NL2010800C2

NL2010800C2 - Kit en werkwijze voor detectie van legionella.

Info

Publication number: NL2010800C2
Application number: NL2010800A
Authority: NL
Inventors: Ruben Cornelis Simons; Patrick Bruinsel
Original assignee: Bacteriologisch Onderzoeksbureau Biobeheer B V
Priority date: 2013-05-14
Filing date: 2013-05-14
Publication date: 2014-11-24

Description

P31579NL00/RKI

Korte aanduiding: Kit en werkwijze voor detectie van Legionella

Gebied van de uitvinding

Deze uitvinding behoort tot het gebied van de moleculaire biologie, met name op het gebied van microbiologie en bacteriologie. De uitvinding verschaft een werkwijze en een kit voor het gelijktijdig detecteren en onderscheiden van Legionella species, Legionella pneumophila en Legionella pneumophila serotype 1 in een monster. De innovatie van de huidige methode ligt niet alleen in zijn vermogen om Legionella species maar ook om Legionella pneumophila-bacienën te identificeren en direct onderscheid maken tussen Legionella pneumophila en Legionella pneumophila serotype 1-bacteriën die aanwezig zijn in een monster.

De werkwijze kan bestaan uit een triplex polymerase chain reaction (PCR), en maakt gebruik van een unieke combinatie van primerparen en oligonucleotideprobes voor het gelijktijdig detecteren en onderscheiden van Legionella ssp., Legionella pneumophila en Legionella pneumophila serotype 1. De werkwijze en kit van de uitvinding zijn bijzonder geschikt voor de detectie van Legionella op koloniemateriaal in oplossing. De werkwijze kan routinematig worden gebruikt als onderdeel van testen en screening.

Stand der techniek

Er zijn momenteel 48 soorten Legionella-bacteriën beschreven, waarvan er 12 soorten in relatie worden gebracht met menselijke ziekten. Van deze soorten vormt Legionella pneumophila de grootste bedreiging voor de volksgezondheid. Legionella pneumophila wordt na een serotypering onder verdeeld in 2 groepen: serotype 1 en serotype 2 t/m 15. Alle Legionella pneumophila serotypen vormen een gevaar voor de gezondheid, maar serotype 1 vormt een zeer grote bedreiging voor de gezondheid.

Legionella (pneumophila) veroorzaakt de veteranenziekte of legionellagriep. De ziekte (ook wel legionellosis genoemd) kan ontstaan wanneer mensen de bacterie inademen. De griepvariant (ook wel Pontiac koorts) is meestal tijdelijk en van voorbijgaande aard, de veteranenziekte daarentegen is een chronische longaandoening met mogelijk dodelijke afloop. De veteranenziekte tast naast de longen ook andere organen aan. Gemiddeld worden in Nederland per jaar ongeveer 800 mensen opgenomen in ziekenhuizen met de veteranenziekte.

Voorwaarde voor infectie is dat de bacterie via de neus of de mond wordt opgenomen en zich kan vestigen in de longen. De verspreiding gebeurt veelal via zogenaamde aërosolen, dit zijn kleine waterdruppeltjes die de bacterie kunnen bevatten en ontstaan door turbulente waterbewegingen. Douches, whirlpools, koeltorens voor airco-installaties en zwembadattracties vormen de grootste groep met punten in gebouwen waar waterverneveling optreedt. Wastafelkranen, keukenkranen, wasmachinekranen en toiletten zorgen vrijwel niet voor verneveling en worden daarom minder risicovol geacht.

Er zijn geen vaccins beschikbaar om de veteranenziekte te voorkomen. Het enig wat preventief gedaan kan worden is het voorkomen van de hoge aantallen bacteriën in water dat verneveld wordt. Daarom moeten openbare gebouwen en ruimten, tezamen met hun watervoorzieningen, op regelmatige basis gecontroleerd worden op de aanwezigheid van Legionella-bacteriën, in het bijzonder van Legionella pneumophila, meer in het bijzonder van Legionella pneumophila serotype 1.

In het licht van de epidemiologische achtergrond zou een ideale detectiemethode snel de aanwezigheid van Legionella detecteren, en tegelijkertijd de species en, als toepasbaar, het serotype identificeren.

Op kweken gebaseerde methoden zijn van oudsher gebruikt om verontreiniging van het water door Legionella pneumophila te beoordelen. Dergelijke werkwijzen zijn niet optimaal omdat identificatie van Legionella-bacteriën door middel van kweken tijdrovend is. Het kan wel twee weken duren voordat definitieve resultaten worden verkregen.

Alternatieve detectiemethoden omvatten kwantitatieve real-time PCR-methoden, die voor snelle detectie en kwantificering van Legionella-bacteriën met behulp van genetische merkers die specifiek zijn voor Legionella-bacteriën, met hoge gevoeligheid en specificiteit kunnen zorgen. Deze methode is aanzienlijk minder tijdrovend dan op kweken gebaseerde methoden.

Hoewel aanzienlijke vorderingen zijn geboekt door het gebruik van kwantitatieve realtime PCR-methoden, is er nog steeds een grote behoefte aan snelle en betrouwbare detectiemethoden die tegelijkertijd bacteriën van het genus Legionella, het species Legionella pneumophila en Legionella pneumophila serotype 1 kunnen detecteren en onderscheiden.

Samenvatting van de uitvinding

De uivinding heeft betrekking op een werkwijze voor het tegelijkertijd detecteren van de aanwezigheid van bacteriën van Legionella species, Legionella pneumophila, en Legionella pneumophila serotype 1 in een testmonster, omvattende: het in contact brengen van een eerste probe met de nucleïnezuursequentie van SEQ ID NO:1, welke eerste probe onder stringente omstandigheden kan hybridiseren met een Legionella species-specifieke nucleïnezuursequentie, waarbij de Legionella species-specifieke nucleïnezuursequentie een 16S rRNA-gen is; het in contact brengen van een tweede probe met de nucleïnezuursequentie van SEQ ID N0:2, welke tweede probe onder stringente omstandigheden kan hybridiseren met een Legionella pneumophila-specïï\eke nucleïnezuursequentie, waarbij de Legionella pneumophila-spec\f\eke nucleïnezuursequentie een mip-gen is; het in contact brengen van een derde probe met de nucleïnezuursequentie van SEQ ID NO:3, welke derde probe onder stringente omstandigheden kan hybridiseren met een Legionella pneumophila serotype 1-specifieke nucleïnezuursequentie, waarbij de Legionella pneumophila serotype 1-specifieke nucleïnezuursequentie een wzm-gen is; waarin de eerste, tweede en derde probe detecteerbaar gelabeld zijn; en waarin de werkwijze voorts het detecteren van hybridisatie tussen een of meer gelabelde probes en een nucleïnezuursequentie omvat, waarin detectie van hybridisatie tussen de eerste probe en de Legionella species-specifieke nucleïnezuursequentie indicatief is voor de aanwezigheid van Legionella species in het testmonster, waarin detectie van hybridisatie tussen de tweede probe en de Legionella pneumophila-specïï\eke nucleïnezuursequentie indicatief is voor de aanwezigheid van Legionella pneumophila in het testmonster, en waarin detectie van hybridisatie tussen de derde probe en de Legionella pneumophila serotype 1-specifieke nucleïnezuursequentie indicatief is voor de aanwezigheid van Legionella pneumophila serotype 1 in het testmonster.

De werkwijze mag voorts de stap omvatten van: het vermeerderen van ten minste een deel van de Legionella species-specifieke nucleïnezuursequentie, ten minste een deel van de Legionella pneumophila-specifieke nucleïnezuursequentie, en ten minste een deel van de Legionella pneumophila serotype 1-specifieke nucleïnezuursequentie.

De vermeerderingsstap mag voorafgaan aan het detecteren van hybridisatie tussen een of meer gelabelde probes en een nucleïnezuursequentie.

In een uitvoeringsvorm wordt het ten minste ene deel van de Legionella species-specifieke nucleïnezuursequentie vermeerderd middels een eerste primerpaar omvattende een eerste voorwaartse primer, die de nucleïnezuursequentie als getoond wordt in SEQ ID NO:4 omvat, en een eerste tegengestelde primer, die de nucleïnezuursequentie als getoond wordt in SEQ ID NO:5 omvat.

In een uitvoeringsvorm wordt het ten minste ene deel van de Legionella pneumophila-specifieke nucleïnezuursequentie vermeerderd middels een tweede primerpaar omvattende een tweede voorwaartse primer, die de nucleïnezuursequentie als getoond wordt in SEQ ID NO:6 omvat, en een tweede tegengestelde primer, die de nucleïnezuursequentie als getoond wordt in SEQ ID NO:7 omvat.

In een uitvoeringsvorm wordt het ten minste ene deel van de Legionella pneumophila serotype 1-specifieke nucleïnezuursequentie vermeerderd middels een derde primerpaar omvattende een derde voorwaartse primer, die de nucleïnezuursequentie als getoond wordt in SEQ ID NO:8 omvat, en een derde tegengestelde primer, die de nucleïnezuursequentie als getoond wordt in SEQ ID NO:9 omvat.

Het eerste primerpaar, het tweede primerpaar en het derde primerpaar kunnen worden toegepast in de vermeerderingsstap.

De eerste, tweede en derde probe kunnen een fluorofoor en een quencher omvatten. In een uitvoeringsvorm omvat de eerste probe de nucleïnezuursequentie 5’-CCGAGCGGTGAGTAACGCGTAGGAATATGGCTCGG-3’ (SEQ ID NO:1). In een uitvoeringsvorm is de eerste probe FAM-5’-CCGAGCGGTGAGTAACGCGTAGGAATATGGCTCGG-3'-Dabcyl.

In een uitvoeringsvorm omvat de tweede probe de nucleïnezuursequentie 5'TGCCTTTAGCCATTGCTTCCG-'3 (SEQ ID NO:2). In een uitvoeringsvorm is de tweede probe TEX615-5'- TGCCTTTAGCCATTGCTTCCG-'3-BHQ1.

In een uitvoeringsvorm omvat de derde probe de nucleïnezuursequentie 5'-TCTTGGGATTGGGTTGGGTTATTTTAACTCCT-3' (SEQ ID NO:3). In een uitvoeringsvorm is de derde probe HEX-5'- T CTT G G G ATTGGGTTGGGTT ATTTT AACT CCT-3'-B H Q1.

De uitvinding betreft eveneens een werkwijze voor het tegelijkertijd detecteren van de aanwezigheid van bacteriën van Legionella species, Legionella pneumophila, en Legionella pneumophila serotype 1 in een testmonster, omvattende de stappen: het vermeerderen van ten minste een deel van een Legionella species-specifieke nucleïnezuursequentie middels een eerste primerpaar omvattende een eerste voorwaartse primer, die de nucleïnezuursequentie als getoond wordt in SEQ ID NO:4 omvat, en een eerste tegengestelde primer, die de nucleïnezuursequentie als getoond wordt in SEQ ID NO:5 omvat ter verkrijging van een eerste vermeerderingsproduct, het vermeerderen van ten minste een deel van een Legionella pneumophila-specifieke nucleïnezuursequentie middels een tweede primerpaar omvattende een tweede voorwaartse primer, die de nucleïnezuursequentie als getoond wordt in SEQ ID NO:6 omvat, en een tweede tegengestelde primer, die de nucleïnezuursequentie als getoond wordt in SEQ ID NO:7 omvat ter verkrijging van een tweede vermeerderingsproduct, en het vermeerderen van ten minste een deel van een Legionella pneumophila serotype 1-specifieke nucleïnezuursequentie middels een derde primerpaar omvattende een derde voorwaartse primer, die de nucleïnezuursequentie als getoond wordt in SEQ ID NO:8 omvat, en een derde tegengestelde primer, die de nucleïnezuursequentie als getoond wordt in SEQ ID NO:9 omvat ter verkrijging van een derde vermeerderingsproduct, en het detecteren van het eerste vermeerderingsproduct, het tweede vermeerderings-product en het derde vermeerderingsproduct.

In een uitvoeringsvorm vindt het vermeerderen van ten minste een deel van een Legionella species-specifieke nucleïnezuursequentie, het vermeerderen van ten minste een deel van een Legionella pneumophila-spec\ï\eke nucleïnezuursequentie, en het vermeerderen van ten minste een deel van een Legionella pneumophila serotype 1-specifieke nucleïnezuursequentie in hetzelfde reactiemengsel plaats.

Het eerste vermeerderings-product, het tweede vermeerderings-product en het derde vermeerderingsproduct kunnen middels fluorescentie worden gedetecteerd.

Het eerste vermeerderings-product, het tweede vermeerderings-product en het derde vermeerderingsproduct kunnen real-time worden gedetecteerd.

In een uitvoeringsvorm wordt het eerste vermeerderings-product gedetecteerd middels een eerste probe, wordt het tweede vermeerderingsproduct gedetecteerd middels een tweede probe en wordt het derde vermeerderingsproduct gedetecteerd middels een derde probe.

De eerste, tweede en derde probe kunnen een fluorofoor en een quencher omvatten.

In een uitvoeringsvorm omvat de eerste probe de nucleïnezuursequentie 5’-CCGAGCGGTGAGTAACGCGTAGGAATATGGCTCGG-3’ (SEQ ID NO:1). In een uitvoeringsvorm is de eerste probe FAM-5’-CCGAGCGGTGAGTAACGCGTAGGAATATGGCTCGG-3'-Dabcyl.

Het testmonster kan bijvoorbeeld gekozen worden uit de groep, bestaande uit: een watermonster, een aerosolmonster, longmonster, urinemonster, bronchiaal monster, mucusmonster, een uitstrijkjesmonster, een DNA-monster en een monster waarin een of meer bacteriekolonies zijn gesuspendeerd in een waterig medium.

In een ander aspect heeft de uitvinding betrekking op een kit voor het detecteren van de aanwezigheid van bacteriën van Legionella species, Legionella pneumophila, en Legionella pneumophila serotype 1 in een testmonster, omvattende: een eerste primerpaar omvattende een eerste voorwaartse primer, die de nucleïnezuursequentie als getoond wordt in SEQ ID NO:4 omvat, en een eerste tegengestelde primer, die de nucleïnezuursequentie als getoond wordt in SEQ ID NO:5 omvat; een tweede primerpaar omvattende een tweede voorwaartse primer, die de nucleïnezuursequentie als getoond wordt in SEQ ID NO:6 omvat, en een tweede tegengestelde primer, die de nucleïnezuursequentie als getoond wordt in SEQ ID NO:7 omvat; en een derde primerpaar omvattende een derde voorwaartse primer, die de nucleïnezuursequentie als getoond wordt in SEQ ID NO:8 omvat, en een derde tegengestelde primer, die de nucleïnezuursequentie als getoond wordt in SEQ ID NO:9 omvat.

De kit kan tevens een eerste probe, een tweede probe, en een derde probe omvatten, waarin de eerste probe onder stringente omstandigheden kan hybridiseren met een Legionella species-specifieke nucleïnezuursequentie, waarbij de Legionella species-specifieke nucleïnezuursequentie een 16S rRNA-gen is; waarin de tweede probe onder stringente omstandigheden kan hybridiseren met een Legionella pneumophila-specifieke nucleïnezuursequentie, waarbij de Legionella pneumophila-spec\f\eke nucleïnezuursequentie een mip-gen is; waarin de derde probe onder stringente omstandigheden kan hybridiseren met een Legionella pneumophila serotype 1-specifieke nucleïnezuursequentie, waarbij de Legionella pneumophila serotype 1-specifieke nucleïnezuursequentie een wzm-gen is;

De eerste, tweede en derde probe kunnen detecteerbaar gelabeld, bijvoorbeeld fluorescent gelabeld, zijn.

De eerste, tweede en derde probe kunnen een fluorofoor en een quencer omvatten.

In een uitvoeringsvorm omvat de tweede probe de nucleïnezuursequentie 5'TGCCTTTAGCCATTGCTTCCG-'3 (SEQ ID NO:2). In een uitvoeringsvorm is de tweede probe TEX615-5’- TGCCTTTAGCCATTGCTTCCG-'3-BHQ1.

In een uitvoeringsvorm omvat de derde probe de nucleïnezuursequentie 5'-TCTTGGGATTGGGTTGGGTTATTTTAACTCCT-3' (SEQ ID NO:3). In een uitvoeringsvorm is de derde probe HEX-5'- T CTT G G GATT GGGTTGGGTT ATTTT AACT CCT-3'-B H Q1.

De kit kan voorts geschreven instructies voor het detecteren van de aanwezigheid van bacteriën van Legionella species, Legionella pneumophila, en Legionella pneumophila serotype 1 in een testmonster omvat.

De uitvinding voorziet tevens in de toepassing van de hierboven beschreven kit voor het detecteren van ten minste Legionella species in een testmonster, voor het detecteren van ten minste Legionella species en Legionella pneumophila in een testmonster, of voor het detecteren van Legionella species, Legionella pneumophila en Legionella pneumophila serotype 1 in een testmonster.

Ook voorziet de uitvinding in de toepassing van een eerste primerpaar, tweede primerpaar en derde primerpaar voor het detecteren van bacteriën van Legionella species in een testmonster, waarin het eerste primerpaar bestaat uit een eerste voorwaartse primer met de nucleïnezuursequentie van SEQ ID NO:4 en een eerste tegengestelde primer met de nucleïnezuursequentie van SEQ ID NO:5 omvat, het tweede primerpaar bestaat uit een tweede voorwaartse primer met de nucleïnezuursequentie van SEQ ID NO:6 en een tweede tegengestelde primer met de nucleïnezuursequentie van SEQ ID NO:7, en het derde primerpaar bestaat uit een derde voorwaartse primer met de nucleïnezuursequentie van SEQ ID NO:8, en een derde tegengestelde primer met de nucleïnezuursequentie van SEQ ID NO:9.

De uitvinding voorziet tevens in de toepassing van de hierboven beschreven eerste primerpaar, tweede primerpaar en derde primerpaar voor het detecteren van ten minste Legionella species in een testmonster, voor het detecteren van ten minste Legionella species en Legionella pneumophila in een testmonster, of voor het detecteren van Legionella species, Legionella pneumophila en Legionella pneumophila serotype 1 in een testmonster.

Voorts kunnen een eerste probe, tweede probe en derde probe worden gebruikt, waarbij de eerste probe FAM-5’-CCGAGCGGTGAGTAACGCGTAGGAATATGGCTCGG-3'-Dabcyl is, de tweede probe TEX615-5’-TGCCTTTAGCCATTGCTTCCG-'3-BHQ1 is, en de derde probe ΗEX-5'- TCTTGGGATTGGGTTGGGTTATTTTAACTCCT-3'-BHQ1 is.

Definities

In dit document en in de conclusies wordt het werkwoord "omvatten" en vervoegingen daarvan gebruikt in de niet-beperkende zin. Dit betekent dat de onderdelen die volgen zijn opgenomen, maar onderdelen die niet volgen zijn niet specifiek uitgesloten. Het omvat ook het meer beperkende werkwoord "bevatten". Bovendien sluit verwijzing naar een element door het onbepaalde lidwoord "een" niet uit dat meer dan een element aanwezig is, tenzij de context duidelijk vereist dat slechts een van de elementen aanwezig is. Het onbepaalde lidwoord "een" betekent derhalve meestal "ten minste een".

De term "nucleïnezuursequentie" verwijst naar een DNA- of RNA-molecuul in enkelstrengs of dubbelstrengs vorm.

De term "gen" verwijst naar een DNA-sequentie die een gebied (getranscribeerd gebied) omvat dat getranscribeerd wordt tot een RNA molecuul (bijv. een mRNA) in een cel, functioneel gekoppeld aan geschikte regulerende gebieden (bijv. een promoter). Een gen kan derhalve verscheidene werkzaam verbonden sequenties bevatten, zoals een promotor, een 5' leidersequentie die bijvoorbeeld sequenties die betrokken zijn bij translatie-initiatie van een (voor een eiwit) coderend gebied (cDNA of genomisch DNA), en een 3' niet-getranslateerde sequentie, die bijvoorbeeld een transcriptieterminatieplaats omvat.

"Stringente hybridisatieomstandigheden" kunnen worden gebruikt om nucleotidesequenties die nagenoeg identiek zijn aan een bepaalde nucleotidesequentie te identificeren. Stringente omstandigheden zijn sequentie-afhankelijk en zullen verschillend zijn in verschillende omstandigheden. De vakman zal in staat zijn stringente omstandigheden vast te stellen. In het algemeen worden stringente omstandigheden ongeveer 5°C lager dan het thermische smeltpunt (Tm) voor de specifieke sequenties bij een gedefinieerde ionsterkte en pH gekozen. De Tm is de temperatuur (onder gedefinieerde ionsterkte en pH) waarbij 50% van de doelsequentie hybridiseert aan een perfect overeenkomend probe/primer. Er kunnen bijvoorbeeld stringente omstandigheden worden gekozen waarbij de zoutconcentratie ongeveer 0,02 molair bij pH 7 en de temperatuur ten minste 60°C is. Het verlagen van de zoutconcentratie en/of verhogen van de temperatuur verhoogt stringentie. Stringente omstandigheden voor DNA-DNA hybridisatie (Southern blots met een probe van bijv. 100nt) zijn bijvoorbeeld die, welke ten minste een wassing (meestal 2) in 0,2 X SSC bij een temperatuur van ten minste 50°C, meestal ongeveer 55°C , gedurende 20 min omvatten, of equivalente omstandigheden. Zie ook Sambrook et al.. (1989) en Sambrook en Russell (2001).

De term “vermeerdering” of “DNA-vermeerdering” wordt hierin gebruikt om de in vitro synthese van dubbelstrengs DNA-moleculen onder toepassing van de polymerase kettingreactie (polymerase chain reaction; PCR) aan te duiden. Overigens bestaan andere DNA-vermeerderingsmethoden en ook deze vallen binnen de term “vermeerdering” of “DNA-vermeerdering”.

In het algemeen verwijst de term “primers” naar DNA-strengen die de synthese van DNA kunnen primen. DNA polymerase kan DNA de novo niet synthetiseren zonder primers: het kan alleen een bestaande DNA-streng verlengen in een reactie waarin de complementaire streng wordt gebruikt als een sjabloon om de volgorde van nucleotiden te bepalen. We noemen bijvoorbeeld de synthetische oligonucleotide moleculen die worden gebruikt in een polymerase kettingreactie (polymerase chain reaction; PCR) primers.

Gedetailleerde beschrijving van de uitvinding

De uitvinders hebben primerparen geïdentificeerd die, wanneer ze in combinatie gebruikt worden in een triplex PCR-methode, drie PCR-producten vormen, waardoor tegelijkertijd bacteriën van het genus Legionella, het species Legionella pneumophila en Legionella pneumophila serotype 1 kunnen worden gedetecteerd en van elkaar kunnen worden onderscheiden. De drie PCR-producten zijn afgeleid van het 16S rRNA gen, het mip gen, en het wzm gen, respectievelijk, welke specifiek zijn voor het genus Legionella, de species Legionella pneumophila, en Legionella pneumophila serotype 1, respectievelijk. Tevens hebben de uitvinders PCR-omstandigheden geïdentificeerd waarin de drie PCR-producten optimaal worden gevormd, zodat de triplex PCR-methode even betrouwbaar, robuust, specifiek en selectief is als de standaard detectiemethode (afzonderlijke PCR voor detectie van bacteriën van het genus Legionella, voor detectie van het species Legionella pneumophila en voor detectie Legionella pneumophila serotype 1).

Werkwijzen voor het detecteren van Legionella-bacteriën

In een eerste aspect heeft de uitvinding betrekking op een werkwijze voor het tegelijkertijd detecteren van bacteriën van het genus Legionella, de species Legionella pneumophila, en Legionella pneumophila serotype 1 in een testmonster, omvattende: het in contact brengen van een eerste probe met de nucleïnezuursequentie van SEQ ID NO:1, welke eerste probe onder stringente omstandigheden kan hybridiseren met een Legionella species-specifieke nucleïnezuursequentie, waarbij de Legionella species-specifieke nucleïnezuursequentie een 16S rRNA gen is; het in contact brengen van een tweede probe met de nucleïnezuursequentie van SEQ ID NO:2, welke tweede probe onder stringente omstandigheden kan hybridiseren met een Legionella pneumophila-specifieke nucleïnezuursequentie, waarbij de Legionella pneumophila-spec\f\eke nucleïnezuursequentie een mip gen is; het in contact brengen van een derde probe met de nucleïnezuursequentie van SEQ ID NO:3, welke derde probe onder stringente omstandigheden kan hybridiseren met een Legionella pneumophila serotype 1-specifieke nucleïnezuursequentie, waarbij de Legionella pneumophila serotype 1-specifieke nucleïnezuursequentie een wzm gen is; waarin de eerste, tweede en derde probe detecteerbaar gelabeld zijn; en waarin de werkwijze voorts het detecteren van hybridisatie tussen een of meer gelabelde probes en een nucleïnezuursequentie omvat, waarin detectie van hybridisatie tussen de eerste probe en de Legionella species-specifieke nucleïnezuursequentie indicatief is voor de aanwezigheid van Legionella species in het testmonster, waarin detectie van hybridisatie tussen de tweede probe en de Legionella pneumophila-specïïieke nucleïnezuursequentie indicatief is voor de aanwezigheid van Legionella pneumophila in het testmonster, en waarin detectie van hybridisatie tussen de derde probe en de Legionella pneumophila serotype 1-specifieke nucleïnezuursequentie indicatief is voor de aanwezigheid van Legionella pneumophila serotype 1 in het testmonster.

In een voorkeursuitvoeringsvorm omvat de werkwijze tevens de stap van het vermeerderen van ten minste een deel van de Legionella species-specifieke nucleïnezuursequentie, ten minste een deel van de Legionella pneumophila-spectfleke nucleïnezuursequentie, en ten minste een deel van de Legionella pneumophila serotype 1-specifieke nucleïnezuursequentie. Bij voorkeur vindt deze vermeerderingsstap plaats voorafgaand aan het detecteren van hybridisatie tussen de een of meer gelabelde probes en de genoemde nucleïnezuursequenties omvat. In een geschikte uitvoeringsvorm, vindt deze vermeerderingsstap plaats middels Polymerase Chain Reaction (PCR).

Bij voorkeur kunnen de gelabelde probes onder stringente omstandigheden hybridiseren met dat deel van de specifieke nucleïnezuursequenties, dat tevens vermeerderd wordt in de vermeerderingsstap. Hierdoor kan specifiek (vorming van) vermeerdenngs-product tijdens of na vermeerdering gedetecteerd worden.

In een uitvoeringsvorm wordt het ten minste ene deel van de Legionella species-specifieke nucleïnezuursequentie vermeerderd middels een eerste primerpaar omvattende een eerste voorwaartse primer, die de nucleïnezuursequentie als getoond wordt in SEQ ID NO:4 omvat, en een eerste tegengestelde primer, die de nucleïnezuursequentie als getoond wordt in SEQ ID NO:5 omvat. Bij voorkeur wordt het ten minste ene deel van de Legionella-specifieke nucleïnezuursequentie vermeerderd middels een eerste primerpaar bestaande uit een eerste voorwaartse primer met de nucleïnezuursequentie van SEQ ID NO:4 en een eerste tegengestelde primer met de nucleïnezuursequentie van SEQ ID NO:5.

In een uitvoeringsvorm wordt het ten minste ene deel van de Legionella pneumophila-specifieke nucleïnezuursequentie vermeerderd middels een tweede primerpaar omvattende een tweede voorwaartse primer, die de nucleïnezuursequentie als getoond wordt in SEQ ID NO:6 omvat, en een tweede tegengestelde primer, die de nucleïnezuursequentie als getoond wordt in SEQ ID NO:7 omvat. Bij voorkeur wordt het ten minste ene deel van de Legionella pneumophila-specifieke nucleïnezuursequentie vermeerderd middels een tweede primerpaar bestaande uit een tweede voorwaartse primer met de nucleïnezuursequentie van SEQ ID NO:6 en een tweede tegengestelde primer met de nucleïnezuursequentie van SEQ ID NO:7.

In een uitvoeringsvorm wordt het ten minste ene deel van de Legionella pneumophila serotype 1-specifieke nucleïnezuursequentie vermeerderd middels een derde primerpaar omvattende een derde voorwaartse primer, die de nucleïnezuursequentie als getoond wordt in SEQ ID NO:8 omvat, en een derde tegengestelde primer, die de nucleïnezuursequentie als getoond wordt in SEQ ID NO:9 omvat. Bij voorkeur wordt het ten minste ene deel van de Legionella pneumophila serotype 1-specifieke nucleïnezuursequentie vermeerderd middels een derde primerpaar bestaande uit een derde voorwaartse primer met de nucleïnezuursequentie van SEQ ID NO:8 en een derde tegengestelde primer met de nucleïnezuursequentie van SEQ ID NO:9.

Bij voorkeur worden zowel het eerste primerpaar alsook het tweede primerpaar en het derde primerpaar toegepast in de vermeerderingsstap.

Wanneer de vermeerderingsstap middels PCR wordt uitgevoerd, kunnen de volgende parameters worden gebruikt. Een geschikt thermoprofiel is het volgende: 5 minuten bij 95°C (denaturatie van het cel-DNA), en 40 cycli van 30 seconden bij 95°C (denaturatie van DNA-segmenten), 50 seconden bij 61,5°C (verlenging van de primer). Vanzelfsprekend kunnen de tijden en temperaturen alsmede het aantal cycli enigszins worden aangepast met behoud van goede resultaten.

De verhouding tussen het eerste primerpaar, het tweede primerpaar en het derde primerpaar mag ongeveer 2:1:2 zijn. Bij voorkeur worden de eerste voorwaartse en tegengestelde primer elk toegepast in een eindconcentratie in het gebied van 150-250 nmol/l, met meer voorkeur in het gebied van 175-225 nmol/l, zoals rond ongeveer 200 nmol/l. De tweede voorwaartse en tegengestelde primer worden bij voorkeur elk toegepast in een eindconcentratie in het gebied van 60-140 nmol/l, bij voorkeur 80-120 nmol/l, zoals rond ongeveer 100 nmol/l. De derde voorwaartse en tegengestelde primer worden bij voorkeur elk toegepast in een eindconcentratie in het gebied van 150-250 nmol/l, met meer voorkeur in het gebied van 175-225 nmol/l, zoals rond ongeveer 200 nmol/l.

De eerste probe kan bij voorkeur worden toegepast in een eindconcentratie in het gebied van 150-250 nmol/l, met meer voorkeur in het gebied van 175-225 nmol/l, zoals rond ongeveer 200 nmol/l. De tweede probe kan bij voorkeur worden toegepast in een eindconcentratie in het gebied van 60-140 nmol/l, bij voorkeur 80-120 nmol/l, zoals rond ongeveer 100 nmol/l. De derde probe kan bij voorkeur worden toegepast in een eindconcentratie in het gebied van 150-250 nmol/l, met meer voorkeur in het gebied van 175-225 nmol/l, zoals rond ongeveer 200 nmol/l.

Magnesium chloride (MgCI2) wordt bij voorkeur eveneens in de PCR-reactie toegepast, bijvoorbeeld in een concentratie in het gebied van 2,5-3,5 mM, bij voorkeur 2,75-3,25 mM, zoals bijvoorbeeld ongeveer 3 mM.

De Sensimix II Probe Kit (Amplifa Labortechnik GmbH) mag gebruikt worden in de PCR-methode volgens deze werkwijze volgens de instructies van de fabrikant.

De eerste, tweede en derde probe kunnen fluorescent gelabeld zijn. Fluorescent gelabelde probes zijn in het bijzonder geschikt voor real-time meting van vermeerdering van een doelwit-nucleïnezuursequentie. Ook zijn fluorescent gelabelde probes in het bijzonder geschikt voor multiplex-PCR. Fluorescente groepen (ook wel fluoroforen genoemd) kunnen licht emitteren na excitatie. Verschillende fluorescente groepen emitteren licht van verschillende golflengte. Door de fluorescente groepen voor de eerste probe, de tweede probe en de derde probe dusdanig te kiezen dat ze in een verschillend golflengtegebied licht emitteren, kunnen de fluorescentiesignalen voor elk van de probes tegelijkertijd worden gedetecteerd en van elkaar kunnen worden onderscheiden. Niet-beperkende voorbeelden van geschikte fluoroforen zijn: FAM™, SYBR® Green 1, Fluoresceïne, EvaGreen™, Alexa

Fluor® 488, JOE™, VIC™, HEX™, TET™, Yakima Yellow®, Cal Flour® Gold 540, NED, ROXTM, Cy3.5®, Texas Red®, Alexa Fluor® 568, TEX615, Cy5®, Quasar 670™, LightCycler Red 640®, Alexa Fluor™ 633, Quasar 705TM, LightCycler Red 705®, Alexa Fluor® 680. De vakman is goed in staat de juiste fluoroforen te kiezen voor de probes van deze uitvinding.

De probes kunnen naast een fluorofoor eveneens een quencher omvatten. De vakman is in staat een geschikte quencher te kiezen. Niet-beperkende voorbeelden van een geschikte quencher zijn Dabcyl en BHQ1. De fluorofoor en de quencher kunnen ofwel aan het 5’-uiteinde ofwel aan het 3’-einde van de nucleïnezuursequenties van de eerste, tweede en derde probe zitten.

In een uitvoeringsvorm, omvat de eerste probe de nucleïnezuursequentie 5’-CCGAGCGGTGAGTAACGCGTAGGAATATGGCTCGG-3’ (SEQ ID NO:1). Deze kan aan een of beide uiteinden gekoppeld zijn aan een fluorofoor en eventueel een quencher. In een uitvoeringsvorm is de eerste probe FAM-5’-CCGAGCGGTGAGTAACGCGTAGGAATATGGCTCGG-3'-Dabcyl.

In een uitvoeringsvorm omvat de tweede probe de nucleïnezuursequentie 5TGCCTTTAGCCATTGCTTCCG-'3 (SEQ ID NO:2). Ook deze kan aan een of beide uiteinden gekoppeld zijn aan een fluorofoor en eventueel een quencher. In een uitvoeringsvorm is de tweede probe TEX615-5’- TGCCTTTAGCCATTGCTTCCG-'3-BHQ1.

In een uitvoeringsvorm omvat de derde probe de nucleïnezuursequentie 5'-TCTTGGGATTGGGTTGGGTTATTTTAACTCCT-3' (SEQ ID NO:3). Ook deze kan aan een of beide uiteinden gekoppeld zijn aan een fluorofoor en eventueel een quencher. In een uitvoeringsvorm is de derde probe HEX-5'-TCTTG G GATT G G GTTG G G TT ATTTT AACT CCT-3'-BHQ1 is.

In een verder aspect ziet de uitvinding op een werkwijze voor het tegelijkertijd detecteren van de aanwezigheid van bacteriën van Legionella species, Legionella pneumophila, en Legionella pneumophila serotype 1 in een testmonster, omvattende de stappen: het vermeerderen van ten minste een deel van een Legionella species-specifieke nucleïnezuursequentie middels een eerste primerpaar omvattende een eerste voorwaartse primer, die de nucleïnezuursequentie als getoond wordt in SEQ ID NO:4 omvat, en een eerste tegengestelde primer, die de nucleïnezuursequentie als getoond wordt in SEQ ID NO:5 omvat ter verkrijging van een eerste vermeerderingsproduct, het vermeerderen van ten minste een deel van een Legionella pneumophila-specifieke nucleïnezuursequentie middels een tweede primerpaar omvattende een tweede voorwaartse primer, die de nucleïnezuursequentie als getoond wordt in SEQ ID NO:6 omvat, en een tweede tegengestelde primer, die de nucleïnezuursequentie als getoond wordt in SEQ ID NO:7 omvat ter verkrijging van een tweede vermeerderingsproduct, en het vermeerderen van ten minste een deel van een Legionella pneumophila serotype 1-specifieke nucleïnezuursequentie middels een derde primerpaar omvattende een derde voorwaartse primer, die de nucleïnezuursequentie als getoond wordt in SEQ ID NO:8 omvat, en een derde tegengestelde primer, die de nucleïnezuursequentie als getoond wordt in SEQ ID NO:9 omvat ter verkrijging van een derde vermeerderingsproduct, en het detecteren van het eerste vermeerderingsproduct, het tweede vermeerderingsproduct en het derde vermeerderingsproduct.

Het eerste vermeerderingsproduct (waarvan de nucleïnezuursequentie is weergegeven in SEQ ID NO: 13), het tweede vermeerderingsproduct (waarvan de nucleïnezuursequentie is weergegeven in SEQ ID NO:14) en het derde vermeerderingsproduct (waarvan de nucleïnezuursequentie is weergegeven in SEQ ID NO: 15) kunnen worden gedetecteerd middels iedere techniek bekend voor de vakman. Zij kunnen bijvoorbeeld tegelijkertijd worden gedetecteerd middels een eerste probe, tweede probe, en derde probe, welke probes gericht zijn op de sequentie van het eerste vermeerderingsproduct, tweede vermeerderingsproduct, en derde vermeerderingsproduct, respectievelijk. De probes kunnen gelabeld, bijvoorbeeld fluorescent gelabeld zijn, zoals bijvoorbeeld hierboven beschreven.

In een geschikte uitvoeringsvorm, vindt deze vermeerderingsstap plaats middels Polymerase Chain Reaction (PCR).

Wanneer de vermeerderingsstap middels PCR wordt uitgevoerd, kunnen de hierboven beschreven parameters, concentraties, hulpstoffen en probes worden gebruikt.

Het testmonster kan ieder monster zijn, zolang het DNA bevat. Het kan bijvoorbeeld worden gekozen uit de groep, bestaande uit: een watermonster, een aerosolmonster, longmonster, urinemonster, bronchiaal monster, mucusmonster, een uitstrijkjesmonster, een DNA-monster en een monster waarin een of meer bacteriekolonies zijn gesuspendeerd in een waterig medium. DNA kan voorafgaand aan de werkwijze volgens de uitvinding worden geïsoleerd met behulp van commercieel verkrijgbare kits. Alternatief, kan bijvoorbeeld een bacteriekolonie worden gesuspendeerd in een waterig medium, bijvoorbeeld een zoutoplossing. Ook kan een monster, bijvoorbeeld een watermonster, zonder voorbehandeling worden toegepast in de werkwijze volgens de uitvinding.

Kit voor detectie van Legionella species, Legionella pneumophila, en/of Legionella pneumophila serotype 1

In een ander aspect voorziet deze uitvinding in een kit voor het detecteren van bacteriën van het genus Legionella, de species Legionella pneumophila, en Legionella pneumophila serotype 1 in een testmonster, omvattende: een eerste primerpaar omvattende een eerste voorwaartse primer, die de nucleïnezuursequentie als getoond wordt in SEQ ID NO:4 omvat, en een eerste tegengestelde primer, die de nucleïnezuursequentie als getoond wordt in SEQ ID NO:5 omvat; een tweede primerpaar omvattende een tweede voorwaartse primer, die de nucleïnezuursequentie als getoond wordt in SEQ ID NO:6 omvat, en een tweede tegengestelde primer, die de nucleïnezuursequentie als getoond wordt in SEQ ID NO:7 omvat; en een derde primerpaar omvattende een derde voorwaartse primer, die de nucleïnezuursequentie als getoond wordt in SEQ ID NO:8 omvat, en een derde tegengestelde primer, die de nucleïnezuursequentie als getoond wordt in SEQ ID NO:9 omvat.

In een uitvoeringsvorm bestaat het eerste primerpaar uit een eerste voorwaartse primer met de nucleïnezuursequentie van SEQ ID NO:4 en een eerste tegengestelde primer met de nucleïnezuursequentie van SEQ ID NO:5.

In een uitvoeringsvorm bestaat het tweede primerpaar uit een tweede voorwaartse primer met de nucleïnezuursequentie van SEQ ID NO:6 en een tweede tegengestelde primer met de nucleïnezuursequentie van SEQ ID NO:7.

In een uitvoeringsvorm bestaat het derde primerpaar uit een derde voorwaartse primer met de nucleïnezuursequentie van SEQ ID NO:8 en een derde tegengestelde primer met de nucleïnezuursequentie van SEQ ID NO:9.

In een uitvoeringsvorm omvat de kit ten minste een eerste primerpaar van SEQ ID NO:4 en SEQ ID NO:5, een tweede primerpaar van SEQ ID NO:6 en SEQ ID NO:7, en een derde primerpaar van SEQ ID NO:8 en SEQ ID NO:9.

De kit mag tevens een eerste probe, een tweede probe, en een derde probe omvatten, waarin de eerste probe onder stringente omstandigheden kan hybridiseren met een Legionella species-specifieke nucleïnezuursequentie, waarbij de Legionella species-specifieke nucleïnezuursequentie een 16S rRNA-gen is; waarin de tweede probe onder stringente omstandigheden kan hybridiseren met een Legionella pneumophila-specifieke nucleïnezuursequentie, waarbij de Legionella pneumophila-specifieke nucleïnezuursequentie een mip-gen is; en waarin de derde probe onder stringente omstandigheden kan hybridiseren met een Legionella pneumophila serotype 1-specifieke nucleïnezuursequentie, waarbij de Legionella pneumophila serotype 1-specifieke nucleïnezuursequentie een wzm-gen is; waarin bij voorkeur de eerste, tweede en derde probe detecteerbaar gelabeld zijn.

De eerste, tweede en derde probe kunnen fluorescent gelabeld zijn. Fluorescent gelabelde probes zijn in het bijzonder geschikt voor real-time meting van vermeerdering van een doelwit-nucleïnezuursequentie. Ook zijn fluorescent gelabelde probes in het bijzonder geschikt voor multiplex-PCR. Fluorescente groepen (ook wel fluoroforen genoemd) kunnen licht emitteren na excitatie. Verschillende fluorescente groepen emitteren licht van verschillende golflengte. Door de fluorescente groepen voor de eerste probe, de tweede probe en de derde probe dusdanig te kiezen dat ze in een verschillend golflengtegebied licht emitteren, kunnen de fluorescentiesignalen voor elk van de probes tegelijkertijd worden gedetecteerd en van elkaar kunnen worden onderscheiden. Niet-beperkende voorbeelden van geschikte fluoroforen zijn: FAM™, SYBR® Green 1, Fluoresceïne, EvaGreen™, Alexa Fluor® 488, JOE™, VIC™, HEX™, TET™, Yakima Yellow®, Cal Flour® Gold 540, NED, ROXTM, Cy3.5®, Texas Red®, Alexa Fluor® 568, TEX615, Cy5®, Quasar 670™, LightCycler Red 640®, Alexa Fluor™ 633, Quasar 705TM, LightCycler Red 705®, Alexa Fluor® 680. De vakman is goed in staat de juiste fluoroforen te kiezen voor de probes van deze uitvinding.

De probes kunnen naast een fluorofoor eveneens een quencher omvatten. De vakman is in staat een geschikte quencher te kiezen. Niet-beperkende voorbeelden van een geschikte quencher zijn Dabcyl en BHQ1.

In een uitvoeringsvorm, omvat de eerste probe de nucleïnezuursequentie 5’-CCGAGCGGTGAGTAACGCGTAGGAATATGGCTCGG-3’ (SEQ ID NO:1). Deze kan aan een of beide uiteinden gekoppeld zijn aan een fluorofoor en eventueel een quencher.

In een uitvoeringsvorm is de eerste probe FAM-5’-CCGAGCGGTGAGTAACGCGTAGGAATATGGCTCGG-3'-Dabcyl.

In een uitvoeringsvorm omvat de derde probe de nucleïnezuursequentie 5'-TCTTGGGATTGGGTTGGGTTATTTTAACTCCT-3' (SEQ ID NO:3). Ook deze kan aan een of beide uiteinden gekoppeld zijn aan een fluorofoor en eventueel een quencher.

In een uitvoeringsvorm is de derde probe HEX-5'-TCTTG G GATT G G GTTG G G TT ATTTT AACT CCT-3'-BHQ1 is.

De kit kan aanvullend geschreven instructies voor het detecteren van de aanwezigheid van bacteriën van Legionella species, Legionella pneumophila, en Legionella pneumophila serotype 1 in een testmonster omvat. Deze instructies kunnen gedetailleerde gegevens omvatten met betrekking tot de uitvoering van de multiplex PCR voor detectie van

Legionella van deze uitvinding, zoals hierboven aangegeven zijn betreffende de werkwijze volgens de uitvinding en als beschreven in het voorbeeld.

Toepassingen van de kit primerparen en probes

In een aspect voorziet de uitvinding in toepassing van de kit volgens de uitvinding voor het detecteren van ten minste Legionella species in een testmonster, bij voorkeur voor het detecteren van ten minste Legionella species en Legionella pneumophila in een testmonster, met meer voorkeur voor het detecteren van Legionella species, Legionella pneumophila en Legionella pneumophila serotype 1 in een testmonster.

In een ander aspect voorziet de uitvinding in toepassing van een eerste primerpaar, tweede primerpaar en derde primerpaar voor het detecteren van bacteriën van Legionella species in een testmonster, bij voorkeur voor het tegelijkertijd detecteren van bacteriën van Legionella species en Legionella pneumophila in een testmonster, met meer voorkeur voor het tegelijkertijd detecteren van bacteriën van Legionella species, Legionella pneumophila en Legionella pneumophila serotype 1 in een testmonster, waarin het eerste primerpaar bestaat uit een eerste voorwaartse primer met de nucleïnezuursequentie van SEQ ID NO:4 en een eerste tegengestelde primer met de nucleïnezuursequentie van SEQ ID NO:5 omvat, het tweede primerpaar bestaat uit een tweede voorwaartse primer met de nucleïnezuursequentie van SEQ ID NO:6 en een tweede tegengestelde primer met de nucleïnezuursequentie van SEQ ID NO:7, en het derde primerpaar bestaat uit een derde voorwaartse primer met de nucleïnezuursequentie van SEQ ID NO:8, en een derde tegengestelde primer met de nucleïnezuursequentie van SEQ ID NO:9.

In een uitvoeringsvorm wordt voorts een eerste probe, tweede probe en derde probe gebruikt, waarbij de eerste probe FAM-5’- CCGAGCGGTGAGTAACGCGTAGGAATATGGCTCGG-3'-Dabcyl is, de tweede probe TEX615-5’-TGCCTTTAGCCATTGCTTCCG-'3-BHQ1 is, en de derde probe HEX-5'-TCTTG G GATT G G GTTG G G TT ATTTT AACT CCT-3'-BHQ1 is.

Seguentieliist SEQ ID NO: 1: nucleïnezuursequentie van PlegsPR (probe voor 16S rRNA-gen) SEQ ID NO: 2: nucleïnezuursequentie van PpneuPR (probe voor mip-gen) SEQ ID NO: 3: nucleïnezuursequentie van LptypelPR (probe voor wzm-gen) SEQ ID NO: 4: nucleïnezuursequentie van PlegspF (Voorwaartse primer voor 16S rRNA-gen) SEQ ID NO: 5: nucleïnezuursequentie van PlegspR (Tegengestelde primer voor 16S rRNA-gen) SEQ ID NO: 6: nucleïnezuursequentie van PpneuF (Voorwaartse primer voor mip-gen) SEQ ID NO: 7: nucleïnezuursequentie van PpneuR (Tegengestelde primer voor mip-gen) SEQ ID NO: 8: nucleïnezuursequentie van Lptype1F2 (Voorwaartse primer voor wzm-gen) SEQ ID NO: 9: nucleïnezuursequentie van Lptype1R2 (Tegengestelde primer voor wzm-gen) SEQ ID NO: 10: nucleïnezuursequentie van Legionella pneumophila 16S rRNA-gen SEQ ID NO:11: nucleïnezuursequentie van Legionella pneumophila mip-gen SEQ ID NO: 12: nucleïnezuursequentie van Legionella pneumophila wzm-gen SEQ ID NO: 13: PCR-product van primers met SEQ ID NO:4 en SEQ ID NO:5 in 5’-3’ richting.

SEQ ID NO: 14: PCR-product van primers met SEQ ID NO:6 en SEQ ID NO:7 in 5’-3’ richting.

SEQ ID NO: 15: PCR-product van primers met SEQ ID NO:8 en SEQ ID NO:9 in 5’-3’ richting.

Voorbeeld

Alle Legionella-species bezitten een voor de soort specifiek stuk DNA. Wanneer het uitgangsmateriaal (bijvoorbeeld een kolonie verdacht voor Legionella) in gedestilleerd water wordt gesuspendeerd, komt het DNA door osmotische druk vrij in het water. Dit kan bijvoorbeeld het DNA-monster volgens de uitvinding vormen.

De uitvinders gebruikten een groot aantal primers specifiek voor ofwel Legionella species, ofwel Legionella pneumophila ofwel Legionella pneumophila serotype 1. Allereerst werd getest of combinaties van deze primers konden leiden tot een PCR-product. Voor de validatie werd gebruik gemaakt van diverse bekende Legionella-species (bijv. Legionella cherrii, Legionella gormanni, etcetera), diverse Legionella pneumophila serotypen (bijv. serotypen 2, 6, 9, 12, 14) en diverse Legionella pneumophila serotype 1 stammen. Als negatieve controle werden diverse niet-Legionella species (bijv. Burkholderia cepacia,

Listeria monocytogenes, Stenotrophomonas maltophilia, Proteus vulgaris) gebruikt.

De diverse bacteriestammen werden gekweekt op Oxoid BCYE voedingsbodems. Vervolgens werd 100 pl DNase/RNase vrij water in diverse putjes (wells) van een steriele doorzichtige microtiterplaat gepipetteerd. Een kolonie werd aangetipt en een zichtbare hoeveelheid werd gesuspendeerd in de juiste putjes. Ook kolonies van de positieve en negatieve controles werden aangetipt en een zichtbare hoeveelheid werd gesuspendeerd in de juiste putjes. Ook werden seriële verdunningen (10-voudige, 100-voudige, 1000-voudige verdunning) gemaakt om de detectiegrens te bepalen.

Het bleek dat alleen de volgende primers een product vormen bij dezelfde temperatuur:

Legionella species-specifieke primers:

PlegspF(orwardprimer) 5’- AGGCTAATCTTAAAGCGCC -3' (SEQ ID NO:4) PlegspR(everseprimer) 5’- CCTG G CT CAG ATT GA ACG -3' (SEQ ID NO:5)

Legionella pneumophila-spec\f\eke primers:

PpneuF(orwardprimer) 5’-CCGATGCCACATCATTAGC-‘3 (SEQ ID NO:6)

PpneuR(erverseprimer) 5’-CCAATTGAGCGCCACTCATAG-‘3 (SEQ ID N0:7) Legionella pneumophila serotype 1-specifieke primers:

Lptypel F(orwardprimer)2 5'- CAAAGGGCGTTACAGTCAAACC -3' (SEQ ID NO:8)

Lptypel R(everseprimer)2 5'- CAAACACCCCAACCGTAATCA -3' (SEQ ID N0:9)

De volgende probes werden gebruikt voor real-time detectie van gevormde PCR-producten: Voor Legionella species: PLegspPR(obe) FAM 5'-CCGAGCGGTGAGTAACGCGTAGGAATATGGCTCGG-3' Dabcyl (SEQ ID NO:1)

Voor Legionella pneumophila:

PpneuPR(obe) TEX615 5'-TGCCTTTAGCCATTGCTTCCG-3’ BHQ1 (SEQ ID NO:2) Voor Legionella pneumophila serotype 1:

Lptypel PR(obe) HEX 5'-TCTTGGGATTGGGTTGGGTTATTTTAACTCCT-3' BHQ1 (SEQ ID NO:3)

De probes bevatten een fluorofoor en een quencher. De drie gebruikte fluoroforen FAM, TEX615 en HEX emitteren licht van verschillende golflengten (510, 615 en 555 nm, respectievelijk), en kunnen aldus separaat worden gedetecteerd. Derhalve kan in de tijd de vorming van de drie afzonderlijke PCR-producten tegelijkertijd worden gedetecteerd.

De optimale concentratie van de diverse primers en optimale overige PCR-omstandigheden werden bepaald. Tabel 1 toont de samenstelling van het optimale PCR-reactiemengsel van de triplex PCR volgens de uitvinding.

Tabel 1. PCR-reactiemengsel voor bevestiging Legionella-species en typering van de Legionella-species

Het thermoprofiel voor PCR werd eveneens geoptimaliseerd. Het volgende thermoprofiel gaf zeer goede resultaten: 1. 5 minuten bij 95°C denaturatie en activatie van hot-start Taq polymerase 2. 30 seconden bij 95°C denaturatie (vorming van enkelstrengs DNA) 3. 50 seconden bij 61,5°C verlenging (extension) 4. Stappen 2 en 3 werden 40 keer uitgevoerd

Er werden geen niet-Legionella species gedetecteerd. In het algemeen werden geen vals positieven of vals negatieven gedetecteerd. Verder werd gevonden dat ook 1000-voudige verdunningen van de Legionella-stammen nog konden worden gedetecteerd. Aldus blijkt de triplex-PCR-test van de uitvinding zeer robuust, specifiek en selectief te zijn.

Claims

1. Werkwijze voor het tegelijkertijd detecteren van de aanwezigheid van bacteriën van Legionella species, Legionella pneumophila, en Legionella pneumophila serotype 1 in een testmonster, omvattende de stappen: het vermeerderen van ten minste een deel van een Legionella species-specifieke nucleïnezuursequentie middels een eerste primerpaar omvattende een eerste voorwaartse primer, die de nucleïnezuursequentie als getoond wordt in SEQ ID NO:4 omvat, en een eerste tegengestelde primer, die de nucleïnezuursequentie als getoond wordt in SEQ ID NO:5 omvat ter verkrijging van een eerste vermeerderingsproduct, het vermeerderen van ten minste een deel van een Legionella pneumophila-specifieke nucleïnezuursequentie middels een tweede primerpaar omvattende een tweede voorwaartse primer, die de nucleïnezuursequentie als getoond wordt in SEQ ID NO:6 omvat, en een tweede tegengestelde primer, die de nucleïnezuursequentie als getoond wordt in SEQ ID NO:7 omvat ter verkrijging van een tweede vermeerderingsproduct, en het vermeerderen van ten minste een deel van een Legionella pneumophila serotype 1-specifieke nucleïnezuursequentie middels een derde primerpaar omvattende een derde voorwaartse primer, die de nucleïnezuursequentie als getoond wordt in SEQ ID NO:8 omvat, en een derde tegengestelde primer, die de nucleïnezuursequentie als getoond wordt in SEQ ID NO:9 omvat ter verkrijging van een derde vermeerderingsproduct, en het detecteren van het eerste vermeerderingsproduct, het tweede vermeerderingsproduct en het derde vermeerderingsproduct.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij het vermeerderen van ten minste een deel van een Legionella species-specifieke nucleïnezuursequentie, het vermeerderen van ten minste een deel van een Legionella pneumophila-specifieke nucleïnezuursequentie, en het vermeerderen van ten minste een deel van een Legionella pneumophila serotype 1-specifieke nucleïnezuursequentie in hetzelfde reactiemengsel plaatsvindt.

3. Werkwijze volgens een van conclusies 1 of 2, waarbij het eerste vermeerderingsproduct, het tweede vermeerderings-product en het derde vermeerderingsproduct middels fluorescentie worden gedetecteerd.

4. Werkwijze volgens een van conclusies 1-3, waarbij het eerste vermeerderingsproduct, het tweede vermeerderings-product en het derde vermeerderingsproduct real-time worden gedetecteerd.

5. Werkwijze volgens een van de voorgaande conclusies, waarbij het eerste vermeerderings-product wordt gedetecteerd middels een eerste probe, het tweede vermeerderings-product wordt gedetecteerd middels een tweede probe en het derde vermeerderingsproduct wordt gedetecteerd middels een derde probe.

6. Werkwijze volgens conclusie 5, waarin de eerste, tweede en derde probe een fluorofoor en een quencher omvatten.

7. Werkwijze volgens een van conclusies 5 of 6, waarin de eerste probe de nucleïnezuursequentie 5’-CCGAGCGGTGAGTAACGCGTAGGAATATGGCTCGG-3’ (SEQ ID NO:1) omvat.

8. Werkwijze volgens conclusie 7, waarin de eerste probe FAM-5’-CCGAGCGGTGAGTAACGCGTAGGAATATGGCTCGG-3'-Dabcyl is.

9. Werkwijze volgens een van conclusies 5-8, waarin de tweede probe de nucleïnezuursequentie 5TGCCTTTAGCCATTGCTTCCG-'3 (SEQ ID NO:2) omvat.

10. Werkwijze volgens conclusie 9, waarin de tweede probe TEX615-5’-TGCCTTTAGCCATTGCTTCCG-'3-BHQ1 is.

11. Werkwijze volgens een van conclusies 5-10, waarin de derde probe de nucleïnezuursequentie 5'-TCTTGGGATTGGGTTGGGTTATTTTAACTCCT-3' (SEQ ID NO:3) omvat.

12. Werkwijze volgens conclusie 11, waarin de derde probe HEX-5'-TCTTG G GATT G G GTTG G G TT ATTTT AACT CCT-3'-BHQ1 is.

13. Werkwijze voor het tegelijkertijd detecteren van de aanwezigheid van bacteriën van Legionella species, Legionella pneumophila, en Legionella pneumophila serotype 1 in een testmonster, omvattende: het in contact brengen van een eerste probe met de nucleïnezuursequentie van SEQ ID NO:1, welke eerste probe onder stringente omstandigheden kan hybridiseren met een Legionella species-specifieke nucleïnezuursequentie, waarbij de Legionella species-specifieke nucleïnezuursequentie een 16S rRNA-gen is; het in contact brengen van een tweede probe met de nucleïnezuursequentie van SEQ ID NO:2, welke tweede probe onder stringente omstandigheden kan hybridiseren met een Legionella pneumophila-specïï\eke nucleïnezuursequentie, waarbij de Legionella pneumophila-specifieke nucleïnezuursequentie een mip-gen is; het in contact brengen van een derde probe met de nucleïnezuursequentie van SEQ ID NO:3, welke derde probe onder stringente omstandigheden kan hybridiseren met een Legionella pneumophila serotype 1-specifieke nucleïnezuursequentie, waarbij de Legionella pneumophila serotype 1-specifieke nucleïnezuursequentie een wzm-gen is; waarin de eerste, tweede en derde probe detecteerbaar gelabeld zijn; en waarin de werkwijze voorts het detecteren van hybridisatie tussen een of meer gelabelde probes en een nucleïnezuursequentie omvat, waarin detectie van hybridisatie tussen de eerste probe en de Legionella species-specifieke nucleïnezuursequentie indicatief is voor de aanwezigheid van Legionella species in het testmonster, waarin detectie van hybridisatie tussen de tweede probe en de Legionella pneumophila-specïï\eke nucleïnezuursequentie indicatief is voor de aanwezigheid van Legionella pneumophila in het testmonster, en waarin detectie van hybridisatie tussen de derde probe en de Legionella pneumophila serotype 1-specifieke nucleïnezuursequentie indicatief is voor de aanwezigheid van Legionella pneumophila serotype 1 in het testmonster.

14. Werkwijze volgens conclusie 13, welke voorts de stap omvat: het vermeerderen van ten minste een deel van de Legionella species-specifieke nucleïnezuursequentie, ten minste een deel van de Legionella pneumophila-specifieke nucleïnezuursequentie, en ten minste een deel van de Legionella pneumophila serotype 1-specifieke nucleïnezuursequentie.

15. Werkwijze volgens conclusie 14, waarbij de vermeerderingsstap voorafgaat aan het detecteren van hybridisatie tussen een of meer gelabelde probes en een nucleïnezuursequentie.

16. Werkwijze volgens conclusie 14 of 15, waarbij het ten minste ene deel van de Legionella species-specifieke nucleïnezuursequentie wordt vermeerderd middels een eerste primerpaar omvattende een eerste voorwaartse primer, die de nucleïnezuursequentie als getoond wordt in SEQ ID NO:4 omvat, en een eerste tegengestelde primer, die de nucleïnezuursequentie als getoond wordt in SEQ ID NO:5 omvat.

17. Werkwijze volgens een van conclusies 14-16, waarbij het ten minste ene deel van de Legionella pneumophila-specifieke nucleïnezuursequentie wordt vermeerderd middels een tweede primerpaar omvattende een tweede voorwaartse primer, die de nucleïnezuursequentie als getoond wordt in SEQ ID NO:6 omvat, en een tweede tegengestelde primer, die de nucleïnezuursequentie als getoond wordt in SEQ ID NO:7 omvat.

18. Werkwijze volgens een van conclusies 14-17, waarbij het ten minste ene deel van de Legionella pneumophila serotype 1-specifieke nucleïnezuursequentie wordt vermeerderd middels een derde primerpaar omvattende een derde voorwaartse primer, die de nucleïnezuursequentie als getoond wordt in SEQ ID NO:8 omvat, en een derde tegengestelde primer, die de nucleïnezuursequentie als getoond wordt in SEQ ID NO:9 omvat.

19. Werkwijze volgens een van conclusies 14-18, waarbij het eerste primerpaar, het tweede primerpaar en het derde primerpaar wordt toegepast in de vermeerderingsstap.

20. Werkwijze volgens een van conclusies 14-19, waarin de eerste, tweede en derde probe een fluorofoor en een quencher omvatten.

21. Werkwijze volgens een van conclusies 14-20, waarin de eerste probe de nucleïnezuursequentie 5’-CCGAGCGGTGAGTAACGCGTAGGAATATGGCTCGG-3' (SEQ ID NO:1) omvat.

22. Werkwijze volgens conclusie 21, waarin de eerste probe FAM-5’-CCGAGCGGTGAGTAACGCGTAGGAATATGGCTCGG-3'-Dabcyl is.

23. Werkwijze volgens een van conclusies 14-22, waarin de tweede probe de nucleïnezuursequentie 5TGCCTTTAGCCATTGCTTCCG-'3 (SEQ ID NO:2) omvat.

24. Werkwijze volgens conclusie 23, waarin de tweede probe TEX615-5’-TGCCTTTAGCCATTGCTTCCG-'3-BHQ1 is.

25. Werkwijze volgens een van conclusies 14-24, waarin de derde probe de nucleïnezuursequentie 5'-TCTTGGGATTGGGTTGGGTTATTTTAACTCCT-3' (SEQ ID NO:3) omvat.

26. Werkwijze volgens conclusie 25, waarin de derde probe HEX-5'-T CTT G G GATT GGGTTG G GTT ATTTT AACTCCT-3'-B HQ1 is.

27. Werkwijze volgens een van de voorgaande conclusies, waarin het testmonster is gekozen uit de groep, bestaande uit: een watermonster, een aerosolmonster, longmonster, urinemonster, bronchiaal monster, mucusmonster, een uitstrijkjesmonster, een DNA-monster en een monster waarin een of meer bacteriekolonies zijn gesuspendeerd in een waterig medium.

28. Een kit voor het detecteren van de aanwezigheid van bacteriën van Legionella species, Legionella pneumophila, en Legionella pneumophila serotype 1 in een testmonster, omvattende: een eerste primerpaar omvattende een eerste voorwaartse primer, die de nucleïnezuursequentie als getoond wordt in SEQ ID NO:4 omvat, en een eerste tegengestelde primer, die de nucleïnezuursequentie als getoond wordt in SEQ ID NO:5 omvat; een tweede primerpaar omvattende een tweede voorwaartse primer, die de nucleïnezuursequentie als getoond wordt in SEQ ID NO:6 omvat, en een tweede tegengestelde primer, die de nucleïnezuursequentie als getoond wordt in SEQ ID NO:7 omvat; en een derde primerpaar omvattende een derde voorwaartse primer, die de nucleïnezuursequentie als getoond wordt in SEQ ID NO:8 omvat, en een derde tegengestelde primer, die de nucleïnezuursequentie als getoond wordt in SEQ ID NO:9 omvat.

29. Een kit volgens conclusie 28, die tevens een eerste probe, een tweede probe, en een derde probe omvat, waarin de eerste probe onder stringente omstandigheden kan hybridiseren met een Legionella species-specifieke nucleïnezuursequentie, waarbij de Legionella species-specifieke nucleïnezuursequentie een 16S rRNA-gen is; waarin de tweede probe onder stringente omstandigheden kan hybridiseren met een Legionella pneumophila-specifieke nucleïnezuursequentie, waarbij de Legionella pneumophila-spec\f\eke nucleïnezuursequentie een mip-gen is; waarin de derde probe onder stringente omstandigheden kan hybridiseren met een Legionella pneumophila serotype 1-specifieke nucleïnezuursequentie, waarbij de Legionella pneumophila serotype 1-specifieke nucleïnezuursequentie een wzm-gen is; waarin bij voorkeur de eerste, tweede en derde probe detecteerbaar gelabeld zijn.

30. De kit volgens conclusie 29, waarin de eerste, tweede en derde probe fluorescent gelabeld zijn.

31. De kit volgens conclusie 29, waarin de eerste, tweede en derde probe een fluorofoor en een quencer omvatten.

32. De kit volgens een van conclusies 29-31, waarin de eerste probe de nucleïnezuursequentie 5’-CCGAGCGGTGAGTAACGCGTAGGAATATGGCTCGG-3' (SEQ ID NO:1) omvat.

33. De kit volgens conclusie 32, waarin de eerste probe FAM-5’-CCGAGCGGTGAGTAACGCGTAGGAATATGGCTCGG-3'-Dabcyl is.

34. De kit volgens een van conclusies 29-33, waarin de tweede probe de nucleïnezuursequentie 5TGCCTTTAGCCATTGCTTCCG-'3 (SEQ ID NO:2) omvat.

35. De kit volgens conclusie 34, waarin de tweede probe TEX615-5’-TGCCTTTAGCCATTGCTTCCG-'3-BHQ1 is.

36. De kit volgens een van conclusies 29-35, waarin de derde probe de nucleïnezuursequentie ö'-TCTTGGGATTGGGTTGGGTTATTTTAACTCCT-3' (SEQ ID NO:3) omvat.

37. De kit volgens conclusie 36, waarin de derde probe HEX-5'-TCTTG G GATT G G GTTG G G TT ATTTT AACT CCT-3'-BHQ1 is.

38. De kit volgens een van conclusies 28-37, die voorts geschreven instructies voor het detecteren van de aanwezigheid van bacteriën van Legionella species, Legionella pneumophila, en Legionella pneumophila serotype 1 in een testmonster omvat.

39. Toepassing van de kit volgens een van conclusies 28-38 voor het detecteren van ten minste Legionella species in een testmonster.

40. Toepassing volgens conclusie 39, voor het detecteren van ten minste Legionella species en Legionella pneumophila in een testmonster.

41. Toepassing volgens conclusie 40, voor het detecteren van Legionella species, Legionella pneumophila en Legionella pneumophila serotype 1 in een testmonster.

42. Toepassing van een eerste primerpaar, tweede primerpaar en derde primerpaar voor het detecteren van bacteriën van Legionella species in een testmonster, waarin het eerste primerpaar bestaat uit een eerste voorwaartse primer met de nucleïnezuursequentie van SEQ ID NO:4 en een eerste tegengestelde primer met de nucleïnezuursequentie van SEQ ID NO:5 omvat, het tweede primerpaar bestaat uit een tweede voorwaartse primer met de nucleïnezuursequentie van SEQ ID NO:6 en een tweede tegengestelde primer met de nucleïnezuursequentie van SEQ ID NO:7, en het derde primerpaar bestaat uit een derde voorwaartse primer met de nucleïnezuursequentie van SEQ ID NO:8, en een derde tegengestelde primer met de nucleïnezuursequentie van SEQ ID NO:9.

43. Toepassing volgens conclusie 42 voor het tegelijkertijd detecteren van bacteriën van Legionella species en Legionella pneumophila in een testmonster.

44. Toepassing volgens conclusie 43 voor het tegelijkertijd detecteren van bacteriën van Legionella species, Legionella pneumophila en Legionella pneumophila serotype 1 in een testmonster.

45. Toepassing volgens een van conclusies 42-44, waarbij voorts een eerste probe, tweede probe en derde probe worden gebruikt, waarbij de eerste probe FAM-5’-CCGAGCGGTGAGTAACGCGTAGGAATATGGCTCGG-3'-Dabcyl is, de tweede probe TEX615-5’-TGCCTTTAGCCATTGCTTCCG-'3-BHQ1 is, en de derde probe HEX-5'-TCTTG G GATT G G GTTG G G TT ATTTT AACT CCT-3'-BHQ1 is.