JP2017521066A - 水質汚染を検出するための方法及び試薬 - Google Patents
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Abstract
Description
本明細書で使用されるとき、用語「給水源」または「試料」は、何らかの自然発生の水域、例えば、湖、水流、川、または水を保有する工業用もしくは家庭用人工容器または水体、例えば、貯水槽、プール、噴水式水飲み器、飲料水または飲用水、水を含有または保有するHVACシステム、瓶詰めの水、工業用給水源または容器、廃水容器等を意味する。これらの給水源または試料は、純粋なレジオネラを含有し得るか、高いレジオネラレベルの微生物の混合集団を含有し得るか、低いレジオネラレベルの微生物の混合集団を含有し得るか、レジオネラを有さない微生物の混合集団を含有し得るか、または微生物汚染を含有し得ない。そのような試料または給水源は、指し示された微生物からの標的配列の濃縮されていないか、または濃縮されたDNA試料を含有し得る。
一実施形態において、微生物汚染について給水源を検査するための試薬は、レジオネラ微生物種に対して高特異性を有し、レジオネラ以外微生物種と交差反応しないか、または最小限に交差反応する。一実施形態において、そのような試薬は、レジオネラ中の標的配列を増幅するか、またはハイブリダイズする少なくとも1つのヌクレオチド配列プライマー(DNAまたはRNA)を含む。別の実施形態において、標的配列は、配列番号17のヌクレオチド528と844との間に見られ、かつそれらを含んでいる。一実施形態において、ompS標的配列は、配列番号17のヌクレオチド327と491との間に見られ、かつそれらを含んでいる。別の実施形態において、標的配列は、配列番号17のヌクレオチド327と844との間に見られ、かつそれらを含んでいる。別の実施形態において、標的配列は、配列番号17のヌクレオチド327と491との間に見られ、かつそれらを含んでいる。別の実施形態において、標的配列は、配列番号17のヌクレオチド327と550との間に見られ、かつそれらを含んでいる。別の実施形態において、標的配列は、配列番号17のヌクレオチド327と680との間に見られ、かつそれらを含んでいる。別の実施形態において、標的配列は、配列番号17のヌクレオチド528と550との間に見られ、かつそれらを含んでいる。別の実施形態において、標的配列は、配列番号17のヌクレオチド528と680との間に見られ、かつそれらを含んでいる。別の実施形態において、標的配列は、配列番号17のヌクレオチド660と844との間に見られ、かつそれらを含んでいる。別の実施形態において、標的配列は、配列番号17のヌクレオチド660と680との間に見られ、かつそれらを含んでいる。さらに他の実施形態において、標的領域は、同定された配列の両端に約5〜約15のさらなるヌクレオチドを含む、上記で同定されたそれらの領域を含み得る。
試薬、例えば、本明細書で説明されるプライマーは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、定量的PCR(qPCR)、またはオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションベースの手法の技術を含む、レジオネラ検出のための方法において望ましく使用される。
(a)配列番号3を含む順方向プライマー配列327、
(b)配列番号4含む順方向プライマー配列528、
(c)配列番号5を含む順方向プライマー配列660、
(d)配列番号6を含む順方向プライマー配列825、
(e)配列番号7を含む逆方向プライマー配列GC−327、
(f)配列番号8を含む逆方向プライマー配列GC−528、
(g)配列番号9を含む逆方向プライマー配列GC−660、
(h)配列番号10を含む逆方向プライマー配列GC−825、または
(i)(a)〜(h)を含むプライマー配列の組み合わせ、または
(j)ゆらぎ塩基を用いるか、あるいは1つ以上の5’もしくは3’塩基を添加もしくは削除することによる、または配列番号17のその位置に沿ってプライマー1〜5塩基の位置を変更することによる、そのようなプライマー配列の修飾。
発明者は、レジオネラ遺伝子を、新規レジオネラ検出の試薬に適した標的の源としてlpg1974(Weissenmayer,Prendergast et al.2011)と同定した。ompS(NCBIジェンバンク受入番号M76178.1)としても既知のこの遺伝子は、他のレジオネラ遺伝子と比べて、かなり高レベルで安定に発現することが分かった。したがって、この遺伝子及びそのコード外膜タンパク質は、発現が、成長条件に非感受性であり、非標的生物の検出を防止するためにレジオネラに独特であるヌクレオチド配列の発明者対の目標を満たす。
ompSの5’末端は、遺伝子の他の領域に対してばらつきが少なく、レジオネラニューモフィラ生物に対してより特異的であるように見えたため、それを、qPCRプライマー産生の標的とした。発明者は、ツール、すなわち、IDTプライマー設計ウェブサイト(http://www.idtdna.com/scitools/Applications/RealTimePCR/)を利用して、特定の融解温度、長さ、及びホモ二量体/ヘテロ二量体特徴を有するqPCRプライマーを構築した(表1)。
95℃で3分間、続いて、95℃で10秒41サイクル、58℃で10秒、72℃で30秒、その後、95℃で10秒、続いて、ソフトウェアの初期設定状態を使用した融解曲線。検証を実行するために使用される市販で購入したレジオネラゲノム標準を用いて、CFX96Bio−Rad SystemでqPCR増幅を行った。qPCR条件は、推奨された説明書と違ったが、効率及びR^2値は、通常のパラメーター内であったため、変更が何らかの影響を及ぼした可能性は低い。これらの条件は、反応ウェルごとに、12.5μlのBio−Rad iQ SYBR Master MiX、0.15μlの順方向及び逆方向プライマーの両方(ストックプライマー濃度は、50μMであった)、4.7μlの分子生物学グレードH2O(正確な7.2μlのH2Oの代わり)を使用することを含んだ。その量まで、5μlの100倍希釈の精製されたゲノムDNAを添加した。
従来のPCRアプローチまたはハイブリダイゼーションベースのアプローチのいずれかに使用され得るDNAの領域もまた、例えば、複数のレジオネラ種の広範な検出のために分析した。これを行うために、レジオネラニューモフィラからのompS遺伝子のDNA配列及びレジオネラロングビーチからのompS遺伝子のDNA配列を、整列し、直接比較して、総類似度または十分に高い配列類似度の領域を同定して、1〜2個のゆらぎ塩基を有するプライマーを同定することを可能にした。「ゆらぎ塩基」は、反応に使用されるプライマープールに基づいて、代替的な塩基選択肢が可能なプライマー配列に位置するあるヌクレオチド塩基を指す。例えば、「R」のゆらぎ塩基は、所与のプライマープール中、50%グアニン及び50%シトシンである。このアプローチは、関連性が高いが、100%同一ではないDNAの領域を含めるために、プライマー反応性の広範化を可能にした。
既知のプライマーの一連のベンチマークを行って、新規ompSプライマーが、他の既知のompSプライマーと比べて改善を実証したかを特定した。プライマー設定に最適であった条件(プライマー融解温度(TM)を下回る2℃での、一比較において、反応条件は、12.5μlのMaster MiX、0.5μlの順方向及び逆方向プライマーの両方、及び10.5μlのdH2Oで、MolBio Ultraclean DNA Isolation Kitを利用して単離された1μlの精製されたゲノムDNAが添加された。定義された菌株からのDNA及びCDC ELITE試験パネルから単離された核酸からのDNAをアッセイした。
定義された細菌種(レジオネラニューモフィラATCC BAA74、P.緑膿菌ATCC 15442、バーコオルデリアセパシアATCC 25416、スフィンゴモナスパウチモビリス BAA1092、フラボバクテリウムオドラタム(別名ミロイデスオドラタス)NCIMB 13294、エンテロバクターエロゲネスATCC 13048、及びクレブシエラニューモニエATCC 8308)からの細胞懸濁液を得、2つの分割量に分割した。1つの分割量を蒔いて、生物濃度の尺度としてcfu/ml数を得、他方を、MolBio UltraClean DNA Kitを介して、DNA単離に晒した。各開始コロニーのcfu/mlが特定されたら、細胞数に基づいて、等しいゲノム単位/ml濃度を、各DNAの小瓶を割り当てた。それから、希釈範囲を産生して、標的生物の非存在を模擬し、その後、高レベルの非標的生物DNAに対してレジオネラの量を増加した(表2に特定の条件を参照)。
PCR断片を可視化するために、ゲル鋳造、緩衝液、及び安全上の注意について、LonzaのFlashgelカセットベースのシステムまたは標準動作手順のいずれかに従った。SOPに従って、5μlのPCR産物/ローディング色素を、各ウェルに添加し、100bp DNAラダー(Promega)/ローディング色素のうちの5つを、一番左のウェルに添加した(Lonza Flashgelシステムでは2μl)。1.5%アガロースゲルを、30分間100Vで1x TBE緩衝液中で実行した。その後、それらを、空のプラスチックピペットチップボックスに置き、60分間50mlの1X SYBR Green(Invitrogen)に曝露し、その後、Bio−Rad Gel XR Imager上で可視化した。Lonza Flashgelsを、製造者の説明書を使用して操作し、組込みの撮像カメラを用いて可視化した。
qPCRプライマー配列番号1及び2を産生して、ompS遺伝子が、広範なレジオネラ検出のためにqPCRベースの方法に使用され得るかを判定した。液体培養成長緑膿菌及びパラコッカスデニトリフィカンスからのDNAを、陰性対照として使用した。レジオネラニューモフィラ BAA74からのDNAは、陽性対照として機能し、菌株から抽出したDNAを、実験試料として使用されるCDC ELITE試験試料(レジオネラデュモフィ、レジオネラロングビーチ、レジオネラフィーレイ、及びレジオネラチェリイ)から単離した。レジオネラDNAを得るために、コロニーを、細菌培地プレートから塗布し、バイオセイフティキャビネット内で水中に撹拌して、MoBio Ultraclean DNA抽出キットを使用して抽出した。DNAを、qPCR実行において使用されるBio−Radからのプラスチック試薬を用いて、分析前にdH2O中に100倍希釈した。市販で購入したレジオネラニューモフィラゲノム標準は、5対数標準希釈の材料として機能した。
高選択性のレジオネラプライマー設計であると観察された点、及びプライマー(表1)が提案されたハイブリダイゼーションアプローチのために、さらに離間されるべきであるとの判定に従って、新しいプライマーを、ompS遺伝子のより中核を成す3’末端から選択した(図2及び7参照)。特定の領域を、レジオネラロングビーチに対して相同性の高度の配列に基づいて単離した。プライマー名称の「gc」は、「産生された補体」を指し、プライマー製造者(IDT)は、反対の鎖のDNA上の同一の位置に位置したプライマーを産生して、同一の領域のDNAが、その位置の5’及び3’の両方のプライマーを用いて試験され得るようにした。その後、各プライマーセットの適合性を、表2に列挙された条件を使用して試験した。
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Claims (20)
- レジオネラ微生物種に対して高特異性を有するヌクレオチド配列を含む、微生物汚染について給水源を検査するための試薬であって、
前記ヌクレオチド配列は、レジオネラ以外の微生物種と交差反応しないか、または最小限に交差反応する、試薬。 - 配列番号1〜10を含む少なくとも1つのヌクレオチド配列プライマー、または配列番号1〜10を含む複数のプライマー配列の組み合わせ、または配列番号1〜10の修飾を含む、請求項1に記載の試薬。
- 順方向ヌクレオチド配列プライマー及び逆方向ヌクレオチド配列プライマーを含む1セットのプライマーを含む、請求項2に記載の試薬。
- 前記順方向プライマーは、配列番号1、3、4、5、または6のうちの少なくとも1つを含み、前記逆方向プライマーは、配列番号2、7、8、9、または10のうちの少なくとも1つを含む、請求項3に記載の試薬。
- 前記順方向プライマーは、配列番号4を含み、前記逆方向プライマーは、配列番号10を含む、請求項3に記載の試薬。
- 配列番号1〜10を含む前記プライマーから選択される複数のセットの試薬を含む、請求項2に記載の試薬。
- 前記試薬は、配列番号1〜10を含む全てのヌクレオチド配列プライマーを含む、請求項2に記載の試薬。
- 前記ヌクレオチド配列のうちの1つ以上が固定化または固定される基板をさらに備える、請求項2に記載の試薬。
- 検出可能な標識または標識コンポーネントが、少なくとも1つのプライマーに関連付けられる、請求項2に記載の試薬。
- 前記基板は、アレイ、マイクロアレイ、マイクロチップ、プラスチック表面、またはガラス表面である、請求項8に記載の試薬。
- 前記ヌクレオチド配列は、RNAである、請求項1に記載の試薬。
- 前記ヌクレオチド配列は、DNAである、請求項1に記載の試薬。
- 請求項1に記載の試薬と、標識、基板、前記標識と相互作用し、検出可能なシグナルを産生することが可能な標識コンポーネントから選択される、1つ以上のコンポーネントと、を備える、キット。
- 請求項1に記載の試薬を備える、水質監視デバイス。
- 微生物汚染について給水源を検査する方法であって、
給水源を、レジオネラ微生物種に対して高特異性を有する請求項1の試薬と接触させることであって、前記試薬は、レジオネラ以外の微生物種と交差反応しないか、または最小限に交差反応する、接触させることと、
前記給水源中のレジオネラ種の汚染濃度を検出または測定することと、を含む、方法。 - 前記試薬は、配列番号1〜10から選択される少なくとも1つのヌクレオチド配列プライマー、配列番号1〜10を含むプライマー配列の組み合わせ、または配列番号1〜10の修飾を含む、請求項15に記載の方法。
- 測定することは、58℃より低い選択されたアニーリング温度で、レジオネラ中に存在する標的核酸配列にプライマーまたはプライマーの組み合わせをアニーリングすることを含む、請求項15に記載の方法。
- 前記測定することは、レジオネラ中に存在する標的核酸配列にプライマーをハイブリダイズすることを含む、請求項15に記載の方法。
- 前記測定することは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)またはリアルタイム定性的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)を行うことを含む、請求項15に記載の方法。
- レジオネラ種での汚染とシュードモナス種での汚染とを区別することを含む、請求項15に記載の方法。
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