。いくつかのかかる実施形態では、本明細書に抗体１５Ｇ１の１つ以上のＨＶＲ配列を含む抗体が提供される。 Antibody 15G1 and Other Embodiments Certain embodiments provided herein are based in part on the expression of antibody 15G1 that binds to an epitope within amino acids 420-470 of human GPC3. In some embodiments, provided herein are antibodies that bind to an epitope within amino acids 420-470 of human GPC3. In some such embodiments, provided herein are antibodies that comprise one or more HVR sequences of antibody 15G1.

いくつかの実施形態では、本発明は、（ａ）配列番号：２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号：３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号：３１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号：３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号：３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１、２、３、４、５、または６つのＨＶＲを含む抗ＧＰＣ３抗体を提供する。   In some embodiments, the invention provides: (a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28; (b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29; (c) SEQ ID NO: 30 HVR-H3 comprising the amino acid sequence of: (d) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31; (e) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 32; and (f) of SEQ ID NO: 33. Anti-GPC3 antibodies comprising at least 1, 2, 3, 4, 5, or 6 HVRs selected from HVR-L3 comprising an amino acid sequence are provided.

１つの態様では、本発明は、（ａ）配列番号：２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号：３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全部のＶＨ ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。１つの実施形態では、抗体が、配列番号：３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。もう１つの実施形態では、抗体が、配列番号：３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３及び配列番号：３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。さらに１つの実施形態では、抗体が、配列番号：３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号：３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び配列番号：２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２を含む。さらに１つの実施形態では、抗体が、（ａ）配列番号：２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号：３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。   In one aspect, the invention provides (a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28; (b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29; and (c) SEQ ID NO: 30. An antibody comprising at least one, at least two, or all three VH HVR sequences selected from HVR-H3 comprising an amino acid sequence is provided. In one embodiment, the antibody comprises HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30. In another embodiment, the antibody comprises HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30 and HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33. In yet another embodiment, the antibody comprises HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30, HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33, and HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29. Including. In a further embodiment, the antibody comprises (a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28; (b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29; and (c) SEQ ID NO: 30. HVR-H3 comprising the amino acid sequence of

もう１つの態様では、本発明は、（ａ）配列番号：３１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号：３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号：３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全部のＶＬ ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。１つの実施形態では、抗体が、（ａ）配列番号：３１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号：３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号：３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。   In another aspect, the invention provides (a) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31; (b) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 32; and (c) SEQ ID NO: 33. An antibody comprising at least one, at least two, or all three VL HVR sequences selected from HVR-L3 comprising the amino acid sequences of: In one embodiment, the antibody comprises (a) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31; (b) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 32; and (c) of SEQ ID NO: 33. Includes HVR-L3 containing amino acid sequence.

もう１つの態様では、本発明の抗体が、（ａ）（ｉ）配列番号：２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号：２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号：３０から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つの、少なくとも２つの、または３つ全部のＶＨ ＨＶＲ配列を含むＶＨドメイン；及び（ｂ）（ｉ）配列番号：３１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号：３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号：３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全部のＶＬ ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインを含む。   In another aspect, an antibody of the invention comprises (a) (i) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28, (ii) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29, and (iii) ) A VH domain comprising at least one, at least two, or all three VH HVR sequences selected from HVR-H3 comprising an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 30; and (b) (i) SEQ ID NO: At least one selected from: HVR-L1 comprising the amino acid sequence of 31; (ii) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 32; and (c) HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33. A VL domain comprising at least two or all three VL HVR sequences.

もう１つの態様では、本発明は、（ａ）配列番号：２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号：３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号：３１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号：３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号：３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体を提供する。   In another aspect, the invention provides (a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28; (b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29; (c) of SEQ ID NO: 30 HVR-H3 comprising the amino acid sequence; (d) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31; (e) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 32; and (f) the amino acid of SEQ ID NO: 33. An antibody comprising HVR-L3 comprising a sequence is provided.

前記の実施形態のいずれかでは、抗ＧＰＣ３抗体が、ヒト化される。１つの実施形態では、抗ＧＰＣ３抗体が前記の実施形態のいずれかのとおりのＨＶＲを含み、さらにヒト受容体フレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。特定の実施形態では、ヒト受容体フレームワークが、ヒトＶＬカッパＩコンセンサス（ＶＬＫＩ）フレームワーク及び／またはＶＨフレームワークＶＨ１である。特定の実施形態では、ヒト受容体フレームワークが、以下の変異のいずれか１つを含むヒトＶＬカッパＩコンセンサス（ＶＬＫＩ）フレームワーク及び／またはＶＨフレームワークＶＨ１である。 In any of the above embodiments, the anti-GPC3 antibody is humanized. In one embodiment, the anti-GPC3 antibody comprises an HVR as in any of the previous embodiments, and further comprises a human receptor framework, eg, a human immunoglobulin framework or a human consensus framework. In certain embodiments, the human receptor framework is the human VL kappa I consensus (VL KI ) framework and / or the VH framework VH 1 . In certain embodiments, the human receptor framework is a human VL kappa I consensus (VL KI ) framework and / or VH framework VH 1 comprising any one of the following mutations:

もう１つの態様では、抗ＧＰＣ３抗体が、配列番号：２６のアミノ酸配列との配列同一性が、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％である重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。特定の実施形態では、配列番号：２６のアミノ酸配列との同一性が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％であるＶＨ配列が、参照配列に対して置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含有するが、配列がＧＰＣ３に結合する能力を保持することを含む抗ＧＰＣ３抗体を含有する。特定の実施形態では、計１〜１０個のアミノ酸が、配列番号：２６中で置換、挿入及び／または除去される。特定の実施形態では、計１〜５個のアミノ酸が、配列番号：２６中で置換、挿入及び／または除去される。特定の実施形態では、置換、挿入、または欠失が、ＨＶＲ（すなわち、ＦＲ）の外の領域で生じる。任意で、抗ＧＰＣ３抗体が、その配列の翻訳後修飾を含む配列番号：２６のＶＨ配列を含む。特定の実施形態では、ＶＨが、：（ａ）配列番号：２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される１つ、２つまたは３つのＨＶＲを含む。   In another aspect, the anti-GPC3 antibody has at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, Contains heavy chain variable domain (VH) sequences that are 98%, 99%, or 100%. In certain embodiments, the identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26 is at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% Certain VH sequences contain substitutions (eg, conservative substitutions), insertions, or deletions relative to a reference sequence, but contain anti-GPC3 antibodies that include retaining the ability of the sequence to bind to GPC3. In certain embodiments, a total of 1-10 amino acids are substituted, inserted, and / or removed in SEQ ID NO: 26. In certain embodiments, a total of 1 to 5 amino acids are substituted, inserted and / or removed in SEQ ID NO: 26. In certain embodiments, substitutions, insertions, or deletions occur in regions outside of HVR (ie, FR). Optionally, the anti-GPC3 antibody comprises the VH sequence of SEQ ID NO: 26, including post-translational modifications of that sequence. In certain embodiments, VH comprises: (a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28, (b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29, and (c) SEQ ID NO: 30. One, two or three HVRs selected from HVR-H3 comprising the amino acid sequence of

もう１つの態様では、抗体が配列番号：２７のアミノ酸配列との配列同一性が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％である軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗ＧＰＣ３抗体が提供される。特定の実施形態では、配列番号：２７のアミノ酸配列との同一性が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％であるＶＬ配列が、参照配列に対して置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含有するが、配列がＧＰＣ３に結合する能力を保持することを含む抗ＧＰＣ３抗体を含有する。特定の実施形態では、計１〜１０個のアミノ酸が、配列番号：２７中で置換、挿入及び／または除去される。特定の実施形態では、計１〜５個のアミノ酸が、配列番号：２７中で置換、挿入及び／または除去される。特定の実施形態では、置換、挿入、または欠失が、ＨＶＲ（すなわち、ＦＲ）の外の領域で生じる。任意で、抗ＧＰＣ３抗体が、その配列の翻訳後修飾を含む配列番号：２７のＶＬ配列を含む。特定の実施形態では、ＶＬが、（ａ）配列番号：３１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号：３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号：３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される１つ、２つまたは３つのＨＶＲを含む。   In another embodiment, the antibody has at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99 sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27. An anti-GPC3 antibody comprising a light chain variable domain (VL) that is 100% or 100% is provided. In certain embodiments, the identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27 is at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% Certain VL sequences contain anti-GPC3 antibodies that contain substitutions (eg, conservative substitutions), insertions, or deletions relative to a reference sequence, but that retain the ability of the sequence to bind to GPC3. In certain embodiments, a total of 1-10 amino acids are substituted, inserted, and / or removed in SEQ ID NO: 27. In certain embodiments, a total of 1 to 5 amino acids are substituted, inserted and / or removed in SEQ ID NO: 27. In certain embodiments, substitutions, insertions, or deletions occur in regions outside of HVR (ie, FR). Optionally, the anti-GPC3 antibody comprises the VL sequence of SEQ ID NO: 27 that includes a post-translational modification of that sequence. In certain embodiments, VL comprises (a) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31; (b) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 32; and (c) of SEQ ID NO: 33. Includes one, two or three HVRs selected from HVR-L3 comprising amino acid sequences.

もう１つの態様では、抗体前記に提供した実施形態のいずれかのとおりのＶＨ、及び前記に提供した実施形態のいずれかのとおりのＶＬを含む抗ＧＰＣ３抗体が提供される。１つの実施形態では、抗体が、配列番号：２６及び配列番号：２７中のＶＨ及びＶＬ配列を含み、それぞれが、これらの配列の翻訳後修飾を含む。もう１つの実施形態では、抗ＧＰＣ３抗体が、配列番号：２６及び配列番号：２７中のそれぞれのＶＨ及びＶＬ配列を含む抗体のヒト化形態を含む。   In another aspect, there is provided an anti-GPC3 antibody comprising an antibody VH as in any of the embodiments provided above and VL as in any of the embodiments provided above. In one embodiment, the antibody comprises the VH and VL sequences in SEQ ID NO: 26 and SEQ ID NO: 27, each containing post-translational modifications of these sequences. In another embodiment, the anti-GPC3 antibody comprises a humanized form of an antibody comprising the respective VH and VL sequences in SEQ ID NO: 26 and SEQ ID NO: 27.

さらに１つの態様では、本明細書に提供される抗ＧＰＣ３抗体と同じエピトープに結合する抗体が、本明細書に提供される。例えば、特定の実施形態では、配列番号：２６のＶＨ配列及び配列番号：２７のそれぞれのＶＬ配列を含む抗ＧＰＣ３抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。   In yet another aspect, provided herein is an antibody that binds to the same epitope as an anti-GPC3 antibody provided herein. For example, in certain embodiments, an antibody is provided that binds to the same epitope as an anti-GPC3 antibody comprising the VH sequence of SEQ ID NO: 26 and the respective VL sequence of SEQ ID NO: 27.

図４Ｂに示したとおり、Ｋａｂａｔナンバリングに従ったＨＶＲ１−ＬＣ、ＨＶＲ２−ＬＣ及びＨＶＲ３−ＬＣ配列を含む軽鎖可変ドメイン、及び、図４Ａに示したとおり、Ｋａｂａｔナンバリングに従ったＨＶＲ１−ＨＣ、ＨＶＲ２−ＨＣ及びＨＶＲ３−ＨＣ配列を含む重鎖可変ドメインを含む抗体が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、抗体が、図４Ｂに示したとおり、ＨＶＲ１−ＬＣ、ＨＶＲ２−ＬＣ及び／またはＨＶＲ３−ＬＣ配列、及びＦＲ１−ＬＣ、ＦＲ２−ＬＣ、ＦＲ３−ＬＣ及び／またはＦＲ４−ＬＣ配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗体が、図４Ａに示したとおり、ＨＶＲ１−ＨＣ、ＨＶＲ２−ＨＣ及び／またはＨＶＲ３−ＨＣ配列、及びＦＲ１−ＨＣ、ＦＲ２−ＨＣ、ＦＲ３−ＨＣ及び／またはＦＲ４−ＨＣ配列を含む重鎖可変ドメインを含む。   As shown in FIG. 4B, a light chain variable domain comprising HVR1-LC, HVR2-LC and HVR3-LC sequences according to Kabat numbering, and HVR1-HC, HVR2 according to Kabat numbering as shown in FIG. 4A. Provided herein are antibodies comprising heavy chain variable domains comprising HC and HVR3-HC sequences. In some embodiments, the antibody is an HVR1-LC, HVR2-LC and / or HVR3-LC sequence, and FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC and / or FR4-LC, as shown in FIG. 4B. A light chain variable domain comprising the sequence. In some embodiments, the antibody is an HVR1-HC, HVR2-HC and / or HVR3-HC sequence, and FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC and / or FR4-HC, as shown in FIG. 4A. Contains a heavy chain variable domain containing sequence.

本発明のさらに１つの態様では、前記の実施形態のいずれかに従った抗ＧＰＣ３抗体が、ヒト抗体を含む単クローン性抗体である。１つの実施形態では、抗ＧＰＣ３抗体が、抗体フラグメント、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体、またはＦ（ａｂ’）２フラグメントである。もう１つの実施形態では、抗体が、完全長抗体、例えば、本明細書に定義されるとおり、ＩｇＧ１もしくはＩｇＧ２ａ抗体または他の抗体クラスまたはイソタイプである。 In a further aspect of the invention, the anti-GPC3 antibody according to any of the previous embodiments is a monoclonal antibody comprising a human antibody. In one embodiment, the anti-GPC3 antibody is an antibody fragment, eg, an Fv, Fab, Fab ′, scFv, bispecific antibody, or F (ab ′) 2 fragment. In another embodiment, the antibody is a full length antibody, eg, an IgG1 or IgG2a antibody or other antibody class or isotype, as defined herein.

さらに１つの態様では、前記の実施形態のいずれかに従った抗ＧＰＣ３抗体が、単独で、または組み合わせて、以下に記載したとおり、特徴のいずれかを組み入れてよい。   In a further aspect, an anti-GPC3 antibody according to any of the above embodiments, alone or in combination, may incorporate any of the features as described below.

抗体４Ｇ７及び他の実施形態
本明細書に提供される特定の実施形態は、部分的に、完全長ヒトＧＰＣ３に結合するが、Ｎ−末端フラグメントまたはヒトＧＰＣ３のＣ−末端フラグメントに結合しない抗体４Ｇ７の発現に基づく。これは、ヒトＧＰＣ３のアミノ酸Ｒ３５８／Ｓ３５９でフーリン切断部位にまたがるエピトープに結合することを示唆している。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される抗体が、完全長成熟ヒトＧＰＣ３に結合するが、ヒトＧＰＣ３のＮ−末端フラグメント（配列番号：１のアミノ酸２５〜３５８）に結合せず、ヒトＧＰＣ３のＣ−末端フラグメント（配列番号：１のアミノ酸３５９〜５６０（ＧＰＩ結合なし）またはアミノ酸３５９〜５８０（ＧＰＩ結合あり））に結合しない。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される抗体が、ヒトＧＰＣ３のアミノ酸Ｒ３５８／Ｓ３５９でフーリン切断部位にまたがるエピトープに結合する。いくつかのかかる実施形態では、本明細書に抗体４Ｇ７の１つ以上のＨＶＲ配列を含む抗体が提供される。 Antibody 4G7 and Other Embodiments Certain embodiments provided herein partially bind to full-length human GPC3, but do not bind to an N-terminal fragment or a C-terminal fragment of human GPC3. Based on the expression of This suggests that amino acids R358 / S359 of human GPC3 bind to an epitope spanning the furin cleavage site. In some embodiments, an antibody provided herein binds to full-length mature human GPC3 but does not bind to the N-terminal fragment of human GPC3 (amino acids 25-358 of SEQ ID NO: 1) It does not bind to the C-terminal fragment of human GPC3 (amino acids 359 to 560 (no GPI binding) or amino acids 359 to 580 (GPI binding) of SEQ ID NO: 1). In some embodiments, an antibody provided herein binds to an epitope spanning the furin cleavage site at amino acids R358 / S359 of human GPC3. In some such embodiments, provided herein are antibodies that comprise one or more HVR sequences of antibody 4G7.

いくつかの実施形態では、本発明は、（ａ）配列番号：２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号：２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号：２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号：２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号：２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１、２、３、４、５、または６つのＨＶＲを含む抗ＧＰＣ３抗体を提供する。   In some embodiments, the invention provides: (a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20; (b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21; (c) SEQ ID NO: 22 HVR-H3 comprising the amino acid sequence of: (d) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23; (e) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24; and (f) of SEQ ID NO: 25 Anti-GPC3 antibodies comprising at least 1, 2, 3, 4, 5, or 6 HVRs selected from HVR-L3 comprising an amino acid sequence are provided.

１つの態様では、本発明は、（ａ）配列番号：２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号：２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全部のＶＨ ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。１つの実施形態では、抗体が、配列番号：２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。もう１つの実施形態では、抗体が、配列番号：２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３及び配列番号：２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。さらに１つの実施形態では、抗体が、配列番号：２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号：２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び配列番号：２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２を含む。さらに１つの実施形態では、抗体が、（ａ）配列番号：２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号：２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。   In one aspect, the invention provides (a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20; (b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21; and (c) SEQ ID NO: 22. An antibody comprising at least one, at least two, or all three VH HVR sequences selected from HVR-H3 comprising an amino acid sequence is provided. In one embodiment, the antibody comprises HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22. In another embodiment, the antibody comprises HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22 and HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25. In yet another embodiment, the antibody comprises HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22, HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25, and HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21. Including. In a further embodiment, the antibody comprises (a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20; (b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21; and (c) SEQ ID NO: 22. HVR-H3 comprising the amino acid sequence of

もう１つの態様では、本発明は、（ａ）配列番号：２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号：２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号：２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全部のＶＬ ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。１つの実施形態では、抗体が、（ａ）配列番号：２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号：２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号：２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。   In another aspect, the invention provides (a) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23; (b) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24; and (c) SEQ ID NO: 25. An antibody comprising at least one, at least two, or all three VL HVR sequences selected from HVR-L3 comprising the amino acid sequences of: In one embodiment, the antibody comprises (a) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23; (b) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24; and (c) SEQ ID NO: 25. Includes HVR-L3 containing amino acid sequence.

もう１つの態様では、本発明の抗体が、（ａ）（ｉ）配列番号：２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号：２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号：２２から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つの、少なくとも２つの、または３つ全部のＶＨ ＨＶＲ配列を含むＶＨドメイン；及び（ｂ）（ｉ）配列番号：２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号：２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号：２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全部のＶＬ ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインを含む。   In another aspect, an antibody of the invention comprises (a) (i) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20, (ii) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, and (iii) ) A VH domain comprising at least one, at least two, or all three VH HVR sequences selected from HVR-H3 comprising an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 22; and (b) (i) SEQ ID NO: At least one selected from: HVR-L1 comprising the amino acid sequence of 23, (ii) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24, and (c) HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25 A VL domain comprising at least two or all three VL HVR sequences.

もう１つの態様では、本発明は、（ａ）配列番号：２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号：２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号：２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号：２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号：２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体を提供する。   In another aspect, the invention provides (a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20; (b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21; (c) of SEQ ID NO: 22 HVR-H3 comprising the amino acid sequence; (d) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23; (e) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24; and (f) the amino acid of SEQ ID NO: 25. An antibody comprising HVR-L3 comprising a sequence is provided.

前記の実施形態のいずれかでは、抗ＧＰＣ３抗体が、ヒト化される。１つの実施形態では、抗ＧＰＣ３抗体が前記の実施形態のいずれかのとおりのＨＶＲを含み、さらにヒト受容体フレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。特定の実施形態では、ヒト受容体フレームワークが、ヒトＶＬカッパＩコンセンサス（ＶＬＫＩ）フレームワーク及び／またはＶＨフレームワークＶＨ１である。特定の実施形態では、ヒト受容体フレームワークが、以下の変異のいずれか１つを含むヒトＶＬカッパＩコンセンサス（ＶＬＫＩ）フレームワーク及び／またはＶＨフレームワークＶＨ１である。 In any of the above embodiments, the anti-GPC3 antibody is humanized. In one embodiment, the anti-GPC3 antibody comprises an HVR as in any of the previous embodiments, and further comprises a human receptor framework, eg, a human immunoglobulin framework or a human consensus framework. In certain embodiments, the human receptor framework is the human VL kappa I consensus (VL KI ) framework and / or the VH framework VH 1 . In certain embodiments, the human receptor framework is a human VL kappa I consensus (VL KI ) framework and / or VH framework VH 1 comprising any one of the following mutations:

もう１つの態様では、抗ＧＰＣ３抗体が、配列番号：１８のアミノ酸配列との配列同一性が、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％である重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。特定の実施形態では、配列番号：１８のアミノ酸配列との同一性が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％であるＶＨ配列が、参照配列に対して置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含有するが、配列がＧＰＣ３に結合する能力を保持することを含む抗ＧＰＣ３抗体を含有する。特定の実施形態では、計１〜１０個のアミノ酸が、配列番号：１８中で置換、挿入及び／または除去される。特定の実施形態では、計１〜５個のアミノ酸が、配列番号：１８中で置換、挿入及び／または除去される。特定の実施形態では、置換、挿入、または欠失が、ＨＶＲ（すなわち、ＦＲ）の外の領域で生じる。任意で、抗ＧＰＣ３抗体が、その配列の翻訳後修飾を含む配列番号：１８のＶＨ配列を含む。特定の実施形態では、ＶＨが、：（ａ）配列番号：２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号：２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号：２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される１つ、２つまたは３つのＨＶＲを含む。   In another aspect, the anti-GPC3 antibody has at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, Contains heavy chain variable domain (VH) sequences that are 98%, 99%, or 100%. In certain embodiments, the identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 is at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% Certain VH sequences contain substitutions (eg, conservative substitutions), insertions, or deletions relative to a reference sequence, but contain anti-GPC3 antibodies that include retaining the ability of the sequence to bind to GPC3. In certain embodiments, a total of 1-10 amino acids are substituted, inserted, and / or removed in SEQ ID NO: 18. In certain embodiments, a total of 1-5 amino acids are substituted, inserted, and / or removed in SEQ ID NO: 18. In certain embodiments, substitutions, insertions, or deletions occur in regions outside of HVR (ie, FR). Optionally, the anti-GPC3 antibody comprises the VH sequence of SEQ ID NO: 18 comprising post-translational modifications of that sequence. In certain embodiments, VH comprises: (a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20, (b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, and (c) SEQ ID NO: 22. One, two or three HVRs selected from HVR-H3 comprising the amino acid sequence of

もう１つの態様では、抗体が配列番号：１９のアミノ酸配列との配列同一性が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％である軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗ＧＰＣ３抗体が提供される。特定の実施形態では、配列番号：１９のアミノ酸配列との同一性が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％であるＶＬ配列が、参照配列に対して置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含有するが、配列がＧＰＣ３に結合する能力を保持することを含む抗ＧＰＣ３抗体を含有する。特定の実施形態では、計１〜１０個のアミノ酸が、配列番号：１９中で置換、挿入及び／または除去される。特定の実施形態では、計１〜５個のアミノ酸が、配列番号：１９中で置換、挿入及び／または除去される。特定の実施形態では、置換、挿入、または欠失が、ＨＶＲ（すなわち、ＦＲ）の外の領域で生じる。任意で、抗ＧＰＣ３抗体が、その配列の翻訳後修飾を含む配列番号：１９のＶＬ配列を含む。特定の実施形態では、ＶＬが、（ａ）配列番号：２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号：２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号：２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される１つ、２つまたは３つのＨＶＲを含む。   In another embodiment, the antibody has at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99 sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19. An anti-GPC3 antibody comprising a light chain variable domain (VL) that is 100% or 100% is provided. In certain embodiments, the identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 is at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% Certain VL sequences contain anti-GPC3 antibodies that contain substitutions (eg, conservative substitutions), insertions, or deletions relative to a reference sequence, but that retain the ability of the sequence to bind to GPC3. In certain embodiments, a total of 1-10 amino acids are substituted, inserted, and / or removed in SEQ ID NO: 19. In certain embodiments, a total of 1-5 amino acids are substituted, inserted, and / or removed in SEQ ID NO: 19. In certain embodiments, substitutions, insertions, or deletions occur in regions outside of HVR (ie, FR). Optionally, the anti-GPC3 antibody comprises the VL sequence of SEQ ID NO: 19, including post-translational modifications of that sequence. In certain embodiments, VL comprises (a) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23; (b) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24; and (c) of SEQ ID NO: 25. Includes one, two or three HVRs selected from HVR-L3 comprising amino acid sequences.

もう１つの態様では、抗体前記に提供した実施形態のいずれかのとおりのＶＨ、及び前記に提供した実施形態のいずれかのとおりのＶＬを含む抗ＧＰＣ３抗体が提供される。１つの実施形態では、抗体が、配列番号：１８及び配列番号：１９中のＶＨ及びＶＬ配列を含み、それぞれが、これらの配列の翻訳後修飾を含む。もう１つの実施形態では、抗ＧＰＣ３抗体が、配列番号：１８及び配列番号：１９中のそれぞれのＶＨ及びＶＬ配列を含む抗体のヒト化形態を含む。   In another aspect, there is provided an anti-GPC3 antibody comprising an antibody VH as in any of the embodiments provided above and VL as in any of the embodiments provided above. In one embodiment, the antibody comprises the VH and VL sequences in SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 19, each containing post-translational modifications of these sequences. In another embodiment, the anti-GPC3 antibody comprises a humanized form of an antibody comprising the respective VH and VL sequences in SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 19.

さらに１つの態様では、本明細書に提供される抗ＧＰＣ３抗体と同じエピトープに結合する抗体が、本明細書に提供される。例えば、特定の実施形態では、配列番号：１８のＶＨ配列及び配列番号：１９のそれぞれのＶＬ配列を含む抗ＧＰＣ３抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。   In yet another aspect, provided herein is an antibody that binds to the same epitope as an anti-GPC3 antibody provided herein. For example, in certain embodiments, an antibody is provided that binds to the same epitope as an anti-GPC3 antibody comprising the VH sequence of SEQ ID NO: 18 and the respective VL sequence of SEQ ID NO: 19.

図４Ｂに示したとおり、Ｋａｂａｔナンバリングに従ったＨＶＲ１−ＬＣ、ＨＶＲ２−ＬＣ及びＨＶＲ３−ＬＣ配列を含む軽鎖可変ドメイン、及び、図４Ａに示したとおり、Ｋａｂａｔナンバリングに従ったＨＶＲ１−ＨＣ、ＨＶＲ２−ＨＣ及びＨＶＲ３−ＨＣ配列を含む重鎖可変ドメインを含む抗体が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、抗体が、図４Ｂに示したとおり、ＨＶＲ１−ＬＣ、ＨＶＲ２−ＬＣ及び／またはＨＶＲ３−ＬＣ配列、及びＦＲ１−ＬＣ、ＦＲ２−ＬＣ、ＦＲ３−ＬＣ及び／またはＦＲ４−ＬＣ配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗体が、図４Ａに示したとおり、ＨＶＲ１−ＨＣ、ＨＶＲ２−ＨＣ及び／またはＨＶＲ３−ＨＣ配列、及びＦＲ１−ＨＣ、ＦＲ２−ＨＣ、ＦＲ３−ＨＣ及び／またはＦＲ４−ＨＣ配列を含む重鎖可変ドメインを含む。   As shown in FIG. 4B, a light chain variable domain comprising HVR1-LC, HVR2-LC and HVR3-LC sequences according to Kabat numbering, and HVR1-HC, HVR2 according to Kabat numbering as shown in FIG. 4A. Provided herein are antibodies comprising heavy chain variable domains comprising HC and HVR3-HC sequences. In some embodiments, the antibody is an HVR1-LC, HVR2-LC and / or HVR3-LC sequence, and FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC and / or FR4-LC, as shown in FIG. 4B. A light chain variable domain comprising the sequence. In some embodiments, the antibody is an HVR1-HC, HVR2-HC and / or HVR3-HC sequence, and FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC and / or FR4-HC, as shown in FIG. 4A. Contains a heavy chain variable domain containing sequence.

本発明のさらに１つの態様では、前記の実施形態のいずれかに従った抗ＧＰＣ３抗体が、ヒト抗体を含む単クローン性抗体である。１つの実施形態では、抗ＧＰＣ３抗体が、抗体フラグメント、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体、またはＦ（ａｂ’）２フラグメントである。もう１つの実施形態では、抗体が、完全長抗体、例えば、本明細書に定義されるとおり、ＩｇＧ１もしくはＩｇＧ２ａ抗体または他の抗体クラスまたはイソタイプである。 In a further aspect of the invention, the anti-GPC3 antibody according to any of the previous embodiments is a monoclonal antibody comprising a human antibody. In one embodiment, the anti-GPC3 antibody is an antibody fragment, eg, an Fv, Fab, Fab ′, scFv, bispecific antibody, or F (ab ′) 2 fragment. In another embodiment, the antibody is a full length antibody, eg, an IgG1 or IgG2a antibody or other antibody class or isotype, as defined herein.

さらに１つの態様では、前記の実施形態のいずれかに従った抗ＧＰＣ３抗体が、単独で、または組み合わせて、以下に記載したとおり、特徴のいずれかを組み入れてよい。   In a further aspect, an anti-GPC3 antibody according to any of the above embodiments, alone or in combination, may incorporate any of the features as described below.

１．抗体親和性
特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体の解離定数（Ｋｄ）が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦５０ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦５ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０.１ｎＭ、≦０.０１ｎＭ、または≦０.００１ｎＭであり、任意で、１０−１３Ｍ（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば、１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）である。 1. Antibody Affinity In certain embodiments, the dissociation constant (Kd) of the antibodies provided herein has a ≦ 1 μM, ≦ 100 nM, ≦ 50 nM, ≦ 10 nM, ≦ 5 nM, ≦ 1 nM, ≦ 0.1 nM, ≦ 0. 0.01 nM, or ≦ 0.001 nM, and optionally 10 −13 M (eg, 10 −8 M or less, eg, 10 −8 M to 10 −13 M, eg, 10 −9 M to 10 −13 M ).

１つの実施形態では、Ｋｄが、以下のアッセイに記載したとおり、対象の抗体のＦａｂバージョン及びその抗原で実行される放射性同位元素標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）によって測定される。抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性は、未標識抗原の一連の滴定の存在下で、最小濃度の（１２５Ｉ）−標識抗原とＦａｂを平衡化し、その後、抗Ｆａｂ抗体コーティングプレートと結合した抗原を捕捉することによって測定される（例えば、Ｃｈｅｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１（１９９９）を参照）。アッセイのための条件を確立するために、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標）マルチウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、５０ｍＭの炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中の５μｇ／ｍＬの捕捉抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａｂｓ）で一晩コーティングし、その後、ＰＢＳ中の２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンにより、室温（およそ２３℃）で２〜５時間ブロッキングする。非吸着性のプレート（Ｎｕｎｃ番号２６９６２０）中で、１００ｐＭまたは２６ｐＭ［１２５Ｉ］−抗原を、対象のＦａｂの段階希釈液と混合する（例えば、Ｐｒｅｓｔａら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：４５９３−４５９９（１９９７）の抗ＶＥＧＦ抗体Ｆａｂ−１２の評価と一致）。その後、対象のＦａｂを一晩インキュベートする；しかし、インキュベーションは、平衡に到達することを確実にするために、より長い期間（例えば、約６５時間）継続してもよい。その後、混合物を、室温での（例えば、１時間にわたる）インキュベーションのために、捕捉プレートに移す。その後、溶液を除去し、プレートを、ＰＢＳ中の０．１％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標））で８回洗浄する。プレートが乾燥した場合、１５０μＬ／ウェルのシンチラント（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ−２０（商標）；Ｐａｃｋａｒｄ）を添加し、プレートをＴＯＰＣＯＵＮＴ（商標）ガンマカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ）により１０分間計数する。最大結合の２０％以下をもたらす各Ｆａｂの濃度を、競合結合アッセイに使用するために選択する。 In one embodiment, Kd is measured by a radioisotope labeled antigen binding assay (RIA) performed on the Fab version of the antibody of interest and its antigen, as described in the following assay. The solution binding affinity of the Fab to the antigen is determined by equilibrating the Fab with a minimal concentration of ( 125I ) -labeled antigen in the presence of a series of titrations of unlabeled antigen and then binding the antigen bound to the anti-Fab antibody coated plate. Measured by capture (see, eg, Chen et al., J. Mol. Biol. 293: 865-881 (1999)). To establish the conditions for the assay, MICROTITER® multiwell plates (Thermo Scientific) were washed with 5 μg / mL capture anti-Fab antibody (Cappel Labs) in 50 mM sodium carbonate (pH 9.6). Coat overnight and then block with 2% (w / v) bovine serum albumin in PBS for 2-5 hours at room temperature (approximately 23 ° C.). In a non-adsorbing plate (Nunc number 269620), 100 pM or 26 pM [ 125 I] -antigen is mixed with serial dilutions of the Fab of interest (eg, Presta et al., Cancer Res. 57: 4593-4599 (1997). The evaluation of the anti-VEGF antibody Fab-12 in FIG. The subject Fab is then incubated overnight; however, the incubation may continue for a longer period of time (eg, about 65 hours) to ensure that equilibrium is reached. The mixture is then transferred to a capture plate for incubation at room temperature (eg, over 1 hour). The solution is then removed and the plate is washed 8 times with 0.1% polysorbate 20 (TWEEN-20®) in PBS. When the plate is dry, 150 μL / well scintillant (MICROSCINT-20 ™; Packard) is added and the plate is counted for 10 minutes with a TOPCOUNT ™ gamma counter (Packard). The concentration of each Fab that results in 20% or less of maximum binding is selected for use in the competitive binding assay.

もう１つの実施形態によれば、Ｋｄは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用した表面プラスモン共鳴アッセイを使用して、２５℃で、約１０応答単位（ＲＵ）で固定化された抗原ＣＭ５チップを用いて測定される。簡潔にいうと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡＣＯＲＥ，Ｉｎｃ．）を、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）により、供給業者の指示に従って活性化する。抗原を１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍｌ（約０．２μＭ）まで希釈した後、５μｌ／分の流速で注入し、およそ１０応答単位（ＲＵ）のカップリングタンパク質を得る。抗原の注入後、１Ｍのエタノールアミンを注入して、未反応基をブロックする。動態測定のために、Ｆａｂの２倍段階希釈液（０．７８ｎＭ−５００ｎＭ）を、０．０５％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０（商標））界面活性剤を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中に、２５℃で、およそ２５μｌ／分の流速で注入する。会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）を、単純な１対１ラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ第３．２版）を使用して、会合センサグラム及び解離センサグラムに同時に適合させることによって、算出する。平衡解離定数（Ｋｄ）を、比率ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして算出する。例えば、Ｃｈｅｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１（１９９９）を参照。前記の表面プラスモン共鳴アッセイによるオン速度が、１０６Ｍ−１ｓ−１を超える場合、その後、オン速度は、蛍光消光技術を使用することによって、測定することができる。蛍光消光技術は、分光計、例えば、撹拌キュベットを備えるストップトフロー装着分光光度計（Ａｖｉｖ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）または８０００−シリーズＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯ（商標）分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）で測定されるとおり、漸増濃度の抗原の存在下で、２５oＣで、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中の２０ｎＭ抗−抗原抗体（Ｆａｂ型）の蛍光発光強度（励起＝２９５ｎｍ；発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍ帯域通過）の増加または減少を測定する。 According to another embodiment, the Kd is 25 using a surface plasmon resonance assay using BIACORE®-2000 or BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc, Piscataway, NJ). Measured using an antigen CM5 chip immobilized at about 10 response units (RU) at ° C. Briefly, carboxymethylated dextran biosensor chip (CM5, BIACORE, Inc.) was prepared using N-ethyl-N ′-(3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide hydrochloride (EDC) and N-hydroxysuccinimide. Activate with (NHS) according to the supplier's instructions. The antigen is diluted with 10 mM sodium acetate (pH 4.8) to 5 μg / ml (about 0.2 μM) and then injected at a flow rate of 5 μl / min to obtain approximately 10 response units (RU) of coupled protein. After the injection of antigen, 1M ethanolamine is injected to block unreacted groups. For kinetic measurements, Fab 2-fold serial dilutions (0.78 nM-500 nM) were added at 25 ° C. in PBS with 0.05% polysorbate 20 (TWEEN-20 ™) surfactant (PBST). At a flow rate of approximately 25 μl / min. Associating association rate (k on ) and dissociation rate (k off ) into association and dissociation sensorgrams using a simple one-to-one Langmuir binding model (BIACORE® Evaluation Software Version 3.2) Calculate by fitting simultaneously. The equilibrium dissociation constant (Kd) is calculated as the ratio k off / k on . For example, Chen et al. Mol. Biol. 293: 865-881 (1999). If the on-rate by the surface plasmon resonance assay exceeds 10 6 M −1 s −1 , then the on-rate can be measured by using a fluorescence quenching technique. Fluorescence quenching techniques are used in increasing concentrations as measured with a spectrometer, for example, a stopped-flow equipped spectrophotometer with a stirring cuvette (Aviv Instruments) or an 8000-series SLM-AMINCO ™ spectrophotometer (ThermoSpectronic). Increase or decrease in fluorescence emission intensity (excitation = 295 nm; emission = 340 nm, 16 nm band pass) of 20 nM anti-antigen antibody (Fab type) in PBS (pH 7.2) at 25 ° C in the presence of antigen. taking measurement.

２．抗体フラグメント
特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体が、抗体フラグメントである。抗体フラグメントとしては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、及びｓｃＦｖフラグメント、ならびに以下に記載した他のフラグメントが挙げられるがこれらに限定されない。特定の抗体フラグメントの再検討には、ＨｕｄｓｏｎらＮａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）を参照。ｓｃＦｖフラグメントの再検討には、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ 及び Ｍｏｏｒｅ 編，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照；また、ＷＯ ９３／１６１８５；及び米国特許第５，５７１，８９４号及び５，５８７，４５８号を参照。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期が増大しているＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２フラグメントの考察には、米国特許第５，８６９，０４６号を参照。 2. Antibody Fragments In certain embodiments, the antibodies provided herein are antibody fragments. Antibody fragments include, but are not limited to, Fab, Fab ′, Fab′-SH, F (ab ′) 2 , Fv, and scFv fragments, and other fragments described below. For review of specific antibody fragments, see Hudson et al. Nat. Med. 9: 129-134 (2003). For review of scFv fragments, see, for example, Plugthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, edited by Rosenburg and Moore, (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994); see also WO 93/16185; and US Pat. Nos. 5,571,894 and 5,587,458. See US Pat. No. 5,869,046 for a discussion of Fab and F (ab ′) 2 fragments containing salvage receptor binding epitope residues and having increased in vivo half-life.

二重特異性抗体は、二価または二重特異性としてよい２つの抗原−結合部位を有する抗体フラグメントである。例えば、ＥＰ ４０４，０９７；ＷＯ １９９３／０１１６１；Ｈｕｄｓｏｎら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８（１９９３）を参照。三量体及び四量体は、また、Ｈｕｄｓｏｎら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）に記載されている。   Bispecific antibodies are antibody fragments that have two antigen-binding sites that can be bivalent or bispecific. See, for example, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9: 129-134 (2003); and Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). Trimers and tetramers are also described in Hudson et al., Nat. Med. 9: 129-134 (2003).

単一−ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全部もしくは一部または軽鎖可変ドメインの全部もしくは一部を含む抗体フラグメントである。特定の実施形態では、単一−ドメイン抗体が、ヒト単一−ドメイン抗体（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ；例えば、米国特許第６，２４８，５１６ Ｂ１号を参照）である。   Single-domain antibodies are antibody fragments that contain all or part of an antibody heavy chain variable domain or all or part of a light chain variable domain. In certain embodiments, the single-domain antibody is a human single-domain antibody (Domantis, Inc., Waltham, MA; see, eg, US Pat. No. 6,248,516 B1).

抗体フラグメントは、本明細書に記載したとおり、これらに限定されないが、インタクト抗体の蛋白分解ならびに遺伝子組み換え宿主細胞（例えば、大腸菌またはファージ）による生成を含むさまざまな技術によって生成することができる。   Antibody fragments can be produced by a variety of techniques, including, but not limited to, proteolysis of intact antibodies as well as production by genetically modified host cells (eg, E. coli or phage), as described herein.

３．キメラ及びヒト化抗体
特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体が、キメラ抗体である。特定のキメラ抗体が、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；及びＭｏｒｒｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６８５１−６８５５（１９８４））に記載されている。１つの例では、キメラ抗体が、非ヒト可変領域（例えば、可変領域に由来するマウス、ラット、ハムスター、ウサギ、または非ヒト霊長動物、例えば、サル）及びヒト不変領域を含む。さらに１つの例では、キメラ抗体が、クラスまたはサブクラスが、親抗体のクラスまたはサブクラスから変化した「クラス変換」抗体である。キメラ抗体は、これらの抗原−結合フラグメントを含む。 3. Chimeric and humanized antibodies In certain embodiments, the antibodies provided herein are chimeric antibodies. Certain chimeric antibodies are described, for example, in US Pat. No. 4,816,567; and Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)). In one example, a chimeric antibody comprises a non-human variable region (eg, a mouse, rat, hamster, rabbit, or non-human primate such as a monkey derived from the variable region) and a human constant region. In yet another example, a chimeric antibody is a “class changed” antibody whose class or subclass has changed from the class or subclass of the parent antibody. Chimeric antibodies comprise these antigen-binding fragments.

特定の実施形態では、キメラ抗体が、ヒト化抗体である。通常、非ヒト抗体は、ヒト化され、ヒトまで免疫原性を低下させるが、親の非ヒト抗体の特異性及び親和性を保持する。一般に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えば、ＣＤＲ（またはこれらの一部）が非ヒト抗体に由来し、ＦＲ（またはこれらの一部）がヒト抗体配列に由来する１つ以上の可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、任意で、また、ヒト不変領域の少なくとも一部を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体のいくつかのＦＲ残基が、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基に由来する抗体）からの対応する残基で置換され、例えば、抗体特異性または親和性を回復させる、または改善する。   In certain embodiments, the chimeric antibody is a humanized antibody. Usually, non-human antibodies are humanized and reduce immunogenicity to humans, but retain the specificity and affinity of the parent non-human antibody. In general, a humanized antibody comprises one or more variable domains in which an HVR, eg, CDR (or portion thereof) is derived from a non-human antibody and FR (or portion thereof) is derived from a human antibody sequence. . A humanized antibody is optional and includes at least a portion of a human constant region. In some embodiments, some FR residues of the humanized antibody are replaced with corresponding residues from a non-human antibody (eg, an antibody derived from an HVR residue), eg, antibody specificity or affinity Restore or improve sex.

ヒト化抗体及びその生成方法が、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−１６３３（２００８）に再検討されており、さらに例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ３３２：３２３−３２９（１９８８）；Ｑｕｅｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：１００２９−１００３３（１９８９）；米国特許第５，８２１，３３７号，７，５２７，７９１号，６，９８２，３２１号、及び７，０８７，４０９号Ｋａｓｈｍｉｒｉら，Ｍｅｔｈｏｄｓ３６：２５−３４（２００５）（ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）グラフティングを記載している）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９−４９８（１９９１）（「表面再建」を記載している）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら，Ｍｅｔｈｏｄｓ３６：４３−６０（２００５）（「ＦＲシャッフリング」を記載している）；及びＯｓｂｏｕｒｎら，Ｍｅｔｈｏｄｓ３６：６１−６８（２００５）及びＫｌｉｍｋａら，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３：２５２−２６０（２０００）（ＦＲシャッフリングへの「ｇｕｉｄｅｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ」アプローチを記載している）に記載されている。   Humanized antibodies and methods for producing them are described in, for example, Almagro and Francesson, Front. Biosci. 13: 1619-1633 (2008) and are further reviewed in, for example, Riechmann et al., Nature 332: 323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'lAcad. Sci. USA 86: 10029-10033 (1989); US Pat. Nos. 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321, and 7,087,409 Kashmiri et al., Methods 36: 25-34 (2005). ) (Describing SDR (a-CDR) grafting); Padlan, Mol. Immunol. 28: 489-498 (1991) (describing “surface reconstruction”); Dall'Acqua et al., Methods 36: 43-60 (2005) (describing “FR shuffling”); and Osbourn et al., Methods 36 : 61-68 (2005) and Klimka et al., Br. J. et al. Cancer, 83: 252-260 (2000), which describes a “guided selection” approach to FR shuffling.

ヒト化に用いてよいヒトフレームワーク領域としては、「最良適合」法（例えば、ＳｉｍｓらＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）を参照）を用いて選択されるフレームワーク領域；軽鎖または重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、ＣａｒｔｅｒらＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）；及びＰｒｅｓｔａらＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３）を参照）；ヒト成熟（体細胞性変異）フレームワーク領域またはヒト生殖細胞系フレームワーク領域（例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−１６３３（２００８）を参照，）；及びスクリーニングＦＲライブラリー（例えば、Ｂａｃａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８−１０６８４（１９９７）及びＲｏｓｏｋら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２６１１−２２６１８（１９９６）を参照）に由来するフレームワーク領域が挙げられるが、これらに限定されない。   Human framework regions that may be used for humanization include framework regions selected using the “best fit” method (see, eg, Sims et al. J. Immunol. 151: 2296 (1993)); Framework regions derived from consensus sequences of human antibodies of a particular subgroup of chain variable regions (see, eg, Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285 (1992); and Presta et al., J. Immunol., 151: 2623 (1993)); see human maturation (somatic mutation) framework region or human germline framework region (see, eg, Almagro and Francesson, Front. Biosci. 13: 1619-1633 (2008)). ,); And script Frameworks from the ning FR libraries (see, eg, Baca et al., J. Biol. Chem. 272: 10678-10684 (1997) and Rosok et al., J. Biol. Chem. 271: 22611-22618 (1996)) Examples include, but are not limited to areas.

４．ヒト抗体
特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体が、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野で知られるさまざまな技術を用いて生成することができる。ヒト抗体は、一般に、ｖａｎ Ｄｉｊｋ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：３６８−７４（２００１）及びＬｏｎｂｅｒｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４５０−４５９（２００８）に記載されている。 4). Human Antibodies In certain embodiments, the antibodies provided herein are human antibodies. Human antibodies can be generated using various techniques known in the art. Human antibodies are generally described in van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) and Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20: 450-459 (2008).

ヒト抗体は、修飾され、抗原チャレンジに反応してヒト可変領域でインタクトヒト抗体またはインタクト抗体を生成するトランスジェニック動物に、免疫原を投与することによって調製してよい。かかる動物は、通常、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置換する、または染色体外に存在する、またはランダムに動物の染色体に統合されるヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含有する。かかるトランスジェニックマウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座が、一般に不活性化される。トランスジェニック動物からヒト抗体を得る方法の再検討では、Ｌｏｎｂｅｒｇ、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１１１７−１１２５（２００５）を参照。また、例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術を記載している米国特許第６，０７５，１８１号及び６，１５０，５８４号；ＨｕＭａｂ（登録商標）技術を記載している米国特許第５，７７０，４２９号；Ｋ−Ｍ ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載している米国特許第７，０４１，８７０号、及びＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）技術を記載している米国特許出願公開第２００７／００６１９００号）を参照。かかる動物によって生成されるインタクト抗体からのヒト可変領域は、例えば、異なるヒト不変領域と結合することによってさらに修飾してよい。   Human antibodies may be prepared by administering the immunogen to a transgenic animal that has been modified to produce intact human antibodies or intact antibodies in the human variable region in response to an antigen challenge. Such animals usually contain all or part of a human immunoglobulin locus that replaces an endogenous immunoglobulin locus, or is extrachromosomal or randomly integrated into the animal's chromosome. In such transgenic mice, the endogenous immunoglobulin locus is generally inactivated. In a review of methods for obtaining human antibodies from transgenic animals, see Lonberg, Nat. Biotech. 23: 1117-1125 (2005). Also, for example, US Pat. Nos. 6,075,181 and 6,150,584 describing XENOMOUSE ™ technology; US Pat. No. 5,770,429 describing HuMab® technology. No .; U.S. Pat. No. 7,041,870 describing KM MOUSE® technology and U.S. Patent Application Publication No. 2007/0061900 describing VelociMouse® technology). . Human variable regions from intact antibodies produced by such animals may be further modified, for example, by combining with different human constant regions.

ヒト抗体は、また、ハイブリドーマに基づく方法によって生成することができる。ヒト単クローン性抗体の生成のためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株が、記載されている。（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）；及びＢｏｅｒｎｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６（１９９１）を参照）。ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ技術によって生成されるヒト抗体が、また、Ｌｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０３：３５５７−３５６２（２００６）に記載されている。さらに、方法としては、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞株からの単クローン性ヒトＩｇＭ抗体の生成を記載している）及びＮｉ、Ｘｉａｎｄａｉ Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ、２６（４）：２６５−２６８（２００６）（ヒト−ヒトハイブリドーマを記載している）に記載されたものが挙げられる。ヒトハイブリドーマ技術（Ｔｒｉｏｍａ技術）が、また、Ｖｏｌｌｍｅｒｓ ａｎｄ Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０（３）：９２７−９３７（２００５）及び Ｖｏｌｌｍｅｒｓ ａｎｄ Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２７（３）：１８５−９１（２００５）に記載されている。   Human antibodies can also be generated by hybridoma-based methods. Human myeloma and mouse-human heteromyeloma cell lines for the production of human monoclonal antibodies have been described. (See, for example, Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Deker, Inc., and Y); , 147: 86 (1991)). Human antibodies produced by human B-cell hybridoma technology are also described in Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103: 3557-3562 (2006). Further methods include, for example, US Pat. No. 7,189,826 (which describes the production of monoclonal human IgM antibodies from hybridoma cell lines) and Ni, Xiandai Mianix, 26 (4): 265- 268 (2006) (which describes human-human hybridomas). Human hybridoma technology (Trioma technology) is also described in Volmmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20 (3): 927-937 (2005) and Vollmers and Brandinin, Methods and Findings. -91 (2005).

ヒト抗体は、また、ヒト−由来ファージディスプレイライブラリーから選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列を分離することによって生成してよい。かかる可変ドメイン配列は、その後、所望のヒト定常ドメインと結合してよい。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択する技術が、以下に記載されている。   Human antibodies may also be generated by isolating Fv clone variable domain sequences selected from a human-derived phage display library. Such variable domain sequences may then be combined with the desired human constant domain. Techniques for selecting human antibodies from antibody libraries are described below.

５．ライブラリー由来抗体
本発明の抗体は、所望の活性または活性を有する抗体の組合せライブラリーをスクリーニングすることによって分離してよい。例えば、ファージディスプレイライブラリーを生成し、所望の結合特性を有する抗体のかかるライブラリーをスクリーニングするためのさまざまな方法が、当技術分野で知られている。かかる方法は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍらｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８：１−３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎら，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００１）に再検討されており、さらに、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５４；Ｃｌａｃｋｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８（１９９１）；Ｍａｒｋｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９２）；Ｍａｒｋｓ ａｎｄ Ｂｒａｄｂｕｒｙ、ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２４８：１６１−１７５（Ｌｏ、ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３）；Ｓｉｄｈｕら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９−３１０（２００４）；Ｌｅｅら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３−１０９３（２００４）；Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１（３４）：１２４６７−１２４７２（２００４）；及びＬｅｅら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８４（１−２）：１１９−１３２（２００４）に記載されている。 5. Library-derived antibodies The antibodies of the invention may be isolated by screening a combinatorial library of antibodies having the desired activity or activity. For example, various methods are known in the art for generating phage display libraries and screening such libraries of antibodies with the desired binding properties. Such methods have been reviewed, for example, by Hoogenboom et al. In Methods in Molecular Biology 178: 1-37 (O'Brien et al., Ed., Human press, Totowa, NJ, 2001), and further, for example, McCafferty et al., Nature 348: 552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Biol. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248: 161-175 (Lo, ed., Human press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Biol. Mol. Biol. 338 (2): 299-310 (2004); Lee et al., J. MoI. Mol. Biol. 340 (5): 1073-1993 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (34): 12467-12472 (2004); and Lee et al., J. Biol. Immunol. Methods 284 (1-2): 119-132 (2004).

特定のファージディスプレイ方法では、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって別々にクローンされ、ファージライブラリーにランダムに再結合され、その後、Ｗｉｎｔｅｒら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：４３３−４５５（１９９４）に記載されたとおり、抗原−結合ファージのためにスクリーニングすることができる。ファージは、通常、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメント、またはＦａｂフラグメントとして抗体フラグメントを提示する。免疫化ソースからのライブラリーは、ハイブリドーマを構成する必要がなく、免疫原に高−親和性抗体をもたらす。代わりに、ナイーブレパートリーを（例えば、ヒトから）クローンし、広範囲の非自己に抗体の単一ソースをもたらすことができ、また、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら，ＥＭＢＯ Ｊ、１２：７２５−７３４（１９９３）によって記載されたとおり、免疫処置なしで自己抗原をもたらすことができる。最終的に、ナイーブライブラリーは、また、幹細胞からの非再配列Ｖ−遺伝子セグメントをクローニングすることによって、及びランダム配列を含有するＰＣＲプライマーを用いて合成的に生成し、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ、Ｊ．ＭｏｌＢｉｏｌ、２２７：３８１−３８８（１９９２）によって記載されたとおり、高可変ＣＤＲ３領域をコードし、ｉｎ ｖｉｔｒｏで再配列することができる。ヒト抗体ファージライブラリーを記載している特許公開としては、例えば、米国特許第５，７５０，３７３号、及び米国特許公開第２００５／００７９５７４号、２００５／０１１９４５５号、２００５／０２６６０００号、２００７／０１１７１２６号、２００７／０１６０５９８号、２００７／０２３７７６４号、２００７／０２９２９３６号、及び２００９／０００２３６０号が挙げられる。   In certain phage display methods, repertoires of VH and VL genes are cloned separately by polymerase chain reaction (PCR) and randomly recombined into a phage library, after which Winter et al., Ann. Rev. Immunol. 12: 433-455 (1994) can be screened for antigen-binding phage. Phages typically display antibody fragments as single chain Fv (scFv) fragments or Fab fragments. Libraries from immunization sources do not need to constitute hybridomas, resulting in high-affinity antibodies to the immunogen. Alternatively, naïve repertoires can be cloned (eg, from humans) to provide a single source of antibodies to a wide range of non-self and are described by Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993) As can be seen, self-antigens can be generated without immunization. Finally, a naïve library was also generated synthetically by cloning non-rearranged V-gene segments from stem cells and using PCR primers containing random sequences, as described in Hoogenboom and Winter, J. Am. The highly variable CDR3 region can be encoded and rearranged in vitro as described by MolBiol, 227: 381-388 (1992). Patent publications describing human antibody phage libraries include, for example, US Pat. No. 5,750,373 and US Patent Publication Nos. 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126. No., 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936, and 2009/0002360.

ヒト抗体ライブラリーから分離される抗体または抗体フラグメントが、本明細書のヒト抗体またはヒト抗体フラグメントと考えられる。   Antibodies or antibody fragments that are separated from a human antibody library are considered human antibodies or human antibody fragments herein.

６．多重特異性抗体
特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体が、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる部位の結合特異性を有する単クローン性抗体である。特定の実施形態では、結合特異性の一方が、ＧＰＣ３の結合特異性であり、他方が、他の抗原の結合特異性である。特定の実施形態では、結合特異性の一方が、ＧＰＣ３の結合特異性であり、他方が、ＣＤ３の結合特異性である。例えば、米国特許第５，８２１，３３７号を参照。特定の実施形態では、二重特異性抗体が、ＧＰＣ３の２つの異なるエピトープに結合してよい。二重特異性抗体は、また、ＧＰＣ３を発現する細胞に対して細胞毒性薬剤を局在化させるために用いてよい。二重特異性抗体は、完全長抗体または抗体フラグメントとして調製することができる。 6). Multispecific antibodies In certain embodiments, the antibodies provided herein are multispecific antibodies, eg, bispecific antibodies. Multispecific antibodies are monoclonal antibodies that have binding specificities for at least two different sites. In certain embodiments, one of the binding specificities is the binding specificity of GPC3 and the other is the binding specificity of another antigen. In certain embodiments, one of the binding specificities is the binding specificity of GPC3 and the other is the binding specificity of CD3. See, for example, US Pat. No. 5,821,337. In certain embodiments, bispecific antibodies may bind to two different epitopes of GPC3. Bispecific antibodies may also be used to localize cytotoxic agents to cells that express GPC3. Bispecific antibodies can be prepared as full length antibodies or antibody fragments.

多重特異性抗体を生成する技術としては、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の遺伝子組み換え共発現（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｕｅｌｌｏ、Ｎａｔｕｒｅ３０５：５３７（１９８３）、ＷＯ９３／０８８２９、及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら，ＥＭＢＯＪ．１０：３６５５（１９９１）を参照）、及び「ノブ−イン−ホール」エンジニアリング（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号を参照）が挙げられるが、これらに限定されない。多重特異性抗体は、また、抗体Ｆｃ−ヘテロ二量体分子を生成するための静電ステアリング効果をエンジニアリングすること（ＷＯ２００９／０８９００４Ａ１）；２つ以上の抗体またはフラグメントを架橋すること（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号、及びＢｒｅｎｎａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９：８１（１９８５）を参照）；二重特異性抗体を生成するためにロイシンジッパーを用いて（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）を参照）；二重特異性抗体フラグメントを生成するための「二重特異性抗体」技術を用いて（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：６４４４−６４４８（１９９３）を参照）；及び単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体（例えば、Ｇｒｕｂｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）を参照）を用いて；及び、例えば、ＴｕｔｔらＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）に記載されたとおり、三重特異性抗体を調製することによって生成してよい。   Techniques for generating multispecific antibodies include recombinant co-expression of two immunoglobulin heavy chain-light chain pairs with different specificities (Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983), WO 93/08829, and Traunecker et al. , EMBO J. 10: 3655 (1991)), and “knob-in-hole” engineering (see, eg, US Pat. No. 5,731,168). Multispecific antibodies can also engineer electrostatic steering effects to generate antibody Fc-heterodimeric molecules (WO2009 / 089004A1); cross-link two or more antibodies or fragments (eg, US No. 4,676,980 and Brennan et al., Science, 229: 81 (1985); using leucine zippers to generate bispecific antibodies (see, eg, Koselny et al., J. Immunol. , 148 (5): 1547-1553 (1992)); using “bispecific antibody” technology to generate bispecific antibody fragments (see, eg, Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)); Single-chain Fv (sFv) dimers: with (e.g., Gruber et al., J. Immunol, 152. 5368 (see 1994)); and, for example, Tutt et al J. Immunol. 147: 60 (1991) may be generated by preparing trispecific antibodies.

また、「オクトパス抗体」を含む３つ以上の機能的抗原結合部位を有するエンジニアリングされた抗体が、本明細書に含まれる（例えば、ＵＳ２００６／００２５５７６Ａ１を参照）。   Also included herein are engineered antibodies having three or more functional antigen binding sites, including “Octopus antibodies” (see, eg, US2006 / 0025576A1).

本明細書の抗体またはフラグメントは、また、ＧＰＣ３ならびにもう１つの異なる抗原ＧＰＣ３（例えば、ＵＳ２００８／００６９８２０を参照）に結合する抗原結合部位を含む「二重作用ＦＡｂ」または「ＤＡＦ」を含む。   The antibody or fragment herein also includes a “dual action FAb” or “DAF” that includes an antigen binding site that binds GPC3 as well as another different antigen GPC3 (see, eg, US2008 / 0069820).

７．抗体変異体
特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体のアミノ酸配列変異体が、検討されている。例えば、抗体の結合親和性及び／または他の生物学的特性を改善することが好ましいものとしてよい。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に好適な修飾を導入することによって、またはペプチド合成によって調製してよい。かかる修飾としては、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失及び／または挿入及び／または置換が挙げられる。最終構成が、所望の特性、例えば、抗原−結合を有するという条件で、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせを生成して、最終構成に達することができる。 7). Antibody Variants In certain embodiments, amino acid sequence variants of the antibodies provided herein are contemplated. For example, it may be preferable to improve the binding affinity and / or other biological properties of the antibody. Amino acid sequence variants of the antibody may be prepared by introducing suitable modifications to the nucleotide sequence encoding the antibody, or by peptide synthesis. Such modifications include, for example, deletion and / or insertion and / or substitution of residues within the amino acid sequence of the antibody. Any combination of deletions, insertions, and substitutions can be generated to arrive at the final configuration, provided that the final configuration has the desired properties, eg, antigen-binding.

ａ）置換、挿入、及び欠失変異体
特定の実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換型突然変異生成の対象の部位としては、ＨＶＲ及びＦＲが挙げられる。表１の「好ましい置換」の項目名の下に、保存的置換を示している。表１の「例示的置換」の項目名の下に、より実質的な変化を提供しており、アミノ酸側鎖クラスに関してさらに以下に記載している。対象の抗体にアミノ酸置換を導入してよく、所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の低下、またはＡＤＣＣまたはＣＤＣの改善のために生成物をスクリーニングしてよい。
表１
a) Substitution, insertion and deletion variants In certain embodiments, antibody variants having one or more amino acid substitutions are provided. Examples of sites for substitutional mutagenesis include HVR and FR. Conservative substitutions are shown under the item “preferred substitutions” in Table 1. More substantial changes are provided under the “Exemplary Substitution” entry name in Table 1 and are further described below with respect to amino acid side chain classes. Amino acid substitutions may be introduced into the subject antibodies and the product may be screened for desired activity, eg, retention / improvement of antigen binding, reduced immunogenicity, or improvement of ADCC or CDC.
Table 1

非保存的置換では、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスと交換する。   Non-conservative substitutions replace one member of these classes with another class.

置換型変異体の１つの型は、親抗体（例えば、ヒト化またはヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基を置換することを必要とする。一般に、さらに試験のために選択される得られた変異体（単数及び複数）は、親抗体と比較して特定の生物学的特性の修飾（例えば、改善）（例えば、親和性の増大、免疫原性の低下）を有する、及び／または親抗体の特定の生物学的特性を実質的に保持している。例示的置換型変異体は、例えば、ファージディスプレイに基づく親和性成熟技術、例えば、本明細書に記載したものを用いて、都合良く生成することができる親和性成熟抗体である。簡潔にいうと、１つ以上のＨＶＲ残基が変異され、変異体抗体が、ファージ上に提示され、特定の生物活性（例えば、結合親和性）のためにスクリーニングされる。   One type of substitutional variant involves substituting one or more hypervariable region residues of a parent antibody (eg, a humanized or human antibody). In general, the resulting variant (s) selected for further testing is subject to modification (eg, improvement) of specific biological properties (eg, increased affinity, immunity) compared to the parent antibody. Have a reduced originality) and / or substantially retain certain biological properties of the parent antibody. Exemplary substitutional variants are affinity matured antibodies that can be conveniently generated, for example, using affinity display techniques based on phage display, such as those described herein. Briefly, one or more HVR residues are mutated and mutant antibodies are displayed on phage and screened for specific biological activity (eg, binding affinity).

例えば、抗体親和性を改善するために、ＨＶＲ中で変性（例えば、置換）を行ってよい。ＨＶＲ「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟プロセス中に高頻度で変異されるコドンによってコードされる残基（例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０７：１７９−１９６（２００８）を参照）、及び／またはＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）中で、かかる変性を行ってよく、結果として生じる変異体ＶＨまたはＶＬが、結合親和性について試験される。二次ライブラリーを構築し、それから再選択することによる親和性成熟が、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍらｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ１７８：１−３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎら，ｅｄ．，ＨｕｍａｎＰｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，（２００１））に記載されている。親和性成熟のいくつかの実施形態では、多様性が、さまざまな方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリング、またはオリゴヌクレオチド指向性突然変異生成）のいずれかによって成熟のために選択された可変遺伝子中に導入される。その後、二次ライブラリーが、作製される。ライブラリーは、その後、所望の親和性を有する任意の抗体変異体を特定するためにスクリーニングされる。多様性を導入するためのもう１つの方法は、いくつかのＨＶＲ残基（例えば、１回に４〜６残基）が無作為化されるＨＶＲ指向性アプローチを含む。特に、例えば、アラニンキャニング突然変異生成またはモデリングを用いて、抗原結合に関与する残基を特定してよい。特にＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３が、標的とされることが多い。   For example, denaturation (eg, substitution) may be performed in HVR to improve antibody affinity. HVR “hot spots”, ie, residues encoded by codons that are frequently mutated during the somatic maturation process (see, eg, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207: 179-196 (2008)), and Such denaturation may be performed in / or SDR (a-CDR) and the resulting mutant VH or VL is tested for binding affinity. Affinity maturation by constructing and then reselecting a secondary library is described, for example, by Hoogenboom et al. In Methods in Molecular Biology 178: 1-37 (O'Brien et al., Ed., HumanPress, Toyota, NJ, (2001) )It is described in. In some embodiments of affinity maturation, variable genes whose diversity has been selected for maturation by any of a variety of methods (eg, error-prone PCR, strand shuffling, or oligonucleotide-directed mutagenesis). Introduced in. A secondary library is then created. The library is then screened to identify any antibody variants that have the desired affinity. Another method for introducing diversity involves an HVR-directed approach where several HVR residues (eg, 4-6 residues at a time) are randomized. In particular, for example, alanine canning mutagenesis or modeling may be used to identify residues involved in antigen binding. In particular, CDR-H3 and CDR-L3 are often targeted.

特定の実施形態では、かかる変性が実質的に抗原を結合する抗体の能力を低下させない限り、置換、挿入、または欠失が、１つ以上のＨＶＲ内で生じてよい。例えば、実質的に結合親和性を低下させない保存的変性（例えば、本明細書に提供されるとおり、保存的置換）をＨＶＲ中で行ってよい。かかる変性は、ＨＶＲ「ホットスポット」またはＳＤＲの外側としてよい。前記に提供した変異体ＶＨ及びＶＬ配列の特定の実施形態では、各ＨＶＲが変化しない、または１つ、２つまたは３つのアミノ酸置換だけを含有する。   In certain embodiments, substitutions, insertions, or deletions may occur within one or more HVRs as long as such denaturation does not substantially reduce the antibody's ability to bind antigen. For example, conservative modifications (eg, conservative substitutions as provided herein) that do not substantially reduce binding affinity may be performed in HVR. Such denaturation may be outside the HVR “hot spot” or SDR. In certain embodiments of the variant VH and VL sequences provided above, each HVR is unchanged or contains only one, two or three amino acid substitutions.

突然変異生成を標的とすることができる抗体の残基または領域の特定の有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５に記載されたとおり、「アラニンキャニング突然変異生成」と称されている。この方法では、抗体の抗原との相互作用が影響を受けているかどうかを測定するために、標的残基（例えば、荷電残基、例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、及びｇｌｕ）の残基または基が、特定され、中性または陰性荷電アミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）によって置換される。最初の置換に対して機能的感受性を示すアミノ酸位置に、さらに置換を導入してよい。代わりに、または追加で、抗体及び抗原間の接触点を特定するために、抗原−抗体複合体の結晶構造が用いられる。置換の候補として、かかる接触残基及び隣接残基を標的としてよい、または除外してよい。変異体をスクリーニングして所望の特性を含有するかどうかを決定してよい。   Particular useful methods of antibody residues or regions that can target mutagenesis are described in “Alanine Canning Mutagenesis” as described in Cunningham and Wells (1989) Science, 244: 1081-1085. It is called. In this method, residues of target residues (eg, charged residues such as arg, asp, his, lys, and glu) are used to determine whether the antibody's interaction with the antigen is affected. Or a group is identified and replaced by a neutral or negatively charged amino acid (eg alanine or polyalanine). Additional substitutions may be introduced at amino acid positions that are functionally sensitive to the first substitution. Alternatively or additionally, the crystal structure of the antigen-antibody complex is used to identify contact points between the antibody and antigen. Such contact residues and adjacent residues may be targeted or excluded as candidates for substitution. Variants may be screened to determine whether they contain the desired properties.

アミノ酸配列挿入は、長さが１つの残基から１００以上の残基を含有するポリペプチドまでの範囲のアミノ末端融合及び／またはカルボキシル末端融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例としては、Ｎ−末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入型変異体としては、抗体のＮ−末端またはＣ−末端の酵素（例えば、ＡＤＥＰＴ用）または抗体の血清半減期を増大させるポリペプチドへの融合が挙げられる。   Amino acid sequence insertions are amino-terminal and / or carboxyl-terminal fusions ranging in length from one residue to a polypeptide containing 100 or more residues, and intra-sequence insertions of single or multiple amino acid residues including. Examples of terminal insertions include antibodies having an N-terminal methionyl residue. Other insertional variants of the antibody molecule include an N-terminal or C-terminal enzyme of the antibody (eg, for ADEPT) or fusion to a polypeptide that increases the serum half-life of the antibody.

ｂ）グリコシル化変異体
特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増大または低下させるように変化される。抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、１つ以上のグリコシル化部位が、生成または除去されるようにアミノ酸配列を変化させることによって都合良く実施してよい。 b) Glycosylation variants In certain embodiments, the antibodies provided herein are altered to increase or decrease the extent to which the antibody is glycosylated. Addition or deletion of glycosylation sites to the antibody may be conveniently performed by altering the amino acid sequence such that one or more glycosylation sites are created or removed.

抗体がＦｃ領域を含む場合、それに結合される糖を変化させてよい。哺乳動物細胞によって生成される天然抗体は、通常、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７へのＮ−結合によって一般に結合する分枝二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔら ＴＩＢＴＥＣＨ １５：２６−３２（１９９７）を参照。オリゴ糖は、さまざまな糖、例えば、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、ならびに二分岐オリゴ糖構造の「幹」中のＧｌｃＮＡｃに結合するフコースを含んでよい。いくつかの実施形態では、本発明の抗体中のオリゴ糖の修飾は、特定の改善した特性を有する抗体変異体を生成するように行ってよい。   If the antibody contains an Fc region, the sugar attached to it may be altered. Natural antibodies produced by mammalian cells usually contain branched biantennary oligosaccharides that are generally linked by N-linkage to the Asn297 of the CH2 domain of the Fc region. See, for example, Wright et al. TIBTECH 15: 26-32 (1997). Oligosaccharides may include various sugars such as mannose, N-acetylglucosamine (GlcNAc), galactose, and sialic acid, and fucose that binds to GlcNAc in the “stem” of the biantennary oligosaccharide structure. In some embodiments, modification of oligosaccharides in the antibodies of the present invention may be performed to produce antibody variants with certain improved properties.

１つの実施形態では、Ｆｃ領域に結合（直接または間接）するフコースを欠く糖構造を有する抗体変異体が、提供される。例えば、かかる抗体中のフコースの量は、１％〜８０％、１％〜６５％、５％〜６５％または２０％〜４０％としてよい。フコースの量は、例えば、ＷＯ２００８／０７７５４６に記載されたとおり、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって測定されるとおり、Ａｓｎ２９７に結合する全糖構造（例えば、複合体、ハイブリッド及び高マンノース構造）の合計と比較して、Ａｓｎ２９７で糖鎖内のフコースの平均量を計算することによって、測定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域中の位置２９７あたりに位置するアスパラギン残基を指す（Ｆｃ領域残基のＥＵナンバリング）；しかし、Ａｓｎ２９７は、また、抗体中のマイナー配列変異により、位置２９７の±３アミノ酸上流または下流あたり、すなわち、位置２９４〜３００に位置してよい。かかるフコシル化変異体は、改善したＡＤＣＣ機能を有してよい。例えば、米国特許公開第２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ、Ｌ．）；米国特許第号２００４／００９３６２１（Ｋｙｏｗａ Ｈａｋｋｏ Ｋｏｇｙｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を参照。「非フコシル化」または「フコース−欠損」抗体変異体に関係した公開の例としては、米国特許第２００３／０１５７１０８号；ＷＯ２０００／６１７３９；ＷＯ２００１／２９２４６；米国特許第２００３／０１１５６１４号；米国特許第２００２／０１６４３２８号；米国特許第２００４／００９３６２１号；米国特許第２００４／０１３２１４０号；米国特許第２００４／０１１０７０４号；米国特許第２００４／０１１０２８２号；米国特許第２００４／０１０９８６５号；ＷＯ２００３／０８５１１９；ＷＯ２００３／０８４５７０；ＷＯ２００５／０３５５８６；ＷＯ２００５／０３５７７８；ＷＯ２００５／０５３７４２；ＷＯ２００２／０３１１４０；ＯｋａｚａｋｉらＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６：１２３９−１２４９（２００４）；Ｙａｍａｎｅ−ＯｈｎｕｋｉらＢｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）が挙げられる。非フコシル化抗体を生成することができる細胞株の例としては、タンパク質フコシル化のＬｅｃ１３ＣＨＯ細胞欠損（ＲｉｐｋａらＡｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３−５４５（１９８６）；米国特許出願第２００３／０１５７１０８Ａ１号、Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ；及びＷＯ２００４／０５６３１２Ａ１、Ａｄａｍｓら，特に実施例１１）、及びノックアウト細胞株、例えば、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Ｙａｍａｎｅ−ＯｈｎｕｋｉらＢｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）；Ｋａｎｄａ、Ｙ．ら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９４（４）：６８０−６８８（２００６）；及びＷＯ２００３／０８５１０７を参照）が挙げられる。   In one embodiment, antibody variants having a sugar structure that lacks fucose that binds (directly or indirectly) to the Fc region are provided. For example, the amount of fucose in such antibodies may be 1% -80%, 1% -65%, 5% -65% or 20% -40%. The amount of fucose is the sum of all sugar structures (eg, conjugates, hybrids and high mannose structures) bound to Asn297, as measured by MALDI-TOF mass spectrometry, for example as described in WO2008 / 077546. In comparison, Asn297 is measured by calculating the average amount of fucose in the sugar chain. Asn297 refers to the asparagine residue located around position 297 in the Fc region (EU numbering of Fc region residues); however, Asn297 is also ± 3 amino acids upstream of position 297 due to minor sequence variations in the antibody. Alternatively, it may be located downstream, i.e. at positions 294-300. Such fucosylated mutants may have improved ADCC function. See, for example, U.S. Patent Publication No. 2003/0157108 (Presta, L.); U.S. Patent No. 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.). Examples of publications related to “non-fucosylated” or “fucose-deficient” antibody variants include US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US Pat. US Patent No. 2004/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/0851119; WO 2003 WO2005 / 035586; WO2005 / 035778; WO2005 / 053742; WO2002 / 031140; Okazaki et al. Mol. Biol. 336: 1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Examples of cell lines capable of producing non-fucosylated antibodies include protein 13 fucosylated Lec13CHO cell deficiency (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249: 533-545 (1986); US Patent Application No. 2003 / 0157108A1. , Presta, L; and WO 2004 / 056312A1, Adams et al., In particular Example 11), and knockout cell lines such as the α-1,6-fucosyltransferase gene, FUT8, knockout CHO cells (see, eg, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng.87: 614 (2004); see Kanda, Y. et al., Biotechnol.Bioeng., 94 (4): 680-688 (2006); And the like.

さらに、例えば、抗体のＦｃ領域に結合する二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分される、二分オリゴ糖を有する抗体変異体が提供される。かかる抗体変異体は、フコシル化を低下させる、及び／またはＡＤＣＣ機能を改善させてしてよい。かかる抗体変異体の例は、例えば、ＷＯ２００３／０１１８７８（Ｊｅａｎ−Ｍａｉｒｅｔら）；米国特許第６，６０２，６８４号（Ｕｍａｎａら）；及び米国特許第２００５／０１２３５４６号（Ｕｍａｎａら）に記載されている。また、Ｆｃ領域に結合するオリゴ糖中に少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗体変異体が、提供される。かかる抗体変異体は、ＣＤＣ機能を改善してよい。かかる抗体変異体は、例えば、ＷＯ１９９７／３００８７（Ｐａｔｅｌら）；ＷＯ１９９８／５８９６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）；及びＷＯ１９９９／２２７６４（Ｒａｊｕ、Ｓ．）に記載されている。   Further provided are antibody variants with bisected oligosaccharides, for example, where the biantennary oligosaccharide that binds to the Fc region of the antibody is bisected by GlcNAc. Such antibody variants may reduce fucosylation and / or improve ADCC function. Examples of such antibody variants are described, for example, in WO2003 / 011878 (Jean-Mairet et al.); US Pat. No. 6,602,684 (Umana et al.); And US 2005/0123546 (Umana et al.). Yes. Also provided are antibody variants having at least one galactose residue in the oligosaccharide that binds to the Fc region. Such antibody variants may improve CDC function. Such antibody variants are described, for example, in WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); and WO 1999/22764 (Raju, S.).

ｃ）Ｆｃ領域変異体
特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体のＦｃ領域に１つ以上のアミノ酸修飾を導入し、これにより、Ｆｃ領域変異体を生成してよい。Ｆｃ領域変異体は、１つ以上のアミノ酸位置でのアミノ酸修飾（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４Ｆｃ領域）を含んでよい。 c) Fc region variants In certain embodiments, one or more amino acid modifications may be introduced into the Fc region of an antibody provided herein, thereby generating an Fc region variant. An Fc region variant may comprise a human Fc region sequence (eg, a human IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4 Fc region) that includes an amino acid modification (eg, substitution) at one or more amino acid positions.

特定の実施形態では、本発明が、いくつかのエフェクター機能を有するが、全エフェクター機能を有しない抗体変異体を意図し、これが、ｉｎ ｖｉｖｏでの抗体の半減期が、重要であるが、特定のエフェクター機能（例えば、補体及びＡＤＣＣ）は、不要または有害である用途の好ましい候補となる。ＣＤＣ及び／またはＡＤＣＣ活性の低下／除去を確認するために、Ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／またはｉｎ ｖｉｖｏ細胞傷害アッセイを実施することができる。抗体が、ＦｃγＲ結合を欠くが（したがって、ＡＤＣＣ活性を欠く可能性がある）、ＦｃＲｎ結合能力を保持することを確実にするために、例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを実施することができる。ＡＤＣＣを媒介するための初代細胞、ＮＫ細胞は、Ｆｃ（ＲＩＩＩだけを発現するが、単球は、Ｆｃ（ＲＩ、Ｆｃ（ＲＩＩ及びＦｃ（ＲＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−４９２（１９９１）の４６４ページの表３にまとめられている対象の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの非限定例が、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．らＰｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３：７０５９−７０６３（１９８６））及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：１４９９−１５０２（１９８５）を参照）；第５，８２１，３３７号（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１３５１−１３６１（１９８７）を参照）に記載されている代わりに、非放射性アッセイ法を用いてよい（例えば、フローサイトメトリーのためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ；及びＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞傷害アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を参照）。かかるアッセイのための有用なエフェクター細胞としては、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。代わりに、または追加で、ｉｎ ｖｉｖｏで、例えば、動物モデルで、対象の分子のＡＤＣＣ活性を評価してよく、例えば、ＣｌｙｎｅｓらＰｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：６５２−６５６（１９９８）に開示されている。また、抗体が、Ｃ１ｑを結合することができず、それゆえにＣＤＣ活性を欠くことを確認するためにＣ１ｑ結合アッセイを実施してよい。例えば、ＷＯ２００６／０２９８７９及びＷＯ２００５／１００４０２のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを実施してよい（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２０２：１６３（１９９６）；Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ら，Ｂｌｏｏｄ１０１：１０４５−１０５２（２００３）；及びＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ． ａｎｄ Ｍ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ１０３：２７３８−２７４３（２００４）を参照）。また、当技術分野で知られている方法を用いて、ＦｃＲｎ結合及びｉｎ ｖｉｖｏクリアランス／半減期測定を実施することができる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ら，Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９−１７６９（２００６）を参照）。   In certain embodiments, the present invention contemplates antibody variants that have some effector functions, but not all effector functions, where the in vivo antibody half-life is important, Effector functions (eg complement and ADCC) are good candidates for applications that are unwanted or harmful. In vitro and / or in vivo cytotoxicity assays can be performed to confirm the reduction / elimination of CDC and / or ADCC activity. To ensure that the antibody lacks FcγR binding (and thus may lack ADCC activity), but retains FcRn binding ability, for example, an Fc receptor (FcR) binding assay may be performed. it can. The primary cells for mediating ADCC, NK cells, express Fc (RIII only, whereas monocytes express Fc (RI, Fc (RII and Fc (RIII. FcR expression on hematopoietic cells is Ravetch and Kinet, Annu.Rev.Immunol.9: 457-492 (1991), page 464, Table 464, non-limiting examples of in vitro assays for assessing ADCC activity of molecules of interest are described in US 5,500,362 (eg, Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83: 7059-7063 (1986)) and Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82: 1499- 1502 (1985)); No. 5,821,33 (See, eg, Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166: 1351-1361 (1987)), non-radioactive assays may be used (eg, for flow cytometry ACTI ™ non-radioactive cytotoxicity assay (see CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; and CytoTox96® non-radioactive cytotoxicity assay (Promega, Madison, Wis.) Useful effector cells for such assays. May include peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and natural killer (NK) cells Alternatively or additionally, the ADCC activity of the molecule of interest may be assessed in vivo, eg, in an animal model. For example, Clyne Proc.Nat'lAcad.Sci.USA 95: 652-656 (1998), and C1q to confirm that the antibody is unable to bind C1q and therefore lacks CDC activity. Binding assays may be performed, see, for example, the C1q and C3c binding ELISAs of WO 2006/029879 and WO 2005/100402. To assess complement activation, CDC assays may be performed (eg, Gazzano-Santoro et al. J. Immunol. Methods 202: 163 (1996); Cragg, MS et al., Blood 101: 1045-1052 (2003); and Cragg, MS and M. J. Glennie, Blood 103: 2738-2743 (2004). ) Reference). Also, FcRn binding and in vivo clearance / half-life measurements can be performed using methods known in the art (see, eg, Petkova, SB et al., Int'l. Immunol. 18 ( 12): 1759-1769 (2006)).

エフェクター機能が低下した抗体が、１つ以上のＦｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９が置換されるものを含む（米国特許第６，７３７，０５６号）。かかるＦｃ変異体は、２つ以上のアミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７で置換されるＦｃ変異体を含み、残基２６５及び２９７がアラニンに置換されるいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体（米国特許第７，３３２，５８１号）を含む。   Antibodies with reduced effector function include those in which one or more Fc region residues 238, 265, 269, 270, 297, 327 and 329 are substituted (US Pat. No. 6,737,056). Such Fc variants include Fc variants substituted at two or more amino acid positions 265, 269, 270, 297 and 327, so-called “DANA” Fc variants in which residues 265 and 297 are replaced with alanine ( U.S. Pat. No. 7,332,581).

ＦｃＲへの結合が改善または低下した特定の抗体変異体が、記載されている（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号；ＷＯ２００４／０５６３１２、及びＳｈｉｅｌｄｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１−６６０４（２００１）を参照）。   Certain antibody variants with improved or reduced binding to FcR have been described (eg, US Pat. No. 6,737,056; WO 2004/056312, and Shields et al., J. Biol. Chem. 9 (2 ): 6591-6604 (2001)).

特定の実施形態では、抗体変異体が、ＡＤＣＣを改善する１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の位置２９８、３３３、及び／または３３４（残基のＥＵナンバリング）での置換を有するＦｃ領域を含む。   In certain embodiments, the antibody variant has one or more amino acid substitutions that improve ADCC, for example, substitutions at positions 298, 333, and / or 334 (EU numbering of residues) of the Fc region. including.

いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域で変化が行われ、その結果、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、ＷＯ９９／５１６４２、及びＩｄｕｓｏｇｉｅらＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８−４１８４（２０００）に記載されたとおり、Ｃ１ｑ結合及び／または補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）が変化（すなわち、改善または低下）する。   In some embodiments, changes are made in the Fc region, such as in US Pat. No. 6,194,551, WO 99/51642, and Idusogie et al. Immunol. 164: 4178-4184 (2000), which alters (ie, improves or decreases) C1q binding and / or complement dependent cytotoxicity (CDC).

半減期が増大し、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が改善した抗体は、母親のＩｇＧの胎児への輸送の原因となっており（Ｇｕｙｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）及びＫｉｍら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））、米国特許第２００５／００１４９３４Ａ１号（Ｈｉｎｔｏｎら）に記載されている。これらの抗体が、Ｆｃ領域のＦｃＲｎへの結合を改善する１つ以上の置換をその中に有するＦｃ領域を含む。かかるＦｃ変異体としては、１つ以上のＦｃ領域残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４または４３４で置換されるもの、例えば、Ｆｃ領域残基４３４の置換が挙げられる（米国特許第７，３７１，８２６号）。   Antibodies with increased half-life and improved binding to the neonatal Fc receptor (FcRn) are responsible for the transport of maternal IgG to the fetus (Guyer et al., J. Immunol. 117: 587 (1976)). And Kim et al., J. Immunol. 24: 249 (1994)), US 2005/0014934 A1 (Hinton et al.). These antibodies comprise an Fc region having one or more substitutions therein that improve binding of the Fc region to FcRn. Such Fc variants include one or more Fc region residues: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, Those substituted with 380, 382, 413, 424 or 434, for example, substitution of Fc region residue 434 (US Pat. No. 7,371,826).

また、Ｄｕｎｃａｎ＆Ｗｉｎｔｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ３２２：７３８−４０（１９８８）；米国特許第５，６４８，２６０号；米国特許第５，６２４，８２１号；及びＦｃ領域変異体．の他の例に関するＷＯ９４／２９３５１を参照。   Also, Duncan & Winter, Nature 322: 738-40 (1988); US Pat. No. 5,648,260; US Pat. No. 5,624,821; and Fc region variants. See WO94 / 29351 for other examples.

ｄ）システインエンジニアリング抗体変異体
特定の実施形態では、抗体の１つ以上の残基がシステイン残基で置換される、システインエンジニアリング抗体、例えば、「ｔｈｉｏＭＡｂｓ」を生成することが好ましいものとしてよい。特定の実施形態では、置換残基が、抗体の到達可能部位で生じる。システインでこれらの残基を置換することによって、これにより、反応性チオール基が抗体の到達可能部位に位置し、反応性チオール基を用いて、さらに本明細書に記載したとおり、抗体を他の部分、例えば、薬剤部分またはリンカー−薬剤部分に結合し、イムノコンジュゲートを生成してよい。特定の実施形態では、システインで以下の残基のうち１つ以上を置換してよい：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔナンバリング）；重鎖のＡ１１８（ＥＵナンバリング）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵナンバリング）。システインエンジニアリング抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載されるとおり、生成してよい。 d) Cysteine Engineering Antibody Variants In certain embodiments, it may be preferred to generate cysteine engineering antibodies, eg, “thioMAbs”, in which one or more residues of the antibody are replaced with cysteine residues. In certain embodiments, the substituted residue occurs at an accessible site of the antibody. By substituting these residues with cysteine, this places the reactive thiol group at an accessible site of the antibody, and the reactive thiol group can be used to further modify the antibody as described herein. A moiety, such as a drug moiety or a linker-drug moiety, may be attached to produce an immunoconjugate. In certain embodiments, one or more of the following residues may be substituted with cysteine: light chain V205 (Kabat numbering); heavy chain A118 (EU numbering); and heavy chain Fc region S400 (EU numbering). Cysteine engineering antibodies may be generated, for example, as described in US Pat. No. 7,521,541.

ｅ）抗体誘導体
特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体は、さらに修飾して、当技術分野で知られ、容易に入手可能な追加の非タンパク質部分を含有してよい。抗体の誘導体化に好適な部分は、水溶性ポリマーを含むが、これらに限定されない。水溶性ポリマーの非限定例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マイレン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマー）、及びデキストランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、プロリルプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、及びこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中のその安定性のため、製造での利点がある可能性がある。ポリマーは、任意の分子量としてよく、分枝鎖または非分枝鎖としてよい。１つ以上のポリマーが結合される場合、抗体に結合するポリマーの数は、変化させてよく、それらは、同じまたは異なる分子とすることができる。一般に、誘導体化に用いられるポリマーの数及び／または型は、これらに限定されないが、改善される抗体の特定の特性または機能、抗体誘導体が規定された条件下での治療に用いられるかどうかなどを含む、留意点に基づいて決定することができる。 e) Antibody Derivatives In certain embodiments, the antibodies provided herein may be further modified to contain additional non-protein moieties that are known in the art and readily available. Suitable moieties for antibody derivatization include, but are not limited to, water soluble polymers. Non-limiting examples of water-soluble polymers include polyethylene glycol (PEG), ethylene glycol / propylene glycol copolymer, carboxymethyl cellulose, dextran, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, poly-1,3-dioxolane, poly-1,3,6. -Trioxane, ethylene / maleic anhydride copolymer, polyamino acid (homopolymer or random copolymer), and dextran or poly (n-vinylpyrrolidone) polyethylene glycol, propylene glycol homopolymer, prolyl propylene oxide / ethylene oxide copolymer, polyoxyethyl Non-limiting polyols (eg, glycerol), polyvinyl alcohol, and mixtures thereof. Polyethylene glycol propionaldehyde may have manufacturing advantages due to its stability in water. The polymer may be of any molecular weight and may be branched or unbranched. If more than one polymer is attached, the number of polymers attached to the antibody may vary and they can be the same or different molecules. In general, the number and / or type of polymers used for derivatization are not limited to, but are specific properties or functions of the antibody to be improved, whether the antibody derivative is used for treatment under defined conditions, etc. It can be determined based on points to be noted including

もう１つの実施形態では、放射線への暴露によって選択的に加熱してよい抗体及び非タンパク質部分のコンジュゲートが提供される。１つの実施形態では、非タンパク質部分が、カーボンナノチューブである（Ｋａｍら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０２：１１６００−１１６０５（２００５））。放射線は、任意の波長としてよく、通常の細胞を害さないが、抗体−非タンパク質部分の近位の細胞が死ぬ温度まで非タンパク質部分を加熱する波長が挙げられるが、これらに限定されない。   In another embodiment, conjugates of antibodies and non-protein moieties that may be selectively heated by exposure to radiation are provided. In one embodiment, the non-protein moiety is a carbon nanotube (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). The radiation may be any wavelength and does not harm normal cells, but includes, but is not limited to, the wavelength that heats the non-protein portion to a temperature at which cells adjacent to the antibody-non-protein portion die.

Ｂ．遺伝子組換え方法及び組成物
例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されたとおり、遺伝子組換え方法及び組成物を用いて、抗体を生成してよい。１つの実施形態では、本明細書に記載の抗ＧＰＣ３抗体をコードする分離核酸が提供される。かかる核酸が、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び／またはＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／または重鎖）をコードしてよい。さらに１つの実施形態では、かかる核酸を含む１つ以上のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。さらに１つの実施形態では、かかる核酸を含む宿主細胞が提供される。１つのかかる実施形態では、宿主細胞が、（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１のベクター及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２のベクターを含む（例えば、これらで形質転換される）。１つの実施形態では、宿主細胞が、真核細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。１つの実施形態では、抗ＧＰＣ３抗体を生成する方法が提供される、当該方法が、前記に提供したとおり、抗体の発現に好適な条件下で、抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養すること、及び任意で宿主細胞（または宿主細胞培地）からの抗体を回復させることを含む。 B. Genetic Recombination Methods and Compositions Antibodies may be generated using genetic recombination methods and compositions, for example, as described in US Pat. No. 4,816,567. In one embodiment, an isolated nucleic acid encoding an anti-GPC3 antibody described herein is provided. Such a nucleic acid may encode an amino acid sequence comprising an antibody VL and / or an amino acid sequence comprising a VH (eg, an antibody light and / or heavy chain). In one further embodiment, one or more vectors (eg, expression vectors) comprising such nucleic acids are provided. In a further embodiment, host cells comprising such nucleic acids are provided. In one such embodiment, the host cell encodes a vector comprising (1) an amino acid sequence comprising an antibody VL and an amino acid sequence comprising an antibody VH, or (2) an amino acid sequence comprising an antibody VL. And a second vector containing a nucleic acid encoding an amino acid sequence containing the VH of the antibody (eg, transformed with them). In one embodiment, the host cell is a eukaryotic cell, eg, a Chinese hamster ovary (CHO) cell or a lymphoid cell (eg, Y0, NS0, Sp20 cell). In one embodiment, a method of producing an anti-GPC3 antibody is provided, which cultivates a host cell comprising a nucleic acid encoding the antibody under conditions suitable for expression of the antibody, as provided above. And optionally recovering the antibody from the host cell (or host cell medium).

抗ＧＰＣ３抗体の遺伝子組換え生成のために、例えば、前記に記載のとおり、抗体をコードする核酸を分離し、さらに宿主細胞中のクローニング及び／または発現のために、１つ以上のベクターに挿入する。かかる核酸直ちに分離してよく、従来の方法を用いて（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）、配列決定してよい。   For recombinant production of anti-GPC3 antibody, for example, as described above, the nucleic acid encoding the antibody is isolated and further inserted into one or more vectors for cloning and / or expression in a host cell. To do. Such nucleic acids may be isolated immediately and sequenced using conventional methods (eg, by using oligonucleotide probes that can specifically bind to the genes encoding the heavy and light chains of the antibody). Good.

抗体をコードするベクターのクローニングまたは発現に好適な宿主細胞としては、本明細書に記載の前核または真核細胞が挙げられる。例えば、特にグリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要でない場合、細菌中で抗体を生成してよい。細菌中の抗体フラグメント及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、５，７８９，１９９号、及び５，８４０，５２３号を参照（また、Ｅ．ｃｏｌｉ中の抗体フラグメントの発現を記載しているＣｈａｒｌｔｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，版，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３），ｐｐ．２４５−２５４を参照）。発現後に、可溶性フラクション中の細菌細胞ペーストから抗体を分離してよく、さらに精製することができる。   Suitable host cells for cloning or expressing the antibody-encoding vector include prokaryotic or eukaryotic cells as described herein. For example, antibodies may be generated in bacteria, particularly where glycosylation and Fc effector function are not required. For expression of antibody fragments and polypeptides in bacteria, see, eg, US Pat. Nos. 5,648,237, 5,789,199, and 5,840,523 (also see antibodies in E. coli). See Charleston, Methods in Molecular Biology, Vol. 248, which describes the expression of fragments (see BKK CC Lo, Edition, Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254). After expression, the antibody may be separated from the bacterial cell paste in the soluble fraction and can be further purified.

原核生物に加えて、真核微生物、例えば、糸状菌または酵母菌が、抗体をコードするベクターに好適なクローニングまたは発現宿主である。これは、グリコシル化経路が「ヒト化」されている真菌及び酵母菌株を含み、その結果、部分的または完全ヒトグリコシル化パターンを有する抗体が生成される。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２：１４０９−１４１４（２００４）、及びＬｉら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４：２１０−２１５（２００６）を参照。   In addition to prokaryotes, eukaryotic microbes such as filamentous fungi or yeast are suitable cloning or expression hosts for antibody-encoding vectors. This includes fungal and yeast strains in which the glycosylation pathway is “humanized”, resulting in the production of antibodies having a partial or fully human glycosylation pattern. Gerngross, Nat. Biotech. 22: 1409-1414 (2004), and Li et al., Nat. Biotech. 24: 210-215 (2006).

グリコシル化抗体の発現に好適な宿主細胞は、また、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）に由来する。無脊椎動物細胞の例としては、植物及び昆虫細胞が挙げられる。昆虫細胞とともに、特にスポドプテラフルギペルダ細胞のトランスフェクションに用いてよい多くのバキュロウイルス株が確認されている。   Suitable host cells for the expression of glycosylated antibody are also derived from multicellular organisms (invertebrates and vertebrates). Examples of invertebrate cells include plant and insect cells. A number of baculovirus strains have been identified that may be used in conjunction with insect cells, particularly for transfection of Spodoptera frugiperda cells.

また、宿主として、植物細胞培養を用いることができる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、６，０４０，４９８号、６，４２０，５４８号、７，１２５，９７８号、及び６，４１７，４２９号を参照（トランスジェニック植物中の抗体を生成するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術を記載している）。   Moreover, plant cell culture can be used as a host. See, for example, US Pat. Nos. 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978, and 6,417,429 (see antibodies in transgenic plants). Describes the PLATIBODIES ™ technology to generate).

また、宿主として、脊椎動物細胞を用いてもよい。例えば、懸濁成長に適合する哺乳動物細胞株が、有用である可能性がある。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例が、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系；ヒト胎児腎臓系（例えば、Ｇｒａｈａｍら，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７）に記載されたとおり、２９３または２９３細胞）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０）に記載されたとおり、ＴＭ４細胞）；サル腎臓細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリサル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）；例えば、Ｍａｔｈｅｒら，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２）に記載されたとおり、ＴＲＩ細胞；ＭＲＣ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：４２１６（１９８０））；及び骨髄腫細胞株、例えば、Ｙ０、ＮＳ０及びＳｐ２／０を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が挙げられる。抗体生成に好適な特定の哺乳動物宿主細胞株の再検討には、例えば、Ｙａｚａｋｉ ａｎｄ Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ），ｐｐ．２５５−２６８（２００３）を参照。 In addition, vertebrate cells may be used as the host. For example, mammalian cell lines that are compatible with suspension growth may be useful. Other examples of useful mammalian host cell lines are the monkey kidney CV1 system transformed by SV40 (COS-7); the human fetal kidney system (eg, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977) 293 or 293 cells); baby hamster kidney cells (BHK); mouse Sertoli cells (eg, TM4 cells, as described in Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); Monkey kidney cells (CV1); African green monkey kidney cells (VERO-76); human cervical cancer cells (HELA); canine kidney cells (MDCK; buffalo rat liver cells (BRL3A); human lung cells (W138); human liver Cells (Hep G2); mouse mammary tumors (MMT060562); eg, Ma Her et al., Annals NY Acad.Sci.383: 44-68 (1982), TRI cells; MRC5 cells; and FS4 cells Other useful mammalian host cell lines include: DHFR - CHO cells (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)); and myeloma cell lines such as Chinese hamster ovary (CHO) cells including Y0, NS0 and Sp2 / 0. For review of specific mammalian host cell lines suitable for antibody production, see, for example, Yasaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (BKC Lo, ed., Humana Press, Totowa). , NJ), pp. 255-268 (20 03).

Ｃ．アッセイ
当技術分野で知られている種々のアッセイによって、本明細書に提供される抗ＧＰＣ３抗体を、特定し、スクリーニングし、またはその物理／化学特性及び／または生物学的活性を特徴づけてよい。 C. Assays Various assays known in the art may identify, screen, or characterize the physical / chemical properties and / or biological activity of anti-GPC3 antibodies provided herein. .

１つの態様では、本発明の抗体が、例えば、公知の方法、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＢＩＡＣｏｒｅ（登録商標）、ＦＡＣＳ、またはウェスタンブロットによって、その抗原結合活性について試験される。   In one aspect, an antibody of the invention is tested for its antigen binding activity, for example, by known methods such as ELISA, BIACore®, FACS, or Western blot.

もう１つの態様では、競合アッセイを用いて、本明細書に記載の抗体のいずれかとＧＰＣ３への結合が競合する抗体を特定してよい。特定の実施形態では、かかる競合抗体が、本明細書に記載の抗体によって結合される同じエピトープ（例えば、直鎖または立体配座エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための例示的方法の詳細が、Ｍｏｒｒｉｓ（１９９６）「ＥｐｉｔｏｐｅＭａｐｐｉｎｇＰｒｏｔｏｃｏｌｓ，」ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．６６（ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）に提供されている。   In another aspect, a competition assay may be used to identify antibodies that compete for binding to GPC3 with any of the antibodies described herein. In certain embodiments, such competing antibodies bind to the same epitope (eg, a linear or conformational epitope) that is bound by the antibodies described herein. Details of exemplary methods for mapping epitopes to which antibodies bind are described in Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols,” in Methods in Molecular Biology vol. 66 (HumanaPress, Totowa, NJ).

例示的競合アッセイでは、ＧＰＣ３（例えば、本明細書に記載の抗体のいずれか）に結合する第１の標識抗体及びＧＰＣ３への結合が第１の抗体と競合するその能力を試験するための第２の未標識抗体を含む溶液中で、固定化されたＧＰＣ３をインキュベートする。第２の抗体は、ハイブリドーマ上澄み液中に存在してよい。対照として、第１の標識抗体を含むが、第２の未標識抗体を含まない溶液中で、固定化されたＧＰＣ３をインキュベートする。インキュベート後、第１の抗体のＧＰＣ３への結合を許容する条件下で、過剰非結合抗体を除去し、固定化されたＧＰＣ３に関係する標識の量を測定する。固定化されたＧＰＣ３に関係する標識の量が、対照試料と比較して、試験試料中で実質的に減少する場合、これは、第２の抗体が、ＧＰＣ３への結合が第１の抗体と競合していることを示唆している。Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ｃｈ．１４（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）を参照。   In an exemplary competition assay, a first labeled antibody that binds to GPC3 (eg, any of the antibodies described herein) and a first assay to test its ability to bind to GPC3 to compete with the first antibody. The immobilized GPC3 is incubated in a solution containing 2 unlabeled antibodies. The second antibody may be present in the hybridoma supernatant. As a control, the immobilized GPC3 is incubated in a solution containing the first labeled antibody but not the second unlabeled antibody. After incubation, excess unbound antibody is removed under conditions that allow binding of the first antibody to GPC3 and the amount of label associated with immobilized GPC3 is measured. If the amount of label associated with immobilized GPC3 is substantially reduced in the test sample compared to the control sample, this indicates that the second antibody is bound to GPC3 with the first antibody. Suggests that they are competing. Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch. 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).

Ｄ．イムノコンジュゲート
本発明また、１つ以上の細胞毒性薬剤、例えば、化学療法薬または薬剤、成長阻害剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、または動物由来の酵素的活性毒素、またはこれらのフラグメント）、または放射性同位体（すなわち、放射性コンジュゲート）に結合する本明細書の抗ＧＰＣ３抗体を含むイムノコンジュゲートを提供する。 D. Immunoconjugate The invention also includes one or more cytotoxic agents, such as chemotherapeutic agents or agents, growth inhibitors, toxins (eg, protein toxins, enzymatically active toxins from bacteria, fungi, plants, or animals, or These fragments), or immunoconjugates comprising the anti-GPC3 antibodies herein that bind to a radioisotope (ie, a radioconjugate) are provided.

イムノコンジュゲートにより、薬剤部分の腫瘍への標的デリバリーが可能になり、いくつかの実施形態では、その細胞内蓄積により、非結合薬剤の全身的投与の結果、正常細胞に対して許容できないレベルの毒性となる可能性がある（Ｐｏｌａｋｉｓ Ｐ．（２００５）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ５：３８２−３８７）。   The immunoconjugate allows targeted delivery of the drug moiety to the tumor, and in some embodiments its intracellular accumulation results in unacceptable levels for normal cells as a result of systemic administration of unbound drug. It can be toxic (Polakis P. (2005) Current Opinion in Pharmacology 5: 382-387).

抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）は、抗原−発現腫瘍細胞に強力な細胞毒性薬剤を標的とすることによって、抗体及び細胞毒性薬剤の両者の特性を組み合わせ（Ｔｅｉｃｈｅｒ，Ｂ．Ａ．（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ９：９８２−１００４）、これにより、有効性を最大化し、標的外毒性を最少化することによって治療指数が向上する標的化学療法分子である（Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．Ｊ．ａｎｄ ＳｅｎｔｅｒＰ．Ｄ．（２００８）Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｊｏｕｒ．１４（３）：１５４−１６９；Ｃｈａｒｉ，Ｒ．Ｖ．（２００８）Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．４１：９８−１０７）。   Antibody-drug conjugates (ADC) combine the properties of both antibodies and cytotoxic drugs by targeting potent cytotoxic drugs to antigen-expressing tumor cells (Teicher, BA (2009) Current). Cancer Drug Targets 9: 982-1004), which is a targeted chemotherapeutic molecule that improves the therapeutic index by maximizing efficacy and minimizing off-target toxicity (Carter, PJ and Senter P.D. (2008) The Cancer Jour. 14 (3): 154-169; Chari, RV (2008) Acc. Chem. Res. 41: 98-107).

本発明のＡＤＣ化合物は、抗癌性活性を有するものを含む。いくつかの実施形態では、ＡＤＣ化合物が、薬剤部分に結合された、すなわち共有結合された抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗体が、リンカーを介して薬剤部分に共有結合されている。本発明の抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）は、腫瘍組織へ有効用量の薬剤を選択的にデリバリーし、これにより、選択性が広がる、すなわち、治療指数（「治療窓」）を向上しながら、より少ない有効用量を実現することができる。   The ADC compound of the present invention includes those having anticancer activity. In some embodiments, the ADC compound comprises an antibody attached to the drug moiety, ie, covalently attached. In some embodiments, the antibody is covalently linked to the drug moiety via a linker. The antibody-drug conjugate (ADC) of the present invention selectively delivers an effective dose of drug to tumor tissue, thereby increasing selectivity, ie improving the therapeutic index (“therapeutic window”) while A smaller effective dose can be achieved.

抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）の薬剤部分（Ｄ）は、細胞毒性または細胞増殖抑制効果を有する任意の化合物、部分または基を含んでよい。薬剤部分が、これらに限定されないが、チューブリン結合、ＤＮＡ結合または挿入、及びＲＮＡポリメラーゼ、タンパク質合成、及び／またはトポイソメラーゼの抑制を含む機序により、その細胞毒性及び細胞増殖抑制効果を付与してよい。例示的薬剤部分としては、マイタンシノイド、カリケアミシン、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、ネモルビシン及びその誘導体、ＰＮＵ−１５９６８２、アントラサイクリン、デュオカルマイシン、ビンカアルカロイド、タキサン、トリコテセン、ＣＣ１０６５、カンプトテシン、エリナフィド、及び立体異性体、イソスター、類似体、及び細胞毒性活性を有するこれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。以下にさらに詳細にかかるイムノコンジュゲートの非限定例を記載する。   The drug moiety (D) of the antibody-drug conjugate (ADC) may comprise any compound, moiety or group that has a cytotoxic or cytostatic effect. The drug moiety imparts its cytotoxic and cytostatic effects by mechanisms including, but not limited to, tubulin binding, DNA binding or insertion, and RNA polymerase, protein synthesis, and / or topoisomerase suppression. Good. Exemplary drug moieties include maytansinoids, calicheamicins, pyrrolobenzodiazepines (PBD), nemorubicin and its derivatives, PNU-159682, anthracyclines, duocarmycins, vinca alkaloids, taxanes, trichothecenes, CC1065, camptothecins, elinafides, and steric Examples include, but are not limited to, isomers, isosteres, analogs, and derivatives thereof having cytotoxic activity. Non-limiting examples of such immunoconjugates are described in further detail below.

１．例示的抗体−薬剤コンジュゲート
抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）化合物の例示的実施形態が、腫瘍細胞を標的とする抗体（Ａｂ）、薬剤部分（Ｄ）、及びＡｂをＤに結合するリンカー部分（Ｌ）を含む。いくつかの実施形態では、抗体が、１つ以上のアミノ酸残基、例えば、リジン及び／またはシステインを介してリンカー部分（Ｌ）に結合される。 1. Exemplary Antibody-Drug Conjugate An exemplary embodiment of an antibody-drug conjugate (ADC) compound comprises an antibody (Ab) that targets tumor cells, a drug moiety (D), and a linker moiety that binds Ab to D ( L). In some embodiments, the antibody is attached to the linker moiety (L) via one or more amino acid residues, eg, lysine and / or cysteine.

例示的ＡＤＣが、式Ｉを有する。
Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｐ Ｉ
式中、ｐは、１〜約２０である。いくつかの実施形態では、抗体に結合することができる薬剤部分の数が、遊離システイン残基の数によって制限される。いくつかの実施形態では、遊離システイン残基が、本明細書に記載の方法によって抗体アミノ酸配列に導入される。式Ｉの例示的ＡＤＣとしては、１、２、３、または４個のエンジニアリングシステインアミノ酸を有する抗体が挙げられるが、これらに限定されない（Ｌｙｏｎ，Ｒ．ら（２０１２）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ．５０２：１２３−１３８）。いくつかの実施形態では、１つ以上の遊離システイン残基が、エンジニアリングを用いないで抗体中に既に存在しており、この場合、薬剤に抗体を結合するために既存の遊離システイン残基を用いてよい。いくつかの実施形態では、１つ以上の遊離システイン残基を生成するために抗体の結合前に、抗体を還元条件にさらす。 An exemplary ADC has the formula I:
Ab- (LD) p I
Where p is 1 to about 20. In some embodiments, the number of drug moieties that can bind to the antibody is limited by the number of free cysteine residues. In some embodiments, free cysteine residues are introduced into the antibody amino acid sequence by the methods described herein. Exemplary ADCs of Formula I include, but are not limited to, antibodies having 1, 2, 3, or 4 engineering cysteine amino acids (Lyon, R. et al. (2012) Methods in Enzym. 502: 123 -138). In some embodiments, one or more free cysteine residues are already present in the antibody without engineering, in which case the existing free cysteine residues are used to bind the antibody to the agent. It's okay. In some embodiments, the antibody is subjected to reducing conditions prior to antibody binding to produce one or more free cysteine residues.

ａ）例示的リンカー
「リンカー」（Ｌ）は、抗体（Ａｂ）に１つ以上の薬剤部分（Ｄ）を結合して、式Ｉの抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）を形成するために用いることができる二官能性または多官能性部分である。いくつかの実施形態では、薬剤及び抗体に共有結合するための反応性官能基を有するリンカーを用いて抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）を調製することができる。例えば、いくつかの実施形態では、抗体（Ａｂ）のシステインチオールが、リンカーまたは薬剤−リンカー中間体の反応性官能基と結合を形成し、ＡＤＣを生成することができる。 a) Exemplary Linker A “linker” (L) is used to attach one or more drug moieties (D) to an antibody (Ab) to form an antibody-drug conjugate (ADC) of formula I. Is a difunctional or polyfunctional moiety. In some embodiments, an antibody-drug conjugate (ADC) can be prepared using a linker having a reactive functional group for covalent attachment to the drug and antibody. For example, in some embodiments, the cysteine thiol of an antibody (Ab) can form a bond with a reactive function of a linker or drug-linker intermediate to generate an ADC.

１つの態様では、リンカーが、共有結合を形成する抗体上に存在する遊離システインと反応することができる官能基を有する。かかる反応性官能基の非限定例としては、マレイミド、ハロアセトアミド、α−ハロアセチル、活性化エステル、例えば、スクシンイミドエステル、４−ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、テトラフルオロフェニルエステル、無水物、酸塩化物、塩化スルホニル、イソシアネート、及びイソチオシアネートが挙げられる。例えば、Ｋｌｕｓｓｍａｎ，ら（２００４），Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１５（４）：７６５−７７３の７６６ページの結合方法、及び本明細書の実施例を参照。   In one aspect, the linker has a functional group that can react with a free cysteine present on the antibody that forms a covalent bond. Non-limiting examples of such reactive functional groups include maleimide, haloacetamide, α-haloacetyl, activated esters such as succinimide ester, 4-nitrophenyl ester, pentafluorophenyl ester, tetrafluorophenyl ester, anhydride, acid Examples include chloride, sulfonyl chloride, isocyanate, and isothiocyanate. See, for example, the binding method on page 766 of Klussman, et al. (2004), Bioconjugate Chemistry 15 (4): 765-773, and the examples herein.

いくつかの実施形態では、リンカーが、抗体上に存在する求電子性基と反応することができる官能基を有する。かかる求電子性基の例としては、アルデヒド及びケトンカルボニル基が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、リンカーの反応性官能基のヘテロ原子が、抗体上の求電子性基と反応し、抗体単位と共有結合を形成することができる。かかる反応性官能基の非限定例としては、ヒドラジド、オキシム、アミノ、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、及びアリールヒドラジドが挙げられるが、これらに限定されない。   In some embodiments, the linker has a functional group that can react with an electrophilic group present on the antibody. Examples of such electrophilic groups include, but are not limited to, aldehydes and ketone carbonyl groups. In some embodiments, a heteroatom of the reactive functional group of the linker can react with an electrophilic group on the antibody to form a covalent bond with the antibody unit. Non-limiting examples of such reactive functional groups include, but are not limited to, hydrazide, oxime, amino, hydrazine, thiosemicarbazone, hydrazine carboxylate, and aryl hydrazide.

リンカーは、１つ以上のリンカー成分を含んでよい。例示的リンカー成分としては、６−マレイミドカプロイル（「ＭＣ」）、マレイミドプロパノイル（「ＭＰ」）、ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（「ＰＡＢ」）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエート（「ＳＰＰ」）、及び４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１カルボキシレート（「ＭＣＣ」）が挙げられる。種々のリンカー成分が、当技術分野で知られており、そのうちのいくつかを以下に記載している。   The linker may comprise one or more linker components. Exemplary linker components include 6-maleimidocaproyl (“MC”), maleimidopropanoyl (“MP”), p-aminobenzyloxycarbonyl (“PAB”), N-succinimidyl 4- (2-pyridylthio) pentanoate ("SPP"), and 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1carboxylate ("MCC"). Various linker components are known in the art, some of which are described below.

リンカーは、薬剤の放出を促進する「開裂可能リンカー」としてよい。開裂可能リンカーの非限定例としては、酸−不安定性リンカー（例えば、ヒドラゾンを含む）、プロテアーゼ−感受性（例えば、ペプチダーゼ−感受性）リンカー、光分解性リンカー、またはジスルフィド−含有リンカーが挙げられる（Ｃｈａｒｉら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ５２：１２７−１３１（１９９２）；米国特許第５２０８０２０号）。   The linker may be a “cleavable linker” that facilitates release of the drug. Non-limiting examples of cleavable linkers include acid-labile linkers (eg, including hydrazone), protease-sensitive (eg, peptidase-sensitive) linkers, photodegradable linkers, or disulfide-containing linkers (Chari Et al., Cancer Research 52: 127-131 (1992); US Pat. No. 5,208,020).

いくつかの実施形態では、リンカー成分が、抗体をもう１つのリンカー成分または薬剤部分に結合する「ストレッチャー単位」を含む。ストレッチャー単位の非限定例を以下に示している（波線は、抗体、薬剤、または追加のリンカー成分との共有結合の部位を示す）。
ＭＣ
ＭＰ
ｍＰＥＧ
In some embodiments, the linker component comprises a “stretcher unit” that binds the antibody to another linker component or drug moiety. Non-limiting examples of stretcher units are shown below (dashed lines indicate sites of covalent attachment to antibodies, drugs, or additional linker components).
MC
MP
mPEG

いくつかの実施形態では、リンカー成分が、直接またはストレッチャー単位及び／またはアミノ酸単位を介して、抗体を薬剤部分に結合する「スペーサー」単位を含む。スペーサー単位は、「自壊性」または「非自壊性」としてよい。「非自壊性」スペーサー単位は、スペーサー単位の一部または全部が、ＡＤＣの開裂時に、薬剤部分に結合したままのものである。非自壊性スペーサー単位の例としては、グリシンスペーサー単位及びグリシン−グリシンスペーサー単位が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、腫瘍−細胞関連プロテアーゼによるグリシン−グリシンスペーサー単位を含有するＡＤＣの酵素的開裂の結果、ＡＤＣの残りからグリシン−グリシン−薬剤部分が放出される。いくつかのかかる実施形態では、グリシン−グリシン−薬剤部分は、腫瘍細胞中で加水分解ステップにかけられ、こうして、薬剤部分からグリシン−グリシンスペーサー単位が切断される。   In some embodiments, the linker component comprises a “spacer” unit that attaches the antibody to the drug moiety, either directly or through a stretcher unit and / or an amino acid unit. The spacer unit may be “self-destructing” or “non-self-destructing”. A “non-self-destructing” spacer unit is one in which part or all of the spacer unit remains attached to the drug moiety upon cleavage of the ADC. Examples of non-self-destructing spacer units include, but are not limited to, glycine spacer units and glycine-glycine spacer units. In some embodiments, enzymatic cleavage of an ADC containing a glycine-glycine spacer unit by a tumor-cell associated protease results in the release of the glycine-glycine-drug moiety from the rest of the ADC. In some such embodiments, the glycine-glycine-drug moiety is subjected to a hydrolysis step in the tumor cell, thus cleaving the glycine-glycine spacer unit from the drug moiety.

「自壊性」スペーサー単位は、薬剤部分の放出を可能にする。特定の実施形態では、リンカーのスペーサー単位が、ｐ−アミノベンジル単位を含む。いくつかのかかる実施形態では、ｐ−アミノベンジルアルコールが、アミド結合を介してアミノ酸単位に結合され、カルバメート、メチルカルバメート、またはカーボネートが、ベンジルアルコール及び薬剤間に生成される（Ｈａｍａｎｎら（２００５）ＥｘｐｅｒｔＯｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔｅｎｔｓ（２００５）１５：１０８７−１１０３）。いくつかの実施形態では、スペーサー単位が、ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢ）である。いくつかの実施形態では、ＡＤＣが、以下の構造を有する自壊性リンカーを含む。
式中、Ｑが、−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）、−ハロゲン、−ニトロ、または−シノである；ｍが、０〜４の範囲の整数である；及びｐが、１〜約２０の範囲である。いくつかの実施形態では、ｐが、１〜１０、１〜７、１〜５、または１〜４の範囲である。 A “self-destructing” spacer unit allows release of the drug moiety. In certain embodiments, the spacer unit of the linker comprises a p-aminobenzyl unit. In some such embodiments, p-aminobenzyl alcohol is linked to an amino acid unit via an amide bond, and a carbamate, methyl carbamate, or carbonate is generated between benzyl alcohol and the drug (Hamann et al. (2005)). Expert Opin. Ther. Patents (2005) 15: 1087-1103). In some embodiments, the spacer unit is p-aminobenzyloxycarbonyl (PAB). In some embodiments, the ADC comprises a self-destructing linker having the structure:
In formula (I), Q is -C 1 -C 8 alkyl, -O- (C 1 -C 8 alkyl), - halogen, - nitro or - is Shino; m is an integer ranging from 0 to 4 And p ranges from 1 to about 20. In some embodiments, p ranges from 1-10, 1-7, 1-5, or 1-4.

自壊性スペーサーの他の例としては、ＰＡＢ基、例えば、２−アミノイミダゾール−５−メタノール誘導体（米国特許第７，３７５，０７８号；Ｈａｙら（１９９９）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．９：２２３７）及びオルト−またはパラ−アミノベンジルアセタールと電子的にほぼ同じ芳香族化合物が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、アミド結合加水分解時に環形成されるスペーサー、例えば、置換及び非置換４−アミノ酪酸アミド（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓら（１９９５）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｂｉｏｌｏｇｙ２：２２３）、好適に置換したビシクロ［２．２．１］及びビシクロ［２．２．２］環系（Ｓｔｏｒｍ ら（１９７２）Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９４：５８１５）及び２−アミノフェニルプロピオン酸アミド（Ａｍｓｂｅｒｒｙ，ら（１９９０）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５５：５８６７）を用いることができる。薬剤のグリシン残基のα−炭素への結合が、ＡＤＣに有用である可能性がある自壊性スペーサーのもう１つの例である（Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙら（１９８４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２７：１４４７）。   Other examples of self-destructive spacers include PAB groups such as 2-aminoimidazole-5-methanol derivatives (US Pat. No. 7,375,078; Hay et al. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9: 2237) and ortho- or para-aminobenzyl acetals which are substantially the same electronically aromatic compounds. In some embodiments, spacers that are ring-formed upon amide bond hydrolysis, such as substituted and unsubstituted 4-aminobutyric acid amides (Rodrigues et al. (1995) Chemistry Biology 2: 223), suitably substituted bicyclo [2.2 .1] and bicyclo [2.2.2] ring systems (Storm et al. (1972) J. Amer. Chem. Soc. 94: 5815) and 2-aminophenylpropionic acid amides (Amsbury, et al. (1990) J. Org. Chem.55: 5867) can be used. Binding of the drug's glycine residue to the α-carbon is another example of a self-destructing spacer that may be useful for ADCs (Kingsbury et al. (1984) J. Med. Chem. 27: 1447).

いくつかの実施形態では、リンカーＬは、分岐多官能性リンカー部分を介して、１つ以上の薬剤部分が抗体に共有結合するための樹状型リンカーとしてよい（Ｓｕｎら（２００２）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ１２：２２１３−２２１５；Ｓｕｎら（２００３）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１１：１７６１−１７６８）。樹状リンカーは、抗体に対する薬剤の分子比、すなわち、ＡＤＣの効力に関係している添加量を増大させることができる。したがって、抗体が、１つだけの反応性システインチオール基を有する場合、樹状リンカーを介して、多くの薬剤部分を結合してよい。   In some embodiments, the linker L may be a dendritic linker for covalent attachment of one or more drug moieties to the antibody via a branched multifunctional linker moiety (Sun et al. (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12 : 2213-2215; Sun et al. (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11: 1761-1768). Dendritic linkers can increase the amount of drug to antibody ratio, ie the amount of addition related to ADC potency. Thus, if an antibody has only one reactive cysteine thiol group, many drug moieties may be attached via a dendritic linker.

いくつかの実施形態では、リンカーが、溶解度及び／または反応性を調節する基で置換される。非限定例として、荷電置換基、例えば、スルホネート（−ＳＯ３ −）またはアンモニウムが、リンカー試薬の水溶解性を増大し、ＡＤＣを調製するために用いられる合成経路に応じて、抗体及び／または薬剤部分とリンカー試薬のカップリング反応を促進する、またはＤとＡｂ−Ｌ（抗体−リンカー中間体）のカップリング反応、もしくはＡｂとＤ−Ｌ（薬剤−リンカー中間体）のカップリング反応を促進する可能性がある。いくつかの実施形態では、リンカーの一部が、抗体に結合し、リンカーの一部が薬剤に結合し、その後、Ａｂ−（リンカー部分）ａが、薬剤−（リンカー部分）ｂに結合し、式ＩのＡＤＣを形成する。いくつかのかかる実施形態では、抗体が、１つ以上の（リンカー部分）ａ置換基を含み、その結果、１つ以上の薬剤が、式ＩのＡＤＣ中の抗体に結合する。 In some embodiments, the linker is substituted with groups that modulate solubility and / or reactivity. As a non-limiting example, charged substituents such as sulfonate (—SO 3 − ) or ammonium increase the water solubility of the linker reagent and depending on the synthetic route used to prepare the ADC and / or Promotes the coupling reaction between the drug moiety and the linker reagent, or promotes the coupling reaction between D and Ab-L (antibody-linker intermediate) or Ab and DL (drug-linker intermediate) there's a possibility that. In some embodiments, a portion of the linker binds to the antibody, a portion of the linker binds to the drug, and then Ab- (linker moiety) a binds to drug- (linker moiety) b ; An ADC of formula I is formed. In some such embodiments, the antibody comprises one or more (linker moieties) a substituents so that one or more agents are conjugated to the antibody in the ADC of Formula I.

本発明の化合物は、これらに限定されないが、以下のリンカー試薬で調製されるＡＤＣを明確に意味する：ビス−マレイミド−トリオキシエチレングリコール（ＢＭＰＥＯ）、Ｎ−（β−マレイミドプロピルオキシ）−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＢＭＰＳ）、Ｎ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）、Ｎ−［γ−マレイミドブチリルオキシ］スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）、１，６−ヘキサン−ビス−ビニルスルホン（ＨＢＶＳ）、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシ−（６−アミドカプロエート）（ＬＣ−ＳＭＣＣ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド（ＭＰＢＨ）、スクシンイミジル３−（ブロモアセトアミド）プロピオネート（ＳＢＡＰ）、スクシンイミジルヨードアセテート（ＳＩＡ）、スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）、スクシンイミジル６−［（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート］（ＳＭＰＨ）、イミノイミノチオラン（ＩＴ）、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、及びスルホ−ＳＭＰＢ、及びスクシンイミジル−（４−ビニルスルホン）ベンゾエート（ＳＶＳＢ）、ならびにビス−マレイミド試薬：ジチオビスマレイミドエタン（ＤＴＭＥ）、１，４−ビスマレイミドブタン（ＢＭＢ）、１，４−ビスマレイミジル−２，３−ジヒドロキシブタン（ＢＭＤＢ）、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）、ビスマレイミドエタン（ＢＭＯＥ）、ＢＭ（ＰＥＧ）２（以下に示した）、及びＢＭ（ＰＥＧ）３（以下に示した）を含む；イミドエステル（例えば、ジメチルアジピミデートＨＣｌ）の二官能性誘導体、活性エステル（例えば、ジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン２，６−ジイソシアネート）、及びビス−活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）。いくつかの実施形態では、ビス−マレイミド試薬が、抗体中のシステインのチオール基のチオール−含有薬剤部分、リンカー、またはリンカー−薬剤中間体への結合を可能にする。チオール基と反応性がある他の官能基としては、ヨードアセトアミド、ブロモアセトアミド、ビニルピリジン、ジスルフィド、ピリジルジスルフィド、イソシアネート、及びイソチオシアネートが挙げられるが、これらに限定されない。
The compounds of the present invention clearly mean, but are not limited to, ADCs prepared with the following linker reagents: bis-maleimido-trioxyethylene glycol (BMPEO), N- (β-maleimidopropyloxy) -N -Hydroxysuccinimide ester (BMPS), N- (ε-maleimidocaproyloxy) succinimide ester (EMCS), N- [γ-maleimidobutyryloxy] succinimide ester (GMBS), 1,6-hexane-bis-vinylsulfone (HBVS), succinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxy- (6-amidocaproate) (LC-SMCC), m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester (MBS), 4- (4 -N-maleimidophe B) Butyric acid hydrazide (MPBH), succinimidyl 3- (bromoacetamido) propionate (SBAP), succinimidyl iodoacetate (SIA), succinimidyl (4-iodoacetyl) aminobenzoate (SIAB), N-succinimidyl-3- ( 2-pyridyldithio) propionate (SPDP), N-succinimidyl-4- (2-pyridylthio) pentanoate (SPP), succinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC), succinimidyl 4- (p -Maleimidophenyl) butyrate (SMPB), succinimidyl 6-[(β-maleimidopropionamido) hexanoate] (SMPH), iminoiminothiolane (IT), sulfo-EMCS, sulfo Pho-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, and sulfo-SMPB, and succinimidyl- (4-vinylsulfone) benzoate (SVSB), and bis-maleimide reagents: dithiobismaleimide ethane ( DTME), 1,4-bismaleimide butane (BMB), 1,4-bismaleimidyl-2,3-dihydroxybutane (BMDB), bismaleimide hexane (BMH), bismaleimide ethane (BMOE), BM (PEG) 2 ( And BM (PEG) 3 (shown below); bifunctional derivatives of imide esters (eg dimethyl adipimidate HCl), active esters (eg disuccinimidyl suberate) ), Aldehydes (eg glutaraldehyde) Bis-azide compounds (eg bis (p-azidobenzoyl) hexanediamine), bis-diazonium derivatives (eg bis- (p-diazonium benzoyl) -ethylenediamine), diisocyanates (eg toluene 2,6-diisocyanate), And bis-active fluorine compounds (eg, 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzene). In some embodiments, a bis-maleimide reagent allows attachment of a cysteine thiol group in an antibody to a thiol-containing drug moiety, linker, or linker-drug intermediate. Other functional groups that are reactive with thiol groups include, but are not limited to, iodoacetamide, bromoacetamide, vinyl pyridine, disulfide, pyridyl disulfide, isocyanate, and isothiocyanate.

特定の有用なリンカー試薬は、種々の商業的供給元、例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．（Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）から得ることができる，または当技術分野に記載の方法；例えば，Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ，ら（１９９７）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，３８：５２５７−６０；Ｗａｌｋｅｒ，Ｍ．Ａ．（１９９５）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６０：５３５２−５３５５；Ｆｒｉｓｃｈら（１９９６）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．７：１８０−１８６；米国特許第６２１４３４５号；ＷＯ０２／０８８１７２；米国特許第２００３１３０１８９号；米国特許第２００３０９６７４３号；ＷＯ０３／０２６５７７；ＷＯ０３／０４３５８３；及びＷＯ０４／０３２８２８に従って、合成することができる。   Certain useful linker reagents are available from various commercial sources, such as Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, IL), Molecular Biosciences Inc. (Boulder, CO) or methods described in the art; see, eg, Dubowchik, et al. (1997) Tetrahedron Letters, 38: 5257-60; Walker, M .; A. (1995) J. MoI. Org. Chem. 60: 5352-5355; Frisch et al. (1996) Bioconjugate Chem. 7: 180-186; U.S. Pat. No. 6,214,345; WO02 / 088172; U.S. Pat. No. 20030189189; U.S. Pat.

炭素−１４−標識１−イソチオシアネートベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）が、放射性ヌクレオチドの抗体への結合のための例示的キレート薬剤である。例えば、ＷＯ９４／１１０２６を参照。   Carbon-14-labeled 1-isothiocyanate benzyl-3-methyldiethylenetriaminepentaacetic acid (MX-DTPA) is an exemplary chelating agent for the binding of radionucleotides to antibodies. See, for example, WO 94/11026.

ｂ）例示的薬剤部分
（１）メイタンシン及びマイタンシノイド
いくつかの実施形態では、イムノコンジュゲートが、１つ以上のマイタンシノイド分子に結合する抗体を含む。マイタンシノイドは、メイタンシンの誘導体であり、チューブリン重合を抑制することによって作用する有糸***阻害剤（ｍｉｔｏｔｏｔｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）である。メイタンシンは、東アフリカの低木メイテナスセラタから最初に分離された（米国特許第３８９６１１１号）。その後、特定の微生物が、また、マイタンシノイド、例えば、マイタンシノール及びＣ−３マイタンシノールエステルを生成することが発見された（米国特許第４，１５１，０４２号）。合成マイタンシノイドは、例えば、米国特許第４，１３７，２３０号；４，２４８，８７０号；４，２５６，７４６号；４，２６０，６０８号；４，２６５，８１４号；４，２９４，７５７号；４，３０７，０１６号；４，３０８，２６８号；４，３０８，２６９号；４，３０９，４２８号；４，３１３，９４６号；４，３１５，９２９号；４，３１７，８２１号；４，３２２，３４８号；４，３３１，５９８号；４，３６１，６５０号；４，３６４，８６６号；４，４２４，２１９号；４，４５０，２５４号；４，３６２，６６３号；及び４，３７１，５３３号に開示されている。 b) Exemplary Drug Moieties (1) Maytansine and Maytansinoid In some embodiments, the immunoconjugate comprises an antibody that binds to one or more maytansinoid molecules. Maytansinoids are derivatives of maytansine and are mitotic inhibitors that act by inhibiting tubulin polymerization. Maytansine was first isolated from the shrub Maytenus serrata in East Africa (US Pat. No. 3,896,111). It was subsequently discovered that certain microorganisms also produce maytansinoids, such as maytansinol and C-3 maytansinol esters (US Pat. No. 4,151,042). Synthetic maytansinoids are, for example, U.S. Pat. Nos. 4,137,230; 4,248,870; 4,256,746; 4,260,608; 4,265,814; No. 757; 4,307,016; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929; 4,317,821 No. 4,322,348; 4,331,598; 4,361,650; 4,364,866; 4,424,219; 4,450,254; 4,362,663 And 4,371,533.

マイタンシノイド薬剤部分は、（ｉ）発酵または発酵生成物の化学修飾もしくは誘導体化によって調製するために比較的入手しやすい、（ｉｉ）非ジスルフィドリンカーを介した抗体への結合に好適な官能基による誘導体化に適している、（ｉｉｉ）血しょう中で安定している、及び（ｉｖ）さまざまな腫瘍細胞株に対して効果的であるため、抗体−薬剤コンジュゲート中の魅力的な薬剤部分である。   The maytansinoid drug moiety is (i) a functional group suitable for attachment to an antibody via a non-disulfide linker, which is relatively readily available for preparation by fermentation or chemical modification or derivatization of the fermentation product. Attractive drug moieties in antibody-drug conjugates that are suitable for derivatization with (iii) stable in plasma, and (iv) effective against various tumor cell lines It is.

マイタンシノイド薬剤部分として用いるのに好適な特定のマイタンシノイドが、当技術分野で知られており、公知の方法に従って、天然ソースから分離することができる、または遺伝子組み換え技術を用いて生成することができる（例えば、Ｙｕら（２００２）ＰＮＡＳ９９：７９６８−７９７３を参照）。マイタンシノイドは、また、公知の方法に従って合成的に調製してよい。   Certain maytansinoids suitable for use as maytansinoid drug moieties are known in the art and can be isolated from natural sources or produced using genetic engineering techniques according to known methods (See, eg, Yu et al. (2002) PNAS 99: 7968-7793). Maytansinoids may also be prepared synthetically according to known methods.

例示的マイタンシノイド薬剤部分としては、修飾された芳香環を有するもの、例えば、Ｃ−１９−デクロノ（米国特許第４２５６７４６号）（例えば、アンサマイトシンＰ２の水素化リチウムアルミニウム還元によって調製される）；Ｃ−２０−ヒドロキシ（またはＣ−２０−デメチル）＋／−Ｃ−１９−デクロノ（米国特許第４３６１６５０号及び４３０７０１６号）（例えば、ストレプトマイセスもしくはアクチノマイセスを用いる脱メチル、またはＬＡＨを用いる脱塩素によって調製される）；及びＣ−２０−デメトキシ、Ｃ−２０−アシルオキシ（−ＯＣＯＲ）、＋／−デクロノ（米国特許第４，２９４，７５７号）（例えば、塩化アシルを用いるアシル化によって調製される）、及び芳香環の他の位置で修飾されたものが挙げられるが、これらに限定されない。   Exemplary maytansinoid drug moieties include those having a modified aromatic ring, such as C-19-decrono (US Pat. No. 4,256,746) (eg, prepared by lithium aluminum hydride reduction of ansamitocin P2). C-20-hydroxy (or C-20-demethyl) +/- C-19-decrono (US Pat. Nos. 4,361,650 and 4,307,016) (eg, demethylation using Streptomyces or Actinomyces, or LAH C-20-demethoxy, C-20-acyloxy (-OCOR), +/- decrono (US Pat. No. 4,294,757) (eg acyl with acyl chloride) Prepared), and those modified at other positions on the aromatic ring But, but it is not limited to these.

また、例示的マイタンシノイド薬剤部分としては、修飾を有するもの、例えば、Ｃ−９−ＳＨ（米国特許第４４２４２１９号）（例えば、Ｈ２ＳまたはＰ２Ｓ５とマイタンシノールの反応によって調製される）；Ｃ−１４−アルコキシメチル（デメトキシ／ＣＨ２ＯＲ）（米国特許第４３３１５９８号）；Ｃ−１４−ヒドロキシメチルまたはアシルオキシメチル（ＣＨ２ＯＨまたはＣＨ２ＯＡｃ）（米国特許第４４５０２５４号）（例えば、ノカルジアから調製される）；Ｃ−１５−ヒドロキシ／アシルオキシ（米国特許第４３６４８６６号）（例えば、ストレプトマイセスによるマイタンシノールの変換によって調製される）；Ｃ−１５−メトキシ（米国特許第４３１３９４６号及び４３１５９２９号）（例えば、トレウィアヌドルフローラから分離される）；Ｃ−１８−Ｎ−デメチル（米国特許第４３６２６６３号及び４３２２３４８号）（例えば、ストレプトマイセスによるマイタンシノールの脱メチルによって調製される）；及び４，５−デオキシ（米国特許第４３７１５３３号）（例えば、マイタンシノールの三塩化チタニウム／ＬＡＨ還元によって調製される）が挙げられる。 Exemplary maytansinoid drug moieties also have modifications, such as C-9-SH (US Pat. No. 4,424,219) (eg, prepared by reaction of H 2 S or P 2 S 5 with maytansinol. C-14-alkoxymethyl (demethoxy / CH 2 OR) (US Pat. No. 4,331,598); C-14-hydroxymethyl or acyloxymethyl (CH 2 OH or CH 2 OAc) (US Pat. No. 4,450,254) (For example, prepared from nocardia); C-15-hydroxy / acyloxy (US Pat. No. 4,364,866) (for example, prepared by conversion of maytansinol by Streptomyces); C-15-methoxy (US patent) Nos. 4313946 and 4315929) (for example, Trevianando C-18-N-demethyl (US Pat. Nos. 4,362,663 and 4322348) (prepared, for example, by demethylation of maytansinol by Streptomyces); and 4,5-deoxy (separated from flora); U.S. Pat. No. 4,371,533) (prepared, for example, by titanium trichloride / LAH reduction of maytansinol).

マイタンシノイド化合物の多くの位置が、結合位置として有用である。例えば、従来のカップリング技術を用いるヒドロキシル基との反応によってエステル結合を形成してよい。いくつかの実施形態では、反応は、ヒドロキシル基を有するＣ−３位置、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ−１４位置、ヒドロキシル基で修飾されたＣ−１５位置、及びヒドロキシル基を有するＣ−２０位置で生じてよい。いくつかの実施形態では、結合が、マイタンシノールまたはマイタンシノール構造類似体のＣ−３位置で形成される。   Many positions of maytansinoid compounds are useful as binding positions. For example, ester bonds may be formed by reaction with hydroxyl groups using conventional coupling techniques. In some embodiments, the reaction comprises a C-3 position having a hydroxyl group, a C-14 position modified with hydroxymethyl, a C-15 position modified with a hydroxyl group, and a C-20 position having a hydroxyl group. May occur. In some embodiments, the bond is formed at the C-3 position of maytansinol or maytansinol structural analogs.

マイタンシノイド薬剤部分は、以下の構造を有するものを含む。
式中、波線は、マイタンシノイド薬剤部分の硫黄原子のＡＤＣのリンカーとの共有結合を示す。各Ｒは、独立してＨまたはＣ１−Ｃ６アルキルとしてよい。アミド基を硫黄原子に結合するアルキレン鎖は、メタニル、エタニルまたはプロピルとしてよい、すなわち、ｍが１、２、または３である（米国特許第６３３４１０号；米国特許第５２０８０２０号；Ｃｈａｒｉら（１９９２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：１２７−１３１；Ｌｉｕ ら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ９３：８６１８−８６２３）。 Maytansinoid drug moieties include those having the following structure.
In the formula, the wavy line indicates the covalent bond of the sulfur atom of the maytansinoid drug moiety to the linker of the ADC. Each R may independently be H or C 1 -C 6 alkyl. The alkylene chain linking the amide group to the sulfur atom may be methanyl, ethanyl or propyl, ie, m is 1, 2, or 3 (US Pat. No. 6,334,410; US Pat. No. 5,208,020; Chari et al. (1992). Cancer Res. 52: 127-131; Liu et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci USA 93: 8618-8623).

マイタンシノイド薬剤部分の全立体異性体が、本発明のＡＤＣのために検討されている、すなわち、キラル炭素のＲ及びＳ配置のいずれの組み合わせも検討されている（米国特許第７２７６４９７号米国特許第６９１３７４８号；米国特許第６４４１１６３号；米国特許第６３３４１０号（ＲＥ３９１５１）；米国特許第５２０８０２０号；Ｗｉｄｄｉｓｏｎら（２００６）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４９：４３９２−４４０８、参照によりその全体が組み入れられる）。いくつかの実施形態では、マイタンシノイド薬剤部分が、以下の立体化学を有する。
All stereoisomers of the maytansinoid drug moiety have been investigated for the ADCs of the present invention, i.e. any combination of R and S configurations of chiral carbons has been investigated (US Pat. No. 7,276,497). US Pat. No. 6,931,748; US Pat. No. 6,441,163; US Pat. No. 6,334,410 (RE39151); US Pat. No. 5,208,020; Widison et al. (2006) J. Med. Chem. 49: 4392-4408, which is incorporated by reference in its entirety). . In some embodiments, the maytansinoid drug moiety has the following stereochemistry:

マイタンシノイド薬剤部分の例示的実施形態としては、以下の構造を有するＤＭ１；ＤＭ３；及びＤＭ４が挙げられるが、これらに限定されない。
式中、波線は、薬剤の硫黄原子の抗体−薬剤コンジュゲートのリンカー（Ｌ）との共有結合を示す。 Exemplary embodiments of maytansinoid drug moieties include, but are not limited to, DM1; DM3; and DM4 having the following structure:
In the formula, the wavy line indicates the covalent bond of the sulfur atom of the drug to the linker (L) of the antibody-drug conjugate.

他の例示的マイタンシノイド抗体−薬剤コンジュゲートが、以下の構造及び略名（式中、Ａｂが、抗体であり、ｐが、１〜約２０である）を有する。いくつかの実施形態では、ｐが、１〜１０であり、ｐが、１〜７であり、ｐが、１〜５である、またはｐが１〜４である。
Ａｂ−ＳＰＰ−ＤＭ１
Ａｂ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１ Other exemplary maytansinoid antibody-drug conjugates have the following structures and abbreviations, wherein Ab is an antibody and p is 1 to about 20. In some embodiments, p is 1-10, p is 1-7, p is 1-5, or p is 1-4.
Ab-SPP-DM1
Ab-SMCC-DM1

ＤＭ１がＢＭＰＥＯリンカーを介して抗体のチオール基に結合する例示的抗体−薬剤コンジュゲートは、以下の構造及び略名を有する。
式中、Ａｂが、抗体である；ｎが、０、１、または２である；及びｐが、１〜約２０である。いくつかの実施形態では、ｐが、１〜１０であり、ｐが、１〜７であり、ｐが、１〜５である、またはｐが１〜４である。 An exemplary antibody-drug conjugate in which DM1 is attached to the antibody thiol group via a BMPEO linker has the following structure and abbreviation:
Wherein Ab is an antibody; n is 0, 1, or 2; and p is 1 to about 20. In some embodiments, p is 1-10, p is 1-7, p is 1-5, or p is 1-4.

マイタンシノイドを含有するイムノコンジュゲート、この生成方法、及びこの治療的利用が、例えば、米国特許第５，２０８，０２０号及び５，４１６，０６４号；米国特許第２００５／０２７６８１２Ａ１号；及びＥｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ ＥＰ ０ ４２５２３５Ｂ１に開示されており、これらの開示は、参照により本明細書に明確に組み入れられる。また、ＬｉｕらＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：８６１８−８６２３（１９９６）；及びＣｈａｒｉらＣａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ５２：１２７−１３１（１９９２）を参照。   Immunoconjugates containing maytansinoids, methods for their production, and therapeutic uses thereof are described, for example, in US Pat. Nos. 5,208,020 and 5,416,064; US Patent 2005 / 0276812A1; and European Patent EP 0 425235B1, the disclosures of which are expressly incorporated herein by reference. Also, Liu et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 8618-8623 (1996); and Chari et al., Cancer Research 52: 127-131 (1992).

いくつかの実施形態では、抗体またはマイタンシノイド分子の生物活性を有意に減少させることなく、マイタンシノイド分子に抗体を化学的に結合することによって、抗体−マイタンシノイドコンジュゲートを調製してよい。例えば、米国特許第５，２０８，０２０号（この開示は、参照により本明細書に明確に組み入れられる）を参照。いくつかの実施形態では、１抗体分子当たり平均３〜４個のマイタンシノイド分子が結合されたＡＤＣが、抗体の機能または溶解性に否定的に影響を及ぼすことなく、標的細胞の細胞傷害性を向上させるのに有効であることを示した。いくつかの例では、毒素／抗体の１つの分子でも、裸抗体の使用より、細胞傷害性を向上させることが予測される。   In some embodiments, an antibody-maytansinoid conjugate is prepared by chemically coupling an antibody to a maytansinoid molecule without significantly reducing the biological activity of the antibody or maytansinoid molecule. Good. See, for example, US Pat. No. 5,208,020, the disclosure of which is expressly incorporated herein by reference. In some embodiments, ADCs with an average of 3-4 maytansinoid molecules bound per antibody molecule can be used to target cell cytotoxicity without negatively affecting antibody function or solubility. It was shown to be effective in improving In some instances, one toxin / antibody molecule is expected to improve cytotoxicity over the use of a naked antibody.

抗体−マイタンシノイドコンジュゲートを生成するための例示的結合基が、例えば、本明細書に記載のもの及び米国特許第５２０８０２０号；ＥＰ Ｐａｔｅｎｔ０４２５２３５Ｂ１；ＣｈａｒｉらＣａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ５２：１２７−１３１（１９９２）；米国特許第２００５／０２７６８１２Ａ１号；及び米国特許第２００５／０１６９９３Ａ１号に開示されたものを含み、これらの開示は、参照により本明細書に明確に組み入れられる。   Exemplary linking groups for generating antibody-maytansinoid conjugates are, for example, those described herein and US Pat. No. 5,208,020; EP Patent 0425235B1; Chari et al. Cancer Research 52: 127-131 (1992); Including those disclosed in US 2005/0276812 A1; and US 2005/016993 A1, the disclosures of which are expressly incorporated herein by reference.

（２）カリケアミシン
いくつかの実施形態では、イムノコンジュゲートが、１つ以上のカリケアミシン分子に結合する抗体を含む。抗生物質のカリケアミシンファミリー、及びこれらの構造類似体は、ピコモル濃度以下で二本鎖ＤＮＡ切断を生じさせることができる（Ｈｉｎｍａｎら，（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ５３：３３３６−３３４２；Ｌｏｄｅら，（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ５８：２９２５−２９２８）。カリケアミシンは、作用の細胞内部位を有するが、特定の例では、容易に血しょう膜を通過しない。したがって、いくつかの実施形態では、抗体媒介細胞内移行によるこれらの薬剤の細胞摂取が、その細胞毒性作用を大きく向上させる可能性がある。カリケアミシン薬剤部分を有する抗体−薬剤コンジュゲートを調製する方法の非限定例が、例えば、米国特許第５７１２３７４号；米国特許第５７１４５８６号；米国特許第５７３９１１６号；及び米国特許第５７６７２８５号に記載されている。 (2) Calicheamicin In some embodiments, the immunoconjugate comprises an antibody that binds to one or more calicheamicin molecules. The calicheamicin family of antibiotics, and their structural analogs, are capable of producing double-stranded DNA breaks below picomolar concentrations (Hinman et al., (1993) Cancer Research 53: 3336-3342; Rode et al., (1998). ) Cancer Research 58: 2925-2928). Although calicheamicin has an intracellular site of action, in certain instances it does not readily cross the plasma membrane. Thus, in some embodiments, cellular uptake of these agents by antibody-mediated intracellular translocation can greatly enhance their cytotoxic effects. Non-limiting examples of methods for preparing antibody-drug conjugates having a calicheamicin drug moiety are described, for example, in US Pat. No. 5,712,374; US Pat. No. 5,714,586; US Pat. No. 5,739,116; and US Pat. No. 5,767,285. Yes.

（４）ピロロベンゾジアゼピン
いくつかの実施形態では、ＡＤＣが、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤＢ二量体が、特定のＤＮＡ配列を認識し、特定のＤＮＡ配列に結合する。天然物アントラマイシン、ＰＢＤは、１９６５年に最初に報告された（Ｌｅｉｍｇｒｕｂｅｒ，ら，（１９６５）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８７：５７９３−５７９５；Ｌｅｉｍｇｒｕｂｅｒ，ら，（１９６５）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８７：５７９１−５７９３）。それ以後、三環ＰＢＤ足場の二量体（米国特許第６８８４７９９号；米国特許第７０４９３１１号；米国特許第７０６７５１１号；米国特許第７２６５１０５号；米国特許第７５１１０３２号；米国特許第７５２８１２６号；米国特許第７５５７０９９号）を含む、多くのＰＢＤが、自然物及び構造類似体とも、報告されている（Ｔｈｕｒｓｔｏｎ，ら，（１９９４）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１９９４，４３３−４６５）。特定の理論によって束縛されることを意図しないが、二量体構造が、Ｂ−型ＤＮＡの小溝に対して、イソヘリシティーに適した三次元形状を与え、結合部位にぴったり合うフィットをもたらすと考えられている（Ｋｏｈｎ，ＩｎＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓＩＩＩ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３−１１（１９７５）；Ｈｕｒｌｅｙ及びＮｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒ，（１９８６）Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，１９：２３０−２３７）。Ｃ２アリール置換基を有する二量体ＰＢＤ化合物が、細胞毒性薬剤として有用であることが示された（Ｈａｒｔｌｅｙら（２０１０）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７０（１７）：６８４９−６８５８；Ａｎｔｏｎｏｗ（２０１０）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５３（７）：２９２７−２９４１；Ｈｏｗａｒｄら（２００９）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ａｎｄ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ１９（２２）：６４６３−６４６６）。 (4) Pyrrolobenzodiazepine In some embodiments, the ADC comprises pyrrolobenzodiazepine (PBD). In some embodiments, the PDB dimer recognizes and binds to a specific DNA sequence. The natural product anthramycin, PBD, was first reported in 1965 (Leimgruber, et al., (1965) J. Am. Chem. Soc., 87: 5793-5795; Leimgruber, et al., (1965) J. Am. Chem. Soc., 87: 5791-5793). Thereafter, dimers of tricyclic PBD scaffolds (US Pat. No. 6,884,799; US Pat. No. 7049311; US Pat. No. 7067511; US Pat. No. 7,265,105; US Pat. Many PBDs have been reported, including natural products and structural analogs (Thurston, et al., (1994) Chem. Rev. 1994, 433-465), including No. 7557099). Although not intending to be bound by any particular theory, the dimeric structure provides a three-dimensional shape suitable for isohelicity to the minor groove of B-type DNA, resulting in a snug fit to the binding site. (Kohn, In Antibiotics III. Springer-Verlag, New York, pp. 3-11 (1975); Hurley and Needham-Van Deventer, (1986) Acc. Chem. Res., 19: 230-237). Dimeric PBD compounds with C2 aryl substituents have been shown to be useful as cytotoxic agents (Hartley et al. (2010) Cancer Res. 70 (17): 6849-6858; Antonow (2010) J. Med). Chem. 53 (7): 2927-2941; Howard et al. (2009) Bioorganic and Med.Chem.Letters 19 (22): 6463-6466).

いくつかの実施形態では、ＰＢＤ化合物は、ｉｎ ｖｉｖｏで除去可能である窒素保護基を有するＮ１０位置でこれを保護することによって、プロドラッグとして用いることができる（ＷＯ００／１２５０７；ＷＯ２００５／０２３８１４）。   In some embodiments, PBD compounds can be used as prodrugs by protecting it at the N10 position with a nitrogen protecting group that can be removed in vivo (WO00 / 12507; WO2005 / 023814).

ＰＢＤ二量体は、抗体に結合され、得られたＡＤＣが、抗癌特性を有することを示した（米国特許第２０１０／０２０３００７号）。ＰＢＤ二量体上の結合部位の非限定例としては、５員環ピロロ環、ＰＢＤ単位間のつなぎ鎖、及びＮ１０−Ｃ１１イミン基（ＷＯ２００９／０１６５１６；米国特許第２００９／３０４７１０号；米国特許第２０１０／０４７２５７号；米国特許第２００９／０３６４３１号；米国特許第２０１１／０２５６１５７号；ＷＯ２０１１／１３０５９８）が挙げられる。   PBD dimer was conjugated to the antibody and the resulting ADC was shown to have anti-cancer properties (US 2010/0203007). Non-limiting examples of binding sites on PBD dimers include 5-membered pyrrolo rings, tethers between PBD units, and N10-C11 imine groups (WO 2009/016516; US 2009/304710; US Pat. 2010/047257; US 2009/036431; US 2011/0256157; WO 2011/130598).

ＡＤＣのＰＢＤ二量体成分の非限定例が、式Ａの成分、
Ａ
ならびに塩及びこれらの溶媒和物であり、式中、
波線が、リンカーとの共有結合部位を示す；
点線が、Ｃ１及びＣ２またはＣ２及びＣ３間の二重結合の任意の存在を示す；
Ｒ２が、Ｈ、ＯＨ、＝Ｏ、＝ＣＨ２、ＣＮ、Ｒ、ＯＲ、＝ＣＨ−ＲＤ、＝Ｃ（ＲＤ）２、Ｏ−ＳＯ２−Ｒ、ＣＯ２Ｒ及びＣＯＲから独立して選択され、さらに任意でハロまたはジハロから選択され、式中、ＲＤが、Ｒ、ＣＯ２Ｒ、ＣＯＲ、ＣＨＯ、ＣＯ２Ｈ、及びハロから独立して選択される；
Ｒ６及びＲ９が、Ｈ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、Ｍｅ３Ｓｎ及びハロから独立して選択される；
Ｒ７が、Ｈ、Ｒ、ＯＨ、または、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、Ｍｅ３Ｓｎ及びハロから独立して選択される；
Ｑが、Ｏ、Ｓ及びＮＨから独立して選択される；
Ｒ１１が、Ｈ、またはＲのいずれかであり、または、Ｑが、Ｏ、ＳＯ３Ｍであり、Ｍが、金属カチオンである；
Ｒ及びＲ’それぞれが、任意で置換Ｃ１−８アルキル、Ｃ１−１２アルキル、Ｃ３−８ヘテロシクリル、Ｃ３−２０複素環、及びＣ５−２０アリール基から独立して選択され、任意で基ＮＲＲ’に関して、Ｒ及びＲ’が、これらが結合する窒素原子とともに任意で置換４、５、６または７員の複素環式環を形成する；
Ｒ１２、Ｒ１６、Ｒ１９及びＲ１７が、Ｒ２、Ｒ６、Ｒ９及びＲ７それぞれに対して定義されるとおりである；
Ｒ″が、Ｃ３−１２アルキレン基であり、その鎖が、１つ以上のヘテロ原子、例えば、Ｏ、Ｓ、Ｎ（Ｈ）、ＮＭｅ及び／または芳香環、例えば、ベンゼンまたはピリジンによって中断されていてもよく；及び
Ｘ及びＸ’が、Ｏ、Ｓ及びＮ（Ｈ）から独立して選択される。 A non-limiting example of a PBD dimer component of an ADC is a component of formula A,
A
And salts and solvates thereof, wherein
The wavy line indicates the site of covalent binding with the linker;
The dotted line indicates any presence of a double bond between C1 and C2 or C2 and C3;
R 2 is independent of H, OH, ═O, ═CH 2 , CN, R, OR, ═CH—R D , ═C (R D ) 2 , O—SO 2 —R, CO 2 R and COR. Further optionally selected from halo or dihalo, wherein R D is independently selected from R, CO 2 R, COR, CHO, CO 2 H, and halo;
R 6 and R 9 are independently selected from H, R, OH, OR, SH, SR, NH 2 , NHR, NRR ′, NO 2 , Me 3 Sn and halo;
R 7 is independently selected from H, R, OH, or SH, SR, NH 2 , NHR, NRR ′, NO 2 , Me 3 Sn and halo;
Q is independently selected from O, S and NH;
R 11 is either H or R, or Q is O, SO 3 M, and M is a metal cation;
R and R ′ are each independently selected from substituted C 1-8 alkyl, C 1-12 alkyl, C 3-8 heterocyclyl, C 3-20 heterocycle, and C 5-20 aryl groups, optionally With respect to the group NRR ′, R and R ′ together with the nitrogen atom to which they are attached optionally form a substituted 4, 5, 6 or 7 membered heterocyclic ring;
R 12 , R 16 , R 19 and R 17 are as defined for R 2 , R 6 , R 9 and R 7 respectively;
R ″ is a C 3-12 alkylene group and the chain is interrupted by one or more heteroatoms such as O, S, N (H), NMe and / or aromatic rings such as benzene or pyridine. And X and X ′ are independently selected from O, S and N (H).

いくつかの実施形態では、Ｒ及びＲ’それぞれが、任意で置換Ｃ１−１２アルキル、Ｃ３−２０複素環、及びＣ５−２０アリール基から独立して選択され、任意で基ＮＲＲ’に関して、Ｒ及びＲ’が、これらが結合する窒素原子とともに任意で置換４、５、６または７員の複素環式環を形成する。 In some embodiments, R and R ', respectively, optionally substituted C 1-12 alkyl, C 3 - 20 heterocycle, and C 5-20 is independently selected from aryl groups, optionally with a group NRR' with respect to , R and R ′ together with the nitrogen atom to which they are attached optionally form a substituted 4, 5, 6 or 7 membered heterocyclic ring.

いくつかの実施形態では、Ｒ９及びＲ１９が、Ｈである。 In some embodiments, R 9 and R 19 are H.

いくつかの実施形態では、Ｒ６及びＲ１６が、Ｈである。 In some embodiments, R 6 and R 16 are H.

いくつかの実施形態では、Ｒ７及びＲ１７が、ともにＯＲ７Ａであり、Ｒ７Ａが、任意で置換Ｃ１−４アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ７Ａが、Ｍｅである。いくつかの実施形態では、Ｒ７Ａが、ＣＨ２Ｐｈであり、Ｐｈが、フェニル基である。 In some embodiments, R 7 and R 17 are both OR 7A and R 7A is optionally substituted C 1-4 alkyl. In some embodiments, R 7A is Me. In some embodiments, R 7A is CH 2 Ph and Ph is a phenyl group.

いくつかの実施形態では、Ｘが、Ｏである。   In some embodiments, X is O.

いくつかの実施形態では、Ｒ１１が、Ｈである。 In some embodiments, R 11 is H.

いくつかの実施形態では、各単量体単位中にＣ２及びＣ３間の二重結合がある。   In some embodiments, there is a double bond between C2 and C3 in each monomer unit.

いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ１２が、Ｈ及びＲから独立して選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ１２が、独立してＲである。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ１２が、独立して任意で置換Ｃ５−２０アリールまたはＣ５−７アリールまたはＣ８−１０アリールである。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ１２が、独立して任意で置換フェニル、チエニル、ナフチル、ピリジル、キノリニル、またはイソキノリニルである。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ１２が、＝Ｏ、＝ＣＨ２、＝ＣＨ−ＲＤ、及び＝Ｃ（ＲＤ）２から独立して選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ１２それぞれが、＝ＣＨ２である。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ１２それぞれが、Ｈである。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ１２それぞれが、＝Ｏである。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ１２それぞれが、＝ＣＦ２である。いくつかの実施形態では、Ｒ２及び／またはＲ１２が、独立して＝Ｃ（ＲＤ）２である。いくつかの実施形態では、Ｒ２及び／またはＲ１２が、独立して＝ＣＨ−ＲＤである。 In some embodiments, R 2 and R 12 are independently selected from H and R. In some embodiments, R 2 and R 12 are independently R. In some embodiments, R 2 and R 12 are independently optionally substituted C 5-20 aryl or C 5-7 aryl or C 8-10 aryl. In some embodiments, R 2 and R 12 are independently optionally substituted phenyl, thienyl, naphthyl, pyridyl, quinolinyl, or isoquinolinyl. In some embodiments, R 2 and R 12 are independently selected from ═O, ═CH 2 , ═CH—R D , and ═C (R D ) 2 . In some embodiments, each of R 2 and R 12 is ═CH 2 . In some embodiments, each of R 2 and R 12 is H. In some embodiments, each of R 2 and R 12 is ═O. In some embodiments, each of R 2 and R 12 is ═CF 2 . In some embodiments, R 2 and / or R 12 are independently ═C (R D ) 2 . In some embodiments, R 2 and / or R 12 are independently ═CH—R D.

いくつかの実施形態では、Ｒ２及び／またはＲ１２が、＝ＣＨ−ＲＤである場合、各基は、独立して以下に示した配置のいずれかを有してよい。
いくつかの実施形態では、＝ＣＨ−ＲＤが、配置（Ｉ）である。 In some embodiments, when R 2 and / or R 12 is ═CH—R D , each group may independently have any of the configurations shown below.
In some embodiments, ═CH—R D is configuration (I).

いくつかの実施形態では、Ｒ″が、Ｃ３アルキレン基またはＣ５アルキレン基である。 In some embodiments, R ″ is a C 3 alkylene group or a C 5 alkylene group.

いくつかの実施形態では、ＡＤＣの例示的ＰＢＤ二量体成分が、式Ａ（Ｉ）の構造を有する。
Ａ（Ｉ）；
式中、ｎが０または１である。 In some embodiments, an exemplary PBD dimer component of the ADC has the structure of formula A (I).
A (I);
In the formula, n is 0 or 1.

いくつかの実施形態では、ＡＤＣの例示的ＰＢＤ二量体成分が、式Ａ（ＩＩ）の構造を有する。
Ａ（ＩＩ）；
式中、ｎが０または１である。 In some embodiments, an exemplary PBD dimer component of the ADC has the structure of formula A (II).
A (II);
In the formula, n is 0 or 1.

いくつかの実施形態では、ＡＤＣの例示的ＰＢＤ二量体成分が、式Ａ（ＩＩＩ）の構造を有する。
Ａ（ＩＩＩ）；
式中、ＲＥ及びＲＥ″それぞれが、ＨまたはＲＤから独立して選択され、ＲＤが、前記のとおり定義される；及び
式中、ｎが０または１である。 In some embodiments, an exemplary PBD dimer component of the ADC has the structure of formula A (III).
A (III);
Wherein R E and R E ″ are each independently selected from H or R D , R D is defined as above; and, where n is 0 or 1.

いくつかの実施形態では、ｎが、０である。いくつかの実施形態では、ｎが、１である。いくつかの実施形態では、ＲＥ及び／またはＲＥ″が、Ｈである。いくつかの実施形態では、ＲＥ及びＲＥ″が、Ｈである。いくつかの実施形態では、ＲＥ及びＲＥ″が、ＲＤであり、ＲＤが、任意で置換Ｃ１−１２アルキルである。いくつかの実施形態では、ＲＥ及びＲＥ″が、ＲＤであり、ＲＤが、メチルである。 In some embodiments, n is 0. In some embodiments, n is 1. In some embodiments, R E and / or R E ″ are H. In some embodiments, R E and R E ″ are H. In some embodiments, R E and R E ″ are R D and R D is optionally substituted C 1-12 alkyl. In some embodiments, R E and R E ″ are R D and R D is methyl.

いくつかの実施形態では、ＡＤＣの例示的ＰＢＤ二量体成分が、式Ａ（ＩＶ）の構造を有する。
Ａ（ＩＶ）；
式中、Ａｒ１及びＡｒ２それぞれが、独立して任意で置換Ｃ５−２０アリールである；Ａｒ１及びＡｒ２は、同じものまたは異なるものとしてよい；及び
式中、ｎが０または１である。 In some embodiments, an exemplary PBD dimer component of the ADC has a structure of formula A (IV).
A (IV);
Wherein Ar 1 and Ar 2 are each independently optionally substituted C 5-20 aryl; Ar 1 and Ar 2 may be the same or different; and wherein n is 0 or 1 is there.

いくつかの実施形態では、ＡＤＣの例示的ＰＢＤ二量体成分が、式Ａ（Ｖ）の構造を有する。
Ａ（Ｖ）；
式中、Ａｒ１及びＡｒ２それぞれが、独立して任意で置換Ｃ５−２０アリールである；Ａｒ１及びＡｒ２は、同じものまたは異なるものとしてよい；及び
式中、ｎが０または１である。 In some embodiments, an exemplary PBD dimer component of the ADC has the structure of formula A (V).
A (V);
Wherein Ar 1 and Ar 2 are each independently optionally substituted C 5-20 aryl; Ar 1 and Ar 2 may be the same or different; and wherein n is 0 or 1 is there.

いくつかの実施形態では、Ａｒ１及びＡｒ２それぞれが、任意で置換フェニル、フラニル、チオフェニル及びピリジルから独立して選択される。いくつかの実施形態では、Ａｒ１及びＡｒ２それぞれが、独立して任意で置換フェニルである。いくつかの実施形態では、Ａｒ１及びＡｒ２それぞれが、独立して任意で置換チエン−２−イルまたはチエン−３−イルである。いくつかの実施形態では、Ａｒ１及びＡｒ２それぞれが、独立して任意で置換キノリニルまたはイソキノリニルである。キノリニルまたはイソキノリニル基は、任意の利用可能な環位置を介してＰＢＤコアに結合することができる。例えば、キノリニルは、キノリン−２−イル、キノリン−３−イル、キノリン−４−イル、キノリン−５−イル、キノリン−６−イル、キノリン−７−イルおよびキノリン−８−イルとしてよい。いくつかの実施形態では、キノリニルが、キノリン−３−イル及びキノリン−６−イルから選択される。イソキノリニルは、イソキノリン−１−イル、イソキノリン−３−イル、イソキノリン−４−イル、イソキノリン−５−イル、イソキノリン−６−イル、イソキノリン−７−イルおよびイソキノリン−８−イルとしてよい。いくつかの実施形態では、イソキノリニルが、イソキノリン−３−イル及びイソキノリン−６−イルから選択される。 In some embodiments, each of Ar 1 and Ar 2 is independently selected from optionally substituted phenyl, furanyl, thiophenyl and pyridyl. In some embodiments, each of Ar 1 and Ar 2 is independently optionally substituted phenyl. In some embodiments, each of Ar 1 and Ar 2 is independently optionally substituted thien-2-yl or thien-3-yl. In some embodiments, each of Ar 1 and Ar 2 is independently optionally substituted quinolinyl or isoquinolinyl. A quinolinyl or isoquinolinyl group can be attached to the PBD core via any available ring position. For example, quinolinyl may be quinolin-2-yl, quinolin-3-yl, quinolin-4-yl, quinolin-5-yl, quinolin-6-yl, quinolin-7-yl and quinolin-8-yl. In some embodiments, quinolinyl is selected from quinolin-3-yl and quinolin-6-yl. Isoquinolinyl may be isoquinolin-1-yl, isoquinolin-3-yl, isoquinolin-4-yl, isoquinolin-5-yl, isoquinolin-6-yl, isoquinolin-7-yl and isoquinolin-8-yl. In some embodiments, isoquinolinyl is selected from isoquinolin-3-yl and isoquinolin-6-yl.

さらに、ＡＤＣのＰＢＤ二量体成分の非限定例が、式Ｂの成分、
Ｂ
ならびに塩及びこれらの溶媒和物であり、式中、
波線が、リンカーとの共有結合部位を示す；
ＯＨに結合した波線が、ＳまたはＲ配置を示す；
ＲＶ１及びＲＶ２が、Ｈ、メチル、エチル及びフェニル（フェニルは、任意で、特に４位置で、フルオロで置換してよい）及びＣ５−６ヘテロシクリルから独立して選択される；式中、ＲＶ１及びＲＶ２は、同じものまたは異なるものとしてよい；及び
ｎが、０または１である。 Further, a non-limiting example of the PBD dimer component of the ADC is a component of formula B,
B
And salts and solvates thereof, wherein
The wavy line indicates the site of covalent binding with the linker;
The wavy line bound to OH indicates the S or R configuration;
R V1 and R V2 are independently selected from H, methyl, ethyl and phenyl (phenyl may optionally be substituted with fluoro, especially in the 4-position) and C 5-6 heterocyclyl; R V1 and R V2 may be the same or different; and n is 0 or 1.

いくつかの実施形態では、ＲＶ１及びＲＶ２が、Ｈ、フェニル、及び４−フルオロフェニルから独立して選択される。 In some embodiments, R V1 and R V2 are independently selected from H, phenyl, and 4-fluorophenyl.

いくつかの実施形態では、Ｂ環のＮ１０イミン、Ｃ環のＣ−２エンド／エキソ位置、またはＡ環を結合するつなぎ鎖単位（以下の構造Ｃ（Ｉ）及びＣ（ＩＩ）を参照）を含む、ＰＢＤ二量体薬剤部分の種々の部位の１つで、リンカーを結合してよい。   In some embodiments, the N10 imine on the B ring, the C-2 endo / exo position on the C ring, or the tether unit connecting the A ring (see structures C (I) and C (II) below) A linker may be attached at one of the various sites of the PBD dimer drug moiety, including.

ＡＤＣのＰＢＤ二量体成分の非限定例が、式Ｃ（Ｉ）及びＣ（ＩＩ）を含む。
Ｃ（Ｉ）
Ｃ（ＩＩ） Non-limiting examples of the PBD dimer component of the ADC include formulas C (I) and C (II).
C (I)
C (II)

式Ｃ（Ｉ）及びＣ（ＩＩ）は、そのＮ１０−Ｃ１１イミン形態中に示されている。例示的ＰＢＤ薬剤部分が、また、以下の表に示したとおり、カルビノールアミン及び保護カルビノールアミン形態を含む。
式中：
Ｘが、ＣＨ２（ｎ＝１〜５）、Ｎ、またはＯである；
Ｚ及びＺ’が、ＯＲ及びＮＲ２から独立して選択され、Ｒが、１〜５個の炭素原子を含有する第一級、第二級または第三級アルキル鎖である；
Ｒ１、Ｒ’１、Ｒ２及びＲ’２それぞれが、Ｈ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ２−Ｃ８アルケニル、Ｃ２−Ｃ８アルキニル、Ｃ５−Ｃ２０アリール（を含む置換したアリール）、Ｃ５−Ｃ２０ヘテロアリール基、−ＮＨ２、−ＮＨＭｅ、−ＯＨ、及び−ＳＨから独立して選択され、いくつかの実施形態では、アルキル、アルケニル及びアルキニル鎖が、５個までの炭素原子を含む；
Ｒ３及びＲ’３が、Ｈ、ＯＲ、ＮＨＲ、及びＮＲ２から独立して選択され、Ｒが、１〜５個の炭素原子を含有する第一級、第二級または第三級アルキル鎖である；
Ｒ４及びＲ’４が、Ｈ、Ｍｅ、及びＯＭｅから独立して選択される；
Ｒ５が、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ２−Ｃ８アルケニル、Ｃ２−Ｃ８アルキニル、Ｃ５−Ｃ２０アリール（ハロ、ニトロ、シアノ、アルコキシ、アルキル、ヘテロシクリルによって置換したアリールを含む）及びＣ５−Ｃ２０ヘテロアリール基から選択され、いくつかの実施形態では、アルキル、アルケニル及びアルキニル鎖が、５個までの炭素原子を含む；
Ｒ１１が、Ｈ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、または保護基（例えば、アセチル、トリフルオロアセチル、ｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）、ベンジルオキシカルボニル（ＣＢＺ）、９−フルオレニルメチレンオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、または自壊性単位を含む部分、例えば、バリン−シトルリン−ＰＡＢ）である；
Ｒ１２が、Ｈ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、または保護基である；
Ｒ１、Ｒ’１、Ｒ２、Ｒ’２、Ｒ５、もしくはＲ１２のうちの１つの水素、またはＡ環の間の−ＯＣＨ２ＣＨ２（Ｘ）ｎＣＨ２ＣＨ２Ｏ−スペーサーの水素が、ＡＤＣのリンカーに結合される結合で置換されている。 Formulas C (I) and C (II) are shown in their N10-C11 imine form. Exemplary PBD drug moieties also include carbinolamine and protected carbinolamine forms, as shown in the table below.
In the formula:
X is, CH 2 (n = 1~5) , is N or O,;
Z and Z ′ are independently selected from OR and NR 2 and R is a primary, secondary or tertiary alkyl chain containing 1 to 5 carbon atoms;
R 1 , R ′ 1 , R 2 and R ′ 2 are each substituted with H, C 1 -C 8 alkyl, C 2 -C 8 alkenyl, C 2 -C 8 alkynyl, C 5 -C 20 aryl (including Aryl), C 5 -C 20 heteroaryl group, —NH 2 , —NHMe, —OH, and —SH, and in some embodiments, up to 5 alkyl, alkenyl, and alkynyl chains. Containing carbon atoms;
A primary, secondary or tertiary alkyl chain in which R 3 and R ′ 3 are independently selected from H, OR, NHR and NR 2 and R contains 1 to 5 carbon atoms. Is
R 4 and R ′ 4 are independently selected from H, Me, and OMe;
R 5 is C 1 -C 8 alkyl, C 2 -C 8 alkenyl, C 2 -C 8 alkynyl, C 5 -C 20 aryl (including aryl substituted by halo, nitro, cyano, alkoxy, alkyl, heterocyclyl) And in some embodiments, the alkyl, alkenyl and alkynyl chains contain up to 5 carbon atoms; and C 5 -C 20 heteroaryl groups;
R 11 is H, C 1 -C 8 alkyl, or a protecting group (eg, acetyl, trifluoroacetyl, t-butoxycarbonyl (BOC), benzyloxycarbonyl (CBZ), 9-fluorenylmethyleneoxycarbonyl (Fmoc ), Or a moiety containing self-destructing units, such as valine-citrulline-PAB);
R 12 is H, C 1 -C 8 alkyl, or a protecting group;
One of R 1 , R ′ 1 , R 2 , R ′ 2 , R 5 , or R 12 , or —OCH 2 CH 2 (X) n CH 2 CH 2 O-spacer between the A rings Hydrogen is replaced with a bond that is attached to the linker of the ADC.

ＡＤＣの例示的ＰＢＤ二量体部分としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない（波線は、リンカーとの共有結合部位を示す）。
ＰＢＤ二量体； Exemplary PBD dimer moieties of an ADC include, but are not limited to, the following (the wavy line indicates the site of covalent attachment to the linker).
PBD dimer;

さらにＰＢＤ二量体を含むＡＤＣの非限定例は、モノメチルジスルフィドＮ１０−結合ＰＢＤ（以下に示した）を抗体に結合することによって生成してよく、
、
モノメチルジスルフィドＮ１０−結合ＰＢＤ抗体−薬剤コンジュゲートが生成される。
Further non-limiting examples of ADCs containing PBD dimers may be generated by binding monomethyl disulfide N10-linked PBD (shown below) to the antibody,
,
A monomethyl disulfide N10-linked PBD antibody-drug conjugate is produced.

二量体−マレイミド−アセタールのリンカーは、酸不安定性である。   The dimer-maleimide-acetal linker is acid labile.

当技術分野で知られている方法に従って、ＰＢＤ二量体及びＰＢＤ二量体を含むＡＤＣを調製してよい。例えば、ＷＯ２００９／０１６５１６；米国特許第２００９／３０４７１０号；米国特許第２０１０／０４７２５７号；米国特許第２００９／０３６４３１号；米国特許第２０１１／０２５６１５７号；ＷＯ２０１１／１３０５９８を参照。   PBD dimers and ADCs containing PBD dimers may be prepared according to methods known in the art. See, for example, WO 2009/016516; US 2009/304710; US 2010/047257; US 2009/036431; US 2011/0256157; WO 2011/130598.

（５）アントラサイクリン
いくつかの実施形態では、ＡＤＣが、アントラサイクリンを含む。アントラサイクリンが、細胞毒性活性を示す抗生物質化合物である。特定の理論によって束縛されることを意図しないが、研究では、アントラサイクリンが、１）薬剤分子を細胞のＤＮＡへ挿入し、これにより、ＤＮＡ−依存性核酸合成を抑制すること；２）遊離ラジカルの薬剤によって生成し、その後、細胞マクロ分子と反応させ、細胞を損傷させること、及び／または３）薬剤分子の細胞膜との相互作用を含む、多くのさまざまな機序によって細胞を殺すように作用する可能性があることを示している（例えば、Ｃ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎら，「Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ａｎｄ Ｓｔｏｒａｇｅ Ｏｆ Ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅ Ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｌｅｕｋｅｍｉａ」 ｉｎ Ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ；Ｎ．Ｒ．Ｂａｃｈｕｒ，「Ｆｒｅｅ ＲａｄｉｃａｌＤａｍａｇｅ」ｉｄ．ａｔ ｐｐ．９７−１０２を参照）。アントラサイクリンは、その細胞毒性の可能性のために、多くの癌、例えば、白血病、乳癌腫、肺癌腫、卵巣腺癌及び肉腫の治療に用いられている（例えば、Ｐ．Ｈ−Ｗｉｅｒｎｉｋ，ｉｎ Ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｓｔａｔｕｓ Ａｎｄ ＮｅｗＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｐ１１を参照）。 (5) Anthracyclines In some embodiments, the ADC comprises an anthracycline. Anthracyclines are antibiotic compounds that exhibit cytotoxic activity. While not intending to be bound by any particular theory, the study shows that anthracyclines are: 1) inserting drug molecules into cellular DNA, thereby inhibiting DNA-dependent nucleic acid synthesis; 2) free radicals Acts by killing cells by many different mechanisms, including the subsequent production of the drug and then reacting with cellular macromolecules to damage cells and / or the interaction of drug molecules with the cell membrane (For example, C. Peterson et al., “Transport And Storage Of Anthropocline In Experiential Systems And Human Leukemia A” N. R. Bachur, “Free RadialDamage” id.at pp. 97-102). Anthracyclines are used in the treatment of many cancers, such as leukemia, breast cancer, lung carcinoma, ovarian adenocarcinoma and sarcoma, due to their cytotoxic potential (eg, PH Wiernik, in Anthracycline: See Current Status And New Developments p11).

アントラサイクリンの非限定例としては、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ダウノマイシン、ネモルビシン、及びこれらの誘導体が挙げられる。ダウノルピシン及びドキソルビシンのイムノコンジュゲート及びプロドラッグが、調製され、研究されている（Ｋｒａｔｚら（２００６）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１３：４７７−５２３；Ｊｅｆｆｒｅｙら（２００６）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ１６：３５８−３６２；Ｔｏｒｇｏｖら（２００５）Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１６：７１７−７２１；Ｎａｇｙら（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９７：８２９−８３４；Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋら（２００２）Ｂｉｏｏｒｇ．＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ１２：１５２９−１５３２；Ｋｉｎｇら（２００２）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４５：４３３６−４３４３；ＥＰ０３２８１４７；米国特許第６６３０５７９号）。抗体−薬剤コンジュゲートＢＲ９６−ドキソルビシンは、腫瘍−関連抗原ルイス−Ｙと特異的に反応し、第Ｉ相試験及び第ＩＩ相試験で評価されている（Ｓａｌｅｈら（２０００）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ１８：２２８２−２２９２；Ａｊａｎｉら（２０００）Ｃａｎｃｅｒ Ｊｏｕｒ．６：７８−８１；Ｔｏｌｃｈｅｒら（１９９９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ１７：４７８−４８４）。   Non-limiting examples of anthracyclines include doxorubicin, epirubicin, idarubicin, daunomycin, nemorubicin, and derivatives thereof. Immunoconjugates and prodrugs of daunorubicin and doxorubicin have been prepared and studied (Kratz et al. (2006) Current Med. Chem. 13: 477-523; Jeffrey et al. (2006) Bioorganic & Med. Chem. Letters 16: 358-362. Torgov et al. (2005) Bioconj.Chem.16: 717-721; Nagy et al. (2000) Proc.Natl.Acad.Sci.USA97: 829-834; Dubowchik et al. (2002) Bioorg. & Med.Chem. King et al. (2002) J. Med. Chem. 45: 4336-4343; ). The antibody-drug conjugate BR96-doxorubicin reacts specifically with the tumor-associated antigen Lewis-Y and has been evaluated in Phase I and Phase II studies (Saleh et al. (2000) J. Clin. Oncology 18: 2282-2292; Ajani et al. (2000) Cancer Journal. 6: 78-81; Tolcher et al. (1999) J. Clin. Oncology 17: 478-484).

ＰＮＵ−１５９６８２は、ネモルビシンの強力な代謝物質（または誘導体）である（Ｑｕｉｎｔｉｅｒｉ，ら（２００５）Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ１１（４）：１６０８−１６１７）。ネモルビシンは、ドキソルビシンのグリコシドアミノ上に２−メトキシモルホリノ基を有するドキソルビシンの半合成類似体であり、肝細胞癌のための第ＩＩ／ＩＩＩ相試験（Ｓｕｎら（２００３）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ２２，Ａｂｓ１４４８；Ｑｕｉｎｔｉｅｒｉ（２００３）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４４：第１版，Ａｂｓ４６４９；Ｐａｃｃｉａｒｉｎｉら（２００６）Ｊｏｕｒ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ２４：１４１１６）を含む、臨床評価中である（Ｇｒａｎｄｉら（１９９０）Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ．Ｒｅｖ．１７：１３３；Ｒｉｐａｍｏｎｔｉら（１９９２）Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ６５：７０３；）。   PNU-159682 is a potent metabolite (or derivative) of nemorubicin (Quintieri, et al. (2005) Clinical Cancer Research 11 (4): 1608-1617). Nemorubicin is a semi-synthetic analog of doxorubicin with a 2-methoxymorpholino group on the glycoside amino of doxorubicin, a phase II / III study for hepatocellular carcinoma (Sun et al. (2003) Proceedings of the American Society for Clinical Oncology 22, Abs 1448; Quintieri (2003) Proceedings of the American Association of Cancer Research, 44: 1st edition, Abs 4649; Pacarianini et al. (2006) Jour.Clin. 1990) Cancer Treat. Rev. 17:13 ; Ripamonti et al. (1992) Brit.J.Cancer65: 703;).

ネモルビシンまたはネモルビシン誘導体を含むＡＤＣの非限定例が、式Ｉａに示されている。
式中、Ｒ１が、水素原子、ヒドロキシまたはメトキシ基であり、Ｒ２が、Ｃ１−Ｃ５アルコキシ基、またはこれらの製剤的に許容可能な塩である；
Ｌ１及びＺがともに、本明細書に記載のとおりのリンカー（Ｌ）である；
Ｔが、本明細書に記載のとおりの抗体（Ａｂ）である；及び
ｍが、１〜約２０である。いくつかの実施形態では、ｍが、１〜１０、１〜７、１〜５、または１〜４である。 A non-limiting example of an ADC comprising nemorubicin or a nemorubicin derivative is shown in Formula Ia.
In which R 1 is a hydrogen atom, a hydroxy or methoxy group, and R 2 is a C 1 -C 5 alkoxy group, or a pharmaceutically acceptable salt thereof;
L 1 and Z are both linkers (L) as described herein;
T is an antibody (Ab) as described herein; and m is 1 to about 20. In some embodiments, m is 1-10, 1-7, 1-5, or 1-4.

いくつかの実施形態では、Ｒ１及びＲ２がともに、メトキシ（−ＯＭｅ）である。 In some embodiments, R 1 and R 2 are both methoxy (—OMe).

さらに、ネモルビシンまたはネモルビシン誘導体を含むＡＤＣの非限定例が、式Ｉｂに示されている。
式中、Ｒ１が、水素原子、ヒドロキシまたはメトキシ基であり、Ｒ２が、Ｃ１−Ｃ５アルコキシ基、またはこれらの製剤的に許容可能な塩である；
Ｌ２及びＺがともに、本明細書に記載のとおりのリンカー（Ｌ）である；
Ｔが、本明細書に記載のとおりの抗体（Ａｂ）である；及び
ｍが、１〜約２０である。いくつかの実施形態では、ｍが、１〜１０、１〜７、１〜５、または１〜４である。 In addition, a non-limiting example of an ADC comprising nemorubicin or a nemorubicin derivative is shown in Formula Ib.
In which R 1 is a hydrogen atom, a hydroxy or methoxy group, and R 2 is a C 1 -C 5 alkoxy group, or a pharmaceutically acceptable salt thereof;
L 2 and Z are both linkers (L) as described herein;
T is an antibody (Ab) as described herein; and m is 1 to about 20. In some embodiments, m is 1-10, 1-7, 1-5, or 1-4.

いくつかの実施形態では、Ｒ１及びＲ２がともに、メトキシ（−ＯＭｅ）である。 In some embodiments, R 1 and R 2 are both methoxy (—OMe).

いくつかの実施形態では、ネモルビシンを含有するＡＤＣのネモルビシン成分が、ＰＮＵ−１５９６８２である。いくつかのかかる実施形態では、ＡＤＣの薬剤部分が、以下の構造のうちの１つを有してよい：
；または
；
式中、波線は、リンカー（Ｌ）への結合を示す。 In some embodiments, the nemorubicin component of the ADC containing nemorubicin is PNU-159682. In some such embodiments, the drug portion of the ADC may have one of the following structures:
Or
;
In the formula, a wavy line indicates a bond to the linker (L).

ＰＮＵ−１５９６８２を含むアントラサイクリンは、いくつかの結合部位及び本明細書に記載のリンカーを含むさまざまなリンカーを介して、抗体に結合してよい（米国特許第２０１１／００７６２８７号；ＷＯ２００９／０９９７４１；米国特許第２０１０／００３４８３７号；ＷＯ２０１０／００９１２４）。   Anthracyclines, including PNU-159682, may be conjugated to the antibody via several linkers, including several binding sites and linkers described herein (US 2011/0076287; WO 2009/099741; US 2010/0034837; WO 2010/009124).

ネモルビシン及びリンカーを含む例示的ＡＤＣとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
ＰＮＵ−１５９６８２マレイミドアセタール−Ａｂ；
ＰＮＵ−１５９６８２−マレイミド−Ａｂ。 Exemplary ADCs comprising nemorubicin and a linker include, but are not limited to:
PNU-159682 Malemidoacetal-Ab;
PNU-156982-maleimide-Ab.

ＰＮＵ−１５９６８２マレイミドアセタール−Ａｂのリンカーは、酸不安定性である。   The linker of PNU-159682 maleimidacetal-Ab is acid labile.

（６）他の薬剤部分
薬剤部分が、また、ゲルダナマイシン（Ｍａｎｄｌｅｒら（２０００）Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．９２（１９）：１５７３−１５８１；Ｍａｎｄｌｅｒら（２０００）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ１０：１０２５−１０２８；Ｍａｎｄｌｅｒら（２００２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１３：７８６−７９１）；及び、これらに限定されないが、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、（緑膿菌からの）菌体外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンチンタンパク質、洋種ヤマゴボウタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、ツルレイシ阻害剤、クルシン、クロチン、サポアオナリアオフィシナリス阻害剤、ゲロニン、マイトジェリン、レストリクトシン、フェノマイシン、ネオマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）、及びトリコテセンを含む酵素的活性毒素及びこれらのフラグメントを含む。例えば、ＷＯ９３／２１２３２を参照。 (6) Other drug moieties The drug moiety is also a geldanamycin (Mandler et al. (2000) J. Nat. Cancer Inst. 92 (19): 1573-1581; Mandler et al. (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10: 1025. Mandler et al. (2002) Bioconjugate Chem. 13: 786-791); and, but not limited to, diphtheria A chain, non-binding active fragment of diphtheria toxin, exotoxin A (from Pseudomonas aeruginosa) Chain, ricin A chain, abrin A chain, modesin A chain, alpha-sarcin, cinnabra bragili protein, diantin protein, pokeweed protein (PAPI, PAPII, and PAP-S), vine radish inhibitor, crusin, Including carotene, support A Ona rear officinalis inhibitor, gelonin, Maitojerin, restrictocin, fenofibrate hygromycin, neomycin (enomycin), and the enzymatic active toxins and fragments thereof comprising the trichothecenes. See, for example, WO 93/21232.

薬剤部分が、また、核酸分解活性を有する化合物（例えば、リボヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼ）を含む。   The drug moiety also includes a compound having nucleolytic activity (eg, ribonuclease or DNA endonuclease).

特定の実施形態では、イムノコンジュゲートが、放射性が高い原子を含んでよい。放射性結合抗体の生成のために、さまざまな放射性同位体が入手可能である。例としては、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体が挙げられる。いくつかの実施形態では、イムノコンジュゲートが、検出に用いられる場合、シンチグラフィー検査のための放射性原子、例えば、Ｔｃ９９またはＩ１２３、または核磁気共鳴（ＮＭＲ）イメージング（また、磁気共鳴イメージング、ＭＲＩとして知られる）のためのスピンラベル、例えば、ジルコニウム−８９、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガトリニウム、マンガンもしくは鉄を含んでよい。ジルコニウム−８９は、例えば、ＰＥＴイメージングのために、種々の金属キレート薬剤と錯体形成してよく、抗体に結合してよい（ＷＯ２０１１／０５６９８３）。 In certain embodiments, the immunoconjugate may comprise a highly radioactive atom. Various radioisotopes are available for the production of radioconjugated antibodies. Examples include the radioisotopes of At 211 , I 131 , I 125 , Y 90 , Re 186 , Re 188 , Sm 153 , Bi 212 , P 32 , Pb 212 and Lu. In some embodiments, when an immunoconjugate is used for detection, a radioactive atom for scintigraphic examination, eg, Tc 99 or I 123 , or nuclear magnetic resonance (NMR) imaging (also magnetic resonance imaging, Spin labels for (e.g., known as MRI), such as zirconium-89, iodine-131, indium-111, fluorine-19, carbon-13, nitrogen-15, oxygen-17, gatrinium, manganese or iron. . Zirconium-89 may be complexed with various metal chelating agents, for example for PET imaging, and may be bound to antibodies (WO2011 / 056983).

公知の方法で、イムノコンジュゲートに放射性標識または他の標識を組み入れてよい。例えば、１つ以上の水素の代わりに１つ以上のフッ素−１９原子を含む好適なアミノ酸前駆体を用いて、ペプチドを生合成してよい、または化学合成してよい。いくつかの実施形態では、抗体中のシステイン残基を介して、標識、例えば、Ｔｃ９９、Ｉ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８及びＩｎ１１１を結合することができる。いくつかの実施形態では、抗体のリジン残基を介して、イットリウム−９０を結合することができる。いくつかの実施形態では、ＩＯＤＯＧＥＮ方法（Ｆｒａｋｅｒら（１９７８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．８０：４９−５７）を用いて、ヨウ素−１２３を組み入れることができる。「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ」（Ｃｈａｔａｌ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ１９８９）が、特定の他の方法を記載している。 Radiolabels or other labels may be incorporated into the immunoconjugate in a known manner. For example, a peptide may be biosynthesized or chemically synthesized using a suitable amino acid precursor containing one or more fluorine-19 atoms instead of one or more hydrogens. In some embodiments, labels such as Tc 99 , I 123 , Re 186 , Re 188 and In 111 can be attached via cysteine residues in the antibody. In some embodiments, yttrium-90 can be attached via a lysine residue of the antibody. In some embodiments, iodine-123 can be incorporated using the IODOGEN method (Fraker et al. (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57). “Monoclonal Antibodies in Immunoscinography” (Chatal, CRC Press 1989) describes certain other methods.

特定の実施形態では、イムノコンジュゲートが、プロドラッグ−活性化酵素に結合する抗体を含んでよい。いくつかのかかる実施形態では、プロドラッグ−活性化酵素が、プロドラッグ（例えば、ペプチジル化学療法薬、ＷＯ８１／０１１４５を参照）を活性薬剤、例えば、抗癌薬剤に変換する。いくつかの実施形態では、かかるイムノコンジュゲートが、抗体依存性酵素媒介プロドラッグ治療（「ＡＤＥＰＴ」）に有用である。抗体に結合してよい酵素としては、ホスフェート含有プロドラッグを遊離薬剤に変換するのに有用である、アルカリホスファターゼ；スルフェート含有プロドラッグを遊離薬剤に変換するのに有用である、アリールスルファターゼ；非毒性５−フルオロシトシンを抗癌薬剤、５−フルオロウラシルに変換するのに有用である、シトシンデアミナーゼ；ペプチド含有プロドラッグを遊離薬剤に変換するのに有用である、プロテアーゼ、例えば、セラチアプロテアーゼ、サーモリシン、ズブチリシン、カルボキシペプチダーゼ及びカテプシン（例えば、カテプシンＢ及びＬ）；Ｄ−アミノ酸置換基を含有するプロドラッグを変換するのに有用である、Ｄ−アラニルカルボキシペプチダーゼ；グリコシル化プロドラッグを遊離薬剤に変換するのに有用である、炭水化物分解酵素、例えば、β−ガラクトシダーゼ及びノイラミニダーゼ；β−ラクタムにより誘導体化された薬剤を遊離薬剤に変換するのに有用である、β−ラクタマーゼ；及び、フェノキシアセチルまたはフェニルアセチル基、それぞれによりそのアミン窒素で誘導体化された薬剤を遊離薬剤に変換するのに有用である、ペニシリンアミダーゼ、例えば、ペニシリンＶアミダーゼ及びペニシリンＧアミダーゼが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、当技術分野でよく知られている遺伝子組換えＤＮＡ技術によって、抗体に酵素を共有結合してよい。例えば、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ３１２：６０４−６０８（１９８４）を参照。   In certain embodiments, the immunoconjugate may comprise an antibody that binds to a prodrug-activating enzyme. In some such embodiments, a prodrug-activating enzyme converts a prodrug (eg, a peptidyl chemotherapeutic agent, see WO81 / 01145) to an active agent, eg, an anticancer drug. In some embodiments, such immunoconjugates are useful for antibody-dependent enzyme-mediated prodrug therapy (“ADEPT”). Enzymes that may be conjugated to antibodies include alkaline phosphatases that are useful for converting phosphate-containing prodrugs to free drugs; aryl sulfatases that are useful for converting sulfate-containing prodrugs to free drugs; non-toxic Useful for converting 5-fluorocytosine to the anticancer drug, 5-fluorouracil, cytosine deaminase; useful for converting peptide-containing prodrugs to free drugs, proteases such as serratia protease, thermolysin, subtilisin Carboxypeptidases and cathepsins (eg, cathepsins B and L); D-alanyl carboxypeptidases useful for converting prodrugs containing D-amino acid substituents; converting glycosylated prodrugs to free drugs To have Carbohydrate-degrading enzymes, such as β-galactosidase and neuraminidase; β-lactamases useful for converting drugs derivatized with β-lactams to free drugs; and phenoxyacetyl or phenylacetyl groups, respectively Include, but are not limited to, penicillin amidases, such as penicillin V amidase and penicillin G amidase, that are useful for converting drugs derivatized with the amine nitrogen into free drugs. In some embodiments, the enzyme may be covalently linked to the antibody by recombinant DNA techniques well known in the art. See, for example, Neuberger et al., Nature 312: 604-608 (1984).

ｃ）薬剤負荷
薬剤負荷は、式Ｉの分子中の１抗体当たりの薬剤部分の平均数ｐによって表される。薬剤負荷の範囲は、１抗体当たり、１〜２０の薬剤部分（Ｄ）としてよい。式ＩのＡＤＣが、薬剤部分の範囲１〜２０で結合された抗体の集合を含む。結合反応によるＡＤＣの調製での１抗体当たりの薬剤部分の平均数は、従来の手段、例えば、質量分析、ＥＬＩＳＡアッセイ、及びＨＰＬＣによって特徴づけることができる。また、ｐによるＡＤＣの量的分布を測定してよい。いくつかの例では、ｐが他の薬剤負荷によるＡＤＣからの特定の値である均質なＡＤＣの分離、精製、及び特性指摘は、逆相ＨＰＬＣまたは泳動などの手段によって実現することができる。 c) Drug loading Drug loading is represented by the average number p of drug moieties per antibody in the molecule of formula I. The range of drug loading may be 1-20 drug moieties (D) per antibody. The ADC of Formula I comprises a collection of antibodies bound in the drug moiety range 1-20. The average number of drug moieties per antibody in the preparation of ADC by binding reaction can be characterized by conventional means such as mass spectrometry, ELISA assay, and HPLC. Also, the quantitative distribution of ADC by p may be measured. In some examples, separation, purification, and characterization of homogeneous ADCs where p is a specific value from the ADC with other drug loadings can be achieved by means such as reverse phase HPLC or electrophoresis.

いくつかの抗体−薬剤コンジュゲートでは、抗体上の結合部位の数によりｐを制限することができる。例えば、結合が、前記の特定の例示的実施形態のとおり、システインチオールである場合、抗体が、唯一またはいくつかのシステインチオール基を有してよい、またはリンカーが結合する可能性がある唯一またはいくつかの十分な反応性のチオール基を有してよい。特定の実施形態では、薬剤負荷が高い、例えば、ｐが５より大きいと、特定の抗体−薬剤コンジュゲートの凝集、不溶解性、毒性、または分子透過性の損失を生じる可能性がある。特定の実施形態では、ＡＤＣの平均薬剤負荷が、１〜約８；約２〜約６；または約３〜約５の範囲である。確かに、特定のＡＤＣでは、１抗体当たりの薬剤部分の最適な割合は、８未満としてよく、約２〜約５としてよいことが示された（米国特許第７４９８２９８号）。   In some antibody-drug conjugates, p can be limited by the number of binding sites on the antibody. For example, if the linkage is a cysteine thiol, as in the specific exemplary embodiments described above, the antibody may have only one or several cysteine thiol groups, or the linker may be attached only or It may have some fully reactive thiol groups. In certain embodiments, high drug loading, eg, p greater than 5, can result in aggregation, insolubility, toxicity, or loss of molecular permeability of certain antibody-drug conjugates. In certain embodiments, the average drug load of the ADC ranges from 1 to about 8; from about 2 to about 6; or from about 3 to about 5. Indeed, it has been shown that for certain ADCs, the optimal ratio of drug moieties per antibody may be less than 8 and may be from about 2 to about 5 (US Pat. No. 7,498,298).

特定の実施形態では、薬剤部分の理論的最大値より少ないと、結合反応中に抗体に結合される。抗体が、例えば、以下に記載のとおり、薬剤−リンカー中間体またはリンカー試薬と反応しないリジン残基を含有してよい。一般に、抗体は、薬剤部分に結合する可能性がある多くの遊離及び反応性システインチオール基を含有しない；確かに、抗体中のほとんどのシステインチオール残基は、ジスルフィド架橋として存在する。特定の実施形態では、部分または全体還元条件下で、還元剤、例えば、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）またはトリカルボニルエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）で抗体を還元し、反応性システインチオール基を生成してよい。特定の実施形態では、抗体が、変性条件に供され、反応性求核基、例えば、リジンまたはシステインを現す。   In certain embodiments, less than the theoretical maximum of the drug moiety is bound to the antibody during the binding reaction. An antibody may contain a lysine residue that does not react with the drug-linker intermediate or linker reagent, eg, as described below. In general, antibodies do not contain many free and reactive cysteine thiol groups that can bind to the drug moiety; indeed, most cysteine thiol residues in antibodies exist as disulfide bridges. In certain embodiments, the antibody may be reduced with a reducing agent such as dithiothreitol (DTT) or tricarbonylethylphosphine (TCEP) under partial or total reducing conditions to produce a reactive cysteine thiol group. In certain embodiments, the antibody is subjected to denaturing conditions to reveal a reactive nucleophilic group, such as lysine or cysteine.

ＡＤＣの負荷（薬剤／抗体比）は、さまざまな方法で、例えば、（ｉ）抗体と比較して薬剤−リンカー中間生成物またはリンカー試薬の分子過剰を制限すること、（ｉｉ）結合反応時間または温度を制限すること、及び（ｉｉｉ）システインチオール修飾のための部分または制限還元条件によって制御することができる。   The loading of the ADC (drug / antibody ratio) can be varied in various ways, for example (i) limiting the molecular excess of the drug-linker intermediate product or linker reagent compared to the antibody, (ii) the binding reaction time or It can be controlled by limiting the temperature and (iii) a moiety for cysteine thiol modification or limited reducing conditions.

１つ以上の求核基が、薬剤−リンカー中間体またはリンカー試薬と反応すると、その後、得られた生成物が、ＡＤＣ化合物の抗体に結合される１つ以上の薬剤部分の分配との混合物となると理解しなければならない。１抗体当たりの薬剤の平均数は、抗体に対して特異的であり、薬剤に対して特異的であるデュアルＥＬＩＳＡ抗体アッセイによって、混合物から計算してよい。質量分析によって混合物中の個々のＡＤＣ分子を特定してよく、ＨＰＬＣ、例えば、疎水性相互作用クロマトグラフィーによって分離してよい（例えば、ＭｃＤｏｎａｇｈら（２００６）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇｒ．Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ１９（７）：２９９−３０７；Ｈａｍｂｌｅｔｔら（２００４）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１０：７０６３−７０７０；Ｈａｍｂｌｅｔｔ，Ｋ．Ｊ．，ら“Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｒｕｇ ｌｏａｄｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，ａｎｄ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉ−ＣＤ３０ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ，”Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｏ．６２４，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｍａｒｃｈ ２７−３１，２００４，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ＡＡＣＲ，Ｖｏｌｕｍｅ４５，Ｍａｒｃｈ ２００４；Ａｌｌｅｙ，Ｓ．Ｃ．，ら．“Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｔｈｅ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｒｕｇ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，”Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｏ．６２７，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｍａｒｃｈ２７−３１，２００４，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ＡＡＣＲ，Ｖｏｌｕｍｅ ４５，Ｍａｒｃｈ２００４を参照）。特定の実施形態では、電気泳動およびクロマトグラフィーによって、結合混合物から単一負荷値を有する均質なＡＤＣを分離してよい。   When one or more nucleophilic groups react with a drug-linker intermediate or linker reagent, the resulting product is then mixed with a partition of one or more drug moieties that are bound to the antibody of the ADC compound; You have to understand. The average number of drugs per antibody is specific for the antibody and may be calculated from the mixture by a dual ELISA antibody assay that is specific for the drug. Individual ADC molecules in the mixture may be identified by mass spectrometry and separated by HPLC, eg, hydrophobic interaction chromatography (eg, McDonah et al. (2006) Prot. Engr. Design & Selection 19 (7): 299- 307; Hamblett et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10: 7063-7070; Abstract No. 624, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, March 27-31, 2004, Processedings of the AACR, Volume 45, March 2004, Alley, S. C., et al. “Controlling the location of drought in training. 627, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, March 27-31, 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, March 2004). In certain embodiments, homogeneous ADCs having a single loading value may be separated from the binding mixture by electrophoresis and chromatography.

ｄ）イムノコンジュゲートを調製する特定の方法
（１）抗体の求核基を二価のリンカー試薬と反応させ、共有結合を介してＡｂ−Ｌを形成し、続いて薬剤部分Ｄと反応させること；及び（２）薬剤部分の求核基を二価のリンカー試薬と反応させ、共有結合を介してＤ−Ｌを形成し、続いて抗体の求核基と反応させることを含む、当業者に知られる有機化学反応、条件、及び試薬を用いるいくつかの経路によって、式ＩのＡＤＣを調製してよい。 d) Specific methods for preparing immunoconjugates (1) reacting the nucleophilic group of an antibody with a divalent linker reagent to form Ab-L via a covalent bond, followed by reaction with drug moiety D And (2) reacting the nucleophilic group of the drug moiety with a divalent linker reagent to form DL via a covalent bond, followed by reacting with the nucleophilic group of the antibody. ADCs of formula I may be prepared by several routes using known organic chemistry, conditions, and reagents.

抗体の求核性基としては、（ｉ）Ｎ−末端アミン基、（ｉｉ）側鎖アミン基、例えばリジン、（ｉｉｉ）側鎖チオール基、例えば、システイン、及び（ｉｖ）抗体がグリコシル化されている糖ヒドロキシルまたはアミノ基が挙げられるが、これらに限定されない。アミン、チオール、及びヒドロキシル基は、求核性であり、（ｉ）活性エステル、例えば、ＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルメート、及び酸ハロゲン化物；（ｉｉ）アルキル及びベンジルハロゲン化物、例えば、ハロアセトアミド；及び（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシル、及びマレイミド基を含むリンカー部分及びリンカー試薬上の求電子性基と反応して、共有結合を形成することができる。特定の抗体は、還元可能鎖間ジスルフィド、すなわち、システイン架橋を有する。還元剤、例えば、ＤＴＴ（ジチオトレイトール）またはトリカルボニルエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）による処理によって抗体をリンカー試薬と結合反応させてよく、その結果、抗体が、である全体的にまたは部分的に還元される。したがって、それぞれのシステイン架橋は、理論上、２つの反応性チオール求核基を形成する。リジン残基の修飾によって、例えば、２−イミノイミノチオラン（トラウト試薬）とリジン残基を反応させることによって、抗体に追加の求核基を導入することができ、その結果、アミンがチオールに変換される。また、１つ、２つ、３つ、４つ以上のシステイン残基を導入することによって（例えば、１つ以上の非天然システインアミノ酸残基を含む変異体抗体を調製することによって）、抗体に反応性チオール基を導入してよい。   Antibody nucleophilic groups include (i) N-terminal amine groups, (ii) side chain amine groups such as lysine, (iii) side chain thiol groups such as cysteine, and (iv) antibodies that are glycosylated. Non-limiting sugar hydroxyl or amino groups. Amine, thiol, and hydroxyl groups are nucleophilic and (i) active esters such as NHS esters, HOBt esters, haloformates, and acid halides; (ii) alkyl and benzyl halides such as haloacetamide; And (iii) can react with electrophilic groups on linker moieties and linker reagents containing aldehyde, ketone, carboxyl, and maleimide groups to form covalent bonds. Certain antibodies have reducible interchain disulfides, ie cysteine bridges. The antibody may be coupled to the linker reagent by treatment with a reducing agent, such as DTT (dithiothreitol) or tricarbonylethylphosphine (TCEP), so that the antibody is wholly or partially reduced. The Thus, each cysteine bridge theoretically forms two reactive thiol nucleophiles. Modification of the lysine residue can introduce additional nucleophilic groups into the antibody, for example by reacting 2-iminoiminothiolane (Trout reagent) with a lysine residue, so that the amine is attached to the thiol. Converted. Alternatively, by introducing one, two, three, four or more cysteine residues (eg by preparing a variant antibody comprising one or more unnatural cysteine amino acid residues) A reactive thiol group may be introduced.

また、リンカー試薬または薬剤上の求核基と、抗体上の求電子性基、例えば、アルデヒドまたはケトンカルボニル基の反応によって、本発明の抗体−薬剤コンジュゲートを生成してよい。リンカー試薬の有用な求核基としては、ヒドラジド、オキシム、アミノ、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、及びアリールヒドラジドが挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施形態では、抗体が、修飾され、リンカー試薬または薬剤の求核置換基と反応することができる求電子性部分が導入される。もう１つの実施形態では、リンカー試薬または薬剤部分のアミン基と反応する可能性があるアルデヒドまたはケトン基を形成するために、例えば、過ヨウ素酸酸化試薬でグリコシル化抗体の糖を酸化してよい。得られたイミンシッフ塩基は、安定した結合を形成する可能性がある、または、例えば、ボロヒドリド試薬によって還元され、安定したアミン結合を形成する可能性がある。１つの実施形態では、ガラクトースオキシダーゼまたはメタ過ヨウ素酸ナトリウムとグリコシル化抗体の炭水化物部分を反応させて、薬剤（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）の好適な基と反応することができる抗体中のカルボニル（アルデヒド及びケトン）基を生成してよい。もう１つの実施形態では、Ｎ−末端セリンまたはトレオニン残基を含有する抗体が、メタ過ヨウ素酸ナトリウムと反応することができ、その結果、最初のアミノ酸の代わりにアルデヒドが生成される（Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ＆Ｓｔｒｏｈ，（１９９２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．３：１３８−１４６；米国特許第５３６２８５２号）。かかるアルデヒドは、薬剤部分またはリンカー求核基と反応することができる。   An antibody-drug conjugate of the invention may also be generated by reaction of a nucleophilic group on a linker reagent or drug with an electrophilic group on the antibody, such as an aldehyde or ketone carbonyl group. Useful nucleophilic groups for linker reagents include, but are not limited to, hydrazide, oxime, amino, hydrazine, thiosemicarbazone, hydrazine carboxylate, and aryl hydrazide. In one embodiment, the antibody is modified to introduce an electrophilic moiety that can react with a nucleophilic substituent of a linker reagent or drug. In another embodiment, the glycosylated antibody sugar may be oxidized, for example, with a periodate oxidation reagent to form an aldehyde or ketone group that may react with the amine group of the linker reagent or drug moiety. . The resulting imine Schiff base may form a stable bond or may be reduced, for example, by a borohydride reagent to form a stable amine bond. In one embodiment, a carbonyl (aldehyde and aldehyde) in an antibody that can react galactose oxidase or sodium metaperiodate with a carbohydrate moiety of a glycosylated antibody to react with a suitable group of a drug (Hermanson, Bioconjugate Techniques). Ketone) groups may be formed. In another embodiment, an antibody containing an N-terminal serine or threonine residue can react with sodium metaperiodate, resulting in the generation of an aldehyde in place of the first amino acid (Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3: 138-146; US Pat. No. 5,362,852). Such aldehydes can react with drug moieties or linker nucleophilic groups.

薬剤部分の例示的求核基としては、（ｉ）活性エステル、例えば、ＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルメート、及び酸ハロゲン化物；（ｉｉ）アルキル及びベンジルハロゲン化物、例えば、ハロアセトアミド；（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシル、及びマレイミド基を含むリンカー部分及びリンカー試薬上の求電子性基と反応して、共有結合を形成することができる、アミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、及びアリールヒドラジド基が挙げられるが、これらに限定されない。   Exemplary nucleophilic groups of the drug moiety include (i) active esters such as NHS esters, HOBt esters, haloformates, and acid halides; (ii) alkyl and benzyl halides such as haloacetamides; (iii) aldehydes Amine, thiol, hydroxyl, hydrazide, oxime, hydrazine, thiosemicarbamate that can react with electrophilic groups on linker moieties and linker reagents, including ketone, carboxyl, and maleimide groups to form covalent bonds Zon, hydrazine carboxylate, and aryl hydrazide groups include, but are not limited to.

ＡＤＣを調製するために用いてよい架橋試薬の非限定例が、本明細書の「例示的リンカー」と表題のついたセクションに記載されている。タンパク質部分及び化学部分を含む２つの部分を結合するためのかかる架橋試薬を用いる方法が、当技術分野で知られている。いくつかの実施形態では、例えば、遺伝子組換え技術またはペプチド合成によって、抗体及び細胞毒性薬剤を含む融合タンパク質を生成してよい。遺伝子組換えＤＮＡ分子が、互いに隣接した、またはコンジュゲートの所望の特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域によって分離された、コンジュゲートの抗体及び細胞毒性部分をコードする領域を含んでよい。   Non-limiting examples of cross-linking reagents that may be used to prepare the ADC are described in the section entitled “Exemplary Linker” herein. Methods using such cross-linking reagents to join two moieties, including a protein moiety and a chemical moiety are known in the art. In some embodiments, a fusion protein comprising an antibody and a cytotoxic agent may be produced, for example, by genetic engineering techniques or peptide synthesis. The recombinant DNA molecule may include regions encoding the antibody and cytotoxic portions of the conjugate, separated by regions that encode linker peptides that are adjacent to each other or do not destroy the desired properties of the conjugate.

さらにもう１つの実施形態では、腫瘍事前標的化に利用するために「受容体」（例えば、ストレプトアビジン）に抗体を結合してよく、抗体−受容体コンジュゲートが、患者に投与され、続いて、清澄剤を用いて循環から非結合コンジュゲートを除去し、その後、細胞毒性薬剤（例えば、薬剤または放射性核種）に結合する「リガンド」（例えば、アビジン）を投与する。   In yet another embodiment, the antibody may be conjugated to a “receptor” (eg, streptavidin) for use in tumor pre-targeting, and the antibody-receptor conjugate is administered to the patient, followed by A clarifier is used to remove unbound conjugate from the circulation, followed by administration of a “ligand” (eg, avidin) that binds to a cytotoxic agent (eg, drug or radionuclide).

Ｅ．診断及び検出のための方法及び組成物
特定の実施形態では、本明細書に提供される抗ＧＰＣ３抗体のいずれかが、生体試料中のＧＰＣ３の存在を検出するのに有用である。用語「検出する」は、本明細書に用いる場合、定量的または定性的検出を包含する。「生体試料」は、例えば、細胞または組織（例えば、癌性または癌性の可能性があるリンパ系組織、例えば、リンパ球、リンパ芽球、単球、骨髄単球、及びこれらの混合物を含む生検材料）を含む。 E. Methods and compositions for diagnosis and detection In certain embodiments, any of the anti-GPC3 antibodies provided herein are useful for detecting the presence of GPC3 in a biological sample. The term “detect” as used herein includes quantitative or qualitative detection. A “biological sample” includes, for example, cells or tissues (eg, cancerous or potentially cancerous lymphoid tissues such as lymphocytes, lymphoblasts, monocytes, bone marrow monocytes, and mixtures thereof) Biopsy material).

１つの実施形態では、診断または検出の方法に用いられる抗ＧＰＣ３抗体が提供される。さらに１つの態様では、生体試料中のＧＰＣ３の存在の検出方法が提供される。特定の実施形態では、方法が、抗ＧＰＣ３抗体がＧＰＣ３に結合するのを許容する条件下で、本明細書に記載の抗ＧＰＣ３抗体と生体試料を接触させること、ならびに、複合体が生体試料中の抗ＧＰＣ３抗体及びＧＰＣ３間に、形成されるかどうかを検出することを含む。かかる方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ法としてよい。１つの実施形態では、抗ＧＰＣ３抗体が、抗ＧＰＣ３抗体による治療に適格である被験者を選択するために用いられ、例えば、ＧＰＣ３が、患者の選択のためのバイオマーカーである。さらに１つの実施形態では、生体試料が、細胞または組織である。   In one embodiment, an anti-GPC3 antibody for use in a diagnostic or detection method is provided. In yet another aspect, a method for detecting the presence of GPC3 in a biological sample is provided. In certain embodiments, the method comprises contacting the biological sample with an anti-GPC3 antibody described herein under conditions that allow the anti-GPC3 antibody to bind to GPC3, and the complex is in the biological sample. Detecting whether it is formed between the anti-GPC3 antibody and GPC3. Such a method may be an in vitro or in vivo method. In one embodiment, anti-GPC3 antibodies are used to select subjects that are eligible for treatment with anti-GPC3 antibodies, eg, GPC3 is a biomarker for patient selection. In yet another embodiment, the biological sample is a cell or tissue.

さらに１つの実施形態では、例えば、癌を診断、予測、または病期分類する、治療の好適なコースを決定する、または治療に対する癌の応答をモニタリングする目的のために、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ画像撮影によって、被験者中のＧＰＣ３−陽性癌を検出するために、抗ＧＰＣ３抗体が、ｉｎ ｖｉｖｏで用いられる。ｉｎ ｖｉｖｏ検出のための当技術分野で知られている１つの方法が、例えば、ｖａｎ Ｄｏｎｇｅｎら，Ｔｈｅ Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ１２：１３７９−１３８９（２００７）及びＶｅｒｅｌら，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４４：１２７１−１２８１（２００３）に記載されたとおり、免疫−ポジトロン放出断層撮影（免疫−ＰＥＴ）である。かかる実施形態では、被験者中のＧＰＣ３−陽性癌を検出するための方法が提供され、当該方法が、ＧＰＣ３−陽性癌を有する、または有する疑いのある被験者に標識抗ＧＰＣ３抗体を投与すること、及び被験者中の標識抗ＧＰＣ３抗体を検出することを含み、標識抗ＧＰＣ３抗体の検出は、被験者中のＧＰＣ３−陽性癌を示す。特定のかかる実施形態では、標識抗ＧＰＣ３抗体が、陽電子放出体、例えば、６８Ｇａ、１８Ｆ、６４Ｃｕ、８６Ｙ、７６Ｂｒ、８９Ｚｒ、及び１２４Ｉに結合する抗ＧＰＣ３抗体を含む。特定の実施形態では、陽電子放出体が、８９Ｚｒである。 In yet another embodiment, for example, in vivo imaging, for purposes of diagnosing, predicting, or staging cancer, determining a suitable course of treatment, or monitoring cancer response to treatment, for example. To detect GPC3-positive cancer in a subject, an anti-GPC3 antibody is used in vivo. One method known in the art for in vivo detection is described, for example, by van Dongen et al., The Oncologist 12: 1379-1389 (2007) and Verel et al., J. MoI. Nucl. Med. 44: 1271-1281 (2003). Immuno-positron emission tomography (immune-PET). In such embodiments, a method for detecting GPC3-positive cancer in a subject is provided, the method administering a labeled anti-GPC3 antibody to a subject having or suspected of having GPC3-positive cancer; and Detecting a labeled anti-GPC3 antibody in the subject, wherein the detection of the labeled anti-GPC3 antibody is indicative of a GPC3-positive cancer in the subject. In certain such embodiments, the labeled anti-GPC3 antibody comprises an anti-GPC3 antibody that binds to a positron emitter, eg, 68 Ga, 18 F, 64 Cu, 86 Y, 76 Br, 89 Zr, and 124 I. In certain embodiments, the positron emitter is 89 Zr.

さらに実施形態では、診断または検出の方法が、ＧＰＣ３の存在を試験するための生体試料に基質に固定化された第１の抗ＧＰＣ３抗体を接触させること、第２の抗ＧＰＣ３抗体に基質を暴露すること、及び第２の抗ＧＰＣ３が、生体試料中の第１の抗ＧＰＣ３抗体及びＧＰＣ３間の複合体に結合されるかどうかを検出することを含む。基質は、任意の支持培地、例えば、ガラス、金属、セラミック、ポリマービーズ、スライド、チップ、及び他の基質としてよい。特定の実施形態では、生体試料が、細胞または組織を含む。特定の実施形態では、第１または第２の抗ＧＰＣ３抗体が、本明細書に記載の抗体のいずれかである。   In further embodiments, the diagnostic or detection method comprises contacting a first anti-GPC3 antibody immobilized on a substrate with a biological sample for testing the presence of GPC3, and exposing the substrate to a second anti-GPC3 antibody. And detecting whether the second anti-GPC3 is bound to a complex between the first anti-GPC3 antibody and GPC3 in the biological sample. The substrate may be any support medium such as glass, metal, ceramic, polymer beads, slides, chips, and other substrates. In certain embodiments, the biological sample comprises cells or tissues. In certain embodiments, the first or second anti-GPC3 antibody is any of the antibodies described herein.

前記の実施形態のいずれかに従って診断または検出してよい例示的障害としては、ＧＰＣ３−陽性癌、例えば、ＧＰＣ３−陽性肝臓癌、ＧＰＣ３−陽性肝細胞癌、ＧＰＣ３−陽性膵癌、ＧＰＣ３−陽性肺癌、ＧＰＣ３−陽性結腸癌、ＧＰＣ３−陽性乳癌、ＧＰＣ３−陽性前立腺癌、ＧＰＣ３−陽性白血病、及びＧＰＣ３−陽性リンパ腫が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＧＰＣ−陽性癌が、肝臓癌である。いくつかの実施形態では、ＧＰＣ−陽性癌が、肝細胞癌である。いくつかの実施形態では、ＧＰＣ３−陽性癌が、抗ＧＰＣ３免疫組織化学（ＩＨＣ）またはｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）スコア「０」超を受けている癌であり、これは、非常に弱い、または腫瘍細胞の９０％超に染色なしに対応する。もう１つの実施形態では、ＧＰＣ３−陽性癌が、１＋、２＋または３＋レベルで、ＧＰＣ３を発現する。いくつかの実施形態では、ＧＰＣ３−陽性癌が、ＧＰＣ３ｍＲＮＡを検出する逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイに従って、ＧＰＣ３を発現する癌である。いくつかの実施形態では、ＲＴ−ＰＣＲが、定量的ＲＴ−ＰＣＲである。   Exemplary disorders that may be diagnosed or detected according to any of the above embodiments include GPC3-positive cancers, such as GPC3-positive liver cancer, GPC3-positive hepatocellular carcinoma, GPC3-positive pancreatic cancer, GPC3-positive lung cancer, Examples include, but are not limited to, GPC3-positive colon cancer, GPC3-positive breast cancer, GPC3-positive prostate cancer, GPC3-positive leukemia, and GPC3-positive lymphoma. In some embodiments, the GPC-positive cancer is liver cancer. In some embodiments, the GPC-positive cancer is hepatocellular carcinoma. In some embodiments, the GPC3-positive cancer is a cancer that has received an anti-GPC3 immunohistochemistry (IHC) or in situ hybridization (ISH) score greater than “0”, which is very weak, or Over 90% of the tumor cells correspond to no staining. In another embodiment, the GPC3-positive cancer expresses GPC3 at a 1+, 2+ or 3+ level. In some embodiments, the GPC3-positive cancer is a cancer that expresses GPC3 according to a reverse transcriptase PCR (RT-PCR) assay that detects GPC3 mRNA. In some embodiments, the RT-PCR is quantitative RT-PCR.

特定の実施形態では、標識抗ＧＰＣ３抗体が提供される。標識としては、直接に検出される標識または部分（例えば、蛍光、発色、高電子密度、化学発光、及び放射性標識）、ならびに、間接的に、例えば、酵素的反応または分子相互作用を介して検出される部分、例えば、酵素またはリガンドが挙げられるが、これらに限定されない。例示的標識としては、放射線同位体３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、及び１３１Ｉ、発蛍光団、例えば、希土キレートまたはフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ、例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘテロサイクリックオキシダーゼ、例えば、ウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ、これは色素前駆体、例えば、ＨＲＰを酸化させるために過酸化水素を用いる酵素と結合され、ラクトペルオキシダーゼ、またはミクロペルオキシダーゼ、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定した遊離ラジカルなどが挙げられるが、これらに限定されない。もう１つの実施形態では、標識が、陽電子放出体である。陽電子放出体としては、６８Ｇａ、１８Ｆ、６４Ｃｕ、８６Ｙ、７６Ｂｒ、８９Ｚｒ、及び１２４Ｉが挙げられるこれらに限定されない。特定の実施形態では、陽電子放出体が、８９Ｚｒである。 In certain embodiments, a labeled anti-GPC3 antibody is provided. Labels include labels or moieties that are detected directly (eg, fluorescent, chromogenic, high electron density, chemiluminescent, and radioactive labels) and indirectly, eg, detected through enzymatic reactions or molecular interactions Moieties, such as, but not limited to, enzymes or ligands. Exemplary labels include radioisotopes 32 P, 14 C, 125 I, 3 H, and 131 I, fluorophores such as rare earth chelates or fluorescein and its derivatives, rhodamine and its derivatives, dansyl, umbelliferone Luciferases such as firefly luciferase and bacterial luciferase (US Pat. No. 4,737,456), luciferin, 2,3-dihydrophthalazinedione, horseradish peroxidase (HRP), alkaline phosphatase, β-galactosidase, glucoamylase, Lysozyme, saccharide oxidase such as glucose oxidase, galactose oxidase, and glucose-6-phosphate dehydrogenase, heterocyclic oxidase such as uricase and xanthane Tin oxidase, which is combined with a dye precursor, eg, an enzyme that uses hydrogen peroxide to oxidize HRP, lactoperoxidase or microperoxidase, biotin / avidin, spin label, bacteriophage label, stable free radical, etc. However, it is not limited to these. In another embodiment, the label is a positron emitter. Positron emitters include, but are not limited to, 68 Ga, 18 F, 64 Cu, 86 Y, 76 Br, 89 Zr, and 124 I. In certain embodiments, the positron emitter is 89 Zr.

Ｆ．医薬製剤
本明細書に記載のとおり、抗ＧＰＣ３抗体またはイムノコンジュゲートの医薬製剤が、１つ以上の任意の製剤的に許容可能なキャリアを有し、所望の程度の純度を有するかかる抗体またはイムノコンジュゲートを混合することによって調製され（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ第１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．版（１９８０））、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で調製される。製剤的に許容可能なキャリアは、一般に用いられる用量及び濃度でレシピエントに対して毒性がなく、緩衝液、例えば、ホスフェート、シトレート、及び他の有機酸；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド；ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノ−ル；シクロヘキサノ−ル；３−ペンタノ−ル；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン；グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む単糖、二糖、及び他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール；造塩対立イオン、例えば、ナトリウム；金属複合体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；及び／または非イオン界面活性剤、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書の例示的製剤的に許容可能なキャリアが、さらに侵入型薬剤分散剤、例えば、可溶性中性−活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標），ＢａｘｔｅｒＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）を含む。ｒＨｕＰＨ２０を含む特定の例示的ｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法が、米国特許公開第２００５／０２６０１８６号及び２００６／０１０４９６８号に記載されている。１つの態様では、ｓＨＡＳＥＧＰが、１つ以上の追加のグリコサミノグリカン（ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎａｓｅｓ）、例えば、コンドロイチナーゼと混合される。 F. Pharmaceutical formulations As described herein, a pharmaceutical formulation of an anti-GPC3 antibody or immunoconjugate has one or more of any pharmaceutically acceptable carrier and has such a desired degree of purity. Prepared by mixing the conjugates (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. edition (1980)) and prepared in the form of a lyophilized formulation or an aqueous solution. Pharmaceutically acceptable carriers are not toxic to recipients at commonly used dosages and concentrations and are buffered, eg, phosphates, citrates, and other organic acids; antioxidants including ascorbic acid and methionine; Preservatives (eg, octadecyldimethylbenzylammonium chloride; hexamethonium chloride; benzalkonium chloride; benzethonium chloride; phenol, butyl or benzyl alcohol; alkyl parabens such as methyl or propyl paraben; catechol; resorcinol; cyclohexanol 3-pentanol; and m-cresol); low molecular weight (less than about 10 residues) polypeptide; protein, such as serum albumin, gelatin, or immunoglobulin; hydrophilic polymer, such as polyvinylid Pyrrolidone; amino acids such as glycine, glutamine, asparagine, histidine, arginine, or lysine; monosaccharides, disaccharides, and other carbohydrates including glucose, mannose, or dextrin; chelating agents such as EDTA; sugars such as sucrose , Mannitol, trehalose or sorbitol; salt-forming counterions such as sodium; metal complexes (eg Zn-protein complexes); and / or nonionic surfactants such as polyethylene glycol (PEG), It is not limited to these. Exemplary pharmaceutically acceptable carriers herein further include invasive drug dispersants such as soluble neutral-active hyaluronidase glycoprotein (sHASEGP), such as human soluble PH-20 hyaluronidase glycoprotein, such as rHuPH20. (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Certain exemplary sHASEGPs including rHuPH20 and methods of use are described in US Patent Publication Nos. 2005/0260186 and 2006/0104968. In one aspect, sHASEGP is mixed with one or more additional glycosaminoglycans, eg, chondroitinase.

例示的凍結乾燥抗体またはイムノコンジュゲート製剤が、米国特許第６，２６７，９５８号に記載されている。水性抗体またはイムノコンジュゲート製剤が、米国特許第６，１７１，５８６号及びＷＯ２００６／０４４９０８に記載されたものを含み、後者の製剤は、ヒスチジン−アセテート緩衝液を含む。   Exemplary lyophilized antibody or immunoconjugate formulations are described in US Pat. No. 6,267,958. Aqueous antibody or immunoconjugate formulations include those described in US Pat. No. 6,171,586 and WO 2006/044908, the latter formulation comprising histidine-acetate buffer.

本明細書の製剤は、また、治療される特定の適応症に必要な１つ以上の有効成分、好ましくは互いに有害に作用しない相補的活性を有するものを含有してよい。   The formulations herein may also contain one or more active ingredients necessary for the particular indication being treated, preferably those with complementary activities that do not adversely affect each other.

有効成分は、例えば、コアセルヴェーション技術によって、または界面重合によって調製されるマイクロカプセル中に閉じ込めてよく、例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセルであり、それぞれ、コロイド薬剤デリバリー系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノパーティクル及びナノカプセル）中またはマクロエマルジョン中に調製される。かかる技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ第１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．版（１９８０）に開示されている。   The active ingredient may be encapsulated in microcapsules prepared, for example, by coacervation technology or by interfacial polymerization, for example hydroxymethylcellulose or gelatin-microcapsules and poly- (methyl methacrylate) microcapsules, respectively Prepared in colloidal drug delivery systems (eg liposomes, albumin microspheres, microemulsions, nanoparticles and nanocapsules) or in macroemulsions. Such techniques are described in Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. et al. Edition (1980).

持続性放出調製物を調製してよい。好適な持続性放出調製物の例としては、抗体またはイムノコンジュゲートを含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、そのマトリックスは、造形品、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルの形態である。   Sustained release preparations may be prepared. Examples of suitable sustained release preparations include semi-permeable matrices of solid hydrophobic polymers containing antibodies or immunoconjugates that are in the form of shaped articles such as films or microcapsules. is there.

ｉｎ ｖｉｖｏ投与に用いられる製剤は、一般に無菌である。例えば、無菌濾過膜を介した濾過によって容易に滅菌を実施してよい。   Formulations used for in vivo administration are generally sterile. For example, sterilization may be easily performed by filtration through a sterile filtration membrane.

Ｇ．治療方法及び組成物
方法、例えば、治療方法に、本明細書に提供される抗ＧＰＣ３抗体またはイムノコンジュゲートのいずれかを用いてよい。 G. Therapeutic Methods and Compositions Any of the anti-GPC3 antibodies or immunoconjugates provided herein may be used in methods, eg, therapeutic methods.

１つの態様では、本明細書に提供される抗ＧＰＣ３抗体またはイムノコンジュゲートが、ＧＰＣ３−陽性細胞の増殖の抑制方法に用いられ、当該方法が、抗ＧＰＣ３抗体またはイムノコンジュゲートが細胞の表面上のＧＰＣ３に結合するのを許容する条件下で、抗ＧＰＣ３抗体またはイムノコンジュゲートに細胞を暴露し、これにより、細胞の増殖を抑制することを含む。特定の実施形態では、方法が、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ法である。さらに実施形態では、細胞が、リンパ球、リンパ芽球、単球、または骨髄単球細胞である。   In one aspect, an anti-GPC3 antibody or immunoconjugate provided herein is used in a method of inhibiting the growth of GPC3-positive cells, wherein the anti-GPC3 antibody or immunoconjugate is on the surface of a cell. Exposing the cell to an anti-GPC3 antibody or immunoconjugate under conditions that allow binding to the GPC3, thereby inhibiting cell proliferation. In certain embodiments, the method is an in vitro or in vivo method. In further embodiments, the cell is a lymphocyte, lymphoblast, monocyte, or bone marrow monocyte cell.

Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）から市販されているＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙを用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞増殖の抑制をアッセイしてよい。このアッセイは、代謝活性細胞の指示薬である存在するＡＴＰの定量化に基づいて培養中の生存可能細胞の数を測定する。Ｃｒｏｕｃｈら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１６０：８１−８８、米国特許第６６０２６７７号を参照。アッセイは、９６−または３８４−ウェルフォーマットで実施してよく、自動ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）に適用できるようにする。Ｃｒｅｅら（１９９５）ＡｎｔｉＣａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ ６：３９８−４０４を参照。アッセイ手順は、単一試薬（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬）を培養された細胞に直接添加することを含む。これにより、細胞リーシス及びルシフェラーゼ反応によって生じる発光シグナルの生成がもたらされる。発光シグナルは、存在するＡＴＰの量に比例し、培養に存在する生存可能細胞の数に直接比例する。データは、ルミノメーターまたはＣＣＤカメラ画像撮影装置によって記録することができる。発光アウトプットは、相対発光量（ＲＬＵ）として示される。   In vitro inhibition of cell proliferation may be assayed using the CellTiter-Glo ™ Luminescent Cell Viability Assay commercially available from Promega (Madison, Wis.). This assay measures the number of viable cells in culture based on the quantification of existing ATP, which is an indicator of metabolically active cells. Crouch et al. (1993) J. MoI. Immunol. Meth. 160: 81-88, U.S. Pat. No. 6,602,677. The assay may be performed in a 96- or 384-well format, making it applicable to automated high-throughput screening (HTS). See Cree et al. (1995) AntiCancer Drugs 6: 398-404. The assay procedure involves adding a single reagent (CellTiter-Glo® reagent) directly to the cultured cells. This results in the generation of a luminescent signal produced by cell lysis and luciferase reactions. The luminescent signal is proportional to the amount of ATP present and directly proportional to the number of viable cells present in the culture. Data can be recorded by a luminometer or CCD camera imager. The luminescence output is shown as the relative luminescence (RLU).

もう１つの態様では、薬剤として使用される抗ＧＰＣ３抗体またはイムノコンジュゲートが提供される。さらに態様では、治療方法に使用される抗ＧＰＣ３抗体またはイムノコンジュゲートが提供される。特定の実施形態では、ＧＰＣ３−陽性癌を治療するのに使用される抗ＧＰＣ３抗体またはイムノコンジュゲートが提供される。特定の実施形態では、本発明は、ＧＰＣ３−陽性癌を有する個体の治療方法に使用される抗ＧＰＣ３抗体またはイムノコンジュゲートを提供し、当該方法が、個体に有効量の抗ＧＰＣ３抗体またはイムノコンジュゲートを投与することを含む。１つのかかる実施形態では、方法が、さらに、例えば、以下に記載したとおり、有効量の少なくとも１つの追加の治療薬剤を個体に投与することを含む。   In another aspect, an anti-GPC3 antibody or immunoconjugate for use as a medicament is provided. In a further aspect, an anti-GPC3 antibody or immunoconjugate for use in a method of treatment is provided. In certain embodiments, anti-GPC3 antibodies or immunoconjugates used to treat GPC3-positive cancer are provided. In certain embodiments, the invention provides an anti-GPC3 antibody or immunoconjugate for use in a method of treating an individual having GPC3-positive cancer, wherein the method comprises an effective amount of the anti-GPC3 antibody or immunoconjugate for the individual. Including administering a gate. In one such embodiment, the method further comprises administering to the individual an effective amount of at least one additional therapeutic agent, eg, as described below.

さらに１つの態様では、薬剤の製造または調製に抗ＧＰＣ３抗体またはイムノコンジュゲートの使用のために、本発明が提供される。１つの実施形態では、薬剤が、ＧＰＣ３−陽性癌の治療用である。さらに１つの実施形態では、薬剤が、ＧＰＣ３−陽性癌の治療方法に使用するためのものであり、当該方法が、ＧＰＣ３−陽性癌を有する個体に有効量の薬剤を投与することを含む。１つのかかる実施形態では、方法が、さらに、例えば、以下に記載したとおり、有効量の少なくとも１つの追加の治療薬剤を個体に投与することを含む。   In a further aspect, the invention is provided for the use of an anti-GPC3 antibody or immunoconjugate for the manufacture or preparation of a medicament. In one embodiment, the agent is for the treatment of GPC3-positive cancer. In yet another embodiment, the agent is for use in a method of treating GPC3-positive cancer, the method comprising administering an effective amount of the agent to an individual having GPC3-positive cancer. In one such embodiment, the method further comprises administering to the individual an effective amount of at least one additional therapeutic agent, eg, as described below.

さらに１つの態様では、本発明は、ＧＰＣ３−陽性癌を治療するための方法を提供する。１つの実施形態では、方法が、かかるＧＰＣ３−陽性癌を有する個体に有効量の抗ＧＰＣ３抗体またはイムノコンジュゲートを投与することを含む。１つのかかる実施形態では、方法が、さらに、以下に記載したとおり、有効量の少なくとも１つの追加の治療薬剤を個体に投与することを含む。   In yet another aspect, the present invention provides a method for treating GPC3-positive cancer. In one embodiment, the method comprises administering an effective amount of an anti-GPC3 antibody or immunoconjugate to an individual having such GPC3-positive cancer. In one such embodiment, the method further comprises administering to the individual an effective amount of at least one additional therapeutic agent, as described below.

前記の実施形態のいずれかに従ったＧＰＣ３−陽性癌は、例えば、ＧＰＣ３−陽性肝臓癌、ＧＰＣ３−陽性肝細胞癌、ＧＰＣ３−陽性膵癌、ＧＰＣ３−陽性肺癌、ＧＰＣ３−陽性結腸癌、ＧＰＣ３−陽性乳癌、ＧＰＣ３−陽性前立腺癌、ＧＰＣ３−陽性白血病、またはＧＰＣ３−陽性リンパ腫としてよい。いくつかの実施形態では、ＧＰＣ３−陽性癌が、抗ＧＰＣ３免疫組織化学（ＩＨＣ）またはｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）スコア「０」超を受けている癌であり、これは、非常に弱い、または腫瘍細胞の９０％超に染色なしに対応する。もう１つの実施形態では、ＧＰＣ３−陽性癌が、１＋、２＋または３＋レベルで、ＧＰＣ３を発現する。いくつかの実施形態では、ＧＰＣ３−陽性癌が、ＧＰＣ３ｍＲＮＡを検出する逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイに従って、ＧＰＣ３を発現する癌である。いくつかの実施形態では、ＲＴ−ＰＣＲが、定量的ＲＴ−ＰＣＲである。   The GPC3-positive cancer according to any of the above embodiments is, for example, GPC3-positive liver cancer, GPC3-positive hepatocellular carcinoma, GPC3-positive pancreatic cancer, GPC3-positive lung cancer, GPC3-positive colon cancer, GPC3-positive It may be breast cancer, GPC3-positive prostate cancer, GPC3-positive leukemia, or GPC3-positive lymphoma. In some embodiments, the GPC3-positive cancer is a cancer that has received an anti-GPC3 immunohistochemistry (IHC) or in situ hybridization (ISH) score greater than “0”, which is very weak, or Over 90% of the tumor cells correspond to no staining. In another embodiment, the GPC3-positive cancer expresses GPC3 at a 1+, 2+ or 3+ level. In some embodiments, the GPC3-positive cancer is a cancer that expresses GPC3 according to a reverse transcriptase PCR (RT-PCR) assay that detects GPC3 mRNA. In some embodiments, the RT-PCR is quantitative RT-PCR.

前記の実施形態のいずれかに従った「個体」は、ヒトとしてよい。   An “individual” according to any of the above embodiments may be a human.

さらに１つの態様では、本発明は、例えば、前記の治療方法のいずれかに使用するために、本明細書に提供される抗ＧＰＣ３抗体またはイムノコンジュゲートのいずれかを含む医薬製剤を提供する。１つの実施形態では、医薬製剤が、本明細書に提供される抗ＧＰＣ３抗体またはイムノコンジュゲートのいずれか及び製剤的に許容可能なキャリアを含む。もう１つの実施形態では、医薬製剤が、例えば、以下に記載したとおり、本明細書に提供される抗ＧＰＣ３抗体またはイムノコンジュゲートのいずれか及び少なくとも１つの追加の治療薬剤を含む。   In a further aspect, the present invention provides a pharmaceutical formulation comprising any of the anti-GPC3 antibodies or immunoconjugates provided herein, for example, for use in any of the above therapeutic methods. In one embodiment, the pharmaceutical formulation comprises any of the anti-GPC3 antibodies or immunoconjugates provided herein and a pharmaceutically acceptable carrier. In another embodiment, the pharmaceutical formulation comprises any of the anti-GPC3 antibodies or immunoconjugates provided herein and at least one additional therapeutic agent, eg, as described below.

単独で、または他の薬剤と組み合わせて、治療に本発明の抗体またはイムノコンジュゲートを用いることができる。例えば、少なくとも１つの追加の治療薬剤とともに本発明の抗体またはイムノコンジュゲートを投与してよい。   The antibodies or immunoconjugates of the invention can be used for therapy alone or in combination with other agents. For example, an antibody or immunoconjugate of the invention may be administered with at least one additional therapeutic agent.

前記のかかる組み合わせ治療が、投与の組み合わせ（２つ以上の治療薬剤が、同じまたは別々の製剤中に含まれる）、及び別々の投与を包含し、この場合、本発明の抗体またはイムノコンジュゲートの投与は、追加の治療薬剤及び／またはアジュバントの投与の前、同時に、及び／または後に行うことができる。また、放射線治療と組み合わせて、本発明の抗体またはイムノコンジュゲートを用いることができる。   Such combination therapies include combinations of administration (two or more therapeutic agents are included in the same or separate formulations) and separate administration, in which case the antibody or immunoconjugate of the invention Administration can occur before, simultaneously with and / or after administration of the additional therapeutic agent and / or adjuvant. Also, the antibody or immunoconjugate of the present invention can be used in combination with radiation therapy.

非経口、肺内、及び鼻腔内、ならびに、局所治療に必要であれば、腫瘍内投与を含む任意の好適な手段によって、本発明の抗体またはイムノコンジュゲート（及び任意の追加の治療薬剤）を投与することができる。非経口的注入としては、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与が挙げられる。投与が、短期または長期であるかに部分的に応じて、任意の好適な経路によって、例えば、注入、例えば、静脈内または皮下注入によって投与することができる。これらに限定されないが、さまざまな時期にわたる単一または複数の投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含むさまざまな投与計画が、本明細書で検討されている。   The antibodies or immunoconjugates (and any additional therapeutic agents) of the invention may be administered by any suitable means including parenteral, intrapulmonary, and intranasal, and, if necessary for local treatment, intratumoral administration. Can be administered. Parenteral injection includes intramuscular, intravenous, intraarterial, intraperitoneal, or subcutaneous administration. Depending on whether administration is short-term or long-term, it can be administered by any suitable route, for example, by infusion, eg, intravenous or subcutaneous infusion. Various dosing regimes are discussed herein, including, but not limited to, single or multiple dosing over various periods, bolus administration, and pulse infusion.

良質の医療行為と一致する方法で、本発明の抗体またはイムノコンジュゲートが製剤化され、投薬され、投与される。この文脈で考慮される因子としては、治療する特定の障害、治療する特定の哺乳動物、個々の患者の臨床的状態、障害の原因、薬剤がデリバリーされる部位、投与の方法、投与のスケジュール、及び医師に知られる他の因子が挙げられる。抗体またはイムノコンジュゲートを必要しないが、該当する障害を予防または治療するために、任意で現在用いられる１つ以上の薬剤とともに製剤化される。かかる他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗体またはイムノコンジュゲートの量、障害または治療の型、及び前記に記載した他の因子に依存する。これらは、本明細書に記載のとおりの同じ用量及び投与経路で、または本明細書に記載の用量の約１〜９９％で、または好適であると経験的に／臨床的に決定される、任意の用量で、及び任意の経路によって、一般に用いられる。   The antibody or immunoconjugate of the invention is formulated, dosed, and administered in a manner consistent with good medical practice. Factors considered in this context include the specific disorder being treated, the particular mammal being treated, the clinical condition of the individual patient, the cause of the disorder, the site where the drug is delivered, the method of administration, the schedule of administration, And other factors known to physicians. No antibody or immunoconjugate is required, but is optionally formulated with one or more agents currently used to prevent or treat the disorder of interest. The effective amount of such other agents depends on the amount of antibody or immunoconjugate present in the formulation, the type of disorder or treatment, and other factors described above. These are empirically / clinically determined to be suitable at the same dose and route of administration as described herein, or about 1-99% of the dose described herein, or suitable, Generally used at any dose and by any route.

疾患の予防または治療のため、本発明の抗体またはイムノコンジュゲートの好適な用量（単独で、または１つ以上の他の追加の治療薬剤と組み合わせて用いられる）は、治療される疾患の型、抗体またはイムノコンジュゲートの型、疾患の重症度及び過程、抗体またはイムノコンジュゲートが予防または治療目的のために投与されるかどうか、以前の治療、患者の病歴及び抗体への反応、ならびに担当医師の自由裁量に依存する。抗体またはイムノコンジュゲートは、１回の治療または一連の治療にわたって好適に患者に投与される。疾患の型及び重症度に応じて、例えば、１回以上の別々の投与、または連続注入によるかどうかにより約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ）の抗体またはイムノコンジュゲートを患者への投与の最初の候補用量とすることができる。典型的な１日の投薬量は、前記記載の因子に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／Ｋｇまたはそれ以上の範囲とすることができる。数日間またはそれより長期にわたる繰り返し投与では、状態に応じて、疾患症状の所望の抑制が生じるまで、治療が、一般に維持される。抗体またはイムノコンジュゲートの１つの例示的用量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。このため、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ（またはこれらの任意の組み合わせ）のうちの１つ以上の用量を患者に投与してよい。断続的に、例えば、毎週または３週間ごとにかかる用量を投与してよい（例えば、患者は、約２〜約２０、または、例えば、約６の用量の抗体を受けるように）。最初に高負荷の用量を投与し、続いて、１つ以上の低用量を投与してよい。しかし、他の用量計画を有用なものとしてよい。この治療の進捗は、従来の技術及びアッセイによって容易にモニターされる。   For the prevention or treatment of disease, a suitable dose (used alone or in combination with one or more other therapeutic agents) of the antibody or immunoconjugate of the invention is the type of disease being treated, The type of antibody or immunoconjugate, severity and process of the disease, whether the antibody or immunoconjugate is administered for prophylactic or therapeutic purposes, previous treatment, patient history and response to the antibody, and physician in charge Depends on discretion. The antibody or immunoconjugate is suitably administered to the patient over a single treatment or series of treatments. Depending on the type and severity of the disease, for example, about 1 μg / kg to 15 mg / kg (eg, 0.1 mg / kg to 10 mg / kg) antibody, depending on whether it is by one or more separate doses or by continuous infusion Alternatively, the immunoconjugate can be the first candidate dose for administration to a patient. A typical daily dosage can range from about 1 μg / kg to 100 mg / Kg or more, depending on the factors described above. For repeated administrations over several days or longer, depending on the condition, the treatment is generally maintained until a desired suppression of disease symptoms occurs. One exemplary dose of antibody or immunoconjugate ranges from about 0.05 mg / kg to about 10 mg / kg. Thus, one or more doses of about 0.5 mg / kg, 2.0 mg / kg, 4.0 mg / kg or 10 mg / kg (or any combination thereof) may be administered to the patient. Intermittently, such doses may be administered, for example, every week or every 3 weeks (eg, patients receive about 2 to about 20, or for example, about 6 doses of antibody). A high load dose may be administered first, followed by one or more low doses. However, other dose schedules may be useful. The progress of this therapy is easily monitored by conventional techniques and assays.

本発明のイムノコンジュゲート及び抗ＧＰＣ３抗体の両者を用いて、前記の製剤または治療方法のいずれかを実施してよいと理解される。   It will be appreciated that either the immunoconjugate of the invention and the anti-GPC3 antibody may be used to carry out any of the above formulations or treatment methods.

Ｈ．製品
本発明のもう１つの態様では、前記に記載した障害の治療、予防及び／または診断に有用な材料を含有する製品が提供される。製品は、容器及び容器上に、または容器とともにラベルまたは添付文書を含む。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグなどが挙げられる。容器は、さまざまな材料、例えば、ガラスまたはプラスチックで形成してよい。容器は、組成物自体または障害を治療、予防及び／または診断するのに効果的なもう１つの組成物と混合される組成物を保持し、無菌アクセスポート（例えば、容器は、静脈内溶液バッグ、または皮下注入針によって貫通可能なストッパーを有するバイアルとすることができる）を有してよい。組成物中の少なくとも１つの活性薬剤は、本発明の抗体またはイムノコンジュゲートである。ラベルまたは添付文書は、組成物が、選択した状態を治療するために用いられることを示す。さらに、製品は、（ａ）本発明の抗体またはイムノコンジュゲートを含む組成物を含有する第１の容器；及び（ｂ）さらに細胞毒性またはその逆の治療薬剤を含む組成物を含有する第２の容器を含んでよい。本発明の本実施形態の製品は、さらに、特定の状態を治療するために組成物を用いることができることを示す添付文書を含んでよい。代わりに、または追加で、製品は、さらに、製剤的に許容可能な緩衝液、例えば、注入用滅菌精製水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液またはブドウ糖溶液を含む第２の（または第３の）容器を含んでよい。当該製品は、さらに、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む商業的観点及び使用者の観点から好ましい他の材料を含んでよい。 H. Products In another aspect of the present invention, products containing materials useful for the treatment, prevention and / or diagnosis of the disorders described above are provided. The product includes a label or package insert on or with the container. Suitable containers include, for example, bottles, vials, syringes, IV solution bags, and the like. The container may be formed from a variety of materials, such as glass or plastic. The container holds the composition itself or another composition that is mixed with another composition effective for treating, preventing and / or diagnosing a disorder, and a sterile access port (eg, the container is an intravenous solution bag Or a vial having a stopper pierceable by a hypodermic needle. At least one active agent in the composition is an antibody or immunoconjugate of the invention. The label or package insert indicates that the composition is used to treat the selected condition. Further, the product comprises (a) a first container containing a composition comprising an antibody or immunoconjugate of the invention; and (b) a second containing a composition further comprising a therapeutic agent that is cytotoxic or vice versa. Of containers. The product of this embodiment of the invention may further include a package insert indicating that the composition can be used to treat a particular condition. Alternatively or additionally, the product may further comprise a second (or a pharmaceutically acceptable buffer, such as a sterile purified water for injection (BWFI), phosphate buffered saline, Ringer's solution or glucose solution. A third) container may be included. The product may further include other materials preferred from a commercial and user standpoint, including other buffers, diluents, filters, needles, and syringes.

ＩＩＩ．実施例
以下は、本発明の方法及び組成物の実施例である。前記に提供した一般的説明を考慮すれば、種々の他の実施形態を実施してよいと理解される。 III. Examples The following are examples of the methods and compositions of the present invention. In view of the general description provided above, it is understood that various other embodiments may be implemented.

実施例１：ヒトＧＰＣ３発現
遺伝子発現情報を含有するプロプライエタリデータベース（ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）、Ｇｅｎｅ Ｌｏｇｉｃ Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を用いてヒトＧＰＣ３遺伝子発現を分析した。マイクロアレイプロファイルビューアを用いて、ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）データベースのグラフィカル分析を実施した。図１は、種々の組織のヒトＧＰＣ３遺伝子発現の図示である。ｙ−軸上のスケールは、ハイブリダイゼーションシグナル強度に基づく遺伝子発現レベルを示す。点が、記載した組織それぞれの名前から伸びた線の左右に現れている。線の左に現れている点は、正常組織の遺伝子発現を示し、線の右に現れている点は、腫瘍及び疾患組織の遺伝子発現を示す。図１は、正常なカウンターパートと比較して、特定の腫瘍または疾患組織のＧＰＣ３遺伝子発現の増大を示す。例えば、ＧＰＣ３が、肝臓腫瘍及び疾患組織に実質的に過剰発現している。 Example 1 Human GPC3 Expression Human GPC3 gene expression was analyzed using a proprietary database (GeneExpress®, Gene Logic Inc., Gaithersburg, MD) containing gene expression information. Graphical analysis of the GeneExpress® database was performed using a microarray profile viewer. FIG. 1 is an illustration of human GPC3 gene expression in various tissues. The scale on the y-axis indicates the gene expression level based on the hybridization signal intensity. Dots appear to the left and right of the line extending from the name of each listed organization. Points appearing to the left of the line indicate gene expression in normal tissues, and points appearing to the right of the line indicate gene expression in tumor and diseased tissues. FIG. 1 shows an increase in GPC3 gene expression in certain tumor or diseased tissues compared to normal counterparts. For example, GPC3 is substantially overexpressed in liver tumors and diseased tissues.

図２は、ＧＰＣ３が、肝細胞癌に実質的に過剰発現しており、肝硬変にいくぶん過剰発現していることを示す。ＧＰＣ３が、正常肝臓に過剰発現しておらず、種々の他の肝臓疾患にも過剰発現していない。   FIG. 2 shows that GPC3 is substantially overexpressed in hepatocellular carcinoma and somewhat overexpressed in cirrhosis. GPC3 is not overexpressed in normal liver and is not overexpressed in various other liver diseases.

また、肝細胞癌の異なるステージのｃＤＮＡ試料中で、及び、肝硬変、脂肪変性、肝炎、慢性肝炎、及び肝臓の腺腫（ＯｒｉＧｅｎｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を含む他の肝臓疾患からの試料中でｑＰＣＲによって、ＧＰＣ３の発現を測定した。ＧＰＣ３発現をＲＰＬ１９に標準化した。図３に示したとおり、ＧＰＣ３が、ステージＩＶ肝細胞癌試料中で高く発現した。また、ＧＰＣ３が、発現した１つの慢性肝炎試料で高く発現した。このアッセイを用いて、副腎、脳、子宮頸、結腸、副睾丸、食道、脂肪、心臓、小腸、頭蓋内動脈、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、リンパ球、乳腺、筋肉、鼻粘膜、視神経、卵巣、卵管、すい臓、心膜、下垂体、胎盤、前立腺、直腸、網膜、精嚢、皮膚、脊髄、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、舌、扁桃腺、気管、尿管、膀胱、子宮、虫部垂、膣、及び大静脈を含むさまざまな正常ヒト組織中に有意なＧＰＣ３発現を検出しなかった。   Also by qPCR in cDNA samples at different stages of hepatocellular carcinoma and in other liver diseases including cirrhosis, steatosis, hepatitis, chronic hepatitis, and liver adenoma (OriGene, Rockville, MD) GPC3 expression was measured. GPC3 expression was normalized to RPL19. As shown in FIG. 3, GPC3 was highly expressed in stage IV hepatocellular carcinoma samples. In addition, GPC3 was highly expressed in one chronic hepatitis sample that was expressed. Using this assay, the adrenal gland, brain, cervix, colon, epididymis, esophagus, fat, heart, small intestine, intracranial artery, kidney, liver, lung, lymph node, lymphocyte, mammary gland, muscle, nasal mucosa, optic nerve , Ovary, fallopian tube, pancreas, pericardium, pituitary, placenta, prostate, rectum, retina, seminal vesicle, skin, spinal cord, spleen, stomach, testis, thymus, thyroid, tongue, tonsils, trachea, ureter, bladder No significant GPC3 expression was detected in various normal human tissues including uterus, appendix, vagina, and vena cava.

実施例２：単クローン性抗体生成
Ａ．ＧＰＣ３細胞外ドメイン免疫処置及び抗体特性化
以下の手順を用いて、哺乳動物発現系に発現したＣ−末端Ｆｌａｇ（ＲＡＤＹＫＤＤＤＤＫ）に融合した遺伝子組換えｈｕＧＰＣ３細胞外ドメイン（ＥＣＤ、１〜５４７のアミノ酸）を有する５匹のＢａｌｂ／ｃマウスに抗原投与することによって、抗ヒト（ｈｕ）ＧＰＣ３単クローン性抗体を生成した。 Example 2: Monoclonal antibody production GPC3 extracellular domain immunization and antibody characterization Genetically modified huGPC3 extracellular domain (ECD, amino acids 1-547) fused to a C-terminal Flag (RADYKDDDDK) expressed in a mammalian expression system using the following procedure Anti-human (hu) GPC3 monoclonal antibodies were generated by challenge to 5 Balb / c mice with

陽性クローンを増殖し、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、及び免疫組織化学（ＩＨＣ）によって、ｈｕＧＰＣ３、ｃｙｎｏＧＰＣ３、及びＨｅｐＧ２細胞への結合を再スクリーニングした。抗体７Ｈ１及び４Ｇ７を含む１３の抗体を選択し、精製した。抗体７Ｈ１の重鎖及び軽鎖可変領域配列を、それぞれ配列番号：２及び３に示している。抗体４Ｇ７の重鎖及び軽鎖可変領域配列を、それぞれ配列番号：２６及び２７に示している。図４Ａ〜Ｂを参照。   Positive clones were expanded and rescreened for binding to huGPC3, cynoGPC3, and HepG2 cells by ELISA, FACS, and immunohistochemistry (IHC). Thirteen antibodies, including antibodies 7H1 and 4G7, were selected and purified. The heavy and light chain variable region sequences of antibody 7H1 are shown in SEQ ID NOs: 2 and 3, respectively. The heavy and light chain variable region sequences of antibody 4G7 are shown in SEQ ID NOs: 26 and 27, respectively. See Figures 4A-B.

ＩＨＣによって、抗体７Ｈ１が、肝膿瘍癌組織マイクロアレイ、ＪＨＨ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、及びＧＰＣ３で安定してトランスフェクトされた細胞と強く反応することがわかり、ＦＡＣＳによって、抗体７Ｈ１及び４Ｇ７が、ＧＰＣ３を発現しているＨｅｐＧ２ Ｘ１細胞及び２９３Ｓ細胞と強く反応することがわかった。図５は、抗体７Ｈ１の例示的ＦＡＣＳデータを示す。ウェスタンブロットによって、抗体７Ｈ１が、また、ヒト、シノモルグスサル、ラット、及びマウスＧＰＣ３を検出する。   IHC shows that antibody 7H1 reacts strongly with liver abscess cancer tissue microarray, JHH cells, HepG2 cells, and cells stably transfected with GPC3, and with FACS, antibodies 7H1 and 4G7 express GPC3. It was found to react strongly with the HepG2 X1 cells and 293S cells. FIG. 5 shows exemplary FACS data for antibody 7H1. By Western blot, antibody 7H1 also detects human, cynomolgus monkey, rat, and mouse GPC3.

競合アッセイを用いて、抗ＧＰＣ３抗体のエピトープビニングを実施した。Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ３８４測定器（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を用いて、ストレプトアビジンバイオセンサー上で、１０μｇ／ｍｌで、６００秒間、ビオチン化ＧＰＣ３を捕捉した。６００秒間、１０μｇ／ｍｌを添加することによって飽和までの第１の抗体の結合を実現した。５μｇ／ｍｌで、競合抗体に同じバイオセンサーを浸漬し、６００秒間、結合を測定した。第２の抗体が、飽和量の第１の抗体の存在下で結合できないのは、２つの抗体が同じエピトープビン中にあったことを示す；第２の抗体が、飽和量の第１の抗体の存在下で結合できるのは、２つの抗体が異なるエピトープビン中にあったことを示す。第１の飽和抗体として抗体７Ｈ１を用いた。第１の飽和抗体として抗体４Ｇ７を用いて次の実験を実施した。抗体７Ｈ１及び４Ｇ７が、異なるエピトープビン中にあることがわかった。   Epitope binning of the anti-GPC3 antibody was performed using a competition assay. Biotinylated GPC3 was captured at 10 μg / ml for 600 seconds on a streptavidin biosensor using an Octet RED384 instrument (ForteBio). Binding of the first antibody to saturation was achieved by adding 10 μg / ml for 600 seconds. The same biosensor was immersed in the competitive antibody at 5 μg / ml and binding was measured for 600 seconds. The inability of the second antibody to bind in the presence of a saturating amount of the first antibody indicates that the two antibodies were in the same epitope bin; the second antibody was saturating the first antibody. Can be bound in the presence of, indicating that the two antibodies were in different epitope bins. Antibody 7H1 was used as the first saturated antibody. The following experiment was performed using antibody 4G7 as the first saturated antibody. Antibodies 7H1 and 4G7 were found to be in different epitope bins.

さらに抗体７Ｈ１及び４Ｇ７のエピトープを精製するために、ヒトＧＰＣ３のＣ−末端切断構成体を生成した。ヒトＧＰＣ３のアミノ酸２５〜１３７、ヒトＧＰＣ３のアミノ酸２５〜２４７、及びヒトＧＰＣ３のアミノ酸２５〜３５８を含む、３つの異なるＣ−末端切断を生成した。３つのＣ−末端切断それぞれが、ＧＰＣＮ−末端シグナル配列（ＳＳ）及びＣ−末端グリコホスファチジルイノシトールアンカー（ＧＰＩ結合）を含んだ。図６を参照。ＦＡＣＳによって、抗体７Ｈ１が、２９３Ｓ細胞の表面上に過渡的に発現した３つ全部の構成体に結合することがわかり、また、ウェスタンブロットによって３つ全部の構成体に結合することがわかった。図６を参照。ＦＡＣＳによって、抗体４Ｇ７が、ヒトＧＰＣ３のＮ−末端（アミノ酸２５〜３５８）またはＣ−末端（アミノ酸３５９〜５６０）フラグメントへの有意な結合を示さなかった。これは、４Ｇ７のエピトープが、ヒトＧＰＣ３のアミノ酸Ｒ３５８／Ｓ３５９で、フーリン切断部位に及んでいる可能性を示唆する。図７を参照（Ｃ−末端フラグメント結合の陽性対照として、ヒトＧＰＣ３のアミノ酸５１１〜５８０に生じさせたＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ抗体１Ｇ１２を用いた）。ヒトＡ１１８Ｃシステイン−エンジニアリングＩｇＧ１及びＩｇκ不変領域（配列番号：４２及び４３）を有するキメラ抗体として抗体７Ｈ１を再配列した。   To further purify the epitopes of antibodies 7H1 and 4G7, a C-terminal truncation construct of human GPC3 was generated. Three different C-terminal truncations were generated, including amino acids 25-137 of human GPC3, amino acids 25-247 of human GPC3, and amino acids 25-358 of human GPC3. Each of the three C-terminal truncations contained a GPCN-terminal signal sequence (SS) and a C-terminal glycophosphatidylinositol anchor (GPI binding). See FIG. FACS showed that antibody 7H1 binds to all three constructs transiently expressed on the surface of 293S cells, and Western blot found to bind to all three constructs. See FIG. By FACS, antibody 4G7 did not show significant binding to the N-terminal (amino acids 25-358) or C-terminal (amino acids 359-560) fragments of human GPC3. This suggests that the 4G7 epitope may extend to the furin cleavage site at amino acid R358 / S359 of human GPC3. See FIG. 7 (Santa Cruz Biotechnology antibody 1G12 raised at amino acids 511-580 of human GPC3 was used as a positive control for C-terminal fragment binding). Antibody 7H1 was rearranged as a chimeric antibody with human A118C cysteine-engineering IgG1 and Igκ constant regions (SEQ ID NOs: 42 and 43).

Ｂ．ＧＰＣ３短縮細胞外ドメイン免疫処置及び抗体特性化
ＧＰＣＮ−末端シグナル配列（ＳＳ）及びＣ−末端グリコホスファチジルイノシトールアンカー（ＧＰＩ結合）を有するｈｕＧＰＣ３アミノ酸３５９〜５６０をコードするＤＮＡを有する５匹のＢａｌｂ／ｃマウスに抗原投与することによって、ヒトＧＰＣ３の細胞外ドメインのＣ−末端部分に対する単クローン性抗体を生成した。７週間、１週間あたり１回、流体力学的尾静脈（ＨＴＶ）注入により、５０μｇのＤＮＡ及び２．５μｇのマウスＧＭ−ＣＳＦで、マウスに抗原投与した。ＦＡＣＳによって、免疫処置に用いられる同じｈｕＧＰＣ（ａａ３５９−５６０）構成体を発現している２９３細胞への結合について、血清をスクリーニングした。融合後、１０のハイブリドーマが、ＥＬＩＳＡによって、ヒトＧＰＣ３細胞外ドメイン（アミノ酸１〜５６０）を結合した抗体を発現し、ハイブリドーマが、ＦＡＣＳによって、２９３細胞上に発現したｈｕＧＰＣ（ａａ３５９−５６０）を結合した抗体を発現した。抗体４Ａ１１及び１５Ｇ１を含む、ヒトＩｇＧ１ Ａ１１８Ｃシステインエンジニアリング重鎖及びＩｇκ軽鎖不変領域を有する３つの抗体をクローンした。抗体４Ａ１１の重鎖及び軽鎖可変領域配列を、それぞれ配列番号：１０及び１１に示している。抗体１５Ｇ１の重鎖及び軽鎖可変領域配列を、それぞれ配列番号：１８及び１９に示している。図４Ａ〜Ｂを参照。 B. GPC3 shortened extracellular domain immunization and antibody characterization 5 Balb / c with DNA encoding huGPC3 amino acids 359-560 with GPCN-terminal signal sequence (SS) and C-terminal glycophosphatidylinositol anchor (GPI binding) Monoclonal antibodies against the C-terminal part of the extracellular domain of human GPC3 were generated by antigen challenge to mice. Mice were challenged with 50 μg DNA and 2.5 μg mouse GM-CSF by hydrodynamic tail vein (HTV) injection once a week for 7 weeks. Sera were screened by FACS for binding to 293 cells expressing the same huGPC (aa359-560) construct used for immunization. After fusion, 10 hybridomas expressed an antibody bound to human GPC3 extracellular domain (amino acids 1-560) by ELISA, and the hybridoma bound huGPC (aa359-560) expressed on 293 cells by FACS. The expressed antibody was expressed. Three antibodies with human IgG1 A118C cysteine engineering heavy chain and Igκ light chain constant region, including antibodies 4A11 and 15G1, were cloned. The heavy and light chain variable region sequences of antibody 4A11 are shown in SEQ ID NOs: 10 and 11, respectively. The heavy and light chain variable region sequences of antibody 15G1 are shown in SEQ ID NOs: 18 and 19, respectively. See Figures 4A-B.

さらに抗体４Ａ１１及び１５Ｇ１のエピトープを精製するために、ｈｕＧＰＣ（ａａ３５９−５８９）のＣ−末端切断構成体を生成した。ヒトＧＰＣ３のアミノ酸３５９〜４２０、ヒトＧＰＣ３のアミノ酸３５９〜４７０、及びヒトＧＰＣ３のアミノ酸３５９〜５０９を含む、３つの異なるＮ−末端切断を生成した。３つのＣ−末端切断それぞれが、ＨＳＶＮ−末端シグナル配列（ＳＳ）及びｇＤ配列（配列番号：４１）及びＣ−末端グリコホスファチジルイノシトールアンカー（ＧＰＩ結合）を含んだ。図８を参照。２９３細胞の表面上にｈｕＧＰＣ切断構成体を発現させ、ＦＡＣＳによって抗体結合を測定した。陽性対照として抗−ｇＤを用いた。陰性対照としてベクター−トランスフェクトされた２９３細胞を用いた。抗体４Ａ１１が、ｈｕＧＰＣ（ａａ３５９−５５９）及びｈｕＧＰＣ（ａａ３５９−５０９）に結合したが、ｈｕＧＰＣ（ａａ３５９−４７０）またはｈｕＧＰＣ（ａａ３５９−４２０）に結合しなかった。これは、ヒトＧＰＣのアミノ酸４７０〜５０９内のエピトープに結合することを示す。図９を参照。抗体１５Ｇ１が、ｈｕＧＰＣ（ａａ３５９−５５９）、ｈｕＧＰＣ（ａａ３５９−５０９）、及びｈｕＧＰＣ（ａａ３５９−４７０）に結合したが、ｈｕＧＰＣ（ａａ３５９−４２０）に結合しなかった。これは、ヒトＧＰＣのアミノ酸４２０〜４７０内のエピトープに結合することを示す。図９を参照。   To further purify the epitopes of antibodies 4A11 and 15G1, a C-terminal truncation construct of huGPC (aa359-589) was generated. Three different N-terminal truncations were generated, including amino acids 359-420 of human GPC3, amino acids 359-470 of human GPC3, and amino acids 359-509 of human GPC3. Each of the three C-terminal truncations contained an HSVN-terminal signal sequence (SS) and gD sequence (SEQ ID NO: 41) and a C-terminal glycophosphatidylinositol anchor (GPI binding). See FIG. HuGPC cleavage constructs were expressed on the surface of 293 cells and antibody binding was measured by FACS. Anti-gD was used as a positive control. Vector-transfected 293 cells were used as a negative control. Antibody 4A11 bound to huGPC (aa359-559) and huGPC (aa359-509) but not to huGPC (aa359-470) or huGPC (aa359-420). This indicates that it binds to an epitope within amino acids 470-509 of human GPC. See FIG. Antibody 15G1 bound to huGPC (aa359-559), huGPC (aa359-509), and huGPC (aa359-470) but not to huGPC (aa359-420). This indicates that it binds to an epitope within amino acids 420-470 of human GPC. See FIG.

ＦＡＣＳによって、完全長Ｎ−末端ｇＤ−標識シノモルグスサルＧＰＣ３及び２９３細胞の表面上に発現した完全長Ｎ−末端ｇＤ−標識ラットＧＰＣ３への結合について、抗体１５Ｇ１及び４Ａ１１を試験した。両抗体とも、シノモルグスサルＧＰＣ３に結合した。また、１５Ｇ１は、ラットＧＰＣ３に結合したが、４Ａ１１は、結合しなかった。図１０を参照。図１１に示したとおり、１５Ｇ１エピトープは、ヒト、シノモルグスサル、アカゲザル、マウス、及びラットＧＰＣ３間で、高く保存されており、一方、４Ａ１１エピトープは、特に霊長動物及びげっ歯類動物ＧＰＣ３間のいくつかの配列変異を含有する。７Ｈ１エピトープは、また、ヒト、シノモルグスサル、アカゲザル、マウス、及びラットＧＰＣ３間で、高く保存されており、前記のとおり、抗体７Ｈ１は、ウェスタンブロットによってヒト、シノモルグスサル、ラット、及びマウスＧＰＣ３を検出する。   Antibodies 15G1 and 4A11 were tested for binding to full-length N-terminal gD-labeled rat GPC3 expressed on the surface of full-length N-terminal gD-labeled Cynomolgus monkey GPC3 and 293 cells by FACS. Both antibodies bound to Cynomolgus monkey GPC3. 15G1 bound to rat GPC3, but 4A11 did not bind. See FIG. As shown in FIG. 11, the 15G1 epitope is highly conserved among human, cynomolgus monkeys, rhesus monkeys, mice, and rat GPC3, while the 4A11 epitope is some of the primate and rodent GPC3 in particular. Of sequence variations. The 7H1 epitope is also highly conserved among human, cynomolgus monkey, rhesus monkey, mouse, and rat GPC3, and as described above, antibody 7H1 detects human, cynomolgus monkey, rat, and mouse GPC3 by Western blot.

実施例３：単クローン性抗体の内在化
Ｈｅｐ３Ｂ．２．１−７、ＨｅｐＧ２、及びＪＨＨ７細胞中で、内在化について抗体７Ｈ１、４Ｇ７、１５Ｇ１、及び４Ａ１１をアッセイした。２時間、及び２０時間、３７℃で、抗体内在化を測定した。２時間または２０時間、３７℃で、または４℃で、１時間、４μｇ／ｍｌで、抗体と細胞をインキュベートした。その後、ＰＢＳで細胞を洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで固定化し、５分間、３７℃で、０．０５％サポニンで透過化した。その後、１時間、室温で、リソソームマーカーとしての抗−ＬＡＭＰＩ抗体（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）と、細胞をインキュベートし、洗浄し、その後、１時間、室温で、抗−ヒト−Ｃｙ３及び抗−ラビット−Ａｌｅｘａ４８８とインキュベートした。細胞を洗浄し及びその後、マウント培地でマウントした。強度に基づいて視覚的に染色を定量した。 Example 3: Internalization of monoclonal antibodies Hep3B. The antibodies 7H1, 4G7, 15G1, and 4A11 were assayed for internalization in 2.1-7, HepG2, and JHH7 cells. Antibody internalization was measured at 37 ° C. for 2 hours and 20 hours. Cells were incubated with antibody at 4 μg / ml for 2 hours or 20 hours at 37 ° C. or 4 ° C. for 1 hour. The cells were then washed with PBS, fixed with 4% paraformaldehyde, and permeabilized with 0.05% saponin for 5 minutes at 37 ° C. The cells were then incubated with anti-LAMPI antibody (Sigma Aldrich) as a lysosomal marker for 1 hour at room temperature, washed, and then for 1 hour at room temperature with anti-human-Cy3 and anti-rabbit-Alexa488. Incubated. Cells were washed and then mounted with mounting medium. Staining was quantified visually based on intensity.

２時間時点で、抗体の非常に小さな内在化を観察した。２０時間時点で、それぞれの細胞株中の抗体のリソソームへの内在化の程度を表２にまとめた。
２０時間で、Ｎ−末端結合抗体７Ｈ１が、Ｃ−末端結合抗体４Ａ１１及び１５Ｇ１と異なる内在化特性を示した。アミノ酸Ｒ３５８／Ｓ３５９でフーリン切断部位にまたがるエピトープに結合すると予測される抗体４Ｇ７が、他の抗体と異なる内在化特性を示した。 At 2 hours, very little internalization of the antibody was observed. The degree of internalization of antibodies in each cell line into lysosomes at 20 hours is summarized in Table 2.
At 20 hours, the N-terminally linked antibody 7H1 showed different internalization properties than the C-terminally linked antibodies 4A11 and 15G1. Antibody 4G7, predicted to bind to an epitope spanning the furin cleavage site at amino acids R358 / S359, showed different internalization properties than other antibodies.

実施例４：ＧＰＣ３発現細胞株の遊離ネモルビシン誘導体及び遊離ピロロベンゾジアゼピンへの感受性
以下の構造を有する遊離ネモルビシン誘導体、ＰＮＵ−１５９６８２、
、
または以下の構造を有する遊離ピロロベンゾジアゼピン、ＳＧ−２０５７、
、
への感受性について、以下のとおり、種々のＧＰＣ３発現細胞株を試験した。９６−ウェルクリアボトムプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）中の５０μｌの正常成長培地で、１ウェル当たり１０００細胞でプレートした細胞を用いて、ＰＮＵ−１５９６８２またはＳＧ−２０５７の存在下で増殖を評価した。２４時間後、３連ウェルに薬剤の段階希釈液と追加の５０μｌの培地を添加した。３日または５日後，細胞Ｔｉｔｅｒ−ＧｌｏＩＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）を用いて、及びＥｎＶｉｓｉｏｎ２１０１マルチラベルリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で、細胞数を測定した。実験の結果を表３にまとめている。
表３に示したとおり、試験した全細胞株が、両薬剤に感受性である。 Example 4: Sensitivity of GPC3-expressing cell line to free nemorubicin derivative and free pyrrolobenzodiazepine Free nemorubicin derivative having the following structure, PNU-159682,
,
Or free pyrrolobenzodiazepine having the structure: SG-2057,
,
Various GPC3-expressing cell lines were tested for susceptibility to: Proliferation was assessed in the presence of PNU-159682 or SG-2057 using cells plated at 1000 cells per well with 50 μl of normal growth medium in 96-well clear bottom plates (PerkinElmer Life Sciences). After 24 hours, drug serial dilutions and an additional 50 μl of medium were added to triplicate wells. After 3 or 5 days, cell numbers were determined using the cells Titer-GloII (Promega Corp.) and with the EnVision 2101 multilabel reader (PerkinElmer). The results of the experiment are summarized in Table 3.
As shown in Table 3, all cell lines tested are sensitive to both drugs.

実施例５：抗ＧＰＣ３抗体薬剤コンジュゲートの生成
大規模抗体生成のために、ＣＨＯ細胞中で抗体を生成した。ＣＨＯ細胞中にＶＬ及びＶＨをコードするベクターをトランスフェクトし、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィーによって細胞培養培地からＩｇＧを精製した。 Example 5: Generation of anti-GPC3 antibody drug conjugates Antibodies were generated in CHO cells for large-scale antibody production. Vectors encoding VL and VH were transfected into CHO cells and IgG was purified from cell culture medium by protein A affinity chromatography.

薬剤−リンカー部分マレイミドアセタールＰＮＵ−１５９６８２（図１２Ａを参照）またはモノメチルジスルフィドＮ１０−結合ＰＢＤ（図１２Ｂを参照）に重鎖Ａ１１８Ｃ変異（７Ｈ１チオ−ＨＣＡ１１８Ｃ、４Ａ１１チオ−ＨＣＡ１１８Ｃ、１５Ｇ１チオ−ＨＣＡ１１８Ｃ）を有するキメラ７Ｈ１、４Ａ１１、または１５Ｇ１（ヒトＩｇＧ１／カッパ）を結合することによって、抗ＧＰＣ３抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）を生成した。最初に分離されたとおり、抗体中のエンジニアリングシステイン残基は、細胞チオール（例えば、グルタチオン）とジスルフィドが混合されて存在し、このため、結合に利用できない。これらの抗体の部分還元（例えば、ＤＴＴによる）、精製、及びデヒドロアスコルビン酸（ＤＨＡＡ）による再酸化により、例えば、Ｊｕｎｕｔｕｌａら（２００８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：９２５−９３２及び米国特許第２０１１／０３０１３３４号に、以前に記載されたとおり、結合に利用できる遊離システインスルフヒドリル基を有する抗体が得られる。簡潔にいうと、抗体が、薬剤−リンカー部分と混合され、薬剤−リンカー部分が、抗体の遊離システイン残基に結合される。数時間後、ＡＤＣを精製した。それぞれのＡＤＣの薬剤負荷（１抗体当たり薬剤部分の平均数）を測定し、ＰＢＤコンジュゲートでは、１．４〜１．８であり、ＰＮＵコンジュゲートでは、１．４〜１．８であった。   Drug-linker moiety maleimidacetal PNU-159682 (see FIG. 12A) or monomethyl disulfide N10-linked PBD (see FIG. 12B) with heavy chain A118C mutation (7H1 thio-HCA118C, 4A11 thio-HCA118C, 15G1 thio-HCA118C) Anti-GPC3 antibody-drug conjugates (ADCs) were generated by binding chimeric 7H1, 4A11, or 15G1 (human IgG1 / kappa) having. As initially separated, engineering cysteine residues in the antibody are present in a mixture of cellular thiols (eg, glutathione) and disulfides and are therefore not available for conjugation. Partial reduction of these antibodies (eg, by DTT), purification, and reoxidation with dehydroascorbic acid (DHAA), for example, see Junutula et al. (2008) Nat. Biotechnol. 26: 925-932 and US 2011/0101334 provide antibodies with free cysteine sulfhydryl groups available for conjugation as previously described. Briefly, the antibody is mixed with a drug-linker moiety, and the drug-linker moiety is attached to the free cysteine residue of the antibody. After several hours, the ADC was purified. The drug loading (average number of drug moieties per antibody) of each ADC was measured and was 1.4-1.8 for PBD conjugates and 1.4-1.8 for PNU conjugates. .

実施例６：ＨｅｐＧ２ Ｘ１細胞株異種移植モデルでの抗ＧＰＣ３抗体薬剤コンジュゲートの有効性
ヒトＨｅｐＧ２ Ｘ１異種移植モデルを用いて、抗ＧＰＣ３ＡＤＣの有効性を検討した。側腹部の尾の付け根にＨｅｐＧ２ Ｘ１の１０００万の細胞を雌Ｃ．Ｂ−１７ＳＣＩＤマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ、ＣＡ）それぞれに接種した。異種移植腫瘍が、１００〜３００ｍｍ３の平均腫瘍容量に達した場合（第０日と称する）、動物を無作為化によりそれぞれ７〜１０匹のマウスの群に割り付け、図１３に示した用量で、ＡＤＣの単一静脈内注入を受けさせた。全試験期間を通じて１週間に１〜２回、マウスの腫瘍及び体重を測定した。体重減少が、開始時の体重の２０％を越えた場合、マウスをすみやかに安楽死させた。腫瘍が、３０００ｍｍ３に達した、または切迫潰瘍形成の徴候を示した後に、全動物を安楽死させた。注入後の第１、７及び１４日に、ＰＫブリードによって抗体の存在を確認した。抗体４Ｇ７、７Ｈ１、及び４Ａ１１を用いて、ＦＡＣＳによって、異種移植マウスから分離されたＨｅｐＧ２ Ｘ１細胞及びＨｅｐＧ２ Ｘ１腫瘍の表面上にＧＰＣ３の発現を確認した。図１３Ａ〜Ｂを参照。 Example 6: Efficacy of anti-GPC3 antibody drug conjugate in HepG2 X1 cell line xenograft model The efficacy of anti-GPC3 ADC was examined using a human HepG2 X1 xenograft model. 10 million cells of HepG2 X1 at the base of the tail on the flank. Each of B-17 SCID mice (Charles River Laboratories; Hollister, Calif.) Was inoculated. When the xenograft tumors reached an average tumor volume of 100-300 mm 3 (referred to as day 0), the animals were randomized and assigned to groups of 7-10 mice each, at the doses shown in FIG. Received a single intravenous infusion of ADC. Mice were measured for tumor and body weight 1-2 times per week throughout the entire study period. Mice were promptly euthanized when the weight loss exceeded 20% of the starting weight. All animals were euthanized after the tumor reached 3000 mm 3 or showed signs of impending ulceration. The presence of the antibody was confirmed by PK bleed on days 1, 7 and 14 after injection. GPC3 expression was confirmed on the surface of HepG2 X1 cells and HepG2 X1 tumors isolated from xenograft mice by FACS using antibodies 4G7, 7H1, and 4A11. See Figures 13A-B.

図１４に示したとおり、７Ｈ１−ジスルフィド−ＰＢＤ（７．９８ｍｇ／ｋｇ）及び４Ａ１１ジスルフィド−ＰＢＤ（７．５１ｍｇ／ｋｇ）の両者で、実質的な腫瘍成長抑制を実現した。この実験では、ＰＮＵコンジュゲート（７Ｈ１−アセタール−ＰＮＵ及び４Ａ１１−アセタール−ＰＮＵ）の方が、有効性が低かった。   As shown in FIG. 14, both 7H1-disulfide-PBD (7.98 mg / kg) and 4A11 disulfide-PBD (7.51 mg / kg) achieved substantial tumor growth inhibition. In this experiment, PNU conjugates (7H1-acetal-PNU and 4A11-acetal-PNU) were less effective.

実施例７：ＪＨＨ７細胞株異種移植モデルでの抗ＧＰＣ３抗体薬剤コンジュゲートの有効性
ヒトＪＨＨ７異種移植モデルを用いて、抗ＧＰＣ３ＡＤＣの有効性を検討した。側腹部の尾の付け根にＪＨＨ７の３００万の細胞を雌ＮＣＲ．ヌードマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ；ＣａｍｂｒｉｄｇｅＣｉｔｙ，ＩＮ）それぞれに接種した。異種移植腫瘍が、１００〜３００ｍｍ３の平均腫瘍容量に達した場合（第０日と称する）、動物を無作為化によりそれぞれ７〜１０匹のマウスの群に割り付け、図１３に示した用量で、ＡＤＣの単一静脈内注入を受けさせた。全試験期間を通じて１週間に１〜２回、マウスの腫瘍及び体重を測定した。体重減少が、開始時の体重の２０％を越えた場合、マウスをすみやかに安楽死させた。腫瘍が、３０００ｍｍ３に達した、または切迫潰瘍形成の徴候を示した後に、全動物を安楽死させた。注入後の第１、４及び１４日に、ＰＫブリードによって抗体の存在を確認した。抗体４Ｇ７、７Ｈ１、及び４Ａ１１を用いて、ＦＡＣＳによって、異種移植マウスから分離されたＪＨＨ７細胞及びＪＨＨ７腫瘍の表面上にＧＰＣ３の発現を確認した。図１５Ａ〜Ｂを参照。 Example 7: Efficacy of anti-GPC3 antibody drug conjugate in JHH7 cell line xenograft model The efficacy of anti-GPC3 ADC was investigated using a human JHH7 xenograft model. Three million cells of JHH7 were added to female NCR. Each nude mouse (Taconic; Cambridge City, IN) was inoculated. When the xenograft tumors reached an average tumor volume of 100-300 mm 3 (referred to as day 0), the animals were randomized and assigned to groups of 7-10 mice each, at the doses shown in FIG. Received a single intravenous infusion of ADC. Mice were measured for tumor and body weight 1-2 times per week throughout the entire study period. Mice were promptly euthanized when the weight loss exceeded 20% of the starting weight. All animals were euthanized after the tumor reached 3000 mm 3 or showed signs of impending ulceration. On days 1, 4 and 14 after injection, the presence of the antibody was confirmed by PK bleed. GPC3 expression was confirmed on the surface of JHH7 cells and JHH7 tumors isolated from xenograft mice by FACS using antibodies 4G7, 7H1, and 4A11. See Figures 15A-B.

図１６に示したとおり、７Ｈ１−ジスルフィド−ＰＢＤ（７．９８ｍｇ／ｋｇ）及び４Ａ１１ジスルフィド−ＰＢＤ（７．５１ｍｇ／ｋｇ）の両者で、実質的な腫瘍成長抑制を実現した。この実験では、ＰＮＵコンジュゲート（７Ｈ１−アセタール−ＰＮＵ及び４Ａ１１−アセタール−ＰＮＵ）の方が、有効性が低かった。   As shown in FIG. 16, both 7H1-disulfide-PBD (7.98 mg / kg) and 4A11 disulfide-PBD (7.51 mg / kg) achieved substantial tumor growth inhibition. In this experiment, PNU conjugates (7H1-acetal-PNU and 4A11-acetal-PNU) were less effective.

理解を明確するため、図および実施例により前記発明の詳細を記載したが、説明および実施例が、本発明の範囲を限定するものと解釈してはならない。本明細書に記載した全特許および科学文献の開示は、全体が明確に参照として組み入れられる。
For clarity of understanding, the details of the invention have been described with reference to the drawings and examples, but the description and examples should not be construed to limit the scope of the invention. The disclosures of all patent and scientific literature described herein are expressly incorporated by reference in their entirety.

Claims (73)

ヒトＧＰＣ３を結合する分離抗体であって、前記抗体が、以下から選択されるエピトープに結合する前記分離抗体。
ａ）ヒトＧＰＣ３のアミノ酸２５〜１３７内のエピトープ；
ｂ）ヒトＧＰＣ３のアミノ酸Ｒ３５８／Ｓ３５９でフーリン切断部位にまたがるエピトープ；
ｃ）ヒトＧＰＣ３のアミノ酸４２０〜４７０内のエピトープ；及び
ｄ）ヒトＧＰＣ３のアミノ酸４７０〜５０９内のエピトープ。 An isolated antibody that binds human GPC3, wherein the antibody binds to an epitope selected from:
a) an epitope within amino acids 25-137 of human GPC3;
b) an epitope spanning the furin cleavage site at amino acids R358 / S359 of human GPC3;
c) an epitope within amino acids 420-470 of human GPC3; and d) an epitope within amino acids 470-509 of human GPC3. 前記抗体が、ヒトＧＰＣ３のアミノ酸２５〜１３７内のエピトープに結合する、請求項１に記載の抗体。   2. The antibody of claim 1, wherein the antibody binds to an epitope within amino acids 25-137 of human GPC3. 前記抗体が、シノモルグスサル、マウス、及びラットから選択される少なくとも１つの種に由来するＧＰＣ３に結合する、請求項２に記載の抗体。   3. The antibody of claim 2, wherein the antibody binds to GPC3 derived from at least one species selected from Cynomolgus monkeys, mice, and rats. 前記抗体が、シノモルグスサル、マウス、及びラットに由来するＧＰＣ３に結合する、請求項３に記載の抗体。   4. The antibody of claim 3, wherein the antibody binds to GPC3 derived from Cynomolgus monkey, mouse, and rat. 前記抗体が、配列番号：６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号：９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の抗体。   The antibody of claim 1 wherein the antibody comprises HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, and HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5. The antibody according to any one of the above. 前記抗体が、配列番号：４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び配列番号：６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の抗体。   The antibody of claim 1 wherein the antibody comprises HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. The antibody according to any one of the above. 前記抗体が、配列番号：７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号：８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号：９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の抗体。   The antibody of claim 1 wherein the antibody comprises HVR-L1, comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, and HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9. The antibody according to any one of the above. 前記抗体が、以下を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の抗体。
ａ）配列番号：２のアミノ酸配列と少なくとも９５％配列同一性を有するＶＨ配列；
ｂ）配列番号：３のアミノ酸配列と少なくとも９５％配列同一性を有するＶＬ配列；または
ｃ）（ａ）と同様のＶＨ及び（ｂ）と同様のＶＬ。 The antibody of any one of the preceding claims, wherein the antibody comprises:
a) a VH sequence having at least 95% sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
b) a VL sequence having at least 95% sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; or c) a VH similar to (a) and a VL similar to (b). 前記抗体が、以下を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の抗体。
ａ）配列番号：２のアミノ酸配列を有するＶＨ配列；
ｂ）配列番号：３のアミノ酸配列を有するＶＬ配列；
ｃ）配列番号：２のアミノ酸配列に基づくヒト化ＶＨ；
ｄ）配列番号：３のアミノ酸配列に基づくヒト化ＶＬ配列；
ｅ）（ａ）または（ｃ）と同様のＶＨ及び（ｂ）または（ｄ）と同様のＶＬ。 The antibody of any one of the preceding claims, wherein the antibody comprises:
a) a VH sequence having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
b) a VL sequence having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3;
c) humanized VH based on the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
d) a humanized VL sequence based on the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3;
e) VH similar to (a) or (c) and VL similar to (b) or (d). 前記抗体が、ヒトＧＰＣ３のアミノ酸Ｒ３５８／Ｓ３５９でフーリン切断部位にまたがるエピトープに結合する、請求項１に記載の抗体。   2. The antibody of claim 1, wherein the antibody binds to an epitope spanning the furin cleavage site at amino acids R358 / S359 of human GPC3. 前記抗体が、完全長成熟ヒトＧＰＣ３に結合するが、配列番号：１のアミノ酸２５〜３５８からなるヒトＧＰＣ３のＮ−末端フラグメントに結合せず、配列番号：１のアミノ酸３５９〜５６０またはアミノ酸３５９〜５８０からなるヒトＧＰＣ３のＣ−末端フラグメントに結合しない、請求項１０に記載の抗体。   The antibody binds to full-length mature human GPC3 but does not bind to the N-terminal fragment of human GPC3 consisting of amino acids 25 to 358 of SEQ ID NO: 1, amino acids 359 to 560 of SEQ ID NO: 1 or amino acids 359 to 11. The antibody of claim 10, wherein the antibody does not bind to a C-terminal fragment of human GPC3 consisting of 580. 前記抗体が、配列番号：３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号：３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び配列番号：２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２を含む、請求項１、１０、及び１１のいずれか１項に記載の抗体。   The antibody comprises HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30, HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33, and HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29. The antibody according to any one of 10 and 11. 前記抗体が、配列番号：２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号：２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び配列番号：３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む、請求項１、１０、１１、及び１２のいずれか１項に記載の抗体。   The antibody comprises HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28, HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29, and HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30. The antibody according to any one of 10, 11, and 12. 前記抗体が、配列番号：３１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号：３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号：３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、請求項１及び１０から１３のいずれか１項に記載の抗体。   The antibody comprises HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31, HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 32, and HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33. 14. The antibody according to any one of 10 to 13. 前記抗体が、以下を含む、請求項１及び１０から１４のいずれか１項に記載の抗体。
ａ）配列番号：２６のアミノ酸配列と少なくとも９５％配列同一性を有するＶＨ配列；
ｂ）配列番号：２７のアミノ酸配列と少なくとも９５％配列同一性を有するＶＬ配列；または
ｃ）（ａ）と同様のＶＨ及び（ｂ）と同様のＶＬ。 15. The antibody of any one of claims 1 and 10 to 14, wherein the antibody comprises:
a) a VH sequence having at least 95% sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26;
b) a VL sequence having at least 95% sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27; or c) a VH similar to (a) and a VL similar to (b). 前記抗体が、以下を含む、請求項１及び１０から１５のいずれか１項に記載の抗体。
ａ）配列番号：２６のアミノ酸配列を有するＶＨ配列；
ｂ）配列番号：２７のアミノ酸配列を有するＶＬ配列；
ｃ）配列番号：２６のアミノ酸配列に基づくヒト化ＶＨ；
ｄ）配列番号：２７のアミノ酸配列に基づくヒト化ＶＬ配列；または
ｅ）（ａ）または（ｃ）と同様のＶＨ及び（ｂ）または（ｄ）と同様のＶＬ。 16. The antibody of any one of claims 1 and 10 to 15, wherein the antibody comprises:
a) a VH sequence having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26;
b) a VL sequence having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27;
c) a humanized VH based on the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26;
d) a humanized VL sequence based on the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27; or e) a VH similar to (a) or (c) and a VL similar to (b) or (d). 前記抗体が、ヒトＧＰＣ３のアミノ酸４２０〜４７０内のエピトープに結合する、請求項１に記載の抗体。   2. The antibody of claim 1, wherein the antibody binds to an epitope within amino acids 420-470 of human GPC3. 前記抗体が、シノモルグスサル、アカゲザル、マウス、及びラットから選択される少なくとも１つの種に由来するＧＰＣ３に結合する、請求項１または請求項１７に記載の抗体。   18. The antibody of claim 1 or claim 17, wherein the antibody binds to GPC3 derived from at least one species selected from Cynomolgus monkeys, rhesus monkeys, mice, and rats. 前記抗体が、シノモルグスサル、アカゲザル、マウス、及びラットに由来するＧＰＣ３に結合する、請求項１８に記載の抗体。   19. The antibody of claim 18, wherein the antibody binds to GPC3 derived from cynomolgus monkeys, rhesus monkeys, mice, and rats. 前記抗体が、配列番号：２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号：２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び配列番号：２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２を含む、請求項１及び１７から１９のいずれか１項に記載の抗体。   The antibody comprises HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22, HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25, and HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21. The antibody according to any one of 17 to 19. 前記抗体が、配列番号：２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号：２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び配列番号：２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む、請求項１及び１７から２０のいずれか１項に記載の抗体。   The antibody comprises HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20, HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, and HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22. 21. The antibody according to any one of 17 to 20. 前記抗体が、配列番号：２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号：２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号：２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、請求項１及び１７から２１のいずれか１項に記載の抗体。   The antibody comprises HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23, HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24, and HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25. The antibody according to any one of 17 to 21. 前記抗体が、以下を含む、請求項１及び１７から２２のいずれか１項に記載の抗体。
ａ）配列番号：１８のアミノ酸配列と少なくとも９５％配列同一性を有するＶＨ配列；
ｂ）配列番号：１９のアミノ酸配列と少なくとも９５％配列同一性を有するＶＬ配列；または
ｃ）（ａ）と同様のＶＨ及び（ｂ）と同様のＶＬ。 23. The antibody of any one of claims 1 and 17 to 22, wherein the antibody comprises:
a) a VH sequence having at least 95% sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18;
b) a VL sequence having at least 95% sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19; or c) a VH similar to (a) and a VL similar to (b). 前記抗体が、以下を含む、請求項１及び１７から２３のいずれか１項に記載の抗体。
ａ）配列番号：１８のアミノ酸配列を有するＶＨ配列；
ｂ）配列番号：１９のアミノ酸配列を有するＶＬ配列；
ｃ）配列番号：１８のアミノ酸配列に基づくヒト化ＶＨ；
ｄ）配列番号：１９のアミノ酸配列に基づくヒト化ＶＬ配列；または
ｅ）（ａ）または（ｃ）と同様のＶＨ及び（ｂ）または（ｄ）と同様のＶＬ。 24. The antibody of any one of claims 1 and 17 to 23, wherein the antibody comprises:
a) a VH sequence having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18;
b) a VL sequence having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19;
c) a humanized VH based on the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18;
d) a humanized VL sequence based on the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19; or e) a VH similar to (a) or (c) and a VL similar to (b) or (d). 前記抗体が、ヒトＧＰＣ３のアミノ酸４７０〜５０９内のエピトープに結合する、請求項１に記載の抗体。   2. The antibody of claim 1, wherein the antibody binds to an epitope within amino acids 470-509 of human GPC3. 前記抗体が、シノモルグスサルＧＰＣ３に結合する、請求項１または請求項２５に記載の抗体。   26. The antibody of claim 1 or claim 25, wherein the antibody binds to Cynomolgus monkey GPC3. 前記抗体が、ラットＧＰＣ３に結合しない、請求項１、２５、及び２６のいずれか１項に記載の抗体。   27. The antibody of any one of claims 1, 25, and 26, wherein the antibody does not bind to rat GPC3. 前記抗体が、配列番号：１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号：１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び配列番号：１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２を含む、請求項１及び２５から２７のいずれか１項に記載の抗体。   The antibody comprises HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, and HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13. 28. The antibody according to any one of 25 to 27. 前記抗体が、配列番号：１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号：１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び配列番号：１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む、請求項１及び２５から２８のいずれか１項に記載の抗体。   The antibody comprises HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, and HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14. 29. The antibody according to any one of 25 to 28. 前記抗体が、配列番号：１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号：１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号：１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、請求項１及び２５から２９のいずれか１項に記載の抗体。   The antibody comprises HVR-L1, comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, HVR-L2, comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, and HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17. 30. The antibody according to any one of 25 to 29. 前記抗体が、以下を含む、請求項１及び２５から３０のいずれか１項に記載の抗体。
ａ）配列番号：１０のアミノ酸配列と少なくとも９５％配列同一性を有するＶＨ配列；
ｂ）配列番号：１１のアミノ酸配列と少なくとも９５％配列同一性を有するＶＬ配列；または
ｃ）（ａ）と同様のＶＨ及び（ｂ）と同様のＶＬ。 31. The antibody of any one of claims 1 and 25 to 30, wherein the antibody comprises:
a) a VH sequence having at least 95% sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10;
b) a VL sequence having at least 95% sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11; or c) a VH similar to (a) and a VL similar to (b). 前記抗体が、以下を含む、請求項１及び２５から３１のいずれか１項に記載の抗体。
ａ）配列番号：１０のアミノ酸配列を有するＶＨ配列；
ｂ）配列番号：１１のアミノ酸配列を有するＶＬ配列；
ｃ）配列番号：１０のアミノ酸配列に基づくヒト化ＶＨ；
ｄ）配列番号：１１のアミノ酸配列に基づくヒト化ＶＬ配列；または
ｅ）（ａ）または（ｃ）と同様のＶＨ及び（ｂ）または（ｄ）と同様のＶＬ。 32. The antibody of any one of claims 1 and 25 to 31, wherein the antibody comprises:
a) a VH sequence having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10;
b) a VL sequence having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11;
c) humanized VH based on the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10;
d) a humanized VL sequence based on the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11; or e) a VH similar to (a) or (c) and a VL similar to (b) or (d). ＧＰＣ３に結合する分離抗体であって、前記抗体が、（ａ）配列番号：４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号：６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号：７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号：８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号：９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、前記分離抗体。   An isolated antibody that binds to GPC3, wherein the antibody is (a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4; (b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5; (c) sequence HVR-H3 comprising the amino acid sequence of No. 6; (d) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID No. 7; (e) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID No. 8; and (f) SEQ ID No. The isolated antibody comprising HVR-L3 comprising the amino acid sequence of 9. ＧＰＣ３に結合する分離抗体であって、前記抗体が、（ａ）配列番号：１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号：１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号：１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号：１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号：１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、前記分離抗体。   An isolated antibody that binds to GPC3, wherein the antibody is (a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12; (b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13; (c) sequence HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14; (d) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15; (e) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16; and (f) SEQ ID NO: The isolated antibody comprising HVR-L3 comprising the amino acid sequence of 17. ＧＰＣ３に結合する分離抗体であって、前記抗体が、（ａ）配列番号：２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号：２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号：２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号：２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号：２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、前記分離抗体。   An isolated antibody that binds to GPC3, wherein the antibody is (a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20; (b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21; (c) the sequence HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22; (d) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23; (e) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24; and (f) SEQ ID NO: The isolated antibody comprising HVR-L3 comprising the amino acid sequence of 25. ＧＰＣ３に結合する分離抗体であって、前記抗体が、（ａ）配列番号：２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号：２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号：３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号：３１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号：３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号：３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、前記分離抗体。   An isolated antibody that binds to GPC3, wherein the antibody is (a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28; (b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29; (c) sequence HVR-H3 comprising the amino acid sequence of No. 30; (d) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID No. 31; (e) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID No. 32; and (f) SEQ ID NO. The isolated antibody comprising HVR-L3 comprising the amino acid sequence of 33. 単クローン性抗体である、先行請求項のいずれか１項に記載の抗体。   The antibody according to any one of the preceding claims, which is a monoclonal antibody. ヒト、ヒト化、またはキメラ抗体である、先行請求項のいずれか１項に記載の抗体。   The antibody according to any one of the preceding claims, which is a human, humanized or chimeric antibody. ＧＰＣ３を結合する抗体フラグメントである、先行請求項のいずれか１項に記載の抗体。   The antibody according to any one of the preceding claims, which is an antibody fragment that binds GPC3. ＧＰＣ３が、配列番号：１のアミノ酸２５〜５８０を含むヒトＧＰＣ３である、先行請求項のいずれか１項に記載の抗体。   The antibody according to any one of the preceding claims, wherein GPC3 is human GPC3 comprising amino acids 25-580 of SEQ ID NO: 1. 前記抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａまたはＩｇＧ２ｂ抗体である、先行請求項のいずれか１項に記載の抗体。   The antibody according to any one of the preceding claims, wherein the antibody is an IgG1, IgG2a or IgG2b antibody. 先行請求項のいずれか１項に記載の抗体をコードする分離核酸。   An isolated nucleic acid encoding the antibody according to any one of the preceding claims. 請求項４２に記載の核酸を含む宿主細胞。   43. A host cell comprising the nucleic acid of claim 42. 前記抗体が、生成されるように、請求項４３に記載の宿主細胞を培養することを含む抗体の生成方法。   44. A method for producing an antibody comprising culturing the host cell of claim 43, such that the antibody is produced. 請求項１から４１のいずれか１項に記載の抗体及び細胞毒性薬剤を含むイムノコンジュゲート。   42. An immunoconjugate comprising the antibody of any one of claims 1-41 and a cytotoxic agent. 式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｐを有する請求項４５に記載のイムノコンジュゲートであって、式中、
（ａ）Ａｂが、前記請求項１から４１のいずれか一項に記載の抗体である；。
（ｂ）Ｌが、リンカーである；
（ｃ）Ｄが、細胞毒性薬剤である；及び
（ｄ）ｐが、１〜８の範囲である、前記イムノコンジュゲート。 46. The immunoconjugate of claim 45, having the formula Ab- (LD) p, wherein
(A) Ab is the antibody according to any one of claims 1 to 41;
(B) L is a linker;
(C) The immunoconjugate wherein D is a cytotoxic agent; and (d) p is in the range of 1-8. 前記細胞毒性薬剤が、マイタンシノイド、カリケアミシン、ピロロベンゾジアゼピン、及びネモルビシン誘導体から選択される、請求項４６に記載のイムノコンジュゲート。   47. The immunoconjugate of claim 46, wherein the cytotoxic agent is selected from maytansinoids, calicheamicins, pyrrolobenzodiazepines, and nemorubicin derivatives. Ｄが、式Ａのピロロベンゾジアゼピンである；
Ａ；
式中、点線が、Ｃ１及びＣ２またはＣ２及びＣ３間の二重結合任意の存在を示す；
Ｒ２が、Ｈ、ＯＨ、＝Ｏ、＝ＣＨ２、ＣＮ、Ｒ、または、＝ＣＨ−ＲＤ、＝Ｃ（ＲＤ）２、Ｏ−ＳＯ２−Ｒ、ＣＯ２Ｒ及びＣＯＲから独立して選択され、さらに任意でハロまたはジハロから選択され、式中、ＲＤが、Ｒ、ＣＯ２Ｒ、ＣＯＲ、ＣＨＯ、ＣＯ２Ｈ、及びハロから独立して選択される；
Ｒ６及びＲ９が、Ｈ、Ｒ、ＯＨ、または、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、Ｍｅ３Ｓｎ及びハロから独立して選択される；
Ｒ７が、Ｈ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、Ｍｅ３Ｓｎ及びハロから独立して選択される；
Ｑが、Ｏ、Ｓ及びＮＨから独立して選択される；
Ｒ１１が、Ｈ、またはＲのいずれかであり、または、Ｑが、Ｏ、ＳＯ３Ｍであり、Ｍが、金属カチオンである；
Ｒ及びＲ’それぞれが、任意で置換Ｃ１−８アルキル、Ｃ３−８ヘテロシクリル及びＣ５−２０アリール基から独立して選択され、任意で基ＮＲＲ’に関して、Ｒ及びＲ’が、これらが結合する窒素原子とともに任意で置換４、５、６または７員の複素環式環を形成する；
Ｒ１２、Ｒ１６、Ｒ１９及びＲ１７が、Ｒ２、Ｒ６、Ｒ９及びＲ７それぞれに対して定義されるとおりである；
Ｒ″が、Ｃ３−１２アルキレン基であり、その鎖が、１つ以上のヘテロ原子及び／または任意で置換されている芳香環によって中断されていてもよく；及び
Ｘ及びＸ’が、Ｏ、Ｓ及びＮ（Ｈ）から独立して選択される、請求項４６に記載のイムノコンジュゲート。 D is a pyrrolobenzodiazepine of formula A;
A;
In which the dotted line indicates the optional presence of a double bond between C1 and C2 or C2 and C3;
R 2 is independent of H, OH, ═O, ═CH 2 , CN, R, or ═CH—R D , ═C (R D ) 2 , O—SO 2 —R, CO 2 R and COR. Further optionally selected from halo or dihalo, wherein R D is independently selected from R, CO 2 R, COR, CHO, CO 2 H, and halo;
R 6 and R 9 are independently selected from H, R, OH, or SH, SR, NH 2 , NHR, NRR ′, NO 2 , Me 3 Sn and halo;
R 7 is independently selected from H, R, OH, OR, SH, SR, NH 2 , NHR, NRR ′, NO 2 , Me 3 Sn and halo;
Q is independently selected from O, S and NH;
R 11 is either H or R, or Q is O, SO 3 M, and M is a metal cation;
R and R ′ are each independently selected from substituted C 1-8 alkyl, C 3-8 heterocyclyl and C 5-20 aryl groups, and optionally with respect to the group NRR ′, R and R ′ Optionally forming a substituted 4, 5, 6 or 7 membered heterocyclic ring with the nitrogen atom to which it is attached;
R 12 , R 16 , R 19 and R 17 are as defined for R 2 , R 6 , R 9 and R 7 respectively;
R ″ is a C 3-12 alkylene group, the chain of which may be interrupted by one or more heteroatoms and / or optionally substituted aromatic rings; and X and X ′ are O 47. The immunoconjugate of claim 46, independently selected from S, N and N (H). Ｄが、以下の構造を有し、
；
式中、ｎが０または１である、請求項４８に記載のイムノコンジュゲート。 D has the following structure:
;
49. The immunoconjugate of claim 48, wherein n is 0 or 1. Ｄが、ネモルビシン誘導体である、請求項４６に記載のイムノコンジュゲート。   47. The immunoconjugate of claim 46, wherein D is a nemorubicin derivative. Ｄが、以下から選択される構造を有する、請求項５０に記載のイムノコンジュゲート。
；及び
。 51. The immunoconjugate of claim 50, wherein D has a structure selected from
;as well as
. 前記リンカーが、プロテアーゼによって開裂可能である、請求項４６から５１のいずれか１項に記載のイムノコンジュゲート。   52. The immunoconjugate of any one of claims 46 to 51, wherein the linker is cleavable by a protease. 前記リンカーが、酸不安定性である、請求項４６から５１のいずれか１項に記載のイムノコンジュゲート。   52. The immunoconjugate of any one of claims 46 to 51, wherein the linker is acid labile. 前記リンカーが、ヒドラゾンを含む、請求項５３に記載のイムノコンジュゲート。   54. The immunoconjugate of claim 53, wherein the linker comprises hydrazone. 以下から選択される式を有する、請求項４６に記載のイムノコンジュゲート。
；
及び
。 47. The immunoconjugate of claim 46, having a formula selected from:
;
as well as
. ｐが、２〜５の範囲である請求項４６から５５のいずれか１項に記載のイムノコンジュゲート。   56. The immunoconjugate of any one of claims 46 to 55, wherein p is in the range of 2-5. 請求項４５から５７のいずれか１項に記載のイムノコンジュゲート及び製剤的に許容可能なキャリアを含む医薬製剤。   58. A pharmaceutical formulation comprising the immunoconjugate of any one of claims 45 to 57 and a pharmaceutically acceptable carrier. さらに追加の治療薬剤を含む、請求項５７に記載の医薬製剤。   58. The pharmaceutical formulation of claim 57, further comprising an additional therapeutic agent. 請求項１から４１のいずれか１項に記載の抗体及び製剤的に許容可能なキャリアを含む医薬製剤。   42. A pharmaceutical formulation comprising the antibody of any one of claims 1-41 and a pharmaceutically acceptable carrier. さらに追加の治療薬剤を含む、請求項５９に記載の医薬製剤。   60. The pharmaceutical formulation of claim 59, further comprising an additional therapeutic agent. 有効量の請求項１から４１のいずれか１項に記載の抗体、請求項４５から５６のいずれか１項に記載のイムノコンジュゲートまたは請求項５６から５９のいずれか１項に記載の医薬製剤を個体に投与することを含む、ＧＰＣ３−陽性癌を有する個体の治療方法。   58. An effective amount of the antibody according to any one of claims 1-41, the immunoconjugate according to any one of claims 45-56 or the pharmaceutical formulation according to any one of claims 56-59. A method for treating an individual having GPC3-positive cancer, comprising administering to the individual. 前記ＧＰＣ３−陽性癌が、肝臓癌である、請求項６１に記載の方法。   62. The method of claim 61, wherein the GPC3-positive cancer is liver cancer. さらに追加の治療薬剤を個体に投与することを含む、請求項６１または請求項６２に記載の方法。   64. The method of claim 61 or claim 62, further comprising administering an additional therapeutic agent to the individual. ＧＰＣ３−陽性細胞の増殖の抑制方法であって、請求項１から４１のいずれか１項に記載の抗体、または請求項４５から５６のいずれか１項に記載のイムノコンジュゲートが、前記細胞の表面上のＧＰＣ３に結合することを許容する条件下で、前記細胞を、前記抗体または前記イムノコンジュゲートに暴露し、これにより、前記細胞の増殖を抑制することを含む、前記方法。   57. A method for inhibiting the growth of GPC3-positive cells, wherein the antibody according to any one of claims 1 to 41 or the immunoconjugate according to any one of claims 45 to 56 Exposing said cell to said antibody or said immunoconjugate under conditions permitting binding to GPC3 on a surface, thereby inhibiting proliferation of said cell. 前記細胞が、肝臓癌細胞である、請求項６４に記載の方法。   65. The method of claim 64, wherein the cell is a liver cancer cell. 標識に結合する請求項１から４１のいずれか１項に記載の抗体。   42. The antibody of any one of claims 1-41, which binds to a label. 前記標識が、陽電子放出体である、請求項６６に記載の抗体。   68. The antibody of claim 66, wherein the label is a positron emitter. 前記陽電子放出体が、８９Ｚｒである、請求項６７に記載の抗体。 The positron emitter is a 89 Zr, antibody of claim 67. 生体試料中のヒトＧＰＣ３の検出方法であって、請求項１から４１及び６６から６８のいずれか１項に記載の抗ＧＰＣ３抗体が、自然ヒトＧＰＣ３に結合するのを許容する条件下で、前記生体試料と前記抗ＧＰＣ３抗体を接触させること、ならびに、複合体が、前記生体試料中の前記抗ＧＰＣ３抗体及び自然ヒトＧＰＣ３間に、形成されるかどうかを検出することを含む、前記方法。   A method for detecting human GPC3 in a biological sample, wherein the anti-GPC3 antibody according to any one of claims 1 to 41 and 66 to 68 is allowed to bind to natural human GPC3. Contacting the biological sample with the anti-GPC3 antibody, and detecting whether a complex is formed between the anti-GPC3 antibody and natural human GPC3 in the biological sample. 前記生体試料が、肝臓癌試料である、請求項６９に記載の方法。   70. The method of claim 69, wherein the biological sample is a liver cancer sample. ＧＰＣ３−陽性癌の検出方法であって、（ｉ）ＧＰＣ３−陽性癌を有する、または有する疑いのある被験者に、請求項１から４１及び６６から６８のいずれか１項に記載の抗ＧＰＣ３抗体を含む標識抗ＧＰＣ３抗体を投与すること、及び（ｉｉ）前記標識抗ＧＰＣ３抗体の検出が、前記被験者中のＧＰＣ３−陽性癌を示す、前記被験者中の前記標識抗ＧＰＣ３抗体を検出することを含む、前記方法。   69. A method for detecting GPC3-positive cancer, comprising: (i) applying the anti-GPC3 antibody according to any one of claims 1 to 41 and 66 to 68 to a subject having or suspected of having GPC3-positive cancer. Administering a labeled anti-GPC3 antibody comprising, and (ii) detecting the labeled anti-GPC3 antibody comprising detecting the labeled anti-GPC3 antibody in the subject, indicating GPC3-positive cancer in the subject. Said method. 前記標識抗ＧＰＣ３抗体が、陽電子放出体に結合する抗ＧＰＣ３抗体を含む、請求項７１に記載の方法。   72. The method of claim 71, wherein the labeled anti-GPC3 antibody comprises an anti-GPC3 antibody that binds to a positron emitter. 前記陽電子放出体が、８９Ｚｒである、請求項７２に記載の方法。 The positron emitter is a 89 Zr, The method of claim 72.
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