JP2017515455A - フコシル化オリゴ糖の生産に使用するためのアルファ(1,2)フコシルトランスフェラーゼ・シンジーン - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、精製されたオリゴ糖、特に、典型的にはヒト乳中で見出される特定のフコシル化オリゴ糖を生産するための組成物および方法を提供する。
ヒト乳は、多種で豊富な中性および酸性オリゴ糖群を含んでいる。130を超える異なる複合オリゴ糖がヒト乳において同定されており、それらの構造の多様さおよび豊富さは、ヒトに特有である。これらの分子は、栄養分としては乳児によって直接利用されないかもしれないが、そうであったとしてもそれらは健康な腸内微生物環境の確立、疾患の予防および免疫機能において重要な役割を果たしている。本明細書に記載される本発明より以前は、ヒト乳オリゴ糖(HMOS)を安価で生産する能力に問題があった。例えば、化学合成を通じたそれらの生産は立体特異性の問題、前駆体の入手性、生産物の不純度およびかさむ総費用によって制限されていた。そのため、多量のHMOSを安価で生産する新しい戦略が切に求められている。
1)配列データベースのコンピュータ検索を行い、任意の既知のラクトース利用性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼの単純配列ホモログ(simple sequence homolog)の大グループを定義する工程;
2)工程(1)のリストを使用して、リストのメンバーによって共有されている共通配列および/または構造モチーフを含む検索プロフィールを抽出する工程;
3)工程(2)で抽出された共通配列または構造モチーフに基づく検索プロフィールをクエリーとして使用して配列データベースを検索し、参照ラクトース利用性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼに対する配列相同性が既定のパーセントしきい値である候補配列を同定する工程;
4)自然状態でα(1,2)フコシル-グリカンを発現することで特徴づけられる候補生物のリストをコンパイルする工程;
5)候補生物由来である候補配列を選択し、候補ラクトース利用性酵素のリストを生成する工程;
6)宿主生物において候補ラクトース利用性酵素を発現させる工程;ならびに
7)ラクトース利用性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ活性について試験する工程であって、その生物における所望のフコシル化オリゴ糖産物の検出が、候補配列が新規のラクトース利用性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼを含むことを示す、工程、
を含む。別の態様において、検索プロフィールは、既知のα(1,2)-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する2つ以上の酵素のアミノ酸配列の多配列アラインメントから生成される。データベース検索は、その後、多配列アラインメントクエリーに対して有意な配列類似性を有する新規のα(1,2)フコシルトランスフェラーゼを純化し繰り返し検索するよう設計され得る。
いくつかの研究はヒト乳グリカンが抗菌性抗接着剤として使用され得ることを示唆しているが、ヒトが消費するのに適した品質のこれらの剤を十分量生産する困難さおよび費用の高さがそれらのフルスケールの試験および想定されている用途を制限している。必要とされていることは、妥当な費用で十分量の適当なグリカンを生産する適切な方法である。本明細書に記載される本発明より以前に、グリカン合成に関して様々な異なる合成アプローチを使用する試みがなされていた。いくつかの化学的アプローチは、オリゴ糖を合成することができる(Flowers,H.M. Methods Enzymol 50, 93-121 (1978); Seeberger,P.H. Chem Commun (Camb) 1115-1121 (2003))が、これらの方法のための試薬は高価でありかつ潜在的に毒性である(Koeller,K.M. & Wong,C.H. Chem Rev 100, 4465-4494 (2000))。改変された生物から発現される酵素(Albermann,C., Piepersberg,W. & Wehmeier,U.F. Carbohydr Res 334, 97-103 (2001); Bettler,E., Samain,E., Chazalet,V., Bosso,C., et al. Glycoconj J 16, 205-212 (1999); Johnson,K.F. Glycoconj J 16, 141-146 (1999); Palcic,M.M. Curr Opin Biotechnol 10, 616-624 (1999); Wymer,N. & Toone,E.J. Curr Opin Chem Biol 4, 110-119 (2000))は正確かつ効率的な合成を提供する(Palcic,M.M. Curr Opin Biotechnol 10, 616-624 (1999); Crout,D.H. & Vic,G. Curr Opin Chem Biol 2, 98-111 (1998))が、試薬、特に糖ヌクレオチドの費用の高さが、低費用大規模生産におけるそれらの利用を制限している。微生物は、その細菌の生まれつきのヌクレオチド糖プールからオリゴ糖を合成するのに必要とされるグリコシルトランスフェラーゼを発現するよう遺伝子改変される(Endo,T., Koizumi,S., Tabata,K., Kakita,S. & Ozaki,A. Carbohydr Res 330, 439-443 (2001); Endo,T., Koizumi,S., Tabata,K. & Ozaki,A. Appl Microbiol Biotechnol 53, 257-261 (2000); Endo,T. & Koizumi,S. Curr Opin Struct Biol 10, 536-541 (2000); Endo,T., Koizumi,S., Tabata,K., Kakita,S. & Ozaki,A. Carbohydr Res 316, 179-183 (1999); Koizumi,S., Endo,T., Tabata, K. & Ozaki,A. Nat Biotechnol 16, 847-850 (1998))。しかし、本明細書に記載される本発明より以前には、代謝的に改変された細菌宿主におけるHMOS合成に有用なさらなるグリコシルトランスフェラーゼを同定および特徴づける要望が高まっていた。
ヒト乳は、多種で豊富な中性および酸性オリゴ糖群を含んでいる(Kunz,C., Rudloff,S., Baier,W., Klein,N., and Strobel,S. (2000). Annu Rev Nutr 20, 699-722; Bode,L. (2006). J Nutr 136, 2127-130)。130を超える異なる複合オリゴ糖がヒト乳において同定されており、それらの構造の多様さおよび豊富さは、ヒトに特有である。これらの分子は、栄養分としては乳児によって直接利用されないかもしれないが、そうであったとしてもそれらは健康な腸内微生物環境の確立(Marcobal,A., Barboza,M., Froehlich,J.W., Block,D.E., et al. J Agric Food Chem 58, 5334-5340 (2010))、疾患の予防(Newburg,D.S., Ruiz-Palacios,G.M. & Morrow,A.L. Annu Rev Nutr 25, 37-58 (2005))および免疫機能(Newburg,D.S. & Walker,W.A. Pediatr Res 61, 2-8 (2007))において重要な役割を果たしている。ヒト乳オリゴ糖(HMOS)との接触が数百年に及んでいるにもかかわらず、病原体は今もなお、標的細胞への接着を妨げ感染を阻害するHMOSの能力を回避する方法を開発しなければならない。病原体接着阻害物質としてHMOSを利用する能力は、現在の急増する抗生物質耐性の危機に取り組む上で有用である。生合成により生産されたヒト乳オリゴ糖は、社会の最も対処困難な問題のいくつかに対する新規クラスの治療剤のリード化合物となる。
非結合オリゴ糖およびそれらの複合多糖の両方を含むヒト乳グリカンは、乳児の胃腸(GI)管の保護および発達において重要な役割を果たしている。2'-フコシルラクトース(2'-FL)を含む中性フコシル化オリゴ糖は、様々な重要な病原体から乳児を保護する。様々な哺乳動物において見出される乳オリゴ糖は大きく異なっており、ヒトの組成は特有である(Hamosh M., 2001 Pediatr Clin North Am, 48:69-86; Newburg D.S., 2001 Adv Exp Med Biol, 501:3-10)。さらに、ヒト乳におけるグリカンレベルは、授乳期を通じて変化し、個体間でも大きく異なる(Morrow A.L. et al., 2004 J Pediatr, 145:297-303; Chaturvedi P et al., 2001 Glycobiology, 11:365-372)。およそ200個の異なるヒト乳オリゴ糖が同定されており、単エピトープの組み合わせがこの多様性を担っている(Newburg D.S., 1999 Curr_Med Chem, 6:117-127; Ninouevo M. et al., 2006 J Agric Food Chem, 54:7471-74801)。
ヒトミルクグリカンは、腸管病原体の細胞受容体に対する構造的相同性を有し、受容体のデコイとして機能する。例えば、カンピロバクター(Campylobacter)の病原性株は、H-2を含むグリカン、すなわち2'-フコシル-N-アセチルラクトサミンまたは2'-フコシルラクトース(2'FL)に特異的に結合し;カンピロバクターの結合および感染性は2'-FLおよびこのH-2エピトープを含む他のグリカンによって阻害される。同様に、いくつかの下痢誘発性大腸菌病原体は、インビボで、2結合型フコース部分を含むヒトミルクオリゴ糖によって強く阻害される。ヒトカリシウイルスのいくつかの主要株、特にノロウイルスもまた2結合型フコシル化グリカンに結合し、この結合はヒトミルク2結合型フコシル化グリカンによって阻害される。これらの2結合型フコシルオリゴ糖を高レベルで有するヒトミルクの摂取は、ノロウイルス、カンピロバクター、大腸菌関連下痢のSTおよびメキシコ人乳児集団におけるすべての原因の中等度〜重度の下痢の危険の低下に関連した(Newburg D.S. et al., 2004 Glycobiology, 14:253-263; Newburg D.S. et al., 1998 Lancet, 351:1160-1164)。いくつかの病原体、例えばインフルエンザ(Couceiro,J.N., Paulson,J.C. & Baum,L.G. Virus Res 29, 155-165 (1993))、パラインフルエンザ(Amonsen,M., Smith,D.F., Cummings,R.D. & Air,G.M. J Virol 81, 8341-8345 (2007))およびロタウイルス(rotovirus)(Kuhlenschmidt,T.B., Hanafin,W.P., Gelberg,H.B. & Kuhlenschmidt,M.S. Adv Exp Med Biol 473, 309-317 (1999))は、それらの宿主受容体としてシアル化グリカンを利用する。シアリル-ルイスXエピトープは、ヘリコバクター・ピロリ(Mahdavi,J., Sonden,B., Hurtig,M., Olfat,F.O., et al. Science 297, 573-578 (2002))、シュードモナス・エルギノーサ(Scharfman,A., Delmotte,P., Beau,J., Lamblin,G., et al. Glycoconj J 17, 735-740 (2000))およびノロウイルスのいくつかの株(Rydell,G.E., Nilsson,J., Rodriguez-Diaz, J., Ruvoen-Clouet,N., et al. Glycobiology 19, 309-320 (2009))によって使用される。
本発明は、新規のα(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素を提供する。本発明はまた、宿主細菌における新規のα(1,2)フコシルトランスフェラーゼの発現のための新規のα(1,2)フコシルトランスフェラーゼの核酸配列を有する核酸コンストラクト(すなわち、プラスミドまたはベクター)を提供する。本発明はまた、本明細書でさらに記載されるように、適当な宿主生産細菌において新規のα(1,2)フコシルトランスフェラーゼを発現させることによってフコシル化オリゴ糖を生産する方法を提供する。
本明細書には、代謝的に改変された大腸菌におけるフコシル結合オリゴ糖の合成に関して新規のα(1,2)フコシルトランスフェラーゼ(α(1,2)FT)を有効化するために使用した遺伝子スクリーニングアプローチが記載されている。HMOS 2'-フコシルラクトース(2'-FL)を合成することができるα(1,2)FTが、特に関心対象である。2'-FLは、ヒト乳中に存在する最も豊富なフコシル化オリゴ糖であり、このオリゴ糖は、細菌病原体、例えばカンピロバクター・ジェジュニにより引き起こされる感染性下痢に対する保護を新生児に提供する(Ruiz-Palacious,G.M., et al. (2003). J Biol Chem 278, 14112-120; Morrow,A.L. et al. (2004). J Pediatr 145, 297-303; Newburg,D.S. et al. (2004). Glycobiology 14, 253-263)。他の関心対象のα(1,2)FTは、HMOSラクトジフコテトラオース(LDFT)、ラクト-N-フコペンタオースI(LNF I)またはラクト-N-ジフコヘキサオースI(LDFH I)の合成が可能なものである。
大腸菌K-12は、微生物生理学および遺伝学における幅広い研究の対象であり、様々な工業利用において商業的に利用されている、よく研究された細菌である。その親種である大腸菌の自然生息場所は、哺乳動物の大腸である。大腸菌K-12は、安全使用の歴史があり、その派生株は、ヒトに投与およびヒトが消費するための化合物および薬物の生産を含む多くの工業用途で使用されている。大腸菌K-12は、1922年に、回復期のジフテリア患者から最初に単離された。それは毒性を有さず、一般的な研究用培地で容易に成長し、そして微生物生理学および遺伝学の研究において広く使用されているので、微生物学の研究、教育ならびに工業用および医薬用製品の生産において使用される標準的な細菌株となっている。大腸菌K-12は、現在、実験環境で70年を超えて維持された結果として弱体化された生物であるとみなされている。その結果、K-12株は、通常の条件下でヒトおよび他の動物の腸にコロニーを形成することができない。この周知の菌株に関するさらなる情報は、http://epa.gov/oppt/biotech/pubs/fra/fra004.htmで入手可能である。大腸菌K12に加えて、他の細菌株も生産宿主株として使用され、例えば、様々な細菌種、例えばエルウィニア・ヘルビコラ(パントエア・アグロメランス)、シトロバクター・フロインディ、パントエア・シトレア、ペクトバクテリウム・カロトボルムまたはザントモナス・カンペストリス、がオリゴ糖生合成法において使用され得る。バチルス・サブチリス、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・コアグランス、バチルス・サーモフィルス、バチルス・ラテロスポールス、バチルス・メガテリウム、バチルス・ミコイデス、バチルス・プミルス、バチルス・レンタス、バチルス・セレウスおよびバチルス・サーキュランスを含むバチルス属の細菌もまた使用され得る。同様に、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・サリバリウス、ラクトバチルス・プランタルム、ラクトバチルス・ヘルベティクス、ラクトバチルス・デルブリュッキイ、ラクトバチルス・ラムノサス、ラクトバチルス・ブルガリクス、ラクトバチルス・クリスパータス、ラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・イエンセニイおよびラクトコッカス・ラクティスを含むがこれらに限定されないラクトバチルスおよびラクトコッカス属の細菌が、本発明の方法を用いて修飾され得る。ストレプトコッカス・サーモフィルスおよびプロピオニバクテリウム・フロイデンライシイもまた、本明細書に記載される発明に適した細菌種である。本明細書に記載されるように修飾された、エンテロコッカス(例えば、エンテロコッカス・フェシウムおよびエンテロコッカス・サーモフィルス)、ビフィドバクテリウム(例えば、ビフィドバクテリウム・ロングム、ビフィドバクテリウム・インファンティスおよびビフィドバクテリウム・ビフィダム)属、スポロラクトバチルス種、ミクロモノスポラ種、ミクロコッカス種、ロドコッカス種およびシュードモナス(例えば、シュードモナス・フルオレッセンスおよびシュードモナス・エルギノーサ)由来の株もまた本発明の一部として含まれる。
40g (NH4)2HPO4
100g KH2PO4
10g MgSO4.7H2O
40g NaOH
1X 微量元素:
1.3g NTA(ニトリロ三酢酸)
0.5g FeSO4.7H2O
0.09g MnCl2.4H2O
0.09g ZnSO4.7H2O
0.01g CoCl2.6H2O
0.01g CuCl2.2H2O
0.02g H3BO3
0.01g Na2MoO4.2H2O(pH 6.8)
水で10リットルに
DF204消泡剤(0.1ml/L)
150g グリセロール(初期バッチ生育)、その後に様々な時間、様々な速度で90%グリセロール-1% MgSO4-1X 微量元素を供給する流加モード。
さらなる新規のα(1,2)フコシルトランスフェラーゼを同定するために、4つの以前に同定されたラクトース利用性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼタンパク質配列:H.ピロリfutC(SEQ ID NO:1)、H.ムステラエFutL(SEQ ID NO:2)、バクテロイデス・ブルガタスfutN(SEQ ID NO:3)および大腸菌O126 wbgL(SEQ ID NO:4)を用い、CLCbio Main Workbenchパッケージ、バージョン6.9(CLCbio、10 Rogers Street #101, Cambridge, Massachusetts 02142, USA)のアラインメントアルゴリズムを用いて多配列アラインメントクエリーを生成した。この4つの以前に同定されたラクトース利用性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼタンパク質配列間の配列アラインメントおよび配列同一性の比率が図3に示されている。クエリーとしてFASTA形式の多配列アラインメントを用いて反復PSI-BLASTを行い、NCBI PSI-BLASTプログラムをNCBI BLAST+バージョン2.2.29のローカルコピー上で実施した。初期位置特異的スコア行列ファイル(.pssm)をPSI-BLASTによって生成し、次いでこれを反復的相同性検索のスコアを調整するために使用した。このプロセスをさらに大きな候補グループを生成するために繰り返し、各回の結果を、行列をさらに洗練させるために使用した。
psiblast-db<LOCAL NR database name> -max_target_seqs 2500-in_msa<MSA file in FAST format> -out <results output file> -outfmt"7sskingdoms sscinames scomnames sseqid stitle evalue length pident" -out_pssm<PSSM file output> -out_ascii_pssm<PSSM(ascii) output> -num_iterations 6 -num_threads 8
ラクトース利用性フコシルトランスフェラーゼ活性を試験するため、候補酵素(すなわち、シンジーン)を発現し、細胞質GDP-フコースおよびラクトースプールの両方を含む宿主生物においてフコシル化オリゴ糖(すなわち、2'-FL)の産生を評価する。フコシル化オリゴ糖の産生は、候補酵素をコードする配列がラクトース利用性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼとして機能することを示す。同定されたヒットのうち、12個の新規のα(1,2)フコシルトランスフェラーゼを、2'-フコシルラクトースを産生するそれらの機能的能力についてさらに分析した:プレボテラ・メラニノゲニカFutO、クロストリジウム・ボルテアエFutP、クロストリジウム・ボルテアエ+13 FutP、ラクノスピラセアエ種FutQ、メタノスファエルラ・パルストリスFutR、タネレラ種FutS、バクテロイデス・カカエFutU、ブチリビブリオFutV、プレボテラ種FutW、パラバクテロイデス・ジョンソニイFutX、アケルマンシア・ムシニフィリアFutY、サルモネラ菌FutZ、バクテロイデス種FutZA。
新規のα(1,2)FTであるFutO、FutQおよびFutXを発現する細菌のさらなる特徴付けを行った。詳細には、増殖速度および外因性α(1,2)FT発現を試験した。
B.ブルガタスFutNを発現するよう代謝的に改変された大腸菌細胞によって生産されたフコシル化オリゴ糖を、発酵後の培養ブロスから精製した。
本発明はその詳細な説明に関連して説明されているが、これまでの説明は例示を意図したものであり、発明の範囲を限定するものではなく、発明の範囲は添付の特許請求の範囲によって定義されるものである。他の局面、利点および変更も添付の特許請求の範囲に包含される。
Claims (47)
- 外因性ラクトース利用性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素を含む細菌を提供する工程を含み、該酵素のアミノ酸配列がFutC(SEQ ID NO:1)に対して少なくとも22%の同一性を有する、細菌内でフコシル化オリゴ糖を生産する方法。
- 外因性ラクトース利用性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素を含む細菌を提供する工程を含み、該酵素のアミノ酸配列がFutN(SEQ ID NO:3)に対して少なくとも25%の同一性を有する、細菌内でフコシル化オリゴ糖を生産する方法。
- α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素が、パラバクテロイデス・ジョンソニイ(Parabacteroides johnsonii)FutX、ラクノスピラセアエ(Lachnospiraceae)種FutQ、プレボテラ・メラニノゲニカ(Prevotella melaninogenica)FutO、プレボテラ種FutW、バクテロイデス(Bacteroides)種FutZA、タネレラ(Tannerella)種FutS、クロストリジウム・ボルテアエ(Clostridium bolteae)+13 FutP、バクテロイデス・カカエ(Bacteroides caccae)FutU、サルモネラ菌(Salmonella enterica)FutZ、メタノスファエルラ・パルストリス(Methanosphaerula palustries)FutR、ブチリビブリオ(Butyrivibrio)FutV、アケルマンシア・ムシニフィリア(Akkermansia muciniphilia)FutY、クロストリジウム・ボルテアエFutP、またはそれらの機能的変種もしくはフラグメントから選択されるいずれか一つを含む、請求項1または2記載の方法。
- α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素が、アミノ酸配列SEQ ID NO:10〜21および292のいずれか一つまたはそれらの機能的変種もしくはフラグメントを含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 前記細菌からまたは前記細菌の培養上清からフコシル化オリゴ糖を回収する工程をさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- フコシル化オリゴ糖が、2'-フコシルラクトース(2'-FL)、ラクトジフコテトラオース(LDFT)、ラクト-N-フコペンタオースI(LNF I)、またはラクト-N-ジフコヘキサオースI(LDFH I)を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 前記細菌がさらに、外因性ラクトース利用性α(1,3)フコシルトランスフェラーゼ酵素および/または外因性ラクトース利用性α(1,4)フコシルトランスフェラーゼ酵素を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 外因性ラクトース利用性α(1,3)フコシルトランスフェラーゼ酵素が、ピロリ菌(Helicobacter pylori)26695 futA遺伝子を含む、請求項7記載の方法。
- 外因性ラクトース利用性α(1,4)フコシルトランスフェラーゼ酵素が、ピロリ菌UA948 FucTa遺伝子またはピロリ菌株DMS6709 FucT III遺伝子を含む、請求項7記載の方法。
- 前記細菌がさらに、減少したレベルのβ-ガラクトシダーゼ活性、不完全なコラン酸合成経路、不活性化されたATP依存性細胞内プロテアーゼ、不活性化されたlacAまたはそれらの組み合わせを伴う、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- トリプトファンの存在下およびチミジンの非存在下で前記細菌を培養する工程をさらに含む、請求項10記載の方法。
- 減少したレベルのβ-ガラクトシダーゼ活性が、前記細菌の欠失もしくは不活性化された内因性lacZ遺伝子および/または欠失もしくは不活性化された内因性lacI遺伝子を伴う、請求項10記載の方法。
- 減少したレベルのβ-ガラクトシダーゼ活性がさらに、野生型細菌より低いβ-ガラクトシダーゼ活性レベルを含む外因性lacZ遺伝子またはその変種を伴う、請求項12記載の方法。
- 減少したレベルのβ-ガラクトシダーゼ活性が、野生型細菌より低い活性レベルを含む、請求項10記載の方法。
- 減少したレベルのβ-ガラクトシダーゼ活性が、6,000単位未満のβ-ガラクトシダーゼ活性を含む、請求項14記載の方法。
- 減少したレベルのβ-ガラクトシダーゼ活性が、1,000単位未満のβ-ガラクトシダーゼ活性を含む、請求項14記載の方法。
- 前記細菌が、lacY遺伝子の直接上流にlacIq遺伝子プロモーターを含む、請求項10記載の方法。
- 不完全なコラン酸合成経路が、前記細菌のwcaJ遺伝子の不活性化を伴う、請求項10記載の方法。
- 不活性化されたATP依存性細胞内プロテアーゼが、内因性lon遺伝子のヌル変異、不活性化変異、または欠失である、請求項10記載の方法。
- 内因性lon遺伝子の不活性化変異が、機能性大腸菌(E.coli)lacZ+遺伝子の挿入を含む、請求項19記載の方法。
- 前記細菌がさらに、機能性ラクトースパーミアーゼ遺伝子を含む、請求項10記載の方法。
- 前記細菌が、大腸菌lacYを含む、請求項21記載の方法。
- 前記細菌がさらに、外因性大腸菌rcsAまたは大腸菌rcsB遺伝子を含む、請求項10記載の方法。
- 前記細菌がさらに、thyA遺伝子内に変異を含む、請求項10記載の方法。
- 前記細菌が、外因性ラクトースの存在下で細胞内ラクトースを蓄積する、請求項10記載の方法。
- 前記細菌が、細胞内GDP-フコースを蓄積する、請求項10記載の方法。
- 前記細菌が大腸菌である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 生産株が、バチルス(Bacillus)、パントエア(Pantoea)、ラクトバチルス(Lactobacillus)、ラクトコッカス(Lactococcus)、ストレプトコッカス(Streptococcus)、プロプリオニバクテリウム(Proprionibacterium)、エンテロコッカス(Enterococcus)、ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)、スポロラクトバチルス(Sporolactobacillus)、ミクロモモスポラ(Micromomospora)、ミクロコッカス(Micrococcus)、ロドコッカス(Rhodococcus)、またはシュードモナス(Pseudomonas)属のメンバーである、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 生産株が、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)、バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)、バチルス・コアグランス(Bacillus coagulans)、バチルス・サーモフィルス(Bacillus thermophilus)、バチルス・ラテロスポールス(Bacillus laterosporus)、バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)、バチルス・ミコイデス(Bacillus mycoides)、バチルス・プミルス(Bacillus pumilus)、バチルス・レンタス(Bacillus lentus)、バチルス・セレウス(Bacillus cereus)、およびバチルス・サーキュランス(Bacillus circulans)、エルウイニア・ヘルビコラ(Erwinia herbicola)(パントエア・アグロメランス(Pantoea agglomerans))、シトロバクター・フロインディ(Citrobacter freundii)、パントエア・シトレア(Pantoea citrea)、ペクトバクテリウム・カロトボルム(Pectobacterium carotovorum)、ザントモナス・カンペストリス(Xanthomonas campestris)、ラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)、ラクトバチルス・サリバリウス(Lactobacillus salivarius)、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)、ラクトバチルス・ヘルベティクス(Lactobacillus helveticus)、ラクトバチルス・デルブリュッキイ(Lactobacillus delbrueckii)、ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルス・ブルガリクス(Lactobacillus bulgaricus)、ラクトバチルス・クリスパータス(Lactobacillus crispatus)、ラクトバチルス・ガセリ(Lactobacillus gasseri)、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)、ラクトバチルス・ロイテリ(Lactobacillus reuteri)、ラクトバチルス・イエンセニイ(Lactobacillus jensenii)、ラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)、ストレプトコッカス・サーモフィルス(Streptococcus thermophiles)、プロプリオニバクテリウム・フロイデンライシイ(Proprionibacterium freudenreichii)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、エンテロコッカス・サーモフィルス(Enterococcus thermophiles)、ビフィドバクテリウム・ロングム(Bifidobacterium longum)、ビフィドバクテリウム・インファンティス(Bifidobacterium infantis)、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)、およびシュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)からなる群より選択される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 前記細菌が、α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする単離された核酸を含む核酸コンストラクトを含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 前記核酸が、細菌内での前記酵素の産生を誘導する1つまたは複数の異種制御配列に機能的に連結されている、請求項30記載の方法。
- 異種制御配列が、細菌プロモーターおよびオペレーター、細菌リボソーム結合部位、細菌転写ターミネーター、またはプラスミド選択マーカーを含む、請求項31記載の方法。
- 前記請求項のいずれか一項によって生産された、精製されたフコシル化オリゴ糖。
- 宿主細菌生産株内での該酵素の産生のための、ラクトース利用性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする単離された核酸を含む核酸コンストラクトであって、該酵素のアミノ酸配列がFutC(SEQ ID NO:1)に対して少なくとも22%の同一性を有する、核酸コンストラクト。
- 宿主細菌生産株内での該酵素の産生のための、ラクトース利用性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする単離された核酸を含む核酸コンストラクトであって、該酵素のアミノ酸配列がFutN(SEQ ID NO:3)に対して少なくとも25%の同一性を有する、核酸コンストラクト。
- α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素が、パラバクテロイデス・ジョンソニイFutX、ラクノスピラセアエ種FutQ、プレボテラ・メラニノゲニカFutO、プレボテラ種FutW、バクテロイデス種FutZA、タネレラ種FutS、クロストリジウム・ボルテアエ+13 FutP、バクテロイデス・カカエFutU、サルモネラ菌FutZ、メタノスファエルラ・パルストリスFutR、ブチリビブリオFutV、アケルマンシア・ムシニフィリアFutY、クロストリジウム・ボルテアエFutP、またはそれらの機能的変種もしくはフラグメントから選択されるいずれか一つを含む、請求項34または35記載のコンストラクト。
- α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素が、アミノ酸配列SEQ ID NO:10〜21および292のいずれか一つまたはそれらの機能的変種もしくはフラグメントを含む、請求項34〜36のいずれか一項記載のコンストラクト。
- 前記核酸が、細菌内での前記酵素の産生を誘導する1つまたは複数の異種制御配列に機能的に連結されている、請求項34〜37のいずれか一項記載のコンストラクト。
- 異種制御配列が、細菌プロモーターおよびオペレーター、細菌リボソーム結合部位、細菌転写ターミネーター、プラスミド選択マーカー、および/または複製起点を含む、請求項38記載のコンストラクト。
- ラクトース受容性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする単離された核酸を含む単離された細菌であって、該核酸によってコードされる酵素のアミノ酸配列がFutC(SEQ ID NO:1)に対して少なくとも22%の同一性を有する、単離された細菌。
- ラクトース受容性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする単離された核酸を含む単離された細菌であって、該核酸によってコードされる酵素のアミノ酸配列がFutN(SEQ ID NO:3)に対して少なくとも25%の同一性を有する、単離された細菌。
- α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素が、パラバクテロイデス・ジョンソニイFutX、ラクノスピラセアエ種FutQ、プレボテラ・メラニノゲニカFutO、プレボテラ種FutW、バクテロイデス種FutZA、タネレラ種FutS、クロストリジウム・ボルテアエ+13 FutP、バクテロイデス・カカエFutU、サルモネラ菌FutZ、メタノスファエルラ・パルストリスFutR、ブチリビブリオFutV、アケルマンシア・ムシニフィリアFutY、クロストリジウム・ボルテアエFutP、またはそれらの機能的変種もしくはフラグメントから選択されるいずれか一つを含む、請求項40または41記載の単離された細菌。
- α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素が、アミノ酸配列SEQ ID NO:10〜21および292のいずれか一つまたはそれらの機能的変種もしくはフラグメントを含む、請求項40〜42のいずれか一項記載の単離された細菌。
- α(1,3)フコシルトランスフェラーゼ酵素および/またはα(1,4)フコシルトランスフェラーゼ酵素をさらに含む、請求項40〜43のいずれか一項記載の単離された細菌。
- 大腸菌である、請求項40〜44のいずれか一項記載の単離された細菌。
- 減少したレベルのβ-ガラクトシダーゼ活性、不完全なコラン酸合成経路、不活性化されたアデノシン-5'-三リン酸(ATP)依存性細胞内プロテアーゼ、不活性化された内因性lacA遺伝子、またはそれらの任意の組み合わせをさらに伴う、請求項40〜45のいずれか一項記載の単離された細菌。
- 遺伝子型ΔampC::Ptrp BcI, Δ(lacI-lacZ)::FRT, PlacIqlacY+, ΔwcaJ::FRT, thyA::Tn10, Δlon:(npt3, lacZ+)を含む、請求項46記載の単離された細菌。
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