JP2017514492A - 鞘翅目害虫に対する抵抗性を付与するdre4核酸分子 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、「鞘翅目害虫に対する抵抗性を付与するDRE4核酸分子」について2014年5月7日に出願した米国仮特許出願番号第61/989,843号の出願日の利益を主張するものである。
添付の配列一覧表に列挙した核酸配列を37C.F.R.§1.822に規定の通りにヌクレオチド塩基の標準的文字略記を用いて示す。各核酸配列の1つの鎖のみを示すが、相補鎖および逆相補鎖は、表示鎖の記載により含められるものと理解される。添付の配列一覧表において、
配列番号1は、例示的なジアブロティカ属(Diabrotica)dre4 DNA配列を示す。
配列番号2〜4は、in vitroでのdsRNA合成に用いたジアブロティカ属(Diabrotica)dre4の例示的な非連続の断片(dre4reg1(領域1)、dre4reg2(領域2)およびdre4reg3(領域3))を示す(5’および3’末端におけるT7プロモーター配列は示さず)。
配列番号5は、T7ファージプロモーターのDNA配列を示す。
配列番号6は、in vitroでのdsRNA合成に用いたYFPコード領域セグメントのDNA配列(5’および3’末端におけるT7プロモーター配列は示さず)を示す。
配列番号7〜12は、dre4reg1、dre4reg2およびdre4reg3を含むdre4配列の一部を増幅するために用いたプライマーを示す。
配列番号13は、ジアブロティカ属(Diabrotica)dre4ヘアピンv1−RNA形成配列(核酸分子pDAB114546に見いだされる)を示す。dre4センス鎖は、大文字で示す塩基位置からなり、ST−LS1イントロンは、下線付き文字で示す塩基位置からなり、dre4アンチセンス鎖は、下線付きでない小文字で示す塩基位置からなる。
配列番号17は、pDAB101556に見いだされるYFPタンパク質コード配列を示す。
配列番号18は、アネキシン領域1のDNA配列を示す。
配列番号19は、アネキシン領域2のDNA配列を示す。
配列番号20は、ベータスペクトリン2領域1のDNA配列を示す。
配列番号21は、ベータスペクトリン2領域2のDNA配列を示す。
配列番号22は、mtRP−L4領域1のDNA配列を示す。
配列番号23は、mtRP−L4領域2のDNA配列を示す。
配列番号24〜51は、dsRNA合成のためのアネキシン、ベータスペクトリン2、mtRP−L4およびYFPの遺伝子領域を増幅するために用いたプライマーを示す。
配列番号52は、TIP4l様タンパク質をコードするトウモロコシDNA配列を示す。
配列番号53は、オリゴヌクレオチドT20NVのDNA配列を示す。
配列番号54〜58は、トウモロコシ転写レベルを測定するために用いたプライマーおよびプローブの配列を示す。
配列番号59は、バイナリーベクター主鎖検出に用いたSpecRコード領域の一部のDNA配列を示す。
配列番号60は、ゲノムコピー数解析に用いたAADIコード領域の一部のDNA配列を示す。
配列番号61は、トウモロコシインベルターゼ遺伝子のDNA配列を示す。
配列番号62〜70は、遺伝子コピー数解析に用いたプライマーおよびプローブの配列を表す。
配列番号71〜73は、トウモロコシ発現解析に用いたプライマーおよびプローブの配列を示す。
配列番号74は、トウモロコシ転写レベルを測定するために用いたプローブの配列を示す。
1.いくつかの実施形態の概要
鞘翅目害虫の外寄生の遺伝的防除のための方法および組成物を本明細書に開示する。鞘翅目害虫集団のRNAi媒介防除のための標的遺伝子として用いる鞘翅目害虫の生活環に必須の1つまたは複数の遺伝子を同定する方法も提供する。1つまたは複数のdsRNA分子をコードDNAプラスミドベクターは、成長、生存、発育および/または生殖に必須の1つまたは複数の標的遺伝子を抑制するように設計することができる。いくつかの実施形態では、鞘翅目害虫における標的遺伝子のコードまたは非コード配列と相補的である核酸分子による標的遺伝子の発現の転写後抑制または阻害の方法を提供する。これらおよびさらなる実施形態では、鞘翅目害虫は、標的遺伝子のコードまたは非コード配列と相補的である核酸分子のすべてまたは一部から転写される1つまたは複数のdsRNA、siRNA、miRNAおよび/またはhpRNA分子を摂取し、それにより植物保護効果をもたらし得る。
dsRNA 二本鎖リボ核酸
GI 成長阻害
NCBI 米国国立生物工学情報センター(National Center for Biotechnology Information)
gDNA ゲノムDNA
iRNA 阻害リボ核酸
ORF オープンリーディングフレーム
RNAi リボ核酸干渉
miRNA マイクロリボ核酸
shRNA 短分子ヘアピン型リボ核酸
siRNA 低分子阻害リボ核酸
hpRNA ヘアピンリボ核酸
UTR 非翻訳領域
WCR ウェスタンコーンルートワーム(ジアブロティカ・ヴィルギフェラ・ヴィルギフェラ(Diabrotica virgifera virgifera)ルコント)
NCR ノーザンコーンルートワーム(ジアブロティカ・バルベリ(Diabrotica barberi)スミスおよびローレンス)
MCR メキシカンコーンルートワーム(ジアブロティカ・ヴィルギフェラ・ゼアエ(Diabrotica virgifera zeae)クリサンおよびスミス)
PCR ポリメラーゼ連鎖反応
RISC RNA誘導型サイレンシング複合体
SCR サザンコーンルートワーム(ジアブロティカ・ウンデシムプンクタータ・ホワルディ(Diabrotica undecimpunctata howardi)バーバー)
YEP 黄色蛍光タンパク質
続く説明および表において、多くの用語が用いられている。そのような用語に与えるべき範囲を含む、明細書および特許請求の範囲の明確で、一貫した理解を可能にするために、以下の定義を記載する。
高厳密条件(少なくとも90%の配列同一性を共有する配列を検出する): 5x SSC緩衝液中での65℃で16時間のハイブリダイゼーション;2x SSC緩衝液で室温でそれぞれ15分間2回洗浄する;および0.5x SSC緩衝液で65℃でそれぞれ20分間2回洗浄する。
中厳密条件(少なくとも80%の配列同一性を共有する配列を検出する): 5x〜6xSSC緩衝液中での65〜70℃で16〜20時間のハイブリダイゼーション;2x SSC緩衝液で室温でそれぞれ5〜20分間2回洗浄する;および1x SSC緩衝液で55〜70℃でそれぞれ30分間2回洗浄する。
非厳密対照条件(少なくとも50%の配列同一性を共有する配列がハイブリダイズする): 6x SSC緩衝液中での室温〜55℃で16〜20時間のハイブリダイゼーション;2x〜3x SSC緩衝液で室温〜55℃でそれぞれ20〜30分間少なくとも2回洗浄する。
A.概要
本明細書で述べるのは、鞘翅目害虫の防除に有用な核酸分子である。述べる核酸分子は、標的配列(例えば、天然遺伝子および非コード配列)、dsRNA、siRNA、hpRNAおよびmiRNAを含む。例えば、鞘翅目害虫における1つまたは複数の天然核酸配列のすべてまたは一部に対して特異的に相補的であり得るdsRNA、siRNA、miRNAおよび/またはhpRNA分子をいくつかの実施形態で述べる。これらおよびさらなる実施形態では、天然核酸配列(複数可)は、1つまたは複数の標的遺伝子(複数可)であり得、その産物は、例えばかつ制限なく、代謝プロセスに関与、生殖プロセスに関与、または幼虫の発育に関与し得る。本明細書で述べる核酸分子は、核酸分子が特異的に相補的である少なくとも1つの天然核酸配列(複数可)を含む細胞に導入した場合、細胞中でRNAiを開始し、結果として天然核酸配列(複数可)の発現を低減または排除し得る。いくつかの例において、標的遺伝子に特異的に相補的である配列を含む核酸分子による標的遺伝子の発現の低減または排除は、鞘翅目害虫において致死性である、あるいは成長および/または生殖の低減をもたらすことがあり得る。
本発明は、とりわけ、鞘翅目害虫の細胞、組織もしくは器官における標的遺伝子発現を阻害するiRNA(例えば、dsRNA、siRNA、miRNAおよびhpRNA)分子;ならびに鞘翅目害虫の細胞、組織もしくは器官における標的遺伝子発現を阻害するために細胞もしくは微生物においてiRNA分子として発現することができるDNA分子を提供する。
鞘翅目害虫における様々な天然配列は、iRNAおよびiRNAをコードするDNA分子等の、本発明の核酸分子の設計のための標的配列として用いることができる。しかし、天然配列の選択は、簡単なプロセスではない。鞘翅目害虫における少数の天然配列のみが有効な標的となる。例えば、特定の天然配列を本発明の核酸分子により効果的に下方制御することができるかどうか、あるいは特定の天然配列の下方制御が鞘翅目害虫の成長、生存能力、増殖および/または生殖に対して有害効果を有するかどうかを確実に予測することはできない。それらから単離されたEST等の、天然鞘翅目害虫配列の圧倒的大多数(例えば、米国特許第7,612,194号および米国特許第7,943,819号に示されている)は、WCR、またはNCR等の鞘翅目害虫の成長、生存能力、増殖および/または生殖に対する有害効果を有さない。鞘翅目害虫に対する有害作用を有し得る天然配列のどれを、宿主植物におけるそのような天然配列に対して相補的な核酸分子を発現させ、宿主植物に害をもたらすことなく、摂食により鞘翅目害虫に対して有害効果をもたらすための組換え技術に用いることができるかも予測できない。
いくつかの実施形態では、本発明は、細胞(例えば、細菌細胞、酵母細胞または植物細胞)への導入のためのDNA分子であって、RNAへの発現ならびに鞘翅目害虫による摂取により、鞘翅目害虫の細胞、組織もしくは器官における標的遺伝子の抑制を達成するヌクレオチド配列を含むDNA分子も提供する。したがって、いくつかの実施形態は、鞘翅目害虫における標的遺伝子発現を阻害するための植物細胞中でiRNA(例えば、dsRNA、siRNA、miRNAおよびhpRNA)分子として発現することができる核酸配列を含む組換え核酸分子を提供する。発現を開始または増大させるために、そのような組換え核酸分子は、1つまたは複数の調節配列を含んでいてもよく、調節配列は、iRNAとして発現することができる核酸配列に作動可能に連結することができる。植物において遺伝子抑制分子を発現させる方法は、公知であり、本発明のヌクレオチド配列を発現させるために用いることができる。例えば、国際PCT公開国際公開第06/073727号および米国特許出願公開第2006/0200878A1号を参照のこと。
および第6,624,145号)、Cry35Ab1(米国特許第6,083,499号、第6,340,593号および第6,548,291号)、単一イベントにおける「Cry34/35Ab1」組合せ(例えば、トウモロコシイベントDAS−59122−7;米国特許第7,323,556号)、Cry3A(例えば、米国特許第7,230,167号)、Cry3B(例えば、米国特許第8,101,826号)、Cry6A(例えば、米国特許第6,831,062号)およびそれらの組合せ(例えば、米国特許出願第2013/0167268号、第2013/0167269号および第2013/0180016号)等の殺虫タンパク質(例えば、バチルス・ツリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)殺虫タンパク質)をコードする遺伝子;除草剤耐性遺伝子(例えば、グリホセート、グルホシネート、ジカンバまたは2,4−Dに対する耐性を与える遺伝子(例えば、米国特許第7,838,733号));ならびに収量の増加、脂肪酸代謝の変化または細胞質雄性不稔性の回復等のトランスジェニック植物における望ましい表現型に寄与する遺伝子。特定の実施形態では、昆虫被害および植物病害の防除の増大のための所望の形質を達成するために本発明のiRNA分子をコードする配列を他の昆虫防除または病害抵抗性形質と組み合わせることができる。異なる作用機序を用いる昆虫防除形質を組み合わせることは、単一の防除形質を有する植物と比べて優れた耐久性を有する保護トランスジェニック植物をもたらし得る。その理由は、例えば、形質(複数可)に対する抵抗性が圃場で起こる可能性が低いためである。
A.概要
本発明のいくつかの実施形態では、鞘翅目害虫の防除に有用な少なくとも1つの核酸分子を鞘翅目害虫に与えることができ、核酸分子は、鞘翅目害虫におけるRNAi媒介遺伝子サイレンシングをもたらす。特定の実施形態では、iRNA分子(例えば、dsRNA、siRNA、miRNAおよびhpRNA)を鞘翅目害虫に与えることができる。いくつかの実施形態では、鞘翅目害虫の防除に有用な核酸分子は、核酸分子を鞘翅目害虫と接触させることによって鞘翅目害虫に与えることができる。これらおよびさらなる実施形態では、鞘翅目害虫の防除に有用な核酸分子は、鞘翅目害虫の給餌基体、例えば、栄養組成物に加えることができる。これらおよびさらなる実施形態では、鞘翅目害虫の防除に有用な核酸分子は、鞘翅目害虫により摂取される核酸分子を含む植物物質の摂取により与えることができる。特定の実施形態では、核酸分子は、植物物質に導入された組換え核酸配列の発現により、例えば、組換え核酸配列を含むベクターによる植物細胞の形質転換および形質転換植物細胞からの植物物質または全植物の再生により、植物物質中に存在する。
複数の実施形態では、本発明は、例えば、標的配列と特異的に相補的であるヌクレオチド配列を含む少なくとも1つの鎖を含むiRNA分子を設計することにより、鞘翅目害虫(例えば、WCR、SCRまたはNCR)のトランスクリプトームにおける必須天然ヌクレオチド配列(例えば、必須遺伝子)を標的とするように設計することができるiRNA分子(例えば、dsRNA、siRNA、miRNAおよびhpRNA)を提供する。そのように設計されたiRNA分子の配列は、標的配列と同一であり得るか、あるいはiRNA分子とその標的配列との特異的ハイブリダイゼーションを妨げないミスマッチを取り込み得る。
鞘翅目害虫におけるRNAi媒介遺伝子抑制のためのiRNA分子の発現は、多くのin vitroまたはin vivo方式のいずれか1つにより行うことができる。iRNA分子は、次に、例えば、iRNA分子を害虫と接触させることにより、または害虫にiRNA分子を摂取もしくは別の方法でインターナリゼーションさせることにより、鞘翅目害虫に与えることができる。本発明のいくつかの実施形態は、鞘翅目害虫の形質転換宿主植物、形質転換植物細胞ならびに形質転換植物の子孫を含む。形質転換植物細胞および形質転換植物は、害虫保護効果をもたらすために、例えば、異種プロモーターの制御下で1つまたは複数のiRNA分子を発現するように工学的に操作することができる。したがって、形質転換植物および植物細胞が摂食時に鞘翅目害虫により消費される場合、害虫は、トランスジェニック植物または細胞において発現したiRNA分子を摂取し得る。本発明のヌクレオチド配列は、様々な原核および真核微生物宿主に導入して、iRNA分子を生成することもできる。「微生物」という用語は、細菌および菌類等の原核および真核種を含む。
[実施例]
多くのdsRNA分子(dre4reg1(配列番号2)、dre4reg2(配列番号3)およびdre4reg3(配列番号4)に対応するものを含む)をMEGASCRIPT(登録商標)RNAiキットまたはHiScribe(登録商標)T7 In Vitro転写キットを用いて合成し、精製した。精製dsRNA分子は、100X希釈TE緩衝液pH7.4に入れて調製し、すべてのバイオアッセイは、WCR(ジアブロティカ・ヴィルギフェラ・ヴィルギフェラ(Diabrotica virgifera virgifera)ルコント)の死および成長阻害についてのバックグラウンド基準としての役割を果たした、この緩衝液からなる対照処理を含んでいた。バイオアッセイ緩衝液中のdsRNA分子の濃度は、NANODROP(商標)8000分光光度計(THERMO SCIENTIFIC、Wilmington、DE)を用いて測定した。
GI=[1−(TWIT/TNIT)/(TWIBC/TNIBC)]
ここで、TWITは、処理における生存昆虫の総体重であり、TNITは、処理における昆虫の総数であり、TWIBCは、バックグラウンド基準(緩衝液対照)における生存昆虫の総体重であり、TNIBCは、バックグラウンド基準(緩衝液対照)における昆虫の総数である。
RNAiトランスジェニック植物昆虫抵抗性技術による防除のための候補標的遺伝子配列を得るためのプールされたトランスクリプトームの解析のためにWCR(ジアブロティカ・ヴィルギフェラ・ヴィルギフェラ(Diabrotica virgifera virgifera)ルコント)の発育の複数の段階を選択した。
標的遺伝子のコード領域の一部をPCRにより増幅するためにプライマーを設計した。表1を参照のこと。適切な場合、T7ファージプロモーター配列(TTAATACGACTCACTATAGGGAGA;配列番号5)を増幅センスまたはアンチセンス鎖の5’末端に取り込んだ。表1を参照のこと。TRIzol(登録商標)(Life Technologies、Grand Island、NY)を用いてWCRから全RNAを抽出した。この場合、WCR幼虫および成虫を、1mLのTRIzol(登録商標)を含む1.5mL小遠心管中で均一な懸濁液が得られるまでPestle Motor Mixer(Cole−Parmer、Vernon Hills、IL)を用いて室温でホモジナイズした。室温で5分間のインキュベーションの後、ホモジネートを遠心分離して、細胞デブリを除去し、1mLの上清を新たな管に移した。200μLのクロロホルムを加え、混合物を15秒間激しく振とうした。抽出物を室温で2〜3分間放置した後、4℃で12000xgでの遠心分離により相を分離した。上相(約0.6mLを含む)を他の滅菌1.5mL管に注意深く移し、500μLの室温イソプロパノールを加えた。室温で10分間インキュベートした後、混合物を4℃にて12000xgで10分間遠心分離した。上清を注意深く除去し、捨て、RNAペレットを75%エタノールを用いてボルテックスすることにより2回洗浄し、各洗浄の後に7500xg(4℃または25℃)で5分間の遠心分離により回収した。エタノールを注意深く除去し、ペレットを3〜5分間風乾し、次いで、ヌクレアーゼ不含有滅菌水に溶解した。
PCRによる鋳型の調製およびdsRNA合成
dre4およびYFP dsRNAの産生のための特定の鋳型を得るために用いた戦略を図1Aに示す。dre4 dsRNA合成に用いることを目的とした鋳型DNAは、表1におけるプライマー対およびWCR初齢幼虫または成虫から単離した全RNAから作製した(PCR鋳型としての)第一鎖cDNAを用いたPCRにより作製した。各選択されたdre4およびYFP標的遺伝領域について、PCR増幅により、増幅センスおよびアンチセンス鎖の5’末端にT7プロモーター配列が導入された(YFPセグメントは、YFPコード領域のDNAクローンから増幅された)。次いで、標的遺伝子の各領域の2つのPCR増幅断片をほぼ等量で混合し、混合物をdsRNAの産生のための転写鋳型として用いた。図1Aを参照のこと。特定のプライマー対により増幅されたdsRNA鋳型の配列は、配列番号2(dre4 reg1)、配列番号3(dre4 reg2)、配列番号4(dre4 reg3)およびYFP(配列番号6)であった。昆虫バイオアッセイ用の二本鎖RNAは、製造業者の指示に従ってAMBION(登録商標)MEGASCRIPT(登録商標)RNAiキット(INVITOGEN)または製造業者の指示に従ってHiScribe(登録商標)T7 In Vitro転写キット(New England Biolabs、Ipswich、MA)を用いて合成し、精製した。dsRNAの濃度は、NANODROP(商標)8000分光光度計(THERMO SCIENTIFIC、Wilmington、DE)を用いて測定した。
dre4(配列番号1)のセグメントを含むヘアピン形成のための標的遺伝子構築物を含むエントリーベクター(pDAB114540およびpDAB114541)は、化学合成断片の組合せ(DNA2.0、Menlo Park、CA)および標準分子クローニング法を用いてアセンブルした。RNA一次転写物による分子内ヘアピン形成は、互いに反対の方向の標的遺伝子セグメントの2つのコピーを配列すること(単一転写単位内に)によって促進したが、2つのセグメントは、ST−LS1イントロン配列(配列番号16;Vancanneyt et al. (1990) Mol. Gen. Genet. 220(2):245-50)により分離されている。したがって、一次mRNA転写物は、イントロン配列によって分離された、互いの大きな逆方向反復配列としての2つのdre4遺伝子セグメント配列を含む。トウモロコシユビキチン1プロモーターのコピー(米国特許第5,510,474号)を一次mRNAヘアピン転写物の生成を駆動するために用い、トウモロコシペルオキシダーゼ5遺伝子の3’非翻訳領域を含む断片(ZmPer5 3’UTR v2;米国特許第6,699,984号)をヘアピンRNA発現遺伝子の転写を終結させるために用いた。
実施例2で同定された標的遺伝子配列を阻害するように設計された合成dsRNAは、飼料ベースのアッセイにおいてWCRに投与した場合、死亡および成長阻害を引き起こした。dre4 reg1、dre4 reg2およびdre4 reg3は、スクリーニングした他のdsRNAと比べてこのアッセイにおいて著しく高い有効性を示すことが認められた。
アグロバクテリウム(Agrobacterium)媒介形質転換
植物ゲノムに安定に組み込まれたキメラ遺伝子の発現により1つまたは複数の殺虫dsRNA分子(例えば、dre4;配列番号1を含む遺伝子を標的とするdsRNA分子を含む少なくとも1つのdsRNA分子)を産生するトランスジェニックトウモロコシ細胞、組織および植物は、アグロバクテリウム(Agrobacterium)媒介形質転換の後に生成した。スーパーバイナリーまたはバイナリー形質転換ベクターを用いるトウモロコシ形質転換法は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第8,304,604号明細書に記載されているように、当技術分野で公知である。形質転換組織は、ハロキシホップ含有培地上で成長するそれらの能力により選択し、適宜、dsRNAの産生についてスクリーニングした。そのような形質転換組織培養の一部は、実施例1で述べたように本質的に、バイオアッセイのために新生トウモロコシ根切り虫幼虫に与えることができる。
上(実施例4)で述べたバイナリー形質転換ベクターpDAB114515、pDAB115770、pDAB110853またはpDAB110556を含むアグロバクテリウム(Agrobacterium)菌株DAt13192細胞(国際公開第2012/016222号A2)のグリセロールストックを適切な抗生物質を含むAB最少培地プレート(Watson, et al., (1975) J. Bacteriol. 123:255-264)に画線接種し、20℃で3日間成長させた。次いで、培養物を同じ抗生物質を含むYEPプレート(gm/L;酵母エキス、10;ペプトン、10;NaCl、5)に画線接種し、20℃で1日間インキュベートした。
実験当日に、接種培地およびアセトシリンゴンを含む保存溶液を実験における構築物の数に対して適切な容積で調製し、滅菌済みの使い捨て250mLフラスコにピペットで移した。接種培地(Frame et al. (2011) Genetic Transformation Using Maize Immature Zygotic Embryos. IN Plant Embryo Culture Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. T. A. Thorpe and E. C. Yeung, (Eds), Springer Science and Business Media, LLC. pp 327-341)は、2.2gm/L MS塩;1X ISU修飾MSビタミン(Frame et al., ibid.);68.4gm/Lスクロース;36gm/Lグルコース;115mg/L L−プロリン;および100mg/Lミオイノシトールを含んでいた(pH5.4)。アセトシリンゴンを接種培地を含むフラスコに100%ジメチルスルホキシド中1M保存溶液から200μMの最終濃度になるまで加え、溶液を十分に混合した。
トウモロコシ未熟胚を温室内で成長させたゼア・マイス(Zea mays)近交系B104の植物(Hallauer et al. (1997) Crop Science 37:1405-1406)から入手し、自家または近縁授粉して、穂を産生させた。穂は、授粉後約10〜12日目に収穫した。実験日に、脱殻した穂を層流フード内で市販の漂白剤(ULTRA CLOROX(登録商標)殺菌漂白剤、6.15%次亜塩素酸ナトリウム;2滴のTWEEN 20を含む)の20%溶液中に浸漬し、20〜30分間振とうした後、滅菌脱イオン水で3回すすぐことによって表面滅菌した。未熟接合胚(1.8〜2.2mm長)を各穂から無菌的に切り離し、200μMアセトシリンゴンを含む液体接種培地中適切なアグロバクテリウム(Agrobacterium)細胞の2.0mL懸濁液を含む小遠心管に無作為に分配し、2μLの10%BREAK−THRU(登録商標)S233界面活性剤(EVONIK INDUSTRIES;Essen、Germany)を加えた。所与のセットの実験について、プールした穂由来の胚を各形質転換に使用した。
単離後、胚をロッカープラットフォーム上に5分間置いた。次いで、管の内容物を、4.33gm/L MS塩;1X ISU修飾MSビタミン;30gm/Lスクロース;700mg/L L−プロリン;KOH中3.3mg/Lジカンバ(3,6−ジクロロ−o−アニス酸または3,6−ジクロロ−2−メトキシ安息香酸);100mg/Lミオイノシトール;100mg/Lカゼイン酵素加水分解物;15mg/L AgNO3;DMSO中200μMアセトシリンゴン;および3gm/L GELZAN(商標)を含むpH5.8の共培養培地のプレート上に注いだ。液体アグロバクテリウム(Agrobacterium)懸濁液を滅菌済みの使い捨てホールピペットにより除去した。次いで、胚を、顕微鏡を活用して滅菌済み鉗子を用いて胚盤を上向きにして配向させた。プレートを閉じ、3M(商標)MICROPORE(商標)医療用テープで密封し、約60μmol m−2s−1の光合成有効放射(PAR)の連続光を用いた25℃のインキュベーターに入れた。
共培養期間の後、胚を、4.33gm/L MS塩;1X ISU修飾MSビタミン;30gm/Lスクロース;700mg/L L−プロリン;KOH中3.3mg/Lジカンバ;100mg/Lミオイノシトール;100mg/Lカゼイン酵素加水分解物;15mg/L AgNO3;0.5gm/L MES(2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸一水和物;PHYTOTECHNOLOGIES LABR;Lenexa、KS);250mg/Lカルベニシリン;および2.3gm/L GELZAN(商標)から構成されていたpH5.8の静止培地に移した。36以下の胚を各プレートに除去した。プレートを透明プラスチックボックスに入れ、約50μmol m−2s−1PARの連続光を用いて27℃で7〜10日間インキュベートした。次いで、カルス化胚を、100nM R−ハロキシホップ酸(0.0362mg/L;AAD−1遺伝子を含むカルスの選択用)を含む(上記)静止培地から構成されていた、選択培地1上に移した(<18/プレート)。プレートを透明ボックスに戻し、約50μmol m−2s−1PARの連続光を用いて27℃で7日間インキュベートした。次いで、カルス化胚を、500nM R−ハロキシホップ酸(0.181mg/L)を含む(上記)静止培地から構成されていた、選択培地II上に移した(<12/プレート)。プレートを透明ボックスに戻し、約50μmol m−2s−1PARの連続光を用いて27℃で14日間インキュベートした。この選択ステップは、トランスジェニックカルスがさらに増殖し、分化することを可能とした。
植物がV3−V4段階に達した場合、それらをIE CUSTOM BLEND(PROFILE/METRO MIX 160)土壌ミックスに移植し、温室内(光曝露の種類:光または同化;高照度限界:1200PAR;日照時間16時間;27℃昼間/24℃夜間)で開花まで成長させた。
トウモロコシ組織の分子解析(例えば、RNA qPCR)は、根の食害を評価したのと同じ日に温室成長植物から採取した葉および根の試料について実施した。
カルス細胞イベントまたはトランスジェニック植物をPer5 3’UTR配列のリアルタイム定量的PCR(qPCR)により解析して、TIP4l様タンパク質(すなわち、GENBANK受託番号AT4G34270のマイスホモログ;74%同一性のtBLASTXスコアを有する)をコードする、内部トウモロコシ遺伝子(配列番号52;GENBANK受託番号BT069734)の転写物レベルと比較した、全長ヘアピン転写物の相対発現レベルを決定した。RNAは、RNAEASY(商標)96キット(QIAGEN、Valencia、CA)を用いて単離した。溶出後、全RNAをキットの提案プロトコールによるDNAsel処理にかけた。次いで、RNAをNANODROP8000分光光度計(THERMO SCIENTIFIC)で定量し、濃度を25ng/μLに対して標準化した。第一鎖cDNAは、製造業者の推奨プロトコールに実質的に従って、5μL変性RNAを含む10μL反応容積でHIGH CAPACITY cDNA SYNTHESIS KIT(INVITROGEN)を用いて作製した。複合ランダムプライマーおよびオリゴdTの作業ストックを調製するために、ランダムプライマーストックミックスの1mL管への10μLの100μM T20VNオリゴヌクレオチド(IDT)(配列番号53;TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN、ここで、Vは、A、CまたはGであり、Nは、A、C、GまたはT/Uである)の添加を含めるように、プロトコールをわずかに修正した。
dre4ヘアピンdsRNAを発現するトランスジェニック植物におけるdre4ヘアピンRNAの分子サイズを測定するためのノーザンブロット(RNAブロット)解析を用いることにより、トランスジェニック植物のさらなる分子的特徴付けが得られる。
2回の葉のパンチにほぼ相当するトウモロコシ葉片を96ウエルコレクションプレート(QIAGEN)に収集した。組織の破壊は、1個のステンレススチールビーズを含むBIOSPRINT96 AP1溶解緩衝液(BIOSPRINT96 PLANT KIT;QIAGENから供給)中でKLECKO(商標)組織粉砕機(GARCIA MANUFACTURING、Visalia、CA)を用いて実施した。組織の温侵の後、BIOSPRINT96 PLANT KITおよびBIOSPRINT96抽出ロボットを用いてゲノムDNA(gDNA)を高処理式で単離した。ゲノムDNAは、qPCR反応を始める前に2:3 DNA:水に希釈した。
加水分解プローブアッセイによる導入遺伝子検出は、LIGHTCYCLER(登録商標)480システムを用いてリアルタイムPCRにより実施した。ST−LS1イントロン配列(配列番号16)を検出するために、またはSpecR遺伝子の一部(すなわち、バイナリーベクタープラスミド上で運ばれるスペクチオマイシン抵抗性遺伝子;配列番号70;表9におけるSPC1オリゴヌクレオチド)を検出するために加水分解プローブアッセイに用いるオリゴヌクレオチドは、LIGHTCYCLER(登録商標) PROBE DESIGN SOFTWARE 2.0を用いて設計した。さらに、AAD−1除草剤耐性遺伝子のセグメント(配列番号64;表9におけるGAAD1オリゴヌクレオチド)を検出するために加水分解プローブアッセイに用いるオリゴヌクレオチドは、PRIMER EXPRESSソフトウエア(APPLIED BIOSYSTEMS)を用いて設計した。表9にプライマーおよびプローブの配列を示す。アッセイは、各アッセイにおいてgDNAが存在していたことを保証するための内部参照配列としての役割を果たした、内因性トウモロコシ染色体遺伝子(インベルターゼ(配列番号61;GENBANK受託番号U16123;ここでIVR1と呼ぶ)用試薬を用いて多重化した。増幅のために、0.4μMの各プライマーおよび0.2μMの各プローブを含む10μL容積多重反応においてLIGHTCYCLER(登録商標)480 PROBES MASTERミックス(ROCHE APPLIED SCIENCE)を1x最終濃度で調製した(表10)。表11に概要を示すように2段階増幅反応を実施した。FAMおよびHEX標識プローブの発蛍光団の活性化および発光は、上述の通りであり、CY5コンジュゲートは、650nmで最大限に励起され、670nmで最大限に蛍光を発する。
植物細胞中で生成する対象発明のdsRNAの生物活性は、バイオアッセイ法によって示される。例えば、Baum et al. (2007) Nat. Biotechnol. 25(11):1322-1326を参照のこと。例えば、殺虫dsRNAを生成する植物に由来する様々な植物組織または組織片を制御された摂食環境における標的昆虫に与えることによって、有効性を示すことができる。あるいは、殺虫dsRNAを生成する植物に由来する様々な植物組織から抽出物を調製し、抽出された核酸を本明細書で前述したようにバイオアッセイのための人工飼料の上に分配して加える。そのような摂食アッセイの結果は、殺虫dsRNAを生成しない宿主植物の適切な対照組織を用いる同様に実施されたバイオアッセイと、または他の対照試料と比較する。
洗浄卵から孵化した2匹のウェスタンコーンルートワーム幼虫(1〜3日齢)を選択し、バイオアッセイトレーの各ウエルに入れる。次いで、ウエルを「PULL N’ PEEL」タブカバー(BIO−CV−16、BIO−SERV)で覆い、18時間/6時間 明/暗サイクルとした28℃インキュベーターに入れた。最初の外寄生の9日後に、各処理における昆虫の総数のうちの死亡昆虫の百分率と計算される、死亡率について幼虫を評価した。昆虫試料を−20℃で2日間凍結し、次いで、各処理の昆虫の幼虫をプールし、体重を測定する。成長阻害の百分率は、2つの対照ウエル処理の平均体重の平均値によって割った実験処理の平均体重として計算する。データは、成長阻害百分率(陰性対照の)として表す。対照平均体重を超える平均体重は、ゼロに標準化する。
ウェスタンコーンルートワーム(WCR、ジアブロティカ・ヴィルギフェラ・ヴィルギフェラ(Diabrotica virgifera virgifera)ルコント)卵は、CROP CHARACTERISTICS(Farmington、MN)から土壌入りで受領した。WCR卵を28℃で10〜11日間インキュベートした。土壌からの卵を洗浄し、0.15%寒天溶液中に入れ、濃度を0.25mLアリコート当たり約75〜100個の卵に調整した。孵化速度をモニターするために卵懸濁液のアリコートを用いて孵化プレートをペトリ皿中にセットした。
10〜20のトランスジェニックT0ゼア・マイス(Zea mays)植物を実施例6で述べたように生成する。RNAi構築物のヘアピンdsRNAを発現するさらなる10〜20のT1ゼア・マイス(Zea mays)独立系をトウモロコシ根切り虫チャレンジのために得る。配列番号13、配列番号14に示す、または他の場合配列番号1をさらに含むヘアピンdsRNAを得ることができる。さらなるヘアピンdsRNAは、例えば、Cafl−180(米国特許出願公開第2012/0174258号)、VatpaseC(米国特許出願公開第2012/0174259号)、Rho1(米国特許出願公開第2012/0174260号)、VatpaseH(米国特許出願公開第2012/0198586号)、PPI−87B(米国特許出願公開第2013/0091600号)、RPA70(米国特許出願公開第2013/0091601号)またはRPS6(米国特許出願公開第2013/0097730号)等の鞘翅目害虫配列から得ることができる。これらは、RT−PCRまたは他の分子解析法により確認される。選択される独立T1系からの全RNA調製物は、RNAi構築物のそれぞれにおけるヘアピン発現カセットのST−LS1イントロンに結合するように設計されたプライマーを用いるRT−PCRに場合によって用いられる。さらに、RNAi構築物における各標的遺伝子に対する特異的プライマーは、植物体におけるsiRNA生成に必要なプロセシング前(pre-processed)mRNAを増幅し、その生成を確認するために場合によって用いられる。各標的遺伝子の所望のバンドの増幅により、各トランスジェニックゼア・マイス(Zea mays)植物におけるヘアピンRNAの発現が確認される。標的遺伝子のdsRNAヘアピンのsiRNAへのプロセシングは、RNAブロットハイブリダイゼーションを用いて独立トランスジェニック系においてその後場合によって確認される。
鞘翅目害虫以外の生物を標的とするiRNA分子に転写されるそのゲノムにおける異種コード配列を含むトランスジェニックゼア・マイス(Zea mays)植物を、1つまたは複数の殺虫dsRNA分子(例えば、配列番号1を含む遺伝子を標的とするdsRNA分子を含む少なくとも1つのdsRNA分子)を生成するようにアグロバクテリウム(Agrobacterium)またはWHISKERS(商標)方法論(Petolino and Arnold (2009) Methods Mol. Biol. 526:59-67参照)により二次的に形質転換する。実施例4に述べたように本質的に調製される植物形質転換プラスミドベクターを、鞘翅目害虫以外の生物を標的とするiRNA分子に転写されるそのゲノムにおける異種コード配列を含むトランスジェニックHi IIまたはB104ゼア・マイス(Zea mays)植物から得られたトウモロコシ懸濁細胞または未熟トウモロコシ胚にアグロバクテリウム(Agrobacterium)またはWHISKERS(商標)媒介形質転換法により送達する。
鞘翅目害虫生物を標的とするiRNA分子(例えば、配列番号1を含む遺伝子を標的とするdsRNA分子を含む少なくとも1つのdsRNA分子)に転写されるそのゲノムにおける異種コード配列を含むトランスジェニックゼア・マイス(Zea mays)植物を、1つまたは複数の殺虫タンパク質分子、例えば、Cry3、Cry34およびCry35殺虫タンパク質を生成するようにアグロバクテリウム(Agrobacterium)またはWHISKERS(商標)方法論(Petolino and Arnold (2009) Methods Mol. Biol. 526:59-67参照)により二次的に形質転換する。実施例4に述べたように本質的に調製される植物形質転換プラスミドベクターを、鞘翅目害虫生物を標的とするiRNA分子に転写されるそのゲノムにおける異種コード配列を含むトランスジェニックB104ゼア・マイス(Zea mays)植物から得られたトウモロコシ懸濁細胞または未熟トウモロコシ胚にアグロバクテリウム(Agrobacterium)またはWHISKERS(商標)媒介形質転換法により送達する。鞘翅目害虫の防除のためのiRNA分子および殺虫タンパク質を生成する二重形質転換植物が得られる。
Claims (56)
- 異種プロモーターに作動可能に連結した単離ポリヌクレオチドであって、配列番号1、配列番号1の相補体、配列番号1の少なくとも19個の連続したヌクレオチドの断片、配列番号1の少なくとも19個の連続したヌクレオチドの断片の相補体、配列番号1を含むジアブロティカ属(Diabrotica)生物(例えば、WCR)の天然コード配列、配列番号1を含むジアブロティカ属(Diabrotica)生物の天然コード配列の相補体、配列番号1を含む天然RNA分子に転写されるジアブロティカ属(Diabrotica)生物の天然非コード配列、配列番号1を含む天然RNA分子に転写されるジアブロティカ属(Diabrotica)生物の天然非コード配列の相補体、配列番号1を含むジアブロティカ属(Diabrotica)生物(例えば、WCR)の天然コード配列の少なくとも19個の連続したヌクレオチドの断片、配列番号1を含むジアブロティカ属(Diabrotica)生物の天然コード配列の少なくとも19個の連続したヌクレオチドの断片の相補体、配列番号1を含む天然RNA分子に転写されるジアブロティカ属(Diabrotica)生物の天然非コード配列の少なくとも19個の連続したヌクレオチドの断片、および配列番号1を含む天然RNA分子に転写されるジアブロティカ属(Diabrotica)生物の天然非コード配列の少なくとも19個の連続したヌクレオチドの断片の相補体からなる群から選択される少なくとも1つのヌクレオチド配列(複数可)を含む、ポリヌクレオチド。
- 前記ヌクレオチド配列が配列番号1、配列番号1の相補体、配列番号2、配列番号2の相補体、配列番号3、配列番号3の相補体、配列番号4、配列番号4の相補体、配列番号13、配列番号13の相補体、配列番号14、および配列番号14の相補体からなる群から選択される、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- 前記少なくとも1つのヌクレオチド配列(複数可)が、植物細胞中で機能的である異種プロモーターに作動可能に連結している、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項1に記載のポリヌクレオチドを含む植物形質転換ベクター。
- 前記ジアブロティカ属(Diabrotica)生物がD.v.ヴィルギフェラ(D. v. virgifera)ルコント;D.バルベリ(D. barberi)スミスおよびローレンス;D.u.ホワルディ(D. u. howardi);D.v.ゼアエ(D. v. zeae);D.バルテアタ(D. balteata)ルコント;D.u.テネラ(D. u. tenella);ならびにD.u.ウンデシムプンクタータ(D. u. undecimpunctata)マンネルヘイムからなる群から選択される、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- リボ核酸(RNA)分子である、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- デオキシリボ核酸(DNA)分子である、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- バチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)由来のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- バチルス・チューリンゲンシス(B. thuringiensis)由来のポリペプチドがCry3、Cry34およびCry35を含む群から選択される、請求項8に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項7に記載のポリヌクレオチドの発現から産生される二本鎖リボ核酸分子。
- 前記ポリヌクレオチド配列を鞘翅目害虫と接触させることが、請求項1に記載のポリヌクレオチド配列と特異的に相補的な内因性ヌクレオチド配列の発現を阻害する、請求項10に記載の二本鎖リボ核酸分子。
- 前記リボヌクレオチド分子を鞘翅目害虫と接触させることが、前記鞘翅目害虫を殺すまたはその成長、生殖および/もしくは摂食を阻害する、請求項11に記載の二本鎖リボ核酸分子。
- 第1、第2および第3のポリヌクレオチド配列を含み、前記第1のポリヌクレオチド配列が請求項1に記載のポリヌクレオチドを含み、前記第3のポリヌクレオチド配列が、前記第2のポリヌクレオチド配列により前記第1のポリヌクレオチド配列に連結されており、リボ核酸に転写されて、二本鎖リボヌクレオチド分子を形成するときに前記第1および前記第3のポリヌクレオチド配列がハイブリダイズするように、前記第3のポリヌクレオチド配列が実質的に前記第1のポリヌクレオチド配列の逆相補体である、請求項10に記載の二本鎖リボ核酸分子。
- 長さが約19〜約30ヌクレオチドの二本鎖リボ核酸分子および一本鎖リボ核酸分子からなる群から選択される、請求項6に記載のポリヌクレオチド。
- 長さが約19〜約30ヌクレオチドの二本鎖リボ核酸分子および一本鎖リボ核酸分子からなる群から選択される、請求項7に記載のポリヌクレオチドの発現から産生されるリボ核酸分子。
- 前記少なくとも1つのヌクレオチド配列(複数可)が、植物細胞中で機能的である異種プロモーターに作動可能に連結している、請求項1に記載のポリヌクレオチドを含む植物形質転換ベクター。
- 請求項1に記載のポリヌクレオチドで形質転換された細胞。
- 原核細胞である、請求項17に記載の細胞。
- 真核細胞である、請求項17に記載の細胞。
- 植物細胞である、請求項19に記載の細胞。
- バチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)由来のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項17に記載の細胞。
- バチルス・チューリンゲンシス(B. thuringiensis)由来のポリペプチドがCry3、Cry34およびCry35を含む群から選択される、請求項21に記載の細胞。
- 請求項1に記載のポリヌクレオチドで形質転換された植物。
- バチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)由来のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項23に記載の植物。
- バチルス・チューリンゲンシス(B. thuringiensis)由来のポリペプチドがCry3、Cry34およびCry35からなる群から選択される、請求項24に記載の植物。
- 前記ポリヌクレオチドを含む、請求項23に記載の植物の種子。
- 前記少なくとも1つのヌクレオチド配列(複数可)が、前記植物において二本鎖リボ核酸分子として発現される、請求項23に記載の植物。
- ゼア・マイス(Zea mays)細胞である、請求項20に記載の細胞。
- ゼア・マイス(Zea mays)である、請求項23に記載の植物。
- 前記少なくとも1つのヌクレオチド配列(複数可)が、前記植物においてリボ核酸分子として発現され、鞘翅目害虫が前記植物の一部を摂取したときに、前記リボ核酸分子が、前記少なくとも1つのヌクレオチド配列(複数可)と特異的に相補的な内因性鞘翅目害虫ヌクレオチド配列の発現を阻害する、請求項23に記載の植物。
- 配列番号1、配列番号1の相補体、配列番号2、配列番号2の相補体、配列番号3、配列番号3の相補体、配列番号4、配列番号4の相補体、配列番号1の少なくとも19個の連続したヌクレオチドの断片、配列番号1の少なくとも19個の連続したヌクレオチドの断片の相補体、配列番号1を含むジアブロティカ属(Diabrotica)生物の天然コード配列、配列番号1を含むジアブロティカ属(Diabrotica)生物の天然コード配列の相補体、配列番号1を含む天然RNA分子に転写されるジアブロティカ属(Diabrotica)生物の天然非コード配列、および配列番号1を含む天然RNA分子に転写されるジアブロティカ属(Diabrotica)生物の天然非コード配列の相補体からなる群から選択される複数のヌクレオチド配列を含む、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ヌクレオチド配列が、植物細胞中で機能的である異種プロモーターにそれぞれ作動可能に連結している、請求項31に記載のポリヌクレオチドを含む植物形質転換ベクター。
- 請求項31に記載のポリヌクレオチドで形質転換された細胞。
- 請求項31に記載のポリヌクレオチドで形質転換された植物。
- 前記複数のヌクレオチド配列が前記植物において二本鎖リボ核酸分子として発現される、請求項34に記載の植物。
- ゼア・マイス(Zea mays)細胞である、請求項33に記載の細胞。
- ゼア・マイス(Zea mays)である、請求項35に記載の植物。
- 前記鞘翅目害虫がジアブロティカ属(Diabrotica)種である、請求項30に記載の植物。
- 前記鞘翅目害虫がD.ヴィルギフェラ・ヴィルギフェラ(D. virgifera virgifera)ルコント、D.バルベリ(D. barberi)スミスおよびローレンス、D.ヴィルギフェラ・ゼアエ(D. virgifera zeae)クリサンおよびスミス、D.ウンデシムプンクタータ・ホワルディ(D. undecimpunctata howardi)バーバー、D.バルテアタ(D. balteata)ルコント、D.ウンデシムプンクタータ・テネラ(D. undecimpunctata tenella)、ならびにD.ウンデシムプンクタータ・ウンデシムプンクタータ(D. undecimpunctata undecimpunctata)マンネルヘイムからなる群から選択される、請求項31に記載の植物。
- 請求項23に記載の植物から生産され、検出可能な量の請求項1に記載のポリヌクレオチドを含む商品生産物。
- 鞘翅目害虫集団を防除する方法であって、前記鞘翅目害虫と接触すると前記鞘翅目害虫内部の生物学的機能を阻害するように機能する二本鎖リボ核酸分子を含む作用物質を供給することを含み、前記作用物質が配列番号1、配列番号1の相補体、配列番号1の少なくとも19個の連続したヌクレオチドの断片、配列番号1の少なくとも19個の連続したヌクレオチドの断片の相補体、配列番号1を含むジアブロティカ属(Diabrotica)生物の天然コード配列、配列番号1を含むジアブロティカ属(Diabrotica)生物の天然コード配列の相補体、配列番号1を含む天然RNA分子に転写されるジアブロティカ属(Diabrotica)生物の天然非コード配列、配列番号1を含む天然RNA分子に転写されるジアブロティカ属(Diabrotica)生物の天然非コード配列の相補体、配列番号1を含むジアブロティカ属(Diabrotica)生物の天然コード配列の少なくとも19個の連続したヌクレオチドの断片、配列番号1を含むジアブロティカ属(Diabrotica)生物の天然コード配列の少なくとも19個の連続したヌクレオチドの断片の相補体、配列番号1を含む天然RNA分子に転写されるジアブロティカ属(Diabrotica)生物の天然非コード配列の少なくとも19個の連続したヌクレオチドの断片、および配列番号1を含む天然RNA分子に転写されるジアブロティカ属(Diabrotica)生物の天然非コード配列の少なくとも19個の連続したヌクレオチドの断片の相補体からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、方法。
- 鞘翅目害虫集団を防除する方法であって、前記鞘翅目害虫と接触すると前記鞘翅目害虫内部の生物学的機能を阻害するように機能する第1および第2のポリヌクレオチド配列を含む作用物質を供給することを含み、前記第1のポリヌクレオチド配列が配列番号1の約19個〜約30個の連続したヌクレオチドと約90%〜約100%の配列同一性を示す領域を含み、前記第1のポリヌクレオチド配列が前記第2のポリヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズする、方法。
- 前記第1のポリヌクレオチド配列が、液胞型ATPアーゼのCサブユニット、液胞型ATPアーゼのHサブユニットおよびRho1低分子量GTP結合タンパク質からなる群から選択される鞘翅目害虫遺伝子の約19個〜約30個の連続したヌクレオチドと約90%〜約100%の配列同一性を示す領域をさらに含む、請求項42に記載の方法。
- 鞘翅目害虫集団を防除する方法であって、
請求項1に記載のポリヌクレオチドを含む形質転換植物細胞を鞘翅目害虫の宿主植物に供給することを含み、前記ポリヌクレオチドが、前記集団に属する鞘翅目害虫と接触すると前記鞘翅目害虫内部の標的配列の発現を阻害するように機能し、前記形質転換植物細胞を欠く同じ種の宿主植物における成長と比べて、前記鞘翅目害虫または鞘翅目害虫集団の成長の低下をもたらすリボ核酸分子を産生するように発現される、方法。 - 前記リボ核酸分子が二本鎖リボ核酸分子である、請求項44に記載の方法。
- 前記鞘翅目害虫集団が、前記形質転換植物細胞を欠く同じ種の宿主植物にまん延する鞘翅目害虫集団と比べて減少する、請求項44に記載の方法。
- 鞘翅目害虫の飼料に請求項1に記載のポリヌクレオチドを供給することを含む、植物における植物鞘翅目害虫のまん延を制御する方法。
- 前記飼料が請求項1に記載のポリヌクレオチドを発現するように形質転換された植物細胞を含む、請求項47に記載の方法。
- コーン作物の収量を改善する方法であって、
請求項3に記載のポリヌクレオチドをコーン植物に導入して、トランスジェニックコーン植物を産生することと、
前記少なくとも1つのヌクレオチド配列(複数可)の発現を可能にするために前記コーン植物を栽培することとを含み、前記少なくとも1つのヌクレオチド配列(複数可)の発現が、鞘翅目害虫の感染または増殖および鞘翅目害虫の感染に起因する収量損失を阻害する、方法。 - 前記少なくとも1つのヌクレオチド配列(複数可)の発現が、前記コーン植物の一部と接触した鞘翅目害虫における少なくとも第1の標的遺伝子を抑制するRNA分子を産生する、請求項49に記載の方法。
- トランスジェニック植物細胞を産生する方法であって、
植物プロモーターに作動可能に連結した請求項1に記載のポリヌクレオチドおよび転写終結配列を含むベクターで植物細胞を形質転換することと、
複数の形質転換植物細胞を含む植物細胞培養の発育を可能にするのに十分な条件下で前記形質転換植物細胞を培養することと、
前記少なくとも1つのヌクレオチド配列(複数可)をそのゲノムに組み込んだ形質転換植物細胞を選択することと、
前記少なくとも1つのヌクレオチド配列(複数可)によりコードされるリボ核酸分子の発現について前記形質転換植物細胞をスクリーニングすることと、
dsRNAを発現する植物細胞を選択することと
を含む、方法。 - 鞘翅目害虫抵抗性トランスジェニック植物を産生する方法であって、
請求項51に記載の方法により産生されるトランスジェニック植物細胞を供給することと、
前記トランスジェニック植物細胞からトランスジェニック植物を再生させることとを含み、前記少なくとも1つのヌクレオチド配列(複数可)によりコードされるリボ核酸分子の発現が、前記形質転換植物に接触する鞘翅目害虫における標的遺伝子の発現を調節するのに十分である、方法。 - 前記形質転換植物がバチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)由来のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項51に記載の方法。
- バチルス・チューリンゲンシス(B. thuringiensis)由来の前記ポリペプチドがCry3、Cry34およびCry35からなる群から選択される、請求項53に記載の方法。
- 鞘翅目害虫における必須dre4遺伝子の発現を阻害する手段を含む作用物質を鞘翅目害虫集団に供給することを含む、前記鞘翅目害虫集団を防除する方法。
- 前記作用物質を供給することが、植物にdre4害虫抵抗性をもたらす手段を鞘翅目害虫のまん延に感受性である植物に導入することを含む、請求項55に記載の方法。
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