JP2017512486A - システイン操作抗体を含むコンジュゲート化合物 - Google Patents

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Abstract

本開示は、１つまたは複数の反応性システイン残基によって操作された、抗体およびそれらの断片を含むコンジュゲート化合物、より具体的には治療または診断用途を有するコンジュゲート化合物を提供する。コンジュゲート化合物は、例えば、化学療法剤、毒素，そして放射性核種またはフルオロフォアなどの検出標識にコンジュゲートされた、システイン操作抗体またはそれらの断片を含む。本開示はまた、哺乳類細胞、または関連病的状態を、生体外、原位置、生体外、および生体内で、診断または治療するために、開示されるコンジュゲート化合物を使用する方法も提供する。【選択図】図１−１

Description

本開示は、システイン操作抗体およびＦｃ融合タンパク質、そしてこのようなシステイン操作分子を含むコンジュゲート化合物を提供する。このようなコンジュゲートは、診断および治療用途で使用され得る。
がん、免疫障害および血管原性障害がある患者を診断し標的化治療するための抗体の使用は、確立されている。がん治療において、細胞毒性薬または細胞***阻害剤、すなわち、腫瘍細胞を殺滅または抑制する薬物を局所送達するための、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）、すなわち、免疫複合体の使用（Ｌａｍｂｅｒｔ（２００５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ５：５４３−５４９；Ｗｕ ｅｔ ａｌ（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：１１３７−１１４６；Ｐａｙｎｅ（２００３）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ３：２０７−２１）は、理論的には、これらの非結合薬物の全身投与が、排除が求められる腫瘍細胞のみならず、正常細胞にも許容できないレベルの毒性をもたらし得る場合において、薬物成分が標的に結合して内在化され、その中で細胞内蓄積がもたらされてもよい、薬物成分の腫瘍への標的化送達を可能にする。ＡＤＣを設計し洗練する努力は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ならびに薬物結合および薬物放出特性の選択性に焦点を合わせている（Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｊ．（２００５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ５：５４３−５４９）。これらの方法としては、抗体と、薬物、毒素、放射性同位体、ペプチド、他の抗体などとのコンジュゲーションが挙げられる。
従来の付着手段、すなわち、共有結合を介した、薬物成分と抗体との結合は、通常、薬物成分が抗体のいくつかの部位に付着する、不均一な分子の混合物をもたらす。例えば、細胞毒性薬は、典型的に、往々にして多数である抗体のリジン残基を介して、抗体にコンジュゲートされており、不均一な抗体薬物コンジュゲート混合物が生じる。
遺伝子操作技術によって、システイン残基がタンパク質内に導入されており、リガンドとの共有結合が形成され、または新規分子内ジスルフィド結合が形成されている。しかし、タンパク質の様々なアミノ酸残基のシステインアミノ酸の変異によってシステインチオール基を操作することは、特に、不対（遊離システイン）残基、または反応または酸化にとって比較的アクセスしやすい残基の場合に、潜在的な問題がある。例えば、分子内または分子間のジスルフィド形成は、タンパク質凝集を引き起こし得る。操作システインの部位は、コンジュゲーション中の薬物のアクセスしやすさに影響を及ぼし、低い収率がもたらされ得る。新規のシステインの導入は、誤った折り畳みまたは三次構造喪失のために、抗体を不活性し得て、またはその標的結合特異性の喪失を引き起こし得る（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ（２００２）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３１１：１−９）。また、コンジュゲート化合物は血清安定性が乏しくあり得て、活性喪失および分解がもたらされ得る（例えば、抗体部分のタンパク質分解またはクリアランスによって、または薬物成分の加水分解によって）。
Ｌａｍｂｅｒｔ（２００５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ５：５４３−５４９；Ｗｕ ｅｔ ａｌ（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：１１３７−１１４６；Ｐａｙｎｅ（２００３）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ３：２０７−２１ Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｊ．（２００５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ５：５４３−５４９ Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ（２００２）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３１１：１−９
したがって、例えば、血清安定性などの安定性が向上された、コンジュゲート化合物をもたらすことができる、改善されたシステイン操作ストラテジーを提供することが、本開示の目的である。
本開示は、システイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質と、少なくとも１つの異種部分とを含むコンジュゲート化合物を提供し、（ｉ）抗体またはＦｃ融合タンパク質のＦｃドメインは、アミノ酸位置の番号付与が、Ｋａｂａｔ（１９９１，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１−３２４２，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，ＶＡ）に記載のＥＵ指針に準拠する、アミノ酸位置２４１、２４３、２５１、２５３、２５８、２６４、２６９、２７１、２７２、２７４、２８０、２８１、２８５、２８８、２９１、２９３、２９４、２９６、３０１、３０７、３０９、３１１、３１８、３２９、３４０、３４１、３４５、３５７、３８５、３８６、３８７、４０１、４０２、４１１、４１７、４３３、４３５、または４３９におけるシステインアミノ酸置換、位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入、およびそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの操作システインアミノ酸を含み、（ｉｉ）少なくとも１つの異種部分は、操作システインの１つにコンジュゲートされる。
いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、２つ以上の操作システインアミノ酸を含む。
いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、血清中で高い安定性を有する。
本開示の別の態様は、本明細書に記載されるような少なくとも１つの操作システインアミノ酸を有する、抗体またはＦｃ融合タンパク質を作成するための核酸、ベクター、および宿主細胞を提供する。
本開示の別の態様は、システイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質と、少なくとも１つの異種部分とを含む、コンジュゲート化合物を作成する方法を提供する。一実施形態では、異種部分は薬物であり、薬物は、細胞毒性薬、化学療法剤、ペプチド、ペプチド模倣体、タンパク質スキャフォールド、酵素、毒素、放射性核種、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ペプチド核酸、蛍光性タグ、またはビオチンから選択される。
本開示の別の態様は、本開示のコンジュゲート化合物を提供し、コンジュゲート化合物は、細胞表面受容体との結合時に内在化できる。このような態様では、本開示のコンジュゲート化合物は、カーゴ分子および／または作用物質を細胞内送達するのに有用である。
本開示の別の態様は、本開示のコンジュゲート化合物によって、がん、自己免疫性、炎症性、または伝染性疾患を治療、検出、および診断する方法を提供する。
本開示の別の態様は、本開示のコンジュゲート化合物を含む組成物を提供する。
図１Ａ及びＢは、それぞれ、Ｋａｂａｔに記載のＥＵ指針に準拠する、ＩｇＧ重鎖（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４）のＣＨ２およびＣＨ３領域のアミノ酸配列および番号付与を示す（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）。ＩｇＧ１と異なる残基は網掛けされ、既知の対立遺伝子バリエーションの部位は星印（＊）によって示される。網掛けボックスは、実施例１で同定されたシステイン置換／挿入部位のいくつかを示し、矢印は、本明細書で提供される実施例において、血清安定性について試験されたシステイン置換／挿入部位を示す。 図１−１の続きである。 マレイミド化学反応を使用してＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（ＡＦ４８８）にコンジュゲートされた、ＥＵ位置２５８（Ｅ２５８Ｃ）でシステインが操作された１Ｃ１抗体を含むコンジュゲート化合物に対応する、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）プロファイルを示す。コンジュゲート化合物は、ヒト血清（ＮＨＳ）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を用いて培養された。パネルＡは０日目のＮＨＳ培養を示し、パネルＢは０日目のＰＢＳ培養を示し、パネルＣは７日後のＮＨＳ培養を示し、パネルＤは７日後のＰＢＳ培養を示す。２８０におけるシグナルは、サンプル中の総タンパク質含量であり、４９４におけるシグナルは、ＡＦ４８８にコンジュゲートされたタンパク質である。７日間の血清培養後に、小量のＡＦ４８８のみがＨＳＡに移入された。 図２−１の続きである。 マレイミド化学反応を使用してＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（ＡＦ４８８）にコンジュゲートされた、ＥＵ位置４３５（Ｈ４３５Ｃ）でシステインが操作された１Ｃ１抗体を含むコンジュゲート化合物に対応する、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）プロファイルを示す。コンジュゲート化合物は、ヒト血清（ＮＨＳ）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を用いて培養された。パネルＡは０日目のＮＨＳ培養を示し、パネルＢは０日目のＰＢＳ培養を示し、パネルＣは７日後のＮＨＳ培養を示し、パネルＤは７日後のＰＢＳ培養を示す。７日間の血清培養後に、小量のＡＦ４８８のみがＨＳＡに移入された。 図３−１の続きである。 マレイミド化学反応を使用してＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（ＡＦ４８８）にコンジュゲートされた、ＥＵ位置４４３（Ｌ４４３Ｃ）でシステインが操作された１Ｃ１抗体を含むコンジュゲート化合物に対応する、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）プロファイルを示す。コンジュゲート化合物は、ヒト血清（ＮＨＳ）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を用いて培養された。パネルＡは０日目のＮＨＳ培養を示し、パネルＢは０日目のＰＢＳ培養を示し、パネルＣは７日後のＮＨＳ培養を示し、パネルＤは７日後のＰＢＳ培養を示す。７日間の血清培養後に、小量のＡＦ４８８のみがＨＳＡに移入された。 図４−１の続きである。 マレイミド化学反応を使用してＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（ＡＦ４８８）にコンジュゲートされた、ＥＵ位置２３９および２４０間の挿入点（Ｃ２３９ｉｎｓ）でシステインが操作された１Ｃ１抗体を含むコンジュゲート化合物に対応する、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）プロファイルを示す。コンジュゲート化合物は、ヒト血清（ＮＨＳ）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を用いて培養された。パネルＡは０日目のＮＨＳ培養を示し、パネルＢは０日目のＰＢＳ培養を示し、パネルＣは７日後のＮＨＳ培養を示し、パネルＤは７日後のＰＢＳ培養を示す。７日間の血清培養後に、小量のＡＦ４８８のみがＨＳＡに移入された。 図５−１の続きである。 マレイミド化学反応を使用してＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（ＡＦ４８８）にコンジュゲートされた、ＥＵ位置２３９（Ｓ２３９Ｃ）でシステインが操作された１Ｃ１抗体を含むコンジュゲート化合物に対応する、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）プロファイルを示す。コンジュゲート化合物は、ヒト血清（ＮＨＳ）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を用いて培養された。パネルＡは０日目のＮＨＳ培養を示し、パネルＢは０日目のＰＢＳ培養を示し、パネルＣは７日後のＮＨＳ培養を示し、パネルＤは７日後のＰＢＳ培養を示す。７日間の血清培養後に、小量のＡＦ４８８のみがＨＳＡに移入された。 図６−１の続きである。 マレイミド化学反応を使用してＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（ＡＦ４８８）にコンジュゲートされた、高度安定化変異である、その軽鎖（ＬＣ）中のＥＵ位置２０５（ＬＣ−Ｖ２０５Ｃ）でシステインが操作された１Ｃ１抗体を含むコンジュゲート化合物に対応する、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）プロファイルを示す。コンジュゲート化合物は、ヒト血清（ＮＨＳ）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を用いて培養された。パネルＡは０日目のＮＨＳ培養を示し、パネルＢは０日目のＰＢＳ培養を示し、パネルＣは７日後のＮＨＳ培養を示し、パネルＤは７日後のＰＢＳ培養を示す。７日間の血清培養後に、小量のＡＦ４８８のみがＨＳＡに移入された。 図７−１の続きである。 マレイミド化学反応を使用してＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（ＡＦ４８８）にコンジュゲートされた、不安定化変異である、ＥＵ位置２８９（Ｔ２８９Ｃ）でシステインが操作された１Ｃ１抗体を含むコンジュゲート化合物に対応する、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）プロファイルを示す。コンジュゲート化合物は、ヒト血清（ＮＨＳ）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を用いて培養された。パネルＡは０日目のＮＨＳ培養を示し、パネルＢは０日目のＰＢＳ培養を示し、パネルＣは７日後のＮＨＳ培養を示し、パネルＤは７日後のＰＢＳ培養を示す。Ａ４８８の大部分は、７日間の血清培養後にＨＳＡに移入された。 図８−１の続きである。 図２〜８に提供される実験データに対応する、生データ（パネルＡ）および０日目について正規化されたデータ（パネルＢ）を示す。Ｅ２５８Ｃ、Ｈ４３５、Ｌ４４３、およびＣ２３９ｉｎｓ変異を含み、ＡＦ４８８にコンジュゲートされた、新規システイン操作１Ｃ１抗体は、７日間の血清培養後に安定していた。新規操作化合物の安定性は、１Ｃ１−ＬＣ−Ｖ２０５Ｃ−ＡＦ４８８安定部位対照と同等であった。１Ｃ１−Ｔ２８９Ｃ−ＡＦ４８８コンジュゲート化合物は、比較部位対照であった。 ＥＵ Ｅ２５８ＣおよびＣ２３９ｉｎｓ変異が、ＦｃＲｎ結合に影響を及ぼさなかったことを示す。図１０Ａでは、示される位置に示される変異を有する抗体が、ＥＬＩＳＡプレート上に固定化された場合、ＦｃＲｎが、ＷＴ ＩｇＧ１ Ｆｃを有する抗体と比較して、同様のレベルで結合できることを示す。図１０Ｂでは、マレイミド化学反応を使用したＡＦ４８８コンジュゲーションがある、またはない、示される位置に示される変異を有する抗体が、ＥＬＩＳＡプレートに固定化された場合、ＦｃＲｎが、ＷＴ ＩｇＧ１ Ｆｃを有する抗体と比較して、同様のレベルで結合できることを示す。曲線のそれぞれについて、ＬｏｇＥＣ50値を提示する表もまた示される。 野性型Ｆｃ領域またはシステイン操作Ｆｃ領域を有する抗体と、ヒトＦｃ受容体、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ（１５８Ｖおよび１５８Ｆ対立遺伝子の双方）、およびＦｃＲｎとの結合親和性を示す。「Ｎ／Ａ」は、ＫＤの確かな推定値を得るには、結合が弱すぎることを意味する。ｐＨ６における、ＦｃＲｎとの結合が示される。 野生型（ＷＴ）、Ｅ２５８Ｃ、Ｓ２３９Ｃ、Ｃ２３９ｉｎｓ、Ｈ４３５Ｃ、およびＬｃ−Ｖ２０５Ｃ変異の示差走査熱量測定（ＤＳＣ）プロファイルを示す。Ｅ２５８Ｃ、Ｓ２３９Ｃ、およびＬｃ−Ｖ２０５Ｃのプロファイルが、ＷＴと同様である一方、Ｃ２３９ｉｎｓおよびＨ４３５Ｃ変異体の双方で、新しいより低い融解ピークが出現する。ＤＳＣ温度記録から誘導されるＴm１値を提示する表もまた、示される。 図１３Ａ−Ｃは、オーリスタチンベースの細胞毒性薬を含み、１Ｃ１抗体に由来する、単一Ｃｙｓ変異抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）のＤＵ１４５細胞に対する細胞毒性を示す。１Ｃ１−Ｓ２３９Ｃ−ＡＤＣ、１Ｃ１−ＬＣ−Ｖ２０５Ｃ−ＡＤＣ、１Ｃ１−Ｅ２５８Ｃ−ＡＤＣ、Ｃ１−Ｈ４３５Ｃ−ＡＤＣ、１Ｃ１−２３９ｉｎｓ−ＡＤＣ、１Ｃ１−Ｔ２８９Ｃ−ＡＤＣ、１Ｃ１−Ｌ４４３Ｃ−ＡＤＣ、１Ｃ１−ｃｃＡＤＣ（ランダムコンジュゲーションアプローチを使用）、および１Ｃ１−ＷＴ−ＡＤＣ（模擬コンジュゲーション）およびＲ３４７−Ｓ２３９Ｃ−ＡＤＣ陰性対照に対する、細胞毒性（ｃｙｔｏｘｉｃｉｔｙ）曲線がプロットされる。パネルＡは、０日目の効果を示す。パネルＢは、３日目の効果を示す。パネルＣは、７日目の効果を示す。曲線のそれぞれについて、ＥＣ50値を提示する表もまた示される。 図１３−１の続きである。 図１４Ａ−Ｃは、ＤＵ１４５細胞に対する、２つの操作システインとオーリスタチンベースの細胞毒性薬とを含む、１Ｃ１抗体に由来するＡＤＣの細胞毒性を示す。プロットされているのは、１Ｃ１−２３９ｉｎｓ−Ｅ２５８Ｃ−ＡＤＣ、Ｃ１−２３９ｉｎｓ−Ｈ４３５Ｃ−ＡＤＣ、１Ｃ１−２３９ｉｎｓ−Ｓ４４２Ｃ−ＡＤＣ、１Ｃ１−ＦＦ−Ｅ２５８Ｃ−Ｓ４３５Ｃ−ＡＤＣ、１Ｃ１−ＦＦ−Ｅ２５８Ｃ−Ｓ４４２Ｃ−ＡＤＣ、１Ｃ１−ＦＦ−Ｈ４３５Ｃ−Ｓ４４２Ｃ−ＡＤＣ（「ＦＦ」は、このコンストラクトが追加的な変異ＥＵ Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｆを含有して、Ｆｃ媒介エフェクター機能が取り除かれることを示すことに留意されたい）、および１Ｃ１−Ｔ２８９Ｃ−ＡＤＣに対する、細胞毒性（ｃｙｔｏｘｉｃｉｔｙ）曲線である。パネルＡは、０日目の効果を示す。パネルＢは、３日目の効果を示す。パネルＣは、７日目の効果を示す。曲線のそれぞれについて、ＥＣ50値を提示する表もまた示される。 図１４−１の続きである。
本開示は、１つまたは複数のアミノ酸残基が反応性システイン残基で置換されている、システイン操作抗体およびＦｃ融合タンパク質を含むコンジュゲート化合物、より具体的には、治療用または診断用化合物とのコンジュゲート化合物を提供する。本明細書で開示されるコンジュゲート化合物は、例えば、化学療法剤、毒素、放射性核種、および放射性核種またはフルオロフォアなどの検出標識に、コンジュゲートされたシステイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質を含む。本開示はまた、試験管内、原位置、生体外、および生体内で、哺乳類細胞、または関連病的状態を診断または治療するために、開示されるコンジュゲート化合物を使用する方法にも関する。
本開示がより容易に理解され得るように、特定の用語が最初に定義される。追加的な定義は、詳細な説明全体を通じて記載される。
Ｉ．定義
提供される実施形態について詳細に説明する前に、本開示は、特定の組成物または工程段階に限定されず、したがって変動し得るものと理解される。本明細書および添付の特許請求範囲の用法では、文脈上例外が明記されていない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、指示対象の複数形を含む。「ａ」（または「ａｎ」）という用語、ならびに「１つまたは複数」および「少なくとも１つ」という用語は、本明細書で同義的に使用され得る。
さらに本明細書で使用される「および／または」は、他方の有無にかかわらず、２つの指定された特徴または成分のそれぞれの特定の開示と見なされるべきである。したがって本明細書において、「Ａおよび／またはＢ」などの語句で使用される「および／または」という用語は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、および「Ｂ」（単独）を含むことが意図される。同様に、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」などの語句で使用される「および／または」という用語は、以下の実施形態のそれぞれを包含することが意図される：Ａ、Ｂ、およびＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；およびＣ（単独）。
特に断りのない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本開示が関連する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。例えば、Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ−Ｓｈｏｗ，２ｎｄ ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；Ｔｈｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；およびＯｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ Ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓは、本開示で使用される多数の用語の一般的辞書を当業者に提供する。
単位、接頭辞、および記号は、それらの国際単位系（ＳＩ）公認形式で示される。数値範囲は、範囲を規定する数を包含する。特に断りのない限り、アミノ酸配列は、アミノからカルボキシ方向で左から右に書かれる。本明細書で提供される見出しは、全体として明細書を参照することにより得られ得る、様々な態様の制限ではない。したがって、すぐ下で定義される用語は、明細書全体を参照してより詳細に定義される。
本明細書において、態様が、「含む」という言葉を用いて記述される場合は常に、「からなる」および／または「から本質的になる」によって記述される、その他の点では類似した態様もまた提供されるものと理解される。
アミノ酸は、それらの一般に知られている三文字記号によって、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会が推奨する一文字記号によってのどちらかで、本明細書で言及される。同様にヌクレオチドは、それらの一般に認められた一文字コードによって言及される。
本明細書で同義的に使用される「抗体」または「免疫グロブリン」という用語は、全抗体およびそれらの任意の抗原結合断片または単一鎖を含む。
典型的な抗体は、ジスルフィド結合によって相互連結される、少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書でＶＨと略記される）および重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、３つまたは４つの定常領域、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書でＶＬと略記される）および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬから構成される。ＶＨおよびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性領域にさらに細分化され得て、フレームワーク領域（ＦＷ）と称される、より保存された領域がその中に散在する。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に、ＦＷ１、ＣＤＲ１、ＦＷ２、ＣＤＲ２、ＦＷ３、ＣＤＲ３、ＦＷ４の順で配列される、３つのＣＤＲおよび４つのＦＷから構成される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合領域を含有する。抗体の定常領域は、免疫グロブリンと、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）をはじめとする、宿主組織または要素との結合を媒介し得る。本開示の代表的システイン操作抗体としては、典型的な抗体と、融合タンパク質と、例えば、典型的な抗体重鎖のＣＨ２ドメインＮ末端に、またはＣＨ３ドメインＣ末端に、（例えば、ペプチド性結合を介して、または化学的リンカーを介して）共有結合する、ＦｃドメインおよびｓｃＦｖを含むコンストラクトなどの抗体またはその抗原結合断片を含むコンストラクトとが挙げられる。
「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子の可変領域内の少なくとも１つの抗原認識部位を通じて、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、または前述の組み合わせなどの標的を認識してそれに特異的に結合する、免疫グロブリン分子を意味する。本明細書の用法では、「抗体」という用語は、抗体が所望の生物学的活性を示しさえすれば、無傷ポリクローナル抗体、無傷モノクローナル抗体、抗体断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片など）、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）変異体、少なくとも２つの無傷抗体から生成される二重特異性抗体などの多特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体の抗原決定部分を含む融合タンパク質、および抗原認識部位を含む任意のその他の修飾免疫グロブリン分子を包含する。抗体は、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと称されるそれらの重鎖定常領域の同一性に基づいて、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭの免疫グロブリンの５つの主要なクラスのいずれか、またはそれらのサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）であり得る。免疫グロブリンの異なるクラスは、異なる周知のサブユニット構造および三次元配置を有する。抗体は、裸であり得て、または毒素、放射性同位体などのその他の分子にコンジュゲートされて、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を形成し得る。
「抗原結合断片」という用語は、無傷抗体の一部を指し、無傷抗体の抗原決定可変領域を指す。抗体の抗原結合機能が、完全長抗体の断片によって実行され得ることは、当該技術分野で公知である。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片、直鎖抗体、一本鎖抗体、および抗体断片から形成される多特異性抗体が挙げられるが、これに限定されるものではない。
「モノクローナル抗体」は、単一抗原決定基またはエピトープの非常に特異的な認識およびその結合に関与する、均質抗体集団を指す。これは、典型的に、異なる抗原決定基に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体とは、対照的である。
「モノクローナル抗体」という用語は、無傷および完全長の双方のモノクローナル抗体、ならびに抗体断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなど）、一本鎖（ｓｃＦｖ）変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、および抗原認識部位を含む任意のその他の修飾免疫グロブリン分子を包含する。さらに、「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ、ファージ選択、組換え発現、および遺伝子組換え動物をはじめとするが、これに限定されるものではない、多数の様式で生成される抗体を指す。
「ヒト化抗体」という用語は、最小の非ヒト（例えば、マウス）配列を含有するように操作されている、非ヒト（例えば、マウス）免疫グロブリンに由来する抗体を指す。典型的に、ヒト化抗体は、その中で相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有する非ヒト生物種（例えば、マウス、ラット、ウサギ、またはハムスター）のＣＤＲからの残基によって置き換えられている、ヒト免疫グロブリンである（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６）。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＷ）残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有する、非ヒト生物種由来抗体中の対応する残基で置換される。
ヒト化抗体は、Ｆｖフレームワーク領域中および／または置換された非ヒト残基中のどちらかの追加的な残基の置換によってさらに修飾されて、抗体特異性、親和性、および／または能力が洗練されて最適化され得る。一般に、ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンに対応するＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てを含有する、少なくとも１つ、および典型的に２つまたは３つの可変領域の全てを実質的に含む一方で、ＦＲ領域の全てまたは実質的に全てはヒト型である。ヒト化抗体はまた、典型的にヒト免疫グロブリンである、免疫グロブリン定常領域またはドメイン（Ｆｃ）の少なくとも一部を含み得る。ヒト化抗体を作成するのに使用される方法の例は、米国特許第５，２２５，５３９号明細書または米国特許第５，６３９，６４１号明細書に記載される。
抗体の「可変領域」は、単独または組み合わせのどちらかで、抗体軽鎖の可変領域、または抗体重鎖の可変領域を指す。重鎖および軽鎖の各可変領域は、超可変領域としてもまた知られている３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によって連結される、４つのフレームワーク領域（ＦＷ）からなる。各鎖中のＣＤＲは、ＦＷ領域によって近傍にまとめられており、もう一方の鎖からのＣＤＲは、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。ＣＤＲを判定するための少なくとも２つの技術がある：（１）異種間の配列変動性に基づくアプローチ（すなわち、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，（５ｔｈ ｅｄ．，１９９１，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｍｄ．））；および（２）抗原抗体複合体の結晶学的研究に基づくアプローチ（Ａｌ−ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７−９４８））。さらに、これらの２つのアプローチの組み合わせが、ＣＤＲ判定技術分野で利用されることもある。
Ｋａｂａｔ番号付与体系は、通常、可変領域中の残基（およそ軽鎖の残基１〜１０７および重鎖の残基１〜１１３）に言及する際に使用される（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））。
Ｋａｂａｔのアミノ酸配置番号付与は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）にある抗体の編纂物の重鎖可変領域または軽鎖可変領域のために使用される番号付与体系を指す。この番号付与体系を使用して、実際の直鎖アミノ酸配列は、可変領域のＦＷまたはＣＤＲの短縮またはそれへの挿入に対応する、より少ないまたは追加的なアミノ酸を含有し得る。例えば、重鎖可変領域は、Ｈ２の残基５２の後に単一アミノ酸挿入（Ｋａｂａｔに従った残基５２ａ）、重鎖ＦＷ残基８２の後に挿入残基（例えば、Ｋａｂａｔに従った残基８２ａ、８２ｂ、および８２ｃなど）を含み得る。
Figure 2017512486
残基のＫａｂａｔ番号付与は、抗体配列の相同性領域における、「標準」Ｋａｂａｔ番号付与配列とのアライメントによって、所与の抗体について判定され得る。Ｃｈｏｔｈｉａは、そうではなく、構造ループ部位を参照する（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））。Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ−Ｈ１ループ末端は、Ｋａｂａｔ番号付与の慣例を使用して番号付与されると、ループの長さに応じてＨ３２およびＨ３４の間で変動する（これは、Ｋａｂａｔ番号付与スキームが、３５ＡおよびＨ３５Ｂおける挿入を、３５Ａまたは３５Ｂがどちらも存在しない場合は３２のループ末端に；３５Ａのみが存在する場合は３３のループ末端に；３５Ａおよび３５Ｂの双方が存在する場合は３４Ｈのループ末端に、位置づけるためである）。ＡｂＭ超可変領域は、Ｋａｂａｔ ＣＤＲおよびＣｈｏｔｈｉａ構造ループの間の妥協点に相当し、Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデル化ソフトウェアによって使用される。
ＩＭＧＴ（ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ）は、ＣＤＲをはじめとする免疫グロブリン可変領域のための番号付与体系もまた提供する。例えば、参照により本明細書に援用される、Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５５−７７（２００３）を参照されたい。ＩＭＧＴ番号付与体系は、５，０００を超える配列のアライメント、構造データ、および超可変ループの特性決定に基づいて、全ての生物種について変動領域およびＣＤＲ領域が容易に比較できるようにする。ＩＭＧＴ番号付与スキーマによれば、ＶＨ−ＣＤＲ１は位置２６〜３５、ＶＨ−ＣＤＲ２は位置５１〜５７、ＶＨ−ＣＤＲ３は位置９３〜１０２、ＶＬ−ＣＤＲ１は位置２７〜３２、ＶＬ−ＣＤＲ２は位置５０〜５２、およびＶＬ−ＣＤＲ３は位置８９〜９７にある。
本明細書の用法では、Ｆｃ領域は、第１の定常領域免疫グロブリンドメイン以外の抗体定常領域を含む、ポリペプチドおよびそれらの断片を含む。したがってＦｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメインと、ＩｇＥおよびＩｇＭの最後の３つの常領域免疫グロブリンドメインと、任意選択的にこれらのドメインの可撓性ヒンジ領域Ｎ末端とを指す。ＩｇＡおよびＩｇＭでは、Ｆｃ領域はＪ鎖を含み得る。ＩｇＧでは、Ｆｃは、免疫グロブリンドメインＣガンマ２およびＣガンマ３（Ｃγ２およびＣγ３）、および任意選択的にＣガンマ１（Ｃγ１）およびＣガンマ２（Ｃγ２）の間のヒンジ領域を含む。Ｆｃ領域の境界は変動し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常は、そのカルボキシル末端の残基Ｃ２２６またはＰ２３０を含むと定義され、番号付与はＫａｂａｔ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））に記載のＥＵ指針に準拠する。Ｆｃは、単独でのこの領域、または抗体、抗体断片、またはＦｃ融合タンパク質の文脈でのこの領域を指し得る。ＥＵ指針によって番号付与される位置２７０、２７２、３１２、３１５、３５６、および３５８をはじめとするが、これに限定されるものではない、いくつかの異なるＦｃ位置において多形性が観察されており、したがって提示される配列と先行技術の配列の間に、わずかな違いが存在することもある。
本明細書の用法では、「Ｆｃ融合タンパク質」という用語は、完全長Ｆｃドメインを含むタンパク質（例えば、本開示のコンジュゲート化合物）、ならびにＦｃドメイン断片（例えば、完全ＣＨ２ドメイン、完全ＣＨ３ドメイン、ＣＨ２断片、ＣＨ３断片、またはそれらの組み合わせ）を含むタンパク質を包含する。Ｆｃ融合タンパク質はまた、ヒンジ領域の全部または一部を含んでもよい。
「ヒト抗体」という用語は、ヒトによって産生された抗体、または当該技術分野で公知の任意の技術を使用して生成された、ヒトによって産生される抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体を意味する。このヒト抗体の定義は、無傷または完全長抗体、それらの断片、および／または例えばマウス軽鎖とヒト重鎖ポリペプチドとを含む抗体などの少なくとも１つのヒト重鎖および／または軽鎖ポリペプチドを含む抗体を含む。
「キメラ抗体」という用語は、免疫グロブリン分子のアミノ酸配列が、２種以上の生物種に由来する抗体を指す。典型的に、軽鎖および重鎖の双方の可変領域が、所望の特異性、親和性、および能力がある、哺乳類種（例えば、マウス、ラット、ウサギなど）に由来する抗体の可変領域に相当する一方で、定常領域は、別の種（通常はヒト）に由来する抗体の配列と相同的であり、その生物種において免疫応答を引き起こすことが回避される。
「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性」または「ＡＤＣＣ」は、分泌Ｉｇが、特定の細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲｓ）に結合して、これらの細胞毒性エフェクター細胞が、抗原保有標的細胞に特異的に結合できるようにして、引き続いて細胞毒によって標的細胞を殺滅する、細胞毒性の形態を指す。標的細胞表面に対するＩｇＧ抗体は、細胞傷害性細胞を「武装」させ、このような殺滅に必須である。標的細胞の溶解は細胞外であり、直接的な細胞間接触が必要であり、補体は関与しない。抗体に加えて、抗原保有標的細胞と特異的に結合する能力を有する、Ｆｃ領域を含むその他のタンパク質、特にＦｃ融合タンパク質が、細胞媒介性の細胞毒性をもたらし得ることが検討される。簡潔さのために、Ｆｃ融合タンパク質の活性からもたらされる細胞媒介性の細胞毒性は、本明細書ではＡＤＣＣ活性とも称される。
「単離」ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物は、天然に見られない形態のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物である。単離ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞または組成物としては、もはや天然に見られる形態でない程度にまで精製されているものが挙げられる。いくつかの態様では、単離抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物は、実質的に純粋である。
「対象」という用語は、特定の治療の受容者であるヒト、非ヒト霊長類、齧歯類などをはじめとするが、これに限定されるものではない、任意の動物（例えば、哺乳類）を指す。典型的に、「対象」および「患者」という用語は、ヒト対象に関して同義的に使用され得る。
「医薬組成物」という用語は、活性成分（例えば、本明細書で開示されるコンジュゲート化合物）の生物学的活性が効果的であるようにする形態であり、組成物が投与される対象にとって許容できないほど有毒である追加的成分を含有しない製剤を指す。このような組成物は、１つまたは複数の薬学的に許容可能な賦形剤を含んでもよい。このような組成物は、滅菌され得る。
本明細書で開示されるようなコンジュゲート化合物の「有効量」は、具体的に記述される目的を遂げるのに十分な量である。「有効量」は、記述される目的との関連で、経験的かつ日常的様式で判定され得る。
「治療有効量」という用語は、対象または哺乳類において疾患または障害を「治療する」のに効果的である、本明細書で開示されるコンジュゲート化合物またはその他の薬物の量を指す。
「標識」という語は、本明細書で使用される場合、「標識」コンジュゲート化合物を生じるように、本明細書で開示されるシステイン操作抗体またはその断片に、直接または間接的にコンジュゲートされた、検出可能化合物または組成物を指す。標識は、単独で検出可能であり得て（例えば、放射性同位体標識または蛍光標識）、または酵素的標識の場合は、基質化合物または組成物の検出可能な化学変性を触媒し得る。
「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「治療する「（ｔｏ ｔｒｅａｔ）」などの用語は、（１）診断された病態または障害の症状を治癒、遅延、軽減し、および／または進行を食い止める治療手段、および（２）標的化される病的状態または障害の発症を予防しおよび／または遅延させる予防または防止手段の双方を指す。したがって、治療を必要とするものとしては、既に障害があるもの；障害を有しやすいもの；およびそれにおいて障害が予防されるものが挙げられる。特定の態様では、患者が、例えば、特定タイプのがんなどの疾患または病状の完全、部分的、または一過性の寛解を示せば、対象は、本開示の方法に従って、例えば、がんなどの疾患または病状について、成功裏に「治療される」。
「がん」、「腫瘍」、「がん性」、および「悪性」という用語は、典型的に、無制御の細胞増殖によって特徴付けられる、哺乳類における生理的状態を指し、または記述する。がんの例としては、腺がん、リンパ腫、芽球腫、メラノーマ、肉腫、および白血をはじめとするがんが挙げられるが、これに限定されるものではない。このようながんのより具体的な例としては、扁平細胞がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、胃腸がん、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫、膵臓がん、神経膠芽腫、神経膠腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がんなどの肝臓がんおよび肝細胞腫、膀胱がん、乳がん（ホルモン媒介性乳がんをはじめとする、例えば、Ｉｎｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ９４：１０５７−１０６５を参照されたい）、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、骨髄腫（多発性骨髄腫など）、唾液腺がん、腎臓がんおよびウィルムス腫瘍などの腎細胞がん、基底細胞がん、メラノーマ、前立腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、精巣がん、食道がん、様々なタイプの頭頸部がん、および粘液卵巣がんなどの粘液起源のがん、胆管細胞がん（肝臓）、および腎臓の乳頭がんが挙げられる。
本明細書の「自己免疫疾患」は、個体の自己組織または臓器から生じて、それらに向けられた、疾患または障害、またはその共分離または顕在化であり、またはそれから帰結する病状である。これらの自己免疫および炎症性疾患の多くでは、高ガンマグロブリン血症、高レベルの自己抗体、コルチコステロイドまたは免疫抑制治療から恩恵を被る組織内の抗原抗体複合体沈着、および罹患組織内のリンパ球様細胞凝集体をはじめとするが、これに限定されるものではない、いくつかの臨床用および実験室マーカーが存在してもよい。Ｂ細胞媒介性自己免疫疾患に関する任意の１つの理論に限定されることなく、Ｂ細胞は、自己抗体産生、免疫複合体形成、樹状細胞およびＴ細胞活性化、サイトカイン合成、直接ケモカイン放出をはじめとする多数の機構的経路を通じて、ヒト自己免疫疾患における病原性効果を示し、異所性リンパ球新生のための病巣を提供すると考えられる。これらの各経路は、自己免疫疾患の病理学に異なる度合いで関与し得る。自己免疫疾患は、臓器特異的疾患（すなわち、免疫応答は、内分泌系、造血系、皮膚、心肺系、胃腸および肝臓系、腎臓系、甲状腺、耳、筋神経系、中枢神経系などの臓器系に対して特異的に向けられる）または複数臓器系に影響を及ぼし得る全身性疾患（例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ、多発性筋炎など）であり得る。
本明細書で同義的に使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドまたは塩基、および／またはそれらの類似体、またはＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼによってポリマーに組み込まれ得る任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびそれらの類似体などの修飾ヌクレオチドを含み得る。先行する記述は、ＲＮＡおよびＤＮＡをはじめとする、本明細書で言及される全てのポリヌクレオチドにあてはまる。
「ベクター」という用語は、宿主細胞中内で、関心のある１つまたは複数の遺伝子または配列を送達する能力があり、いくつかの態様では発現する能力がある、コンストラクトを意味する。ベクターの例としては、ウイルスベクター、裸のＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミドまたはファージベクター、カチオン性縮合剤と結合したＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、リポソーム内にカプセル化されたＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、および産生細胞などの特定の真核細胞が挙げられるが、これに限定されるものではない。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書で同義的に使用されて、任意の長さのアミノ酸ポリマーを指す。ポリマーは、直鎖または分枝鎖であり得て、それは修飾されたアミノ酸を含み得て、それは非アミノ酸によって中断され得る。この用語はまた、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識成分とのコンジュゲーションなどの任意のその他の操作または修飾によって、天然にまたは介入によって修飾されているアミノ酸ポリマーも包含する。例えば、アミノ酸（例えば、非天然アミノ酸などをはじめとする）の１つまたは複数の類似体を含有するポリペプチド、ならびに当該技術分野で公知のその他の修飾もまた、定義に含まれる。本開示のポリペプチドは抗体に基づくので、特定の態様では、ポリペプチドは、単一鎖または結合鎖として存在し得るものと理解される。
「組換え」ポリペプチドまたはタンパク質は、組換えＤＮＡ技術を通じて生成される、ポリペプチドまたはタンパク質を指す。遺伝子操作宿主細胞で発現される組換え的に生成されたポリペプチドおよびタンパク質は、本開示の目的で単離されたと見なされ、任意の適切な技術によって分離され、分画され、または部分的にまたは実質的に精製された、天然または組換えポリペプチドについても同様である。本明細書で開示されるポリペプチドは、当該技術分野で公知の方法を使用して、組換え的に生成され得る。代案としては、本明細書で開示されるタンパク質およびペプチドは、化学的に合成され得る。
「アミノ酸置換」という用語は、親配列中に存在するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基で置換することを指す。アミノ酸は、例えば、化学的ペプチド合成を通じて、または当該技術分野で公知の組換え法を通じて、親配列中で置換され得る。したがって、「位置Ｘにおける置換」または「位置Ｘにおける置換」への言及は、位置Ｘに存在するアミノ酸の代案のアミノ酸残基による置換を指す。置換パターンはスキーマＡＸＹに従って記述され得て，その中で、Ａは、位置Ｘに天然に存在するアミノ酸に対応する一文字コードであり、Ａは置換アミノ酸残基である。したがって、Ｌ２３４Ｆは、位置２３４におけるロイシンアミノ酸（Ｌ）のフェニルアラニン（Ｆ）による置換を指す。
「アミノ酸挿入」という用語は、親配列中に存在する２つのアミノ酸残基の間に新規アミノ酸残基を導入することを指す。アミノ酸は、例えば、化学的ペプチド合成を通じて、または当該技術分野で公知の組換え法を通じて、親配列中に挿入され得る。したがって本明細書の用法では、ＸおよびＹがアミノ酸の位置に対応する「位置ＸおよびＹの間の挿入」（例えば、位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入）という語句は、位置ＸおよびＹの間へのアミノ酸挿入を指し、そしてまた、位置ＸおよびＹでアミノ酸をコードするコドンの間のアミノ酸をコードするコドンの核酸配列中への挿入も指す。挿入パターンは、スキーマＡＸ−ｉｎｓに従って記述され得て、その中で、Ａは挿入されるアミノ酸に対応する一文字コードであり、Ｘは挿入直前の位置である。したがって、Ｃ２３９ｉｎｓは、位置２３９の後のシステインアミノ酸（Ｃ）の挿入（すなわち、位置２３９および２４０間の挿入）を指す。Ｃ２３９ｉｎｓはまた、本明細書で、より短い略称「２３９ｉｎｓ」によって言及されることもある。
「操作システイン」または「位置．．．で操作されたシステイン」という用語、またはそれらの文法的変異型は、抗体または抗体の一部（例えば、Ｆｃドメインまたはその断片）に組み込まれて、チオール官能基（−ＳＨ）を有するシステイン（Ｃ）アミノ酸を指す。
ＩＩ．操作システインを含むコンジュゲート化合物
本開示は、システイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質と、少なくとも１つの異種部分とを含むコンジュゲート化合物を提供し、（ｉ）抗体またはＦｃ融合タンパク質のＦｃドメインは、アミノ酸位置の番号付与が、Ｋａｂａｔ（１９９１，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１−３２４２，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，ＶＡ）に記載のＥＵ指針に準拠する、アミノ酸位置２４１、２４３、２５１、２５３、２５８、２６４、２６９、２７１、２７２、２７４、２８０、２８１、２８５、２８８、２９１、２９３、２９４、２９６、３０１、３０７、３０９、３１１、３１８、３２９、３４０、３４１、３４５、３５７、３８５、３８６、３８７、４０１、４０２、４１１、４１７、４３３、４３５、または４３９におけるシステインアミノ酸置換、位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入、およびそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの操作システインアミノ酸を含み、（ｉｉ）少なくとも１つの異種部分は、操作システインの１つにコンジュゲートされる。
いくつかの態様では、操作システインアミノ酸は、アミノ酸位置２４１、２４３、２５１、２５３、２５８、２６４、２７１、２８５、２８８、２９１、２９６、３０１、３０７、３０９、３１１、３２９、３８５、３８７、４３３、または４３５におけるシステインアミノ酸置換、位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入、およびそれらの組み合わせから選択される。
その他の態様では、操作システインアミノ酸は、アミノ酸位置２５８、または４３５におけるシステインアミノ酸置換、位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入、およびそれらの組み合わせから選択される。
いくつかの態様では、本明細書で開示されるコンジュゲート化合物は、本明細書で開示される１つまたは複数の位置の少なくとも１つの操作システインアミノ酸（例えば、位置２４１、２４３、２５１、２５３、２５８、２６４、２６９、２７１、２７２、２７４、２８０、２８１、２８５、２８８、２９１、２９３、２９４、２９６、３０１、３０７、３０９、３１１、３１８、３２９、３４０、３４１、３４５、３５７、３８５、３８６、３８７、４０１、４０２、４１１、４１７、４３３、４３５、または４３９、あるいは位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入）を含み、任意選択的に、位置２３９、２４８、２５４、２７３、２７９、２８２、２８４、２８６、２８７、２８９、２９７、２９８、３１２、３２４、３２６、３３０、３３５、３３７、３３９、３５０、３５５、３５６、３５９、３６０、３６１、３７５、３８３、３８４、３８９、３９８、４００、４１３、４１５、４１８、４２２、４４０、４４１、４４２、４４３、および４４６をはじめとするが、これに限定されるものではない、当該技術分野で記載されるシステイン操作に適する追加的な位置における、追加的な操作システインを含む。
本明細書で開示されるシステイン操作に適する部位は、代表的抗体１Ｃ１上で同定された。これらの位置は、全ての抗体種を越えて良好に保存されているドメインである、抗体のＣＨ２およびＣＨ３ドメインにある。これらの部位は、特定の抗体構造の構造設計または知識をさらに要することなく、そして抗体の可変ドメインに固有の抗原結合特性に干渉することなく、その他の抗体に広く適用できるはずである。
いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、（ｉ）アミノ酸位置２４１の操作システインアミノ酸、および（ｉｉ）アミノ酸位置２４３、２５１、２５３、２５８、２６４、２６９、２７１、２７２、２７４、２８０、２８１、２８５、２８８、２９１、２９３、２９４、２９６、３０１、３０７、３０９、３１１、３１８、３２９、３４０、３４１、３４５、３５７、３８５、３８６、３８７、４０１、４０２、４１１、４１７、４３３、４３５、または４３９の第２の操作システインアミノ酸、あるいは位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入を含む。いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、アミノ酸位置２４３の操作システインアミノ酸、およびアミノ酸位置２４１、２５１、２５３、２５８、２６４、２６９、２７１、２７２、２７４、２８０、２８１、２８５、２８８、２９１、２９３、２９４、２９６、３０１、３０７、３０９、３１１、３１８、３２９、３４０、３４１、３４５、３５７、３８５、３８６、３８７、４０１、４０２、４１１、４１７、４３３、４３５、または４３９の第２の操作システインアミノ酸、あるいは位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入を含む。いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、（ｉ）アミノ酸位置２５１の操作システインアミノ酸、および（ｉｉ）アミノ酸位置２４１、２４３、２５３、２５８、２６４、２６９、２７１、２７２、２７４、２８０、２８１、２８５、２８８、２９１、２９３、２９４、２９６、３０１、３０７、３０９、３１１、３１８、３２９、３４０、３４１、３４５、３５７、３８５、３８６、３８７、４０１、４０２、４１１、４１７、４３３、４３５、または４３９の第２の操作システインアミノ酸、あるいは位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入を含む。いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、（ｉ）アミノ酸位置２５３の操作システインアミノ酸、および（ｉｉ）アミノ酸位置２４１、２４３、２５１、２５８、２６４、２６９、２７１、２７２、２７４、２８０、２８１、２８５、２８８、２９１、２９３、２９４、２９６、３０１、３０７、３０９、３１１、３１８、３２９、３４０、３４１、３４５、３５７、３８５、３８６、３８７、４０１、４０２、４１１、４１７、４３３、４３５、または４３９の第２の操作システインアミノ酸、あるいは位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入を含む。
いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、（ｉ）アミノ酸位置２５８の操作システインアミノ酸、および（ｉｉ）アミノ酸位置２４１、２４３、２５１、２５３、２６４、２６９、２７１、２７２、２７４、２８０、２８１、２８５、２８８、２９１、２９３、２９４、２９６、３０１、３０７、３０９、３１１、３１８、３２９、３４０、３４１、３４５、３５７、３８５、３８６、３８７、４０１、４０２、４１１、４１７、４３３、４３５、または４３９の第２の操作システインアミノ酸、あるいは位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入を含む。いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、（ｉ）アミノ酸位置２６４の操作システインアミノ酸、および（ｉｉ）アミノ酸位置２４１、２４３、２５１、２５３、２５８、２６９、２７１、２７２、２７４、２８０、２８１、２８５、２８８、２９１、２９３、２９４、２９６、３０１、３０７、３０９、３１１、３１８、３２９、３４０、３４１、３４５、３５７、３８５、３８６、３８７、４０１、４０２、４１１、４１７、４３３、４３５、または４３９の第２の操作システインアミノ酸、あるいは位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入を含む。
いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、（ｉ）アミノ酸位置２６９の操作システインアミノ酸、および（ｉｉ）アミノ酸位置２４１、２４３、２５１、２５３、２５８、２６４、２７１、２７２、２７４、２８０、２８１、２８５、２８８、２９１、２９３、２９４、２９６、３０１、３０７、３０９、３１１、３１８、３２９、３４０、３４１、３４５、３５７、３８５、３８６、３８７、４０１、４０２、４１１、４１７、４３３、４３５、または４３９の第２の操作システインアミノ酸、あるいは位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入を含む。
いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、（ｉ）アミノ酸位置２７１の操作システインアミノ酸、および（ｉｉ）アミノ酸位置２４１、２４３、２５１、２５３、２５８、２６４、２６９、２７２、２７４、２８０、２８１、２８５、２８８、２９１、２９３、２９４、２９６、３０１、３０７、３０９、３１１、３１８、３２９、３４０、３４１、３４５、３５７、３８５、３８６、３８７、４０１、４０２、４１１、４１７、４３３、４３５、または４３９の第２の操作システインアミノ酸、あるいは位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入を含む。いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、（ｉ）アミノ酸位置２７２の操作システインアミノ酸、および（ｉｉ）アミノ酸位置２４１、２４３、２５１、２５３、２５８、２６４、２６９、２７１、２７４、２８０、２８１、２８５、２８８、２９１、２９３、２９４、２９６、３０１、３０７、３０９、３１１、３１８、３２９、３４０、３４１、３４５、３５７、３８５、３８６、３８７、４０１、４０２、４１１、４１７、４３３、４３５、または４３９の第２の操作システインアミノ酸、あるいは位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入を含む。
いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、（ｉ）アミノ酸位置２７４の操作システインアミノ酸、および（ｉｉ）アミノ酸位置２４１、２４３、２５１、２５３、２５８、２６４、２６９、２７１、２７２、２８０、２８１、２８５、２８８、２９１、２９３、２９４、２９６、３０１、３０７、３０９、３１１、３１８、３２９、３４０、３４１、３４５、３５７、３８５、３８６、３８７、４０１、４０２、４１１、４１７、４３３、４３５、または４３９の第２の操作システインアミノ酸、あるいは位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入を含む。いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、（ｉ）アミノ酸位置２８０の操作システインアミノ酸、および（ｉｉ）アミノ酸位置２４１、２４３、２５１、２５３、２５８、２６４、２６９、２７１、２７２、２７４、２８１、２８５、２８８、２９１、２９３、２９４、２９６、３０１、３０７、３０９、３１１、３１８、３２９、３４０、３４１、３４５、３５７、３８５、３８６、３８７、４０１、４０２、４１１、４１７、４３３、４３５、または４３９の第２の操作システインアミノ酸、あるいは位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入を含む。
いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、（ｉ）アミノ酸位置２８１の操作システインアミノ酸、および（ｉｉ）アミノ酸位置２４１、２４３、２５１、２５３、２５８、２６４、２６９、２７１、２７２、２７４、２８０、２８５、２８８、２９１、２９３、２９４、２９６、３０１、３０７、３０９、３１１、３１８、３２９、３４０、３４１、３４５、３５７、３８５、３８６、３８７、４０１、４０２、４１１、４１７、４３３、４３５、または４３９の第２の操作システインアミノ酸、あるいは位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入を含む。
いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、（ｉ）アミノ酸位置２８５の操作システインアミノ酸、および（ｉｉ）アミノ酸位置２４１、２４３、２５１、２５３、２５８、２６４、２６９、２７１、２７２、２７４、２８０、２８１、２８８、２９１、２９３、２９４、２９６、３０１、３０７、３０９、３１１、３１８、３２９、３４０、３４１、３４５、３５７、３８５、３８６、３８７、４０１、４０２、４１１、４１７、４３３、４３５、または４３９の第２の操作システインアミノ酸、あるいは位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入を含む。いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、（ｉ）アミノ酸位置２８８の操作システインアミノ酸、および（ｉｉ）アミノ酸位置２４１、２４３、２５１、２５３、２５８、２６４、２６９、２７１、２７２、２７４、２８０、２８１、２８５、２９１、２９３、２９４、２９６、３０１、３０７、３０９、３１１、３１８、３２９、３４０、３４１、３４５、３５７、３８５、３８６、３８７、４０１、４０２、４１１、４１７、４３３、４３５、または４３９の第２の操作システインアミノ酸、あるいは位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入を含む。いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、（ｉ）アミノ酸位置２９１の操作システインアミノ酸、および（ｉｉ）アミノ酸位置２４１、２４３、２５１、２５３、２５８、２６４、２６９、２７１、２７２、２７４、２８０、２８１、２８５、２８８、２９３、２９４、２９６、３０１、３０７、３０９、３１１、３１８、３２９、３４０、３４１、３４５、３５７、３８５、３８６、３８７、４０１、４０２、４１１、４１７、４３３、４３５、または４３９の第２の操作システインアミノ酸、あるいは位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入を含む。
いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、（ｉ）アミノ酸位置２９３の操作システインアミノ酸、および（ｉｉ）アミノ酸位置２４１、２４３、２５１、２５３、２５８、２６４、２６９、２７１、２７２、２７４、２８０、２８１、２８５、２８８、２９１、２９４、２９６、３０１、３０７、３０９、３１１、３１８、３２９、３４０、３４１、３４５、３５７、３８５、３８６、３８７、４０１、４０２、４１１、４１７、４３３、４３５、または４３９の第２の操作システインアミノ酸、あるいは位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入を含む。いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、（ｉ）アミノ酸位置２９４の操作システインアミノ酸、および（ｉｉ）アミノ酸位置２４１、２４３、２５１、２５３、２５８、２６４、２６９、２７１、２７２、２７４、２８０、２８１、２８５、２８８、２９１、２９３、２９６、３０１、３０７、３０９、３１１、３１８、３２９、３４０、３４１、３４５、３５７、３８５、３８６、３８７、４０１、４０２、４１１、４１７、４３３、４３５、または４３９の第２の操作システインアミノ酸、あるいは位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入を含む。
いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、（ｉ）アミノ酸位置２９６の操作システインアミノ酸、および（ｉｉ）アミノ酸位置２４１、２４３、２５１、２５３、２５８、２６４、２６９、２７１、２７２、２７４、２８０、２８１、２８５、２８８、２９１、２９３、２９４、３０１、３０７、３０９、３１１、３１８、３２９、３４０、３４１、３４５、３５７、３８５、３８６、３８７、４０１、４０２、４１１、４１７、４３３、４３５、または４３９の第２の操作システインアミノ酸、あるいは位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入を含む。いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、（ｉ）アミノ酸位置３０１の操作システインアミノ酸、および（ｉｉ）アミノ酸位置２４１、２４３、２５１、２５３、２５８、２６４、２６９、２７１、２７２、２７４、２８０、２８１、２８５、２８８、２９１、２９３、２９４、２９６、３０７、３０９、３１１、３１８、３２９、３４０、３４１、３４５、３５７、３８５、３８６、３８７、４０１、４０２、４１１、４１７、４３３、４３５、または４３９の第２の操作システインアミノ、あるいは位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入を含む。
いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、（ｉ）アミノ酸位置３０７の操作システインアミノ酸、および（ｉｉ）アミノ酸位置２４１、２４３、２５１、２５３、２５８、２６４、２６９、２７１、２７２、２７４、２８０、２８１、２８５、２８８、２９１、２９３、２９４、２９６、３０１、３０９、３１１、３１８、３２９、３４０、３４１、３４５、３５７、３８５、３８６、３８７、４０１、４０２、４１１、４１７、４３３、４３５、または４３９の第２の操作システインアミノ酸、あるいは位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入を含む。いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、（ｉ）アミノ酸位置３０９の操作システインアミノ酸、および（ｉｉ）アミノ酸位置２４１、２４３、２５１、２５３、２５８、２６４、２６９、２７１、２７２、２７４、２８０、２８１、２８５、２８８、２９１、２９３、２９４、２９６、３０１、３０７、３１１、３１８、３２９、３４０、３４１、３４５、３５７、３８５、３８６、３８７、４０１、４０２、４１１、４１７、４３３、４３５、または４３９の第２の操作システインアミノ酸、あるいは位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入を含む。
いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、（ｉ）アミノ酸位置３１１の操作システインアミノ酸、および（ｉｉ）アミノ酸位置２４１、２４３、２５１、２５３、２５８、２６４、２６９、２７１、２７２、２７４、２８０、２８１、２８５、２８８、２９１、２９３、２９４、２９６、３０１、３０７、３０９、３１８、３２９、３４０、３４１、３４５、３５７、３８５、３８６、３８７、４０１、４０２、４１１、４１７、４３３、４３５、または４３９の第２の操作システインアミノ酸、あるいは位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入を含む。いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、（ｉ）アミノ酸位置３１８の操作システインアミノ酸、および（ｉｉ）アミノ酸位置２４１、２４３、２５１、２５３、２５８、２６４、２６９、２７１、２７２、２７４、２８０、２８１、２８５、２８８、２９１、２９３、２９４、２９６、３０１、３０７、３０９、３１１、３２９、３４０、３４１、３４５、３５７、３８５、３８６、３８７、４０１、４０２、４１１、４１７、４３３、４３５、または４３９の第２の操作システインアミノ酸、あるいは位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入を含む。
いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、（ｉ）アミノ酸位置３２９の操作システインアミノ酸、および（ｉｉ）アミノ酸位置２４１、２４３、２５１、２５３、２５８、２６４、２６９、２７１、２７２、２７４、２８０、２８１、２８５、２８８、２９１、２９３、２９４、２９６、３０１、３０７、３０９、３１１、３１８、３４０、３４１、３４５、３５７、３８５、３８６、３８７、４０１、４０２、４１１、４１７、４３３、４３５、または４３９の第２の操作システインアミノ、あるいは位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入酸を含む。いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、（ｉ）アミノ酸位置３４０の操作システインアミノ酸、および（ｉｉ）アミノ酸位置２４１、２４３、２５１、２５３、２５８、２６４、２６９、２７１、２７２、２７４、２８０、２８１、２８５、２８８、２９１、２９３、２９４、２９６、３０１、３０７、３０９、３１１、３１８、３２９、３４１、３４５、３５７、３８５、３８６、３８７、４０１、４０２、４１１、４１７、４３３、４３５、または４３９の第２の操作システインアミノ酸、あるいは位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入を含む。
いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、（ｉ）アミノ酸位置３４１の操作システインアミノ酸、および（ｉｉ）アミノ酸位置２４１、２４３、２５１、２５３、２５８、２６４、２６９、２７１、２７２、２７４、２８０、２８１、２８５、２８８、２９１、２９３、２９４、２９６、３０１、３０７、３０９、３１１、３１８、３２９、３４０、３４５、３５７、３８５、３８６、３８７、４０１、４０２、４１１、４１７、４３３、４３５、または４３９の第２の操作システインアミノ酸、あるいは位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入を含む。いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、（ｉ）アミノ酸位置３４５の操作システインアミノ酸、および（ｉｉ）アミノ酸位置２４１、２４３、２５１、２５３、２５８、２６４、２６９、２７１、２７２、２７４、２８０、２８１、２８５、２８８、２９１、２９３、２９４、２９６、３０１、３０７、３０９、３１１、３１８、３２９、３４０、３４１、３５７、３８５、３８６、３８７、４０１、４０２、４１１、４１７、４３３、４３５、または４３９の第２の操作システインアミノ酸、あるいは位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入を含む。
いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、（ｉ）アミノ酸位置３５７の操作システインアミノ酸、および（ｉｉ）アミノ酸位置２４１、２４３、２５１、２５３、２５８、２６４、２６９、２７１、２７２、２７４、２８０、２８１、２８５、２８８、２９１、２９３、２９４、２９６、３０１、３０７、３０９、３１１、３１８、３２９、３４０、３４１、３４５、３８５、３８６、３８７、４０１、４０２、４１１、４１７、４３３、４３５、または４３９の第２の操作システインアミノ酸、あるいは位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入を含む。いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、（ｉ）アミノ酸位置３８５の操作システインアミノ酸、および（ｉｉ）アミノ酸位置２４１、２４３、２５１、２５３、２５８、２６４、２６９、２７１、２７２、２７４、２８０、２８１、２８５、２８８、２９１、２９３、２９４、２９６、３０１、３０７、３０９、３１１、３１８、３２９、３４０、３４１、３４５、３５７、３８６、３８７、４０１、４０２、４１１、４１７、４３３、４３５、または４３９の第２の操作システインアミノ酸、あるいは位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入を含む。
いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、（ｉ）アミノ酸位置３８６の操作システインアミノ酸、および（ｉｉ）アミノ酸位置２４１、２４３、２５１、２５３、２５８、２６４、２６９、２７１、２７２、２７４、２８０、２８１、２８５、２８８、２９１、２９３、２９４、２９６、３０１、３０７、３０９、３１１、３１８、３２９、３４０、３４１、３４５、３５７、３８５、３８７、４０１、４０２、４１１、４１７、４３３、４３５、または４３９の第２の操作システインアミノ酸、あるいは位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入を含む。いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、（ｉ）アミノ酸位置３８７の操作システインアミノ酸、および（ｉｉ）アミノ酸位置２４１、２４３、２５１、２５３、２５８、２６４、２６９、２７１、２７２、２７４、２８０、２８１、２８５、２８８、２９１、２９３、２９４、２９６、３０１、３０７、３０９、３１１、３１８、３２９、３４０、３４１、３４５、３５７、３８５、３８６、４０１、４０２、４１１、４１７、４３３、４３５、または４３９の第２の操作システインアミノ酸、あるいは位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入を含む。
いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、（ｉ）アミノ酸位置４０１の操作システインアミノ酸、および（ｉｉ）アミノ酸位置２４１、２４３、２５１、２５３、２５８、２６４、２６９、２７１、２７２、２７４、２８０、２８１、２８５、２８８、２９１、２９３、２９４、２９６、３０１、３０７、３０９、３１１、３１８、３２９、３４０、３４１、３４５、３５７、３８５、３８６、３８７、４０２、４１１、４１７、４３３、４３５、または４３９の第２の操作システインアミノ酸、あるいは位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入を含む。いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、（ｉ）アミノ酸位置４０２の操作システインアミノ酸、および（ｉｉ）アミノ酸位置２４１、２４３、２５１、２５３、２５８、２６４、２６９、２７１、２７２、２７４、２８０、２８１、２８５、２８８、２９１、２９３、２９４、２９６、３０１、３０７、３０９、３１１、３１８、３２９、３４０、３４１、３４５、３５７、３８５、３８６、３８７、４０１、４１１、４１７、４３３、４３５、または４３９の第２の操作システインアミノ酸、あるいは位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入を含む。
いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、（ｉ）アミノ酸位置４１１の操作システインアミノ酸、および（ｉｉ）アミノ酸位置２４１、２４３、２５１、２５３、２５８、２６４、２６９、２７１、２７２、２７４、２８０、２８１、２８５、２８８、２９１、２９３、２９４、２９６、３０１、３０７、３０９、３１１、３１８、３２９、３４０、３４１、３４５、３５７、３８５、３８６、３８７、４０１、４０２、４１７、４３３、４３５、または４３９の第２の操作システインアミノ酸、あるいは位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入を含む。いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、（ｉ）アミノ酸位置４１７の操作システインアミノ酸、および（ｉｉ）アミノ酸位置２４１、２４３、２５１、２５３、２５８、２６４、２６９、２７１、２７２、２７４、２８０、２８１、２８５、２８８、２９１、２９３、２９４、２９６、３０１、３０７、３０９、３１１、３１８、３２９、３４０、３４１、３４５、３５７、３８５、３８６、３８７、４０１、４０２、４１１、４３３、４３５、または４３９の第２の操作システインアミノ酸、あるいは位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入を含む。
いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、（ｉ）アミノ酸位置４３３の操作システインアミノ酸、および（ｉｉ）アミノ酸位置２４１、２４３、２５１、２５３、２５８、２６４、２６９、２７１、２７２、２７４、２８０、２８１、２８５、２８８、２９１、２９３、２９４、２９６、３０１、３０７、３０９、３１１、３１８、３２９、３４０、３４１、３４５、３５７、３８５、３８６、３８７、４０１、４０２、４１１、４１７、４３５、または４３９の第２の操作システインアミノ酸、あるいは位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入を含む。いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、（ｉ）アミノ酸位置４３５の操作システインアミノ酸、および（ｉｉ）アミノ酸位置２４１、２４３、２５１、２５３、２５８、２６４、２６９、２７１、２７２、２７４、２８０、２８１、２８５、２８８、２９１、２９３、２９４、２９６、３０１、３０７、３０９、３１１、３１８、３２９、３４０、３４１、３４５、３５７、３８５、３８６、３８７、４０１、４０２、４１１、４１７、４３３、または４３９の第２の操作システインアミノ酸、あるいは位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入を含む。
いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、（ｉ）アミノ酸位置４３９の操作システインアミノ酸、および（ｉｉ）アミノ酸位置２４１、２４３、２５１、２５３、２５８、２６４、２６９、２７１、２７２、２７４、２８０、２８１、２８５、２８８、２９１、２９３、２９４、２９６、３０１、３０７、３０９、３１１、３１８、３２９、３４０、３４１、３４５、３５７、３８５、３８６、３８７、４０１、４０２、４１１、４１７、４３３、または４３５の第２の操作システインアミノ酸、あるいは位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入を含む。いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、（ｉ）位置２３９および２４０の間に挿入される操作システインアミノ酸、および（ｉｉ）アミノ酸位置２４１、２４３、２５１、２５３、２５８、２６４、２６９、２７１、２７２、２７４、２８０、２８１、２８５、２８８、２９１、２９３、２９４、２９６、３０１、３０７、３０９、３１１、３１８、３２９、３４０、３４１、３４５、３５７、３８５、３８６、３８７、４０１、４０２、４１１、４１７、４３３、４３５、または４３９の第２の操作システインアミノ酸を含む。
いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、ＦｃドメインのＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインで操作された少なくとも１つのシステインを含む。いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、
（ｉ）ＣＨ２ドメイン中の１つの操作システインアミノ酸、または
（ｉｉ）ＣＨ３ドメイン中の１つの操作システインアミノ酸、または
（ｉｉｉ）ＣＨ２ドメイン中の２つ以上の操作システインアミノ酸、または
（ｉｖ）ＣＨ３ドメイン中の２つ以上の操作システインアミノ酸、または
（ｖ）ＣＨ２ドメイン中の１つのシステインアミノ酸およびＣＨ３ドメイン中の１つの操作システインアミノ酸、または
（ｖｉ）ＣＨ２ドメイン中の１つの操作システインアミノ酸、およびＣＨ３ドメイン中の２つ以上の操作システインアミノ酸、または
（ｖｉｉ）ＣＨ２ドメイン中の２つ以上の操作システインアミノ酸、およびＣＨ３ドメイン中の１つの操作システインアミノ酸、または
（ｖｉｉｉ）ＣＨ２ドメイン中の２つ以上の操作システインアミノ酸、およびＣＨ３ドメイン中の２つ以上の操作システインアミノ酸
を含み、その中で、操作システインアミノ酸は、
（ｉ）アミノ酸位置２４１、２４３、２５１、２５３、２５８、２６４、２６９、２７１、２７２、２７４、２８０、２８１、２８５、２８８、２９１、２９３、２９４、２９６、３０１、３０７、３０９、３１１、３１８、３２９、３４０、３４１、３４５、３５７、３８５、３８６、３８７、４０１、４０２、４１１、４１７、４３３、４３５、または４３９におけるシステインアミノ酸置換、位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入；または
（ｉｉ）アミノ酸位置２４１、２４３、２５１、２５３、２５８、２６４、２７１、２８５、２８８、２９１、２９６、３０１、３０７、３０９、３１１、３２９、３８５、３８７、４３３、または４３５におけるアミノ酸置換、位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入；または
（ｉｉｉ）アミノ酸位置２５８、または４３５におけるアミノ酸置換、または位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入から選択される。
いくつかの態様では、このような２つ以上の操作システインアミノ酸は、２、３、４、または５つの操作システインアミノ酸である。いくつかの態様では、ＣＨ２ドメイン中の操作システインアミノ酸は、位置２４１、２４３、２５１、２５３、２５８、２６４、２６９、２７１、２７２、２７４、２８０、２８１、２８５、２８８、２９１、２９３、２９４、２９６、３０１、３０７、３０９、３１１、３１８、３２９、３４０にあり、または位置２３９および２４０の間に挿入される。いくつかの態様では、ＣＨ２ドメイン中の操作システインアミノ酸は、位置２４１、２４３、２５１、２５３、２５８、２６４、２７１、２８５、２８８、２９１、２９６、３０１、３０７、３０９、３１１、３２９にあり、または位置２３９および２４０の間に挿入される。いくつかの態様では、ＣＨ２ドメイン中の操作システインアミノ酸は、位置２５８にあり、または位置２３９および２４０の間に挿入される。いくつかの態様では、ＣＨ３ドメイン中の操作システインアミノ酸は、位置３４１、３４５、３５７、３８５、３８６、３８７、４０１、４０２、４１１、４１７、４３３、４３５、または４３９にある。いくつかの態様では、ＣＨ３ドメイン中の操作システインアミノ酸は、位置３８５、３８７、４３３、または４３５にある、いくつかの態様では、ＣＨ３ドメイン中の操作システインアミノ酸は、位置４３５にある。
いくつかの態様では、本明細書で開示されるコンジュゲート化合物は、Ｆ２４１Ｃ、Ｆ２４３Ｃ、Ｌ２５１Ｃ、Ｉ２５３Ｃ、Ｓ２５４Ｃ、Ｅ２５８Ｃ、Ｖ２６４Ｃ、Ｐ２７１Ｃ、Ｅ２７２Ｃ、Ｋ２７４Ｃ、Ｑ２７４Ｃ、Ｄ２８０Ｃ、Ｇ２８１Ｃ、Ｈ２８５Ｃ、Ｋ２８８Ｃ、Ｐ２９１Ｃ、Ｅ２９３Ｃ、Ｅ２９４Ｃ、Ｙ２９６Ｃ、Ｆ２９６Ｃ、Ｒ３０１Ｃ、Ｔ３０７Ｃ、Ｌ３０９Ｃ、Ｖ３０９Ｃ、Ｑ３１１Ｃ、Ｅ３１８Ｃ、Ｐ３２９Ｃ、Ｋ３４０Ｃ、Ｇ３４１Ｃ、Ｅ３４５Ｃ、Ｅ３５７Ｃ、Ｇ３８５Ｃ、Ｑ３８６Ｃ、Ｐ３８７Ｃ、Ｄ４０１Ｃ、Ｇ４０２Ｃ、Ｔ４１１Ｃ、Ｗ４１７Ｃ、Ｈ４３３Ｃ、Ｈ４３５Ｃ、Ｒ４３５Ｃ、Ｋ４３９Ｃ、Ｓ２３９およびＶ２４０の間のシステインアミノ酸挿入、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるシステインアミノ酸置換を含む。
いくつかの態様では、本明細書で開示されるコンジュゲート化合物は、Ｆ２４１Ｃ、Ｆ２４３Ｃ、Ｌ２５１Ｃ、Ｉ２５３Ｃ、Ｅ２５８Ｃ、Ｖ２６４Ｃ、Ｐ２７１Ｃ、Ｈ２８５Ｃ、Ｋ２８８Ｃ、Ｐ２９１Ｃ、Ｙ２９６Ｃ、Ｆ２９６Ｃ、Ｒ３０１Ｃ、Ｔ３０７Ｃ、Ｌ３０９Ｃ、Ｖ３０９Ｃ、Ｑ３１１Ｃ、Ｐ３２９Ｃ、Ｇ３８５Ｃ、Ｐ３８７Ｃ、Ｈ４３３Ｃ、Ｈ４３５Ｃからなる群から選択されるシステインアミノ酸置換、Ｓ２３９およびＶ２４０間のシステインアミノ挿入、およびそれらの組み合わせを含む。
いくつかの態様では、本明細書で開示されるコンジュゲート化合物は、Ｆ２４１Ｃ、Ｆ２４３Ｃ、Ｌ２５１Ｃ、Ｉ２５３Ｃ、Ｓ２５４Ｃ、Ｅ２５８Ｃ、Ｖ２６４Ｃ、Ｐ２７１Ｃ、Ｅ２７２Ｃ、Ｋ２７４Ｃ、Ｑ２７４Ｃ、Ｄ２８０Ｃ、Ｇ２８１Ｃ、Ｈ２８５Ｃ、Ｋ２８８Ｃ、Ｐ２９１Ｃ、Ｅ２９３Ｃ、Ｅ２９４Ｃ、Ｙ２９６Ｃ、Ｒ３０１Ｃ、Ｔ３０７Ｃ、Ｌ３０９Ｃ、Ｖ３０９Ｃ、Ｑ３１１Ｃ、Ｅ３１８Ｃ、Ｐ３２９Ｃ、Ｋ３４０Ｃのアミノ酸置換、Ｓ２３９およびＶ２４０の間のシステインアミノ酸挿入、およびそれらの組み合わせから選択される、ＣＨ２ドメイン中の少なくとも１つの操作システインを含むＦｃドメインを含む。
いくつかの態様では、本明細書で開示されるコンジュゲート化合物は、Ｇ３４１Ｃ、Ｅ３４５Ｃ、Ｅ３５７Ｃ、Ｇ３８５Ｃ、Ｑ３８６Ｃ、Ｐ３８７Ｃ、Ｄ４０１Ｃ、Ｇ４０２Ｃ、Ｔ４１１Ｃ、Ｗ４１７Ｃ、Ｈ４３３Ｃ、Ｈ４３５Ｃ、Ｒ４３５Ｃ、Ｋ４３９Ｃ、およびそれらの組み合わせのアミノ酸置換から選択される、ＣＨ３ドメイン中の少なくとも１つの操作システインを含むＦｃドメインを含む。
いくつかの態様では、本明細書で開示されるコンジュゲート化合物は、Ｆ２４１Ｃ、Ｆ２４３Ｃ、Ｌ２５１Ｃ、Ｉ２５３Ｃ、Ｅ２５８Ｃ、Ｖ２６４Ｃ、Ｐ２７１Ｃ、Ｈ２８５Ｃ、Ｋ２８８Ｃ、Ｐ２９１Ｃ、Ｙ２９６Ｃ、Ｒ３０１Ｃ、Ｔ３０７Ｃ、Ｌ３０９Ｃ、Ｑ３１１Ｃ、Ｐ３２９Ｃのアミノ酸置換、Ｓ２３９およびＶ２４０間のシステインアミノ挿入、およびそれらの組み合わせから選択される、ＣＨ２ドメイン中の少なくとも１つの操作システインを含むＦｃドメインを含む。いくつかの態様では、本明細書で開示されるコンジュゲート化合物は、Ｇ３８５Ｃ、Ｐ３８７Ｃ、Ｈ４３３Ｃ、Ｈ４３５Ｃ、およびそれらの組み合わせのアミノ酸置換から選択される、ＣＨ３ドメイン中の少なくとも１つの操作システインを含むＦｃドメインを含む。
特定の態様では、本明細書で開示されるコンジュゲート化合物は、
（ａ）位置２３９に位置するセリン（Ｓ）と位置２４０に位置するバリン（ｖ）との間に挿入される、システイン（Ｃ）；
（ｂ）位置２５８に位置するグルタミン酸（Ｅ）を置換する、システイン（Ｃ）；
（ｃ）位置４３５に位置するヒスチジン（Ｈ）を置換するシステイン（Ｃ）；
（ｄ）位置４３５に位置するアルギニン（Ｒ）を置換するシステイン（Ｃ）；または
（ｅ）それらの組み合わせを含むＦｃドメイン
を含み、アミノ酸位置の番号付与はＫａｂａｔに記載のＥＵ指針に準拠する。
当業者は、対立遺伝子変異型の存在のために、本明細書で開示されるＥＵ位置中の異なるアミノ酸が、システインで置換され得ることを理解するであろう。例えば、このような親抗体がＩｇＧ３である場合、いくつかの態様では、システイン（Ｃ）は、親抗体またはその断片中の位置４３５にあるアルギニン（Ｒ）を置換し得る。
いくつかの態様では、本明細書で開示されるコンジュゲート化合物は、位置２４１、２４３、２５１、２５３、２５８、２６４、２７１、２８５、２８８、２９１、２９６、３０１、３０７、３０９、３１１、３２９、３８５、３８７、４３３、または４３５における挿入、または位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入からなる群から選択される１つの操作システインを含み、アミノ酸位置の番号付与はＫａｂａｔに記載のＥＵ指針に準拠する。いくつかの態様では、本明細書で開示されるコンジュゲート化合物は、位置２５８、４３５における挿入、または位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入からなる群から選択される１つの操作システインを含み、アミノ酸位置の番号付与はＫａｂａｔに記載のＥＵ指針に準拠する。
いくつかの態様では、本明細書で開示されるコンジュゲート化合物は、位置２４１、２４３、２５１、２５３、２５８、２６４、２７１、２８５、２８８、２９１、２９６、３０１、３０７、３０９、３１１、３２９、３８５、３８７、４３３、または４３５における挿入、または位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入からなる群から選択される２つの操作システインを含み、アミノ酸位置の番号付与はＫａｂａｔに記載のＥＵ指針に準拠する。いくつかの態様では、本明細書で開示されるコンジュゲート化合物は、位置２５８、４３５における挿入、または位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入からなる群から選択される２つの操作システインを含み、アミノ酸位置の番号付与はＫａｂａｔに記載のＥＵ指針に準拠する。
いくつかの態様では、本明細書で開示されるコンジュゲート化合物は、位置２４１、２４３、２５１、２５３、２５８、２６４、２７１、２８５、２８８、２９１、２９６、３０１、３０７、３０９、３１１、３２９、３８５、３８７、４３３、または４３５における挿入、または位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入からなる群から選択される３つの操作システインを含み、アミノ酸位置の番号付与はＫａｂａｔに記載のＥＵ指針に準拠する。いくつかの態様では、本明細書で開示されるコンジュゲート化合物は、位置２５８、４３５における挿入、または位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入からなる群から選択される３つの操作システインを含み、アミノ酸位置の番号付与はＫａｂａｔに記載のＥＵ指針に準拠する。
いくつかの態様では、本明細書で開示されるコンジュゲート化合物は、位置２４１、２４３、２５１、２５３、２５８、２６４、２７１、２８５、２８８、２９１、２９６、３０１、３０７、３０９、３１１、３２９、３８５、３８７、４３３、または４３５における挿入、または位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入からなる群から選択される４つの操作システインを含み、アミノ酸位置の番号付与はＫａｂａｔに記載のＥＵ指針に準拠する。いくつかの態様では、本明細書で開示されるコンジュゲート化合物は、位置２５８、４３５における挿入、または位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入からなる群から選択される４つの操作システインを含み、アミノ酸位置の番号付与はＫａｂａｔに記載のＥＵ指針に準拠する。
いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、位置２５８の１つの操作システインと、位置４３５で操作された第２のシステインとを含む。いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、位置２５８の１つの操作システインと、位置４４２で操作された第２のシステインとを含む。いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、位置４３５の１つの操作システインと、位置４４２で操作された第２のシステインとを含む。いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、位置２５８の１つの操作システインと、位置２３９および２４０の間で操作された第２のシステインとを含む。いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、位置４３５の１つの操作システインと、位置２３９および２４０の間で操作された第２のシステインとを含む。いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、位置４４２の１つの操作システインと、位置２３９および２４０の間で操作された第２のシステインとを含む。いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、位置２５８、４３５、および４４２の３つの操作システインを含む。その他の態様では、コンジュゲート化合物は、位置２５８、４３５の２つの操作システインと、位置２３９および２４０の間で操作された第３のシステインとを含む。その他の態様では、コンジュゲート化合物は、位置２５８および４４２の２つの操作システインと、位置２３９および２４０の間で操作された第３のシステインとを含む。その他の態様では、コンジュゲート化合物は、位置４３５および４４２の２つの操作システインと、位置２３９および２４０の間で操作された第３のシステインとを含む。いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、位置２５８、４３５、および４４２の３つの操作システインと、位置２３９および２４０の間で操作された第４のシステインとを含む。
いくつかの特定の態様では、コンジュゲート化合物は、
（ｉ）親抗体の位置２５８におけるシステインアミノ酸置換、および親抗体の位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入；
（ｉｉ）親抗体の位置２８９におけるシステインアミノ酸置換、および親抗体の位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入；
（ｉｉｉ）親抗体の位置３３９におけるシステインアミノ酸置換、および親抗体の位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入；
（ｉｖ）親抗体の位置４３５におけるシステインアミノ酸置換、および親抗体の位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入；
（ｖ）親抗体の位置４４２におけるシステインアミノ酸置換、および親抗体の位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入；
（ｖｉ）親抗体の位置２５８の第１のシステインアミノ酸置換、および親抗体の位置２８９の第２のシステインアミノ酸置換；
（ｖｉｉ）親抗体の位置２５８の第１のシステインアミノ酸置換、および親抗体の位置３３９の第２のシステインアミノ酸置換；
（ｖｉｉｉ）親抗体の位置２５８の第１のシステインアミノ酸置換、および親抗体の位置４３５の第２のシステインアミノ酸置換；
（ｉｘ）親抗体の位置２５８の第１のシステインアミノ酸置換、および親抗体の位置４４２の第２のシステインアミノ酸置換；
（ｘ）親抗体の位置４３５の第１のシステインアミノ酸置換、および親抗体の位置２８９の第２のシステインアミノ酸置換；
（ｘｉ）親抗体の位置４３５の第１のシステインアミノ酸置換、および親抗体の位置３３９の第２のシステインアミノ酸置換；
（ｘｉｉ）親抗体の位置４３５の第１のシステインアミノ酸置換、および親抗体の位置４４２の第２のシステインアミノ酸置換；
（ｘｉｉｉ）親抗体の位置２５８および２８９におけるシステインアミノ酸置換、および親抗体の位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入；
（ｘｉｖ）親抗体の位置２５８および３３９におけるシステインアミノ酸置換、および親抗体の位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入；
（ｘｖ）親抗体の位置２５８および４３５におけるシステインアミノ酸置換、および親抗体の位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入；
（ｘｖｉ）親抗体の位置２５８および４４２におけるシステインアミノ酸置換、および親抗体の位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入；
（ｘｖｉｉ）親抗体の位置２８９および３３９におけるシステインアミノ酸置換、および親抗体の位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入；
（ｘｖｉｉｉ）親抗体の位置３３９および４３５におけるシステインアミノ酸置換、および親抗体の位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入；および
（ｘｉｘ）親抗体の位置４３５および４４２におけるシステインアミノ酸置換、および親抗体の位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入
から選択される、二つ組または三つ組の操作システインを含む、システイン操作抗体を含み、アミノ酸位置の番号付与はＫａｂａｔに記載のＥＵ指針に準拠する。
当業者は、いくつかの態様では、Ｆｃ領域を構成する分子のホモ二量体の性質のために、特定の位置で単一システイン残基を操作することで、結果として得られる抗体またはＦｃ融合タンパク質中において、このような位置に２つのシステイン残基の提示が頻繁にもたらされることを理解するであろう。いくつかの態様では、コンジュゲート化合物のＦｃ領域は、変異によって、ヘテロ二量体化（例えば、キメラ変異、相補的変異、ドック・アンド・ロック（ｌｏｃｋ ａｎｄ ｄｏｃｋ）変異、ノブ・イントゥ・ホール変異、鎖交換操作ドメイン（ＳＥＥＤ）変異など）を促進および／または維持し；半減期を変化させる（例えば、ＦｃＲｎ結合を促進する）ために、示差的に操作されてもよい。したがって、コンジュゲート化合物は、例えば、Ｆｃ領域またはその断片中の本明細書で開示される特定の位置で操作された１つのシステイン（例えば、位置２５８のシステイン）と、第２のＦｃ領域または断片中の本明細書で開示される異なる位置で操作された１つのシステイン（例えば、位置４３５で操作されたシステイン）とを含む、ヘテロ二量体を形成するように操作され得る。これはまた、Ｆｃ領域が、本明細書で開示される特定の位置で操作された２、３または４つのシステインを含む態様にも適用できる。同様に、どちらのＦｃ領域も、本明細書で開示される特定の位置に、異なる数の操作システインを含み得て、例えば、１つのＦｃ領域が、１、２、３または４つの操作システインを含み得る一方で、第２のＦｃ領域は、本明細書で開示される特定の位置で操作された操作システインを含まず、または１、２、３または４つのシステインを含み得る。
本明細書で開示される操作システインは、多様な異種性分子による誘導体化のために使用され得るチオール基を導入する（例えば、診断試薬を作成するため、抗体薬物コンジュゲートを作成するため、親抗体の生物学的利用能を改善し得る部分を付加するため、または異なる抗原結合部分を付加して例えば二重特異性抗体を作成するために）。したがって、上で開示されるＥＵ位置で１つまたは複数のシステインを操作することは、１つまたは複数の異種性分子が全ての導入されたチオール基を占有する化合物、またはその中で１つまたは複数のチオール基が追加的なコンジュゲーションのために使用できるコンジュゲート化合物をもたらし得る。したがって、いくつかの態様では（ｉｓ ｓｏｍｅ ａｓｐｅｃｔｓ）、コンジュゲート化合物は、異種性分子とのコンジュゲーションの目的で、少なくとも少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、１３、少なくとも１４、少なくとも１５、または少なくとも１６個のチオール基を含む。いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、異種性分子とのコンジュゲーションの目的で、１６個を超えるチオール基を含む。
いくつかの態様では、１、２、３、または４個のシステインアミノ酸が、図１および２に示されるＥＵ位置で操作される。いくつかの態様では、その他のシステインが、当該技術分野で記載されるシステイン操作に適する追加的なＥＵ位置で操作され得る。いくつかの態様では、その他のアミノ酸は、当該技術分野で開示される追加的なＥＵ位置で修飾され得る。したがって、いくつかの態様では、本明細書で開示されるコンジュゲート化合物は、アミノ酸位置２３９、２４８、２５４、２７３、２７９、２８２、２８６、２８７、２８９、２９７、２９８、３１２、３２４、３２６、３３０、３３５、３３７、３３９、３５０、３５５、３５６、３５９、３６０、３６１、３７５、３８３、３８４、３８９、３９８、４００、４１３、４１５、４１８、４２２、４４０、４４１、４４２、４４３、および４４６におけるシステインアミノ酸置換から選択される、少なくとも１つの操作システイン残基をさらに含む。
ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインを含むあらゆる形態の抗体またはその断片が、本明細書で開示されるように操作され得て、すなわち、それは変異され得る。例えば、親Ｆｃ抗体断片は、システイン操作Ｆｃ断片を形成するように操作され得る。同様に、親モノクローナル抗体は、本明細書で開示されるように、システイン操作され得る。本明細書で開示される設計、選択、および調製方法、そして当該技術分野で公知の方法は、本明細書で開示されるＥＵ位置でシステインが操作されている抗体の作成を可能にし、さらに薬物分子が指定され設計された選択的部位にある、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）化合物などのコンジュゲート化合物を可能にする。操作システイン残基は、例えば、マレイミドまたはハロアセチルなどのチオール反応基を介して、薬物成分などの異種部分が特異的に結合できるようにする。
したがって、本開示は、システイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質の少なくとも１つの操作システイン基を異種部分と反応させるステップとを含む、コンジュゲート化合物を作成する方法を提供し、抗体またはＦｃ融合タンパク質のＦｃドメインは、アミノ酸位置２４１、２４３、２５１、２５３、２５８、２６４、２６９、２７１、２７２、２７４、２８０、２８１、２８５、２８８、２９１、２９３、２９４、２９６、３０１、３０７、３０９、３１１、３１８、３２９、３４０、３４１、３４５、３５７、３８５、３８６、３８７、４０１、４０２、４１１、４１７、４３３、４３５、または４３９におけるシステインアミノ酸置換、位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入およびそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの操作システインアミノ酸を含み、アミノ酸位置の番号付与はＫａｂａｔに記載のＥＵ指針に準拠する。いくつかの態様では、操作システインアミノ酸は、アミノ酸位置２４１、２４３、２５１、２５３、２５８、２６４、２７１、２８５、２８８、２９１、２９６、３０１、３０７、３０９、３１１、３２９、３８５、３８７、４３３、または４３５におけるシステインアミノ酸置換、位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入、およびそれらの組み合わせから選択される。その他の態様では、操作システインアミノ酸は、アミノ酸位置２５８、または４３５におけるシステインアミノ酸置換位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入、およびそれらの組み合わせから選択される。
いくつかの態様では、アミノ酸位置の番号付与がＫａｂａｔに記載のＥＵ指針に準拠する、２４１、２４３、２５１、２５３、２５８、２６４、２６９、２７１、２７２、２７４、２８０、２８１、２８５、２８８、２９１、２９３、２９４、２９６、３０１、３０７、３０９、３１１、３１８、３２９、３４０、３４１、３４５、３５７、３８５、３８６、３８７、４０１、４０２、４１１、４１７、４３３、４３５、４３９から選択されるアミノ酸位置の操作システイン、および位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入のコンジュゲーション効率は、アミノ酸位置の番号付与がＫａｂａｔに記載のＥＵ指針に準拠する、アミノ酸位置２８９にシステインアミノ酸置換を有する異種部分に、同等のシステイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質の操作システイン基を反応させて得られる値の少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％である。
いくつかの態様では、コンジュゲーション効率は、アミノ酸位置の番号付与がＫａｂａｔに記載のＥＵ指針に準拠する、アミノ酸位置２８９にシステインアミノ酸置換を有する異種部分に、同等のシステイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質の操作システイン基を反応させて得られる値の少なくとも５０％である。いくつかの態様では、コンジュゲーション効率は、アミノ酸位置の番号付与がＫａｂａｔに記載のＥＵ指針に準拠する、アミノ酸位置２８９にシステインアミノ酸置換を有する異種部分に、同等のシステイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質の操作システイン基を反応させて得られる値の少なくとも８０％である。その他の態様では、コンジュゲーション効率は、アミノ酸位置の番号付与がＫａｂａｔに記載のＥＵ指針に準拠する、アミノ酸位置２８９にシステインアミノ酸置換を有する異種部分に、同等のシステイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質の操作システイン基を反応させて得られる値の１００％を上回る。
特定の態様では、本明細書で開示されるコンジュゲート化合物は、以下の一般的工程に従って、作成され得る：
（ｉ）例えば、（ａ）アミノ酸位置の番号付与がＫａｂａｔに記載のＥＵ指針に準拠する、アミノ酸位置２４１、２４３、２５１、２５３、２５８、２６４、２６９、２７１、２７２、２７４、２８０、２８１、２８５、２８８、２９１、２９３、２９４、２９６、３０１、３０７、３０９、３１１、３１８、３２９、３４０、３４１、３４５、３５７、３８５、３８６、３８７、４０１、４０２、４１１、４１７、４３３、４３５、または４３９の少なくとも１つのコドンをシステイン（Ｃ）アミノ酸をコードするコドンによって置換し、またはアミノ酸位置２３９および２４０をコードするコドンの間にシステイン（Ｃ）をコードするコドンを挿入し、または
（ｂ）アミノ酸位置の番号付与がＫａｂａｔに記載のＥＵ指針に準拠する、アミノ酸位置２４１、２４３、２５１、２５３、２５８、２６４、２７１、２８５、２８８、２９１、２９６、３０１、３０７、３０９、３１１、３２９、３８５、３８７、４３３、または４３５の少なくとも１つのコドンをシステイン（Ｃ）アミノ酸をコードするコドンによって置換し、またはアミノ酸位置２３９および２４０をコードするコドンの間にシステイン（Ｃ）をコードするコドンを挿入し、または
（ｃ）アミノ酸位置の番号付与がＫａｂａｔに記載のＥＵ指針に準拠する、アミノ酸位置２５８、または４３５の少なくとも１つのコドンをシステイン（Ｃ）アミノ酸をコードするコドンによって置換し、またはアミノ酸位置２３９および２４０をコードするコドンの間にシステイン（Ｃ）をコードするコドンを挿入することによって、部位特異的変異誘発によって、抗体またはＦｃ融合タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列を変異誘発し、
（ｉｉ）システイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質を発現させ；
（ｉｉｉ）システイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質を単離し；
（ｉｖ）システイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質の少なくとも１つの操作システイン基を異種部分と反応させる。
特定の態様では、本明細書で開示されるコンジュゲート化合物は、以下の一般的工程に従って、作成され得る：
（ｉ）（ａ）アミノ酸位置の番号付与がＫａｂａｔに記載のＥＵ指針に準拠する、アミノ酸位置２４１、２４３、２５１、２５３、２５８、２６４、２６９、２７１、２７２、２７４、２８０、２８１、２８５、２８８、２９１、２９３、２９４、２９６、３０１、３０７、３０９、３１１、３１８、３２９、３４０、３４１、３４５、３５７、３８５、３８６、３８７、４０１、４０２、４１１、４１７、４３３、４３５、または４３９のシステインをコードし、または位置２３９および２４０のアミノ酸をコードするコドンの間に挿入される、少なくとも１つのコドンまたは
（ｂ）アミノ酸位置の番号付与がＫａｂａｔに記載のＥＵ指針に準拠する、アミノ酸位置２４１、２４３、２５１、２５３、２５８、２６４、２７１、２８５、２８８、２９１、２９６、３０１、３０７、３０９、３１１、３２９、３８５、３８７、４３３、または４３５のシステインをコードし、または位置２３９および２４０のアミノ酸をコードするコドンの間に挿入される、少なくとも１つのコドンまたは
（ｃ）アミノ酸位置の番号付与がＫａｂａｔに記載のＥＵ指針に準拠する、アミノ酸位置２５８、または４３５でシステインをコードし、または位置２３９および２４０のアミノ酸をコードするコドンの間に挿入される、少なくとも１つのコドン
を含むＦｃ領域タンパク質をコードする核酸配列に、可変重鎖領域または異種性タンパク質をコードする核酸配列を作動可能に連結させる、
（ｉｉ）システイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質を発現させる；
（ｉｉｉ）システイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質を単離する；および
（ｉｖ）システイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質の少なくとも１つの操作システイン基を異種部分と反応させる。
いくつかの態様では、アミノ酸位置の番号付与がＫａｂａｔに記載のＥＵ指針に準拠する、２４１、２４３、２５１、２５３、２５８、２６４、２６９、２７１、２７２、２７４、２８０、２８１、２８５、２８８、２９１、２９３、２９４、２９６、３０１、３０７、３０９、３１１、３１８、３２９、３４０、３４１、３４５、３５７、３８５、３８６、３８７、４０１、４０２、４１１、４１７、４３３、４３５、４３９から選択されるアミノ酸位置の操作システインおよび位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入に化学的に結合した異種部分の約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、または約９５％は、３日間の血清培養後に、損傷を受けない。いくつかの態様では、化学的に結合した異種部分の少なくとも７０％は、３日間の血清培養後に損傷を受けない。いくつかの態様では、化学的に結合した異種部分の約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、または約９５％は、７日間の血清培養後に損傷を受けない。別の態様では、化学的に結合した異種部分の少なくとも７０％は、７日間の血清培養後に損傷を受けない。
いくつかの態様では、アミノ酸位置の番号付与がＫａｂａｔに記載のＥＵ指針に準拠する、２５８、４３５から選択されるアミノ酸位置の操作システイン、および位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入に化学的に結合した異種部分の約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、または約９５％は、３日間の血清培養後に、損傷を受けない。いくつかの態様では、化学的に結合した異種部分の少なくとも７０％は、３日間の血清培養後に損傷を受けない。いくつかの態様では、化学的に結合した異種部分の約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、または約９５％は、７日間の血清培養後に損傷を受けない。別の態様では、化学的に結合した異種部分の少なくとも７０％は、７日間の血清培養後に損傷を受けない。
いくつかの態様では、アミノ酸位置の番号付与がＫａｂａｔに記載のＥＵ指針に準拠する、２４１、２４３、２５１、２５３、２５８、２６４、２６９、２７１、２７２、２７４、２８０、２８１、２８５、２８８、２９１、２９３、２９４、２９６、３０１、３０７、３０９、３１１、３１８、３２９、３４０、３４１、３４５、３５７、３８５、３８６、３８７、４０１、４０２、４１１、４１７、４３３、４３５、４３９から選択されるアミノ酸位置の操作システインおよび位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入に化学的に結合した異種部分を含むコンジュゲート化合物は、血清と共に培養された場合、３日間で約５％、約１０％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、または約５０％未満の活性喪失を示す。いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、血清と共に培養された場合、７日間で５％、約１０％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、または約５０％未満の活性喪失を示す。その他の態様では、コンジュゲート化合物は、血清と共に培養された場合、７日間で約５０％未満の活性喪失を示す。
いくつかの態様では、アミノ酸位置の番号付与がＫａｂａｔに記載のＥＵ指針に準拠する、２５８、４３５から選択されるアミノ酸位置の操作システインおよび位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入に化学的に結合した異種部分を含むコンジュゲート化合物は、血清と共に培養された場合、３日間で約５％、約１０％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、または約５０％未満の活性喪失を示す。いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、血清と共に培養された場合、７日間で５％、約１０％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、または約５０％未満の活性喪失を示す。その他の態様では、コンジュゲート化合物は、血清と共に培養された場合、７日間で約５０％未満の活性喪失を示す。
いくつかの態様では、本明細書で開示されるコンジュゲート化合物は、操作システインと化学的に結合した少なくとも１つの異種部分を含む。その他の態様では、コンジュゲート化合物は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つの異種部分を含み、その中では、少なくとも１つの異種部分が操作システインにコンジュゲートされる。その他の態様では、コンジュゲート化合物は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つの異種部分を含み、その中では、それぞれの異種部分が操作システインにコンジュゲートされる。いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、少なくとも６、８、１０、１２、１４、１６個以上の異種部分を含み、その中では少なくとも１つの異種部分が操作システインにコンジュゲートされる。いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、少なくとも６、８、１０、１２、１４、１６個以上の異種部分を含み、その中ではそれぞれの異種部分が操作システインにコンジュゲートされる。特定の態様では、全ての異種部分が同一である。その他の態様では、少なくとも１つの異種部分は残りと異なる。
いくつかの態様では、システイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質のＦｃドメインは、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、多特異性抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、またはヒト化抗体の一部である。
いくつかの態様では、システイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質のＦｃドメインは、ＩｇＧＦｃドメインまたはその断片である。いくつかの態様では、このようなＩｇＧＦｃドメインまたはその断片はヒトである。いくつかの態様では、ＩｇＧは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプまたはその断片である。いくつかの態様では、システイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質のＦｃドメインは、完全長ＣＨ２を含まない。その他の態様では、システイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質のＦｃドメインは、完全長ＣＨ３ドメインおよび／または完全長ＣＨ４ドメインを含まない。いくつかの態様では、Ｆｃ融合タンパク質は、標的との結合を媒介するポリペプチドを含む。例えば、Ｆｃ融合タンパク質は、（ａ）ｓｃＦｖ；（ｂ）二特異性抗体；（ｃ）Ｆｄ断片；（ｄ）Ｆｖ断片；（ｅ）ＴＡＮＤＡＢ（登録商標）；（ｆ）Ｆ（ａｂ’）2断片；（ｇ）ＦＣＡＢ（商標）、および（ｈ）Ｆ（ａｂ）断片からなる群から選択される抗原結合領域を含み得る。
いくつかの態様では、システイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｄ、一本鎖ＦｖまたはｓｃＦｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、Ｖ−ＮＡＲドメイン、ＩｇＮａｒ、細胞内抗体、ＩｇＧΔＣＨ２、小型抗体、Ｆ（ａｂ’）3、四特異性抗体、三特異性抗体、二特異性抗体、単一ドメイン抗体、ＤＶＤ−Ｉｇ、Ｆｃａｂ、ｍＡｂ2、（ｓｃＦｖ）2、またはｓｃＦｖ−Ｆｃを含み得る。
いくつかの態様では、Ｆｃ融合タンパク質は、タンパク質スキャフォールド（例えば、テネイシンまたはフィブロネクチン由来スキャフォールド）または抗体模倣剤を含む。その他の態様では、Ｆｃ融合タンパク質は、（ａ）リガンド、（ｂ）酵素、（ｃ）の受容体リガンド結合部分、および（ｄ）接着タンパク質からなる群から選択されるポリペプチドを含む。
その他の態様では、システイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質のＦｃドメインは、変異Ｆｃドメインである。Ｆｃドメインの多数の変異が、文献に記載されている。例えば、Ｆｃドメイン変異は、その内容全体が全て参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１２／０６４７３３号パンフレット、国際公開第２０１３／０９３８０９号パンフレット、国際公開第２００８／０７０５９３号パンフレット、および国際公開第１９９６／０１４３３９号パンフレット；米国特許公開第２００７／０２６９３６９号明細書、米国特許公開第２００７／０１１１２６０号明細書、および米国特許公開第２０１０／０２９７１０３号明細書；および米国特許第７，８５５，２７５号明細書に記載される。いくつかの態様では、システイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質のＦｃドメインは、２３４Ｄ、２３４Ｅ、２３４Ｎ、２３４Ｑ、２３４Ｔ、２３４Ｈ、２３４Ｙ、２３４１、２３４Ｖ、２３４Ｆ、２３５Ａ、２３５Ｄ、２３５Ｒ、２３５Ｗ、２３５Ｐ、２３５Ｓ、２３５Ｎ、２３５Ｑ、２３５Ｔ、２３５Ｈ、２３５Ｙ、２３５Ｉ、２３５Ｖ、２３５Ｆ、２３６Ｅ、２３９Ａ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、２３９Ｎ、２３９Ｑ、２３９Ｆ、２３９Ｔ、２３９Ｈ、２３９Ｙ、２４０１、２４０Ａ、２４０Ｔ、２４０Ｍ、２４１Ｗ、２４１Ｌ、２４１Ｙ、２４１Ｅ、２４１Ｒ、２４３Ｗ、２４３Ｌ、２４３Ｙ、２４３Ｒ、２４３Ｑ、２４４Ｈ、２４５Ａ、２４７Ｌ、２４７Ｖ、２４７Ｇ、２５１Ｆ、２５２Ｙ、２５４Ｔ、２５５Ｌ、２５６Ｅ、２５６Ｍ、２６２１、２６２Ａ、２６２Ｔ、２６２Ｅ、２６３１、２６３Ａ、２６３Ｔ、２６３Ｍ、２６４Ｌ、２６４１、２６４Ｗ、２６４Ｔ、２６４Ｒ、２６４Ｆ、２６４Ｍ、２６４Ｙ、２６４Ｅ、２６５Ｇ、２６５Ｎ、２６５Ｑ、２６５Ｙ、２６５Ｆ、２６５Ｖ、２６５１、２６５Ｌ、２６５Ｈ、２６５Ｔ、２６６１、２６６Ａ、２６６Ｔ、２６６Ｍ、２６７Ｑ、２６７Ｌ、２６９Ｙ、２６９Ｆ、２６９Ｒ、２７０Ｅ、２８０Ａ、２８４Ｍ、２９２Ｐ、２９２Ｌ、２９６Ｅ、２９６Ｑ、２９６Ｄ、２９６Ｎ、２９６Ｓ、２９６Ｔ、２９６Ｌ、２９６１、２９６Ｈ、２６９Ｇ、２９７Ｓ、２９７Ｄ、２９７Ｅ、２９８Ｈ、２９８１、２９８Ｔ、２９８Ｆ、２９９１、２９９Ｌ、２９９Ａ、２９９Ｓ、２９９Ｖ、２９９Ｈ、２９９Ｆ、２９９Ｅ、３０５１、３１３Ｆ、３１６Ｄ、３２５Ｑ、３２５Ｌ、３２５１、３２５Ｄ、３２５Ｅ、３２５Ａ、３２５Ｔ、３２５Ｖ、３２５Ｈ、３２７Ｇ、３２７Ｗ、３２７Ｎ、３２７Ｌ、３２８Ｓ、３２８Ｍ、３２８Ｄ、３２８Ｅ、３２８Ｎ、３２８Ｑ、３２８Ｆ、３２８１、３２８Ｖ、３２８Ｔ、３２８Ｈ、３２８Ａ、３２９Ｆ、３２９Ｈ、３２９Ｑ、３３０Ｋ、３３０Ｇ、３３０Ｔ、３３０Ｃ、３３０Ｌ、３３０Ｙ、３３０Ｖ、３３０１、３３０Ｆ、３３０Ｒ、３３０Ｈ、３３１Ｇ、３３１Ａ、３３１Ｌ、３３１Ｍ、３３１Ｆ、３３１Ｗ、３３１Ｋ、３３１Ｑ、３３１Ｅ、３３１Ｓ、３３１Ｖ、３３１１、３３１Ｃ、３３１Ｙ、３３１Ｈ、３３１Ｒ、３３１Ｎ、３３１Ｄ、３３１Ｔ、３３２Ｄ、３３２Ｓ、３３２Ｗ、３３２Ｆ、３３２Ｅ、３３２Ｎ、３３２Ｑ、３３２Ｔ、３３２Ｈ、３３２Ｙ、３３２Ａ、３３９Ｔ、３７０Ｅ、３７０Ｎ、３７８Ｄ、３９２Ｔ、３９６Ｌ、４１６Ｇ、４１９Ｈ、４２１Ｋ、４４０Ｙ、および４４３Ｗからなる群から選択される、少なくとも１つの非天然アミノ酸残基を含み、アミノ酸位置の番号付与はＫａｂａｔに記載のＥＵ指針に準拠する。
いくつかの態様では、システイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質のＦｃドメインは、Ｆｃ受容体との結合低下を有して、例えば、ＡＤＣＣを通じた細胞毒性を低下させる。いくつかの態様では、システイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質のＦｃドメインは、Ｆｃ受容体との結合増大を有して、例えば、ＡＤＣＣを通じた細胞毒性を増大させる。
特定の修飾は、所望のエフェクター機能または血清半減期を提供し得る。副作用または治療合併症を最小化するように、エフェクター機能を排除または低下させることが望ましい場合、特定のその他のＦｃ領域が使用され得る。抗体およびＦｃ融合タンパク質のＦｃ領域は、ＦｃＲｎとの結合親和性が増大し、ひいては血清半減期が増大するように修飾され得る。したがって、いくつかの態様では、システイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質のＦｃドメインは、Ｆｃ受容体ＦｃＲｎとの結合低下を有する。
いくつかの態様では、システイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質のＦｃドメインは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵ指針に従って番号付与される、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４、２４５，２４７、２５１、２５２、２５４、２５５、２５６、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６９、２７９、２８０、２８４、２９２、２９６、２９７、２９８、２９９、３０５、３１３、３１６、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３９、３４１、３４３、３７０、３７３、３７８、３９２、４１６、４１９、４２１、４４０、および４４３からなる群から選択される１つまたは複数の位置に、非天然起源ＡＤＣＣ還元性アミノ酸残基を含む。抗体のＡＤＣＣ活性を低下させる能力がある多数の特定の変異が、当該技術分野で公知であり、例えば２３４Ｆ、２３５Ｅ、２３５Ｆ、２３５Ｑ（または２３５Ｙ）、２３９Ａ、３３２Ｑ、３３１Ｓ、およびそれらの組み合わせが挙げられる。例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第８８０７０８９号パンフレット、国際公開第９９５８５７２号パンフレット、国際公開第９９５１６４２、国際公開第２０１２１７５７５１号パンフレット号パンフレット、国際公開第２０１１１４９９９９号パンフレット、国際公開第２０１１０６６５０１号パンフレット、国際公開第２００００４２０７２号パンフレット、国際公開第２０１１１２０１３４号パンフレットに記載される変異を参照されたい。ＡＤＣＣエフェクター機能が低下された抗体としてはまた、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、および３２９の１つまたは複数に置換があるものも挙げられる（米国特許第６，７３７，０５６号明細書）。このようなＦｃ変異体としてはまた、残基２６５および２９７のアラニンによる置換があるＦｃ変異体をはじめとする、２６５、２６９、２７０、２９７、および３２７の２つ以上のアミノ酸位置に置換があるＦｃ変異体も挙げられる（米国特許第７，３３２，５８１号明細書）。任意選択的に、ＡＤＣＣおよびＣＤＣの双方を低下させる変異が組み込まれてもよい。
（ａ）異種部分
本明細書で開示されるシステイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質は、反応性システインチオール基を介してシステイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質に共有結合的に付着され得る任意の異種部分に、コンジュゲートされ得る。代表的態様では、コンジュゲート化合物は、システイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質および異種部分を含み、その中で異種部分は、操作システインの１つまたは複数を介して、システイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質に付着する。いくつかの態様では、異種部分とシステイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質との間に、１つまたは複数のリンカーが挿入される。したがって、本開示のコンジュゲートされた化合物は、式、ＣＥＰ−（Ｌ−Ｈ）ｐ（式中、ＣＥＰはシステイン操作タンパク質（すなわち、抗体またはＦｃ融合タンパク質）であり、Ｌはリンカーであり、Ｈは異種部分であり、ｐは１、２、３、または４である）で表わされ得る。操作システインのチオール基を通じて、システイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質にコンジュゲートされ得る異種部分の数は、本明細書で開示されるようにして導入されたシステイン残基数によって制限される。したがって、先の式は、その中でシステイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質が、１、２、３、または４つの操作システインアミノ酸を含む、コンジュゲート化合物に言及する。
いくつかの態様では、本明細書で開示されるコンジュゲート化合物は、操作システインの１つにコンジュゲートされた少なくとも１つの異種部分を含み、その中で、このような異種部分は、毒素、薬物、放射性核種、免疫修飾物質、サイトカイン、リンフォカイン、ケモカイン、増殖因子、腫瘍壊死因子、ホルモン、ホルモン拮抗薬、酵素、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、マイクロＲＮＡ、ペプチド核酸、光活性治療薬、血管新生阻害剤、アポトーシス促進剤、非天然アミノ酸、ペプチド、脂質、炭水化物、足場分子、蛍光性タグ、可視化ペプチド、ビオチン、血清半減期延長剤、捕捉タグ、キレート化剤、固体担体、またはそれらの組み合わせである。本明細書で開示される操作システインは、反応性システインチオール基と共有結合し得る、任意の異種部分にコンジュゲートされ得る（Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０４：１４７−１５；Ｈａｒｌｏｗ Ｅ．ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｄ．（１９９９）Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｌｕｎｄｂｌａｄ Ｒ．Ｌ．（１９９１）Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，２ｎｄ ｅｄ．ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．）。
いくつかの態様では、本明細書で開示されるコンジュゲート化合物は、操作システインの１つにコンジュゲートされた少なくとも１つの異種部分を含み、その中で、このような異種部分は薬物である。いくつかの態様では、薬物は、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、アルキルスルホン酸塩、ニトロソ尿素、ゲムシタビン、トリアゼン、葉酸アナログ、アントラサイクリン、タキサン、ＣＯＸ−２インヒビター、ピリミジンアナログ、プリンアナログ、抗生物質、酵素インヒビター、エピポドフィロトキシン、白金配位錯体、ビンカアルカロイド、置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、ホルモン拮抗薬、エンドスタチン、タキソール、カンプトテシン、ＳＮ−３８、ドキソルビシン、ドキソルビシンアナログ、代謝拮抗薬、アルキル化剤、有糸***阻害剤、血管新生阻害剤、チロシンキナーゼインヒビター、ｍＴＯＲインヒビター、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ９０）インヒビター、生体沈殿インヒビター、ＨＤＡＣインヒビター、アポトーシス促進剤、メトトレキサート、ＣＰＴ−１１、またはそれらの組み合わせであり、その中で、コンジュゲーションは、操作システインの１つにある。特定の態様では、薬物は、アミホスチン、シスプラチン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、メクロレタミン、ストレプトゾシン、シクロホスファミド、カルムスチン（ｃａｒｒｎｕｓｔｉｎｅ）、ロムスチン、ドキソルビシンｌｉｐｏ、ゲムシタビン、ダウノルビシン、ダウノルビシンリポ、プロカルバジン、マイトマイシン、シタラビン、エトポシド、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、パクリタキセル、ドセタキセル、アルデスロイキン、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クラドリビン、１０−ヒドロキシ−７−エチル−カンプトテシン（ＳＮ３８）、ゲフィチニブ、ダカルバジン、フロクスウリジン、フルダラビン、ヒドロキシ尿素、イホスファミド、イダルビシン、メスナ、インターフェロンα、インターフェロンβ、イリノテカン、ミトキサントロン、トポテカン、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、プリカマイシン、ミトタン、ペグアスパラガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロランブシルアロマターゼ阻害剤、およびそれらの組み合わせである。
いくつかの態様では、薬物は、例えば、ＭＭＡＥ（モノメチルオーリスタチンＥ）またはＭＭＡＦ（モノメチルオーリスタチンＦ）などのオーリスタチン（米国特許第５，６３５，４８３号明細書；米国特許第５，７８０，５８８号明細書）である。その他の態様では、薬物は、ドラスタチンまたはドラスタチンペプチド性アナログまたは誘導体である。ドラスタチンおよびオーリスタチンは、微小管動態、ＧＴＰ加水分解、および核および細胞***を妨げることが示されており（Ｗｏｙｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４５：３５８０−３５８４（２００１））、抗がん活性を有する（米国特許第５，６６３，１４９号明細書）。ドラスタチンまたはオーリスタチン薬物成分は、ペプチド性薬物成分のＮ（アミノ）末端またはＣ（カルボキシル）末端を介して、コンジュゲート化合物に付着され得る（例えば、国際公開第２００２０８８１７２号パンフレットを参照されたい）。
その他の態様では、薬物は、メイタンシノイドである。いくつかの態様では、メイタンシノイドは、Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシン（ＤＭ１）、Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（４−メルカプト−１−オキソペンチル）−メイタンシン（ＤＭ３）またはＮ２’−デアセチル−Ｎ２’（４−メチル−４−メルカプト−１−オキソペンチル）−メイタンシン（ＤＭ４）である。メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害することで機能する、有糸***阻害剤である。メイタンシンは、最初に、東アフリカの灌木メイテナス・セラタ（Ｍａｙｔｅｎｕｓ ｓｅｒｒａｔａ）から単離された（米国特許第３，８９６，１１１号明細書）。引き続いて、特定の微生物もまた、マイタンシノールおよびＣ−３マイタンシノールエステルなどのマイタンシノイドを産生することが発見された（米国特許第４，１５１，０４２号明細書）。合成マイタンシノールおよび誘導体およびそれらの類似体は、例えば、米国特許第４，１３７，２３０号明細書；米国特許第４，２４８，８７０号明細書；米国特許第４，２５６，７４６号明細書；米国特許第４，２６０，６０８号明細書；米国特許第４，２６５，８１４号明細書；米国特許第４，２９４，７５７号明細書；米国特許第４，３０７，０１６号明細書；米国特許第４，３０８，２６８号明細書；米国特許第４，３０８，２６９号明細書；米国特許第４，３０９，４２８号明細書；米国特許第４，３１３，９４６号明細書；米国特許第４，３１５，９２９号明細書；米国特許第４，３１７，８２１号明細書；米国特許第４，３２２，３４８号明細書；米国特許第４，３３１，５９８号明細書；米国特許第４，３６１，６５０号明細書；米国特許第４，３６４，８６６号明細書；米国特許第４，４２４，２１９号明細書；米国特許第４，４５０，２５４号明細書；米国特許第４，３６２，６６３号明細書；および米国特許第４，３７１，５３３号明細書で開示される。
メイタンシノイド薬物成分は、（ｉ）発酵または化学修飾、発酵産物の誘導体化によって調製するために比較的アクセスしやすく、（ｉｉ）非ジスルフィドリンカーを介した抗体とのコンジュゲーションに適する官能基による誘導体化を適用でき、（ｉｉｉ）漿中で安定しており、（ｉｖ）多様な腫瘍細胞株に対して効果的であることから、抗体薬物コンジュゲート中の魅力的な薬物成分である。マイタンシノイドを含有するコンジュゲート、該物質を作成する方法、およびそれらの治療的使用は、例えば、米国特許第５，２０８，０２０号明細書、米国特許第５，４１６，０６４号明細書、および欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号明細書；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：８６１８−８６２３（１９９６）（ＤＭ１と称されるメイタンシノイドを含む免疫複合体が記載される）；およびＣｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２：１２７−１３１（１９９２）で開示される。
メイタンシノイドコンジュゲート化合物は、抗体またはメイタンシノイド分子のどちらの生物学的活性も顕著に低減させることなく、抗体をメイタンシノイド分子と化学的に結合させることで、調製され得る。例えば、米国特許第５，２０８，０２０号明細書を参照されたい。抗体分子あたり平均で３〜４つのコンジュゲートされたメイタンシノイド分子は、抗体の機能または溶解度に負の影響を及ぼすことなく、標的細胞の細胞毒性の増強において有効性を示したが、毒素／抗体の１つの分子でさえも、裸の抗体の使用よりも細胞毒性を増強することが予測される。メイタンシノイドは、当該技術分野で周知であり、既知の技術によって合成され、または天然原料から単離され得る。適切なメイタンシノイドは、例えば、米国特許第５，２０８，０２０号明細書で開示される。代表的メイタンシノイド薬物成分としては、アンサミトシン（ａｎｓａｍｙｔｏｃｉｎ）Ｐ２の水素化アルミニウムリチウム還元によって調製される、Ｃ−１９−デクロロ（米国特許第４，２５６，７４６号明細書））；（ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）またはアクチノミセス属（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）を使用して脱メチル化によって、またはＬＡＨを使用して脱塩素によって調製される）Ｃ−２０−ヒドロキシ（またはＣ−２０−デメチル）＋／−Ｃ−１９−デクロロ（米国特許第４，３６１，６５０号明細書および米国特許第４，３０７，０１６号明細書）；および（塩化アシルを利用してアシル化によって調製される）Ｃ−２０−デメトキシ、Ｃ−２０−アシルオキシ（−ＯＣＯＲ）、＋／−デクロロ（米国特許第４，２９４，７５７号明細書）、およびその他の位置に修飾を有するものなどの修飾芳香族環を有するものが挙げられる。代表的メイタンシノイド薬物成分としてはまた、Ｃ−９−ＳＨ（米国特許第４，４２４，２１９号明細書）（マイタンシノールのＨ２ＳまたはＰ２Ｓ５との反応によって調製される）；Ｃ−１４−アルコキシメチル（デメトキシ／ＣＨ２ＯＲ）（米国特許第４，３３１，５９８号明細書）；Ｃ−１４−ヒドロキシメチルまたはアシルオキシメチル（ＣＨ２ＯＨまたはＣＨ２ＯＡｃ）（米国特許第４，４５０，２５４号明細書）（ノカルジア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）から調製される）；Ｃ−１５−ヒドロキシ／アシルオキシ（米国特許第４，３６４，８６６号明細書）（ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）によるマイタンシノールの変換によって調製される）；Ｃ−１５−メトキシ（米国特許第４，３１３，９４６号明細書および米国特許第４，３１５，９２９号明細書）（トレウィア・ヌディフロラ（Ｔｒｅｗｉａ ｎｕｄｉｆｌｏｒａ）（Ｔｒｅｗｉａ ｎｕｄｌｆｌｏｒａ）から単離される）；Ｃ−１８−Ｎ−デメチル（米国特許第４，３６２，６６３号明細書および米国特許第４，３２２，３４８号明細書）（ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）によるマイタンシノールの脱メチル化によって調製される）；および４，５−デオキシ（米国特許第４，３７１，５３３号明細書）（マイタンシノールの三塩化チタン／ＬＡＨ還元によって調製される）などの修飾を有するものも挙げられる。メイタンシン化合物上の多数の位置は、結合タイプ次第で、結合位置として有用なことが知られている。例えば、エステル結合を形成するために、ヒドロキシル基を有するＣ−３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ−１４位、ヒドロキシル基で修飾されたＣ−１５位、およびヒドロキシル基を有するＣ−２０位は、全て適切である。
いくつかの態様では、薬物は、カリケアマイシンである。抗生物質のカリケアマイシンファミリーは、ピコモル濃度未満で二本鎖ＤＮＡ切断を生成できる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、例えば、米国特許第５，７１２，３７４号明細書、米国特許第５，７１４，５８６号明細書、米国特許第５，７３９，１１６号明細書、米国特許第５，７６７，２８５号明細書、米国特許第５，７７０，７０１号明細書、米国特許第５，７７０，７１０号明細書、米国特許第５，７７３，００１号明細書、米国特許第５，８７７，２９６号明細書を参照されたい。使用され得るカリケアマイシンの構造的アナログとしては、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ−アセチル−γ１Ｉ、ＰＳＡＧ、およびθ１１が挙げられるが、これに限定されるものではない（Ｈｉｎｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５３：３３３６−３３４２（１９９３），Ｌｏｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５８：２９２５−２９２８（１９９８）ａｎｄ ｔｈｅ ａｆｏｒｅｍｅｎｔｉｏｎｅｄ Ｕ．Ｓ．ｐａｔｅｎｔｓ ｔｏ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｙａｎａｍｉｄ）。
いくつかの態様では、薬物はツブリシンである。ツブリシンは、粘液細菌生物種から単離される天然物のクラスのメンバーである（Ｓａｓｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．５３：８７９−８８５（２０００））。細胞骨格相互作用物質として、ツブリシンは、チューブリン重合を阻害し、細胞周期停止およびアポトーシスを引き起こす、有糸***毒である（Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４３：４８８８−４８９２（２００４）；Ｋｈａｌｉｌ ｅｔ ａｌ．，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ．７：６７８−６８３（２００６）；Ｋａｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３９６：２３５−２４２（２００６））。ツブリシンは、極めて強力な細胞毒性分子であり、例えば、エポチロン、パクリタキセル、およびビンブラスチンなどの任意の臨床的に妥当な従来の化学療法薬の細胞増殖阻害に優る。さらに、それらは、多剤耐性細胞株に対する効力がある（Ｄｏｍｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ９：１４１−１４７（２００５））。これらの化合物は、がん細胞株のパネルに対して試験されると、ＩＣ50値が低いピコモル濃度範囲内にある、高い細胞毒性を示し；したがって、それらは、抗がん治療薬として注目される。例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１２０１９１２３号パンフレット参照されたい。ツブリシンコンジュゲートは、例えば、米国特許第７，７７６，８１４号明細書で開示される。
いくつかの態様では、薬物は、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）である。ＰＢＤは比較的小型の分子であり、いくつかは、ＤＮＡ副溝内の特異的配列を認識する能力を有して、それと共有結合し、したがって抗生物質／抗腫瘍活性を示す。例えば、ＰＢＤ二量体（例えば、ＳＪＧ−１３６またはＳＧ２０００）、Ｃ２不飽和ＰＢＤ二量体、Ｃ２アリール置換を有するピロロベンゾジアゼピン二量体（例えば、ＳＧ２２８５）、加水分解によって活性化されるＰＢＤ二量体プロドラッグ（例えば、ＳＧ２２８５）、およびポリピロール−ＰＢＤ（例えば、ＳＧ２２７４）などのいくつかのＰＢＤおよびそれらの誘導体が、当該技術分野で公知である。ＰＢＤは、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０００／０１２５０７号パンフレット、国際公開第２００７／０３９７５２号パンフレット、国際公開第２００５／１１０４２３号パンフレット、国際公開第２００５／０８５２５１号パンフレット、および国際公開第２００５／０４０１７０号パンフレット、および米国特許第７，６１２，０６２号明細書で詳述される。
いくつかの態様では、本明細書で開示されるコンジュゲート化合物は、操作システインの１つにコンジュゲートされた少なくとも１つの異種部分を含み、その中で、このような異種部分は毒素である。いくつかの態様では、毒素は、例えば、アブリン、ブルシン、シクトキシン、ジフテリア毒素、ボツリヌス毒素、志賀毒素、内毒素、破傷風毒素、百日咳毒素、炭疽病毒素、コレラ毒素、ファルカリノール、α毒素、ゲルダナマイシン、ゲロニン、ロタウストラリン、リシン、ストリキニーネ、テトロドトキシン、サポニン、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、ＤＮａｓｅ Ｉ、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）菌体外毒素、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）内毒素、またはそれらの組み合わせを含む。その他の態様では、毒素は、例えば、モデシンＡ鎖、α−サルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）インヒビター、クルシン、クロチン、サボンソウ（Ｓａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）インヒビター、ミトギリン、レストリクトシン、フェノマイシン、ネオマイシン、トリコテシン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅｓ）、またはそれらの組み合わせを含む。例えば、国際公開第１９９３／０２１２３２号パンフレットを参照されたい。
いくつかの態様では、本明細書で開示されるコンジュゲート化合物は、操作システインの１つにコンジュゲートされた少なくとも１つの異種部分を含み、その中で、このような異種部分はキレート化剤である。いくつかの態様では、キレート化剤は、例えば、ＤＴＰＡ、ＥＣ、ＤＭＳＡ、ＥＤＴＡ、Ｃｙ−ＥＤＴＡ、ＥＤＴＭＰ、ＤＴＰＡ、ＣｙＤＴＰＡ、Ｃｙ２ＤＴＰＡ、ＢＯＰＴＡ、ＤＴＰＡ−ＭＡ、ＤＴＰＡ−ＢＡ、ＤＴＰＭＰ、ＤＯＴＡ、ＴＲＩＴＡ、ＴＥＴＡ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＴＡ−ＭＡ、ＨＰ−ＤＯ３Ａ、ｐＮＢ−ＤＯＴＡ、ＤＯＴＰ、ＤＯＴＭＰ、ＤＯＴＥＰ、ＤＯＴＰＰ、ＤＯＴＢｚＰ、ＤＯＴＰＭＥ、ＨＥＤＰ、ＤＴＴＰ、ａｎＮ３Ｓトリアミドチオール、ＤＡＤＳ、ＭＡＭＡ、ＤＡＤＴ、Ｎ２Ｓ４ジアミンテトラチオール、Ｎ２Ｐ２ジチオール−ビスホスフィン、６−ヒドラジノニコチン酸、プロピレンアミンオキシム、テトラアミン、サイクラム、またはそれらの組み合わせである。
いくつかの態様では、本明細書で開示されるコンジュゲート化合物は、操作システインの１つにコンジュゲートされた少なくとも１つの異種部分を含み、その中で、このような異種部分は放射性核種である。いくつかの態様では、放射性核種は、例えば、クロム（51Ｃｒ）、コバルト（57Ｃｏ）、フッ素（18Ｆ）、ガドリニウム（153Ｇｄ、159Ｇｄ）、ゲルマニウム（68Ｇｅ）、ホルミウム（166Ｈｏ）、インジウム（115Ｉｎ、113Ｉｎ、112Ｉｎ、111Ｉｎ）、ヨウ素（131Ｉ、125Ｉ、123Ｉ、121Ｉ）、ｌａｎｔｈａｎｕｍ（140Ｌａ）、ルテチウム（177Ｌｕ）、マンガン（54Ｍｎ）、モリブデン（99Ｍｏ）、パラジウム（103Ｐｄ）、亜リン酸（32Ｐ）、プラセオジム（142Ｐｒ）、プロメチウム（149Ｐｍ）、レニウム（186Ｒｅ、188Ｒｅ）、ロジウム（105Ｒｈ）、ルテニウム（97Ｒｕ）、サマリウム（153Ｓｍ）、スカンジウム（47Ｓｃ）、セレン（75Ｓｅ）、ストロンチウム（85Ｓｒ）、イオウ（35Ｓ）、テクネチウム（99Ｔｃ）、タリウム（201Ｔｌ）、スズ（113Ｓｎ、117Ｓｎ）、トリチウム（3Ｈ）、キセノン（133Ｘｅ）、イッテルビウム（169Ｙｂ、175Ｙｂ）、イットリウム（90Ｙ）、亜鉛（65Ｚｎ）、またはそれらの組み合わせである。いくつかの特定の態様では、放射性核種は、キレート化剤によってコンジュゲート化合物に付着する。
いくつかの態様では、本明細書で開示されるコンジュゲート化合物は、操作システインの１つにコンジュゲートされた少なくとも１つの異種部分を含み、その中で、このような異種部分は血清半減期延長剤である。いくつかの特定の態様では、血清半減期延長剤は、例えば、アルブミン、アルブミン結合ポリペプチド、ＰＡＳ、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）のβサブユニット、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ＸＴＥＮ、アルブミン結合小分子、またはそれらの組み合わせを含む。
いくつかの態様では、本明細書で開示されるコンジュゲート化合物は、操作システインの１つにコンジュゲートされた少なくとも１つの異種部分を含み、その中で、このような異種部分は可視化標識である。可視化標識としては、制限なしに、発色団、フルオロフォア、蛍光タンパク質、リン光性染料、タンデム染料、粒子、ハプテン、酵素、放射性同位体、またはそれらの組み合わせが挙げられる。
いくつかの態様では、可視化標識は、可視化ペプチドである。いくつかの態様では、可視化ペプチドは、試験管内、生体内、生体外、またはそれらの任意の組み合わせで、コンジュゲート化合物の可視化または位置確認を可能にする。いくつかの態様では、可視化ペプチドは、ビオチン受容体ペプチド、リポ酸受容体ペプチド、蛍光タンパク質、二ヒ素染料のライゲーションのためのまたは準安定テクネチウムをコンジュゲーションさせるためのシステイン含有ペプチド、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）ベースの近接アッセイのためにユウロピウムクラスレートをコンジュゲーションさせるためのペプチド、またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの態様では、蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、強化黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、またはそれらの任意の組み合わせ赤色である。いくつかの態様では、蛍光タンパク質は、フィコビリンタンパク質またはその誘導体である。蛍光タンパク質、特にフィコビリンタンパク質は、タンデム染料で標識された標識試薬を作成するのに有用である。これらのタンデム色素は、より大きなストークスシフトを得る目的で、蛍光タンパク質およびフルオロフォアを含み、発光スペクトルは、蛍光タンパク質の吸収スペクトルの波長からさらに移行する。これは、その中で放出蛍光が最大限に最適化されている、換言すれば、わずかから皆無の蛍光タンパク質が、放射光によって再吸収される、サンプル中で、少量の標的を検出するのに効果的であり得る。これが機能するためには、蛍光タンパク質およびフルオロフォアがエネルギー転移ペアとして機能し、蛍光タンパク質はフルオロフォアが吸収する波長で発光し、次にフルオロフォアは蛍光タンパク質のみで得られ得るよりも遠く離れた波長で発光する。機能的組み合わせは、技術分野で公知のようなフィコビリンタンパク質およびスルホローダミンフルオロフォア、またはスルホン化シアニンフルオロフォアであり得る。フルオロフォアがエネルギー供与体として、蛍光タンパク質がエネルギー受容体して、機能することもある。
その他の態様では、二ヒ素染料は、４’，５’−ビス（１，３，２−ジチオアルソラン−２−イル）フルオレセイン（フラッシュ）である。いくつかの態様では、ビオチン受容体ペプチドは、アビジンベースおよびストレプトアビジンベースの試薬のコンジュゲーションを促進する。いくつかの態様では、リポ酸受容体ペプチドは、チオール反応性プローブのコンジュゲーションを促進してリポ酸を結合させ、または蛍光性リポ酸類似体のライゲーションを誘導する。
いくつかの態様では、本明細書で開示されるコンジュゲート化合物は、操作システインの１つにコンジュゲートされた少なくとも１つの異種部分を含み、その中で、このような異種部分は蛍光性タグである。いくつかの態様では、蛍光性タグは、フルオレセイン型染料、ローダミン型染料、ダンシル型染料、リサミン型染料、シアニン型染料、フィコエリトリン型染料、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ型染料、またはそれらの任意の組み合わせを含む。本明細書で開示されるシステイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質とのコンジュゲーションに好適なフルオロフォアとしては、制限なしに、ピレン（対応する誘導体化合物のいずれかを含めた）、アントラセン、ナフタレン、アクリジン、スチルベン、インドールまたはベンゾインドール、オキサゾールまたはベンゾキサゾール、チアゾールまたはベンゾチアゾール、４−アミノ−７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＮＢＤ）、シアニン（任意の対応する化合物を含めた）、カルボシアニン（任意の対応する化合物を含めた）、カルボスチリル（ｃａｒｂｏｓｔｙｒｙｌ）、ポルフィリン、サリチル酸、アントラニル酸、アズレン、ペリレン、ピリジン、キノリン、ボラポリアザインダセン（任意の対応する化合物を含めた）、キサンテン（任意の対応する化合物を含めた）、オキサジン（任意の対応する化合物を含む）またはベンゾキサジン、カルバジン（任意の対応する化合物を含めた）、フェナレノン、クマリン（開示される対応する化合物を含めた）、ベンゾフラン（対応する化合物を含めた）、およびベンズフェナレノン（任意の対応する化合物を含めた）およびそれらの誘導体が挙げられる。本明細書の用法では、オキサジンとしては、レゾルフィン（任意の対応する化合物を含む）、アミノオキサジノン、ジアミノオキサジン、およびそれらのベンゾ置換類似体、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
特定の態様では、本明細書で開示されるシステイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質にコンジュゲートされるフルオロフォアとしては、キサンテン（ロドール、ローダミン、フルオレセインおよびそれらの誘導体）クマリン、シアニン、ピレン、オキサジン、ボラポリアザインダセン、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態では、このようなフルオロフォアは、スルホン化キサンテン、フッ素化キサンテン、スルホン化クマリン、フッ素化クマリン、スルホン化シアニンまたはそれらの任意の組み合わせである。ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）ＤＹＬＩＧＨＴ（登録商標）、ＣＹ ＤＹＥＳ（登録商標）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）、ＯＲＥＧＯＮ ＧＲＥＥＮ（登録商標）、ＰＡＣＩＦＩＣ ＢＬＵＥ（登録商標）、ＩＲＤＹＥＳ（登録商標）、ＦＡＭ（登録商標）、ＦＩＴＣ（登録商標）、およびＲＯＸ（登録商標）の商標の下に販売されて、一般にその名称で知られている染料もまた含まれる。
本明細書で開示されるシステイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質に付着するフルオロフォアの選択が、コンジュゲート化合物の吸収および蛍光放射特性を左右する。使用され得るフルオロフォア標識の物理特性としては、スペクトル特性（吸収、放出、およびストークスシフト）、蛍光強度、寿命、偏光、および光退色速度、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。１つのフルオロフォアをその他から識別し、それによって多重解析を可能にするために、これらの全ての物理特性が利用され得る。特定の態様では、フルオロフォアは、４８０ｎｍを超える波長に吸収極大を有する。いくつかの態様では、フルオロフォアは、４８８ｎｍ〜５１４ｎｍまたはその近く（アルゴンイオンレーザー励起源の出力による励起に適する）、または５４６ｎｍの近く（水銀燈による励起に適する）で吸収する。いくつかの態様では、フルオロフォアは、組織または生物全体の用途において、ＮＩＲ（近赤外線領域）で発光し得る。蛍光標識のその他の望ましい性質としては、例えば抗体の標識が細胞または生物内（例えば、生きている動物）で実施される場合における、細胞透過性および低毒性が挙げられる。いくつかの特定の態様では、蛍光性タグは、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ Ｃ５マレイミドである。
いくつかの態様では、本明細書で開示されるコンジュゲート化合物は、操作システインの１つにコンジュゲートされた少なくとも１つの異種部分を含み、その中で、このような異種部分は捕捉タグである。いくつかの態様では、捕捉タグは、ビオチンまたはＨｉｓ６タグである。ビオチンは、酵素系内で機能して、検出可能シグナルをさらに増幅させ得るので有用であり、それはまた、単離目的のために、アフィニティクロマトグラフィーで使用されるタグとしても機能する。検出目的では、アビオチンに対して親和性を有する、ビジン−ＨＲＰなどの酵素コンジュゲートが使用され得る。引き続いてペルオキシダーゼ基質が添加されて、検出可能シグナルが生じ得る。ビオチンに加えて、ホルモン、天然および合成薬物、汚染物質、アレルゲン、エフェクター分子、増殖因子、ケモカイン、サイトカイン、リンフォカイン、アミノ酸、ペプチド、化学中間体、ヌクレオチドなどをはじめとする、その他のハプテンが使用され得る。
いくつかの態様では、本明細書で開示されるコンジュゲート化合物は、操作システインの１つにコンジュゲートされた少なくとも１つの異種部分を含み、その中で、このような異種部分は酵素である。酵素は、検出可能シグナルの増幅が得られて、アッセイ感度増大がもたらされ得るために、効果的な標識である。酵素それ自体は、検出可能反応を生じないことが多いが、妥当な基質に接触すると機能して、変換された基質が、蛍光性、比色分析またはルミネセンスシグナルを生じるように、基質を分解する。標識試薬上の１つの酵素が複数の基質の検出可能シグナルへの変換をもたらし得るので、酵素は検出可能シグナルを増幅する。酵素基質は、例えば、比色分析、蛍光性または化学発光などの測定可能産物をもたらすように選択される。このような基質は、当該技術分野で広く使用されており、当該技術分野で公知である。
いくつかの実施形態では、比色分析または蛍光発生性基質および酵素の組み合わせは、西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酸化還元酵素と、識別色（それぞれ褐色および赤色）をもたらす、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）および３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）などの基質とを使用する。検出可能産物をもたらすその他の比色分析酸化還元酵素基質としては、２，２−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、ｏ−ジアニシジン、５−アミノサリチル酸、４−クロロ−１−ナフトールが挙げられるが、これに限定されるものではない。蛍光発生基質としては、ホモバニリン酸または４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル酢酸、Ａｍｐｌｅｘ（登録商標）Ｒｅｄ試薬をはじめとする還元型フェノキサジンおよび還元型ベンゾチアジンおよびその変異体、およびジヒドロフルオレセインをはじめとする還元型ジヒドロキサンテン、およびジヒドロローダミン１２３をはじめとするジヒドロローダミンが挙げられるが、これに限定されるものではない。チラミドであるペルオキシダーゼ基質は、ペルオキシダーゼ基質のユニークなクラスを代表し、それらは、酵素作用前に内因的に検出可能であり得るが、チラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）といわれている、処理中のペルオキシダーゼの作用によって「定位置固定」される。これらの基質は、それらの引き続く検出顕微鏡検査、フローサイトメトリー、光学的スキャニング、および蛍光光度分析のために、細胞、組織またはアレイであるサンプル中の標的を標識するために、広く使用されている。
比色分析（および場合によっては蛍光発生）基質および酵素組み合わせは、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）、６−クロロ−３−インドリルリン酸、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリルリン酸、ｐ−ニトロフェニルリン酸、またはｏ−ニトロフェニルリン酸などの比色分析基質と組み合わされた、または４−メチルウンベリフェリルリン酸、６，８−ジフルオロ−７−ヒドロキシ−４−メチルクマリニルリン酸（ＤｉＦＭＵＰ、米国特許第５，８３０，９１２号明細書）フルオレセイン二リン酸、３−Ｏ−メチルフルオレセインリンリン酸、レゾルフィンリン酸、９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル）リン酸（ＤＤＡＯリン酸）、またはＥＬＦ９７、ＥＬＦ３９または関連リン酸塩などの蛍光発生基質と組み合わされた、酸ホスファターゼ、アルカリホスファターゼなどのホスファターゼ酵素、またはこのようなホスファターゼの組換えバージョンを使用することもある。
グリコシダーゼ、特にβ−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼおよびβ−グルコシダーゼは、追加的な適切な酵素である。適切な比色分析基質としては、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）および類似したインドリルガラクトシド、グルコシド、およびグルクロニド、ｏ−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）、およびｐ−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノシドが挙げられるが、これに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、蛍光発生基質としては、レゾルフィンβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、フルオレセインジガラクトシド（ＦＤＧ）、フルオレセインジグルクロニド、およびそれらの構造変異体、４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、カルボキシウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシドおよびフッ素化クマリンβ−Ｄ−ガラクトピラノシドが挙げられる。
追加的な酵素としては、コリンエステラーゼおよびペプチダーゼなどのヒドロラーゼ、グルコースオキシダーゼおよびチトクロームオキシダーゼなどのオキシダーゼ、およびそれに対する適切な基質が知られている還元酵素が挙げられるが、これに限定されるものではない。
酵素および化学発光を生じるそれらの適切な基質は、いくつかのアッセイで有用である。これらとしては、天然および組換形態のルシフェラーゼおよびエクオリンが挙げられるが、これに限定されるものではない。安定性のジオキセタン、ルミノール、イソルミノール、およびアクリジニウムエステルを含有するものなどのホスファターゼ、グリコシダーゼ、およびオキシダーゼのための化学発光産生基質もまた有効である。
いくつかの態様では、本明細書で開示されるコンジュゲート化合物は、操作システインの１つにコンジュゲートされた少なくとも１つの異種部分を含み、その中で、このような異種部分は核酸である。核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、ペプチド核酸などのヘアピンまたは核酸ミメティックからなる群から選択され得る。特定の態様では、コンジュゲート核酸は、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも５０００塩基対以上である。コンジュゲート核酸は、一本鎖であり得る。様々な態様において、コンジュゲート核酸は、二本鎖であり得る。いくつかの態様では、コンジュゲート核酸は、オープンリーディングフレームをコードする。いくつかの態様では、オープンリーディングフレームは、アポトーシス誘導タンパク質、ウイルスタンパク質、酵素、または腫瘍抑制因子タンパク質に対応する、コンジュゲート核酸によってコードされる。このような核酸を細胞に送達する技術は、当該技術分野で公知である。
（ｂ）リンカー
いくつかの態様では、異種部分は、リンカーを介して、操作システインの１つにコンジュゲートされる。本明細書の用法では、「リンカー」という用語は、ペプチドまたはポリペプチド配列（例えば、合成ペプチドまたはポリペプチド配列）、または非ペプチドリンカーを指し、その主要機能は、操作システインのチオール基を介して、異種部分をシステイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質に結合することである。いくつかの態様では、リンカーは、本開示のコンジュゲート化合物の任意の２つの異種部分または非リンカー要素の間に存在し得る。例えば、１つまたは複数のリンカーが、システイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質と異種部分との間に、または第１の異種部分と第２の異種部分との間に（ｂｅｔｗｅｅｎ ａ ｂｅｔｗｅｅｎ ａ）存在し得る。いくつかの態様では、２つ以上のリンカーが、タンデムに連結され得る。本明細書で開示されるコンジュゲート化合物中に複数のリンカーが存在する場合、リンカーのそれぞれは、同一であるかまたは異なり得る。一般に、リンカーは、コンジュゲート化合物に可撓性を提供する。リンカーは、典型的に切断されず、したがって、いくつかの態様では、リンカーは非切断可能リンカーである。しかし特定の実施形態では、このような切断が望ましくあり得る。したがって、いくつかの態様では、リンカーは、リンカー配列中に位置し得る、またはリンカー配列のどちらかの端に隣接し得る、１つまたは複数のプロテアーゼ切断可能部位を含み得る。
いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、非ペプチドリンカーを含む。その他の態様では、リンカーは、非ペプチドリンカーからなる。いくつかの態様では、非ペプチド性リンカーは、例えば、マレイミドカプロイル（ＭＣ）、ｖａｌ−ｃｉｔ、ＭＣ−ｖａｌ−ｃｉｔ、ＭＣ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢＣ、Ｍａｌ−ＰＥＧ２Ｃ２、Ｍａｌ−ＰＥＧ３Ｃ２Ｍａｌ−ＰＥＧ６Ｃ２、マレイミドプロパノイル（ＭＰ）、メトキシルポリエチレングリコール（ＭＰＥＧ）、４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボン酸スクシンイミジル（ＳＭＣＣ）、ＭＢＳ（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、４−スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルエン（ＳＭＰＴ）、６−［３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサン酸スクシンイミジル（ＬＣ−ＳＰＤＰ）、ＢＭＰＥＯ、ＳＰＰ、４−（ｐ−マレイミドフェニル）酪酸スクシンイミジル（ＳＭＰＢ）、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオ酢酸（ＳＡＴＡ）、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾン酸（ＳＩＡＢ）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。例えば、米国特許第７，３７５，０７８号明細書を参照されたい。
いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、ペプチドリンカーを含む。いくつかの態様では、リンカーは、ペプチドリンカーからなる。いくつかの態様では、ペプチドリンカーは、少なくとも２個のアミノ酸、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、または少なくとも１００個のアミノ酸を含む。その他の態様では、ペプチドリンカーは、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、または少なくとも１，０００個のアミノ酸を含む。なおも別の態様では、ペプチドリンカーは、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、または２０００個のアミノ酸を含み得る。ペプチドリンカーは、１〜５個のアミノ酸、１〜１０個のアミノ酸、１〜２０個のアミノ酸、１０〜５０個のアミノ酸、５０〜１００個のアミノ酸、１００〜２００個のアミノ酸、２００〜３００個のアミノ酸、３００〜４００個のアミノ酸、４００〜５００個のアミノ酸、５００〜６００個のアミノ酸、６００〜７００個のアミノ酸、７００〜８００個のアミノ酸、８００〜９００個のアミノ酸、または９００〜１０００個のアミノ酸を含み得る。
例えば、式［（Ｇｌｙ）x−Ｓｅｒy］ z（式中、ｘは１〜４、ｙは０または１、およびｚは１〜５０である）に記載のペプチドリンカーなどのペプチドリンカーの例は、当該技術分野で周知である。一態様では、ペプチドリンカーは、配列Ｇnを含み、式中、ｎは１〜１００の整数であり得る。特定の態様では、ペプチドリンカーの配列はＧＧＧＧである。ペプチドリンカーは、配列（ＧＡ）n含み得る。ペプチドリンカーは、配列（ＧＧＳ）n含み得る。その他の態様では、ペプチドリンカーは、配列（ＧＧＧＳ）nを含む。なおも別の態様では、ペプチドリンカーは、配列（ＧＧＳ）n （ＧＧＧＧＳ）nを含む。これらの事例では、ｎは１〜１００の整数であり得る。その他の事例では、ｎは１〜２０の整数、すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０であり得る。リンカーの例としては、ＧＧＧ、ＳＧＧＳＧＧＳ、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧ、ＧＧＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ、またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳが挙げられるが、これに限定されるものではない。その他の態様では、リンカーは、ポリＧ配列（ＧＧＧＧ）nであり、ｎは１〜１００の整数であり得る。
一態様では、ペプチドリンカーは合成され、すなわち、非天然起源である。一態様（ｏｎｅ ａｓｐｅｃｔｓ）では、ペプチドリンカーとしては、アミノ酸の第１の直鎖配列を、それが天然に連結せずまたは天然で遺伝的に融合しない、アミノ酸の第２の直鎖配列に連結または遺伝的に融合するアミノ酸配列を含む、ペプチド（またはポリペプチド）（例えば、天然または非天然ペプチド）が挙げられる。例えば、一態様では、ペプチドリンカーは、天然ポリペプチドの修飾形態である（例えば、付加、置換または欠失などの変異を含む）、非天然ポリペプチドを含み得る。別の態様では、ペプチドリンカーは、非天然アミノ酸を含み得る。別の態様では、ペプチドリンカーは、天然には存在しない、直鎖配列で存在する天然アミノ酸を含み得る。なおも別の態様では、ペプチドリンカーは、天然ポリペプチド配列を含み得る。
（ＩＩＩ）抗体およびＦｃ融合タンパク質のシステイン操作
いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、少なくとも１つの標的に特異的に結合する、システイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質を含む。いくつかの態様では、システイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質は、２つ以上の標的に結合し得る。いくつかの態様では、システイン操作抗体は、親抗体対応物の抗原結合能力を保つ。したがって、本明細書で開示されるシステイン操作抗体は、抗原に、好ましくは特異的に結合し得る。このような抗原としては、例えば、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、細胞表面受容体タンパク質およびその他の細胞表面分子、膜貫通タンパク質、シグナル伝達タンパク質、細胞生存調節因子、細胞増殖調節因子、組織発達または分化と関係がある（例えば、機能的に寄与することが知られているまたは疑われる）分子、リンフォカイン、サイトカイン、細胞周期調節に関与する分子、脈管形成に関与する分子、および血管新生に関連する（例えば、機能的に寄与することが知られているまたは疑われる）分子が挙げられる。腫瘍関連抗原は、クラスター分化因子（すなわち、ＣＤタンパク質）であり得る。システイン操作抗体がそれに結合できる抗原は、上述のカテゴリーの１つのサブセットのメンバーであり得る。
いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、少なくとも１つの標的に特異的に結合する、システイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質と、少なくとも１つの第２の標的に特異的に結合する、少なくとも１つの異種部分とを含む。いくつかの態様では、システイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質、および異種部分は、同一標的に結合し得る。その他の態様では、システイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質、および異種部分は、異なる標的に結合し得る。したがって、いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、単一特異性である。その他の態様では、コンジュゲート化合物は、二重特異性、三重特異性、四重特異性などである。その他の態様では、コンジュゲート化合物は、多特異性である。いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、一価、二価、三価、四価などである。なおも別の態様では、コンジュゲート化合物は、多価である。特定の態様では、システイン操作抗体およびＦｃ融合タンパク質および由来コンジュゲート化合物は二価であり、例えば、操作抗体化合物は２つの異なる特異的抗原結合部位を含み、または操作Ｆｃ融合タンパク質は、２つの異なる標的結合ドメインを含む。特定の態様では、システイン操作抗体およびそれらの断片およびそれに由来するコンジュゲート化合物は、二重特異性であり、すなわち、分子は、２つの異なる抗原（例えば、同一であるかまたは異なる分子上の２つの異なるエピトープ）に特異的に結合し得る。いくつかの特定の態様では、システイン操作抗体およびそれらの断片およびそれに由来するコンジュゲート化合物は二重特異性および四価であり、例えば、２つの異なる抗原（例えば、同一であるかまたは異なる分子上の２つの異なるエピトープ）に結合できる、４つの抗原結合部位を含む親抗体に由来する。
本開示は、
（ａ）細胞をシステイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質またはコンジュゲート化合物に曝露させるステップと；
（ｂ）システイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質またはコンジュゲート化合物と、標的細胞との結合程度を判定するステップと
を含む、本明細書で開示されるシステイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質、または本明細書で開示されるコンジュゲート化合物と、標的細胞との結合を検出するアッセイを提供する。
本明細書で開示されるシステイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質が、またはそれに由来する本明細書で開示されるコンジュゲート化合物が、標的に結合する能力は、例えば、フローサイトメトリー、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、または放射免疫測定法（ＲＩＡ）、または動態（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）分析）などの当該技術分野で周知である任意の適切な方法を使用して、実験的に判定され得る。直接結合アッセイならびに競合的結合アッセイ形式もまた、容易に用いられ得る。例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｎｔｉｇｅｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，”Ｉｎ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９８４）；Ｋｕｂｙ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９２）；およびその中に記載される方法を参照されたい。本明細書で開示される、特定のシステイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質、またはそれに由来するコンジュゲート化合物と、標的との測定された相互作用親和性は、異なる条件下（例えば、塩濃度、ｐＨ、温度など）で測定されると、変動し得る。
実質的にあらゆる分子が、システイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質および異種部分を含むコンジュゲート化合物によって、特異的に結合されおよび／またはそれに組み込まれてもよい。いくつかの態様では、ＴＮＦスーパーファミリーの構成員（受容体またはリガンド）、ならびにこのタンパク質ファミリーに属するタンパク質のサブユニット、ドメイン、モチーフ、およびエピトープが、コンジュゲート化合物によって特異的に結合されおよび／またはそれに組み込まれる。ＴＮＦスーパーファミリーは、腫瘍壊死因子α（「ＴＮＦ−α」）、腫瘍壊死因子β（「ＴＮＦ−β」）、リンフォトキシンα（「ＬＴ−α」）、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ４０リガンド、４−１ＢＢリガンド、Ａｐｏ−１リガンド（ＦａｓリガンドまたはＣＤ９５リガンドとも称される）、Ａｐｏ−２リガンド（ＴＲＡＩＬとも称される）、Ａｐｏ−３リガンド（ＴＷＥＡＫとも称される）、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）、ＡＰＲＩＬ、ＲＡＮＫリガンド（ＴＲＡＮＣＥとも称される）、ＴＡＬＬ−１（ＢｌｙＳ、ＢＡＦＦまたはＴＨＡＮＫとも称される）、ＤＲ４、ＤＲ５（Ａｐｏ−２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲ６、Ｔａｎｇｏ−６３、ｈＡＰＯ８、ＴＲＩＣＫ２、またはＫＩＬＬＥＲとしてもまた知られている）、ＤＲ６、ＤｃＲ１，ＤｃＲ２、ＤｃＲ３（ＴＲ６またはＭ６８としてもまた知られている）、ＣＡＲ１、ＨＶＥＭ（ＡＴＡＲまたはＴＲ２としてもまた知られている）、ＧＩＴＲ、ＺＴＮＦＲ−５、ＮＴＲ−１、ＴＮＦＬ１、ＣＤ３０、ＬＴＢｒ、４−１ＢＢ受容体、およびＴＲ９をはじめとするが、これに限定されるものではない、多数の分子を含む。
いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、５Ｔ４、ＡＢＬ、ＡＢＣＦ１、ＡＣＶＲ１、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＡＣＶＲ２、ＡＣＶＲ２Ｂ、ＡＣＶＲＬ１、ＡＤＯＲＡ２Ａ、アグリカン、ＡＧＲ２、ＡＩＣＤＡ、ＡＩＦ１、ＡＩＧＩ、ＡＫＡＰ１、ＡＫＡＰ２、ＡＭＨ、ＡＭＨＲ２、ＡＮＧＰＴ１、ＡＮＧＰＴ２、ＡＮＧＰＴＬ３、ＡＮＧＰＴＬ４、ＡＮＰＥＰ、ＡＰＣ、ＡＰＯＣｌ、ＡＲ、アロマターゼ、ＡＴＸ、ＡＸｌ、ＡＺＧＰ１（亜鉛−α糖タンパク質）、Ｂ７．１、Ｂ７．２、Ｂ７−Ｈ１、ＢＡＤ、ＢＡＦＦ、ＢＡＧ１、ＢＡＩｌ、ＢＣＲ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ６、ＢＤＮＦ、ＢＬＮＫ、ＢＬＲ１（ＭＤＲ１５）、ＢｌｙＳ、ＢＭＰ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３Ｂ（ＧＤＦＩＯ）、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ８、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＢＭＰＲ２、ＢＰＡＧ１（ｐｌｅｃｔｉｎ）、ＢＲＣＡ１、Ｃ１９ｏｒｆｌＯ（ＩＬ２７ｗ）、Ｃ３、Ｃ４Ａ、Ｃ５、Ｃ５Ｒ１、ＣＡＮＴ１、ＣＡＳＰ１、ＣＡＳＰ４、ＣＡＶｌ、ＣＣＢＰ２（Ｄ６／ＪＡＢ６１）、ＣＣＬ１（１−３０９）、ＣＣＬＩ１（エオタキシン）、ＣＣＬ１３（ＭＣＰ−４）、ＣＣＬ１５（ＭＩＰ−Ｉｄ）、ＣＣＬ１６（ｍｃｃ−４）、ＣＣＬ１７（ＴＡＲＣ）、ＣＣＬ１８（ＰＡＲＣ）、ＣＣＬ１９（ＭＩＰ−３ｂ）、ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１）、ＭＣＡＦ、ＣＣＬ２０（ＭＩＰ−３ａ）、ＣＣＬ２１（ＭＥＰ−２）、ＳＬＣ、ｅｘｏｄｕｓ−２、ＣＣＬ２２（ＭＤＣ／ＳＴＣ−Ｉ）、ＣＣＬ２３（ＭＰＩＦ−Ｉ）、ＣＣＬ２４（ＭＰＩＦ−２／エオタキシン−２）、ＣＣＬ２５（ＴＥＣＫ）、ＣＣＬ２６（エオタキシン−３）、ＣＣＬ２７（ＣＴＡＣＫ／ＩＬＣ）、ＣＣＬ２８、ＣＣＬ３（ＭＩＰ−ｌａ）、ＣＣＬ４（ＭＩＰＩｂ）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ７（ＭＣＰ−３）、ＣＣＬ８（ｍｃｐ−２）、ＣＣＮＡ１、ＣＣＮＡ２、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＥ１、ＣＣＮＥ２、ＣＣＲＩ（ＣＫＲ１／ＨＭ１４５）、ＣＣＲ２（ｍｃｐ−ＩＲＢ／ＲＡ）、ＣＣＲ３（ＣＫＲ３／ＣＭＫＢＲ３）、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５（ＣＭＫＢＲ５／ＣｈｅｍＲ１３）、ＣＣＲ６（ＣＭＫＢＲ６／ＣＫＲ−Ｌ３／ＳＴＲＬ２２／ＤＲＹ６）、ＣＣＲ７（ＣＫＲ７／ＥＢＩ１）、ＣＣＲ８（ＣＭＫＢＲ８／ＴＥＲＩ／ＣＫＲ−Ｌ１）、ＣＣＲ９（ＧＰＲ−９−６）、ＣＣＲＬ１（ＶＳＨＫ１）、ＣＣＲＬ２（Ｌ−ＣＣＲ），ＣＤ１６４、ＣＤ１９、ＣＤＩＣ、ＣＤ２０、ＣＤ２００、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ３３、ＣＤ３５、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ３Ｚ、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ５２、ＣＤ６９、ＣＤ７２、ＣＤ７４、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ８、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１３７、ＣＤＨ１（Ｅｃａｄｈｅｒｉｎ）、ＣＤＨ１０、ＣＤＨ１２、ＣＤＨ１３、ＣＤＨ１８，ＣＤＨ１９、ＣＤＨ２０、ＣＤＨ５、ＣＤＨ７、ＣＤＨ８、ＣＤＨ９、ＣＤＫ２、ＣＤＫ３、ＣＤＫ４、ＣＤＫ５、ＣＤＫ６、ＣＤＫ７，ＣＤＫ９、ＣＤＫＮ１Ａ（ｐ２１Ｗａｐ１／Ｃｉｐ１），ＣＤＫＮ１Ｂ（ｐ２７Ｋｉｐ１）、ＣＤＫＮｌＣ、ＣＤＫＮ２Ａ（ｐ１６１ＮＫ４ａ）、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＣＤＫＮ３、ＣＥＢＰＢ、ＣＥＲＩ、ＣＨＧＡ、ＣＨＧＢ、キチナーゼ、ＣＨＳＴ１０、ＣＫＬＦＳＦ２、ＣＫＬＦＳＦ３、ＣＫＬＦＳＦ４、ＣＫＬＦＳＦ５、ＣＫＬＦＳＦ６、ＣＫＬＦＳＦ７、ＣＫＬＦＳＦ８、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ７（クローディン−７）、ＣＬＮ３、ＣＬＵ（クラスタリン）、ＣＭＫＬＲ１、ＣＭＫＯＲ１（ＲＤＣｌ）、ＣＮＲ１、ＣＯＬ１８Ａ１、ＣＯＬＩＡ１、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ６Ａ１、ＣＲ２、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＲＰ、ＣＳＦ１（Ｍ−ＣＳＦ）、ＣＳＦ２（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＣＳＦ３（ＧＣＳＦ）、ＣＴＬＡ４、ＣＴＬ８、ＣＴＮＮＢ１（ｂ−カテニン）、ＣＴＳＢ（カテプシンＢ）、ＣＸ３ＣＬ１（ＳＣＹＤ１）、ＣＸ３ＣＲ１（Ｖ２８）、ＣＸＣＬ１（ＧＲＯ１）、ＣＸＣＬ１０（ＩＰ−ＩＯ）、ＣＸＣＬＩ１（Ｉ−ＴＡＣ／ＩＰ−９）、ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ１）、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ２（ＧＲＯ２）、ＣＸＣＬ３（ＧＲＯ３）、ＣＸＣＬ５（ＥＮＡ−７８／ＬＩＸ）、ＣＸＣＬ６（ＧＣＰ−２）、ＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）、ＣＸＣＲ３（ＧＰＲ９／ＣＫＲ−Ｌ２）、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ６（ＴＹＭＳＴＲ／ＳＴＲＬ３３／Ｂｏｎｚｏ）、ＣＹＢ５、ＣＹＣｌ、ＣＹＳＬＴＲ１、ＤＡＢ２１Ｐ、ＤＥＳ、ＤＫＦＺｐ４５１Ｊ０１１８、ＤＮＣＬ１、ＤＰＰ４、Ｅ２Ｆ１、Ｅｎｇｅｌ、Ｅｄｇｅ、Ｆｅｎｎｅｌ、ＥＦＮＡ３、ＥＦＮＢ２、ＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＥＬＡＣ２、ＥＮＧ、Ｅｎｏｌａ、ＥＮＯ２、ＥＮＯ３、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ４、ＥＰＨＡ５、ＥＰＨＡ６、ＥＰＨＡ７、ＥＰＨＡ８、ＥＰＨＡ９、ＥＰＨＡ１０、ＥＰＨＢ１、ＥＰＨＢ２、ＥＰＨＢ３、ＥＰＨＢ４、ＥＰＨＢ５、ＥＰＨＢ６、ＥＰＨＲＩＮ−Ａ１、ＥＰＨＲＩＮ−Ａ２、ＥＰＨＲＩＮＡ３、ＥＰＨＲＩＮ−Ａ４、ＥＰＨＲＩＮ−Ａ５、ＥＰＨＲＩＮ−Ａ６、ＥＰＨＲＩＮ−Ｂ１、ＥＰＨＲＩＮ−Ｂ２、ＥＰＨＲＩＮ−Ｂ３、ＥＰＨＢ４、ＥＰＧ、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ−２）、ＥＲＥＧ、ＥＲＫ８、エストロゲン受容体、Ｅａｒｌ、ＥＳＲ２、Ｆ３（ＴＦ）、ＦＡＤＤ、ファルネシルトランスフェラーゼ、ＦａｓＬ、ＦＡＳＮｆ、ＦＣＥＲ１Ａ、ＦＣＥＲ２、ＦＣＧＲ３Ａ、ＦＧＦ、ＦＧＦ１（ａＦＧＦ）、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１２Ｂ、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、ＦＧＦ２３、ＦＧＦ３（ｉｎｔ−２）、ＦＧＦ４（ＨＳＴ）、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６（ＨＳＴ−２）、ＦＧＦ７（ＫＧＦ）、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦＲ３、ＦＩＧＦ（ＶＥＧＦＤ）、ＦＩＬＩ（ε）、ＦＢＬ１（ＺＥＴＡ）、ＦＬＪ１２５８４、ＦＬＪ２５５３０、ＦＬＲＴ１（フィブロネクチン）、ＦＬＴ１、ＦＬＴ−３、ＦＯＳ、ＦＯＳＬＩ（ＦＲＡ−１）、ＦＹ（ＤＡＲＣ）、ＧＡＢＲＰ（ＧＡＢＡａ）、ＧＡＧＥＢ１、ＧＡＧＥＣ１、ＧＡＬＮＡＣ４Ｓ−６ＳＴ、ＧＡＴＡ３、ＧＤ２、ＧＤＦ５、ＧＦＩ１、ＧＧＴ１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＮＡＳ１、ＧＮＲＨ１、ＧＰＲ２（ＣＣＲ１０）、ＧＰＲ３１、ＧＰＲ４４、ＧＰＲ８１（ＦＫＳＧ８０）、ＧＲＣＣ１０（Ｃ１０）、ＧＲＰ、ＧＳＮ（ゲルゾリン）、ＧＳＴＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＨＤＡＣ、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ７Ａ、ＨＤＡＣ９、ヘッジホッグ、ＨＧＦ、ＨＩＦ１Ａ、ＨＩＰ１、ヒスタミンおよびヒスタミン受容体、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＭ７４、ＨＭＯＸｌ、ＨＳＰ９０、ＨＵＭＣＹＴ２Ａ、アイスバーグ、ＩＣＯＳＬ、ＩＤ２、ＩＦＮ−ａ、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４，１ＦＮＡ５、ＥＦＮＡ６、ＢＦＮＡ７、ＩＦＮＢ１、ＩＦＮｇａｍｍａ、ＩＦＮＷｌ、ＩＧＢＰ１、ＩＧＦ１、ＩＧＦＩＲ、ＩＧＦ２、ＩＧＦＢＰ２，１ＧＦＢＰ３、ＩＧＦＢＰ６、ＤＬ−１、ＩＬＩＯ、ＩＬＩＯＲＡ、ＩＬＩＯＲＢ、ＩＬ−１、ＩＬ１Ｒ１（ＣＤ１２１ａ）、ＩＬ１Ｒ２（ＣＤ１２１ｂ）、ＩＬＩＲＡ、ＩＬ−２、ＩＬ２ＲＡ（ＣＤ２５）、ＩＬ２ＲＢ（ＣＤ１２２）、ＩＬ２ＲＧ（ＣＤ１３２）、ＩＬ−４、ＩＬ−４Ｒ（ＣＤ１２３）、ＩＬ−５、ＩＬ５ＲＡ（ＣＤ１２５）、ＩＬ３ＲＢ（ＣＤ１３１）、ＩＬ−６、ＩＬ６ＲＡ、（ＣＤ１２６）、ＩＲ６ＲＢ（ＣＤ１３０）、ＩＬ−７、ＩＬ７ＲＡ（ＣＤ１２７）、ＩＬ−８、ＣＸＣＲ１（ＩＬ８ＲＡ）、ＣＸＣＲ２、（ＩＬ８ＲＢ／ＣＤ１２８）、ＩＬ−９、ＩＬ９Ｒ（ＣＤ１２９）、ＩＬ−１０、ＩＬ１０ＲＡ（ＣＤ２１０）、ＩＬ１０ＲＢ（ＣＤＷ２１０Ｂ）、ＩＬ−１１、ＩＬ１１ＲＡ、ＩＬ−１２、ＩＬ−１２Ａ、ＩＬ−１２Ｂ、ＩＬ−１２ＲＢ１、ＩＬ−１２ＲＢ２、ＩＬ−１３、ＩＬ１３ＲＡ１、ＩＬ１３ＲＡ２、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１５ＲＡ、１Ｌ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１７Ａ、ＩＬ１７Ｂ、ＩＬ１７Ｃ、ＩＬ１７Ｒ、ＩＬ１８、ＩＬ１８ＢＰ、ＩＬ１８Ｒ１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＩＬ１９、ＩＬＩＡ、ＩＬＩＢ、ＩＬ１Ｆ１０、ＩＬ１Ｆ５、ＩＬ１Ｆ６、ＩＬ１Ｆ７、ＩＬ１Ｆ８、ＤＬ１Ｆ９、ＩＬＩＨＹＩ、ＩＬＩＲ１、ＩＬ１Ｒ２、ＩＬＩＲＡＰ、ＩＬＩＲＡＰＬＩ、ＩＬ１ＲＡＰＬ２、ＩＬｌＲＬ１、ＩＬｌＲＬ２、ＩＬＩＲＮ、ＩＬ２、ＩＬ２０、ＩＬ２０ＲＡ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ２２、ＩＬ２２Ｒ、ＩＬ２２ＲＡ２、ＩＬ２３、ＤＬ２４、ＩＬ２５、ＩＬ２６、ＩＬ２７、ＩＬ２８Ａ、ＩＬ２８Ｂ、ＩＬ２９、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ３、ＩＬ３０、ＩＬ３ＲＡ、ＩＬ４，１Ｌ４Ｒ、ＩＬ６ＳＴ（糖タンパク質１３０）、ＩＬＫ、ＩＮＨＡ、ＩＮＨＢＡ、ＩＮＳＬ３、ＩＮＳＬ４、ＩＲＡＫ１、ＩＲＡＫ２、ＩＴＧＡ１、ＩＴＧＡ２，１ＴＧＡ３、ＩＴＧＡ６（ａ６インテグリン）、ＩＴＧＡＶ、ＩＴＧＢ３、ＩＴＧＢ４（１３４インテグリン）、ＪＡＧ１、ＪＡＫ１、ＪＡＫ３、ＪＴＢ、ＪＵＮ、Ｋ６ＨＦ、ＫＡＩ１、ＫＤＲ、ＫＩＴＬＧ、ＫＬＦ５（ＧＣボックスＢＰ）、ＫＬＦ６、ＫＬＫ１０、ＫＬＫ１２、ＫＬＫ１３、ＫＬＫ１４、ＫＬＫ１５、ＫＬＫ３、ＫＬＫ４、ＫＬＫ５、ＫＬＫ６、ＫＬＫ９、ＫＲＴ１、ＫＲＴ１９（ケラチン１９）、ＫＲＴ２Ａ、ＫＲＴＨＢ６（毛髪特異的ＩＩ型ケラチン）、ＬＡＭＡ５、ＬＥＰ（レプチン）、Ｌｉｎｇｏ−ｐ７５、Ｌｉｎｇｏ−Ｔｒｏｙ、ＬＰＳ、ＬＴＡ（ＴＮＦ−ｂ）、ＬＴＢ、ＬＴＢ４Ｒ（ＧＰＲ１６）、ＬＴＢ４Ｒ２、ＬＴＢＲ、ＭＡＣＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＧまたはＯｍｇｐ、ＭＡＰ２Ｋ７（ｃ−Ｊｕｎ）、ＭＣＰ−１、ＭＤＫ、ＭＩＢ１、ミッドカイン、ＭＩＦ、ＭＩＳＲＩＩ、ＭＪＰ−２，ＭＫ、ＭＫＩ６７（Ｋｉ−６７）、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＭＳ４Ａ１、ＭＳＭＢ、ＭＴ３（メタロチオネクチン−ＵＩ）、ｍＴＯＲ、ＭＴＳＳ１、ＭＵＣ１（ムチン）、ＭＹＣ、ＭＹＤ８８、ＮＣＫ２、ニューロカン、ＮＦＫＢＩ、ＮＦＫＢ２、ＮＧＦＢ（ＮＧＦ）、ＮＧＦＲ、ＮｇＲ−Ｌｉｎｇｏ、ＮｇＲＮｏｇｏ６６、（Ｎｏｇｏ）、ＮｇＲ−ｐ７５、ＮｇＲ−Ｔｒｏｙ、ＮＭＥＩ（ＮＭ２３Ａ）、ＮＯＴＣＨ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＸ５、ＮＰＰＢ、ＮＲＯＢ１、ＮＲＯＢ２、ＮＲＩＤ１、ＮＲ１Ｄ２、ＮＲ１Ｈ２、ＮＲ１Ｈ３、ＮＲ１Ｈ４、ＮＲｌｌ２、ＮＲｌｌ３、ＮＲ２Ｃ１、ＮＲ２Ｃ２、ＮＲ２Ｅ１、ＮＲ２Ｅ３、ＮＲ２Ｆ１、ＮＲ２Ｆ２、ＮＲ２Ｆ６、ＮＲ３Ｃ１、ＮＲ３Ｃ２、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、ＮＲ４Ａ３、ＮＲ５Ａ１、ＮＲ５Ａ２、ＮＲ６Ａ１、ＮＲＰ１、ＮＲＰ２、ＮＴ５Ｅ、ＮＴＮ４、ＯＤＺｌ、ＯＰＲＤＩ、Ｐ２ＲＸ７、ＰＡＰ、ＰＡＲＴ１、ＰＡＴＥ、ＰＡＷＲ、ＰＣＡ３、ＰＣＤＧＦ、ＰＣＮＡ、ＰＤＧＦＡ、ＰＤＧＦＢ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＥＣＡＭＩ、ｐｅｇ−アスパラギナーゼ、ＰＦ４（ＣＸＣＬ４）、ＰＧＦ、ＰＧＲ、ホスファカン、ＰＩＡＳ２、ＰＩ３キナーゼ、ＰＩＫ３ＣＧ、ＰＬＡＵ（ｕＰＡ）、ＰＬＧ、ＰＬＸＤＣＩ、ＰＫＣ、ＰＫＣ−β、ＰＰＢＰ（ＣＸＣＬ７）、ＰＰＩＤ、ＰＲ１、ＰＲＫＣＱ、ＰＲＫＤ１、ＰＲＬ、ＰＲＯＣ、ＰＲＯＫ２、ＰＳＡＰ、ＰＳＣＡ、ＰＴＡＦＲ、ＰＴＥＮ、ＰＴＧＳ２（ＣＯＸ−２）、ＰＴＮ、ＲＡＣ２（Ｐ２１Ｒａｃ２）、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、ＲＡＲＢ、ＲＧＳ１、ＲＧＳ１３、ＲＧＳ３、ＲＮＦＩ１０（ＺＮＦ１４４）、Ｒｏｎ、ＲＯＢＯ２、ＲＸＲ、Ｓ１００Ａ２、ＳＣＧＢ１Ｄ２（リポフィリンＢ）、ＳＣＧＢ２Ａ１（マンマグロビン２）、ＳＣＧＢ２Ａ２（マンマグロビン１）、ＳＣＹＥ１（内皮単球活性化サイトカイン）、ＳＤＦ２，ＳＥＲＰＥＮＡ１、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＳＥＲＰＩＮＢ５（マスピン）、ＳＥＲＰＩＮＥＩ（ＰＡｌ−Ｉ）、ＳＥＲＰＩＮＦＩ、ＳＨＩＰ−ｌ、ＳＨＩＰ−２、ＳＨＢ１、ＳＨＢ２、ＳＨＢＧ、ＳｆｃＡＺ、ＳＬＣ２Ａ２、ＳＬＣ３３Ａ１、ＳＬＣ４３Ａ１、ＳＬＩＴ２、ＳＰＰ１、ＳＰＲＲ１Ｂ（Ｓｐｒｌ）、ＳＴ６ＧＡＬ１、ＳＴＡＢ１、ＳＴＡＴ６、ＳＴＥＡＰ、ＳＴＥＡＰ２、ＴＢ４Ｒ２、ＴＢＸ２１、ＴＣＰ１０、ＴＤＧＦ１、ＴＥＫ、ＴＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢＩＩ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢ３、ＴＧＦＢＩ、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ３、ＴＨＩＬ、ＴＨＢＳ
１（トロンボスポンジン−１）、ＴＨＢＳ２、ＴＨＢＳ４、ＴＨＰＯ、ＴＩＥ （Ｔｉｅ−１）、ＴＩＭＰ３、組織因子、ＴＬＲ１０、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＮＦ、ＴＮＦａ、ＴＮＦＡＩＰ２（Ｂ９４）、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＮＦＲＳＦＩ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ２１、ＴＮＦＲＳＦ５、ＴＮＦＲＳＦ６（Ｆａｓ）、ＴＮＦＲＳＦ７、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＮＦＳＦ１０（ＴＲＡＩＬ）、ＴＮＦＳＦ１１（ＴＲＡＮＣＥ）、ＴＮＦＳＦ１２（ＡＰＯ３Ｌ）、ＴＮＦＳＦ１３（Ａｐｒｉｌ）４、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＴＮＦＳＦ１４（ＨＶＥＭ−Ｌ）、ＴＮＦＳＦ１５（ＶＥＧＩ）、ＴＮＦＳＦ１８、ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０リガンド）、ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０リガンド）、ＴＮＦＳＦ６（ＦａｓＬ）、ＴＮＦＳＦ７（ＣＤ２７リガンド）、ＴＮＦＳＦ８（ＣＤ３０リガンド）、ＴＮＦＳＦ９（４−１ＢＢリガンド）、ＴＯＬＬＩＰ、Ｔｏｌｌ様受容体、ＴＯＰ２Ａ（トポイソメラーゼｌｉａ）、ＴＰ５３、ＴＰＭ１、ＴＰＭ２，ＴＲＡＤＤ、ＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ４、ＴＲＡＦ５、ＴＲＡＦ６、ＴＲＫＡ、ＴＲＥＭ１、ＴＲＥＭ２、ＴＲＰＣ６、ＴＳＬＰ、ＴＷＥＡＫ、チロシナーゼ、ｕＰＡＲ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、バーシカン、ＶＨＬＣ５、ＶＬＡ−４、Ｗｎｔ−１、ＸＣＬ１（リンホタクチン）、ＸＣＬ２（ＳＣＭ−Ｉｂ）、ＸＣＲＩ（ＧＰＲ５／ＣＣＸＣＲ１）、ＹＹ１、およびＺＦＰＭ２からなる群から選択される、１つまたは複数の分子、ならびに分子のサブユニット、ドメイン、モチーフおよびエピトープに特異的に結合しおよび／またはそれらを組み込む。
いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、例えば、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）、脂質、糖脂質、多糖などの１つまたは複数の非タンパク質分子に特異的に結合しおよび／またはそれらを組み込む、システイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質、または異種部分を含む。いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、腫瘍関連糖脂質抗原、ならびにそのサブユニット、ドメイン、モチーフ、およびエピトープに特異的に結合するおよび／またはそれらを組み込む、システイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質、または異種部分を含む；例えば、米国特許第５，０９１，１７８号明細書を参照されたい）。
いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦＥ、ＶＥＧＦＦ、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、ＦＧＦ、ＦＧＦ２、ＨＧＦ、ＫＤＲ、ｆｉｔ−ｌ、ＦＬＫ−１Ａｎｇ−２、Ａｎｇ−１、ＰＬＧＦ、ＣＥＡ、ＣＸＣＬ１３、Ｂａｆｆ、ＩＬ−２１、ＣＣＬ２１、ＴＮＦ−α、ＣＸＣＬ１２、ＳＤＦ−１、ｂＦＧＦ、ＭＡＣ−ｌ、ＩＬ２３ｐ１９、ＦＰＲ、ＩＧＦＢＰ４、ＣＸＣＲ３、ＴＬＲ４、ＣＸＣＲ２、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈｒｉｎＢ２、ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ１）、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２またはｐ１８５ｎｅｕ）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）、ＨＥＲ４ＥｒｂＢ４またはｔｙｒｏ２）、ＳＣ１、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＲＡＧＥ、Ｎａｖ１．７、ＧＬＰ１、ＲＳＶ、ＲＳＶＦタンパク質、インフルエンザＨＡタンパク質、インフルエンザＮＡタンパク質、ＨＭＧＢ１、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２８、ＣＤ３２、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ６４、ＣＤ７９、ＣＤ２２、ＩＣＡＭ−１、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＨＤＧＦ、ＥｐｈＢ４、ＧＩＴＲ、１３−アミロイド、ｈＭＰＶ、ＰＩＶ−１、ＰＩＶ−２、ＯＸ４０Ｌ、ＩＧＦＢＰ３、ｃＭｅｔ、ＰＤ−１、ＰＬＧＦ、Ｎｅｐｒｏｌｙｓｉｎ、ＣＴＤ、ＩＬ−１８、ＩＬ−６、ＣＸＣＬ−１３、ＩＬ−１Ｒ１、ＩＬ−１５、ＩＬ−４Ｒ、ＩｇＥ、ＰＡｌ−ｌ、ＮＧＦ、ＥｐｈＡ２、ＣＥＡ、ｕＰＡＲｔ、ＤＬＬ−４、ａｖ１３６、ａ５１３１、インターフェロン受容体Ｉ型およびＩＩ型、ＣＤ１９、ＩＣＯＳ、ＩＬ−１７、第ＩＩ因子、Ｈｓｐ９０、ＩＧＦ、ＣＤ１９、ＧＭ−ＣＳＦＲ、ＰＩＶ−３、ＣＭＶ、ＩＬ−１３、ＩＬ−９、およびＥＢＶに対する結合について、リガンドと競合するドメイン（例えば、エピトープ結合領域、またはリガンドドメイン）を含む、システイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質を含む。
いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、アバゴボマブ、アバタセプト（ＯＲＥＮＣＩＡ（登録商標）としてもまた知られている）、アブシキシマブ（ＲＥＯＰＲＯ（登録商標）、ｃ７Ｅ３ Ｆａｂとしてもまた知られている）、アダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ（登録商標））としてもまた知られている、アデカツムマブ、アレムツズマブ（ＣＡＭＰＡＴＨ（登録商標）、ＭａｂＣａｍｐａｔｈまたはＣａｍｐａｔｈ−１Ｈとしてもまた知られている）、アルツモマブ、アフェリモマブ、アナツモマブマフェナトックス、アネツムマブ、アンルキズマブ、アポリズマブ、アルシツモマブ、アセリズマブ、アトリズマブ、アトロリムマブ、バピニューズマブ、バシリキシマブ（ＳＩＭＵＬＥＣＴ（登録商標）としてもまた知られている）、バビツキシマブ、ベクツモマブ（ＬＹＭＰＨＯＳＣＡＮ（登録商標）としてもまた知られている）、ベリムマブ（ＬＹＭＰＨＯ−ＳＴＡＴ−Ｂ（登録商標）としてもまた知られている）、ベルチリムマブ、ベシレソマブ、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）としてもまた知られている）、ビシロマブブラロバルビタール、ビバツヅマブメルタンシン、キャンパス、カナキヌマブ（ＡＣＺ８８５としてもまた知られている）、カンツズマブメルタンシン、カプロマブ（ＰＲＯＳＴＡＳＣＩＮＴ（登録商標）としてもまた知られている）、カツマキソマブ（ＲＥＭＯＶＡＢ（登録商標）としてもまた知られている）、セデリズマブ（ＣＩＭＺＩＡ（（登録商標）としてもまた知られている）、セルトリズマブペゴル、セツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標））としてもまた知られている、クレノリキシマブ、ダセツズマブ、ダクリキシマブ、ダクリズマブ（ＺＥＮＡＰＡＸ（登録商標）としてもまた知られている）、デノスマブ（ＡＭＧ１６２としてもまた知られている）、デツモマブ、ドルリモマブアリトックス、ドルリキシズマブ、ダンツムマブ、デュリムルマブ、ドゥルムルマブ、エクロメキシマブ、エクリズマブ（ＳＯＬＩＲＩＳ（登録商標）としてもまた知られている）、エドバコマブ、エドレコロマブ（Ｍａｂ１７−１Ａ、ＰＡＮＯＲＥＸ（登録商標）としてもまた知られている）、エファリツマブ（ＲＡＰＴＩＶＡ（登録商標）としてもまた知られている）、エフングマブ（ＭＹＣＯＧＲＡＢ（登録商標）としてもまた知られている）、エルシリモマブ、エンリモマブペゴール、エピツモマブシツキセタン、エファリツマブ、エピツモマブ、エピラツズマブ、エルリズマブ、エルツマキソマブ（ＲＥＸＯＭＵＮ（登録商標）としてもまた知られている）、エタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ（登録商標）としてもまた知られている）、エタラシズマブ（エタラツズマブ、ＶＩＴＡＸｌＮ（登録商標）、ＡＢＥＧＲＩＮＴＭとしてもまた知られている）、エキスビビルマブ、ファノレソマブ（ＮＥＵＴＲＯＳＰＥＣ（登録商標）としてもまた知られている）、ファラリモマブ、フェルビズマブ、フォントリズマブ（ＨＵＺＡＦ（登録商標）としてもまた知られている）、ガリキシマブ、ガンテネルマブ、ガビリモマブ（ＡＢＸＣＢＬ（登録商標）としてもまた知られている）、ゲムツズマブオゾガマイシン（ＭＹＬＯＴＡＲＧ（登録商標）としてもまた知られている）、ゴリムマブ（ＣＮＴＯ１４８としてもまた知られている）、ゴミリキシマブ、イバリズマブ（ＴＮＸ−３５５としてもまた知られている）、イブリツモマブチウキセタン（ＺＥＶＡＬＩＮ（登録商標）としてもまた知られている）、イゴボマブ、イムシロマブ、インフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標）としてもまた知られている）、イノリモマブ、イノツズマブオゾガマイシン、イピリムマブ（ＭＤＸ−０１０、ＭＤＸ−１０１としてもまた知られている）、イラツムマブ、ケリキシマブ、ラベツズマブ、レマレソマブ、レブリリズマブ、レルデリムマブ、レキサツムマブ（ＨＧＳ−ＥＴＲ２、ＥＴＲ２−ＳＴ０１としてもまた知られている）、レキシツムマブ、リビビルマブ、リンツズマブ、ルカツムマブ、ルミリキシマブ、マパツムマブ（ＨＧＳＥＴＲ１、ＴＲＭ−１としてもまた知られている）、マスリモマブ、マツズマブ（ＥＭＤ７２０００としてもまた知られている）、メポリズマブ（ＢＯＳＡＴＲＩＡ（登録商標）としてもまた知られている）、メテリムマブ、ミラツズマブ、ミンレツモマブ、ミツモマブ、モロリムマブ、モタビズマブ（ＮＵＭＡＸＴＭとしてもまた知られている）、ムロモナブ（ＯＫＴ３としてもまた知られている）、ナコロマブタフェナトックス、ナプツモマブエスタフェナトックス、ナタリズマブ（ＴＹＳＡＢＲＩ（登録商標）、ＡＮＴＥＧＲＥＮ（登録商標）としてもまた知られている）、ネバクマブ、ネレリモマブ、ニモツズマブ（ＴＨＥＲＡＣＩＭ ｈＲ３（登録商標）、ＴＨＥＲＡ−ＣＩＭ−ｈＲ３（登録商標としてもまた知られている）、ＴＨＥＲＡＬＯＣ（登録商標））、ノフェツモマブメルペンタン（ＶＥＲＬＵＭＡ（登録商標）としてもまた知られている）、オクレリズマブ、オズリモマブ、オファツムマブ、オマリズマブ（ＸＯＬＡＩＲ（登録商標）としてもまた知られている）、オレゴボマブ（ＯＶＡＲＥＸ（登録商標）としてもまた知られている）、オテリキシズマブ、パギバキシマブ、パリビズマブ（ＳＹＮＡＧＩＳ（登録商標）としてもまた知られている）、パニツマブ（ＡＢＸ−ＥＧＦ、ＶＥＣＴＩＢＩＸ（登録商標）としてもまた知られている）、パスコリズマブ、ペムツモマブ（ＴＨＥＲＡＧＹＮ（登録商標）としてもまた知られている）、ペルツズマブ（２Ｃ４、ＯＭＮＩＴＡＲＧ（登録商標）としてもまた知られている）、ペキセリズマブ、ピンツモマブ、プリリキシマブ、プリツムマブ、ラニビズマブ（ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）としてもまた知られている）、ラキシバクマブ、レガビルマブ、レスリズマブ、リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）、ＭａｂＴＨＥＲＡ（登録商標）としてもまた知られている）、ロベリズマブ、ルプリズマブ、サツモマブ、セビルマブ、シブロツズマブ、シプリズマブ（ＭＥＤＩ−５０７としてもまた知られている）、ソンツズマブ、スタムルマブ（ＭＹＯ−０２９としてもまた知られている）、スレソマブ（ＬＥＵＫＯＳＣＡＮ（登録商標）としてもまた知られている）、タカツズマブテトラキセタン、タドシズマブ、タリズマブ、タプリツモマブパプトキス、テフィバズマブ（ＡＵＲＥＸｌＳ（登録商標）としてもまた知られている）、テリモマブアリトックス、テネリキシマブ、テプリズマブ、チシリムマブ、トシリズマブ（ＡＣＴＥＭＲＡ（登録商標）としてもまた知られている）、トラリズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標）としてもまた知られている）、トレメリムマブ（ＣＰ−６７５，２０６としてもまた知られている）、ツコツズマブセルモロイキン、ツビルマブ、ウルトキサズマブ、ウステキヌマブ（ＣＮＴＯ１２７５としてもまた知られている）、バパリキシマブ、ベルツズマブ、ベパリモマブ、ビシリズマブ（ＮＵＶＩＯＮ（登録商標）としてもまた知られている）、ボロシキシマブ（Ｍ２００としてもまた知られている）、ボツムマブ（ＨＵＭＡＳＰＥＣＴ（登録商標））としてもまた知られている、ザルツムマブ、ザノリムマブ（ＨｕＭＡＸ−ＣＤ４としてもまた知られている）、ジラリムマブ、またはゾリモマブアリトックスからなる群から選択される抗体と同一の標的と結合する、システイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質を含む。いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、先の抗体一覧から選択される抗体に由来する抗原結合領域を含む、システイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質を含む。
本明細書で開示されるコンジュゲート化合物は、例えば、ウイルス、細菌（例えば、マイコプラズマ）、真菌、または動物標的などの複数起源に由来する分子に特異的に結合しおよび／またはそれを組み込み得る。場合によっては、動物分子はヒト分子である。いくつかの態様では、本明細書で開示されるコンジュゲート化合物は、寄生生物（例えば、真菌、細菌、線虫（ｎｅｍｏｔｏｄｅｓ）など）に由来する分子に特異的に結合しおよび／またはそれらを組み込み得る。いくつかの態様では、分子は抗原である。したがって、いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は細菌抗原を標的化し得て、異種部分は抗細菌剤である。その他の態様では、標的はウイルス抗原であり、異種部分は抗ウイルス剤である。なおも別の態様では、コンジュゲート化合物は腫瘍抗原（例えば、ヒト腫瘍抗原）を標的化し得て、異種部分は抗腫瘍剤である。いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は真菌抗原を標的化し得て、異種部分は抗真菌剤である。いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は寄生生物抗原を標的化し得て、異種部分は抗寄生虫薬である。その他の態様では、コンジュゲート化合物はマイコプラズマ抗原を標的化し得て、異種部分は抗マイコプラズマ剤である。いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は分化抗原または組織適合性抗原を標的化し得て、異種部分は細胞毒性薬である。開示されるシステイン変異（アミノ酸位置２４１、２４３、２５１、２５３、２５８、２６４、２６９、２７１、２７２、２７４、２８０、２８１、２８５、２８８、２９１、２９３、２９４、２９６、３０１、３０７、３０９、３１１、３１８、３２９、３４０、３４１、３４５、３５７、３８５、３８６、３８７、４０１、４０２、４１１、４１７、４３３、４３５、または４３９における置換、位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入、および任意のそれらの組み合わせ）、および任意選択的に、当該技術分野で記載されるシステイン操作に適する追加的な位置における１つまたは複数のシステイン変異（例えば、アミノ酸位置２３９、２４８、２５４、２７３、２７９、２８２、２８４、２８６、２８７、２８９、２９７、２９８、３１２、３２４、３２６、３３０、３３５、３３７、３３９、３５０、３５５、３５６、３５９、３６０、３６１、３７５、３８３、３８４、３８９、３９８、４００、４１３、４１５、４１８、４２２、４４０、４４１、４４２、４４３および４４６における置換）を含むシステイン操作抗体およびＦｃ融合タンパク質は、当該技術分野で公知の方法に従って調製され得る。例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書を参照されたい。
例えば、開示されるシステイン変異をコードするＤＮＡなどの核酸は、当該技術分野で公知の多様な方法によって調製され得る。これらの方法としては、先に調製されたポリペプチドをコードするＤＮＡの部位特異的（またはオリゴヌクレオチド媒介）変異誘発、ＰＣＲ変異誘発、およびカセット変異誘発による調製が挙げられるが、これに限定されるものではない。組換え抗体およびＦｃ融合タンパク質の変異型はまた、制限酵素断片操作によっても、または合成オリゴヌクレオチドを用いたオーバーラップ伸長ＰＣＲによっても構築され得る。変異原性プライマーは、システインコドン置換をコードする。標準変異誘発技術を用いて、このような変異システイン操作抗体およびＦｃ融合タンパク質をコードするＤＮＡが作成され得る。一般的ガイダンスは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９；およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９９３．にある。
部位特異的変異誘発は、置換変異体、すなわち、変異タンパク質を調製する一方法である。この技術は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｃａｒｔｅｒ（１９８５）ｅｔ ａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：４４３１−４４４３；Ｈｏ ｅｔ ａｌ（１９８９）Ｇｅｎｅ（Ａｍｓｔ．）７７：５１−５９；およびＫｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８を参照されたい）。簡単に述べると、ＤＮＡの部位特異的変異誘発の実施において、出発ＤＮＡが、最初に、所望の変異をコードするオリゴヌクレオチドをこのような出発ＤＮＡの一本鎖にハイブリダイズさせることで、改変される。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡポリメラーゼを使用して、ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用し、出発ＤＮＡ一本鎖をテンプレートとして使用して、第２の鎖全体が合成される。このようにして、所望の変異をコードするオリゴヌクレオチドが、結果として生じる二本鎖ＤＮＡに組み込まれる。部位特異的変異誘発は、発現プラスミド中の変異誘発されるタンパク質を発現する遺伝子中で実施され得て、結果として生じるプラスミドを配列決定して、所望のシステイン置換変異の導入が確認され得る（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２０２５２−２０２６０）。例えば、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）複数部位特異的変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）などの市販のものをはじめとするプロトコルおよび形式の部位特異的。
ＰＣＲ変異誘発はまた、出発ポリペプチドのアミノ酸配列変異体を作成するのに適する。Ｈｉｇｕｃｈｉ，（１９９０）ｉｎ ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｐｐ．１７７−１８３，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ（１９９１）Ｇｅｎｅ １０２：６７−７０；Ｂｅｒｎｈａｒｄ ｅｔ ａｌ（１９９４）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：１２６−１３２；およびＶａｌｌｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ（１９８９）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：７２３−７３３を参照されたい。簡単に述べると、ＰＣＲにおいて少量のテンプレートＤＮＡが出発原料として使用される場合、テンプレートＤＮＡ中の対応する領域とわずかに配列が異なるプライマーを使用して、プライマーがテンプレートと異なる位置のみがテンプレート配列と異なる、特定のＤＮＡ断片が比較的大量に生成され得る。
変異体を調製する別の方法であるカセット変異誘発は、Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ（１９８５）Ｇｅｎｅ ３４：３１５−３２３によって記載される技術に基づく。出発原料は、変異させる出発ポリペプチドＤＮＡを含む、プラスミド（またはその他のベクター）である。変異させる出発ＤＮＡ中のコドンは、同定される。同定された変異部位の両側に、ユニークな制限エンドヌクレアーゼ部位がなくてはならない。このような制限酵素認識部位が存在しない場合、それらは、上述のオリゴヌクレオチド媒介変異誘発法を使用して、出発ポリペプチドＤＮＡ中の適切な部位にそれらを導入することで、作成され得る。プラスミドＤＮＡはこれらの部位で切断されて、直線化される。制限酵素認識部位間のＤＮＡ配列をコードするが、所望の変異を含有する二本鎖オリゴヌクレオチドが、標準手順を使用して合成され、その中では、標準技術を使用して、オリゴヌクレオチドの２本の鎖が別々に合成されて、次に共にハイブリダイズされる。この二本鎖オリゴヌクレオチドは、カセットと称される。このカセットは、それがプラスミドに直接ライゲートされ得るように、直線化プラスミド末端と適合性の５’および３’末端を有するように設計される。このプラスミドは、この時点で変異ＤＮＡ配列を含有する。コードされるシステイン置換を含有する変異ＤＮＡは、ＤＮＡ配列決定によって確認され得る。
単一変異はまたＰＣＲベースの変異誘発によって、テンプレートとして二本鎖プラスミドＤＮＡを使用する、オリゴヌクレオチド誘導変異誘発によっても作成される（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌ，（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｚｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８−５００；Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．（１９８２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：６４８７−６５００）。
本開示のシステイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、組換えＤＮＡ技術を使用して、いくつかの異なる様式でさらに修飾され得る。いくつかの態様では、例えば、マウスモノクローナル抗体などの抗体の軽鎖および重鎖の定常領域は、（１）例えば、ヒト抗体のこれらの領域によって置換されて、キメラ抗体が生成され、または（２）非免疫グロブリンポリペプチドによって置換されて、融合抗体が作成され得る。いくつかの態様では、定常領域は、トランケートまたは除去されて、モノクローナル抗体の所望の抗体断片が作成される。可変領域の部位特異的または高密度変異誘発を使用して、モノクローナル抗体の特異性、親和性などが最適化され得る。
ヒト抗体は、当該技術分野で公知の様々な技術を使用して、直接調製され得る。生体外で免疫化された、または標的抗原に対する抗体を生じる免疫化個体から単離された、不死化ヒトＢリンパ球が生成され得る（例えば、Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）；Ｂｏｅｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：８６−９５（１９９１）；および米国特許第５，７５０，３７３号明細書を参照されたい）。次に不死化Ｂリンパ球内で抗体をコードする１つまたは複数のｃＤＮＡが調製されて、抗体の非天然組換えバージョンの発現のために、発現ベクターおよび／または異種宿主細胞内に挿入され得る。
また、本明細書で開示されるシステイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質は、ファージライブラリーから選択され得て、そのファージライブラリーは、例えば、Ｖａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：３０９−３１４（１９９６）；Ｓｈｅｅｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５：６１５７−６１６２（１９９８）；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１（１９９１）、およびＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１（１９９１））に記載されるように、異種ファージタンパク質との融合タンパク質として、ヒト抗体またはそれらの断片を発現する。抗体ファージライブラリーを作成および使用する技術はまた、それぞれその内容全体が参照により援用される、米国特許第５，９６９，１０８号明細書、米国特許第５６，１７２，１９７明細書、米国特許第５，８８５，７９３明細書、米国特許第６，５２１，４０４明細書、米国特許第６，５４４，７３１明細書、米国特許第６，５５５，３１３明細書、米国特許第６，５８２，９１５明細書、米国特許第６，５９３，０８１明細書、米国特許第６，３００，０６４明細書、米国特許第６，６５３，０６８明細書、米国特許第６，７０６，４８４明細書；および米国特許第７，２６４，９６３にも記載される。
いくつかの態様では、本開示のシステイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質は、ヒト化抗体であり得る。非ヒトまたはヒト抗体を操作し、ヒト化しまたは表面再構成する方法も使用され得て、当該技術分野で周知である。ヒト化され、表面再構成されまたは同様に操作された抗体は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類またはその他の哺乳類をはじめとするが、これに限定されるものではない、非ヒト起源からの１つまたは複数のアミノ酸残基を有し得る。これらの非ヒトアミノ酸残基は、典型的に、「移入」残基と称されることが多い、公知のヒト配列の「移入」可変、定常またはその他のドメインから取り出された残基によって、置換される。技術分野で公知のように、このような移入配列を使用して、免疫原性を低下させ、または結合親和性、オン速度、オフ速度、結合活性、特異性、半減期、または任意のその他の適切な特性を低下させ、促進し、または操作させ得る。本明細書で開示されるシステイン操作抗体またはそれらの断片のヒト化、表面再構成または操作は、その中の参考文献を含めて、それぞれがその全体が参照により本明細書に援用される、Ｄａｍｓｃｈｒｏｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４：３０４９−３０６０（２００７）；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４（１９８８）），Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１（１９８７），Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３（１９９３）、米国特許第５，６３９，６４１号明細書；米国特許第５，７２３，３２３号明細書；米国特許第５，９７６，８６２号明細書；米国特許第５，８２４，５１４号明細書；米国特許第５，８１７，４８３号明細書；米国特許第５，８１４，４７６号明細書；米国特許第５，７６３，１９２号明細書；米国特許第５，７２３，３２３号明細書；米国特許第５，７６６，８８６号明細書；米国特許第５，７１４，３５２号明細書；米国特許第６，２０４，０２３号明細書；米国特許第６，１８０，３７０号明細書；米国特許第５，６９３，７６２号明細書；米国特許第５，５３０，１０１号明細書；米国特許第５，５８５，０８９号明細書；米国特許第５，２２５，５３９号明細書；米国特許第４，８１６，５６７、７，５５７，１８９号明細書；米国特許第７，５３８，１９５号明細書；および米国特許第７，３４２，１１０号明細書；国際公開第９０／１４４４３号パンフレット；国際公開第９０／１４４２４号パンフレット；国際公開第９０／１４４３０号パンフレット；国際公開第２００５／０４２７４３；号パンフレット国際公開第２００６／１０２０９５号パンフレット；および欧州特許第２２９２４６号明細書に記載されるものなどであるが、これに限定されるものではない、任意の公知の方法を使用して実施し得る。
ＩＶ．システイン操作抗体およびＦｃの発現および精製
融合タンパク質
特定の態様では、本開示は、開示されるシステイン変異（アミノ酸位置２４１、２４３、２５１、２５３、２５８、２６４、２６９、２７１、２７２、２７４、２８０、２８１、２８５、２８８、２９１、２９３、２９４、２９６、３０１、３０７、３０９、３１１、３１８、３２９、３４０、３４１、３４５、３５７、３８５、３８６、３８７、４０１、４０２、４１１、４１７、４３３、４３５、または４３９における置換、位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入、および任意のそれらの組み合わせ）を含むシステイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。これらのポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形態またはＤＮＡの形態であり得る。ＤＮＡとしては、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡが挙げられ；二本鎖または一本鎖であり得て、一本鎖であればコード鎖または非コード（アンチセンス）鎖であり得る。特定の態様では、非天然組換えシステイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質を生成するために使用されるＤＮＡは、ｃＤＮＡである。
特定の態様では、ポリヌクレオチドは、単離される。特定の態様では、ポリヌクレオチドは、実質的に純粋である。特定の態様では、ポリヌクレオチドは、同一読み枠内で、例えば、宿主細胞に由来するポリペプチドの発現および分泌を助けるポリヌクレオチド（天然または異種性のどちらか）（例えば、細胞からのポリペプチド輸送を制御するための分泌配列として機能するリーダー配列）に融合された、成熟ポリペプチドのコード配列を含む。リーダー配列を有するポリペプチはプレタンパク質であり、ポリペプチドの成熟形態形成するために、宿主細胞によって切断される、リーダー配列を有し得る。特定の態様では、ポリヌクレオチドが改変されて、特定の宿主細胞のためにコドン使用頻度が最適化される。
特定の態様では、ポリヌクレオチドは、同一読み枠内で、例えば、コードされるポリペプチドの精製を可能にする異種性マーカー配列に融合された、成熟システイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質のコード配列を含む。例えば、マーカー配列は、細菌宿主の場合、マーカーに融合された成熟ポリペプチドの精製を提供するために、ｐＱＥ−９ベクターによって供給されるヘキサヒスチジンタグであり得て、あるいは哺乳類宿主（例えば、ＣＯＳ−７細胞）が使用される場合、マーカー配列は、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来する赤血球凝集素（ＨＡ）タグであり得る。
ポリヌクレオチドは、コード領域、非コード領域、またはその双方に、改変を含有し得る。いくつかの態様では、これらのポリヌクレオチド変異体は、サイレント置換、付加、または欠失を生じる改変を含有するが、コードされるポリペプチドの性質または機能は変化させない。いくつかの態様では、ポリヌクレオチド変異体は、遺伝コードの縮重に起因するサイレント置換によって生じる。ポリヌクレオチド変異体はまた、例えば、特定の宿主のためにコドン発現を最適化する（ヒトｍＲＮＡ中のコドンを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌宿主にとって好ましいものに変更する）ためなどの多様な理由から、生成され得る。
いくつかの態様では、本明細書で開示されるシステイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、をオリゴヌクレオチド合成機使用して、化学合成によって構築され得る。このようなオリゴヌクレオチドは、所望のポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて設計され、関心のある組換えポリペプチドがその中で産生される、宿主細胞内で好まれるコドンが選択され得る。標準法を適用して、関心のある単離ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド配列が合成され得る。例えば、完全なアミノ酸配列を使用して、逆翻訳遺伝子が構築され得る。さらに、特定の単離ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有するＤＮＡオリゴマーが、合成され得る。例えば、所望のポリペプチドの部分をコードするいくつかの小型オリゴヌクレオチドが合成されて、次にライゲートされ得る。個々のオリゴヌクレオチドは、典型的に、相補的組み立てのための５’または３’オーバーハングを含有する。
本明細書に記載されるポリヌクレオチドを含むベクターおよび細胞もまた、提供される。ひとたび組み立てられると、（合成、部位特異的変異誘発または別の方法によって）、関心のある特定の単離ポリペプチド（例えば、システイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質）をコードするポリヌクレオチド配列は、発現ベクターに挿入されて、所望の宿主中のタンパク質発現に適する発現制御配列と作動可能に連結され得る。適切な組み立ては、ヌクレオチド配列決定、制限酵素マッピング、および適切な宿主内の生物活性ポリペプチドの発現によって確認され得る。当該技術分野で周知のように、宿主中で形質移入遺伝子の高い発現レベルを得るためには、遺伝子は、選択された発現宿主中で機能できる転写および翻訳発現制御配列と、作動可能に連結しなくてはならない。
特定の態様では、組換え発現ベクターを使用して、本明細書で開示されるシステイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質をコードするＤＮＡが増幅され、発現される。組換え発現ベクターは、例えば、抗ＨＥＲ２抗体のポリペプチド鎖またはおよびその抗原結合断片をコードする、合成されたまたはｃＤＮＡに由来するＤＮＡ断片を有して、哺乳類、微生物、ウイルスまたは昆虫遺伝子に由来する適切な転写または翻訳調節因子と作動可能に連結する、複製可能なＤＮＡコンストラクトである。転写単位は、通常、（１）例えば、転写プロモーターまたはエンハンサーなどの遺伝子発現において調節的役割を有する、１つまたは複数の遺伝要素、（２）ｍＲＮＡに転写されてタンパク質に翻訳される、構造配列またはコード配列、および（３）下で詳述される適切な転写および翻訳開始および終止配列の組み立てを含む。このような調節因子は、転写を制御するオペレーター配列を含み得る。多種多様な発現宿主／ベクターの組み合わせが用いられ得る。真核宿主のための有用な発現ベクターとしては、例えば、ＳＶ４０、ウシ乳頭腫ウイルス、アデノウイルスおよびサイトメガロウイルスからの発現制御配列を含む、ベクターが挙げられる。細菌宿主のための有用な発現ベクターとしては、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、およびそれらの誘導体をはじめとする、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からのプラスミドなどの公知の細菌プラスミド、Ｍ１３および繊維状一本鎖ＤＮＡファージなどの宿主域のより広いプラスミドが挙げられる。
システイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質の発現のための適切な宿主細胞としては、適切なプロモーターの制御下にある、原核生物、酵母、昆虫またはより高等な真核細胞が挙げられる。原核生物としては、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）または桿菌などのグラム陰性またはグラム陽性生物が挙げられる。より高等な真核細胞としては、下述されるような確立された哺乳類起源の細胞系が挙げられる。無細胞翻訳系もまた、用いられ得る。細菌、真菌、酵母、および哺乳類細胞宿主と共に使用するための適切なクローニングおよび発現ベクターは、その関連する開示が本明細書に参照により援用される、Ｐｏｕｗｅｌｓ ｅｔ ａｌ．（Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８５）によって記載される。抗体産生をはじめとする、タンパク質産生方法に関する追加的な情報は、例えば、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第２００８／０１８７９５４号明細書、米国特許第６，４１３，７４６号明細書、および米国特許第６，６６０，５０１号明細書、および国際公開第０４００９８２３号パンフレットにある。
本開示の組換えシステイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質を発現するために、様々な哺乳類または昆虫細胞培養系もまた、有利に用いられ得る。このようなタンパク質は、通常、正しく折り畳まれて、適切に修飾され、完全に機能性であるので、哺乳類細胞内における組換えタンパク質の発現が実施され得る。適切な哺乳類宿主細胞株の例としては、ＨＥＫ−２９３およびＨＥＫ−２９３Ｔ、Ｇｌｕｚｍａｎ（Ｃｅｌｌ ２３：１７５，１９８１）によって記載されるＣＯＳ−７系統のサル腎培養細胞、そして例えば、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＮＳＯ、ＨｅＬａ、およびＢＨＫ細胞株をはじめとする、その他の細胞株が挙げられる。哺乳類発現ベクターは、複製起点、発現される遺伝子と連結する適切なプロモーターおよびエンハンサー、およびその他の５’または３’フランキング非転写配列などの非転写要素、そして必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与体およびアクセプター部位、および転写終止配列などの５’または３’非翻訳配列を含み得る。昆虫細胞内で異種性タンパク質を作成するためのバキュロウイルスシステムは、Ｌｕｃｋｏｗ ＆ Ｓｕｍｍｅｒｓ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：４７（１９８８）によって概説される。
形質転換宿主によって産生されるシステイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質は、任意の適切な方法に従って精製され得る。このような標準法としては、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性およびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、示差溶解度、またはタンパク質精製のための任意のその他の標準的な技術が挙げられる。ヘキサヒスチジン、マルトース結合領域、インフルエンザ被覆配列、およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼなどの親和性タグをタンパク質に付着させて、適切なアフィニティカラムを通過させることによる容易な精製を可能にし得る。単離されたタンパク質はまた、タンパク質分解、核磁気共鳴、およびＸ線結晶構造解析などの技術を使用して、物理的に特性決定され得る。
例えば、組換えタンパク質を培養液中に分泌するシステムからの上清が、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットなどの市販のタンパク質濃縮フィルターを使用して、最初に濃縮され得る。濃縮ステップに続いて、濃縮物は、適切な精製マトリックスに装入され得る。いくつかの態様では、例えば、ペンダントジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を有する、マトリックスまたは基質などのアニオン交換樹脂が用いられ得る。マトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロースまたはタンパク質精製で一般に用いられるその他のタイプであり得る。いくつかの態様では、カチオン交換ステップが用いられ得る。適切なカチオン交換体としては、スルホプロピルまたはカルボキシメチル基を含む、様々な不溶性マトリックスが挙げられる。
それに加えて、または任意選択的に、例えば、ペンダントメチルまたはその他の脂肪族基を有するシリカゲルなどの疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒体を用いる、１つまたは複数の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）ステップを用いて、システイン操作抗体またはその断片がさらに精製され得る。前述の精製ステップの一部または全部を様々な組み合わせで用いて、均質な組換えタンパク質が提供され得る。
培養中で生成された組換えシステイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質は、例えば、細胞ペレットからの最初の抽出と、それに続く１つまたは複数の濃縮、塩析、水性イオン交換またはサイズ排除クロマトグラフィーステップによって単離され得る。最終的な精製ステップのために、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が用いられ得る。組換えタンパク質の発現で用いられる細胞は、凍結解凍サイクル、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用をはじめとする、任意の都合良い方法によって破壊され得る。抗体およびその他のタンパク質を精製するための当該技術分野で公知の方法としてはまた、例えば、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許公開第２００８／０３１２４２５号明細書、米国特許公開第２００８／０１７７０４８号明細書、および米国特許公開第２００９／０１８７００５号明細書に記載されるものも挙げられる。
Ｖ．異種部分とシステイン操作抗体およびＦｃ融合タンパク質とのコンジュゲーション
開示されるシステイン変異（アミノ酸位置２４１、２４３、２５１、２５３、２５８、２６４、２６９、２７１、２７２、２７４、２８０、２８１、２８５、２８８、２９１、２９３、２９４、２９６、３０１、３０７、３０９、３１１、３１８、３２９、３４０、３４１、３４５、３５７、３８５、３８６、３８７、４０１、４０２、４１１、４１７、４３３、４３５、または４３９における置換、位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入、および任意のそれらの組み合わせ）を含むシステイン操作抗体およびＦｃ融合物は、チオール反応性試薬を使用して、部位特異的にかつ効率的に、少なくとも１つの異種部分とカップリングされ得る。いくつかの態様では、非相同部分のコンジュゲーションは、本明細書で開示される１つまたは複数の位置（例えば、位置２４１、２４３、２５１、２５３、２５８、２６４、２６９、２７１、２７２、２７４、２８０、２８１、２８５、２８８、２９１、２９３、２９４、２９６、３０１、３０７、３０９、３１１、３１８、３２９、３４０、３４１、３４５、３５７、３８５、３８６、３８７、４０１、４０２、４１１、４１７、４３３、４３５、または４３９、または位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入）における少なくとも１つの操作システイン残基によって、および任意選択的に、当該技術分野で公知の１つまたは複数の位置（例えば、位置２３９、２４８、２５４、２７３、２７９、２８２、２８４、２８６、２８７、２８９、２９７、２９８、３１２、３２４、３２６、３３０、３３５、３３７、３３９、３５０、３５５、３５６、３５９、３６０、３６１、３７５、３８３、３８４、３８９、３９８、４００、４１３、４１５、４１８、４２２、４４０、４４１、４４２、４４３、および４４６）における少なくとも１つの操作システイン残基によって、提供されるチオール基で生じ得る。
異種部分を操作システイン残基に結合させるための様々な方法は、当該技術分野で公知である。このようなコンジュゲーション試薬は、典型的に、システイン（例えば、本発明の操作クステイン（ｃｓｔｅｉｎｅ）システイン）のシステインチオールと直接反応してコンジュゲート化合物を形成し、またはリンカー試薬と直接反応してリンカー標識中間体を形成し、またはリンカータンパク質と直接反応してコンジュゲート化合物を形成してもよい、反応性官能基を有する。使用されてもよいリンカー有機化学反応、条件、および試薬の事例としては、共有結合を介してタンパク質リンカー中間体を形成するシステイン基とリンカー試薬との反応と、それに続く活性化異種部分との反応；および共有結合を介して異種部分リンカー中間体を形成する異種部分とリンカー試薬との求核基反応と、それに続くシステイン基（例えば、本発明の操作システイン）との反応が挙げられるが、これに限定されるものではない。
特定の態様では、二官能価リンカーが、本発明で有用である。例えば、二官能価リンカーは、システイン残基に共有結合するためのチオール修飾基と、コンジュゲート化合物に共有結合または非共有結合するための少なくとも１つの付着部分（例えば、第２のチオール修飾部分）とを含む。本発明の化合物を調製するために、多様なタンパク質および化合物、（およびリンカー）が使用され得る。システインチオール基は求核性であり、（ｉ）ＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステルなどの活性エステル、ハロギ酸、および酸ハロゲン化物；（ｉｉ）ハロアセトアミドなどのアルキルおよびベンジルハロゲン化物；（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシル、およびマレイミド基；および（ｉｖ）スルフィド交換を介した、ピリジルジスルフィドをはじめとするジスルフィドをはじめとする、リンカー試薬または化合物−リンカー中間体または薬物上の求電子性基と反応して、共有結合を形成できる。異種部分またはリンカー上の求核性基としては、リンカー部分およびリンカー試薬上の求電子性基と反応して共有結合を形成できる、アミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン，チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボン酸塩、およびアリールヒドラジド基が挙げられるが、これに限定されるものではない。特定の態様では、標識試薬としては、マレイミド、ハロアセチル、ヨードアセトアミドスクシンイミジルエステル、イソチオシアン酸塩、塩化スルホニル、２，６−ジクロロトリアジニルが挙げられる。
非相同分子と、本明細書で開示されるシステイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質とのコンジュゲーションの効率は、コンジュゲーション反応後に残留する遊離チオールの存在を評価することで、判定され得る。遊離チオール基の存在は、技術分野で受け入れられている様々な技術によって、判定され得る。特定の態様では、本明細書の方法は、非相同部分の効率的コンジュゲーションを提供し、その中では、コンジュゲーション効率は、コンジュゲーション反応後に残留する遊離チオール基レベルによる測定で、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％以上である。
いくつかの態様では、本明細書の方法は、非相同部分と、ブロックまたはキャッピングされたスルフヒドリル基を含む遊離システイン残基を含有する、本明細書で開示されるシステイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質とのコンジュゲーションを提供する。このようなキャップとしては、スルフヒドリル基と相互作用して、コンジュゲート形成を防止または阻害する、タンパク質、ペプチド、イオンおよびその他の物質が挙げられる。いくつかの態様では、本明細書で開示されるシステイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質は、コンジュゲーション反応前に、キャップ離脱を要し得る。特定の態様では、システイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質は無キャップであり、コンジュゲーションできる遊離スルフヒドリル基を提示する。特定の態様では、本明細書で開示されるシステイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質は、天然ジスルフィド結合を乱さないまたは再配列しない、キャップ離脱反応を受ける。
いくつかの態様では、本明細書で開示されるシステイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質は、コンジュゲートされるシステイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質が、少なくとも１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２ｍｇ／ｍｌ、少なくとも３ｍｇ／ｍｌ、少なくとも４ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５ｍｇ／ｍｌ以上の濃度で存在する、コンジュゲーション反応を受け得る。
チオール反応性試薬は、例えば、多官能価リンカー試薬、捕捉（すなわち、親和性）標識試薬（例えば、ビオチンリンカー試薬）、検出標識（例えば、フルオロフォア試薬）、固相固定化試薬（例えば、セファロース（商標）、ポリスチレン、またはガラス）、または薬物リンカー中間体であり得る。チオール反応性試薬の一例は、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）である。代表的態様では、システイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質と、多官能価リンカー試薬との反応は、官能化リンカーとの中間コンジュゲート化合物を提供し、それは異種部分（例えば、薬物成分）とさらに反応させ得る。
このようなアプローチは、その中で、反応基が、例えば、マレイミド、ヨードアセトアミド、ピリジルジスルフィド、ハロアセチル、ヨードアセトアミドスクシンイミジルエステル（例えば、ＮＨＳ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）、イソチオシアン酸塩、塩化スルホニル、２，６−ジクロロトリアジニル、ペンタフルオロフェニルエステル、およびホスホラミダイト、またはその他のチオール反応性コンジュゲーションパートナーである、その他のチオール反応性因子とのコンジュゲーションに適用され得る（Ｈａｕｇｌａｎｄ，２００３，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｒｉｎｋｌｅｙ，１９９２，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．３：２；Ｇａｒｍａｎ，１９９７，Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ；Ｍｅａｎｓ（１９９０）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１：２；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．ｉｎ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９６）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ｐｐ．４０−５５，６４３−６７１）。
したがって、本明細書で開示されるシステイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質は、当該技術分野で公知のチオールコンジュゲーション方法を使用して、毒素、薬物、放射性核種、免疫修飾物質、サイトカイン、リンフォカイン、ケモカイン、増殖因子、腫瘍壊死因子、ホルモン、ホルモン拮抗薬、酵素、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、マイクロＲＮＡ、ペプチド核酸、光活性治療薬、血管新生阻害剤、アポトーシス促進剤、非天然アミノ酸、ペプチド、脂質、炭水化物、足場分子、蛍光性タグ、可視化ペプチド、ビオチン、血清半減期延長剤、捕捉タグ、キレート化剤、固体担体、またはそれらの組み合わせなどの少なくとも１つの異種部分にコンジュゲートされ得て、コンジュゲーションは操作システインの１つにある。
ＶＩ．医薬組成物
本開示は、希釈剤、担体、または賦形剤と共に調合される、本明細書で開示される少なくとも１つのコンジュゲート化合物を含む製剤を提供する。本開示は、薬学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤と共に調合される、本明細書で開示される少なくとも１つのコンジュゲート化合物を含む医薬組成物もまた提供する。このような製剤または医薬組成物は、例えば、２つ以上異なるコンジュゲート化合物の１つまたは組み合わせを含み得るが、これに限定されるものではない。例えば、本明細書で開示される製剤または医薬組成物は、例えば、異なるエピトープなどの、または相補的活性を有するものなどの、異なる標的と結合する、コンジュゲート化合物の組み合わせを含み得る。
本明細書で開示されるコンジュゲート化合物を含む、薬剤または無菌組成物を調製するために、コンジュゲート化合物は、薬学的に許容できる担体または賦形剤と混合され得る。治療薬および診断薬の調合物は、生理学的に許容される担体、賦形剤、または例えば、凍結乾燥粉末、スラリー、水溶液、ローション、または懸濁液の形態の安定剤と混合することで、調製され得る。
本明細書で開示されるコンジュゲート化合物を含む医薬組成物はまた、その他の因子との組み合わせなどの併用療法で投与され得る。例えば、併用療法は、外科手術、免疫療法、化学療法、放射線治療、または薬物療法であり得る、少なくとも１つの他の治療法と組み合わされた、本明細書で開示されるコンジュゲート化合物を含み得る。
薬剤化合物は、１つまたは複数の薬学的に許容される塩を含み得る。このような塩の例としては、酸付加塩および塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩としては、塩化水素、硝酸、リン酸，硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸亜リン酸などの無毒の無機酸に由来するもの、ならびに脂肪族モノおよびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などの無毒の有機酸に由来するものが挙げられる。塩基付加塩としては、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどのアルカリ土類金属などに由来するもの、ならびにΝ、Ν’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどの無毒の有機アミンに由来するものが挙げられる。
医薬組成物はまた、薬学的に許容される抗酸化剤を含み得る。薬学的に許容される抗酸化剤の例としては、（１）アスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどの水溶性抗酸化剤；（２）パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなどの油溶性抗酸化剤；および（３）、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などの金属キレート化剤が挙げられる。
本明細書で開示される医薬組成物で用いられ得る適切な水性および非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルが挙げられる。例えば、レシチンなどのコーティング材の使用によって、分散体の場合は必要な粒度の維持によって、および界面活性剤の使用によって、適切な流動性が保たれ得る。
これらの医薬組成物はまた、保存料、湿潤剤、乳化剤、および分散剤などの補助剤を含有し得る。微生物の存在防止は、滅菌手順と、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの様々な抗菌性および抗真菌剤の包含との双方によって、確実にされ得る。組成物に、糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を含めることもまた、望ましくあってもよい。さらに、注射用医薬製剤の持続的吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの遅延吸収剤の包含によって、もたらされ得る。
医薬組成物は、製造および保管条件下で、無菌および安定性であり得る。組成物は、溶液、マイクロエマルション、リポソーム、または高薬物濃度に適切なその他の規則正しい構造として調合され得る。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物を含有する、溶媒または分散媒であり得る。例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散体の場合は必要な粒度の維持によって、および界面活性剤の使用によって、適切な流動性が保たれ得る。多くの場合、組成物に、例えば、糖、マンニトールやソルビトールなどのポリアルコール、または塩化ナトリウムなどの等張剤を含めることが適切であり得る。注射用組成物の持続的吸収は、組成物に、例えば、モノステアリン酸塩、およびゼラチンなどの吸収を遅延させる薬剤を含めることでもたらされ得る。
無菌注射液は、必要に応じて、上に列挙した成分の１つまたは組み合わせに、適切な溶媒中の必要な量の活性化合物を組み込み、続いて滅菌精密濾過することで調製され得る。通常、分散体は、基礎的分散媒および上に列挙したものからの必要なその他の成分を含有する無菌ビヒクルに、活性化合を組み込むことで調製される。滅菌注射液の調製のための無菌粉末の場合、適切な調製法としては、活性成分と、あらかじめ滅菌濾過された溶液からの任意の追加的な所望の成分との粉末をもたらす、真空乾燥および凍結乾燥（凍結乾燥）が挙げられる。
一態様では、本明細書の組成物は、内毒素および／または関連発熱性物質を実質的に含まない、発熱性物質非含有製剤である。内毒素としては、微生物内部に閉じ込められて、微生物が分解されまたは死滅すると放出される、毒素が挙げられる。発熱性物質としてはまた、細菌およびその他の微生物外膜からの発熱誘導熱安定性物質（糖タンパク質）も挙げられる。これらの物質のどちらも、ヒトに投与されると、発熱、低血圧およびショックを引き起こし得る。潜在的有害効果のために、少量の内毒素でさえも静脈内投与される医薬品溶液から、適切に除去され得る。食品医薬品局（「ＦＤＡ」）は、静脈内薬物用途のための単一１時間内の体重１キログラムあたりの用量につき、５内毒素単位（ＥＵ）の上限を設定する。治療用タンパク質が体重１キログラムあたり数百または数千ミリグラムの量で投与される場合、内毒素の痕跡量でさえも適切に除去されてもよい。
一態様では、組成物中の内毒素および発熱性物質レベルは、１０ＥＵ／ｍｇ未満、５ＥＵ／ｍｇ未満、１ＥＵ／ｍｇ未満、０．１ＥＵ／ｍｇ未満、０．０１ＥＵ／ｍｇ未満、または０．００１ＥＵ／ｍｇ未満である。特定の実施形態では、組成物中の内毒素および発熱性物質レベルは、約１０ＥＵ／ｍｇ未満、約５ＥＵ／ｍｇ未満、約１ＥＵ／ｍｇ未満、または約０．１ＥＵ／ｍｇ未満、約０．０１ＥＵ／ｍｇ未満、または約０．００１ＥＵ／ｍｇ未満である。
（ＶＩＩ）診断法
特定の態様では、本明細書で報告されるコンジュゲート化合物は、診断アッセイのために、生体内および／または生体外で使用され得る。このような診断アッセイは、例えば、（ｉ）疾患または障害の存在または不在の検出、（ｉｉ）（がんなどであるが、これに限定されるものではない）疾患または障害の発症または進行のモニタリングまたは予後診断するステップ、（ｉｉｉ）特定の治療法お有効性を判定するなどの臨床試験順、または（ｉｖ）特定の治療法のための候補患者の同定を含む。
いくつかの態様では、本明細書で開示される技術は、このような分子を含有することが疑われる、サンプル中の関心のある標的分子の存在を判定する方法を提供する。いくつかの態様では、方法は、サンプルを本明細書で開示されるコンジュゲート化合物に曝露させるステップと、コンジュゲート化合物と、サンプル中の関心のある標的分子との結合を判定するステップとを含み、コンジュゲート化合物と、サンプル中の関心のある標的分子との結合は、サンプル中の関心のある標的分子の存在の指標となる。いくつかの態様では、サンプルは、生物学的サンプルである。特定の態様では、生物学的サンプルは、関心のある標的分子に関連する疾患または障害を経験している、または経験していることが疑われる、哺乳類に由来する。
例えば、本明細書で開示されるコンジュゲート化合物と、関心のある標的分子（例えば、細胞表面の標的）との結合の検出は、
（ａ）コンジュゲート化合物および関心のある標的分子の間の複合体の形成を可能にする条件下で、任意選択的に対照サンプルと並べて、試験されるサンプル（例えば、細胞）をコンジュゲート化合物に曝露させるステップと；
（ｂ）コンジュゲート化合物と、標的分子との結合程度を判定するステップと
によって達成され得る。
本明細書で開示されるコンジュゲート化合物は、コンジュゲート化合物を対象に投与するステップを含む、それを必要とする対象において、がん、自己免疫、炎症性、または伝染性疾患または障害を検出する方法で使用され得る。コンジュゲート化合物と標的の間の複合体形成は、例えば、ＥＬＩＳＡを使用して検出され得る。試験サンプルと並んで対照サンプルを使用する場合、双方のサンプルで複合体が検出され得て、複合体形成におけるサンプル間の任意の統計的有意差が、試験サンプル中の関心のある標的分子の存在の指標となる。
特定の態様では、生体内診断アッセイを使用して、本明細書で開示されるコンジュゲート化合物を使用して、関心のある標的分子の過剰発現または増幅が検出され得る。いくつかの態様では、コンジュゲート化合物がサンプルに添加され、コンジュゲート化合物は、検出可能標識（例えば、放射性同位体または蛍光標識）で標識される、検出される関心のある標的分子に結合して、患者は、標識の局在化について外部からスキャニングされる。ＩＮＦＯＲＭ（商標）（Ｖｅｎｔａｎａ，Ａｒｉｚ．によって販売される）またはＰＡＴＨＶＩＳＩＯＮ（商標）（Ｖｙｓｉｓ，ＩＩＩ）などのＦＩＳＨアッセイは、ホルマリン固定パラフィン包埋組織上で実施されて、例えば、腫瘍中における、関心のある標的分子の過剰発現の程度（存在する場合）が判定され得る。
特定の態様では、本明細書で開示されるコンジュゲート化合物は、関心のある標的分子の細胞発現の増大に関連する、細胞増殖性疾患を診断する方法で使用され得る。いくつかの態様では、方法は、生物学的サンプル中の試験細胞を本明細書で開示されるコンジュゲート化合物に接触させるステップと；本明細書で開示されるコンジュゲート化合物の結合を検出することで、サンプル中の試験細胞内の関心のある標的分子のレベルを判定するステップと；対照サンプル中の細胞と結合するコンジュゲート化合物のレベルを比較するステップとを含み、コンジュゲート化合物結合のレベルは、試験および対照サンプル中の関心のある分子を発現する細胞数に対して正規化され、対照サンプルと比較した試験サンプル中のコンジュゲート化合物結合のより高いレベルは、関心のある標的分子を発現する細胞に関連する細胞増殖性疾患の存在を示唆する。
特定の態様では、本明細書で開示されるコンジュゲート化合物は、血液または血清中の関心のある可溶性分子を検出する方法で使用され得る。いくつかの態様では、方法は、関心のある分子関連障害を経験していることが疑われる哺乳類からの血液または血清の試験サンプルを本明細書で開示されるコンジュゲート化合物に接触させて、正常な哺乳類からの血液または血清対照サンプルと比較した、試験サンプル中の関心のある可溶性分子の増大を検出するステップを含む。いくつかの態様では、検出する方法は、哺乳類の血液または血清中の関心のある可溶性分子の増大に関連した障害を診断する方法として有用である。
特定の態様では、本明細書で開示されるコンジュゲート化合物は、（ｉ）ＭＲＩ（磁気共鳴イメージング）；（ｉｉ）ＭｉｃｒｏＣＴ（コンピュータ断層撮影）；（ｉｉｉ）ＳＰＥＣＴ（単光子放射型コンピュータ断層撮影法）；（ｉｖ）ＰＥＴ（陽電子放出断層撮影）（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１５：４１−４９を参照されたい）；（ｖ）生物発光；（ｖｉ）蛍光；および（ｖｉｉ）超音波などの生物医学的および分子イメージングの様々な方法および技術によって、イメージング生物マーカーおよびプローブとして使用され得る。免疫シンチグラフィーは、放射性物質で標識された抗体来化合物が動物またはヒト患者に投与されて、体内の抗体局在部位の画像が撮影されるイメージング手順である（米国特許第６，５２８，６２４号明細書）。イメージング生物マーカーは、正常生物学的過程、発病過程、または治療的介入に対する薬理学的応答の指標として、客観的に測定され評価され得る。イメージング生物マーカーは、（ｉ）標的タンパク質の発現、（ｉｉ）治療的タンパク質と、標的タンパク質との結合、すなわち、選択性、および（ｉｉｉ）クリアランスおよび半減期薬物動態データに関する薬力学（ＰＤ）治療的情報を提供し得る。
ＶＩＩＩ．治療法
本開示は、本明細書で開示されるコンジュゲート化合物を対象に投与するステップを含む、それを必要とする対象において、がん、自己免疫、炎症性、または伝染性疾患または障害を治療する方法もまた提供する。いくつかの態様では、方法は、例えば、化学療法、生物学的療法、免疫療法、放射線療法、ホルモン療法、および外科手術である、追加的な治療法を投与するステップをさらに含む。例えば、細胞を本明細書で開示されるコンジュゲート化合物で処理するステップを含む、治療薬などの異種部分を細胞に送達する方法もまた提供される。いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、細胞によって内在化され得る。
様々な態様において、本明細書で開示されるコンジュゲート化合物は、例えばがん細胞などの細胞に投与され得る。コンジュゲート化合物の生物学的効果は、例えば、細胞死、細胞増殖阻害、効果の欠如、細胞形態の変化、または酒蔵（ｃｅｌｌａｒ）増殖パターンの変化であり得る。いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は、上述されるような検出可能標識を含む。特定の態様では、標識は、細胞内の腫瘍抗原の位置を示す。
特定の態様では、コンジュゲート化合物が、治療を必要とする対象に投与され得る。様々な態様では、コンジュゲート化合物は、腫瘍抗原を標的化する薬物または毒素標的を保有する。いくつかの態様では、コンジュゲート化合物は検出可能標識を有し、それによって、例えば、抗原などの標的が同定または位置確認される。いくつかの態様は、例えば、コンジュゲート化合物の治療影響（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｆｆｅｃｔ）などの生物学的効果の検出を含む。特定の態様では、対象の病状がモニターされ得る。コンジュゲート化合物の服用量はモニタリングに応えて調節され得る。
本明細書で開示されるコンジュゲート化合物および同物質を含む組成物は、例えば、自己免疫および／または炎症性疾患、良性または悪性腫瘍などの過剰増殖性障害、白血病およびリンパ系悪性腫瘍；ウイルス、細菌および真菌疾患をはじめとする感染症をはじめとするが、これに限定されるものではない、広範な慢性および急性疾患および障害を予防、管理または治療するための治療薬などの多くの目的で有用である。いくつかの態様では、本明細書で開示される組成物および方法は、上記疾患および障害を予防、管理または治療するために使用される、１つまたは複数の従来の治療法と共に使用され得る。いくつかの態様では、本明細書で開示されるコンジュゲート化合物を使用して、ウイルス、真菌、真核微生物、および細菌などの様々な感染性因子を不活性化する方法もまた提供される。
いくつかの態様では、本明細書で開示されるコンジュゲート化合物および同物質を含む組成物を使用して、細胞数を減少させる方法もまた提供される。一態様では、本明細書の方法は、以下の細胞型の減少で使用され得る：好酸球、好塩基球、好中球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、肥満細胞、単球、内皮細胞、および腫瘍細胞。
特定の態様では、本明細書で開示されるコンジュゲート化合物および同物質を含む組成物はまた、疾患またはそれらの症状（ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｔｈｅｒｅｏｆ）の診断および検出において有用であり得る。いくつかの態様では、組成物は、疾患進行のモニタリングに有用であり得る。様々な態様では、組成物は、治療計画のモニタリングに有用であり得る。特定の態様では、組成物は、診断キットなどの生体外用途での診断に有用である。
いくつかの態様では、本明細書で開示されるコンジュゲート化合物および同物質を含む組成物は、内部移行する細胞表面受容体である抗原を標的化し得る。特定の態様では、標的抗原は、細胞外抗原である。いくつかの態様では、標的は、核内抗原である。いくつかの態様では、本明細書で開示されるコンジュゲート化合物は、ひとたび結合すると細胞内に取り込まれ、内部移行は、対照抗体を少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１１０％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１４０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１６０％、または少なくとも約１７０％上回る。
特定の実施形態では、本明細書で開示されるコンジュゲート化合物は、ひとたび結合すると細胞内部に取り込まれ、内部移行は、対照抗体を１〜１０％、１０〜２０％、２０〜３０％、３０〜４０％、４０〜５０％、５０〜６０％、６０〜７０％、７０〜８０％、８０〜９０％、９０〜１００％、１００〜１１０％、１１０〜１２０％、１２０〜１３０％、１３０〜１４０％、１４０〜１５０％、１５０〜１６０％、１６０〜１７０％上回る。
ＩＸ．キット
本開示は、例えば、本明細書で開示されるコンジュゲート化合物を含むキットなどの製品もまた提供し、それは、本明細書に記載される方法を実施するために使用され得る。特定の態様では、キットは、１つまたは複数の容器内の少なくとも１つの精製コンジュゲート化合物を含む。いくつかの態様では、キットは、全ての対照、アッセイを実施するための指示、そして例えば、結果を解析および提示するための任意の必要なソフトウェアをはじめとする、検出アッセイを遂行するのに必要なおよび／または十分な全ての構成要素を含有する。当業者は、本明細書で開示されるコンジュゲート化合物が、当該技術分野で周知である確立されたキット形式の１つに、容易に組み込まれ得ることを容易に認識するであろう。いくつかの態様では、キットは、容器と、容器上のまたはそれに随伴するラベルまたは添付文書とを含む。適切な容器としては、例えば、瓶、バイアル、シリンジ、ブリスター包装などが挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの多様な材料から形成され得る。いくつかの態様では、容器は、特定の疾患または病状を治療するのに効果的である、本明細書で開示されるコンジュゲート化合物を含む組成物を保持し得て、無菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する、静脈注射用溶液バッグまたはバイアルであり得る）。ラベルまたは添付文書は、組成物ががんなどの選択された病状の治療のために使用されることを示し得る。代案としては、またはそれに加えて、キットは、静菌注射用水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水、リンゲル液、およびデキストロース溶液などの薬理的に許容可能な緩衝液を含む、第２の（または第３の）容器をさらに含み得る。キットは、その他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、およびシリンジをはじめとする、商業的および使用者観点から望ましいその他の材料をさらに含み得る。
上記の全ての参考文献、ならびに本明細書の全ての参考文献は、その内容全体を参照によって本明細書に援用する。
以下の実施例は、制限としてではなく例証として提供される。
実施例１
Ｆｃシステインスキャニング
ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ変異誘発を使用して、Ｆｃ領域の１８７個のアミノ酸が、個々にシステインに変異された。発現および凝集レベルは、ハイスループット小規模形質移入および発現系によって検査された。コンジュゲーション効率は、最初に、ＰｈｙＮｅｘｕｓ Ｍｉｃｒｏ−Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ自動化装置を使用して、ハイスループット自動化固相コンジュゲーション法で調べられ、Ｆｃ−Ｔ２８９のコンジュゲーション効率に対して正規化された。（このアッセイでは、Ｆｃ−Ｔ２８９Ｃは、９５％を超えるコンジュゲーション効率を有する。）
手動液相中規模コンジュゲーションを実施して、変異体のコンジュゲーション効率が、Ｔ２８９Ｃで見られたものの少なくとも約５０％のコンジュゲーション効率を有することが確認された。Ｆｃ変異体は振盪フラスコ内で発現されて、馴化培地中の発現レベルが判定された。Ｆｃ変異体はプロテインＡ上で精製されて、凝集レベルはＳＥＣによって分析された。
表２は、Ｐｈｙｎｅｘｕｓ法におけるＴ２８９Ｃの少なくとも５０％のコンジュゲーション効率を有する変異体について、コンジュゲーションおよび小規模発現データを示す。＞１００％のコンジュゲーション効率は、太字および下線付であり；８０〜１００％は、下線付きであり；５０〜８０％は、普通テキストである。コンジュゲーション効率が５０％より低いクローンは、図示されない。表３にはまた、手動液相コンジュゲーションを使用して判定された、選択された変異体のコンジュゲーション効率も示される。表３は、選択された変異体の発現レベルおよびパーセントモノマー含有量を示す
Ｅ２５８ＣおよびＨ４３５ＣのＡＦ４８８とのコンジュゲーション効率はまた、質量分析法によっても測定され、以前報告されたＦｃ変異体Ｓ２３９Ｃ、Ｔ２８９Ｃ、および軽鎖変異体Ｖ２０５Ｃ（本明細書でＬＣ−Ｖ２０５Ｃと称される）の効率と比較された。表４で要約されるように、全ての変異体は、ほぼ１００％のコンジュゲーション効率を有する（ＤＡＲ＝２は、１００％コンジュゲーションである）。陰性対照（すなわち、操作システイン残基なし）として、野性型抗体が含まれる。
これらの研究を見ても分かるように、下の表２に示される部位の大部分に組み込まれたシステインは、少なくとも約５０のコンジュゲーション効率を有して、良好に発現される。これらの部位は、抗体またはＦｃ融合タンパク質コンジュゲートを作成するのに、有用であってもよい。具体的には、２５８、２７４、２８６、２８９、２９１、２９３、２９６、３１８、３２９、３４０、３４１、３４２、３４５、４０１、４１５、４３３、４３５、および４４３をはじめとするいくつかの位置の操作システインは、片方または双方のアッセイ形式で非常に高いコンジュゲーション効率を示し、良好に発現される。これらの部位の１つまたは複数における操作システイン残基の使用が、部位特異的抗体またはＦｃ融合タンパク質コンジュゲートの効率的な作成のために検討される。
Figure 2017512486
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実施例２
挿入変異体および初期血清安定性スクリーニング
実施例１に記載されるシステイン置換に加えて、その中でシステイン残基が、残基２３９および２４０の間（Ｃ２３９ｉｎｓと称される）、または残基２３８および２３９の間（２３８−ｉｎｓと称される）に挿入される、２つの挿入変異体が作成される。Ｃ２３９ｉｎｓは、Ｔ２８９Ｃと同等のコンジュゲーション効率を示した（表６を参照されたい、データ未掲載）。Ｖ２４０Ｃ変異のコンジュゲーション効率は非常に低かった（わずか訳１１％）ので、これは予想外であった。
これらの変異型のいくつかの血清安定性が調べられた。初期安定性アッセイでは、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８Ｃ５マレイミド（ＡＦＦ４８８）が、代用薬物積荷として、選択された部位にコンジュゲートされ、分析を容易にした。サンプルは、正常ヒト血清（ＮＨＳ）またはＰＢＳ緩衝液と共に３〜７日間培養された。ＮＨＳまたはＰＢＳとの培養後に、蛍光サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）アッセイが使用されて、ＡＦＦ４８８を含有するコンジュゲートの安定性がモニターされた。ＩｇＧピーク中に残留するパーセント蛍光を使用して、安定性が推定された。ヒト血清と共に培養されたサンプルでは、血清中の薬物交換の優勢な受容体であるヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に移入されたＡＦ４８８の百分率は、ＨＳＡピーク中のシグナルのパーセントとして直接測定され得る。図２〜８は、それぞれ、変異体Ｅ２５８Ｃ、Ｈ４３５Ｃ、Ｌ４４３Ｃ、Ｃ２３９ｉｎｓ、Ｓ２３９Ｃ、ＬＣ−Ｖ２０５Ｃ、およびＴ２８９ＣのＳＥＣプロファイルを示し、０日目（パネルＡおよびＢ）および７日目（パネルＣおよびＤ）における、ＮＨＳ（パネルＡおよびＣ）およびＰＢＳ（パネルＢおよびＤ）と共に培養されたサンプルが含まれる。これらの研究結果は、図９にプロットされ、表５に要約される。
これらの研究で試験された４つのコンジュゲーション部位（Ｅ２５８Ｃ、Ｈ４３５Ｃ、Ｌ４４３Ｃ、およびＣ２３９ｉｎｓ）は、先に報告されたＬＣ−Ｖ２０５ＣおよびＳ２３９Ｃ変異体を含むいくつかの抗体で観察された安定性と同様に、７日間の血清培養後に、少なくとも７０％のコンジュゲート化合物が無傷であることが分かった（表５を参照されたい）。
Figure 2017512486
実施例３
Ｆｃ受容体結合および熱安定性測定
いくつかの変異体と、多様なＦｃ受容体との結合が試験された。ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、Ｅ２５８Ｃ、Ｓ２３９Ｃ、Ｃ２３９ｉｎｓ、およびＬＣ−Ｖ２０５Ｃと、ＦｃＲｎとの結合は、野性型（ＷＴ）と同等であった（図１０Ａ）。さらに、Ｅ２５８Ｃ、ＬＣ−Ｖ２０５Ｃ、およびＳ２３９Ｃと、ＦｃＲｎとの結合は、Ａ４８８にコンジュゲートされた場合、本質的に同一であった（図１０Ｂ）。これらのデータは、これらの変異体が、薬物にコンジュゲートされた場合でさえも、ＦｃＲｎ結合に影響を及ぼさないことを示す。対照的に、Ｈ４３５Ｃ変異は、ＦｃＲｎ結合を消滅させ（データ未掲載）、これは、位置ＥＵ４３５の正荷電残基がＦｃＲｎ結合に必須であるという、以前報告された観察に対応する。
ＢＩＡＣＯＲＥ解析を実施して、Ｃ２３９ｉｎｓ、Ｓ４４２Ｃ、およびＬ２３４Ｆ／Ｓ２３９Ａ／Ｓ４４２Ｃ三重変異と、ヒトＦｃ受容体、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ（１５８Ｖおよび１５８Ｆ対立遺伝子の双方）、およびＦｃＲｎとの親和性が判定された。図１１で報告されるデータは、Ｃ２３９ｉｎｓがＦｃγＲＩとの結合を低下させ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ（１５８Ｖおよび１５８Ｆ対立遺伝子の双方）との結合を消滅させるが、ＦｃＲｎ結合への影響は微々たるものであることを示す。対照的に、Ｓ４４２Ｃは、試験されたあらゆるＦｃ受容体との結合に対して、わずかな影響を有した。予測されたように、特定のＦｃγＲｓとの結合を低下させることが報告された変異体であるＬ２３４ＦおよびＳ２３９Ａの追加は、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ（１５８Ｖおよび１５８Ｆ対立遺伝子の双方）とのはるかにより低下した結合をもたらした。したがってＣ２３９ｉｎｓ変異は、エフェクター機能が望ましくない場合における、部位特異的抗体またはＦｃ融合コンジュゲートの作成に、特に有用であってもよい。
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を使用して、野性型（ＷＴ）との比較で、Ｅ２５８Ｃ、Ｓ２３９Ｃ、ＬＣ−Ｖ２０５Ｃ、Ｃ２３９ｉｎｓ、およびＨ４３５Ｃの熱安定性が調べられた。図１２に示されるように、Ｅ２５８Ｃ、Ｓ２３９Ｃ、およびＬｃ−Ｖ２０５Ｃ変異体のＤＳＣプロファイルは、ＷＴと本質的に同一であり、ＤＳＣによる測定で、これらの変異が、モデル１Ｃ１ ＩｇＧ１の熱安定性に影響を及ぼさないことが示唆された。新しいより低い融解ピークが、Ｃ２３９ｉｎｓおよびＨ４３５Ｃの双方で出現したが、Ｔｍ１は、双方の変異体でなおも６０℃を超えており、これらの変異の熱安定性に対する最小の影響のみが示唆される。
実施例４
単一変異毒素コンジュゲート−細胞毒性の血清安定性
１Ｃ１−Ｆｃ−Ｃｙｓ変異体コンジュゲート：２薬物／Ａｂが、細胞毒性アッセイにおいて血清安定性について試験された：１Ｃ１−Ｓ２３９Ｃ、１Ｃ１−Ｅ２５８Ｃ、１Ｃ１−Ｈ４３５Ｃ、１Ｃ１−Ｌ４４３Ｃ、１Ｃ１−ＬＣ−Ｖ２０５Ｃ、１Ｃ１−２３９ｉｎｓ、および１Ｃ１−Ｔ２８９Ｃ。古典的コンジュゲーションを使用して調製された６薬物／Ａｂ対照である１Ｃ１−ｃｃＡＤＣ、細胞毒性アッセイ陰性対照であるＲ３４７−Ｓ２３９Ｃ、および非コンジュゲートの機能を果たす１Ｃ１−ＷＴもまた試験された。各抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、オーリスタチンベースの毒素を含む。
表６に示されるように、各ｃｙｓ変異体は、わずか２％の背景コンジュゲーションを示す野性型とは対照的に、８８〜９８％のコンジュゲーション効率を有する。ＡＤＣは、下の実施例６に記載されるように、血清と共に０、３または７日間培養されて、細胞毒性についてアッセイされた。単一変異体および対照のそれぞれの細胞毒性曲線は、図１３Ａ、Ｂ、およびＣ（それぞれ０、３、および７日目）にプロットされる。ＥＣ50値もまた、プロットの下の表に提供される。この研究からの全てのデータは表７に要約され、３および７日目のＥＣ50損失倍数が提供される。
１Ｃ１−Ｅ２５８Ｃ−ＡＤＣ、１Ｃ１−Ｈ４３５Ｃ−ＡＤＣ、１Ｃ１−Ｌ４４３Ｃ−ＡＤＣ、および１Ｃ１−２３９ｉｎｓ−ＡＤＣは、血清培養後に安定しており、マレイミド化学反応を使用して結合された場合、血清中で安定していると報告されたその他の部位（例えば、ＬＣ−Ｖ２０５Ｃ）と同等であった。これらの変異体のＥＣ50は、７日間の血清培養後でさえ保持された１Ｃ１−Ｔ２８９Ｃ−ＡＤＣは、いくらかの活性を失った。表７を参照されたい。１Ｃ１−２３８−ｉｎｓ−ＡＤＣを使用して、同様の研究が実施されが、この変異は、７日間で６．２５倍を超えるＥＣ50損失を示し（データ未掲載）、この部位におけるマレイミド化学反応を使用したコンジュゲートが安定しておらず、血清中での培養に際して迅速に活性を失うことが示唆された。
ＥＵ位置２５８、４３５、および４４３（Ｅ２５８Ｃ、Ｈ４３５Ｃ、Ｌ４４３Ｃ）にあるＦｃ領域内の４つの操作システイン部位、およびＥＵ位置２３９および２４０（２３９ｉｎｓ）の間に位置する新たに操作された挿入部位は、コンジュゲーションにとって高度にアクセスでき（ｈｉｇｈ ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ）、代表的血清安定性を有すると同定された。
Figure 2017512486
Figure 2017512486
実施例５
二重Ｃｙｓ変異毒素コンジュゲート−細胞毒性の血清安定性
特定の用途では、抗体あたり２つを超える薬物を有することが望ましいことがある（すなわち、４以上のＤＡＲ）。上に記載されるＣｙｓ変異体は、互いに、および／または場合によっては、Ｆｃ媒介エフェクター機能を取り除くための変異体Ｌ２３４Ｆ−Ｌ２３５Ｆ（「ＦＦ」と称される）をはじめとするその他の変異体と共に、様々な組み合わせで試験されて、実施例６に記載される細胞毒性アッセイを使用して、血清安定性について試験された。１Ｃ１−Ｆｃ−２Ｃｙｓ変異体およびコンジュゲート：４薬物／Ａｂコンジュゲートが、細胞毒性アッセイにおいて、血清安定性について試験された：１Ｃ１−２３９ｉｎｓ−Ｅ２５８Ｃ、１Ｃ１−２３９ｉｎｓ−Ｈ４３５Ｃ、１Ｃ１−２３９ｉｎｓ−Ｓ４４２Ｃ、１Ｃ１−ＦＦ−Ｅ２５８Ｃ−Ｈ４３５Ｃ、１Ｃ１−ＦＦ−Ｅ２５８Ｃ−Ｓ４４２Ｃ、および１Ｃ１−ＦＦ−Ｈ４３５Ｃ−Ｓ４４２Ｃ。細胞毒性アッセイのための１Ｃ１−Ｔ２８９Ｃ−２薬物／Ａｂ比較物質、およびＲ３４７−Ｓ２３９Ｃ−２薬物／Ａｂ陰性対照もまた含まれた。全てのＡＤＣは、マレイミド化学反応を使用してコンジュゲートされた、オーリスタチンベースの毒素を含む。
表８に示されるように、各ｃｙｓ変異体は、約９２〜１００％のコンジュゲーション効率を有する。ＡＤＣは、下の実施例６に記載されるように、血清と共に０、３または７日間培養されて、細胞毒性についてアッセイされた。組み合わせ変異体および対照のそれぞれの細胞毒性曲線は、図１４Ａ、Ｂ、およびＣ（それぞれ０、３、および７日目）にプロットされる。ＥＣ50値もまた、プロットの下の表に提供される。この研究からの全てのデータは表９に要約され、３および７日目のＥＣ50損失倍数が提供される。
試験された全ての１Ｃ１−二重Ｃｙｓ変異体ＡＤＣは、血清培養後に安定していた。ＥＣ50は、特に７日間の血清培養後に保持された。１Ｃ１−Ｔ２８９Ｃ−ＡＤＣは、いくらかの活性を失った。表９を参照されたい。
Figure 2017512486
Figure 2017512486
実施例６
材料と方法
Ｆｃシステイン変異：１Ｃ１抗体を含むヒトＩｇＧ１の重鎖が、変異誘発の便宜のために、ｐＯＥ−単一カセットベクター（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ ＬＬＣ）にクローン化された。Ｆｃ断片上の１８７個のアミノ酸は、製造業者の説明書に従って、９６ウェルプレート形式で、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ ＸＬ部位特異的変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を使用して、個々にシステインに変異された。各位置におけるシステイン変異は、配列決定によって確認された。同様の手順を使用して、システイン挿入変異が作成された。
ハイスループット小規模形質移入および発現：１Ｃ１κ鎖がｐＯＥ−κベクター（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ ＬＬＣ）にクローン化され、９６ウェルプレート内で、１Ｃ１κ鎖ベクターおよび１Ｃ１重鎖ベクター（野生型または変異システインあり）のＤＮＡが２９３Ｆ細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）に同時形質移入され、形質移入の５日後に、発現された１Ｃ１抗体を含有する馴化培地（ＣＭ）が収集されて、精製１Ｃ１ＷＴ抗体を用いて作成された標準曲線を使用したＯｃｔｅｔによってＣＭ中の抗体濃度が判定され、発現はまた、タンパク質ゲルによっても分析されて、凝集レベルが推定された。
ハイスループット自動化固相部位特異的コンジュゲーション：Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ Ｃ５マレイミド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）が代用薬物積荷として使用されて、分析を容易にした。ＰｈｙＮｅｘｕｓ Ｍｉｃｒｏ−Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ（ＭＥＡ）装置（ＰｈｙＮｅｘｕｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用して、ハイスループット自動化コンジュゲーションが実施された。ＣＭ中の１Ｃ１抗体は、ピペットチップ内の固定化プロテインＡ上に捕捉され、Ｔｒｉｓ（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）によって還元されてキャップドシステインが除去され、デヒドロアスコルビン酸（ｄｈＡＡ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）によって酸化されて、抗体の鎖内ジスルフィド結合が再形成されて、１０倍モル過剰量のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ Ｃ５マレイミドにコンジュゲートされた。反応は、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）によって停止され、コンジュゲート抗体は、ＩｇＧ溶出緩衝液によって溶出された。
コンジュゲーション効率分析：質量分析によって９５％よりも高いコンジュゲーション効率を有する１Ｃ１−Ｔ２８９Ｃが、コンジュゲーション基準点対照として選択された。コンジュゲーション効率は、蛍光ＳＥＣによって分析され、標準曲線を作成するためにＴ２８９Ｃ−ＡＦ４８８が使用された：異なる量のＴ２８９Ｃ−ＡＦ４８８が、蛍光検出器（Ｅｘ＝４９４、Ｅｍ＝５１９）付きＨＰＬＣ−ＳＥＣに装入された。２８０ｎｍ（Ｘ軸）および４９４ｎｍ（Ｙ軸）における曲線下面積（ＡＵＣ）の値を使用して、標準曲線が作成された。標準曲線は線形であり、Ｒ2は、１に非常に近い。２５ｕｌの１Ｃ１−変異体−ＡＦ４８８がＳＥＣカラムに装入され、Ｔ２８９Ｃ−ＡＦ４８８標準曲線を使用して、各サンプルの２８０および４９４の面積の値を使用して、コンジュゲーション効率が計算された。コンジュゲーション効率は、Ｔ２８９Ｃコンジュゲーションの％として示され、いくつかの変異体のコンジュゲーション効率もまた、質量分析によって測定され、それらは良好に相関した。
中程度規模の発現および手動コンジュゲーション：手動コンジュゲーションを実施して、コンジュゲーション効率が確認された。自動化固相コンジュゲーション法からの基準点Ｔ２８９Ｃの５０％よりも高いコンジュゲーションレベルがある１Ｃ１−Ｆｃ変異体が、振盪フラスコ内の２９３Ｆ細胞内で発現されて、プロテインＡ ＨＰＬＣによって、馴化培地中の発現レベルが測定された。１Ｃ１−Ｆｃ変異体は、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーによって精製され、ＳＥＣによって凝集レベルが分析された。手動コンジュゲーションでは、２ｍｇの１Ｃ１−Ｆｃ変異体が、５０ｍＭのＴＣＥＰ中で３７℃で３時間還元されて、操作システインがキャップ離脱されて、コンジュゲーション緩衝液（ＰＢＳ＋１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）中の徹底的な透析がそれに続いて、遊離システインが除去されて、次に５０ｍＭのｄｈＡＡ中で室温で４時間酸化され、鎖内ジスルフィド結合が再形成された。この材料は、８倍のモル過剰量のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８Ｃ５マレイミドに室温で１時間コンジュゲートされ、反応は、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）によって停止され、回転濃縮器内でサンプルを３回にわたり希釈および濃縮することで遊離非結合ＡＦ４８８が除去されて、コンジュゲートされた１Ｃ１−Ｆｃ変異体は０．３〜０．５ｍｌの最終容積に濃縮されて、タンパク質濃度はナノドロップによって測定された。コンジュゲーション効率は、ｆｌｕｏｒ ＳＥＣおよび質量分析によって測定された。
安定性判定のためのＡＤＣ血清培養：５０μｌのＰＢＳ中の１００μｇのＡＦ４８８コンジュゲート１Ｃ１−Ｆｃ変異体（最終容積の２０％）が、２００μｌの正常ヒト血清またはＰＢＳと混合された（最終容積の８０％）。濾過後、１０ｕｌの混合物をＨＰＬＣ ｆｌｕｏｒ ＳＥＣカラムに装入して、血清培養０日目対象の蛍光プロファイルを得た。各混合物の残りの部分は、３７℃で３日間および７日間培養された。蛍光プロファイルは、０日目サンプルと同様にして得られた。抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の蛍光ピーク（面積）を全蛍光（面積）で除算して、各時点についてＡＤＣ蛍光の百分率を得ることで、血清安定性が分析された。０日目、３日目、および７日目のＩｇＧピーク中の蛍光％残留を使用して、安定性が推定された。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）面積中の新しい蛍光ピークが、血清培養３日目または７日目のサンプルで観察された。このピークを計算して、ＨＳＡに移入されたコンジュゲートの百分率が推定された。
ＦｃＲｎ結合ＥＬＩＳＡ：ハーフエウェルＥＬＩＳＡプレートが、５μｇ／ｍｌの各１Ｃ１Ｆｃ−Ｃｙｓ変異体で４℃にて一晩被覆されて、ＰＢＳＴ、ｐＨ５．８、で洗浄され、アイシングラスブロック緩衝液、ｐＨ５．８で室温にて１時間ブロックされた。０．０２〜１００μｇ／ｍｌのＦｃＲｎ−ビオチン（アイシングラスブロック緩衝液中で希釈された、ｐＨ５．８、合計１１回の希釈）がウェルに添加されて、室温で２時間インキュベートされた。プレートはＰＢＳＴ、ｐＨ５．８で洗浄され、ストレプトアビジンＨＲＰが添加されて室温で４０分間インキュベートされて、ＥＬＩＳＡはＴＭＢで発色されて、０．２ＮのＨ２ＳＯ４で停止された。ＥｎＶｉｓｉｏｎ ２１０４マルチラベルリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）によってＯＤ４５０が測定され、モデルとして可変勾配のあるｌｏｇ（作動薬）対反応を使用して、Ｐｒｉｓｍ５ソフトウェアによってＥＣ５０が分析された（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）。
平衡結合定数ＦｃγＲｓの測定：ＩｇＧとｈＦｃγＲｓとの結合の結合定数（ＫＤ）は、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６装置上で測定された。簡単に述べると、抗体は、装置製造業者によって概説されるように、標準アミノ共役化学反応を使用して、ＧＬＣセンサーチップ上で高密度にて固定化された。測定されたＩｇＧの最終的な表面密度は、およそ３０００ＲＵであった。ＩｇＧなしで同一固定化プロトコルを使用して、標準フローセルもまた、このセンサーチップ上で調製された。各ｈＦｃγＲの原液は、装置緩衝液（５０ｍＭのリン酸、ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、および０．００５％のツイーン２０を含有する、リン酸緩衝食塩水［ＰＢＳ］／ツイーン／エチレンジアミン四酢酸［ＥＤＴＡ］緩衝液）中で、４０００ｎＭ、１６，０００ｎＭ、または３２，０００ｎＭのいずれかで調製されて、次に同一緩衝液中で連続希釈（１：３）され、各受容体について所望の濃度系列が得られた：１．８２ｎＭ〜４，０００ｎＭ（ｈＦｃγＲＩ）、１９７．５ｎＭ〜１６，０００ｎＭ（ｈＦｃγＲＩＩＡ）、３９５．１ｎＭ〜１６，０００ｎＭ（ｈＦｃγＲＩＩｂ）、２１．９ｎＭ〜１６，０００ｎＭ（ｈＦｃγＲＩＩＩＡ−１５８Ｖ）、および３９５〜３２，０００ｍＭ（ｈＦｃγＲＩＩＩＡ−１５８Ｆ）。各濃度のＦｃγＲは、８分間にわたり２５μＬ／分の流速で、５Ｔ４−１０８−ｍａｉａ ＩｇＧおよび対照セル表面の双方の上に注入され、その間に結合データが収集された。注入と注入の間に、５ｍＭのＨＣｌの６０秒間のパルス投与で表面が再生された（すなわち、結合ＦｃγＲが除去された）。数回の緩衝液注入もまた、注入系列全体を通じて散在していた。その後、これらの緩衝液注入の１つが、対照セルデータと共に使用されて、一般に「二重参照」と称される技術（Ｍｙｓｚｋａ，１９９９）を通じて、あらゆる注入の人為結果（例えば、非特異的結合）について、結合データが修正された。最終的に、結合データが収集されて、個々のデータセットは、各濃度（Ｃ）での結合（平衡［Ｒｅｑ］における反応）について平均され、次に１：１結合等温線（Ｒｅｑ対Ｃ）プロットに適合された。供給業者の評価ソフトウェアのバージョン３．１．０．６を使用して、これから平衡結合定数ＫＤが誘導された。
平衡結合定数ヒトＦｃＲｎタンパク質の測定；ＩｇＧと、ヒトＦｃＲｎタンパク質との結合（ｈｕＦｃＲｎ）の親和性（ＫＤ）が、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６装置上で測定された。簡単に述べると、抗体は、上述されるような標準アミノ共役化学反応を使用して、ＧＬＣセンサーチップ上に高密度で固定化された。ｈｕＦｃＲｎタンパク質の原液は、装置緩衝液（５０ｍＭナトリウムリン酸緩衝液、ｐＨ６、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび０．０５％のツイーン２０を含有する）中で３０００ｎＭにて調製されて、次に、同一緩衝液中で１．３７ｎＭに連続希釈（３：１）された。各濃度のＦｃＲｎが、５Ｔ４−１０８−ｍａｉａＩｇＧおよび直列に連結された対照セル表面上に、２５μＬ／分の流速で１６分間にわたり順次注入された。結合データが収集され、続いて、各受容体または緩衝液ブランクの注入と注入の間に、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および０．０５％のツイーン２０を含有する５０ｍＭのナトリウムリン酸緩衝液、ｐＨ７．４が６０秒間にわたり注入されて、ＩｇＧ表面が再生された（すなわち、結合ＦｃＲｎタンパク質が除去される）。数回の緩衝液注入もまた、注入系列全体を通じて散在していた。その後、これらの緩衝液注入の１つを対照セルデータと共に使用して、「二重参照」（Ｍｙｓｚｋａ，１９９９）を通じて、注射人為結果（例えば、非特異的結合）について生データセットが修正された。最終的に、結合データが収集されて、個々のデータセットは、各濃度（Ｃ）での結合（Ｒｅｑ）について平均され、次に１：１結合等温線（Ｒｅｑ対Ｃ）プロットに適合された。これから、平衡結合定数ＫＤは、供給業者のＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアｖ．４．１を使用して誘導された。
熱安定性測定：１Ｃ１ Ｆｃ−Ｃｙｓ変異体の熱的アンフォールディングプロファイルは、示差走査熱量測定（ＶＰ−ＤＳＣ，ＭｉｃｒｏＣａｌ，ＬＬＣ，Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ，ＭＡ）によって測定され、２５ｍＭヒスチジン緩衝液、ｐＨ６．０中の１ｍｇ／ｍｌ濃度の０．５０３ｍｌの１Ｃ１ Ｆｃ−Ｃｙｓ変異体がチャンバーに装入されて、２０℃から１１０℃にかけて１℃／分でスキャンされた。温度記録データからの遷移中間点（Ｔm値）は、製造業者によって提供されるＯｒｉｇｉｎ ７ソフトウェア中の非二状態モデルを使用して断定された。
毒素とのコンジュゲーション：上に記載されるＡＦ４８８とのコンジュゲーションと同一方法を使用して、２ｍｇの各１Ｃ１Ｆｃ−Ｃｙｓ変異体および基準点対照変異体が、毒素１または毒素２に手動でコンジュゲートされた。遊離薬物は、ＣＨＴＩＩ型（セラミックヒドロキシアパタイト）液体クロマトグラフィーによって除去され、１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０中の０〜２ＭのＮａＣｌ勾配を用いて溶出された。単量体ＡＤＣピークが収集されて、７％スクロース添加２５ｍＭヒスチジン、ｐＨ６．０中で透析され、０．３〜０．５ｍｌに濃縮された。コンジュゲーション効率は、質量分析法によって分析された。
ＡＤＣの血清安定性を判定するための細胞毒性アッセイ：ＡＤＣ血清培養は、上述されるのと同様に準備された。ＤＵ−１４５細胞は、８０μｌ中の２０００個の細胞／ウェルで、白色壁９６−ウェルプレート（ＶＷＲ、Ｒａｄｎｏｒ、ＰＡ）内に播種され、３７℃、５％のＣＯ２インキュベーター内で一晩培養された。ＡＤＣ血清サンプルは、三重反復試験において、培養液で０．００４〜８０μｇ／ｍｌに希釈され、２０μｌの希釈ＡＤＣ血清が８０μｌの細胞に添加された。培養中のＡＤＣの最終濃度は、０．０００８〜１６μｇ／ｍｌであり、細胞は、インキュベーターでさらに３日間培養され、生存細胞は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏルミネセンス（Ｌｕｍｉｎｅｓｅｃｅｎｔ）細胞生存率アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して判定された。ルミネセンスシグナルは、ＥｎＶｉｓｉｏｎ ２１０４マルチラベルリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）によって測定され、細胞死滅のＥＣ５０は、可変勾配をモデルとして、対数（作動薬）対応答を使用して、Ｐｒｉｓｍ５ソフトウェアによって分析された（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）。
本明細書で提供される実施形態は、特定機能およびそれらの関係性の具現を例示する、機能的構成要素の助けを借りて上に記載される。これらの機能的構成要素の境界は、本明細書において、説明の便宜のために自由裁量で画定される。代替の境界は、特定の機能およびそれらの関係性が適切に作動しさえすれば、画定され得る。
特定の実施形態の前述の説明は、他者が、過度の実験を実施することなく、本明細書で報告される基本概念から逸脱することなく、技術範囲内の知識を適用して、このような特定の実施形態を様々な用途のために、容易に修正および／または適応できるようにするのに十分である。したがってこのような適応および修飾は、本明細書で提示される教示および指標に基づいて、開示された実施形態の均等物の意味および範囲内であることが意図される。本明細書の専門語または用語法は、説明を目的とし、教示および指標に照らして、当業者によって、本明細書の用語法または専門語が解釈されることを制限しないものと理解される。
本開示の幅および範囲は、上記の例示的な実施形態のいずれによっても制限されるべきではなく、特許請求の範囲およびそれらの均等物によってのみ定義されるべきである。

Claims (93)

  1. システイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質と、少なくとも１つの異種部分とを含む、コンジュゲート化合物であって、
    （ｉ）前記抗体またはＦｃ融合タンパク質のＦｃドメインが、アミノ酸位置の番号付与がＫａｂａｔに記載のＥＵ指針に準拠する、アミノ酸位置２４１、２４３、２５１、２５３、２５８、２６４、２６９、２７１、２７２、２７４、２８０、２８１、２８５、２８８、２９１、２９３、２９４、２９６、３０１、３０７、３０９、３１１、３１８、３２９、３４０、３４１、３４５、３５７、３８５、３８６、３８７、４０１、４０２、４１１、４１７、４３３、４３５、または４３９におけるシステインアミノ酸置換、位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入、およびそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの操作システインアミノ酸を含み、
    （ｉｉ）少なくとも１つの異種部分が、前記操作システインの１つにコンジュゲートされる、コンジュゲート化合物。
  2. 前記操作システインアミノ酸が、アミノ酸位置２４１、２４３、２５１、２５３、２５８、２６４、２７１、２８５、２８８、２９１、２９６、３０１、３０７、３０９、３１１、３２９、３８５、３８７、４３３、または４３５におけるシステインアミノ酸置換、位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入、およびそれらの組み合わせから選択される、請求項１に記載のコンジュゲート化合物。
  3. 前記操作システインアミノ酸が、アミノ酸位置２５８、または４３５におけるシステインアミノ酸置換、位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入、およびそれらの組み合わせから選択される、請求項１に記載のコンジュゲート化合物。
  4. アミノ酸位置の番号付与がＫａｂａｔに記載のＥＵ指針に準拠する、
    （ａ）位置２３９に位置するセリン（Ｓ）と位置２４０に位置するバリン（Ｖ）との間に挿入される、システイン（Ｃ）；
    （ｂ）位置２５８に位置するグルタミン酸（Ｅ）を置換する、システイン（Ｃ）；
    （ｃ）位置４３５に位置するヒスチジン（Ｈ）を置換するシステイン（Ｃ）；
    （ｄ）位置４３５に位置するアルギニン（Ｒ）を置換するシステイン（Ｃ）；または
    （ｅ）それらの組み合わせ
    を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物。
  5. 前記Ｆｃドメインが、アミノ酸位置２３９、２４８、２５４、２７３、２７９、２８２、２８４、２８６、２８７、２８９、２９７、２９８、３１２、３２４、３２６、３３０、３３５、３３７、３３９、３５０、３５５、３５６、３５９、３６０、３６１、３７５、３８３、３８４、３８９、３９８、４００、４１３、４１５、４１８、４２２、４４０、４４１、４４２、４４３、および４４６におけるシステインアミノ酸置換から選択される、少なくとも１つの操作システイン残基をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物。
  6. 少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのチオール基を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物。
  7. 少なくとも６、８、１０、１２、１４、１６個以上のチオール基を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物。
  8. 少なくとも１つの異種部分が、操作システインに化学的に結合する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物。
  9. 少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つの異種部分を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物。
  10. 前記異種部分のそれぞれ１つが、操作システインにコンジュゲートされる、請求項９に記載のコンジュゲート化合物。
  11. 少なくとも６、８、１０、１２、１４、１６個以上の異種部分を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物。
  12. 前記異種部分のそれぞれ１つが、操作システインにコンジュゲートされる、請求項１１に記載のコンジュゲート化合物。
  13. 前記異種部分が全て同一である、請求項９〜１２のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物。
  14. 少なくとも１つの異種部分が残りの部分と異なる、請求項９〜１２のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物。
  15. 前記抗体またはＦｃ融合タンパク質のＦｃドメインが、ＩｇＧＦｃドメインである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物。
  16. 前記抗体またはＦｃ融合タンパク質のＦｃドメインが、ヒトＩｇＧＦｃドメインである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物。
  17. 前記ヒトＩｇＧが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である、請求項１６に記載のコンジュゲート化合物。
  18. 前記Ｆｃ融合タンパク質が、標的との結合を媒介するポリペプチドを含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物。
  19. 前記Ｆｃ融合タンパク質が、（ａ）ｓｃＦｖ；（ｂ）二特異性抗体；（ｃ）Ｆｄ断片；（ｄ）Ｆｖ断片；（ｅ）ＴＡＮＤＡＢ（登録商標）；（ｆ）Ｆ（ａｂ’）2断片；（ｇ）ＦＣＡＢ（商標）、および（ｈ）Ｆ（ａｂ）断片からなる群から選択される抗原結合領域を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物。
  20. 前記Ｆｃ融合タンパク質が、タンパク質スキャフォールドまたは抗体模倣剤を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物。
  21. 前記Ｆｃ融合タンパク質が、（ａ）リガンド；（ｂ）酵素；（ｃ）受容体のリガンド結合部分；および（ｄ）付着タンパク質からなる群から選択されるポリペプチドを含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物。
  22. 前記抗体またはＦｃ融合タンパク質のＦｃドメインが、２３４Ｄ、２３４Ｅ、２３４Ｎ、２３４Ｑ、２３４Ｔ、２３４Ｈ、２３４Ｙ、２３４１、２３４Ｖ、２３４Ｆ、２３５Ａ、２３５Ｄ、２３５Ｒ、２３５Ｗ、２３５Ｐ、２３５Ｓ、２３５Ｎ、２３５Ｑ、２３５Ｔ、２３５Ｈ、２３５Ｙ、２３５１、２３５Ｖ、２３５Ｆ、２３６Ｅ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、２３９Ｎ、２３９Ｑ、２３９Ｆ、２３９Ｔ、２３９Ｈ、２３９Ｙ、２４０１、２４０Ａ、２４０Ｔ、２４０Ｍ、２４１Ｗ、２４１Ｌ、２４１Ｙ２４１Ｅ、２４１Ｒ、２４３Ｗ、２４３Ｌ、２４３Ｙ、２４３Ｒ、２４３Ｑ、２４４Ｈ、２４５Ａ、２４７Ｌ、２４７Ｖ、２４７Ｇ、２５１Ｆ、２５２Ｙ、２５４Ｔ、２５５Ｌ、２５６Ｅ、２５６Ｍ、２６２１、２６２Ａ、２６２Ｔ、２６２Ｅ、２６３１、２６３Ａ、２６３Ｔ、２６３Ｍ、２６４Ｌ、２６４１、２６４Ｗ、２６４Ｔ、２６４Ｒ、２６４Ｆ、２６４Ｍ、２６４Ｙ、２６４Ｅ、２６５Ｇ、２６５Ｎ、２６５Ｑ、２６５Ｙ、２６５Ｆ、２６５Ｖ、２６５１、２６５Ｌ、２６５Ｈ、２６５Ｔ、２６６１、２６６Ａ、２６６Ｔ、２６６Ｍ、２６７Ｑ、２６７Ｌ、２６９Ｙ、２６９Ｆ、２６９Ｒ、２７０Ｅ、２８０Ａ、２８４Ｍ、２９２Ｐ、２９２Ｌ、２９６Ｅ、２９６Ｑ、２９６Ｄ、２９６Ｎ、２９６Ｓ、２９６Ｔ、２９６Ｌ、２９６１、２９６Ｈ、２６９Ｇ、２９７Ｓ、２９７Ｄ、２９７Ｅ、２９８Ｈ、２９８１、２９８Ｔ、２９８Ｆ、２９９１、２９９Ｌ、２９９Ａ、２９９Ｓ、２９９Ｖ、２９９Ｈ、２９９Ｆ、２９９Ｅ、３０５１、３１３Ｆ、３１６Ｄ、３２５Ｑ、３２５Ｌ、３２５１、３２５Ｄ、３２５Ｅ、３２５Ａ、３２５Ｔ、３２５Ｖ、３２５Ｈ、３２７Ｇ、３２７Ｗ、３２７Ｎ、３２７Ｌ、３２８Ｓ、３２８Ｍ、３２８Ｄ、３２８Ｅ、３２８Ｎ、３２８Ｑ、３２８Ｆ、３２８１、３２８Ｖ、３２８Ｔ、３２８Ｈ、３２８Ａ、３２９Ｆ、３２９Ｈ、３２９Ｑ、３３０Ｋ、３３０Ｇ、３３０Ｔ、３３０Ｃ、３３０Ｌ、３３０Ｙ、３３０Ｖ、３３０１、３３０Ｆ、３３０Ｒ、３３０Ｈ、３３１Ｇ、３３１Ａ、３３１Ｌ、３３１Ｍ、３３１Ｆ、３３１Ｗ、３３１Ｋ、３３１Ｑ、３３１Ｅ、３３１Ｓ、３３１Ｖ、３３１１、３３１Ｃ、３３１Ｙ、３３１Ｈ、３３１Ｒ、３３１Ｎ、３３１Ｄ、３３１Ｔ、３３２Ｄ、３３２Ｓ、３３２Ｗ、３３２Ｆ、３３２Ｅ、３３２Ｎ、３３２Ｑ、３３２Ｔ、３３２Ｈ、３３２Ｙ、３３２Ａ、３３９Ｔ、３７０Ｅ、３７０Ｎ、３７８Ｄ、３９２Ｔ、３９６Ｌ、４１６Ｇ、４１９Ｈ、４２１Ｋ、４４０Ｙ、および４４３Ｗからなる群から選択される、少なくとも１つの非天然アミノ酸残基をさらに含み、アミノ酸位置の番号付与がＫａｂａｔに記載のＥＵ指針に準拠する、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物。
  23. 前記抗体が、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、多特異性抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、またはヒト化抗体である、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物。
  24. 少なくとも１つの異種部分が、毒素、薬物、放射性核種、免疫修飾物質、サイトカイン、リンフォカイン、ケモカイン、増殖因子、腫瘍壊死因子、ホルモン、ホルモン拮抗薬、酵素、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、マイクロＲＮＡ、ペプチド核酸、光活性治療薬、血管新生阻害剤、アポトーシス促進剤、非天然アミノ酸、ペプチド、脂質、炭水化物、足場分子、蛍光性タグ、可視化ペプチド、ビオチン、血清半減期延長剤、捕捉タグ、キレート化剤、固体担体、またはそれらの組み合わせであり、その中で、コンジュゲーションが、操作システインの１つにある、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物。
  25. 前記薬物が、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、アルキルスルホン酸塩、ニトロソ尿素、ゲムシタビン、トリアゼン、葉酸アナログ、アントラサイクリン、タキサン、ＣＯＸ−２阻害剤、ピリミジンアナログ、プリンアナログ、抗生物質、酵素阻害剤、エピポドフィロトキシン、白金配位錯体、ビンカアルカロイド、置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、ホルモン拮抗薬、エンドスタチン、タキソール、カンプトテシン、ＳＮ−３８、ドキソルビシン、ドキソルビシンアナログ、代謝拮抗剤、アルキル化剤、有糸***阻害薬、血管新生阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ９０）阻害剤、生体沈殿阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、アポトーシス促進剤、メトトレキサート、ＣＰＴ−１１、またはそれらの組み合わせであり、その中で、コンジュゲーションが、操作システインの１つにある、請求項２４に記載のコンジュゲート化合物。
  26. 前記薬物が、オーリスタチン、ツブリシンまたはピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）である、請求項２４に記載のコンジュゲート化合物。
  27. 前記オーリスタチンが、ＭＭＡＥ（モノメチルオーリスタチンＥ）またはＭＭＡＦ（モノメチルオーリスタチンＦ）である、請求項２６に記載のコンジュゲート化合物。
  28. 前記薬物が、メイタンシノイドである、請求項２４に記載のコンジュゲート化合物。
  29. 前記メイタンシノイドが、Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシン（ＤＭ１）、Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（４−メルカプト−１−オキソペンチル）−メイタンシン（ＤＭ３）またはＮ２’−デアセチル−Ｎ２’（４−メチル−４−メルカプト−１−オキソペンチル）−メイタンシン（ＤＭ４）である、請求項２８に記載のコンジュゲート化合物。
  30. 前記毒素が、アブリン、ブルシン、シクトキシン、ジフテリア毒素、ボツリヌス毒素、志賀毒素、内毒素、破傷風毒素、百日咳毒素、炭疽病毒素、コレラ毒素、ファルカリノール、α毒素、ゲルダナマイシン、ゲロニン、ロタウストラリン、リシン、ストリキニーネ、テトロドトキシン、サポニン、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、ＤＮａｓｅＩ、ブドウ球菌エンテロトキシン−Ａ、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）菌体外毒素、およびシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）内毒素、またはそれらの組み合わせである、請求項２４に記載のコンジュゲート化合物。
  31. 前記キレート化剤が、ＤＴＰＡ、ＥＣ、ＤＭＳＡ、ＥＤＴＡ、Ｃｙ−ＥＤＴＡ、ＥＤＴＭＰ、ＤＴＰＡ、ＣｙＤＴＰＡ、Ｃｙ２ＤＴＰＡ、ＢＯＰＴＡ、ＤＴＰＡ−ＭＡ、ＤＴＰＡ−ＢＡ、ＤＴＰＭＰ、ＤＯＴＡ、ＴＲＩＴＡ、ＴＥＴＡ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＴＡ−ＭＡ、ＨＰ−ＤＯ３Ａ、ｐＮＢ−ＤＯＴＡ、ＤＯＴＰ、ＤＯＴＭＰ、ＤＯＴＥＰ、ＤＯＴＰＰ、ＤＯＴＢｚＰ、ＤＯＴＰＭＥ、ＨＥＤＰ、ＤＴＴＰ、Ｎ３Ｓトリアミドチオール、ＤＡＤＳ、ＭＡＭＡ、ＤＡＤＴ、Ｎ２Ｓ４ジアミンテトラチオール、Ｎ２Ｐ２ジチオール−ビスホスフィン、６−ヒドラジノニコチン酸、プロピレンアミンオキシム、テトラアミン、サイクラム、またはそれらの組み合わせである、請求項２４に記載のコンジュゲート化合物。
  32. 前記放射性核種が、クロム（51Ｃｒ）、コバルト（57Ｃｏ）、フッ素（18Ｆ）、ガドリニウム（153Ｇｄ、159Ｇｄ）、ゲルマニウム（68Ｇｅ）、ホルミウム（166Ｈｏ）、インジウム（115Ｉｎ、113Ｉｎ、112Ｉｎ、111Ｉｎ）、ヨウ素（131Ｉ、125Ｉ、123Ｉ、121Ｉ）、ランタン（140Ｌａ）、ルテチウム（177Ｌｕ）、マンガン（54Ｍｎ）、モリブデン（99Ｍｏ）、パラジウム（103Ｐｄ）、亜リン酸（32Ｐ）、プラセオジム（142Ｐｒ）、プロメチウム（149Ｐｍ）、レニウム（186Ｒｅ、188Ｒｅ）、ロジウム（105Ｒｈ）、ルテニウム（97Ｒｕ）、サマリウム（153Ｓｍ）、スカンジウム（47Ｓｃ）、セレン（75Ｓｅ）、ストロンチウム（85Ｓｒ）、イオウ（35Ｓ）、テクネチウム（99Ｔｃ）、タリウム（201Ｔｌ）、スズ（113Ｓｎ、117Ｓｎ）、トリチウム（3Ｈ）、キセノン（133Ｘｅ）、イッテルビウム（169Ｙｂ、175Ｙｂ）、イットリウム（90Ｙ）、亜鉛（65Ｚｎ）、またはそれらの組み合わせである、請求項２４に記載のコンジュゲート化合物。
  33. 前記放射性核種が、キレート化剤によって、前記コンジュゲート化合物に付着される、請求項３２に記載のコンジュゲート化合物。
  34. 前記血清半減期延長剤が、アルブミン、アルブミン結合ポリペプチド、ＰＡＳ、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）のβサブユニット、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ＸＴＥＮ、アルブミン結合小分子、またはそれらの組み合わせを含む、請求項２４に記載のコンジュゲート化合物。
  35. 前記可視化ペプチドが、試験管内、生体内、生体外またはそれらの任意の組み合わせにおける、前記コンジュゲート化合物の可視化または位置確認を可能にする、請求項２４に記載のコンジュゲート化合物。
  36. 可視化ペプチドが、ビオチン受容体ペプチド、リポ酸受容体ペプチド、蛍光タンパク質、二ヒ素染料ライゲーションのためのまたは準安定テクネチウムコンジュゲーションのためのシステイン含有ペプチド、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）ベースの近接アッセイのためのユウロピウムクラスレートコンジュゲーションのためのペプチド、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項３５に記載のコンジュゲート化合物。
  37. 前記蛍光タンパク質が、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＹＦＰ、ＥＧＦＰ、またはＥＹＦＰである、請求項３６に記載のコンジュゲート化合物。
  38. 前記二ヒ素染料が、４’，５’−ビス（１，３，２−ジチオアルソラン−２−イル）フルオレセイン（フラッシュ）である、請求項３６に記載のコンジュゲート化合物。
  39. 前記ビオチン受容体ペプチドが、アビジンベースおよびストレプトアビジンベースの試薬のコンジュゲーションを促進する、請求項３６に記載のコンジュゲート化合物。
  40. 前記リポ酸受容体ペプチドが、リポ酸に結合するためのチオール反応性プローブのコンジュゲーション、または蛍光性リポ酸類似体の直接的ライゲーションを促進する、請求項３６に記載のコンジュゲート化合物。
  41. 前記捕捉タグが、ビオチンまたはＨｉｓ６タグである、請求項２４に記載のコンジュゲート化合物。
  42. 前記蛍光性タグが、フルオレセイン型染料、ローダミン型染料、ダンシル型染料、リサミン型染料、シアニン型染料、フィコエリトリン型染料、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ型染料、およびそれらの組み合わせを含む、請求項２４に記載のコンジュゲート化合物。
  43. 前記蛍光性タグが、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ Ｃ５マレイミドである、請求項２４に記載のコンジュゲート化合物。
  44. 前記異種部分が、リンカーを介して、前記操作システインの１つにコンジュゲートされる、請求項１〜４３のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物。
  45. 前記リンカーが、切断可能リンカーである、請求項４４に記載のコンジュゲート化合物。
  46. 前記リンカーが、切断不能リンカーである、請求項４４に記載のコンジュゲート化合物。
  47. 前記リンカーが、非ペプチドリンカーを含む、請求項４４に記載のコンジュゲート化合物。
  48. 前記リンカーが、非ペプチドリンカーからなる、請求項４７に記載のコンジュゲート化合物。
  49. 前記非ペプチドリンカーが、ＭＣ、ｖａｌ−ｃｉｔ、ＭＣ−ｖａｌ−ｃｉｔ、ＭＣ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢＣ、Ｍａｌ−ＰＥＧ２Ｃ２、Ｍａｌ−ＰＥＧ３Ｃ２Ｍａｌ−ＰＥＧ６Ｃ２、ＭＰ、ＭＰＥＧ、ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＳＭＰＴ、ＬＣ−ＳＰＤＰ、ＢＭＰＥＯ、ＳＰＰ、またはＳＭＰＢを含む、請求項４７または４８のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物。
  50. 前記リンカーが、ペプチドリンカーを含む、請求項４４に記載のコンジュゲート化合物。
  51. 前記リンカーが、ペプチドリンカーからなる、請求項４４に記載のコンジュゲート化合物。
  52. 前記ペプチドリンカーが、少なくとも２個のアミノ酸、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、または少なくとも１００個のアミノ酸を含む、請求項５０または５１のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物。
  53. 前記ペプチドリンカーが、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、または少なくとも１，０００個のアミノ酸を含む、請求項５０または５１のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物。
  54. 前記ペプチドリンカーが、式、［（Ｇｌｙ）ｘ−Ｓｅｒｙ］ｚ（式中、ｘは１〜４であり、ｙは０または１であり、ｚは１〜５０である）を有するペプチドを含む、請求項５０に記載のコンジュゲート化合物。
  55. 前記システイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質が、少なくとも１つの標的に特異的に結合する、請求項１〜５４のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物。
  56. 前記標的が、タンパク質である、請求項５５に記載のコンジュゲート化合物。
  57. 前記標的が、非タンパク質である、請求項５５に記載のコンジュゲート化合物。
  58. 前記抗体、または抗体と同じ標的に結合するＦｃ融合タンパク質が、アバゴボマブ、アバタセプト、アブシキシマブ、アダリムマブ、アデカツムマブ、アレムツズマブ、アルツモマブ、アフェリモマブ、アナツモマブマフェナトックス、アネツムマブ、アンルキズマブ、アポリズマブ、アルシツモマブ、アセリズマブ、アトリズマブ、アトロリムマブ、ピニューズマブ、バシリキシマブ、バビツキシマブ、ベクツモマブ、ベリムマブ、ベルチリムマブ、ベシレソマブ、ベバシズマブ、ビシロマブブラロバルビタール、ビバツヅマブメルタンシン、キャンパス、カナキヌマブ、カンツズマブメルタンシン、カプロマブ、カツマキソマブ、セデリズマブ、セルトリズマブペゴル、セツキシマブ、クレノリキシマブ、ダセツズマブ、ダクリキシマブ、ダクリズマブ、デノスマブ、デツモマブ、ドルリモマブアリトックス、ドルリキシズマブ、ダンツムマブ、デュリムルマブ、ドゥルムルマブ、エクロメキシマブ、エクリズマブ、エドバコマブ、エドレコロマブ、エファリツマブ、エフングマブ、エルシリモマブ、エンリモマブペゴール、エピツモマブシツキセタン、エファリツマブ、エピツモマブ、エピラツズマブ、エルリズマブ、エルツマキソマブ、エタネルセプト、エタラシズマブ、エキスビビルマブ、ファノレソマブ、ファラリモマブ、フェルビズマブ、フォントリズマブ、ガリキシマブ、ガンテネルマブ、ガビリモマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、ゴリムマブ、ゴミリキシマブ、イバリズマブ、イブリツモマブチウキセタン、イゴボマブ、イムシロマブ、インフリキシマブ、イノリモマブ、イノツズマブオゾガマイシン、イピリムマブ、イラツムマブ、ケリキシマブ、ラベツズマブ、レマレソマブ、レブリリズマブ、レルデリムマブ、レキサツムマブ、レキシツムマブ、リビビルマブ、リンツズマブ、ルカツムマブ、ルミリキシマブ、マパツムマブ、マスリモマブ、マツズマブ、メポリズマブ、メテリムマブ、ミラツズマブ、ミンレツモマブ、ミツモマブ、モロリムマブ、モタビズマブ、ムロモナブ、ナコロマブタフェナトックス、ナプツモマブエスタフェナトックス、ナタリズマブ、ネバクマブ、ネレリモマブ、ニモツズマブ、ノフェツモマブメルペンタン、オクレリズマブ、オズリモマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、オレゴボマブ、オテリキシズマブ、パギバキシマブ、パリビズマブ、パニツマブ、パスコリズマブ、ペムツモマブ、ペルツズマブ、ペキセリズマブ、ピンツモマブ、プリリキシマブ、プリツムマブ、ラニビズマブ、ラキシバクマブ、レガビルマブ、レスリズマブ、リツキシマブ、ロベリズマブ、ルプリズマブ、サツモマブ、セビルマブ、シブロツズマブ、シプリズマブ、ソンツズマブ、スタムルマブ、スレソマブ、タカツズマブテトラキセタン、タドシズマブ、タリズマブ、タプリツモマブパプトキス、テフィバズマブ、テリモマブアリトックス、テネリキシマブ、テプリズマブ、チシリムマブ、トシリズマブ、トラリズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、トレメリムマブ、ツコツズマブセルモロイキン、ツビルマブ、ウルトキサズマブ、ウステキヌマブ、バパリキシマブ、ベルツズマブ、ベパリモマブ、ビシリズマブ、ボロシキシマブ、ボツムマブ、ザルツムマブ、ザノリムマブ、ジラリムマブ、およびゾリモマブアリトックスからなる群から選択される、請求項５５に記載のコンジュゲート化合物。
  59. 前記抗体、または抗体に由来する抗原結合領域を含むＦｃ融合タンパク質が、アバゴボマブ、アバタセプト、アブシキシマブ、アダリムマブ、アデカツムマブ、アレムツズマブ、アルツモマブ、アフェリモマブ、アナツモマブマフェナトックス、アネツムマブ、アンルキズマブ、アポリズマブ、アルシツモマブ、アセリズマブ、アトリズマブ、アトロリムマブ、ピニューズマブ、バシリキシマブ、バビツキシマブ、ベクツモマブ、ベリムマブ、ベルチリムマブ、ベシレソマブ、ベバシズマブ、ビシロマブブラロバルビタール、ビバツヅマブメルタンシン、キャンパス、カナキヌマブ、カンツズマブメルタンシン、カプロマブ、カツマキソマブ、セデリズマブ、セルトリズマブペゴル、セツキシマブ、クレノリキシマブ、ダセツズマブ、ダクリキシマブ、ダクリズマブ、デノスマブ、デツモマブ、ドルリモマブアリトックス、ドルリキシズマブ、ダンツムマブ、デュリムルマブ、ドゥルムルマブ、エクロメキシマブ、エクリズマブ、エドバコマブ、エドレコロマブ、エファリツマブ、エフングマブ、エルシリモマブ、エンリモマブペゴール、エピツモマブシツキセタン、エファリツマブ、エピツモマブ、エピラツズマブ、エルリズマブ、エルツマキソマブ、エタネルセプト、エタラシズマブ、エキスビビルマブ、ファノレソマブ、ファラリモマブ、フェルビズマブ、フォントリズマブ、ガリキシマブ、ガンテネルマブ、ガビリモマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、ゴリムマブ、ゴミリキシマブ、イバリズマブ、イブリツモマブチウキセタン、イゴボマブ、イムシロマブ、インフリキシマブ、イノリモマブ、イノツズマブオゾガマイシン、イピリムマブ、イラツムマブ、ケリキシマブ、ラベツズマブ、レマレソマブ、レブリリズマブ、レルデリムマブ、レキサツムマブ、レキシツムマブ、リビビルマブ、リンツズマブ、ルカツムマブ、ルミリキシマブ、マパツムマブ、マスリモマブ、マツズマブ、メポリズマブ、メテリムマブ、ミラツズマブ、ミンレツモマブ、ミツモマブ、モロリムマブ、モタビズマブ、ムロモナブ、ナコロマブタフェナトックス、ナプツモマブエスタフェナトックス、ナタリズマブ、ネバクマブ、ネレリモマブ、ニモツズマブ、ノフェツモマブメルペンタン、オクレリズマブ、オズリモマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、オレゴボマブ、オテリキシズマブ、パギバキシマブ、パリビズマブ、パニツマブ、パスコリズマブ、ペムツモマブ、ペルツズマブ、ペキセリズマブ、ピンツモマブ、プリリキシマブ、プリツムマブ、ラニビズマブ、ラキシバクマブ、レガビルマブ、レスリズマブ、リツキシマブ、ロベリズマブ、ルプリズマブ、サツモマブ、セビルマブ、シブロツズマブ、シプリズマブ、ソンツズマブ、スタムルマブ、スレソマブ、タカツズマブテトラキセタン、タドシズマブ、タリズマブ、タプリツモマブパプトキス、テフィバズマブ、テリモマブアリトックス、テネリキシマブ、テプリズマブ、チシリムマブ、トシリズマブ、トラリズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、トレメリムマブ、ツコツズマブセルモロイキン、ツビルマブ、ウルトキサズマブ、ウステキヌマブ、バパリキシマブ、ベルツズマブ、ベパリモマブ、ビシリズマブ、ボロシキシマブ、ボツムマブ、ザルツムマブ、ザノリムマブ、ジラリムマブ、およびゾリモマブアリトックスからなる群から選択される、請求項５５に記載のコンジュゲート化合物。
  60. 前記標的が細菌抗原であり、前記異種部分が抗細菌剤である、請求項５５に記載のコンジュゲート化合物。
  61. 前記標的がウイルス抗原であり、前記異種部分が抗ウイルス剤である、請求項５５に記載のコンジュゲート化合物。
  62. 前記標的が腫瘍抗原であり、前記異種部分が抗腫瘍剤である、請求項５５に記載のコンジュゲート化合物。
  63. 前記標的が真菌抗原であり、前記異種部分が抗真菌剤である、請求項５５に記載のコンジュゲート化合物。
  64. 前記標的が寄生生物抗原であり、前記異種部分が抗寄生虫薬である、請求項５５に記載のコンジュゲート化合物。
  65. 前記標的がマイコプラズマ抗原であり、前記異種部分が抗マイコプラズマ剤である、請求項５５に記載のコンジュゲート化合物。
  66. 前記標的が分化または組織適合性抗原であり、前記異種部分が細胞毒性薬である、請求項５５に記載のコンジュゲート化合物。
  67. 前記システイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質が、
    （ｉ）前記親抗体またはその断片の位置２５８におけるシステインアミノ酸置換、および前記親抗体またはその断片のＫａｂａｔ位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入；
    （ｉｉ）前記親抗体の位置２８９におけるシステインアミノ酸置換、および前記親抗体の位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入；
    （ｉｉｉ）前記親抗体の位置３３９におけるシステインアミノ酸置換、および前記親抗体の位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入；
    （ｉｖ）前記親抗体またはその断片の位置４３５におけるシステインアミノ酸置換、および前記親抗体またはその断片のＫａｂａｔ位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入；
    （ｖ）前記親抗体またはその断片の位置４４２におけるシステインアミノ酸置換、および前記親抗体またはその断片のＫａｂａｔ位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入；
    （ｖｉ）前記親抗体の位置２５８の第１のシステインアミノ酸置換、および前記親抗体の位置２８９の第２のシステインアミノ酸置換；
    （ｖｉｉ）前記親抗体の位置２５８の第１のシステインアミノ酸置換、および前記親抗体の位置３３９の第２のシステインアミノ酸置換；
    （ｖｉｉｉ）前記親抗体またはその断片の位置２５８の第１のシステインアミノ酸置換、および前記親抗体またはその断片のＫａｂａｔ位置４３５の第２のシステインアミノ酸置換；
    （ｉｘ）前記親抗体またはその断片の位置２５８の第１のシステインアミノ酸置換、および前記親抗体またはその断片のＫａｂａｔ位置４４２の第２のシステインアミノ酸置換；
    （ｘ）前記親抗体の位置４３５の第１のシステインアミノ酸置換、および前記親抗体の位置２８９の第２のシステインアミノ酸置換；
    （ｘｉ）前記親抗体の位置４３５の第１のシステインアミノ酸置換、および前記親抗体の位置３３９の第２のシステインアミノ酸置換；
    （ｘｉｉ）前記親抗体またはその断片の位置４３５の第１のシステインアミノ酸置換、および前記親抗体またはその断片のＫａｂａｔ位置４４２の第２のシステインアミノ酸置換；
    （ｘｉｉｉ）前記親抗体の位置２５８および２８９におけるシステインアミノ酸置換、および前記親抗体の位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入；
    （ｘｉｖ）前記親抗体の位置２５８および３３９におけるシステインアミノ酸置換、および前記親抗体の位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入；
    （ｘｖ）前記親抗体の位置２５８および４３５におけるシステインアミノ酸置換、および前記親抗体の位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入；
    （ｘｖｉ）前記親抗体の位置２５８および４４２におけるシステインアミノ酸置換、および前記親抗体の位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入；
    （ｘｖｉｉ）前記親抗体の位置２８９および３３９におけるシステインアミノ酸置換、および前記親抗体の位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入；
    （ｘｖｉｉｉ）前記親抗体の位置３３９および４３５におけるシステインアミノ酸置換、および前記親抗体の位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入；および
    （ｘｉｘ）前記親抗体の位置４３５および４４２におけるシステインアミノ酸置換、および前記親抗体の位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入
    から選択される操作システインの二つ組または三つ組を含み、アミノ酸位置の番号付与がＫａｂａｔに記載のＥＵ指針に準拠する、請求項１〜６６のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物。
  68. 請求項１に記載のシステイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質をコードする、核酸。
  69. 請求項６８に記載の核酸を含む、ベクター。
  70. 請求項６８に記載の核酸または請求項６９に記載のベクターを含む、宿主細胞。
  71. 請求項１〜６７のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物と、希釈剤、担体、または賦形剤とを含む製剤。
  72. 請求項１〜６７のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物と、薬学的に許容可能な希釈剤、担体、または賦形剤とを含む医薬製剤。
  73. 請求項７１に記載の医薬製剤；容器；および添付文書またはラベルを含む製造品。
  74. （ｉ）位置２５８、または４３５において、少なくとも１つのコドンをシステイン（Ｃ）アミノ酸をコードするコドンで置換することで、または位置２３９および２４０のアミノ酸をコードするコドンの間にシステイン（Ｃ）をコードするコドンを挿入することで、抗体またはＦｃ融合タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列を変異誘発するステップと、
    （ｉｉ）前記システイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質を発現させるステップと；
    （ｉｉｉ）前記システイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質を単離するステップと；
    （ｉｖ）前記システイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質の少なくとも１つの操作システイン基を異種部分と反応させるステップと
    を含み、アミノ酸位置の番号付与がＫａｂａｔに記載のＥＵ指針に準拠する、請求項１〜６７のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物を作成する方法。
  75. （ｉ）可変重鎖領域または異種タンパク質をコードする核酸配列をＦｃ領域タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結するステップであって、Ｆｃ領域タンパク質をコードする核酸配列が、
    （ａ）アミノ酸位置の番号付与がＫａｂａｔに記載のＥＵ指針に準拠する、アミノ酸位置２４１、２４３、２５１、２５３、２５８、２６４、２６９、２７１、２７２、２７４、２８０、２８１、２８５、２８８、２９１、２９３、２９４、２９６、３０１、３０７、３０９、３１１、３１８、３２９、３４０、３４１、３４５、３５７、３８５、３８６、３８７、４０１、４０２、４１１、４１７、４３３、４３５、または４３９のシステインをコードし、または位置２３９および２４０のアミノ酸をコードするコドンの間に挿入される（ｉｎｔｅｒｔｅｄ）、少なくとも１つのコドンまたは
    （ｂ）アミノ酸位置の番号付与がＫａｂａｔに記載のＥＵ指針に準拠する、少なくともアミノ酸位置２４１、２４３、２５１、２５３、２５８、２６４、２７１、２８５、２８８、２９１、２９６、３０１、３０７、３０９、３１１、３２９、３８５、３８７、４３３、または４３５の、または位置２３９および２４０のアミノ酸をコードするコドンの間に挿入された、システインをコードするコドン；または
    （ｃ）アミノ酸位置の番号付与がＫａｂａｔに記載のＥＵ指針に準拠する、アミノ酸位置２５８、または４３５でシステインをコードする少なくとも１つのコドン、または位置２３９および２４０のアミノ酸をコードするコドンの間に挿入される少なくとも１つのコドン
    を含むステップと；
    （ｉｉ）前記システイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質を発現させるステップと；
    （ｉｉｉ）前記システイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質を単離するステップと；
    （ｉｖ）前記システイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質の少なくとも１つの操作システイン基を異種部分と反応させるステップと
    を含む、請求項１〜６７のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物を作成する方法。
  76. 変異誘発するステップが、部位特異的変異誘発を含む、請求項７４または７５に記載の方法。
  77. （ａ）細胞を請求項１〜６７のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物に曝露させるステップと；
    （ｂ）前記コンジュゲート化合物と標的細胞との結合程度を判定するステップと
    を含む、請求項１〜６７のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物と標的細胞との結合を検出するためのアッセイ。
  78. 請求項１〜６７のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物をそれを必要とする対象に投与するステップを含む、それを必要とする対象において、がん、自己免疫、炎症性、または伝染性疾患または障害を検出する方法。
  79. 請求項１〜６７のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物をそれを必要とする対象に投与するステップを含む、それを必要とする対象において、がん、自己免疫、炎症性、または伝染性疾患または障害を治療する方法。
  80. 化学療法、生物学的療法、免疫療法、放射線療法、ホルモン療法、および外科手術からなる群から選択される、追加的な治療を投与するステップをさらに含む、請求項７８に記載の方法。
  81. 前記細胞を請求項１〜６７のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物で処理するステップを含む、細胞に異種部分を送達する方法。
  82. 前記コンジュゲート化合物が、前記細胞によって内在化される、請求項８０に記載の方法。
  83. 少なくとも７０％のコンジュゲート化合物が、３日間の血清培養後に無傷である、請求項１〜６７のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物。
  84. 少なくとも７０％のコンジュゲート化合物が、７日間の血清培養後に無傷である、請求項１〜６７のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物。
  85. 血清と共に培養した際に、前記コンジュゲートが、７日間の期間にわたり５０％未満の活性喪失を示す、請求項１〜６７、８３または８４のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物。
  86. 前記血清が、齧歯類血清、イヌ血清、霊長類血清、およびヒト血清から選択される、請求項８３、８４または８５に記載のコンジュゲート。
  87. 前記培養が４℃〜３７℃で実施される、請求項６８または６９に記載のコンジュゲート。
  88. 活性が、細胞死滅アッセイ中で判定される、請求項８５〜８７のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物。
  89. システイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質の少なくとも１つの操作システイン基を異種部分と反応させるステップを含み、前記抗体のＦｃドメインまたはＦｃ融合タンパク質が、アミノ酸位置２４１、２４３、２５１、２５３、２５８、２６４、２６９、２７１、２７２、２７４、２８０、２８１、２８５、２８８、２９１、２９３、２９４、２９６、３０１、３０７、３０９、３１１、３１８、３２９、３４０、３４１、３４５、３５７、３８５、３８６、３８７、４０１、４０２、４１１、４１７、４３３、４３５、または４３９におけるシステインアミノ酸置換、位置２３９および２４０間のシステインアミノ酸挿入、およびそれらの組み合わせから選択される、少なくとも１つの操作システインアミノ酸を含み、前記アミノ酸位置番号付与がＫａｂａｔに記載のＥＵ指針に準拠する、コンジュゲート化合物を作成する方法。
  90. 前記操作システインアミノ酸が、アミノ酸位置２４１、２４３、２５１、２５３、２５８、２６４、２７１、２８５、２８８、２９１、２９６、３０１、３０７、３０９、３１１、３２９、３８５、３８７、４３３、または４３５におけるシステインアミノ酸置換、位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入、およびそれらの組み合わせから選択され、前記アミノ酸位置の番号付与がＫａｂａｔに記載のＥＵ指針に準拠する、請求項８４に記載の方法。
  91. 前記操作システインアミノ酸が、アミノ酸位置２５８、または４３５におけるシステインアミノ酸置換、位置２３９および２４０の間のシステインアミノ酸挿入、およびそれらの組み合わせから選択され、前記アミノ酸位置の番号付与がＫａｂａｔに記載のＥＵ指針に準拠する、請求項８４に記載の方法。
  92. 前記コンジュゲーション効率が、アミノ酸位置２８９にシステインアミノ酸置換を有する異種部分に、同等のシステイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質の操作システイン基を反応させて得られる値の少なくとも５０％であり、前記アミノ酸位置の番号付与がＫａｂａｔに記載のＥＵ指針に準拠する、請求項８４〜８６のいずれか一項に記載の方法。
  93. 前記コンジュゲーション効率が、アミノ酸位置２８９にシステインアミノ酸置換を有する異種部分に、同等のシステイン操作抗体またはＦｃ融合タンパク質の操作システイン基を反応させて得られる値の１００％を上回り、前記アミノ酸位置の番号付与がＫａｂａｔに記載のＥＵ指針に準拠する、請求項８４〜８６のいずれか一項に記載の方法。
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