JP2017508993A - Methods and devices for analyzing biological specimens - Google Patents

Methods and devices for analyzing biological specimens Download PDF

Info

Publication number
JP2017508993A
JP2017508993A JP2016574350A JP2016574350A JP2017508993A JP 2017508993 A JP2017508993 A JP 2017508993A JP 2016574350 A JP2016574350 A JP 2016574350A JP 2016574350 A JP2016574350 A JP 2016574350A JP 2017508993 A JP2017508993 A JP 2017508993A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
microtiter plate
base
functionalized
measurement
structural element
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2016574350A
Other languages
Japanese (ja)
Other versions
JP6667460B2 (en
JP2017508993A5 (en
Inventor
ギーリング ゼバスティアン
ギーリング ゼバスティアン
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Paia Biotech GmbH
Original Assignee
Paia Biotech GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Paia Biotech GmbH filed Critical Paia Biotech GmbH
Publication of JP2017508993A publication Critical patent/JP2017508993A/en
Publication of JP2017508993A5 publication Critical patent/JP2017508993A5/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP6667460B2 publication Critical patent/JP6667460B2/en
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5025—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures for parallel transport of multiple samples
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/508—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above
    • B01L3/5085—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above for multiple samples, e.g. microtitration plates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0647—Handling flowable solids, e.g. microscopic beads, cells, particles
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0647—Handling flowable solids, e.g. microscopic beads, cells, particles
    • B01L2200/0668—Trapping microscopic beads
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
    • B01L2300/0627—Sensor or part of a sensor is integrated
    • B01L2300/0654—Lenses; Optical fibres
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
    • B01L2300/0829—Multi-well plates; Microtitration plates
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0848—Specific forms of parts of containers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0848—Specific forms of parts of containers
    • B01L2300/0851—Bottom walls
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0848—Specific forms of parts of containers
    • B01L2300/0858—Side walls
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0887—Laminated structure
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/16—Surface properties and coatings
    • B01L2300/168—Specific optical properties, e.g. reflective coatings
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0403—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces
    • B01L2400/0409—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces centrifugal forces
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0403—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces
    • B01L2400/043—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces magnetic forces
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0403—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces
    • B01L2400/0457—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces passive flow or gravitation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N2021/6482—Sample cells, cuvettes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/01—Arrangements or apparatus for facilitating the optical investigation
    • G01N21/03—Cuvette constructions
    • G01N21/0303—Optical path conditioning in cuvettes, e.g. windows; adapted optical elements or systems; path modifying or adjustment
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6452—Individual samples arranged in a regular 2D-array, e.g. multiwell plates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2201/00—Features of devices classified in G01N21/00
    • G01N2201/06—Illumination; Optics
    • G01N2201/064—Stray light conditioning
    • G01N2201/0642—Light traps; baffles

Abstract

本発明は、１つ以上の機能化された表面の存在下に水溶液中で生物学的検体の定量分析を行うための方法であって、前記水溶液は少なくとも１種類の生物学的検体および少なくとも１種類の蛍光マーカーを含有する前記方法において、前記１つ以上の生物学的検体の量および／または濃度を分析するために未結合の蛍光マーカーの蛍光放射を測定することを特徴とする前記方法、ならびに前記方法を実施することができるデバイスに関する。The present invention is a method for performing quantitative analysis of a biological specimen in an aqueous solution in the presence of one or more functionalized surfaces, the aqueous solution comprising at least one biological specimen and at least one biological specimen. Said method comprising a fluorescent marker of the kind, characterized in that the fluorescence emission of unbound fluorescent marker is measured in order to analyze the amount and / or concentration of said one or more biological analytes, As well as a device capable of carrying out the method.

Description

本願は、未結合の発光マーカーの発光を測定することにより生物学的検体を定性的および／または定量的に分析するための方法、およびこのためのデバイス、および該デバイスの使用に関する。   The present application relates to a method for qualitatively and / or quantitatively analyzing biological analytes by measuring the luminescence of unbound luminescent markers, and a device for this, and the use of the device.

近年の作用物質の開発やその他生命科学の分野における研究において、またバイオ医薬品の製造に際して、重要な手法の一つに、生物学的単位、例えば核酸、タンパク質、抗体、細菌、ウイルスまたは細胞、いわゆる生物学的検体の定量的および／または定性的な分析およびカウントが挙げられる。   In the development of active substances in recent years and other research in the field of life science, and in the production of biopharmaceuticals, one of the important methods is biological units such as nucleic acids, proteins, antibodies, bacteria, viruses or cells Quantitative and / or qualitative analysis and counting of biological specimens may be mentioned.

生物学的検体を分析するための手法または方法に対する要求は一般的に高く、該要求は特に濃度範囲、測定精度および試料調製に関して極めて多岐にわたる。分析する生物学的検体が同一であっても、測定手法は測定の目的に応じて大きく異なりうる。例えば、診断学においてはタンパク質は血清サンプル中で極めて低濃度で測定されるが、一方でタンパク質は生物工学的製造法においては培地内に存在し、該培地内で数十乗高い濃度で存在する。さらにこうした手法は、検体の分析の他に、例えば活性または親和性および特異性に関するより多くの情報を提供しうる。数十年にわたって、特定の生物学的検体、特にタンパク質および抗体を分析するための標準的な方法として、いわゆる「酵素結合免疫吸着アッセイ」、略して「ＥＬＩＳＡアッセイ」または「ＥＬＩＳＡ法」が確立されている。これは、イムノアッセイと酵素による呈色反応とを組み合わせたものである。ＥＬＩＳＡアッセイの原理は、本質的に、生物学的検体（例えばタンパク質）をスカベンジャー分子により表面（例えばマイクロタイタープレート）に結合させることである。スカベンジャー分子は、典型的には抗体、そのフラグメントであるか、またさらにはプロテインＡまたはプロテインＧである。   The demands on techniques or methods for analyzing biological specimens are generally high, and the demands are very diverse, especially with regard to concentration range, measurement accuracy and sample preparation. Even if the biological specimen to be analyzed is the same, the measurement technique can vary greatly depending on the purpose of the measurement. For example, in diagnostics, proteins are measured at very low concentrations in serum samples, whereas in biotechnological manufacturing methods, proteins are present in culture media and are present at concentrations that are tens of powers higher in the culture media. . Furthermore, such techniques can provide more information about the activity or affinity and specificity in addition to the analysis of the analyte, for example. Over the decades, the so-called “enzyme-linked immunosorbent assay”, abbreviated “ELISA assay” or “ELISA method” has been established as a standard method for analyzing specific biological specimens, especially proteins and antibodies. ing. This is a combination of an immunoassay and an enzymatic color reaction. The principle of an ELISA assay is essentially to bind a biological analyte (eg, protein) to a surface (eg, a microtiter plate) with a scavenger molecule. The scavenger molecule is typically an antibody, a fragment thereof, or even protein A or protein G.

広く用いられているいわゆるサンドイッチＥＬＩＳＡ法では、スカベンジャーとして抗体を使用し、次いで検体上の第２の結合部位に検出抗体を結合させる。この検出抗体には酵素が結合されている（例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＨＲＰ）。この酵素は、該酵素の基質を添加することで酵素反応を生じ、これにより色素が生じる。典型的な基質はテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）またはジアミノベンジジン（ＤＡＢ）であり、これらは溶液を青色または褐色に染色する。こうした染色を分光分析法によって測定しうる前に、停止試薬の添加により酵素反応を停止させる必要がある。ＨＲＰにより生成される色素の量は検体の量に比例しており、適切な検出器で、通常はＵＶ／ＶＩＳ光度計で測定される。これに関して、蛍光生成物（例えばレゾルフィン）を生じる酵素基質も知られており、該蛍光生成物は蛍光測定装置により検出される。酵素反応によって、結合した各検体分子についてのサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイにおいて多数の色素分子が生成されうる。こうした増幅作用により、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイは通常は極めて高い感度または検出能力を示す。   In the widely used so-called sandwich ELISA method, an antibody is used as a scavenger, and then a detection antibody is bound to a second binding site on the specimen. An enzyme is bound to this detection antibody (for example, horseradish peroxidase, Horseradish peroxidase, HRP). This enzyme causes an enzymatic reaction by adding a substrate of the enzyme, thereby producing a dye. Typical substrates are tetramethylbenzidine (TMB) or diaminobenzidine (DAB), which stain the solution blue or brown. Before such staining can be measured by spectroscopic methods, it is necessary to stop the enzymatic reaction by adding a stop reagent. The amount of dye produced by HRP is proportional to the amount of analyte and is measured with a suitable detector, usually a UV / VIS photometer. In this regard, enzyme substrates that produce fluorescent products (eg, resorufin) are also known, which are detected by a fluorescence measuring device. Enzymatic reactions can generate a large number of dye molecules in a sandwich ELISA assay for each analyte molecule bound. Due to these amplification effects, sandwich ELISA assays usually show very high sensitivity or detectability.

ＥＬＩＳＡ法も広く用いられている。この方法は、酵素で標識した検出抗体が検体に直接結合するのではなくもう１つのいわゆる一次抗体に結合し、該一次抗体が検体に特異的に結合することを特徴としている。この変法は、酵素で標識した一次抗体を入手することができない場合や、全体的に抗体同士の非特異的な結合が生じ易い場合に用いられる。   The ELISA method is also widely used. This method is characterized in that the detection antibody labeled with the enzyme does not directly bind to the specimen but binds to another so-called primary antibody, and the primary antibody specifically binds to the specimen. This modified method is used when a primary antibody labeled with an enzyme cannot be obtained or when nonspecific binding between antibodies tends to occur as a whole.

直接ＥＬＩＳＡ法は、スカベンジャー分子として抗体ではなく抗原を使用することを特徴としており、該抗原を測定すべき抗体に結合させる。検出は、検出抗体に関して上記した方法と同様に行われる。   The direct ELISA method is characterized by using an antigen instead of an antibody as a scavenger molecule, and the antigen is bound to the antibody to be measured. Detection is performed in the same manner as described above for the detection antibody.

ＥＬＩＳＡ法の欠点の一つに、該方法がインキュベーションステップおよび洗浄ステップを複数含んでおり、こうしたステップを数回行う必要が多いことが挙げられる。これらの作業ステップは自動化が不可能であるかまたは部分的にしか可能でないため、現在では主に手動で行われている。これにより、ＥＬＩＳＡアッセイは人員および時間を要するものとなっている。ＥＬＩＳＡ法では実験時間が４〜５時間となることが多いことから、迅速な結果が必要とされるプロセスや複数のサンプルの測定が望ましいプロセス、例えばＨＴＳ（ハイスループットスクリーニング、Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ−Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）においては、ＥＬＩＳＡアッセイは用いられない。   One disadvantage of the ELISA method is that it involves multiple incubation and washing steps, and these steps often need to be performed several times. These work steps are currently mainly done manually because they cannot be automated or only partially possible. This makes the ELISA assay time consuming and time consuming. In the ELISA method, the experiment time is often 4 to 5 hours. Therefore, a process that requires rapid results or a process in which measurement of a plurality of samples is desirable, for example, HTS (High Throughput Screening, High-Throughput-Screening) In the ELISA assay is not used.

ＥＬＩＳＡ法の欠点はさらに、作業ステップが複数存在することから、生じるトータルエラーが比較的大きいという点にある。これは、各作業ステップが固有のばらつきを引き起こし、こうしたばらつきが積み重なって全体的なばらつきとなるためである。   A further disadvantage of the ELISA method is that the total error that occurs is relatively large due to the presence of multiple work steps. This is because each work step causes a unique variation, and these variations are accumulated to form an overall variation.

ＥＬＩＳＡ法をより迅速にかつより少ない人員および時間で行う試みがすでになされている。ＥＬＩＳＡ法の変法の一つが「蛍光イムノアッセイ」（ＦＩＡまたは”ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ”）である。蛍光イムノアッセイは、一般に前述の「古典的な」ＥＬＩＳＡ法よりも実施が容易である。   Attempts have already been made to perform the ELISA method more quickly and with less personnel and time. One variation of the ELISA method is the “fluorescence immunoassay” (FIA or “fluorescent immunoassay”). Fluorescent immunoassays are generally easier to perform than the “classical” ELISA method described above.

蛍光色素で標識された検出抗体の使用により、蛍光イムノアッセイでは酵素反応なしで作業することができる。これによって方法ステップ数が減少することから、不安定な酵素活性による変動が排除される。この蛍光イムノアッセイは、均一系内でも不均一系内でも行うことができる。不均一系内で行われる場合には特別な粒子が使用されることが多く、また蛍光が該粒子上で測定されるのに対して、均一系蛍光イムノアッセイでは蛍光測定は溶液中で行われる。それにより古典的なＥＬＩＳＡ法のいくつかのステップが省かれ、また実験時間は通常は２〜３時間に短縮される。しかし、酵素反応を行わないことにより、結果としてこうした手法における感度はＥＬＩＳＡの場合よりも低くなる場合が多い。   By using a detection antibody labeled with a fluorescent dye, a fluorescent immunoassay can work without an enzymatic reaction. This reduces the number of method steps, thus eliminating variations due to unstable enzyme activity. This fluorescent immunoassay can be performed in homogeneous or heterogeneous systems. When performed in a heterogeneous system, special particles are often used, and fluorescence is measured on the particles, whereas in homogeneous fluorescence immunoassay, fluorescence measurements are performed in solution. This eliminates several steps of the classic ELISA method and the experimental time is usually reduced to 2-3 hours. However, by not performing the enzyme reaction, the sensitivity in such a technique is often lower than in the case of ELISA.

均一系蛍光イムノアッセイの一例は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社のＤｅｌｆｉａ技術（解離増強型ランタニド蛍光イムノアッセイ）である。この方法では、検出抗体に結合したユーロピウム錯体を溶解させ、次いで、蛍光、特に時間分解蛍光を測定する。もう１つの知られている方法は、Ｃｉｓｂｉｏ社よりＨＴＲＦ技術（「均一時間分解蛍光」”ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ｔｉｍｅ ｒｅｓｏｌｖｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ”）として提供されているＴＲ−ＦＲＥＴ技術、およびＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社のＬＡＮＣＥ技術（「ランタニドキレート励起」”Ｌａｎｔｈａｎｉｄｅ Ｃｈｅｌａｔｅ Ｅｘｃｉｔｅ”）である。   An example of a homogeneous fluorescence immunoassay is Perkin-Elmer's Delfia technology (dissociation enhanced lanthanide fluorescence immunoassay). In this method, the europium complex bound to the detection antibody is dissolved and then fluorescence, in particular time-resolved fluorescence, is measured. Another known method is the TR-FRET technology provided by Cisbio as HTRF technology ("homogeneous time resolved fluorescence") and the LANCE technology of Perkin-Elmer ("Lantanid"). Chelate excitation "" Lanthanide Chelate Excite ").

前述のＴＲ−ＦＲＥＴ法は、相互に結合している２つの抗体が空間的に近づけられる場合に、つまり該抗体が互いに結合している場合に、該抗体が蛍光共鳴移動（ＦＲＥＴ）を生じうるように、該抗体が蛍光色素で標識されているという原理に基づく。一方の抗体にはＦＲＥＴドナーが結合しており、他方の抗体にはＦＲＥＴアクセプターが結合している。ＦＲＥＴは、抗体の互いの間隔が１０ｎｍ未満である場合にしか機能しない。前述の抗体が互いに結合すると、ＦＲＥＴドナーは特定の波長の光で励起されて蛍光を発することができる。ＦＲＥＴドナーの放射光によりＦＲＥＴアクセプターが励起されて蛍光放射を発し、これが測定される。すなわち、双方の抗体が（溶液中で）互いに結合している場合にしか、ＦＲＥＴアクセプターの蛍光放射を測定することができない。ここで、そのような溶液を装入し、これに検体を加え、該検体がＦＲＥＴアクセプターまたはＦＲＥＴドナーに結合すると、これら２つのＦＲＥＴパートナーの一方が複合体から排除され、それによりＦＲＥＴアクセプターの蛍光放射が検体の濃度に依存して低減する。   The above-mentioned TR-FRET method can cause fluorescence resonance transfer (FRET) when two antibodies bound to each other are brought close to each other, that is, when the antibodies are bound to each other. Thus, based on the principle that the antibody is labeled with a fluorescent dye. One antibody has a FRET donor bound thereto, and the other antibody has a FRET acceptor bound thereto. FRET only works if the distance between the antibodies is less than 10 nm. When the aforementioned antibodies bind to each other, the FRET donor can be excited by a specific wavelength of light to fluoresce. The FRET acceptor excites the FRET acceptor to emit fluorescent radiation, which is measured. That is, the fluorescence emission of the FRET acceptor can only be measured when both antibodies are bound to each other (in solution). Here, when such a solution is charged, the sample is added to it, and the sample binds to the FRET acceptor or FRET donor, one of these two FRET partners is eliminated from the complex, thereby causing the fluorescence of the FRET acceptor. Radiation is reduced depending on the concentration of the analyte.

ＦＲＥＴは、２分子の結合を検出するために研究において広く用いられている技術の一つである。しかし、移動効率がサンプル組成に大きく依存することも知られている。この技術をルーチン処理可能な方法とするために、ＴＲ−ＦＲＥＴ技術では、ユーロピウムイオンまたはテルビウムイオンと（例えばトリスビピリジンをベースとする）マクロサイクルとの錯体からなる特別なＦＲＥＴドナーが用いられる。このＦＲＥＴドナーは、サンプル中に存在しうる他の蛍光物質よりも、より長期にわたって持続する蛍光を放射する特性を有する。従って、蛍光の測定は、閃光後に所定の時間的間隔をあけてからでないと行われない。そのため、妨害蛍光がサンプルから減衰してＦＲＥＴ蛍光が生じるまで待機する。それにもかかわらず、ＴＲ−ＦＲＥＴ技術の場合には、マトリックスの影響および蛍光放射の消光（消滅）を算出により補償するために、ＦＲＥＴドナーの放射のみならずＦＲＥＴアクセプターの放射をも測定してその比を求める必要がある。この補償が最適に機能するためには、双方の放射波長を逐次的にではなく同時に測定しなければならない。このことは、正確なＴＲ−ＦＲＥＴ測定を行うための測定装置に２つの検出器が備えられていなければならないことを意味する。ＴＲ−ＦＲＥＴ法のための典型的な測定範囲は、約１０〜５０００ｎｇ／ｍＬ 抗体である。   FRET is one of the techniques widely used in research to detect the binding of two molecules. However, it is also known that the transfer efficiency is highly dependent on the sample composition. To make this technique a routine process, the TR-FRET technique uses a special FRET donor consisting of a complex of europium or terbium ions and a macrocycle (eg based on trisbipyridine). This FRET donor has the property of emitting longer lasting fluorescence than other fluorescent materials that may be present in the sample. Therefore, the measurement of fluorescence is not performed until a predetermined time interval is provided after the flash. Therefore, it waits until the interfering fluorescence decays from the sample and FRET fluorescence occurs. Nevertheless, in the case of TR-FRET technology, in order to compensate for the influence of the matrix and the quenching (extinction) of the fluorescence radiation, not only the radiation of the FRET donor but also the radiation of the FRET acceptor is measured and It is necessary to find the ratio. In order for this compensation to work optimally, both emission wavelengths must be measured simultaneously rather than sequentially. This means that two detectors must be provided in the measuring device for performing an accurate TR-FRET measurement. A typical measurement range for the TR-FRET method is about 10-5000 ng / mL antibody.

古典的なＥＬＩＳＡアッセイのもう１つの変法は、Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒのＡｌｐｈａＬＩＳＡ法である。この場合、プローブで標識された抗体ペアが、同一の検体の異なる結合部位への結合によって空間的に近接する。   Another variation of the classic ELISA assay is the Perkin-Elmer AlphaLISA method. In this case, antibody pairs labeled with probes are spatially close to each other by binding to the same analyte at different binding sites.

ＴＲ−ＦＲＥＴとは異なり、この場合にはプローブとして低分子量のフルオロフォアが使用されるのではなく、約２５０〜３５０ｎｍのサイズを有するドナー粒子およびアクセプター粒子（いわゆるドナービーズおよびアクセプタービーズ）が使用される。このドナービーズに６８０ｎｍの波長のレーザー光を照射することによってこれらから一重項酸素が放出され、該一重項酸素が、近傍に存在するアクセプタービーズ上で約６１５ｎｍの波長の光放射を引き起こす。次いで、これを測定して検体の定量化に利用する。ＴＲ−ＦＲＥＴの場合とは異なり、ＡｌｐｈａＬＩＳＡではプローブ担持分子を同時に添加することができないために第２の反応時間（インキュベーション時間）が必要であり、結果的にプロトコールが長くなる。   Unlike TR-FRET, in this case, a low molecular weight fluorophore is not used as a probe, but donor particles and acceptor particles (so-called donor beads and acceptor beads) having a size of about 250 to 350 nm are used. Is done. By irradiating the donor beads with laser light having a wavelength of 680 nm, singlet oxygen is released therefrom, and the singlet oxygen causes light emission with a wavelength of about 615 nm on the acceptor beads present in the vicinity. This is then measured and used for sample quantification. Unlike TR-FRET, since AlphaLISA cannot simultaneously add probe-carrying molecules, a second reaction time (incubation time) is required, resulting in a longer protocol.

ドナービーズは光に敏感である。これを用いる場合には暗所かまたは緑色光中でしか作業することができず、このことがこの手法の著しい欠点の一つである。ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイで使用することができるレーザーは、特殊な蛍光プレートリーダー中にしか組み込まれていないことが多く、こうした機器を所有または購入する必要があり、これによって実験のコストが高くなる。   Donor beads are sensitive to light. When used, it can only work in the dark or in green light, which is one of the significant disadvantages of this approach. Lasers that can be used in AlphaLISA assays are often only incorporated into specialized fluorescent plate readers, which necessitates owning or purchasing such equipment, which increases the cost of the experiment.

粒子をベースとする不均一系蛍光イムノアッセイでは、古典的なＥＬＩＳＡ法と同様に、最初に生物学的検体をスカベンジャー分子によって表面に（この場合、機能化された不溶性粒体、いわゆる粒子）に結合させる。洗浄ステップ後、蛍光標識された検出抗体をこれに加え、混合し、次いで未結合の蛍光標識された検出抗体を除去する。粒子に結合した蛍光標識された検出抗体の量を測定し、その際、該粒子に結合した蛍光マーカーの蛍光によって、生物学的検体の含有量を分析する。このような手法または分析法は知られている（Ｃ．Ｆ．ＷｏｏｌｌｅｙおよびＭ．Ａ．Ｈａｙｅｓによる総説”Ｒｅｃｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｍｉｃｒｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ”，Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ（２０１３）５（２）参照）。   In particle-based heterogeneous fluorescent immunoassays, as in classic ELISA methods, biological analytes are first bound to the surface by scavenger molecules (in this case, functionalized insoluble particles, so-called particles). Let After the washing step, fluorescently labeled detection antibody is added thereto, mixed, and then unbound fluorescently labeled detection antibody is removed. The amount of fluorescently labeled detection antibody bound to the particle is measured, and the content of the biological specimen is analyzed by the fluorescence of the fluorescent marker bound to the particle. Such techniques or methods of analysis are known (see review by CF Woolley and MA Hayes “Recent developments in emerging microimmunassays”, Bioanalysis (2013) 5 (2)).

Ｇｙｒｏｓ ＡＢ社により用いられた「ＧＹＲＯＳ技術」ではマイクロフルイディクス構造が使用されており、少量のサンプルを遠心分離して（通常は小さな柱体の形態の）粒子堆積物とし、該粒子堆積物の上に蛍光標識されたサンドイッチ複合体を生じさせてこれを測定する。マイクロフルイディクス全体は円形のプラスチックディスク内で実現され、その際、（例えばＣＤ−ＲＯＭの場合のように）該ディスクがその中心軸の周りを回転することによって、液体（例えば、溶解されたスカベンジャー分子、サンプル、洗浄溶液）が流路を通じて外側へと押し出される。ＧＹＲＯＳ技術を用いた場合には１ｎｇ／ｍＬ以上の濃度しか測定できないため、該技術は特にバイオテクノロジーによるプロセスの開発および制御に用いられる。   The “GYROS technology” used by Gyros AB uses a microfluidic structure, where a small amount of sample is centrifuged to form a particle deposit (usually in the form of a small column) and the particle deposit This is measured by producing a fluorescently labeled sandwich complex on top. The entire microfluidics is realized in a circular plastic disc, in which case the liquid (eg a dissolved scavenger) is rotated by rotating the disc around its central axis (eg as in a CD-ROM). Molecules, samples, wash solutions) are pushed out through the flow path. Since the GYROS technology can only measure concentrations of 1 ng / mL or higher, the technology is used in particular for the development and control of biotechnological processes.

Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ社はＳＩＭＯＡ（”Ｓｉｎｇｌｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ａｒｒａｙ”）と呼ばれる技術を提供しており、その際、粒子上にサンドイッチ免疫複合体が形成される。次いで、数十万のキャビティ（凹部／凸部）（該キャビティはそれぞれ粒子を１つだけ収容することができる）にマイクロフルイディクスにより粒子をチップ上に分配する。その後、検出のためにキャビティを密封し、酵素を活性化させ、該酵素が蛍光色素を生成する。検体濃度が極めて低い場合、１つのキャビティ中に存在する検体分子は平均で１つ未満であり、すなわち蛍光を有するかまたは有しないキャビティのみが存在し、該キャビティをカウントする。従って、このアッセイは「デジタルＥＬＩＳＡ」とも称される。このアッセイにより、１０−１５Ｍ未満の検出限界が達成可能である（Ｒｉｓｓｉｎ ｅｔ ａｌ．：”Ｓｉｎｇｌｅ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙｓ ｄｅｔｅｃｔｓ ｓｅｒｕｍ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｔ ｓｕｂｆｅｍｔｏｍｏｌａｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ”，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２８（６），５９５参照）。 Quantelix provides a technique called SIMOA (“Single molecule array”), in which a sandwich immune complex is formed on the particles. The particles are then distributed on the chip by microfluidics into hundreds of thousands of cavities (concave / convex), each of which can contain only one particle. The cavity is then sealed for detection and the enzyme is activated, which produces a fluorescent dye. If the analyte concentration is very low, there is an average of less than one analyte molecule present in one cavity, i.e. there are only cavities with or without fluorescence, counting the cavities. This assay is therefore also referred to as a “digital ELISA”. With this assay, a detection limit of less than 10 −15 M can be achieved (see Rissin et al .: “Single-molecule enzyme-like immunosorbent assays detect serum protocols at sub-molecular concentrations 5”). ).

ＧＹＲＯＳおよびＳＩＭＯＡは多段法であり、コストの高い微細構造化消耗品（例えば上記のディスク）だけでなく、専用の高価な読取り装置が必要である。   GYROS and SIMOA are multi-stage methods that require not only costly microstructured consumables (e.g., the above-described disks), but also dedicated and expensive readers.

粒子に結合している蛍光標識された免疫複合体の測定には、フローサイトメーターを使用することもできる。この場合、粒子はフローシステムによって個別に測定点へと輸送され、該測定点で該粒子をレーザー光で励起させて蛍光を生じさせる。フローサイトメーターを用いた測定は、異なる検体を同時に分析できるという利点を有する。このために、その内部にカラーコードを有する粒子、すなわち識別可能な蛍光色素がドープされた粒子が使用され、その際、各色は所定の検体との結合を表す。測定には２つのレーザーが同時に使用される。第１のレーザーはカラーコードにより粒子の種類を特定し、第２のレーザーは結合した免疫複合体の含有量を特定する。ＸＭＡＰ技術（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐ．）では１回の実験実施で１００個までの異なる検体を検出することができ、これはマルチプルユースと称される。   A flow cytometer can also be used to measure fluorescently labeled immune complexes bound to the particles. In this case, the particles are individually transported to a measurement point by the flow system, and the particles are excited with laser light at the measurement point to generate fluorescence. Measurement using a flow cytometer has the advantage that different analytes can be analyzed simultaneously. For this purpose, particles having a color code therein, that is, particles doped with an identifiable fluorescent dye are used, where each color represents binding to a predetermined analyte. Two lasers are used simultaneously for the measurement. The first laser identifies the type of particle by color code, and the second laser identifies the content of bound immune complexes. With XMAP technology (Luminex Corp.), up to 100 different specimens can be detected in a single experiment, which is called multiple use.

上記の方法に加えて、特に組換え型のタンパク質および抗体を製造するためのプロセスの開発および制御の分野においては、ＥＬＩＳＡよりも簡単な他の測定方法、例えばバイオレイヤー干渉法（Ｂｉｏｌａｙｅｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ）（ＢＬＩ、Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏより）または表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ＳＰＲ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｂｉａｃｏｒｅ）が使用されている。これらの方法、特にＢＬＩは、より高い自動化レベルを可能とし、かつ、典型的にはプロテインＡまたはＧでまたは抗体で被覆された表面への検体の結合に基づいている。   In addition to the methods described above, especially in the field of development and control of processes for producing recombinant proteins and antibodies, other measurement methods that are simpler than ELISA, such as Biolayer Interferometry (Biolayer Interferometry) ( BLI, from Pall ForteBio) or surface plasmon resonance (SPR, GE Healthcare, Biacore). These methods, particularly BLI, allow for a higher level of automation and are typically based on the binding of analytes to surfaces coated with protein A or G or with antibodies.

表面への検体の結合によって該表面の光学特性の変化が引き起こされ、これが測定される。これによって、表面に結合した分子の量が算出される。例えば、ＢＬＩの場合には０．５〜２０００μｇ／ｍＬの測定範囲が達成され、ＳＰＲの場合には０．１５〜１０μｇ／ｍＬの測定範囲が達成される。この手法の欠点には、比較的高価で特殊な測定装置が必要であること、そして特殊な消耗品（例えばセンサーおよびチップ）が必要であることが挙げられる。   The binding of the analyte to the surface causes a change in the optical properties of the surface, which is measured. This calculates the amount of molecules bound to the surface. For example, a measurement range of 0.5 to 2000 μg / mL is achieved in the case of BLI, and a measurement range of 0.15 to 10 μg / mL is achieved in the case of SPR. Disadvantages of this approach include the need for relatively expensive and specialized measurement equipment and the need for specialized consumables (eg, sensors and chips).

上記の方法はいずれも、実験実施が煩雑である点で不利である。これらの方法は生物学的検体を定量化するための多数の作業ステップを必要とすることが多いため、実施のコストが高い。同様に、イムノアッセイに基づく単純化された方法が利用可能であって、これによってより高濃度のサンプルを測定することができ、かつ／または、これによって結果が迅速に得られることが望まれるという、適用および学術的な課題が存在する。さらに、様々な液体中で、例えば血清または細胞培養上清中で特定の抗体を分析することができるイムノアッセイが利用可能であることが望ましい。このことは特に抗体の組換えによる（工業的な）製造に際して有利であり、それにより、タンパク質の製造の際に容易に、迅速にかつ安価に定性的および／または定量的な言明を行うことができる。さらに、わずかな作業ステップで済み、それにより時間および試薬を節約することができる、生物学的検体を分析するため方法、特にイムノアッセイが利用可能であることが望ましい。従って、上記の欠点を完全にまたは少なくとも部分的に回避する、好ましくはイムノアッセイとしての、生物学的検体を分析するための単純で容易に実施可能でありかつ迅速な方法が求められている。   All of the above methods are disadvantageous in that the experiment implementation is complicated. These methods are often expensive to implement because they often require a large number of work steps to quantify the biological analyte. Similarly, a simplified method based on an immunoassay is available, whereby a higher concentration of sample can be measured and / or it is desired that results are obtained quickly. There are application and academic challenges. Furthermore, it is desirable to have available immunoassays that can analyze specific antibodies in various fluids, such as serum or cell culture supernatant. This is particularly advantageous in the case of recombinant (industrial) production of antibodies, so that qualitative and / or quantitative statements can be made easily, quickly and inexpensively during the production of proteins. it can. In addition, it is desirable to have available methods, particularly immunoassays, for analyzing biological specimens that require only a few work steps, thereby saving time and reagents. There is therefore a need for a simple, easily feasible and rapid method for analyzing biological specimens, preferably as an immunoassay, which avoids the above disadvantages completely or at least in part.

従って本発明の課題は、上記の欠点を完全にまたは少なくとも部分的に回避する方法を提供することである。   The object of the present invention is therefore to provide a method which completely or at least partially avoids the abovementioned drawbacks.

上記の課題は、特許請求の範囲に記載された方法により、特に本発明によるデバイスまたは該デバイスの使用により解決された。決定的に重要であるのは、未結合の発光マーカーまたは蛍光マーカーの発光放射または蛍光放射を測定するという点であり、それにより、生物学的検体の分析を容易に迅速にかつ安価で実施することができる。   The above problems have been solved by the methods described in the claims, in particular by the device according to the invention or the use of the device. Of critical importance is the measurement of the emission or fluorescence emission of unbound or fluorescent markers, thereby facilitating the analysis of biological specimens easily, quickly and inexpensively. be able to.

従って本発明は、１つ以上の機能化された表面の存在下に水溶液中で生物学的検体を分析するため（特に定量化するため）の方法であって、前記水溶液は少なくとも１種類の生物学的検体および少なくとも１種類の発光マーカー、好ましくは蛍光マーカーを含有する前記方法において、前記１つ以上の生物学的検体の量および／または濃度を分析するために、未結合の発光マーカーの、好ましくは未結合の蛍光マーカーの、発光放射、好ましくは蛍光放射を測定することを特徴とする前記方法に関する。   Accordingly, the present invention is a method for analyzing (especially quantifying) a biological analyte in an aqueous solution in the presence of one or more functionalized surfaces, the aqueous solution comprising at least one biological species. In the method comprising a biological analyte and at least one luminescent marker, preferably a fluorescent marker, for analyzing the amount and / or concentration of the one or more biological analytes, It relates to said method, characterized in that the luminescent emission, preferably the fluorescence emission, of unbound fluorescent markers is measured.

本発明による方法を用いて、任意のアッセイを行うことができる。好ましくは、本発明による方法はいわゆるイムノアッセイであり、特に、直接イムノアッセイ、サンドイッチイムノアッセイ、置換イムノアッセイまたはディスプレイスメントイムノアッセイ（本明細書中では阻害アッセイとも称される）、競合イムノアッセイおよび二次イムノアッセイからなる群から選択されるイムノアッセイである。   Any assay can be performed using the method according to the invention. Preferably, the method according to the invention is a so-called immunoassay, in particular the group consisting of a direct immunoassay, a sandwich immunoassay, a displacement immunoassay or a displacement immunoassay (also referred to herein as an inhibition assay), a competitive immunoassay and a secondary immunoassay. An immunoassay selected from

一実施形態［Ｖ−１］においては、本発明による方法において、機能化された表面として、ポリマーまたはポリマー混合物からの機能化された粒子であって該粒子の表面上にスカベンジャー分子が存在している粒子が使用され、該スカベンジャー分子が１つ以上の生物学的検体および／または１つ以上の蛍光マーカーと結合する。機能化された粒子は、有利には、約２０〜約２００μｍの範囲内、または約８０〜約２００μｍの範囲内の平均直径を有する。   In one embodiment [V-1], in the method according to the invention, the functionalized surface is a functionalized particle from a polymer or polymer mixture, wherein a scavenger molecule is present on the surface of the particle. Particles are used, and the scavenger molecule binds to one or more biological analytes and / or one or more fluorescent markers. The functionalized particles advantageously have an average diameter in the range of about 20 to about 200 μm, or in the range of about 80 to about 200 μm.

一実施形態［Ｖ−２］においては、本発明による方法において、機能化された表面として、機能化された磁性粒子が使用される。この磁性粒子は、有利には約１〜約１００μｍの範囲内の平均直径を有する。磁性粒子は、強磁性または超常磁性の特性を有する。この磁性粒子は通常はフェライトまたはマグネタイトからの磁性コアを含んでおり、該磁性コアはポリマーまたはポリマー混合物からのシェルにより包囲されている。この磁性粒子は非磁性粒子に相応して機能化されており、すなわちスカベンジャー分子を具備している。   In one embodiment [V-2], functionalized magnetic particles are used as the functionalized surface in the method according to the invention. The magnetic particles preferably have an average diameter in the range of about 1 to about 100 μm. Magnetic particles have ferromagnetic or superparamagnetic properties. The magnetic particles usually comprise a magnetic core from ferrite or magnetite, which is surrounded by a shell from a polymer or polymer mixture. The magnetic particles are functionalized correspondingly to the non-magnetic particles, i.e. have scavenger molecules.

一実施形態［Ｖ−３］においては、本発明による方法は以下を含む：
（ａ）少なくとも１種類の機能化された粒子または少なくとも１種類の機能化された磁性粒子を測定チャンバに導入するステップであって、前記測定チャンバは、前記測定チャンバの底部を通じて光が到達する検出領域と光が到達しない分離除去領域とを有するものとするステップ；
（ｂ）少なくとも１種類の生物学的検体を含有するサンプルを前記測定チャンバに導入するステップ；
（ｃ）少なくとも１種類の蛍光マーカーを前記測定チャンバに導入するステップ；
（ｃ’）前記導入された粒子、サンプルおよび蛍光マーカーを前記測定チャンバ内で混合するステップ；
（ｃ’’）未結合の蛍光マーカーと結合した蛍光マーカーとを（好ましくは沈降または遠心分離により）分離することによって、前記結合した蛍光マーカーが前記分離除去領域内に存在するステップ；
（ｄ）前記未結合の蛍光マーカーの蛍光放射を前記検出領域内で測定するステップ；および
（ｅ）前記１つ以上の生物学的検体の量および／または濃度を分析するステップ。 In one embodiment [V-3], the method according to the invention comprises:
(A) introducing at least one functionalized particle or at least one functionalized magnetic particle into a measurement chamber, wherein the measurement chamber detects light reaching through the bottom of the measurement chamber Having a region and a separation removal region where light does not reach;
(B) introducing a sample containing at least one biological analyte into the measurement chamber;
(C) introducing at least one fluorescent marker into the measurement chamber;
(C ′) mixing the introduced particles, sample and fluorescent marker in the measurement chamber;
(C ″) separating the unbound fluorescent marker and bound fluorescent marker (preferably by sedimentation or centrifugation) so that the bound fluorescent marker is present in the separation removal region;
(D) measuring the fluorescence emission of the unbound fluorescent marker within the detection region; and (e) analyzing the amount and / or concentration of the one or more biological analytes.

測定チャンバとは、本明細書中では、本発明により具備されたマイクロタイタープレートウェルとも理解される。本発明による方法は、好ましくは、本発明による測定チャンバとしてウェルが具備されているマイクロタイタープレートを用いて行われる。   A measurement chamber is also understood herein as a microtiter plate well provided according to the present invention. The method according to the invention is preferably carried out using a microtiter plate provided with wells as measurement chambers according to the invention.

ステップ（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を、もう１つの方法ステップの前または後に行うことができ、その際、該もう１つの方法ステップには、さらなる試験成分または物質、例えば一次抗体または補助物質、例えば界面活性剤を測定チャンバに導入することが含まれる。   Steps (a), (b) and (c) can be performed before or after another method step, wherein the other method step includes additional test components or substances, such as primary antibodies or Introducing an auxiliary substance, such as a surfactant, into the measurement chamber is included.

ステップ（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を逐次的に行うこともできるし、これらのステップの少なくとも２つを同時に行うこともできる。   Steps (a), (b) and (c) can be performed sequentially, or at least two of these steps can be performed simultaneously.

本発明による方法の変形［Ｖ−４］においては、ステップ（ａ）および／またはステップ（ｃ）が、その他の方法ステップの前に、好ましくはその他のステップと時間的間隔を大きくあけて行われる。   In a variant [V-4] of the method according to the invention, step (a) and / or step (c) are performed before other method steps, preferably with a large time interval from the other steps. .

本発明による方法の変形［Ｖ−５］においては、機能化された粒子は磁性（磁化可能）である。   In a variant [V-5] of the method according to the invention, the functionalized particles are magnetic (magnetizable).

もう１つの変形［Ｖ−６］においては、機能化された磁性粒子が使用され、かつステップ（ｃ’’）は、沈降により、および一時的または永続的な磁場の印加により行われる。   In another variant [V-6], functionalized magnetic particles are used and step (c ″) is performed by sedimentation and by application of a temporary or permanent magnetic field.

本発明による方法の一実施形態［Ｖ７］においては、ステップ（ｄ）における未結合の蛍光マーカーの蛍光放射の測定には、蛍光顕微鏡が使用される。使用可能な本発明によるデバイス、測定チャンバまたはマイクロタイタープレートにおいて、底部上の非透光性の層を省くことができる。蛍光顕微鏡は、検出領域内で生じる蛍光放射のみを測定し、分離除去領域から生じる蛍光放射がカットされるように調整されていなければならない。   In one embodiment [V7] of the method according to the invention, a fluorescence microscope is used for measuring the fluorescence emission of the unbound fluorescent marker in step (d). In a device according to the invention, a measurement chamber or a microtiter plate that can be used, the non-translucent layer on the bottom can be omitted. The fluorescence microscope must be tuned so that it only measures the fluorescence radiation that occurs in the detection area and cuts off the fluorescence radiation that originates from the separation and removal area.

マイクロタイタープレートは知られている。これは、互いに孤立した複数のキャビティ（ウェル、カップ、凹部または窪みとも称される）を含む。マイクロタイタープレート上のキャビティの数は可変である。市販されているのは以下の構成である：
２×３（６ウェル）、４×３（１２ウェル）、４×６（２４ウェル）、６×８（４８ウェル）、８×１２（９６ウェル）、１６×２４（３８４ウェル）、３２×４８（１５３６ウェル）。市販のマイクロタイタープレートのカップ内の底部は、様々に形成されていてよい。市販されているのは、以下の底部である：Ｆ底（平底）、Ｃ底（最小限の丸みのついた角を有する平底）、Ｖ底（先が円錐形状の底部）およびＵ底（Ｕ字形の凹部）。本発明により適しているのは、特にＦ底、Ｃ底またはＵ底を有するマイクロタイタープレートであり、この中にデバイスが導入される。 Microtiter plates are known. This includes a plurality of cavities (also referred to as wells, cups, recesses or depressions) that are isolated from one another. The number of cavities on the microtiter plate is variable. The following configurations are commercially available:
2 × 3 (6 wells), 4 × 3 (12 wells), 4 × 6 (24 wells), 6 × 8 (48 wells), 8 × 12 (96 wells), 16 × 24 (384 wells), 32 × 48 (1536 wells). The bottom in the cup of a commercially available microtiter plate may be variously formed. Commercially available are the following bottoms: F bottom (flat bottom), C bottom (flat bottom with minimal rounded corners), V bottom (conical bottom) and U bottom (U Character-shaped recess). More suitable according to the invention are microtiter plates, in particular with an F bottom, C bottom or U bottom, into which the device is introduced.

生物学的検体を分析するための粒子をベースとする方法は知られている（ＵＳ４，７３１，３３７Ｂ、ＤＥ１０２００４０３８１６３Ａ、ＷＯ８６／０４６８４、ＷＯ９４／２９７２２、ＵＳ４，１１５，５３５Ｂ、ＷＯ２０１１／０４５０２２参照）。これらの方法はいずれも、結合した蛍光マーカーの蛍光を測定することに基づいている。   Particle-based methods for analyzing biological specimens are known (see US Pat. No. 4,731,337B, DE102004038163A, WO86 / 04684, WO94 / 29722, US4,115,535B, WO2011 / 045022). Both of these methods are based on measuring the fluorescence of the bound fluorescent marker.

水溶液から不溶性成分を分離除去するためのデバイスは知られている。例えば、ＷＯ２０１１／０３１２３６およびＵＳ２０１０／００２８９３５には、透過分光法または吸収分光法における測定精度を向上させるべく水溶液から微粒状の粒子を分離除去するための特別に形成されたデバイスが記載されている。しかし、これらのデバイスは本発明による方法における使用には適さない。なぜならば、これらのデバイスを用いた場合には、未結合の発光マーカーの発光または未結合の蛍光マーカーの蛍光を確実に測定して、分析すべき１つ以上の生物学的検体を定量化することができないためである。   Devices for separating and removing insoluble components from aqueous solutions are known. For example, WO2011 / 031236 and US2010 / 0028935 describe specially formed devices for separating and removing fine particles from aqueous solutions in order to improve the measurement accuracy in transmission spectroscopy or absorption spectroscopy. However, these devices are not suitable for use in the method according to the invention. This is because when using these devices, the emission of unbound luminescent markers or the fluorescence of unbound fluorescent markers is reliably measured to quantify one or more biological analytes to be analyzed. It is because it cannot be done.

従って、本発明による方法を実施することができる特別なデバイスも、本方法の対象である。   Thus, special devices that can carry out the method according to the invention are also subject of the method.

従って、本発明は、未結合の発光マーカーの発光を測定することにより生物学的検体を分析するためのデバイス［０］であって、結合した発光マーカーと未結合の発光マーカーとが水溶液中で１つ以上の機能化された表面の使用下に空間的および光学的に互いに離れているデバイスにも関し、その際、前記デバイスは分離のために少なくとも部分的に透光性である構造要素を有し、前記デバイスの基部は前記構造要素の底面を除いて非透光性であり、かつ前記水溶液は少なくとも１種類の生物学的検体および少なくとも１種類の発光マーカーを含有し、前記少なくとも１種類の生物学的検体および任意に少なくとも１種類の発光マーカーは１つ以上の機能化された表面に結合する。   Accordingly, the present invention provides a device [0] for analyzing a biological sample by measuring the luminescence of an unbound luminescent marker, wherein the bound luminescent marker and the unbound luminescent marker are in an aqueous solution. It also relates to devices that are spatially and optically separated from each other using one or more functionalized surfaces, wherein the device comprises structural elements that are at least partially translucent for separation. The base of the device is non-translucent except for the bottom surface of the structural element, and the aqueous solution contains at least one biological specimen and at least one luminescent marker, the at least one kind Of the biological analyte and optionally at least one luminescent marker bind to one or more functionalized surfaces.

さらに、本発明は、本発明による方法において使用するための測定チャンバに関し、前記測定チャンバ内で、機能化された磁性粒子が使用される。結合した発光マーカー、好ましくは結合した蛍光マーカーと、未結合の発光マーカー、好ましくは未結合の蛍光マーカーとの分離は、測定チャンバの下方に配置された非透光性の磁性要素を用いた配向的な沈降により行われる。この磁性要素は空所を有し、該空所は、測定チャンバの底部（基部）に測定窓が生じるように配置されている。この磁性要素は基部に固定されていることができるか、または取り外し可能である。測定チャンバは構造要素を有していない。   Furthermore, the invention relates to a measurement chamber for use in the method according to the invention, in which functionalized magnetic particles are used. Separation of bound luminescent markers, preferably bound fluorescent markers, and unbound luminescent markers, preferably unbound fluorescent markers, is oriented using a non-translucent magnetic element located below the measurement chamber By sedimentation. This magnetic element has a void, which is arranged in such a way that a measurement window is created at the bottom (base) of the measurement chamber. This magnetic element can be fixed to the base or removable. The measuring chamber has no structural elements.

機能化された磁性粒子の沈降は、測定窓の上方に粒子が沈殿しないように磁場により操作される。発光、好ましくは蛍光の測定は、測定チャンバの底部で測定窓を通じて蛍光測定装置を用いて測定することにより行われる。   The sedimentation of the functionalized magnetic particles is manipulated by a magnetic field so that the particles do not settle above the measurement window. Luminescence, preferably fluorescence, is measured by measuring with a fluorescence measurement device through a measurement window at the bottom of the measurement chamber.

本発明はさらに、上記の測定チャンバ、またはそのような測定チャンバを少なくとも１つ具備したマイクロタイタープレートの、本発明による方法における使用に関し、その際、同様に機能性磁性粒子が使用される。   The invention further relates to the use of the above-described measurement chamber or a microtiter plate with at least one such measurement chamber in the method according to the invention, in which functional magnetic particles are likewise used.

本発明によるデバイス［０］の一実施形態［Ａ］においては、１つ以上の機能化された表面が機能化された粒子として本発明によるデバイスに導入され、その際、結合した発光マーカーは該デバイスの分離除去領域内に存在し、未結合の発光マーカーは検出領域内に存在し、その際、該未結合の発光マーカーは好ましくは均一に分配されている。   In one embodiment [A] of the device [0] according to the present invention, one or more functionalized surfaces are introduced into the device according to the present invention as functionalized particles, wherein the bound luminescent markers are Unbound luminescent markers present in the separation and removal region of the device are present in the detection region, wherein the unbound luminescent markers are preferably distributed uniformly.

本発明によるデバイス［０］の一実施形態［Ｂ］においては、該デバイスの内側には、１つ以上の機能化された表面が、好ましくは基部とは反対側の構造要素端部の下方に存在する領域内に、好ましくは該デバイスの基部に存在する領域内に、存在する。分離は、生物学的検体と、発光マーカーと、デバイス内に存在し任意に固定化された１つ以上の機能化された表面との結合により行われる。   In one embodiment [B] of the device [0] according to the invention, one or more functionalized surfaces are present inside the device, preferably below the end of the structural element opposite the base. In the area present, preferably in the area present at the base of the device. Separation is accomplished by combining biological analytes, luminescent markers, and one or more functionalized surfaces present and optionally immobilized within the device.

もう１つの実施形態［Ｃ］においては、本発明は、上記のまたは実施形態［Ａ］もしくは［Ｂ］に記載したデバイスに関し、その際、構造要素が突出部として（好ましくは上方に向かって先細状の突出部として）構成されており、前記突出部の横断面は任意の形状を有することができ（例えば、円形、矩形、三角形）、前記デバイスの基部とは反対側の構造要素端部は、前記端部に試験成分、特に粒子が堆積しない状態にある。この端部は例えば平坦であってもよいし凸状形態をとっていてもよく、かつ／または小さい直径を有することができる。   In another embodiment [C], the present invention relates to the device described above or described in embodiment [A] or [B], wherein the structural element is as a protrusion (preferably tapering upwards). And the cross section of the protrusion can have any shape (eg, circular, rectangular, triangular), and the end of the structural element opposite the base of the device is The test component, in particular, particles are not deposited on the end. This end may for example be flat or may have a convex shape and / or have a small diameter.

測定チャンバ内に存在する構造要素は、ピン、円錐、円錐台、底面がｎ角形である角錐または角錐台の形態を有することができ、その際、ｎは３〜１０の範囲内の整数を表し、好ましくは３、４、５、６、７または８を表す。この構造要素はさらに、円錐または角錐から誘導される形態、例えば円形の土台上の円錐、または正方形の土台上の四面体の角錐を有することができる。   The structural elements present in the measuring chamber can have the form of pins, cones, truncated cones, pyramids or truncated pyramids with an n-sided bottom, where n represents an integer in the range of 3-10. , Preferably 3, 4, 5, 6, 7 or 8. This structural element can further have a form derived from a cone or pyramid, for example a cone on a circular base, or a tetrahedral pyramid on a square base.

構造要素はさらに、デバイスの基部とは反対側の端部に、光学部品、例えばレンズを有することができる。   The structural element can further have an optical component, for example a lens, at the end opposite the base of the device.

この構造要素は透光性である。この構造要素は、適した透光性の材料または材料混合物からなる。この材料が測定を妨害する自己蛍光を示さないことが重要である。透光性の材料は知られており、当業者により容易に選択されることができる。そのような材料は、例えばポリスチレン、ＣＯＣ（環状オレフィン共重合体）、ポリプロピレンまたはポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）である。極めて適しているのはポリプロピレンおよびＰＭＭＡである。ポリスチレンは特に高温加工時にある程度の自己蛍光を示すため（Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．２０１３ Ｊａｎｕａｒｙ ２；８５（１）：４４−４９）、本発明によれば好ましくない。   This structural element is translucent. This structural element consists of a suitable translucent material or material mixture. It is important that this material does not exhibit autofluorescence that interferes with the measurement. Translucent materials are known and can be easily selected by those skilled in the art. Such materials are, for example, polystyrene, COC (cyclic olefin copolymer), polypropylene or polymethyl methacrylate (PMMA). Very suitable are polypropylene and PMMA. Polystyrene is particularly unfavorable according to the present invention because it exhibits a certain degree of autofluorescence during high temperature processing (Young et al, Anal Chem. 2013 January 2; 85 (1): 44-49).

こうした材料または材料混合物を、１ｍｍ以下の厚さ（層厚）で使用することができる。好ましい厚さは、以下の範囲内である：約０．０５〜約０．５ｍｍ、約０．１〜約０．４５ｍｍ、約０．１５〜約０．４ｍｍ、約０．２〜約０．４ｍｍ、または約０．２〜約０．３５ｍｍ。   Such materials or material mixtures can be used with a thickness (layer thickness) of 1 mm or less. Preferred thicknesses are within the following ranges: about 0.05 to about 0.5 mm, about 0.1 to about 0.45 mm, about 0.15 to about 0.4 mm, about 0.2 to about 0.00. 4 mm, or about 0.2 to about 0.35 mm.

もう１つの実施形態［Ｄ］においては、本発明は、上記のまたは実施形態［Ａ］、［Ｂ］もしくは［Ｃ］のうちの１つに記載したデバイスに関し、前記デバイス内には分離除去領域および測定領域（検出領域）が存在し、前記測定領域は、透光性の測定窓を有するかまたはそのようなものと光学的に接続されている。   In another embodiment [D], the present invention relates to the device described above or described in one of the embodiments [A], [B] or [C], wherein a separation removal region is included in the device. And a measurement region (detection region), which has a light-transmitting measurement window or is optically connected to such.

もう１つの実施形態［Ｅ］においては、本発明は、上記のまたは実施形態［Ａ］、［Ｂ］、［Ｃ］もしくは［Ｄ］のうちの１つに記載したデバイスに関し、前記デバイス内では構造要素の基部が測定窓として構成されている。その場合、発光の測定は、発光測定装置、好ましくは蛍光測定装置を用いて行われる。励起および放射の検出は、該デバイスの下方で行われる。   In another embodiment [E], the present invention relates to a device as described above or in one of the embodiments [A], [B], [C] or [D], in which the device The base of the structural element is configured as a measurement window. In that case, the measurement of luminescence is performed using a luminescence measuring device, preferably a fluorescence measuring device. Excitation and radiation detection take place below the device.

デバイスまたは測定チャンバ内に存在する構造要素の基部と端部とが光学的に互いに接続されている場合には、該デバイスの基部からこちらへと放射される励起光が該構造要素を通じて検出領域に到達し、該検出領域において未結合の発光マーカー、好ましくは未結合の蛍光マーカーを励起させて放射を生じさせ、次いで該放射が同様に該デバイスの基部から測定される。その場合、構造要素の端部が基部と共に測定窓を形成する。適した構造要素形状を選択する際には、励起光および放射光が粒子により妨害されないように留意すべきである。従って、構造要素の端部が凸状形態をとり、かつ該構造要素が上方に向かって先細状の突出部として構成されていることが特に好ましい。端部が平坦である場合には、該平坦部が小さく、かつ／または、該平坦部に粒子が堆積することができないかまたは妨害とならない数の粒子しか堆積することができない（本明細書中では「実質的に粒子が堆積することができない」とも称される）状態にあることが好ましい。端部が平坦である場合であっても、突出部が、基部とは反対側の該端部に向かって先細状であることが好ましい。   If the base and end of a structural element present in the device or measurement chamber are optically connected to each other, excitation light emitted from the base of the device to the detection area is transmitted through the structural element to the detection region. Once reached, an unbound luminescent marker, preferably an unbound fluorescent marker, is excited in the detection region to produce radiation, which is then measured from the base of the device as well. In that case, the end of the structural element together with the base forms a measurement window. In selecting a suitable structural element shape, care should be taken that the excitation and emission light are not disturbed by the particles. Therefore, it is particularly preferable that the end portion of the structural element has a convex shape and that the structural element is configured as a projecting portion having a tapered shape toward the upper side. If the edge is flat, the flat portion is small and / or only a number of particles that cannot deposit or interfere with the flat portion can be deposited (as used herein). Then, it is preferably in a state (also referred to as “substantially particles cannot be deposited”). Even when the end portion is flat, it is preferable that the protruding portion is tapered toward the end portion on the side opposite to the base portion.

もう１つの実施形態［Ｆ］においては、本発明は、マイクロタイタープレートであって、前記マイクロタイタープレートの窪み、カップまたは凹部内に、それぞれ上記のまたは実施形態［０］、［Ａ］、［Ｂ］、［Ｃ］、［Ｄ］もしくは［Ｅ］のうちの１つに記載したデバイスが組み込まれている前記マイクロタイタープレートに関する。   In another embodiment [F], the present invention provides a microtiter plate, wherein the microtiter plate has a recess, a cup or a recess, respectively, or the above embodiments [0], [A], [ B], [C], [D] or the above-mentioned microtiter plate in which the device described in one of [E] is incorporated.

相応して、一実施形態［Ｆ−１］においては、本発明は、本発明による方法を実施するためのマイクロタイタープレートであって、前記マイクロタイタープレートの少なくとも１つの凹部内にデバイスが導入されており、前記デバイスは少なくとも部分的に透光性である構造要素を有し、前記構造要素は上方に向かって先細状の突出部として構成されており、かつ該突出部の横断面は任意の形状を有することができ、基部とは反対側の構造要素端部は該端部に実質的に試験成分が堆積しない状態にあり、かつ前記デバイスの基部は前記構造要素の底面を除いて非透光性であり、かつ前記凹部の縁部が測定チャンバの側縁部を形成することを特徴とする前記マイクロタイタープレートに関する。   Correspondingly, in one embodiment [F-1], the present invention is a microtiter plate for carrying out the method according to the present invention, wherein the device is introduced into at least one recess of the microtiter plate. The device has a structural element that is at least partially translucent, the structural element being configured as an upwardly tapered protrusion, and the cross section of the protrusion is arbitrary The structural element end opposite the base may be substantially free of test components deposited on the end, and the base of the device may be non-permeable except for the bottom surface of the structural element. The microtiter plate according to claim 1, wherein the microtiter plate is optical and an edge of the recess forms a side edge of the measurement chamber.

もう１つの実施形態［Ｆ−２］においては、本発明は、実施形態［Ｆ−１］に記載したマイクロタイタープレートであって、前記マイクロタイタープレートの元の底部が、構造要素を有する一体型の基部に置き換えられており、前記マイクロタイタープレートの各々の凹部の中に１つの構造要素が存在し、前記基部は前記構造要素の底面を除いて非透光性となるように被覆されていることを特徴とする前記マイクロタイタープレートに関する。   In another embodiment [F-2], the present invention provides the microtiter plate according to embodiment [F-1], wherein the original bottom of the microtiter plate has a structural element. There is one structural element in each recess of the microtiter plate, and the base is coated so as to be non-translucent except for the bottom surface of the structural element. The present invention relates to the microtiter plate.

この場合、基部は構造要素と同一の材料からなり、かつ、該基部を形成する材料の選択に関しては、該構造要素との関連で挙げた材料特性および層厚に関する基準が該当する。   In this case, the base is made of the same material as the structural element, and regarding the selection of the material forming the base, the criteria relating to the material properties and layer thickness mentioned in relation to the structural element apply.

本発明は、以下を含む、実施形態［Ｆ−２］として記載したマイクロタイタープレートの製造にも関する：
（ｘ）マイクロタイタープレートの底部を、構造要素を有する基部に置き換えるステップであって、ここで、前記基部は、好ましくは前記マイクロタイタープレートウェル中に存在するのと同数の構造要素を有するものとするステップ；
（ｙ）前記基部を前記マイクロタイタープレートと接続させるステップ；および
（ｚ）前記基部の下面に非透光性の層を施与し、その際、前記構造要素の底面を空所にするステップ。 The invention also relates to the manufacture of the microtiter plate described as embodiment [F-2], including:
(X) replacing the bottom of the microtiter plate with a base having structural elements, wherein the base preferably has as many structural elements as are present in the microtiter plate wells; Step to do;
(Y) connecting the base to the microtiter plate; and (z) applying a non-translucent layer to the bottom surface of the base, wherein the bottom surface of the structural element is vacated.

基部とマイクロタイタープレートとの接続および非透光性の層の施与は、以下に同様の文脈において記載するように行われる。   The connection between the base and the microtiter plate and the application of the non-translucent layer are performed as described below in a similar context.

構造要素を有する一体型の基部は、成形法により、例えば射出成形法、付加製造法（例えば３Ｄ印刷法）または熱成形法（熱間成形法、深絞り法または真空成形法）により製造可能である。   An integral base with structural elements can be manufactured by a molding method, for example, an injection molding method, an additive manufacturing method (eg 3D printing method) or a thermoforming method (hot forming method, deep drawing method or vacuum forming method). is there.

当然のことながら、マイクロタイタープレートのすべての凹部の中に１つの構造要素が存在しているわけではないこともありうる。同様に、マイクロタイタープレートの複数の凹部の中に異なって形成された複数の構造要素が存在することも可能である。従って、構造要素を有する１つの一体型の基部は、異なって形成された複数の構造要素を有することができる。   Of course, one structural element may not be present in all the recesses of the microtiter plate. Similarly, there can be a plurality of structural elements formed differently in the plurality of recesses of the microtiter plate. Thus, an integral base having structural elements can have a plurality of structural elements formed differently.

もう１つの実施形態［Ｇ］においては、本発明は、上記のまたは実施形態［０］、［Ａ］、［Ｂ］、［Ｃ］、［Ｄ］もしくは［Ｅ］のうちの１つに記載したデバイスを含む測定チャンバに関する。   In another embodiment [G], the invention is described in one of the above or embodiments [0], [A], [B], [C], [D] or [E]. The present invention relates to a measurement chamber including the device.

もう１つの実施形態［Ｈ］においては、本発明は、上記のまたは実施形態［０］、［Ａ］、［Ｂ］、［Ｃ］、［Ｄ］、［Ｅ］、［Ｆ］もしくは［Ｇ］のうちの１つに記載したデバイス、測定チャンバまたはマイクロタイタープレートの、未結合の発光マーカーの発光の測定により生物学的検体を定性的または定量的に分析するための、イムノアッセイ、特に直接イムノアッセイ、サンドイッチイムノアッセイ、競合イムノアッセイまたは二次イムノアッセイにおける使用に関し、その際、前記発光マーカーは、好ましくは蛍光マーカーである。   In another embodiment [H], the present invention relates to the above or embodiments [0], [A], [B], [C], [D], [E], [F] or [G]. An immunoassay, in particular a direct immunoassay, for qualitatively or quantitatively analyzing biological analytes by measuring the luminescence of unbound luminescent markers in a device, measuring chamber or microtiter plate according to one of the For use in sandwich immunoassays, competitive immunoassays or secondary immunoassays, the luminescent marker is preferably a fluorescent marker.

上記の方法の他に、本発明はさらに、以下を含む、本発明によるデバイス、測定チャンバまたはマイクロタイタープレートを使用して、特に上記のまたは実施形態［０］、［Ａ］、［Ｂ］、［Ｃ］、［Ｄ］、［Ｅ］、［Ｆ］もしくは［Ｇ］のうちの１つに記載したデバイス、測定チャンバまたはマイクロタイタープレートを使用して生物学的検体を定性的および／または定量的に分析するための方法に関する：
（ａ）少なくとも１種類の機能化された表面をデバイスに導入するステップ；
（ｂ）少なくとも１種類の生物学的検体を含有するサンプルを前記デバイスに導入するステップ；
（ｃ）少なくとも１種類の発光マーカーを前記デバイスに導入するステップ；
（ｄ）未結合の発光マーカーの発光放射を測定するステップ；および
（ｅ）前記生物学的検体の量および／または濃度を分析するステップ。 In addition to the above method, the present invention further comprises using the device, measurement chamber or microtiter plate according to the present invention, in particular as described above or embodiments [0], [A], [B], Qualitative and / or quantification of biological specimens using the device, measurement chamber or microtiter plate described in one of [C], [D], [E], [F] or [G] On the method to analyze automatically:
(A) introducing at least one functionalized surface into the device;
(B) introducing a sample containing at least one biological analyte into the device;
(C) introducing at least one luminescent marker into the device;
(D) measuring the luminescence emission of unbound luminescent markers; and (e) analyzing the amount and / or concentration of said biological analyte.

本発明による機能化された表面は、デバイス中にすでに存在することができるか、または本発明による方法において単独でもしくは測定溶液（サンプル）と一緒にデバイスに導入される。   The functionalized surface according to the invention can already be present in the device or is introduced into the device alone or together with the measuring solution (sample) in the method according to the invention.

本発明のもう１つの実施形態においては、機能化された表面として、機能化された粒子が使用される。   In another embodiment of the present invention, functionalized particles are used as the functionalized surface.

本発明による方法においては、複数の種類の機能化された表面／粒子上に、または１つの表面／粒子表面上に、複数の種類の機能化が存在することができる。すなわち、表面の機能化の種類は異なっていてよい。その結果、本発明による方法を用いて、および本発明によるデバイスおよび測定チャンバにおいて、または本発明によるマイクロタイタープレートを用いて、複数の種類の生物学的検体を測定することができる。そのためには、各々の検体に対して、異なる波長で励起するおよび／または放射する固有の１つの発光マーカーを使用しなければならない。   In the method according to the invention, there can be multiple types of functionalization on multiple types of functionalized surfaces / particles or on one surface / particle surface. That is, the type of surface functionalization may be different. As a result, multiple types of biological analytes can be measured using the method according to the invention and in the device and measurement chamber according to the invention or using the microtiter plate according to the invention. To do so, one must use one unique luminescent marker that excites and / or emits at a different wavelength for each analyte.

機能化された磁性粒子を使用する場合にも、上記のことが同様に該当する。   The same applies to the case of using functionalized magnetic particles.

「機能化された」という概念は、本発明に関連して、表面上に、好ましくは粒子表面上にスカベンジャー分子（以下、スカベンジャーとも称される）が存在することを意味する。表面または粒子表面の機能化のために、表面は少なくとも１種類のスカベンジャー分子で覆われる。スカベンジャー分子とは、１つ以上の生物学的検体とおよび／または１つ以上の発光マーカーと物理的または化学的に結合する分子をいう。その際、磁性粒子であるか非磁性粒子であるかということは、重要ではない。どちらの種類の粒子とも、本明細書中に記載したとおりに機能化されることができる。   The term “functionalized” in the context of the present invention means that there are scavenger molecules (hereinafter also referred to as scavengers) on the surface, preferably on the particle surface. For functionalization of the surface or particle surface, the surface is covered with at least one scavenger molecule. A scavenger molecule refers to a molecule that physically or chemically binds to one or more biological analytes and / or to one or more luminescent markers. At that time, it is not important whether the particles are magnetic particles or non-magnetic particles. Either type of particle can be functionalized as described herein.

本発明によれば、「機能化された」とは、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）に関連して以下に説明するように、磁性粒子または非磁性粒子が適切な金属イオンで覆われていることをも意味するため、本明細書中では、形成される金属イオン錯体（例えば、ＮＴＡ−Ｎｉ２＋）がスカベンジャー分子を形成し、その後で該スカベンジャー分子が相応するタグを有する試験成分と結合する。 According to the present invention, “functionalized” means that magnetic or non-magnetic particles are covered with a suitable metal ion, as described below in connection with immobilized metal affinity chromatography (IMAC). In this specification, the metal ion complex formed (eg, NTA-Ni 2+ ) forms a scavenger molecule, which is then bound to a test component having a corresponding tag. To do.

競合アッセイに関しては、機能化された表面、特に粒子表面がスカベンジャーを有し、該スカベンジャーに、生物学的検体と発光マーカーとが同一の結合部位で物理的および／または化学的に結合しうることが必要である。他のアッセイに関しては、スカベンジャーが１つ以上の生物学的検体のみと結合するか、または所望の場合には１つ以上の発光マーカー、好ましくは蛍光マーカーと結合する状態にあることが望ましい。   For competitive assays, the functionalized surface, particularly the particle surface, has a scavenger, to which the biological analyte and the luminescent marker can physically and / or chemically bind at the same binding site. is necessary. For other assays, it is desirable for the scavenger to bind only to one or more biological analytes or to bind one or more luminescent markers, preferably fluorescent markers, if desired.

機能化された磁性粒子が使用される場合にも、同様のことが該当する。   The same applies when functionalized magnetic particles are used.

機能化の一変形においては、スカベンジャー分子は１種類の生物学的検体に関して特異的に選択された結合部位のみを有し、一方で他の一変形においては、スカベンジャー分子は複数の異なる結合部位を有し、その際、各々の結合部位は、該結合部位が特定の１つの生物学的検体のみと結合するように選択されている。該変形により、機能化された表面に異なる種類の生物学的検体が結合することが可能である。   In one variation of functionalization, the scavenger molecule has only a specifically selected binding site for one biological analyte, while in another variation, the scavenger molecule has multiple different binding sites. Each binding site is selected such that the binding site binds to only one specific biological analyte. The deformation allows different types of biological analytes to bind to the functionalized surface.

異なる種類の生物学的検体を同時に測定することが望ましい場合には、本発明による方法において、機能化された異なる（磁性）粒子を１つの測定チャンバ内で使用することもできる。   If it is desired to measure different types of biological analytes simultaneously, different functionalized (magnetic) particles can also be used in one measuring chamber in the method according to the invention.

機能化の一変形には、表面に異なる種類のスカベンジャー分子を具備させることが含まれ、その際、該スカベンジャー分子の各々は、分析すべき生物学的検体のための少なくとも１つの結合部位を有する。   One variation of functionalization includes providing different types of scavenger molecules on the surface, each of which has at least one binding site for the biological analyte to be analyzed. .

本発明による方法において、複数の種類の生物学的検体と結合しうる機能化された粒子または機能化された磁性粒子が使用される場合には、各々の検体に対して、異なる波長で励起するおよび／または放射する固有の１つの発光マーカー、好ましくは蛍光マーカーを使用しなければならない。   In the method according to the present invention, when functionalized particles or functionalized magnetic particles that can bind to multiple types of biological analytes are used, each analyte is excited at a different wavelength. And / or one unique luminescent marker that emits, preferably a fluorescent marker, must be used.

本発明による方法を確実に実施するためには、特に直接（イムノ）アッセイ、サンドイッチ（イムノ）アッセイまたは二次（イムノ）アッセイの場合には、スカベンジャー分子、さらに表面または粒子表面が、１つ以上の生物学的検体以外の試験成分と特異的または非特異的に結合することが重要である。これに対する例外は、競合（イムノ）アッセイおよび置換アッセイである。競合（イムノ）アッセイでは、スカベンジャーは同一の結合部位において発光マーカーおよび特異的な生物学的検体と結合することができる。置換アッセイでは、スカベンジャーは発光マーカー、好ましくは蛍光マーカーと結合する。   In order to ensure the implementation of the method according to the invention, in particular in the case of a direct (immuno) assay, a sandwich (immuno) assay or a secondary (immuno) assay, one or more scavenger molecules and more than one surface or particle surface are present. It is important to bind specifically or non-specifically to test components other than biological specimens. Exceptions to this are competition (immuno) assays and displacement assays. In competitive (immuno) assays, scavengers can bind luminescent markers and specific biological analytes at the same binding site. In a displacement assay, the scavenger binds with a luminescent marker, preferably a fluorescent marker.

表面および粒子表面の機能化に適したスカベンジャーは知られており、該スカベンジャーは、１つ以上の所望の試験成分が該スカベンジャーに結合するように選択される。適切なスカベンジャーは主にタンパク質（例えば抗体）であり、該タンパク質は必要に応じてリンカー系を用いて表面または粒子表面に結合される。表面または粒子表面のスカベンジャーでの被覆は、共有結合により行われてもよいし非共有結合により行われてもよい。試験成分のうちの１つ（例えば生物学的検体）が抗体である場合には、スカベンジャーは通常はタンパク質である。抗体に対する知られているスカベンジャーは、例えば黄色ブドウ球菌からのプロテインＡおよびレンサ球菌からのプロテインＧである。   Suitable scavengers for surface and particle surface functionalization are known, and the scavenger is selected such that one or more desired test components bind to the scavenger. Suitable scavengers are primarily proteins (eg antibodies), which are attached to the surface or particle surface using a linker system as required. The surface or particle surface scavenger coating may be performed covalently or non-covalently. If one of the test components (eg, a biological specimen) is an antibody, the scavenger is usually a protein. Known scavengers for antibodies are, for example, protein A from S. aureus and protein G from streptococci.

機能化された磁性粒子が使用される場合にも、同様のことが該当する。   The same applies when functionalized magnetic particles are used.

リンカー系を具備した表面の例は、以下に詳細に記載するように、ストレプトアビジンで被覆された粒子であり、例えばストレプトアビジン Ｍａｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）粒子（ＶＷＲ、品番２８−９８５７−３８）である。もう１つの例は、表面上にニトリロ酢酸基（ＮＴＡ）またはイミノ酢酸基（ＩＤＡ）を有するアガロース粒子であり、該基は金属イオンと極めて安定な錯体を形成し、いわゆるＨｉｓタグで標識されたタンパク質の結合に適している。   Examples of surfaces with a linker system are particles coated with streptavidin, as described in detail below, for example streptavidin Mag-Sepharose® particles (VWR, part number 28-9857-38). It is. Another example is an agarose particle having a nitriloacetic acid group (NTA) or an iminoacetic acid group (IDA) on the surface, which forms a very stable complex with a metal ion and is labeled with a so-called His tag. Suitable for protein binding.

機能化された粒子の製造に適しておりかつ多孔質材料からなる慣用の材料の一つにアガロースがあり、これはＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の名称で市販されている。Ｓｅｐｈａｒｏｓｅまたはアガロースは、様々な架橋度で、また様々な結合能で入手可能である。機能化の前に、すなわちスカベンジャー分子での被覆の前に、化学薬品でアガロース粒子を活性化させることにより、スカベンジャー分子との効率的な結合が保証される。活性化に適した化学薬品は、ＣＮＢｒである。   One conventional material suitable for the production of functionalized particles and consisting of porous materials is agarose, which is marketed under the name Sepharose® (GE Healthcare). Sepharose or agarose is available with various degrees of cross-linking and with various binding capacities. Activation of the agarose particles with chemicals prior to functionalization, i.e. before coating with scavenger molecules, ensures efficient binding with the scavenger molecules. A suitable chemical for activation is CNBr.

すでに説明したように、慣用のスカベンジャー分子はタンパク質である。タンパク質を表面に、特に粒子表面に結合させるために、該表面とスカベンジャー分子との間のリンカーとして作用する化学薬品（例えばストレプトアビジンまたはそのホモログ（例えばアビジン、ニュートラアビジン））を使用することができる。ストレプトアビジンまたはそのホモログはビオチンと安定な結合を生じ、それにより、ビオチン化プロテインＡの各々が、ストレプトアビジンで処理された（粒子）表面と結合する。機能化された磁性粒子が使用される場合にも、同様のことが該当する。   As already explained, the conventional scavenger molecule is a protein. Chemicals that act as linkers between the surface and the scavenger molecule (eg streptavidin or its homologues (eg avidin, neutravidin)) can be used to bind the protein to the surface, in particular to the particle surface. . Streptavidin or its homologues produce stable binding with biotin, whereby each of the biotinylated protein A binds to the (particle) surface treated with streptavidin. The same applies when functionalized magnetic particles are used.

タンパク質のビオチン化は知られており、生化学における標準的な手法の一つである。通常、ビオチン化には活性エステル（例えば、ＮＨＳ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）が利用され、該活性エステルによりビオチンがスカベンジャータンパク質の遊離アミノ官能基に結合される。ビオチン化スカベンジャータンパク質は、通常は、ストレプトアビジンでまたはそのホモログで処理された（磁性）粒子に結合される。   Protein biotinylation is known and is one of the standard techniques in biochemistry. Usually, an active ester (for example, NHS, N-hydroxysuccinimide) is used for biotinylation, and biotin is bound to the free amino functional group of the scavenger protein by the active ester. Biotinylated scavenger proteins are usually bound to (magnetic) particles that have been treated with streptavidin or its homologue.

タンパク質親和性タグを含むスカベンジャータンパク質は、金属錯体を介して（粒子）表面に結合されることができる。これには実質的には、所定のアミノ酸が適切な金属イオン（例えば、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｕ２＋およびＺｎ２＋）と安定な錯体を形成するという原理が用いられる。そのようなアミノ酸は、タンパク質中に天然に存在することもできるし、ポリペプチドとしてタンパク質にいわゆる「タグ」として導入されていてもよい。慣用のタグは、Ａｒｇタグ、ｃ−Ｍｙｃタグ、ＦｌａｇタグおよびＨｉｓタグである。金属イオンは、ＮＴＡ（ニトリロ酢酸）、ＣＭＡ（カルボキシメチルアスパラギン酸）またはＩＤＡ（イミノ酢酸）を用いて（粒子）表面に結合される。実質的には、上記の機能化の際には、その他ではタンパク質のクロマトグラフィー精製の際に、特に固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）の際に使用されるのと同一の原理が利用される。 A scavenger protein comprising a protein affinity tag can be bound to the (particle) surface via a metal complex. This essentially uses the principle that a given amino acid forms a stable complex with an appropriate metal ion (eg, Co 2+ , Ni 2+ , Cu 2+ and Zn 2+ ). Such an amino acid may be naturally present in the protein or may be introduced as a so-called “tag” into the protein as a polypeptide. Conventional tags are Arg tag, c-Myc tag, Flag tag and His tag. Metal ions are bound to the (particle) surface using NTA (nitriloacetic acid), CMA (carboxymethylaspartic acid) or IDA (iminoacetic acid). In essence, the same principles are utilized during the functionalization described above, otherwise used in the chromatographic purification of proteins, in particular in immobilized metal affinity chromatography (IMAC). .

上記の原理を利用することにより、機能化された（磁性）粒子を、使用すべきアッセイに、または分析すべき１つ以上の生物学的検体に個々に適合させることができ、それによって、当業者は本発明による方法を自身のそれぞれの要求に容易に適合させることができる。   By taking advantage of the above principles, functionalized (magnetic) particles can be individually adapted to the assay to be used or to one or more biological analytes to be analyzed. The person skilled in the art can easily adapt the method according to the invention to his respective requirements.

機能化された表面がデバイス内にすでに存在する場合には、本発明は、もう１つの実施形態において、機能化された表面のデバイスへの導入、すなわちステップ（ａ）を、ステップ（ａ’）として行うことに関し、すなわち、前記デバイス内の少なくとも１つの表面、好ましくは前記デバイスの基部を処理し、その際、前記基部とは反対側の構造要素端部には処理を行わないものとし、ここで、前記処理とは、スカベンジャーと前記基部を支援するコーティング緩衝液とを結合させるための処理であるものとし、かつ少なくとも１種類のスカベンジャーを添加し、その際、前記スカベンジャーを好ましくは溶解させて添加するものとする。   If a functionalized surface already exists in the device, the present invention, in another embodiment, introduces the functionalized surface into the device, ie step (a), step (a ′) That is, that is, at least one surface in the device, preferably the base of the device, is treated, with no treatment at the end of the structural element opposite the base, The treatment is a treatment for combining a scavenger and a coating buffer supporting the base, and at least one type of scavenger is added, and the scavenger is preferably dissolved. Shall be added.

従って、本発明は、デバイス、本発明による測定チャンバおよび本発明によるマイクロタイタープレートであって、前記デバイスの少なくとも１つの表面、好ましくは前記デバイスの基部は機能化されており、前記基部とは反対側の構造要素端部は機能化されていない、前記デバイス、本発明による測定チャンバおよび本発明によるマイクロタイタープレートにも関する。処理されたデバイス表面は、本明細書中では「定置」表面とも称される。   Accordingly, the present invention is a device, a measurement chamber according to the present invention and a microtiter plate according to the present invention, wherein at least one surface of the device, preferably the base of the device is functionalized, as opposed to the base It also relates to the device, the measuring chamber according to the invention and the microtiter plate according to the invention, wherein the side structural element ends are not functionalised. Treated device surfaces are also referred to herein as “stationary” surfaces.

スカベンジャーを添加した後、機能化が予定される所望の箇所にコーティング緩衝液を数時間または一晩作用させることが有利である。スカベンジャー分子での表面の被覆に適したコーティング緩衝液は知られている。この例は塩基性の炭酸塩緩衝液であり、これにより、例えばスカベンジャー分子であるプロテインＡを所望の部位に、例えばデバイスの基部に結合させることができる。   After adding the scavenger, it is advantageous to apply the coating buffer for several hours or overnight at the desired location where functionalization is planned. Coating buffers suitable for coating surfaces with scavenger molecules are known. An example of this is a basic carbonate buffer, which allows, for example, protein A, a scavenger molecule, to be bound to a desired site, for example to the base of the device.

同様に、デバイス、本発明による測定チャンバおよび本発明によるマイクロタイタープレートの基部をストレプトアビジンにより機能化することができ、それにより、予めそれぞれビオチン基が付与（標識）されている複数の異なるスカベンジャーが、所望の部位に結合される。   Similarly, the base of the device, the measuring chamber according to the invention and the microtiter plate according to the invention can be functionalized with streptavidin, so that a plurality of different scavengers, each pre-attached (labeled) with a biotin group, can be obtained. Bound to the desired site.

機能化された適切な表面を選択することにより、試験時間に影響を与えることができる。原則的には、機能化された大表面によって、測定すべき１つ以上の生物学的検体が、また所望であって予定される場合には１つ以上の発光マーカーが、拡散によりスカベンジャーと出会う可能性が高まる。測定の速度は、適切な表面サイズ、ならびに該表面上に存在するスカベンジャーの種類および数の選択に影響を受けうる。本発明による方法を迅速化するためには、好ましくは、大表面であって該表面上に複数のスカベンジャーが存在する表面が使用される。このことは、粒子表面にも定置表面にも該当する。   By selecting an appropriate functionalized surface, the test time can be influenced. In principle, a functionalized large surface allows one or more biological analytes to be measured and, if desired and planned, one or more luminescent markers, meet the scavenger by diffusion. The possibility increases. The speed of measurement can be affected by the selection of the appropriate surface size, as well as the type and number of scavengers present on the surface. In order to expedite the process according to the invention, preferably a surface is used which is a large surface with a plurality of scavengers on the surface. This applies to both the particle surface and the stationary surface.

本発明による方法の速度に影響を与えるもう１つの要因としては、使用される機能化された表面のサイズの他に、該表面の結合能が挙げられる。機能化された粒子の場合、該粒子の結合能とは、該機能化された粒子に所定量の生物学的検体を結合させる能力であって、該存在する機能化された粒子の量または重量、質量に関する能力を指す。本発明による方法において速度を決定づけるもう１つのパラメータは、以下に詳説するように、試験成分の入念な混合である。その際、磁性粒子であるか非磁性粒子であるかということは、重要ではない。   Another factor that affects the speed of the method according to the invention is the binding capacity of the surface as well as the size of the functionalized surface used. In the case of functionalized particles, the binding capacity of the particles is the ability to bind a predetermined amount of biological analyte to the functionalized particles, the amount or weight of the functionalized particles present , Refers to mass capacity. Another parameter that determines the speed in the method according to the invention is the careful mixing of the test components, as detailed below. At that time, it is not important whether the particles are magnetic particles or non-magnetic particles.

本発明による方法において機能化された表面として使用することができる機能化された（磁性）粒子は、市販されているかまたは本方法のために相応して個別に製造される。   Functionalized (magnetic) particles that can be used as functionalized surfaces in the process according to the invention are either commercially available or are produced individually correspondingly for the process.

そのような個別に機能化された粒子を製造するために、特に合成または天然のポリマー、例えばポリスチレン、ラテックス、アガロース、ポリラクチドまたはＰＭＭＡならびに多糖類からの粒子を使用することができる。多孔性材料、例えばアガロースからの粒子が好ましい。特に適しているのは、生物学的検体の、例えばタンパク質のクロマトグラフィー精製に使用される市販の粒子である。この粒子は、通常はスラリーとして提供されている。上記のことは磁性粒子にも同様に該当し、その際、合成または天然のポリマーが磁性コアを包囲している。   In order to produce such individually functionalized particles, in particular particles from synthetic or natural polymers such as polystyrene, latex, agarose, polylactide or PMMA and polysaccharides can be used. Particles from a porous material such as agarose are preferred. Particularly suitable are commercially available particles used for the chromatographic purification of biological specimens, for example proteins. The particles are usually provided as a slurry. The above applies equally to magnetic particles, in which a synthetic or natural polymer surrounds the magnetic core.

本発明により使用することができる非磁性粒子は、しばしば球状粒子であり、約０．１〜約２００μｍの範囲内の典型的な平均直径を有する。本発明により好ましい粒子は、約２０〜約２００μｍの範囲内、特に約８０〜約２００μｍの範囲内の平均直径を有し、かつ試験成分との非特異的な結合を生じない。本発明によれば、ＩｇＧまたは検体１ｍＬ当たり２０ｍｇを上回る結合能を有する粒子が好ましい。   Non-magnetic particles that can be used according to the present invention are often spherical particles and have a typical average diameter in the range of about 0.1 to about 200 μm. Preferred particles according to the present invention have an average diameter in the range of about 20 to about 200 μm, in particular in the range of about 80 to about 200 μm, and do not cause non-specific binding with the test component. According to the present invention, IgG or particles having a binding capacity of more than 20 mg per mL of analyte are preferred.

本発明により使用することができる磁性粒子（「磁性ビーズ」とも称される）は、通常は生物学的検体の単離または分析に使用されるものである（例えばＷＯ２００６／１１２７７１参照）。磁性粒子のポリマーコーティングは、通常は、糖、ポリビニルアルコールまたはケイ酸塩からなる。磁性粒子は、粒子に関して説明した方法と同様の方法で機能化することができるか、またはすでに機能化された磁性粒子として市販されている（例えば、ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのプロテインＡ Ｍａｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）粒子、品番２８−９４４０−０６）。本発明により特に適した磁性粒子は、多孔性材料、例えばアガロースからのコーティングを有し、かつフェライトまたはマグネタイトからのコアを有する（例えばＭａｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）粒子）。   Magnetic particles (also referred to as “magnetic beads”) that can be used according to the present invention are those normally used for the isolation or analysis of biological specimens (see eg WO 2006/112771). The polymer coating of magnetic particles usually consists of sugar, polyvinyl alcohol or silicate. Magnetic particles can be functionalized in a manner similar to that described for the particles, or are commercially available as already functionalized magnetic particles (eg, Protein A Mag-Sepharose® from GE Healthcare). Particles, part number 28-9440-06). Magnetic particles particularly suitable according to the invention have a coating from a porous material, such as agarose, and a core from ferrite or magnetite (eg Mag-Sepharose® particles).

磁性粒子も同様に球状粒子であり、約１〜約１００μｍの範囲内の典型的な平均直径を有する。   The magnetic particles are similarly spherical particles and have a typical average diameter in the range of about 1 to about 100 μm.

当業者は、分析される生物学的検体と組み合わせて使用することができる機能化された磁性または非磁性の粒子を容易に見出すことができ、かつ、部分的にそのような組み合わせは従来技術のさらに発展したイムノアッセイ法においてすでに使用されている。   One skilled in the art can readily find functionalized magnetic or non-magnetic particles that can be used in combination with the biological analyte being analyzed, and in part such combinations are prior art. It is already used in further developed immunoassay methods.

以下の記載は、機能化された磁性粒子が使用される場合にも該当する。   The following description also applies when functionalized magnetic particles are used.

ステップ（ａ）（場合により（ａ’））、（ｂ）および（ｃ）は、本発明による方法において、連続して、すなわち逐次的に行われてもよいし、ステップ（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の少なくとも２つを同時に行うこともでき、これを、例えばデバイス内に機能化された表面を装入し、次いでサンプルと発光マーカーとを含有する測定溶液を装入することにより行うことができる。またそれに代えて、検体を含有するサンプルが装入され、これに、発光マーカーと、機能化された粒子の形態の機能化された表面とが添加される。逐次的な添加の場合には、通常はステップの順序は重要ではない。ステップ（ｂ）をステップ（ａ）および（ｃ）の前に行うことも、ステップ（ｂ）をステップ（ｃ）および（ａ）の前に行うことも、ステップ（ｃ）をステップ（ａ）または（ｂ）の前に行うことも可能である。競合イムノアッセイの場合には、ステップ（ｂ）とステップ（ｃ）とを同時に行うことが好ましい。すでに機能化された表面を有するデバイスが使用される場合には、ステップ（ａ）は省かれる。   Steps (a) (optionally (a ′)), (b) and (c) may be carried out continuously, ie sequentially, in the method according to the invention, or steps (a), (b) ) And (c) can also be performed simultaneously, for example by loading a functionalized surface in the device and then loading a measurement solution containing the sample and a luminescent marker. It can be carried out. Alternatively, a sample containing the analyte is loaded, to which is added a luminescent marker and a functionalized surface in the form of functionalized particles. In the case of sequential addition, the order of the steps is usually not important. Step (b) can be performed before steps (a) and (c), step (b) can be performed before steps (c) and (a), or step (c) can be performed as step (a) or It is also possible to carry out before (b). In the case of a competitive immunoassay, it is preferable to perform step (b) and step (c) simultaneously. If a device with an already functionalized surface is used, step (a) is omitted.

好ましくは、本発明による方法において、ステップ（ａ）およびステップ（ｃ）は、その他の方法ステップの前に、同時にまたは逐次的に行われる。同様に好ましくは、ステップ（ａ）またはステップ（ｃ）はその他の方法ステップの前に行われる。   Preferably, in the method according to the invention, steps (a) and (c) are performed simultaneously or sequentially before other method steps. Likewise preferably, step (a) or step (c) is performed before other method steps.

その際、ステップ（ａ）および／または（ｃ）とその他の方法ステップとの時間的間隔は短くても長くてもよい（例えば、数時間、数日間、数週間、数カ月間または数年間）。この間隔が１２時間を上回る場合には、ステップ（ａ）および／または（ｃ）に導入される試験成分、すなわち導入された機能化された（磁性）粒子および／または蛍光マーカーが、測定チャンバ内で乾燥された状態にあることが好ましい。測定チャンバは、室温で、好ましくは最高で３７℃、好ましくは３５℃の高められた温度で乾燥される。乾燥期間は、通常は、測定チャンバに導入される水溶液の量に依存する。通常の乾燥時間は、１２〜２４時間の範囲内である。   In so doing, the time interval between steps (a) and / or (c) and other method steps may be short or long (eg, hours, days, weeks, months or years). If this interval exceeds 12 hours, the test components introduced in steps (a) and / or (c), ie the introduced functionalized (magnetic) particles and / or fluorescent markers are present in the measurement chamber. It is preferable to be in a dried state. The measuring chamber is dried at room temperature, preferably at elevated temperatures up to 37 ° C., preferably 35 ° C. The drying period usually depends on the amount of aqueous solution introduced into the measuring chamber. Normal drying time is in the range of 12-24 hours.

乾燥前に、場合によりさらなる物質を測定チャンバに導入することができ、該物質は、（磁性）粒子および／または発光マーカーまたは蛍光マーカーの機能性／活性が乾燥後にそのまま維持されるためのものであることが望ましい。適当な物質は、ＢＳＡ、糖または界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ ２０である。   Before drying, optionally further substances can be introduced into the measuring chamber, the substances for maintaining the functionality / activity of (magnetic) particles and / or luminescent or fluorescent markers as they are after drying. It is desirable to be. Suitable substances are BSA, sugars or surfactants such as Tween 20.

従って、本発明は、本発明による測定チャンバおよびマイクロタイタープレートであって、
（ｉ）少なくとも１種類の機能化された粒子もしくは機能化された磁性粒子、および少なくとも１種類の蛍光マーカー、または
（ｉｉ）少なくとも１種類の機能化された粒子もしくは機能化された磁性粒子、または
（ｉｉｉ）少なくとも１種類の蛍光マーカー
がそれぞれ乾燥状態にある本発明による測定チャンバおよびマイクロタイタープレート、ならびに本発明による方法におけるその使用にも関する。 Accordingly, the present invention provides a measurement chamber and a microtiter plate according to the present invention,
(I) at least one functionalized particle or functionalized magnetic particle, and at least one fluorescent marker, or (ii) at least one functionalized particle or functionalized magnetic particle, or (Iii) It also relates to a measuring chamber and a microtiter plate according to the invention in which at least one fluorescent marker is in the dry state, respectively, and its use in the method according to the invention.

同様に、本発明はその製造にも関する。このために上記のとおりの措置がとられ、すなわちこれは、相応する試験成分を本発明による測定チャンバへの導入後に乾燥または凍結乾燥させることにより行われる。   Similarly, the invention relates to its manufacture. For this purpose, the measures as described above are taken, ie this is done by drying or freeze-drying the corresponding test components after introduction into the measuring chamber according to the invention.

少なくとも１種類の機能化された粒子または機能化された磁性粒子および／または少なくとも１種類の蛍光マーカーがすでに乾燥状態にある測定チャンバが使用される場合には、本発明による方法においては、該当する試験成分を添加する１つ以上のステップは省かれる。例えば、機能化された（磁性）粒子がすでに乾燥状態にある場合には、機能化された（磁性）粒子の導入、すなわちステップ（ａ）は省かれる。   If a measurement chamber is used in which at least one functionalized particle or functionalized magnetic particle and / or at least one fluorescent marker is already dry, the method according to the invention is applicable. One or more steps of adding test components are omitted. For example, if the functionalized (magnetic) particles are already in a dry state, the introduction of functionalized (magnetic) particles, ie step (a), is omitted.

本発明による方法においては試験成分間に結合が形成されるが、該結合は該試験成分同士の親和性およびその濃度に依存する。本発明による方法に関しては、未結合の発光マーカーの量が所与の一定の試験条件で生物学的検体の量のみに依存することが必要である。   In the method according to the invention, a bond is formed between the test components, which depends on the affinity between the test components and their concentration. For the method according to the invention, it is necessary that the amount of unbound luminescent marker depends only on the amount of biological analyte at a given constant test condition.

本発明の一実施形態においては、様々な部位（エピトープ）で、発光マーカーおよびスカベンジャーと生物学的検体とがそれぞれ結合する（図６ａ、図６ｃおよび図７ａに概略的に示す）。   In one embodiment of the present invention, luminescent markers and scavengers and biological specimens bind at various sites (epitopes), respectively (schematically shown in FIGS. 6a, 6c and 7a).

本発明のもう１つの実施形態においては、発光マーカーおよび生物学的検体がそれぞれスカベンジャー分子上の同一の部位に結合することができる（図６ｂに概略的に示す）。   In another embodiment of the invention, the luminescent marker and the biological analyte can each bind to the same site on the scavenger molecule (shown schematically in FIG. 6b).

本発明のもう１つの実施形態においては、生物学的検体に、発光マーカーに代えていわゆる「一次抗体」が結合し、該一次抗体に該発光マーカーが結合する（図７ｂに概略的に示す）。   In another embodiment of the present invention, the so-called “primary antibody” binds to the biological specimen instead of the luminescent marker, and the luminescent marker binds to the primary antibody (schematically shown in FIG. 7b). .

結合の生成を加速させるためには、すべての試験成分を導入した後に該試験成分を本発明によるデバイス、測定チャンバまたはマイクロタイタープレート内で十分に混合することが合理的である。これは、手動で行われてもよいし自動で行われてもよい。試験成分の接触の速度が高いほど、平衡の達成、ひいては生物学的検体の測定／分析がより迅速に進行する。機能化された磁性粒子が使用される場合にも、同様のことが該当する。   In order to accelerate the formation of bonds, it is reasonable to thoroughly mix the test components in the device, measurement chamber or microtiter plate according to the invention after all the test components have been introduced. This may be done manually or automatically. The higher the rate of contact of the test component, the faster the achievement of equilibrium and thus the measurement / analysis of the biological specimen will proceed. The same applies when functionalized magnetic particles are used.

本方法がより迅速に行われることが望ましい場合には、平衡の達成を省くことができる。この場合には、全てのサンプルおよびキャリブレーターに関して同一のインキュベーション時間および条件を維持することが重要である。   If it is desired that the method be performed more quickly, achieving equilibrium can be omitted. In this case, it is important to maintain the same incubation time and conditions for all samples and calibrators.

混合を自動化するためには、本発明によるデバイスを中に有するユニット（例えば、測定チャンバまたはマイクロタイタープレート）を、実験室で常用されているシェーカー（振とう装置）に載置する。このような振とう装置は知られている。簡単な手法により、最適な振とう速度を見出すことができる。ボルテックス装置の使用も考えられる。混合の目的は、試験成分同士が衝突する確率を高めることで所望の結合を可能な限りスピーディーに形成させ、それにより該成分の結合の平衡達成を迅速に生じさせることにある。成分の結合の平衡達成に要する時間は可変であり、容易に見出すことができる。通常は、成分が測定に十分な結合の平衡に達するまでには、１５〜３０分間の範囲内の最適な完全混合時間を要する。   In order to automate the mixing, a unit (for example a measuring chamber or a microtiter plate) having a device according to the invention therein is placed on a shaker (shaking device) commonly used in the laboratory. Such a shaking device is known. A simple method can find the optimum shaking speed. The use of vortex equipment is also conceivable. The purpose of mixing is to increase the probability that the test components will collide with each other so that the desired bonds are formed as quickly as possible, thereby quickly achieving an equilibrium of the component bonds. The time required to achieve component binding equilibrium is variable and can easily be found. Usually, it takes an optimal complete mixing time in the range of 15-30 minutes for the components to reach binding equilibrium sufficient for measurement.

（好ましくは機能化された粒子の形態の）機能化された表面がフルイディクス系またはマイクロフルイディクス系に導入された場合には、自由拡散または振とうに代えて、試験成分同士が衝突する確率を高めることができ、特に生物学的検体とスカベンジャー分子とが衝突する確率を高めることができる。これらの系内では、機能化された表面が分析すべき１つ以上の生物学的検体によって活発に押し流され、それにより該機能化された表面（好ましくは機能化された粒子）上での該１つ以上の生物学的検体の濃縮が生じる。マイクロフルイディクス系は、扱いにくいサンプル、例えばヒト血清における検出感度を高めるためにしばしば使用される。   If the functionalized surface (preferably in the form of functionalized particles) is introduced into a fluidic or microfluidic system, the probability that the test components will collide with each other instead of free diffusion or shaking. In particular, the probability that a biological specimen and a scavenger molecule collide can be increased. Within these systems, the functionalized surface is actively swept away by one or more biological analytes to be analyzed, whereby the functionalized surface (preferably functionalized particles) on the functionalized surface. Concentration of one or more biological analytes occurs. Microfluidic systems are often used to increase detection sensitivity in cumbersome samples, such as human serum.

本発明による発光マーカーは、所望の試験成分（特に１つ以上の生物学的検体）と結合し、それと同時に光を放射することができる。本発明によるデバイスにおいては、また本発明による方法においては、考えうるあらゆる発光マーカーを使用することができる。好ましくは、蛍光マーカーが使用される。   A luminescent marker according to the present invention is capable of binding to a desired test component (especially one or more biological analytes) and simultaneously emitting light. Any conceivable luminescent marker can be used in the device according to the invention and in the method according to the invention. Preferably, a fluorescent marker is used.

本発明の範囲においては、「結合した発光マーカー」という概念は、機能化された表面に、直接またはさらなる試験成分を介して（例えば検体または一次抗体を介して）結合している、あらゆる発光マーカーであると理解される。同時に、「未結合の」という概念は、機能化された表面に直接結合してもいないしさらなる試験成分を介して結合してもいない発光マーカーまたは蛍光マーカーを指す。   Within the scope of the present invention, the term “bound luminescent marker” refers to any luminescent marker that is bound to a functionalized surface, either directly or via further test components (eg via an analyte or primary antibody). It is understood that. At the same time, the term “unbound” refers to a luminescent or fluorescent marker that is not directly bound to the functionalized surface or bound via a further test component.

所定の生物学的検体および／または機能化された表面に結合する発光マーカーまたは蛍光マーカーは知られており、市販されている。適しているのは、例えばＡｌｅｘａ ６４７標識抗体フラグメントまたはＡｌｅｘａ ４８８標識抗体フラグメント（例えば、Ａｌｅｘａ ６４７ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２ ｓｐｅｃｉｆｉｃ、およびｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ｒａｂｂｉｔ Ａｎｔｉ−Ｃｈｉｃｋｅｎ ＩｇＹ （Ｈ＋Ｌ）−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ ４８８ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ，Ｆ（ａｂ’）２ ｓｐｅｃｉｆｉｃ）またはフルオレセイン−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ｃｈｉｃｋｅｎ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体、およびＲ−フィコエリトリンＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ，Ｆｃγ Ｆｒａｇｍｅｎｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃである。 Luminescent or fluorescent markers that bind to a given biological analyte and / or functionalized surface are known and commercially available. Suitable are, for example, Alexa 647-labeled antibody fragment or Alexa 488-labeled antibody fragment (for example, Alexa 647 Conjugated Affini Pure F (ab ′) 2 Fragment Goat Anti-Human IgG F (ab ′) 2 specific) Chicken IgY (H + L) -Alexa Fluor 488, Alexa 488 Affini Pure F (ab ′) 2 Fragment Goat Anti-Human IgG, F (ab ′) 2 specific IgG) or fluorescein-isocyanate H + L) anti And R- phycoerythrin AffiniPure F (ab ') 2 Fragment Goat Anti-Human IgG, is Fc.gamma. Fragment specific.

発光マーカーまたは蛍光マーカーは、個別での製造も可能である。このために、発光色素または蛍光色素を、適切な結合部位を有しかつ所望の試験成分（好ましくは、分析すべき１つ以上の生物学的検体）と結合しうる生体分子（例えばタンパク質、抗体、抗体フラグメント）と結合させる。この結合は、慣用の手法により、例えば、ＮＨＳ基、エステル基またはマレイミド基を有していることにより抗体およびタンパク質に結合しうる発光色素または蛍光色素を使用することにより行われる。この結合はさらに、上記と同様に、ビオチン化タンパク質にストレプトアビジンを有する発光色素または蛍光色素を結合させることによりストレプトアビジンにより媒介されていてよい。蛍光マーカーとしては、天然の蛍光タンパク質、例えばＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）およびその誘導体を、単独で使用することもできるし、他のタンパク質と一緒にいわゆる融合タンパク質として使用することもできる。   The luminescent marker or fluorescent marker can also be manufactured individually. For this purpose, a luminescent or fluorescent dye has a suitable binding site and can bind to a desired test component (preferably one or more biological analytes to be analyzed) (eg protein, antibody). Antibody fragment). This conjugation is performed by a conventional method, for example, by using a luminescent dye or a fluorescent dye capable of binding to an antibody and a protein by having an NHS group, an ester group or a maleimide group. This binding may further be mediated by streptavidin by attaching a luminescent or fluorescent dye with streptavidin to the biotinylated protein as described above. As a fluorescent marker, a natural fluorescent protein, for example, GFP (green fluorescent protein) and derivatives thereof can be used alone, or can be used as a so-called fusion protein together with other proteins.

色素および結合部位の選択は、本発明によるデバイスの使用かまたは本発明による方法の実施により分析することができる生物学的検体およびそのために使用することができるアッセイに応じて行われる。   The choice of dye and binding site is made depending on the biological analyte that can be analyzed by use of the device according to the invention or by carrying out the method according to the invention and the assay that can be used therefor.

その他では生物学的サンプルの測定時にも使用されている、知られているあらゆる蛍光色素を使用することができる。そのような色素は、例えばシアニン、クマリン、フルオレセイン、ローダミンおよびそれらの誘導体、例えばフルオレシン−イソチオシアネートである。これらは市販されている（例えば、Ａｌｅｘａ（登録商標）、Ｄｙ−Ｌｉｇｈｔ（登録商標）、Ａｔｔｏ（登録商標）またはＯｙｓｔｅｒ（登録商標））。   In addition, any known fluorescent dyes that are also used when measuring biological samples can be used. Such dyes are, for example, cyanine, coumarin, fluorescein, rhodamine and derivatives thereof such as fluorescein-isothiocyanate. These are commercially available (eg, Alexa®, Dy-Light®, Atto® or Oyster®).

上記の蛍光色素に加えて、蛍光マーカーの製造に蛍光量子ドット（「Ｑドット」）を使用することができる。そのような蛍光マーカーは、蛍光放射が特に高度である点が特徴的である。   In addition to the fluorescent dyes described above, fluorescent quantum dots ("Q dots") can be used in the production of fluorescent markers. Such fluorescent markers are characterized by a particularly high degree of fluorescence emission.

分析すべき生物学的検体自体を蛍光色素と結合させて蛍光マーカーとして使用することも考えられうる。そのような蛍光マーカーは、該蛍光マーカーと蛍光標識されていない同一の生物学的検体とがスカベンジャー分子への結合に関して競合する競合アッセイに適している。   It can be considered that the biological specimen to be analyzed itself is combined with a fluorescent dye and used as a fluorescent marker. Such fluorescent markers are suitable for competitive assays in which the fluorescent marker and the same biological analyte that is not fluorescently labeled compete for binding to the scavenger molecule.

本発明の一実施形態においては、発光マーカーとして、蛍光標識された異なる抗体が使用され、それにより、異なる検体またはエピトープを異なる蛍光チャネルにおいて同時に検出することができる（マルチプレキシング）。   In one embodiment of the invention, different fluorescently labeled antibodies are used as luminescent markers, so that different analytes or epitopes can be detected simultaneously in different fluorescent channels (multiplexing).

別段の記載がない限り、「サンプル」という表記は以下のものであると理解される：少なくとも１種類の生物学的検体を含有する、あらゆる種類の流体、あらゆる種類の緩衝液、細胞培養のためのおよび発酵のための培地、ならびに血液、血漿、尿、血清。本発明により特に適したサンプルは、あらゆる種類の流体、あらゆる種類の緩衝液、細胞培養のためのおよび発酵のための培地である。   Unless stated otherwise, the expression “sample” is understood to be: for any kind of fluid, for any kind of buffer, for cell culture containing at least one biological specimen. And medium for fermentation, and blood, plasma, urine, serum. Particularly suitable samples according to the invention are all kinds of fluids, all kinds of buffers, media for cell culture and for fermentation.

別段の記載がない限り、「水溶液」という表記は以下のものであると理解される：水性の、好ましくはｐＨ緩衝処理された溶液（例えばトリス緩衝液）であって、該溶液中には場合によりタンパク質生化学において慣用の（さらなる）物質、例えばウシアルブミン（ＢＳＡ）、界面活性剤（例えばＴｗｅｅｎ ２０）等が存在するものとする。この表記には、反応緩衝液および結合緩衝液も含まれる。結合緩衝液は知られており、それぞれの試験要求に適合させることができる。   Unless stated otherwise, the expression “aqueous solution” is understood to be: an aqueous, preferably pH buffered solution (eg Tris buffer), in which case By means of this, there are present (further) substances commonly used in protein biochemistry, such as bovine albumin (BSA), surfactants (for example Tween 20) and the like. This notation includes reaction buffers and binding buffers. Binding buffers are known and can be adapted to the respective test requirements.

別段の記載がない限り、「測定溶液」という表記は、水溶液であって、該水溶液中に本発明による方法の実施中に試験成分が溶解および／または懸濁している水溶液と理解される。   Unless stated otherwise, the expression “measuring solution” is understood to be an aqueous solution in which the test component is dissolved and / or suspended during the performance of the method according to the invention.

別段の記載がない限り、「試験成分」という表記は、以下の成分の少なくとも１つと理解される：発光マーカー、機能化された定置表面、機能化された粒子、または機能化された磁性粒子、およびサンプル、ならびにスカベンジャー分子、および一次抗体。   Unless stated otherwise, the expression “test component” is understood as at least one of the following components: luminescent marker, functionalized stationary surface, functionalized particle, or functionalized magnetic particle, And samples, as well as scavenger molecules, and primary antibodies.

試験成分を、本発明による方法においては、溶媒に、好ましくは水溶液に溶解または懸濁させて使用することができる。同様に、これらの試験成分を、純粋な状態で、すなわち溶媒を添加せずに、本発明による方法において使用することもできる。このことは例えば、サンプルが、それぞれ少なくとも１つの生物学的検体を含有する流体、緩衝液または細胞培養培地である場合に該当する。好ましい溶媒は、本明細書中に定義される水溶液である。   The test components can be used in the method according to the invention dissolved or suspended in a solvent, preferably in an aqueous solution. Likewise, these test components can also be used in the method according to the invention in the pure state, ie without addition of a solvent. This is the case, for example, when the sample is a fluid, buffer or cell culture medium each containing at least one biological analyte. Preferred solvents are aqueous solutions as defined herein.

別段の記載がない限り、本発明による生物学的検体または「検体」という概念は、本発明による方法により分析または検出されるべき分子であると理解される。そのような生物学的検体の例は、タンパク質、抗体、タンパク質複合体、抗体複合体、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、１つ以上の生体分子からの複合体、ウイルス、または１つ以上の生体細胞もしくはその成分、ならびに生物学的活性を有するかもしくは生体分子と相互作用を生じる低分子量物質である。本発明による方法において、生物学的検体として特に十分に検出可能であるのは、タンパク質、抗体、タンパク質複合体、抗体複合体、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、１つ以上の生体分子からの複合体、およびウイルスである。   Unless otherwise stated, the concept of a biological sample or “sample” according to the present invention is understood to be a molecule to be analyzed or detected by the method according to the present invention. Examples of such biological specimens are proteins, antibodies, protein conjugates, antibody conjugates, peptides, DNA, RNA, complexes from one or more biomolecules, viruses, or one or more living cells or Its components, as well as low molecular weight substances that have biological activity or interact with biomolecules. In the method according to the present invention, proteins, antibodies, protein complexes, antibody complexes, peptides, DNA, RNA, complexes from one or more biomolecules are particularly well detectable as biological analytes, And is a virus.

別段の記載がない限り、「導入」という概念は以下のものであると理解される：通常の措置、例えばピペッティングによる、またはマイクロフルイディクス系の使用による、デバイスまたは測定チャンバの手動によるまたは自動的な充填。   Unless otherwise stated, the concept of “introduction” is understood to be: manual or automatic operation of the device or measurement chamber by normal measures such as pipetting or by using a microfluidic system Filling.

別段の記載がない限り、「結合」という概念は、少なくとも２つの単位が互いに接触することによってこれらの間に安定な結合平衡が生じることと理解される。そのような結合は一般的には相互作用により促進され、その結果、相応する結合、例えば水素橋かけ結合、塩結合、錯結合および共有結合が生じる。本発明による方法およびデバイスにおいて生じる結合は、上記の相互作用のいくつかが混在したものであることが多い。   Unless otherwise stated, the concept of “binding” is understood to result in a stable binding equilibrium between at least two units contacting each other. Such bonds are generally facilitated by interaction, resulting in corresponding bonds such as hydrogen bridge bonds, salt bonds, complex bonds and covalent bonds. The bonds that occur in the methods and devices according to the present invention are often a mixture of some of the above interactions.

本発明の意味における発光にはあらゆる種類の発光が含まれ、特に、光により励起された蛍光、生物発光および化学発光が含まれ、その際、蛍光が好ましい。蛍光測定の際には、分子が励起光によって励起電子状態に上がり、該分子が放射線を放出（１つ以上の所定の波長または蛍光のいわゆる蛍光放射）してエネルギーを放出することで元のエネルギー基底状態に落ちる。分子の蛍光の測定は、確立された手法である。   Luminescence in the sense of the present invention includes all types of luminescence, and in particular includes fluorescence excited by light, bioluminescence and chemiluminescence, with fluorescence being preferred. At the time of fluorescence measurement, a molecule rises to an excited electronic state by excitation light, and the molecule emits radiation (so-called fluorescence emission of one or more predetermined wavelengths or fluorescence) to release the original energy. It falls to the ground state. The measurement of molecular fluorescence is an established technique.

別段の記載がない限り、「磁性要素」という概念は以下のものであると理解される：被覆、または磁性の層、例えばＲｈｅｉｎｍａｇｎｅｔ社のシートＰｅｒｍａｆｌｅｘ ５１８。層厚およびシートは次のように選択され、すなわち、該シートの磁気強度によって、機能化された磁性粒子が混合後にデバイスの底部の測定窓の外側にしか沈降せず、該測定窓は空いたままであって、（好ましくはシェーカー上での）試験成分の効率的な混合が妨害されることのないように選択される。従って、適切な磁場強度または磁気強度とは、試験成分を混合しうるのに十分な弱さを有しつつも混合後に磁性粒子を引き付けるのに十分な強さを有する強度であって、その際、測定窓に磁性粒子が付いていない状態が維持されなければならない。適切な磁性シートは市販されている。シートから打ち抜きまたはレーザー切断によって測定窓を作製することができる。   Unless otherwise stated, the concept of “magnetic element” is understood to be: a coating, or a magnetic layer, for example the sheet Permaflex 518 from Rheinmagnet. The layer thickness and the sheet are selected as follows: the magnetic strength of the sheet allows the functionalized magnetic particles to settle only outside the measuring window at the bottom of the device after mixing, leaving the measuring window open. Moreover, it is selected such that efficient mixing of the test components (preferably on a shaker) is not disturbed. Therefore, a suitable magnetic field strength or magnetic strength is a strength that is weak enough to allow the test components to be mixed, but strong enough to attract the magnetic particles after mixing, The state in which no magnetic particles are attached to the measurement window must be maintained. Suitable magnetic sheets are commercially available. The measurement window can be produced by punching or laser cutting from the sheet.

プロテインＡ Ｍａｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）粒子（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、品番２８−９４４０−０６）とＲｈｅｉｎｍａｇｎｅｔ社のシートＰｅｒｍａｆｌｅｘ ５１８とを組み合わせて使用する場合には、層厚は約１ｍｍであることが好ましい。   When protein A Mag-Sepharose (registered trademark) particles (GE Healthcare, product number 28-9440-06) and Rheinmagnet sheet Permaflex 518 are used in combination, the layer thickness is preferably about 1 mm.

別段の記載がない限り、機能化された磁性粒子が使用される本発明による方法についても以下のことが該当する。   Unless otherwise stated, the following also applies to the method according to the invention in which functionalized magnetic particles are used.

本発明により好ましくは、本発明による方法においては蛍光マーカーが使用され、かつステップ（ｄ）における測定は蛍光測定であり、かつ蛍光測定装置を用いて行われる。   Preferably according to the invention, a fluorescent marker is used in the method according to the invention, and the measurement in step (d) is a fluorescence measurement and is carried out using a fluorescence measuring device.

本発明によるデバイスおよび本発明による方法によって、時間分解運動蛍光測定を行うことが可能となる。このことは、例えば、結合平衡／反応平衡の達成を追跡することが望ましい場合に有利である。   The device according to the invention and the method according to the invention make it possible to perform time-resolved motion fluorescence measurements. This is advantageous, for example, when it is desirable to track the achievement of binding / reaction equilibrium.

本発明による方法におけるステップ（ｅ）、すなわち１つ以上の生物学的検体の量および／または濃度の分析は、検量系列を用いて行われる。検量系列に関して、本発明による方法は、検体の所望のまたは予想される濃度範囲を網羅する該検体の様々な所定の濃度／量で、かつその都度、特に発光マーカーの濃度の同一の試験条件で実施される。その後、未結合の発光マーカーの発光放射の測定値から検量線または関数を作成し、それらをもとに検体含有量が不明なサンプル中の検体濃度を求める。こうした検量線を図５ａ〜図５ｅに例示する。値を求めるための上記の検量系列および検量線の作成は、生化学において一般的である。当業者は、確実な結果を得るべくこうした検量線を作成する方法に精通している。   Step (e) in the method according to the invention, ie the analysis of the amount and / or concentration of one or more biological analytes, is carried out using a calibration series. With respect to a calibration series, the method according to the present invention can be used for various predetermined concentrations / amounts of the analyte covering the desired or expected concentration range of the analyte, and in each case, particularly in the same test conditions of the luminescent marker concentration. To be implemented. Thereafter, a calibration curve or a function is created from the measurement value of the luminescence emission of the unbound luminescent marker, and the analyte concentration in the sample whose analyte content is unknown is obtained based on them. Such a calibration curve is illustrated in FIGS. Preparation of the above calibration series and calibration curve for obtaining values is common in biochemistry. Those skilled in the art are familiar with how to create such a calibration curve to obtain reliable results.

本発明による方法では、溶液中で未結合の状態にある発光マーカーの発光を調べる。これは初めてのことであり、それというのも、生物学的検体を分析するための知られている方法は、該生物学的検体に結合した発光マーカーの測定に基づくためである。従来技術において未結合の発光マーカーの蛍光が測定される場合には、該測定において酵素反応または分離が生じることが多く、その際、該蛍光マーカーは、検出抗体から分離されるかまたは予めＦＲＥＴもしくは粒子プローブによって作製されている。このような分離は、本発明による方法においては予定されていない。   In the method according to the present invention, the luminescence of a luminescent marker in an unbound state in solution is examined. This is the first time because known methods for analyzing biological specimens are based on the measurement of luminescent markers bound to the biological specimen. When fluorescence of an unbound luminescent marker is measured in the prior art, an enzyme reaction or separation often occurs in the measurement, and the fluorescent marker is separated from the detection antibody or previously FRET or It is made with a particle probe. Such separation is not envisaged in the process according to the invention.

本発明による方法により生物学的検体の濃度を分析するためには、そして競合アッセイである場合には、可能な限り高い割合の生物学的検体がスカベンジャー分子に結合していることが有利である。このことは、表面（好ましくは粒子表面）上にスカベンジャー分子が過剰に存在し、かつこれが検体に対して高い親和性を有することによって促進される。理想的には、スカベンジャー分子への検体の結合反応は完全に行われる。   In order to analyze the concentration of biological analytes by the method according to the invention, and in the case of competitive assays, it is advantageous that as high a proportion of the biological analyte as possible is bound to the scavenger molecule. . This is facilitated by the presence of an excess of scavenger molecules on the surface (preferably the particle surface) and it has a high affinity for the analyte. Ideally, the binding reaction of the analyte to the scavenger molecule is complete.

上記のケースでは、未結合の発光マーカー（例えば蛍光マーカー）の濃度は、検体と発光マーカー（例えば蛍光マーカー）との解離定数Ｋｄ、発光マーカー（例えば蛍光マーカー）の使用濃度、および生物学的検体の分析すべき濃度のみに依存する。 In the above case, the concentration of unbound luminescent marker (eg, fluorescent marker) is determined by the dissociation constant K d between the analyte and the luminescent marker (eg, fluorescent marker), the concentration used of the luminescent marker (eg, fluorescent marker), and biological It depends only on the concentration of the sample to be analyzed.

アッセイにおいて発光マーカー（例えば蛍光マーカー）の濃度が一定に維持される場合には、未結合の発光マーカー（例えば蛍光マーカー）の濃度、ひいては測定される発光強度（例えば蛍光強度）は、生物学的検体の濃度のみに依存する。   If the concentration of a luminescent marker (eg, fluorescent marker) is kept constant in the assay, the concentration of unbound luminescent marker (eg, fluorescent marker) and thus the measured luminescence intensity (eg, fluorescent intensity) Depends only on analyte concentration.

本発明による方法を用いかつ競合アッセイにより生物学的検体の濃度を分析するためには、スカベンジャー分子の数が発光マーカーの数より少ないかまたは同数であることが有利であり、それにより、検体分子のそれぞれの結合によって未結合の発光マーカーの数が増加する。   In order to analyze the concentration of biological analytes using the method according to the invention and by competitive assay, it is advantageous that the number of scavenger molecules is less than or equal to the number of luminescent markers, whereby the analyte molecules Each binding increases the number of unbound luminescent markers.

検体の濃度の分析に加えて、本発明による方法により、試験成分への検体の結合に関するさらなる情報、例えば解離定数Ｋｄ、またはＩＣ値、またはＥＣ５０値を得ることができる。 In addition to analyzing the concentration of the analyte, the method according to the invention can provide further information regarding the binding of the analyte to the test component, such as the dissociation constant K d , or IC value, or EC 50 value.

本発明によるデバイスを用いた本発明による方法によって、生物学的検体の分析、特に定量化を、極めて単純な、すなわちワンステップのアッセイプロトコールを用いて行うことができる。このようなワンステップのアッセイは、「ミックス・アンド・メジャー・アッセイ」とも称される。すなわち、本発明による方法においては、単に試験成分を一緒に入れて、結合平衡に達するまで待機するだけである。   With the method according to the invention using the device according to the invention, analysis of biological specimens, in particular quantification, can be performed using a very simple, ie one-step assay protocol. Such a one-step assay is also referred to as a “mix and major assay”. That is, in the method according to the invention, the test components are simply put together and waited until binding equilibrium is reached.

粒子の沈降を待った後、測定を直ちに開始することができる。短時間のうちに、通常は１時間未満で所望のデータが得られ、これにより検量線との相関後に所望の定量的または定性的な結果が得られる。この測定には、実験室内によくある単純な発光検出器または蛍光検出器（蛍光リーダー）で十分である。   After waiting for the particles to settle, the measurement can be started immediately. Within a short period of time, the desired data is obtained, usually in less than an hour, thereby obtaining the desired quantitative or qualitative result after correlation with the calibration curve. For this measurement, a simple luminescence detector or a fluorescence detector (fluorescence reader) often found in the laboratory is sufficient.

本発明による方法は、非競合アッセイとして構成されていてもよいし、競合アッセイとして構成されていてもよい。また、本発明による方法を用いて、直接的および間接的な検出を伴うサンドイッチイムノアッセイを行うこともできる。本発明による方法を用いて実施することができる好ましいアッセイは、直接アッセイ、直接的または間接的な検出を伴うサンドイッチイムノアッセイ、置換アッセイまたはディスプレイスメントアッセイ、競合アッセイおよび二次アッセイである。   The method according to the invention may be configured as a non-competitive assay or may be configured as a competitive assay. The method according to the invention can also be used to carry out sandwich immunoassays with direct and indirect detection. Preferred assays that can be carried out using the method according to the invention are direct assays, sandwich immunoassays with direct or indirect detection, displacement or displacement assays, competition assays and secondary assays.

直接アッセイの場合、生物学的検体は通常は抗体であって、該抗体がスカベンジャー分子に結合し、該スカベンジャー分子自体は抗体ではなく抗原であり、該抗原に、可変部を有する該抗体が特異的に結合する（図６ｃに概略的に示す）か、または、該スカベンジャー分子はプロテインＡおよびＧであり、これらは抗体にそのＦｃ部分で結合する（図６ａに概略的に示す）。   In the case of a direct assay, the biological specimen is usually an antibody, which binds to a scavenger molecule, the scavenger molecule itself is an antigen, not an antibody, and the antigen having a variable region is specific for the antigen. Or scavenger molecules are proteins A and G, which bind to the antibody at its Fc portion (schematically shown in FIG. 6a).

阻害アッセイ、すなわち置換アッセイまたはディスプレイスメントアッセイにおいては、機能化された表面への発光マーカーの結合が、生物学的検体によって完全にまたは部分的に阻害される。このことは、生物学的検体が発光マーカーの結合部位に結合し、該結合部位がもはやスカベンジャー分子との結合に供されないことによって行われる（図６ｄに概略的に示す）。   In inhibition assays, ie displacement or displacement assays, the binding of the luminescent marker to the functionalized surface is completely or partially inhibited by the biological analyte. This is done by the biological analyte binding to the binding site of the luminescent marker, which is no longer subjected to binding with the scavenger molecule (schematically shown in FIG. 6d).

直接的な検出を伴うサンドイッチアッセイの場合には、生物学的検体は通常はタンパク質または抗体であり、これはスカベンジャー分子として作用する抗体の可変部と結合し、その際、発光マーカー、好ましくは蛍光マーカーが該検体の第２の結合部位（エピトープ）に結合してサンドイッチが形成される（図７ａに概略的に示す）。   In the case of sandwich assays with direct detection, the biological analyte is usually a protein or antibody, which binds to the variable part of the antibody acting as a scavenger molecule, with a luminescent marker, preferably fluorescent A marker binds to the second binding site (epitope) of the analyte to form a sandwich (schematically shown in FIG. 7a).

間接的な検出を伴うサンドイッチアッセイの場合には、生物学的検体は通常はタンパク質または抗体であり、これはスカベンジャー分子としての抗体の可変部と結合し、その際、発光マーカー、好ましくは蛍光マーカーは該検体に直接結合するのではなくもう１つの一次抗体に結合し、該一次抗体が該検体の第２の結合部位（エピトープ）に結合する（図７ｂに概略的に示す）。   In the case of sandwich assays with indirect detection, the biological specimen is usually a protein or antibody, which binds to the variable part of the antibody as a scavenger molecule, with a luminescent marker, preferably a fluorescent marker. Does not bind directly to the analyte but binds to another primary antibody, which binds to a second binding site (epitope) of the analyte (schematically shown in FIG. 7b).

適切ないずれのアッセイ変形においても、それぞれ所定量の機能化された表面と、発光マーカー、好ましくは蛍光マーカーと、任意に一次抗体とを、本発明によるデバイスまたは測定チャンバに入れる。   In any suitable assay variant, a predetermined amount of functionalized surface, a luminescent marker, preferably a fluorescent marker, and optionally a primary antibody, is placed in a device or measurement chamber according to the present invention.

競合アッセイの場合には、所定量のスカベンジャー分子または機能化された表面と、サンプルと、同一の結合部位（エピトープ）でのスカベンジャー分子への結合に関して検体と競合する発光マーカー、好ましくは蛍光マーカーとを、本発明によるデバイスまたは測定チャンバに一緒に入れる。そこで、反応平衡に達するまで反応を振とう下に行い、粒子の沈降を待機する。次いで、未結合の発光マーカー、好ましくは蛍光マーカーの量を測定溶液中で測定し、検体の濃度を検量線または校正関数により求める。   In the case of a competitive assay, a predetermined amount of scavenger molecule or functionalized surface, a sample, and a luminescent marker, preferably a fluorescent marker, that competes with the analyte for binding to the scavenger molecule at the same binding site (epitope). Are placed together in a device or measuring chamber according to the invention. Therefore, the reaction is carried out with shaking until the reaction equilibrium is reached, and the particles are allowed to settle. Next, the amount of unbound luminescent marker, preferably a fluorescent marker, is measured in the measurement solution, and the concentration of the specimen is determined by a calibration curve or a calibration function.

その際、未結合の発光マーカー、好ましくは蛍光マーカーの濃度は検体の量のみに依存し、該検体は、スカベンジャー分子への発光マーカーの結合、好ましくはスカベンジャー分子への蛍光マーカーの結合を完全または部分的に阻害し、そのようにして検出領域内での蛍光シグナルの増大が生じる。   In so doing, the concentration of the unbound luminescent marker, preferably the fluorescent marker, depends only on the amount of the analyte, which analyte completely or completely binds the luminescent marker to the scavenger molecule, preferably to the scavenger molecule. Partial inhibition, thus causing an increase in the fluorescence signal within the detection region.

本発明による方法において使用するための本発明によるデバイスは、機能化された表面に結合した試験成分と未結合の試験成分とを分離することができるように構成されている。このために、デバイスは構造要素を含む。構造要素は特に突出部として構成されており、該突出部の横断面は任意の形状を有することができ（例えば、円形、矩形、三角形）、その際、基部とは反対側の端部は、試験成分が粒子である場合には該端部に該試験成分が堆積しない状態にある。構造要素は好ましくは、デバイスの基部に、上方に向かってまっすぐに延びるかまたは先細状の突出部を有し、かつ少なくとも部分的に透光性である。端部は例えば凸状形態をとっていてもよく、かつ／または小さい直径を有することができる。構造要素は好ましくは円錐、円錐台または角錐として構成されており、かつデバイスの基部から突出している。構造要素はさらに、デバイスの基部とは反対側の端部に、光学部品、例えばレンズを有することができる。好ましくは、これはピン、円錐または円錐台の形状を有する。構造要素はポリプロピレンからなることができ、かつ透光性である。以下に記載する目的を達成する突出部の他の幾何学的形状も考えられる。   The device according to the invention for use in the method according to the invention is configured such that test components bound to the functionalized surface can be separated from unbound test components. For this purpose, the device includes a structural element. The structural element is specifically configured as a protrusion, and the cross section of the protrusion can have any shape (for example, circular, rectangular, triangular), with the end opposite the base being When the test component is a particle, the test component is not deposited on the end. The structural element is preferably at least partially translucent at the base of the device, having straight or upwardly projecting protrusions. The ends may for example have a convex shape and / or have a small diameter. The structural element is preferably configured as a cone, frustum or pyramid and protrudes from the base of the device. The structural element can further have an optical component, for example a lens, at the end opposite the base of the device. Preferably this has the shape of a pin, cone or truncated cone. The structural element can be made of polypropylene and is translucent. Other geometric shapes of the protrusions that achieve the objectives described below are also conceivable.

構造要素は、本発明による方法において発光を検出するために予定された光路を空けておくという目的と、結合した発光マーカーの結果を変えてしまう発光が測定装置において生じるのを防ぐという目的とを有する。分離のための構造要素の存在は重要である。なぜならば、未結合の状態にある発光マーカーの発光を通じて生物学的検体の分析が行われるためである。構造要素は、少なくとも部分的に透光性である。   The structural element has the purpose of leaving a planned optical path for detecting luminescence in the method according to the invention and of preventing the luminescence that changes the result of the combined luminescent marker from occurring in the measuring device. Have. The presence of structural elements for separation is important. This is because the biological specimen is analyzed through the luminescence of the luminescent marker in an unbound state. The structural element is at least partially translucent.

同様に、本発明によるデバイスは、測定窓として機能する領域を有する。測定窓は、デバイスの基部に存在していてもよいし、基部と向かい合うデバイス端部に存在していてもよい。少なくとも部分的に透光性である構造要素の基部は、測定窓であることができる。この測定窓を通じて、通常は励起および検出が行われる。しかし、測定窓を検出のみに使用することもできる。デバイスまたは測定チャンバ内での測定窓の構成および位置は可変であり、測定の要求に適合させることができる。しかし、未結合の状態にある発光マーカーの発光のみが測定窓を通じて測定されることが保証されることが重要である。測定窓のサイズおよび発光マーカーの種類を適切に選択することにより、デバイスを利用する本方法の感度を調節することができる。   Similarly, the device according to the invention has a region that functions as a measurement window. The measurement window may be present at the base of the device or may be present at the end of the device facing the base. The base of the structural element that is at least partly translucent can be a measurement window. Excitation and detection are usually performed through this measurement window. However, the measurement window can also be used for detection only. The configuration and position of the measurement window within the device or measurement chamber is variable and can be adapted to the measurement requirements. However, it is important to ensure that only the luminescence of the luminescent marker in the unbound state is measured through the measurement window. By appropriately selecting the size of the measurement window and the type of luminescent marker, the sensitivity of the method utilizing the device can be adjusted.

中で発光マーカーが発光するデバイスまたは測定チャンバ内の領域であって、測定窓を通じて観察することができる／分光分析することができる領域を、以下で「測定領域」または「検出領域」と称する。   The region in the device or measurement chamber in which the luminescent marker emits light and which can be observed / spectrometrically analyzed through the measurement window is hereinafter referred to as “measurement region” or “detection region”.

デバイスまたは測定チャンバ内の領域であって、測定窓からの観察／分光分析ができない領域を、以下で「分離除去領域」と称する。   An area in the device or the measurement chamber that cannot be observed / spectrometrically analyzed from the measurement window is hereinafter referred to as a “separation removal area”.

本発明によるデバイスにおいて、この検出領域と分離除去領域とは、これら２つの領域間での試験成分の交換が効果的かつ容易に可能であるように接続されている。従って、未結合の発光マーカーの濃度は、デバイス／測定チャンバ全体を通して同一である。   In the device according to the invention, the detection area and the separation and removal area are connected in such a way that the exchange of test components between these two areas is possible effectively and easily. Thus, the concentration of unbound luminescent marker is the same throughout the device / measurement chamber.

本発明の好ましい一実施形態においては、測定窓は、基部とは反対側の構造要素端部と光学的に接続されており、かつ該構造要素の底面である。例えば、構造要素は、デバイスの基部での上方に向かってまっすぐに延びるかまたは先細状の突出部であり、かつ透光性であり、かつ該デバイスの基部は非透光性の層または被覆を有し、その際、該構造要素の基部面は空所になっている。その際、この非透光性の層（例えば黒色の塗料層）は、デバイスの基部の領域であって構造要素の下方に存在する領域を残して施与されており、それによって測定窓が形成される。   In a preferred embodiment of the invention, the measurement window is optically connected to the end of the structural element opposite the base and is the bottom surface of the structural element. For example, the structural element extends straight upwards at the base of the device or is a tapered protrusion and is translucent, and the base of the device has a non-translucent layer or coating. And the base surface of the structural element is vacant. This non-light-transmitting layer (eg black paint layer) is applied leaving the area at the base of the device and below the structural elements, thereby forming a measuring window Is done.

この時点で、光はデバイスの基部から測定チャンバへと送られ、その後、該放射線は構造要素を通過して測定領域内へと延びる。測定領域内での発光マーカーの励起後に、放射をまた測定窓で測定することができる。   At this point, light is sent from the base of the device to the measurement chamber, after which the radiation extends through the structural element and into the measurement region. After excitation of the luminescent marker in the measurement area, the radiation can also be measured in the measurement window.

本方法のもう１つの実施形態においては、非透光性の層を有しない本発明によるデバイス、測定チャンバまたはマイクロタイタープレート、特に上記のまたは実施形態［０］、［Ａ］、［Ｂ］、［Ｃ］、［Ｄ］、［Ｅ］、［Ｆ］もしくは［Ｇ］のうちの１つに記載した本発明によるデバイス、測定チャンバまたはマイクロタイタープレートを使用することができ、すなわちその場合には蛍光測定装置として蛍光顕微鏡が使用され、その際、例えば適切な結像特性と適切な収集効率と有する対物レンズ（例えば、Ｏｌｙｍｐｕｓ社の１０倍対物レンズを搭載したＮｙＯＮＥ型の自動化蛍光顕微鏡（ドイツ連邦共和国エルムスホルン所在、ＳｙｎｅｎＴｅｃ社））を選択することによって、検出領域からの蛍光放射のみが検出されるように測定光学系が適合されている。   In another embodiment of the method, the device, measurement chamber or microtiter plate according to the invention without a non-translucent layer, in particular above or embodiments [0], [A], [B], The device, measurement chamber or microtiter plate according to the invention described in one of [C], [D], [E], [F] or [G] can be used, ie in that case A fluorescence microscope is used as the fluorescence measuring apparatus. For example, an objective lens having an appropriate imaging characteristic and an appropriate collection efficiency (for example, an NyONE type automated fluorescence microscope equipped with an Olympus 10-times objective lens (Germany) Measurement light so that only fluorescent radiation from the detection area is detected by selecting SynenTec, Inc., Elmshorn, Republic of the Republic The system is adapted.

機能化された粒子が本発明によるデバイスにおいておよび本発明による方法において機能化された表面として使用される場合には、未結合の発光マーカーと粒子に結合した発光マーカーとの分離は、通常は沈降により行われる。このために、測定溶液を負荷したデバイスを所定の時間にわたって動かさない。機能化された粒子であって、該粒子に結合した発光マーカーを伴う粒子は、周囲の測定溶液よりも高い密度を有し、かつ沈降する。未結合の発光マーカーは、溶液中に残る。その後、この結合した発光マーカーはデバイスの基部の構造要素の近傍で沈殿し、それにより該結合した発光マーカーは分離除去領域内に存在する。従って、機能化された（磁性）粒子が本発明による方法において使用される場合には、該方法はさらにステップ（ｃ’）、すなわち所定の時間にわたる、好ましくは１〜３０分間、または１〜２０分間、または１〜１５分間の、特に好ましくは１〜１０分間のデバイスの静置を含むか、または磁性粒子が使用される場合には１〜５分間、特に好ましくは１〜２分間のデバイスの静置を含む。   When functionalized particles are used in the devices according to the invention and as functionalized surfaces in the method according to the invention, the separation of unbound luminescent markers and luminescent markers bound to the particles is usually precipitated. Is done. For this purpose, the device loaded with the measuring solution is not moved for a predetermined time. Functionalized particles with luminescent markers attached to the particles have a higher density than the surrounding measurement solution and settle. Unbound luminescent markers remain in solution. The bound luminescent marker is then precipitated in the vicinity of the structural element at the base of the device, so that the bound luminescent marker is present in the separation and removal region. Thus, if functionalized (magnetic) particles are used in the method according to the invention, the method further comprises step (c ′), ie for a predetermined time, preferably 1 to 30 minutes, or 1 to 20 Of the device for 1 minute or 1 to 15 minutes, particularly preferably 1 to 10 minutes, or 1 to 5 minutes, particularly preferably 1 to 2 minutes, if magnetic particles are used. Including standing.

総じて、機能化された磁性粒子が使用される場合には、結合した発光マーカーの沈降時間は５分間未満である。磁性粒子が使用されない場合には、沈降時間は３０分間未満であり、通常は５〜２０分間の範囲内である。   Overall, when functionalized magnetic particles are used, the settling time of the bound luminescent marker is less than 5 minutes. When magnetic particles are not used, the settling time is less than 30 minutes and is usually in the range of 5 to 20 minutes.

迅速な試験の実施が望まれる場合には、高い密度を有する機能化された粒子を使用することが有利である。非磁性粒子の場合には、約９０μｍの平均直径が有利であることが判明した。   If rapid testing is desired, it is advantageous to use functionalized particles with high density. In the case of non-magnetic particles, an average diameter of about 90 μm has proved advantageous.

この文脈における高い密度とは、使用される（磁性）粒子が水性の試験溶液よりも高い密度を有することを意味する。   High density in this context means that the (magnetic) particles used have a higher density than the aqueous test solution.

本発明による方法において１μｍ未満の非磁性粒子が使用される場合には、粒子の沈降を待機することに代えて、発光測定の前に遠心分離ステップを挿入することが有利であり、それにより粒子がデバイスの基部へと送られる。   If non-magnetic particles of less than 1 μm are used in the method according to the invention, it is advantageous to insert a centrifugation step before the luminescence measurement instead of waiting for the particles to settle, whereby the particles Is sent to the base of the device.

同様に、迅速な試験の実施に関しては、（磁性の）機能化された粒子が大表面を有することが有利であり、それにより、生物学的検体が溶液による拡散時にスカベンジャー分子と出会う確率が高まる。この確率は、デバイスの振とう（撹拌）により高められる。   Similarly, for rapid test performance, it is advantageous that the (magnetic) functionalized particles have a large surface, which increases the probability that a biological analyte will encounter a scavenger molecule upon diffusion through solution. . This probability is increased by shaking (stirring) the device.

デバイスを、知られている実験室機器および消耗材と、例えばマイクロタイタープレート、エッペンドルフ試験管または他の容器およびプレートと、組み合わせることができ、それによって本発明による方法を実施することができる。その場合、上記の材料の側壁と本発明によるデバイスとが一緒になって測定チャンバを構成する。有利には、（例えばマイクロタイタープレートの形態の）同様の複数の測定チャンバが保持器系内に収容され、その際、「生体分子スクリーニング学会（Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）」（ＳＢＳ）の規格である１２７．７６ｍｍ×８５．４８ｍｍ×１４．３５ｍｍに相当する寸法であることが好ましく、それにより実験室で常用されている機器で作業することができ、そのようにして高度の自動化を達成することができる。   The device can be combined with known laboratory equipment and consumables, for example with microtiter plates, Eppendorf tubes or other containers and plates, whereby the method according to the invention can be carried out. In that case, the side walls of the material and the device according to the invention together constitute a measuring chamber. Advantageously, a plurality of similar measuring chambers (for example in the form of microtiter plates) are housed in a cage system, in accordance with the standard of “Society for Biomolecular Screening” (SBS) It is preferred that the dimensions correspond to 127.76 mm x 85.48 mm x 14.35 mm, so that it is possible to work with equipment commonly used in the laboratory, thus achieving a high degree of automation. it can.

本発明のもう１つの実施形態においては、本発明は、上部が開放または閉鎖されている１つのチャンバからなる測定チャンバに関し、ここで、前記測定チャンバは側壁を有しかつその基部はデバイスにより形成される。この測定チャンバは、丸みを帯びた、またはまっすぐな側壁を有することができる。しかし、測定チャンバが複数の基部を有することも可能であり、すなわち、測定チャンバの基部の他にデバイスの基部が存在していることも可能である。   In another embodiment of the present invention, the present invention relates to a measurement chamber comprising a single chamber whose top is open or closed, wherein said measurement chamber has a side wall and its base is formed by a device. Is done. The measurement chamber can have rounded or straight side walls. However, it is also possible for the measurement chamber to have a plurality of bases, i.e. the base of the device may be present in addition to the base of the measurement chamber.

好ましくは、測定チャンバの側壁とデバイスの基部とは、または測定チャンバの側壁と他の基部（該基部上にデバイスが存在する）とは、液体を透過しないように接続または接着または溶接されている。   Preferably, the side wall of the measurement chamber and the base of the device, or the side wall of the measurement chamber and the other base (the device is present on the base) are connected or bonded or welded so as not to transmit liquid. .

本発明のもう１つの実施形態においては、デバイスはマイクロタイタープレートの凹部に導入されており、その際、該凹部の縁部が測定チャンバの側縁部を形成する。   In another embodiment of the invention, the device is introduced into a recess in the microtiter plate, where the edge of the recess forms the side edge of the measurement chamber.

本発明のもう１つの実施形態においては、本発明は、マイクロタイタープレートであって、前記マイクロタイタープレートの元の底部を、構造要素を含む一体型の基部と交換した前記マイクロタイタープレートに関し、その際、前記基部は、前記構造要素の底面を除いて、（例えば、相応する空所を有する非透光性のシートの貼り付けによって、または塗装によって）非透光性となるように被覆されている。   In another embodiment of the invention, the invention relates to a microtiter plate, wherein the microtiter plate replaces the original bottom of the microtiter plate with an integral base comprising structural elements, In this case, the base portion is coated so as to be non-translucent (for example, by applying a non-translucent sheet having a corresponding space or by painting) except for the bottom surface of the structural element. Yes.

上記のＳＢＳサイズでのデバイスの製造は、例えば底部のないマイクロタイタープレートを使用し、この底部に代えて透光性（透明）でかつ非蛍光性の（例えばポリプロピレンからなる）シートを施与することにより行われ、ここで、該シートにはＳＢＳサイズに相当する配置で構造要素がエンボス加工されている。そのようなシートは、複数の一体型のデバイスを表す。その場合、構造要素はマイクロタイタープレートの開口部に向いている。このようなエンボス加工されたシートは市販されている（例えばＤｏｕｇｌａｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＡｒｒａｙｔａｐｅ（登録商標））。   In the manufacture of the device in the above SBS size, for example, a microtiter plate without a bottom is used, and a light-transmitting (transparent) and non-fluorescent (for example, made of polypropylene) sheet is applied instead of the bottom. Here, the structural elements are embossed on the sheet in an arrangement corresponding to the SBS size. Such a sheet represents a plurality of integrated devices. In that case, the structural element faces the opening of the microtiter plate. Such embossed sheets are commercially available (eg, Douglass Scientific's Arraytape®).

マイクロタイタープレートの面であってその上に実際に底部が存在する面へのシートの施与は、通常は異なる２つのプラスチックを接着しうる接着剤での接着により行われる。最も簡単な方法は、そのために非蛍光性のＵＶ硬化型接着剤を利用することである。最後に、非透光性でかつ非蛍光性の塗料層が、プラスチックシートの下面に、該下面が構造要素の領域内で空所となるように施与される。まずシートに塗料層を施与し、次いで該シートにマイクロタイタープレートを接着させることも考えられる。   Application of the sheet to the surface of the microtiter plate on which the bottom is actually present is usually done by bonding with an adhesive that can bond two different plastics. The simplest method is to use a non-fluorescent UV curable adhesive for this purpose. Finally, a non-translucent and non-fluorescent paint layer is applied to the lower surface of the plastic sheet such that the lower surface is void in the region of the structural element. It is also conceivable to first apply a paint layer to the sheet and then adhere a microtiter plate to the sheet.

磁性要素を有するマイクロタイタープレートの製造は、透明な底部（この文脈においては「基部」とも称される）を有する市販のマイクロタイタープレートと適切な磁気強度の磁性シートとの、場合により可逆的な、すなわち固定されているかまたは取り外し可能な接続により行われ、ここで、該シートはマイクロタイタープレートの（測定チャンバに相応する）各凹部につき１つの空所を有し、該空所が測定窓として利用される。この空所は次のように配置されており、すなわち、シートがマイクロタイタープレートの底部と接続されている場合には、該空所は該マイクロタイタープレートのウェルの下方に中心が合った状態となるように配置されている。空所の最適なサイズはウェルのサイズに依存し、以下の実施例をもとに当業者が見出すことができる。空所の直径は、ウェルの寸法、ならびにアッセイにおいて使用される粒子の数およびサイズに応じて寸法決めされていなければならない。３８４ウェルマイクロタイタープレートにおいては、ウェル１つ当たり約１０００の磁性粒子を使用する場合、約２．５ｍｍの直径を有する空所が有利であることが判明した。これは市販の３８４ウェルプレートの底部面積のほぼ半分に相当し、これによって、一方では磁性粒子の分離除去に十分な面積が提供されると同時に、蛍光測定に十分な大きさの測定窓も提供される。   The manufacture of microtiter plates with magnetic elements is sometimes reversible between a commercially available microtiter plate with a transparent bottom (also referred to in this context as “base”) and a magnetic sheet of appropriate magnetic strength. I.e. by a fixed or detachable connection, wherein the sheet has one cavity for each recess (corresponding to the measuring chamber) of the microtiter plate, the cavity serving as a measuring window Used. This void is arranged as follows: when the sheet is connected to the bottom of the microtiter plate, the void is centered below the well of the microtiter plate. It is arranged to be. The optimum size of the void depends on the size of the well and can be found by one skilled in the art based on the following examples. The diameter of the void must be sized according to the dimensions of the well and the number and size of the particles used in the assay. In a 384 well microtiter plate, a cavity having a diameter of about 2.5 mm has been found to be advantageous when using about 1000 magnetic particles per well. This represents approximately half the bottom area of a commercially available 384 well plate, which on the one hand provides sufficient area for separating and removing magnetic particles while providing a measurement window large enough for fluorescence measurements. Is done.

デバイスまたは測定チャンバの特定の構成に基づき、沈降し、これにより検出領域から移動する結合した発光マーカーまたは蛍光マーカーは、励起により発光または蛍光を生じない。本発明を、以下に図面に示しかつ以下に記載する実施例により説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。   Based on the specific configuration of the device or measurement chamber, the bound luminescent or fluorescent marker that settles and thus moves out of the detection region will not emit or fluoresce upon excitation. The present invention will be described below with reference to examples shown in the drawings and described below, but the present invention is not limited thereto.

構造要素を有する測定チャンバ（１０１）の垂直断面図Vertical section of a measurement chamber (101) with structural elements デバイス（該デバイスは、例えばマイクロタイタープレートに組み込まれていてもよい）の連結体の垂直断面図Vertical sectional view of a coupling body of a device (the device may be incorporated, for example, in a microtiter plate) 磁性要素を有する測定チャンバ（１０１）の垂直断面図Vertical sectional view of the measurement chamber (101) with magnetic elements （例えばマイクロタイタープレートとして仕上げられている）測定チャンバ（１０１）の連結体の垂直断面図Vertical sectional view of the connecting body of the measurement chamber (101) (finished for example as a microtiter plate) デバイスの充填後でかつ結合前の、測定溶液の入った図１ａからの測定チャンバの垂直断面図 − 概略図Vertical sectional view of the measuring chamber from FIG. 1a with the measuring solution after filling of the device and before bonding—schematic view デバイスの充填、結合および分離の後の、測定溶液の入った図１ａからの測定チャンバの垂直断面図 − 概略図Vertical section of the measurement chamber from FIG. 1a with the measurement solution after filling, bonding and separation of the device-schematic view デバイスの充填後でかつ結合前の、測定溶液の入った図１ｃからの測定チャンバの垂直断面図 − 概略図Vertical section of the measurement chamber from FIG. 1c with measurement solution after filling of the device and before bonding—schematic view デバイスの充填、結合および分離の後の、測定溶液の入った図１ｃからの測定チャンバの垂直断面図 − 概略図Vertical section of the measurement chamber from FIG. 1c with measurement solution after device filling, bonding and separation-schematic デバイスの充填、結合および分離の後の、図２ｂからの測定チャンバの上面図 − 概略図Top view of the measurement chamber from Fig. 2b after device filling, bonding and separation-schematic デバイスの充填、結合および分離の後の、図２ｄからの測定チャンバの上面図 − 概略図Top view of the measurement chamber from Fig. 2d after device filling, bonding and separation-schematic view 複数の測定チャンバ（４０２）を含む３８４ウェルマイクロタイタープレート（４０１）の上面図Top view of a 384 well microtiter plate (401) containing multiple measurement chambers (402) 実施例Ａからの検量線Calibration curve from Example A 実施例Ｂからの検量線Calibration curve from Example B 実施例Ｃからの検量線Calibration curve from Example C 実施例Ｄからの２つの蛍光マーカーを用いた測定Measurement using two fluorescent markers from Example D 実施例Ｅからの非透光性の層を有しないマイクロタイタープレートにおけるアッセイの測定Assay measurement in microtiter plates without a light-transmitting layer from Example E 抗体のＦｃ部分に結合するスカベンジャー分子を用いた、抗体に関する直接イムノアッセイにおける試験成分の結合挙動の概略図Schematic of the binding behavior of test components in a direct immunoassay for antibodies using a scavenger molecule that binds to the Fc portion of the antibody 競合イムノアッセイにおける試験成分の結合挙動の概略図Schematic of the binding behavior of test components in a competitive immunoassay スカベンジャー分子として抗原（該抗原に抗体の可変部が結合する）を用いた、抗体に関する直接イムノアッセイにおける試験成分の結合挙動の概略図Schematic diagram of the binding behavior of test components in a direct immunoassay for antibodies using an antigen (the variable part of the antibody binds to the antigen) as a scavenger molecule 抗体に関する阻害アッセイにおける試験成分の結合挙動の概略図Schematic of binding behavior of test components in antibody inhibition assays 直接的な検出（図７ａ）を用いたサンドイッチイムノアッセイにおける試験成分の結合挙動の概略図Schematic of the binding behavior of test components in a sandwich immunoassay using direct detection (FIG. 7a) 間接的な検出（図７ｂ）を用いたサンドイッチイムノアッセイにおける試験成分の結合挙動の概略図Schematic of the binding behavior of test components in a sandwich immunoassay using indirect detection (Figure 7b)

図１ａ：構造要素を有する測定チャンバ（１０１）の垂直断面図
図１ａに、構造要素（１０３）を有する一体型のデバイス（１０２）からなる測定チャンバ（１０１）を示し、該構造要素（１０３）は測定窓（１０４）を有し、該測定窓（１０４）を通じて励起光（１０５）が検出領域（１０６）に到達し、かつ該測定窓（１０４）を通じて発光の放射（１０７）が適切な検出器（該検出器は同時に励起光をももたらす）または検出ユニットを用いて測定される。一体型のデバイス（１０２）は、液体を透過しないように側壁（１０８）と接続されている。デバイスの基部の下面上には非透光性の層（１０９）（例えば塗料またはシート）が存在し、その際、構造要素の底面（１１０）は空所になっている。 FIG. 1a: a vertical sectional view of a measurement chamber (101) with a structural element FIG. 1a shows a measurement chamber (101) consisting of an integrated device (102) with a structural element (103), said structural element (103) Has a measurement window (104) through which the excitation light (105) reaches the detection region (106) and emission radiation (107) is detected appropriately through the measurement window (104). Measured using a detector (the detector also provides excitation light) or a detection unit. The monolithic device (102) is connected to the side wall (108) so as not to transmit liquid. There is a non-translucent layer (109) (eg, paint or sheet) on the lower surface of the base of the device, with the bottom surface (110) of the structural element empty.

図１ｂ：デバイス（該デバイスは、例えばマイクロタイタープレートに組み込まれていてもよい）の連結体の垂直断面図
図１ｂに、マイクロタイタープレートの窪み／凹部に導入されている複数のデバイス（１０２）を示し、その際、側壁（１０８）はマイクロタイタープレートからのものであり、該デバイスはシート（１１１）であり、該シート（１１１）に構造要素（１０３）がエンボス加工されている。 FIG. 1b: vertical cross-sectional view of a connection of a device (the device may be incorporated, for example, in a microtiter plate) FIG. 1b shows a plurality of devices (102) introduced in the recess / recess of the microtiter plate Where the side wall (108) is from a microtiter plate, the device is a sheet (111), and the structural element (103) is embossed on the sheet (111).

図１ｃ：磁性要素を有する測定チャンバ（１０１）の垂直断面図
図１ｃに、透光性の基部（１１２）からなる上方に向かって開放されている測定チャンバ（１０１）を示し、その際、該基部（１１２）の下方には、空所（１１４）を有する非透光性の磁性要素（ここでは、非透光性の磁性の層またはシート）（１１３）が存在し、その際、該空所（１１４）が測定窓（１０４）を形成している。測定窓（１０４）を通じて励起光（１０５）が下方から（すなわち、デバイスの基部から）測定チャンバに到達し、その結果、未結合の発光マーカーの発光の放射（１０７）が生じ、その後、該放射はデバイスの下方の測定窓（１０４）を通じて検出ユニット（１１５）により検出される。好ましくは、そして図示されているように、検出ユニット（例えば蛍光読取り装置）は、励起光の放射および発光の検出を行うことができる。基部（１１２）と、側壁（１０８）および磁性要素（１１３）とは、取り外しできるように接続されていてもよいし、取り外しできないように接続されていてもよい。基部と側壁とは、同一の材料からなってもよいし異なる材料からなってもよい。 FIG. 1c: vertical section of the measurement chamber (101) with magnetic elements FIG. 1c shows the measurement chamber (101) open upwards consisting of a translucent base (112), in which Below the base (112), there is a non-translucent magnetic element (here, a non-translucent magnetic layer or sheet) (113) having a void (114). The location (114) forms the measurement window (104). Excitation light (105) reaches the measurement chamber from below (ie, from the base of the device) through the measurement window (104), resulting in emission light emission (107) of unbound luminescent markers, after which the emission Is detected by the detection unit (115) through the measurement window (104) below the device. Preferably, and as shown, the detection unit (eg, a fluorescence reader) is capable of detecting excitation light emission and emission. The base (112), the side wall (108) and the magnetic element (113) may be connected so as to be removable, or may be connected so as not to be removed. The base and the side wall may be made of the same material or different materials.

図１ｄ：（例えばマイクロタイタープレートとして仕上げられている）測定チャンバ（１０１）の連結体の垂直断面図
図１ｄに、複数の測定チャンバ（１０１）と、透光性の基部（１１２）と、測定窓（１０４）として利用される空所（１１４）を有する非透光性の磁性の層またはシート（１１３）とを示す。本発明による方法における励起および検出は、測定窓を通じて下方から、すなわち複数の測定チャンバまたはマイクロタイタープレートの基部の下方から、行われる。 FIG. 1d: a vertical cross-sectional view of the coupling body of the measurement chamber (101) (finished as a microtiter plate, for example) FIG. A non-translucent magnetic layer or sheet (113) having a cavity (114) utilized as a window (104) is shown. Excitation and detection in the method according to the invention takes place from below through the measurement window, ie from below the base of the plurality of measurement chambers or microtiter plates.

図２ａ：デバイスの充填後でかつ結合前の、測定溶液の入った図１ａからの測定チャンバの垂直断面図 − 概略図
図２ａに、以下の試験成分を含む、測定溶液（２０１）が充填された図１ａからの測定チャンバを示す：生物学的検体（２０４）、機能化された粒子（２０３）および発光マーカー（２０２）。これらは充填の直後に均一に分配され、混合による接触前に未結合の状態にある。機能化された粒子は磁性であってもよい（ここでは図示せず）。 FIG. 2a: Vertical section of the measurement chamber from FIG. 1a with the measurement solution after filling of the device and before bonding—schematic diagram FIG. 2a is filled with the measurement solution (201) containing the following test components: Figure 1a shows a measurement chamber from Fig. La: biological specimen (204), functionalized particles (203) and luminescent markers (202). They are evenly distributed immediately after filling and are unbound before contact by mixing. The functionalized particles may be magnetic (not shown here).

図２ｂ：デバイスの充填、結合および分離の後の、測定溶液の入った図１ａからの測定チャンバの垂直断面図 − 概略図
図２ｂに、結合させ、かつ結合した発光マーカーと未結合の発光マーカーとを分離したの後の、試験成分（２０２）、（２０３）、（２０４）を含む、測定溶液（２０１）が充填された図２ａからの測定チャンバを示す。未結合の発光マーカー（２０２ｕ）は測定チャンバ内に均一に分配されて存在し、一方で、結合した試験成分（２０２、２０３、２０４）は分離除去領域（２０５）内に存在する。 Fig. 2b: Vertical cross-sectional view of the measurement chamber from Fig. 1a containing the measurement solution after filling, binding and separation of the device-schematic view Fig. 2b shows the combined and unbound luminescent markers. FIG. 2b shows the measurement chamber from FIG. 2a filled with the measurement solution (201) containing the test components (202), (203), (204) after separation. Unbound luminescent markers (202u) are uniformly distributed in the measurement chamber, while bound test components (202, 203, 204) are present in the separation removal region (205).

図２ｃ：デバイスの充填後でかつ結合前の、測定溶液の入った図１ｃからの測定チャンバの垂直断面図 − 概略図
図２ｃに、以下の試験成分を含む、測定溶液（２０１）が充填された図１ｃからの測定チャンバを示す：生物学的検体（２０４）、機能化された磁性粒子（２０３−Ｍ）および蛍光マーカー（２０２−Ｆ）。これらは充填の直後に均一に分配され、混合による接触前に未結合の状態にある。 Fig. 2c: Vertical section of the measurement chamber from Fig. 1c with measurement solution after filling of the device and before bonding-schematic diagram Fig. 2c is filled with measurement solution (201) containing the following test components Figure 1c shows a measurement chamber from Figure 1c: biological specimen (204), functionalized magnetic particles (203-M) and fluorescent markers (202-F). They are evenly distributed immediately after filling and are unbound before contact by mixing.

図２ｄ：デバイスの充填、結合および分離の後の、測定溶液の入った図１ｃからの測定チャンバの垂直断面図 − 概略図
図２ｄに、結合させ、かつ結合した蛍光マーカーと未結合の蛍光マーカーとを分離したの後の、試験成分（２０２−Ｆ）、（２０３−Ｍ）、（２０４）を含む、測定溶液（２０１）が充填された図２ｃからの測定チャンバを示す。未結合の蛍光マーカー（２０２ｕ−Ｆ）は測定チャンバ内に均一に分配されて存在し、一方で、結合した試験成分（２０２−Ｆ、２０３−Ｍ、２０４）は分離除去領域（２０５）内に存在する。 Fig. 2d: Vertical cross-sectional view of the measurement chamber from Fig. 1c with the measurement solution after filling, binding and separation of the device-schematic diagram. Fig. 2d shows the combined and bound fluorescent and unbound fluorescent markers. FIG. 2c shows the measurement chamber from FIG. 2c filled with the measurement solution (201) containing the test components (202-F), (203-M), (204) after separation of. Unbound fluorescent markers (202u-F) are present uniformly distributed in the measurement chamber, while bound test components (202-F, 203-M, 204) are present in the separation removal region (205). Exists.

図３ａ：デバイスの充填、結合および分離の後の、図２ｂからの測定チャンバの上面図 − 概略図
図３ａに、図２ｂからの測定チャンバの上面図を示す。結合した試験成分（３０１）は、デバイス／測定チャンバの基部に存在する。デバイスの基部には非透光性の層（３０２）が備えられており、その際、構造要素の底面（３０３）は空所になっている。この空所は、同時に測定窓（３０５）でもある。デバイスの基部とは反対側の端部（３０４）も図示されており、該端部（３０４）は測定窓（３０５）と光学的に接続されている。ここでは、構造要素は、円形の横断面を有しかつ上方に向かって先細状の突出部である。 Fig. 3a: Top view of the measurement chamber from Fig. 2b after device filling, coupling and separation-schematic view Fig. 3a shows a top view of the measurement chamber from Fig. 2b. The combined test component (301) is present at the base of the device / measurement chamber. The base of the device is provided with a non-translucent layer (302), with the bottom surface (303) of the structural element being empty. This void is also the measurement window (305). Also shown is the end (304) opposite the base of the device, which is optically connected to the measurement window (305). Here, the structural element is a protrusion having a circular cross section and tapered upward.

図３ｂ：デバイスの充填、結合および分離の後の、図２ｄからの測定チャンバの上面図 − 概略図
図３ｂに、図２ｄからの測定チャンバの上面図を示す。結合した試験成分（３０１）は、測定チャンバの基部に存在する。測定チャンバの基部には、空所（３０７）を有する非透光性でかつ磁性の層またはシート（３０６）が備えられている。この空所は、同時に測定窓（３０５）でもある。 FIG. 3b: Top view of the measurement chamber from FIG. 2d after device filling, coupling and separation—schematic view FIG. 3b shows a top view of the measurement chamber from FIG. 2d. The combined test component (301) is present at the base of the measurement chamber. The base of the measurement chamber is provided with a non-transparent and magnetic layer or sheet (306) having a cavity (307). This void is also the measurement window (305).

図４：複数の測定チャンバ（４０２）を含む３８４ウェルマイクロタイタープレート（４０１）の上面図
図５ａ：実施例Ａからの検量線
図５ｂ：実施例Ｂからの検量線
図５ｃ：実施例Ｃからの検量線
図５ａ、図５ｂおよび図５ｃにおいて、ｘ軸上には検体濃度がμｇ／ｍＬで示されており、ｙ軸上には蛍光強度が示されている。（菱形の）測定値により関数が描画されている（破線）。 Figure 4: Top view of a 384 well microtiter plate (401) containing multiple measurement chambers (402) Figure 5a: Calibration curve from Example A Figure 5b: Calibration curve from Example B Figure 5c: From Example C 5a, 5b and 5c, the analyte concentration is shown in μg / mL on the x-axis, and the fluorescence intensity is shown on the y-axis. The function is drawn by the measured values (diamonds) (dashed line).

図５ｄ：実施例Ｄからの２つの蛍光マーカーを用いた測定
図５ｄにおいて、ｘ軸上には検体濃度がμｇ／ｍＬで示されており、ｙ軸上には同一の検体の異なるエピトープに結合する２つの蛍光マーカーに関する蛍光強度が示されている。蛍光マーカーは２つの異なる波長（５３５ｎｍまたは５８０ｎｍ）で放射する。（それぞれ菱形の）測定値により、相応する関数が描画されている（破線）。 FIG. 5d: Measurement with two fluorescent markers from Example D In FIG. 5d, the analyte concentration is shown in μg / mL on the x-axis and binds to different epitopes of the same analyte on the y-axis. The fluorescence intensities for the two fluorescent markers are shown. The fluorescent marker emits at two different wavelengths (535 nm or 580 nm). Corresponding functions are drawn (broken lines) with the measured values (each diamond).

図５ｅ：実施例Ｅからの非透光性の層を有しないマイクロタイタープレートにおけるアッセイの測定
図５ｅにおいて、ｘ軸上には検体濃度がμｇ／ｍＬで示されており、ｙ軸上には蛍光強度が示されている。（菱形の）測定値により、関数が描画されている（破線）。本実施例では蛍光顕微鏡を用いて測定したため、ｙ軸のスケーリングは前出の実施例のものとは異なる。 FIG. 5e: Measurement of assay in microtiter plate without light-transmitting layer from Example E In FIG. 5e, the analyte concentration is shown in μg / mL on the x-axis and on the y-axis The fluorescence intensity is shown. The function is drawn (broken line) by the measured values (diamonds). In this example, since measurement was performed using a fluorescence microscope, the y-axis scaling is different from that of the previous example.

図６ａ：抗体のＦｃ部分に結合するスカベンジャー分子を用いた、抗体に関する直接イムノアッセイにおける試験成分の結合挙動の概略図
図６ａに、粒子（６０２）または磁性粒子（６０２−Ｍ）（該粒子上には複数のスカベンジャー分子（６０３）が存在する）からなる、機能化された粒子（６０１）または機能化された磁性粒子（６０１−Ｍ）を示す。生物学的検体（６０４）と、スカベンジャー分子（６０３）および発光マーカー（６０７）または蛍光マーカー（６０７−Ｆ）とが結合する。さらに、未結合の発光マーカー（６０７ｕ）または未結合の蛍光マーカー（６０７ｕ−Ｆ）が存在する。発光マーカーまたは蛍光マーカーは、結合部位（６０６）と、発光色素（６０５）または蛍光色素（６０５−Ｆ）とを有する。 FIG. 6a: Schematic of the binding behavior of the test component in a direct immunoassay for the antibody using a scavenger molecule that binds to the Fc portion of the antibody. FIG. 6a shows a particle (602) or magnetic particle (602-M) (on the particle). Indicates a functionalized particle (601) or a functionalized magnetic particle (601-M) consisting of a plurality of scavenger molecules (603). Biological specimen (604) binds to scavenger molecule (603) and luminescent marker (607) or fluorescent marker (607-F). In addition, there are unbound luminescent markers (607u) or unbound fluorescent markers (607u-F). The luminescent marker or fluorescent marker has a binding site (606) and a luminescent dye (605) or fluorescent dye (605-F).

図６ｂ：競合イムノアッセイにおける試験成分の結合挙動の概略図
図６ｂに、粒子（６０２）または磁性粒子（６０２−Ｍ）（該粒子上には複数のスカベンジャー分子（６０３）が存在する）からなる、機能化された粒子（６０１）または機能化された磁性粒子（６０１−Ｍ）を示す。スカベンジャー分子（６０３）は、生物学的検体（６０４）か、または発光マーカー（６０７）もしくは蛍光マーカー（６０７−Ｆ）か、のいずれかと結合し、その際、該生物学的検体（６０４）は、結合した発光マーカーまたは結合した蛍光マーカーをスカベンジャーから排除することができる。 FIG. 6b: Schematic diagram of the binding behavior of test components in a competitive immunoassay. FIG. 6b consists of particles (602) or magnetic particles (602-M), on which there are multiple scavenger molecules (603). Functionalized particles (601) or functionalized magnetic particles (601-M) are shown. The scavenger molecule (603) binds to either the biological specimen (604) or the luminescent marker (607) or the fluorescent marker (607-F), wherein the biological specimen (604) Bound luminescent markers or bound fluorescent markers can be excluded from the scavenger.

図６ｃ：スカベンジャー分子として抗原（該抗原に抗体の可変部が結合する）を用いた、抗体に関する直接イムノアッセイにおける試験成分の結合挙動の概略図
図６ｃに、粒子（６０２）または磁性粒子（６０２−Ｍ）（該粒子上には複数のスカベンジャー分子（６０３）が存在する）からなる、機能化された粒子（６０１）または機能化された磁性粒子（６０１−Ｍ）を示す。生物学的検体（６０４）は、スカベンジャー分子（６０３）と結合し、さらに発光マーカー（６０７）または蛍光マーカー（６０７−Ｆ）とも結合する。さらに、未結合の発光マーカー（６０７ｕ）または未結合の蛍光マーカー（６０７ｕ−Ｆ）が存在する。発光マーカーは、結合部位（６０６）と、発光色素（６０５）または蛍光色素（６０５−Ｆ）とを有する。 FIG. 6c: Schematic diagram of the binding behavior of the test component in a direct immunoassay for the antibody using the antigen (the variable part of the antibody binds to the antigen) as the scavenger molecule. FIG. 6c shows the particle (602) or magnetic particle (602- M) shows a functionalized particle (601) or a functionalized magnetic particle (601-M) consisting of a plurality of scavenger molecules (603) on the particle. The biological analyte (604) binds to the scavenger molecule (603) and also binds to the luminescent marker (607) or fluorescent marker (607-F). In addition, there are unbound luminescent markers (607u) or unbound fluorescent markers (607u-F). The luminescent marker has a binding site (606) and a luminescent dye (605) or a fluorescent dye (605-F).

図６ｄ：抗体に関する阻害アッセイにおける試験成分の結合挙動の概略図
図６ｄに、粒子（６０２）または磁性粒子（６０２−Ｍ）（該粒子上には複数のスカベンジャー分子（６０３）が存在する）からなる、機能化された粒子（６０１）または機能化された磁性粒子（６０１−Ｍ）を示し、その際、該スカベンジャー分子（６０３）は、結合部位（６０６）と蛍光色素（６０５−Ｆ）とからなる蛍光マーカー（６０７−Ｆ）に結合しうる。生物学的検体（６０４）は蛍光マーカー（６０７−Ｆ）に結合し、それによりスカベンジャー（６０３）への蛍光マーカーの結合が妨害（阻害）される。このタイプの結合の場合、複合体（６０８、６０８−Ｆ）、すなわち生物学的検体（６０４）に結合した発光マーカー（６０７）または蛍光マーカー（６０７−Ｆ）が検出される。 FIG. 6d: Schematic of the binding behavior of the test component in the inhibition assay for antibodies. From FIG. 6d, from particle (602) or magnetic particle (602-M) (there are multiple scavenger molecules (603) on the particle). A functionalized particle (601) or a functionalized magnetic particle (601-M), wherein the scavenger molecule (603) comprises a binding site (606) and a fluorescent dye (605-F) Can bind to a fluorescent marker (607-F). The biological specimen (604) binds to the fluorescent marker (607-F), thereby preventing (inhibiting) the binding of the fluorescent marker to the scavenger (603). For this type of binding, complexes (608, 608-F), ie, luminescent markers (607) or fluorescent markers (607-F) bound to the biological specimen (604) are detected.

図７ａおよび７ｂ：直接的な検出（図７ａ）および間接的な検出（図７ｂ）を用いたサンドイッチイムノアッセイにおける試験成分の結合挙動の概略図
双方の図に、それぞれ粒子（７０２）または磁性粒子（７０２−Ｍ）（該粒子上には複数のスカベンジャー分子（７０３）が結合している）からなる、機能化された粒子（７０１）または機能化された磁性粒子（７０１−Ｍ）を示す。スカベンジャー分子は、適切なタンパク質（７０５）から、例えばビオチン化抗体から形成され、該タンパク質はリンカー（７０４）（例えばストレプトアビジン）を介して粒子（７０２）または磁性粒子（７０２−Ｍ）に結合する。タンパク質（７０５）は、生物学的検体（７０９）に結合する。さらに、結合した発光マーカー（７０６）または結合した蛍光マーカー（７０６−Ｆ）、および未結合の発光マーカー（７０６ｕ）または未結合の蛍光マーカー（７０６ｕ−Ｆ）が図示されている。発光マーカー（７０６）または蛍光マーカー（７０６−Ｆ）は、結合部位（７０７）と、発光色素（７０８）または蛍光色素（７０８−Ｆ）とを有する。 FIGS. 7a and 7b: Schematic representation of the binding behavior of test components in a sandwich immunoassay using direct detection (FIG. 7a) and indirect detection (FIG. 7b). Both figures show particles (702) or magnetic particles ( 702-M) shows a functionalized particle (701) or a functionalized magnetic particle (701-M) consisting of a plurality of scavenger molecules (703) bound on the particle. The scavenger molecule is formed from a suitable protein (705), for example from a biotinylated antibody, which binds to the particle (702) or magnetic particle (702-M) via a linker (704) (eg streptavidin). . Protein (705) binds to biological specimen (709). In addition, bound luminescent marker (706) or bound fluorescent marker (706-F) and unbound luminescent marker (706u) or unbound fluorescent marker (706u-F) are shown. The luminescent marker (706) or fluorescent marker (706-F) has a binding site (707) and a luminescent dye (708) or fluorescent dye (708-F).

図７ｂにおいては、図７ａに示す試験成分の他にさらに一次抗体（７１０）が存在する。この一次抗体（７１０）は検体（７０９）に結合し、さらに発光マーカー（７０６）または蛍光マーカー（７０６−Ｆ）にも結合する。   In FIG. 7b, there is further a primary antibody (710) in addition to the test components shown in FIG. 7a. The primary antibody (710) binds to the specimen (709), and further binds to the luminescent marker (706) or the fluorescent marker (706-F).

本発明による方法を、図１ａに示す本発明による測定チャンバを用いて以下のように実施することができる：
測定チャンバ（１０１）に、生物学的検体（２０４）と、機能化された粒子（２０３）と、未結合の発光マーカー（２０２）とを含有する測定溶液（２０１）を導入する（図２ａ参照）。均質な混合物が生じる。（インキュベーションおよび振とうにより）相応する結合を形成させた後に、結合した試験成分が分離除去領域（２０５）内で沈降し、そこに蓄積する（図２ｂおよび図３ａ参照）。この時点で、検出領域（１０６）内で未結合の発光マーカー（２０２ｕ）を測定することができる。分離除去領域内に存在する結合した発光マーカーが励起光により励起されて放射しうることのないようにし、また該結合した発光マーカーの放射光が測定窓を通じて測定チャンバから検出ユニット／検出器に到達することのないようにするために、非透光性の層（１０９）を使用する。 The method according to the invention can be carried out as follows using the measuring chamber according to the invention shown in FIG.
A measurement solution (201) containing a biological specimen (204), functionalized particles (203), and unbound luminescent markers (202) is introduced into the measurement chamber (101) (see FIG. 2a). ). A homogeneous mixture results. After the corresponding binding has been formed (by incubation and shaking), the bound test components settle in the separation area (205) and accumulate there (see FIGS. 2b and 3a). At this point, unbound luminescent markers (202u) can be measured in the detection region (106). The combined emission marker existing in the separation and removal region is not excited by the excitation light and can be emitted, and the emission light of the combined emission marker reaches the detection unit / detector from the measurement chamber through the measurement window. In order to avoid this, a non-translucent layer (109) is used.

本発明による方法を、図１ｃに示す本発明による磁性要素を有する測定チャンバを用いて以下のように実施することができる：
測定チャンバ（１０１）に、生物学的検体（２０４）と、機能化された磁性粒子（２０３−Ｍ）と、未結合の蛍光マーカー（２０２−Ｆ）とを含有する測定溶液（２０１）を導入する（図２ｃ参照）。均質な混合物が生じる。（インキュベーションおよび振とうにより）相応する結合を形成させた後に、結合した試験成分が磁性要素の磁場により配向性をもって分離除去領域（２０５）内で沈降し、そこに蓄積する（図２ｄおよび図３ｂ参照）。この時点で、検出領域内で未結合の蛍光マーカー（２０２ｕ−Ｆ）を測定することができる。分離除去領域内に存在する結合した蛍光マーカー（２０２−Ｆ）が励起光により励起されて放射しうることのないようにし、また該結合した蛍光マーカー（２０２−Ｆ）の放射光が測定窓（１０４）を通じて測定チャンバから検出装置（１１５）に到達することのないようにするために、非透光性の磁性の層またはシート（１１３）を使用する。 The method according to the invention can be carried out as follows using a measuring chamber with a magnetic element according to the invention shown in FIG.
A measurement solution (201) containing a biological specimen (204), functionalized magnetic particles (203-M), and unbound fluorescent markers (202-F) is introduced into the measurement chamber (101). (See FIG. 2c). A homogeneous mixture results. After the corresponding bonds have been formed (by incubation and shaking), the bound test components settle in the separation area (205) with orientation by the magnetic field of the magnetic element and accumulate there (FIGS. 2d and 3b). reference). At this point, unbound fluorescent marker (202u-F) can be measured in the detection region. The bound fluorescent marker (202-F) existing in the separation / removal region is prevented from being excited and emitted by the excitation light, and the emitted light of the bound fluorescent marker (202-F) is measured in the measurement window ( In order not to reach the detection device (115) from the measurement chamber through 104), a non-translucent magnetic layer or sheet (113) is used.

本発明による方法のための検量の例示的な実施を、以下に記載する。検量系列において使用する生物学的検体の分析を、以下の実施例と同様に、検体含有量が不明なサンプルに関して行い、その際、測定された未結合の蛍光マーカーの蛍光強度により、それぞれの検量線を用いて検体濃度を求める。   An exemplary implementation of a calibration for the method according to the invention is described below. The analysis of biological specimens used in the calibration series is performed on samples whose specimen content is unknown, as in the following examples. At this time, each calibration is performed according to the fluorescence intensity of the unbound fluorescent marker measured. The analyte concentration is determined using a line.

実施例Ａ：直接アッセイ変法における検量系列の測定
測定のために、以下の本発明によるマイクロタイタープレートを使用する：３８４個のウェル（測定チャンバ）を有する黒色のマイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ＢｉｏＯＮＥ社、品番７８１０００−０６）であって、該ウェル内にはそれぞれ高さ１．６ｍｍのポリプロピレンからなる円錐形の構造要素が存在し、該構造要素は上方に向かって先細状であってかつ円形の横断面を有し、該横断面は、基部とは反対側の面で１ｍｍの直径を有する。測定チャンバにはその下面に非透光性の塗料層が設けられており、その際、該層は構造要素の基部面には施与されず、その結果、該基部には約２ｍｍの直径を有する測定窓が生じている。 Example A: Calibration series measurement in a direct assay variant For the measurement, the following microtiter plate according to the present invention is used: a black microtiter plate with 384 wells (measuring chamber) (Greiner BioONE, 781000-06) in which there are conical structural elements made of polypropylene, each 1.6 mm in height, which taper upward and have a circular cross-section. And has a diameter of 1 mm on the side opposite the base. The measuring chamber is provided with a non-light-transmitting paint layer on its lower surface, in which case the layer is not applied to the base surface of the structural element, so that the base has a diameter of about 2 mm. A measuring window having arises.

機能化された粒子として、９０μｍの平均直径を有するプロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）４Ｂ，Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ Ｂｅａｄｓ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、品番Ｐ９４２４）を使用する。   Protein A-Sepharose® 4B, Fast Flow Beads (Sigma-Aldrich, product number P9424) having an average diameter of 90 μm is used as functionalized particles.

蛍光マーカーとして、Ａｌｅｘａ ６４７標識抗体フラグメントを使用する（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２ ｓｐｅｃｉｆｉｃ、品番１０９−６０６−０９７）。 Alexa 647 labeled antibody fragment is used as a fluorescent marker (Jackson Immuno Research, Affini Pure F (ab ′) 2 Fragment Goat Anti-Human IgG F (ab ′) 2 specific, part number 109-606-097).

水溶液として、以下の緩衝液を使用する：１０ｍＭ トリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ウシアルブミン（ＢＳＡ）、０．０５％ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ ２０（登録商標））、蒸留水中でｐＨ７．４（以下、緩衝液と称する）。検量のための生物学的検体として、組換えにより製造された抗体リツキシマブ（Ｍａｂｔｈｅｒａ（登録商標））を使用する。   The following buffers are used as aqueous solutions: 10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.1% bovine albumin (BSA), 0.05% polysorbate 20 (Tween 20®), pH 7.4 (below) in distilled water. , Referred to as buffer). The recombinantly produced antibody rituximab (Mabthera®) is used as a biological specimen for calibration.

マイクロタイタープレートにおいて、合計で１２の異なる検体濃度を用いて検量線を作成する。検体濃度は、０／０．００１／０．００３３／０．００６７／０．０１／０．０３／０．６７／０．１／０．３３／０．６７／１．０および３．３３μｇ／ｍＬ リツキシマブ（Ｍａｂｔｈｅｒａ（登録商標））である。   In a microtiter plate, a calibration curve is created using a total of 12 different analyte concentrations. The analyte concentrations were 0 / 0.001 / 0.0033 / 0.0067 / 0.01 / 0.03 / 0.67 / 0.1 / 0.33 / 0.67 / 1.0 and 3.33 μg / mL Rituximab (Mabthera®).

このために、以下の措置をとる：各測定チャンバ内にストック溶液５４μＬを入れる。このストック溶液は、プロテインＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｂｅａｄｓ Ｓｌｕｒｒｙ １５μＬ、および蛍光マーカー（１０μｇ／ｍＬ）６０μＬを、緩衝液８１０μＬ中に含有する。   For this, the following measures are taken: 54 μL of stock solution is placed in each measuring chamber. This stock solution contains 15 μL of Protein A Sepharose Beads Slurry and 60 μL of fluorescent marker (10 μg / mL) in 810 μL of buffer.

検体の濃縮ストック溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）から緩衝液中の１：３００〜１：１，０００，０００の希釈物を作製し、ここからそれぞれ６μＬ［のアリコート］を測定チャンバに入れることにより、検量系列のための検体の目標濃度を得る。   Make a 1: 300 to 1: 1,000,000 dilution in buffer from a concentrated stock solution of the sample (10 mg / mL), and place 6 μL [aliquots] of each into the measurement chamber. Obtain the target concentration of the analyte for the series.

マイクロタイタープレート全体を、室温でＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ Ｃｏｍｆｏｒｔ上で１４００ｒｐｍで４５分間振とうする。その後、マイクロタイタープレートをサーモシェーカーから取り出し、粒子が沈降するまで５分間待機する。   Shake the entire microtiter plate at 1400 rpm for 45 minutes on an Eppendorf Thermomixer Comfort at room temperature. The microtiter plate is then removed from the thermoshaker and waits for 5 minutes until the particles settle.

次いで、各測定チャンバ内での下方からの蛍光強度の測定（ボトム・リーディング）を、Ｔｅｃａｎ ＩｎｆｉｎｉｔｅＭ１００蛍光プレートリーダーにおいて６４５ｎｍの励起波長および６７５ｎｍの放射波長で行う。   Measurement of the fluorescence intensity (bottom reading) from below in each measurement chamber is then performed in a Tecan Infinite M100 fluorescence plate reader at an excitation wavelength of 645 nm and an emission wavelength of 675 nm.

得られた蛍光強度についての値を検体濃度に対してプロットし、４パラメータフィットを用いたフィッティングにより校正関数を得る。相応する検量線を図５ａに示す。   The obtained value for the fluorescence intensity is plotted against the analyte concentration, and a calibration function is obtained by fitting using a four parameter fit. A corresponding calibration curve is shown in FIG. 5a.

実施例Ｂ：競合アッセイにおける検量系列の測定
測定のために、以下の本発明によるマイクロタイタープレートを使用する：３８４個のウェル（測定チャンバ）を有する黒色のマイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ＢｉｏＯＮＥ社、品番７８１０００−０６）であって、該ウェル内にはそれぞれ高さ１．６ｍｍのポリプロピレンからなる円錐形の構造要素が存在し、該構造要素は上方に向かって先細状であってかつ円形の横断面を有し、該横断面は、基部とは反対側の面で１ｍｍの直径を有する。測定チャンバにはその下面に非透光性の塗料層が設けられており、その際、該層は構造要素の基部面には施与されず、その結果、該基部には約２ｍｍの直径を有する測定窓が生じている。 Example B: Calibration series measurement in a competitive assay The following microtiter plate according to the invention is used for the measurement: black microtiter plate with 384 wells (measuring chamber) (Greiner BioONE, part number 781000) -06) in which there are conical structural elements made of polypropylene each 1.6 mm in height, which are tapered upward and have a circular cross section. And the cross section has a diameter of 1 mm on the side opposite the base. The measuring chamber is provided with a non-light-transmitting paint layer on its lower surface, in which case the layer is not applied to the base surface of the structural element, so that the base has a diameter of about 2 mm. A measuring window having arises.

機能化された粒子として、７０μｍの平均直径を有しかつビオチン化プロテインＡフラグメント（Ａｆｆｉｂｏｄｙ社、品番１０．０６２３．０２．００００５）で機能化されているストレプトアビジン Ｍａｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）粒子（ＶＷＲ、品番２８−９８５７−３８）を使用する。粒子の機能化は、粒子懸濁液１００μＬを、１ｍｇ／ｍＬの濃度を有するビオチン化プロテインＡフラグメントの溶液０．３μＬと共に３０分間インキュベーションし、次いで該粒子を緩衝液で洗浄することにより行われる。   Streptavidin Mag-Sepharose® particles having an average diameter of 70 μm and functionalized with biotinylated protein A fragment (Affibody, product number 10.0623.02.00005) (functionalized particles) VWR, part number 28-9857-38) is used. The functionalization of the particles is performed by incubating 100 μL of the particle suspension with 0.3 μL of a solution of biotinylated protein A fragment having a concentration of 1 mg / mL for 30 minutes and then washing the particles with buffer.

蛍光マーカーとして、Ａｌｅｘａ ４８８ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ｒａｂｂｉｔ Ａｎｔｉ−Ｃｈｉｃｋｅｎ ＩｇＹ（Ｈ＋Ｌ）−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８を使用する（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、品番３０３−５４５−００３）。   Alexa 488 Conjugated Polyclonal Rabbit Anti-Chicken IgY (H + L) -Alexa Fluor 488 is used as a fluorescent marker (Jackson Immuno Research, product number 303-545-003).

水溶液として、以下の緩衝液を使用する：１０ｍＭ トリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ウシアルブミン（ＢＳＡ）、０．０５％ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ ２０（登録商標））、蒸留水中でｐＨ７．４（以下、緩衝液と称する）。検量系列のための生物学的検体として、組換えにより製造された抗体リツキシマブ（Ｍａｂｔｈｅｒａ（登録商標））を使用する。   The following buffers are used as aqueous solutions: 10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.1% bovine albumin (BSA), 0.05% polysorbate 20 (Tween 20®), pH 7.4 (below) in distilled water. , Referred to as buffer). The recombinantly produced antibody rituximab (Mabthera®) is used as the biological specimen for the calibration series.

マイクロタイタープレートにおいて、合計で１４の異なる検体濃度を用いて検量線を作成する。検体濃度は、０．００１／０．００３３／／０．０１／０．０３／０．６７／０．１／０．３３／０．６７／１．０／３．３３／６．６７／１０／２０および１００μｇ／ｍＬ リツキシマブ（Ｍａｂｔｈｅｒａ（登録商標））である。   In a microtiter plate, a calibration curve is generated using a total of 14 different analyte concentrations. The analyte concentration is 0.001 / 0.0033 // 0.01 / 0.03 / 0.67 / 0.1 / 0.33 / 0.67 / 1.0 / 3.33 / 6.67 / 10. / 20 and 100 μg / mL rituximab (Mabthera®).

このために、以下の措置をとる：機能化された粒子を測定チャンバに入れ、その際、各測定チャンバ内にストック溶液４８μＬを入れる。このストック溶液は、上記の機能化された粒子の懸濁液８０μＬを緩衝液１８４０μＬ中に含有する。   For this, the following measures are taken: put the functionalized particles into the measurement chambers, with 48 μL of stock solution in each measurement chamber. This stock solution contains 80 μL of the above functionalized particle suspension in 1840 μL of buffer.

それぞれ同一の濃度の蛍光マーカーと異なる濃度の生物学的検体とからの混合物を作製し、その際、検体の濃縮ストック溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）から緩衝液中の１：１０〜１：１，０００，０００の希釈物を作製する。この希釈物から、それぞれ６μＬのアリコートとそれぞれ６μＬのＲａｂｂｉｔ Ａｎｔｉ−Ｃｈｉｃｋｅｎ ＩｇＹ（Ｈ＋Ｌ）−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８抗体（１０μｇ／ｍＬのストック溶液から）とを一緒に入れて混合する。   Mixtures of fluorescent markers of the same concentration and biological specimens of different concentrations are made, with 1:10 to 1: 1,000 in buffer from a concentrated stock solution of specimen (10 mg / mL). Make a dilution of 1,000. From this dilution, mix each 6 μL aliquot with 6 μL each of Rabbit Anti-Chicken IgY (H + L) -Alexa Fluor 488 antibody (from a 10 μg / mL stock solution).

この蛍光マーカーと生物学的検体とからの混合物を、測定チャンバに充填する。マイクロタイタープレートを室温で１６００ｒｐｍでＥｐｐｅｎｄｏｒｆ ＭｉｘＭａｔｅで３０分間振とうさせることにより、試験成分を混合する。この振とうの完了後にマイクロタイタープレートをシェーカーから取り出し、粒子が沈降するまで待機する。これには約１〜２分間を要した。   The measurement chamber is filled with a mixture of the fluorescent marker and the biological specimen. Test components are mixed by shaking the microtiter plate at 1600 rpm with an Eppendorf MixMate for 30 minutes at room temperature. After completion of this shaking, the microtiter plate is removed from the shaker and waits until the particles settle. This took about 1-2 minutes.

プレートを蛍光レコーダーに移す。この蛍光レコーダーは下方からの測定（いわゆるボトム・リーディング）に適しており（例えば、Ｔｅｃａｎ Ｓａｆｉｒｅ Ｍｏｎｏｃｈｒｏｍａｔｉｃ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅａｄｅｒ）、その際、各測定チャンバに下方から所定の励起波長（ここでは４８８ｎｍ）での照射を行い、生じる蛍光放射または蛍光強度を所定の放射波長（ここでは５３５ｎｍ）で記録する。   Transfer plate to fluorescent recorder. This fluorescent recorder is suitable for measurement from the bottom (so-called bottom reading) (for example, Tecan Safe Monofluorescence reader), in which each measurement chamber is irradiated from below with a predetermined excitation wavelength (488 nm in this case). And record the resulting fluorescence emission or fluorescence intensity at a predetermined emission wavelength (535 nm here).

蛍光強度についての得られた値を検体濃度に対してプロットし、４パラメータフィットを用いたフィッティングにより校正関数を得る。相応する検量線を図５ｂに示す。   The obtained value for the fluorescence intensity is plotted against the analyte concentration and a calibration function is obtained by fitting using a four parameter fit. A corresponding calibration curve is shown in FIG.

実施例Ｃ：磁性要素を有するマイクロタイタープレートにおける検量系列の測定
測定のために、以下の本発明によるマイクロタイタープレートを使用する：３８４個のウェルを有する透明な底部を有する黒色のマイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ＢｉｏＯＮＥ社、品番７８１０９１）であって、該ウェルの下方に、３８４個の空所を有する磁性シートを、該空所の各々が該マイクロタイタープレートのウェルの下方で中心が合った状態となるように貼り付ける。この永久磁性シート（Ｐｅｒｍａｆｌｅｘ ５１８、Ｒｈｅｉｎｍａｇｎｅｔ社）は１ｍｍの厚さを有し、かつこれらの空所は２．５ｍｍの直径を有する。 Example C: Measurement of a calibration series in a microtiter plate with magnetic elements For the measurement, the following microtiter plate according to the invention is used: a black microtiter plate with a transparent bottom with 384 wells ( Greiner BioONE, part number 781091, and a magnetic sheet having 384 cavities below the wells, each of the cavities being centered below the wells of the microtiter plate Paste like so. The permanent magnetic sheet (Permaflex 518, Rheinmagnet) has a thickness of 1 mm, and these voids have a diameter of 2.5 mm.

機能化された磁性粒子として、３７〜１００μｍの直径を有するプロテインＡ Ｍａｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）粒子（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、品番２８−９４４０−０６）を使用する。   Protein A Mag-Sepharose® particles (GE Healthcare, product number 28-9440-06) having a diameter of 37-100 μm are used as functionalized magnetic particles.

蛍光マーカーとして、フルオレシン−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ｃｈｉｃｋｅｎ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ａｂｃａｍ社、品番１１２４５３）を使用する。   As a fluorescent marker, fluorescein-isothiocyanate (FITC) Conjugated polycyclic Chicken Anti-Human IgG (H + L) antibody (Abcam, product number 112453) is used.

水溶液として、以下の緩衝液を使用する：１０ｍＭ トリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ウシアルブミン（ＢＳＡ）、０．０５％ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）、蒸留水中でｐＨ７．４。生物学的検体として、抗体リツキシマブ（Ｍａｂｔｈｅｒａ（登録商標））を使用する。   The following buffers are used as aqueous solutions: 10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.1% bovine albumin (BSA), 0.05% polysorbate 20 (Tween® 20), pH 7.4 in distilled water. The antibody rituximab (Mabthera®) is used as the biological specimen.

実施例Ａに記載したとおりにアッセイを行い、その際、以下の粒子および蛍光マーカーを含有するストック溶液を使用する：緩衝液１７８２μＬ中の、プロテインＡ Ｍａｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）粒子の懸濁液７５μＬおよび蛍光マーカー１．８６μＬ。   The assay is performed as described in Example A, using a stock solution containing the following particles and fluorescent marker: suspension of Protein A Mag-Sepharose® particles in 1782 μL of buffer. 75 μL and fluorescent marker 1.86 μL.

このうちそれぞれ４７μＬを、リツキシマブの検量系列からの各３μＬのサンプルと共にシェーカーＶａｒｉｏｍａｇ Ｍｏｎｏｓｈａｋｅ（Ｈ＋Ｐ社）で３０分間インキュベートした。続いて、マイクロタイタープレートを５分間静置することにより粒子の沈降を待ち、次いで測定を行った。   Of these, 47 μL each was incubated with 3 μL of each sample from the rituximab calibration series for 30 minutes on a shaker Variomag Monoshake (H + P). Subsequently, the microtiter plate was allowed to stand for 5 minutes to wait for particles to settle, and then measurement was performed.

この測定を、Ｔｅｃａｎ Ｓａｆｉｒｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｒｅａｄｅｒにおいて４９０ｎｍの励起波長および５３５ｎｍの放射波長で行う。   This measurement is carried out in a Tecan Safari Fluorescence reader at an excitation wavelength of 490 nm and an emission wavelength of 535 nm.

実施例Ａに記載したとおりに校正関数を求める。相応する検量線を図５ｃに示す。   A calibration function is determined as described in Example A. The corresponding calibration curve is shown in FIG.

実施例Ｄ：２つの蛍光マーカーを用いた測定
測定のために、以下の本発明によるマイクロタイタープレートを使用する：３８４個のウェル（測定チャンバ）と、熱成形により製造された構造要素を含む一体型の底部とを備えた、黒色のマイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ＢｉｏＯＮＥ社、品番７８１０００−０６）。この構造要素は、正方形の土台上の四面体の角錐の形態を有する。測定チャンバにはその下面に非透光性の塗料層が設けられており、その際、該層は構造要素の正方形の基部面には施与されず、その結果、該基部には約２．５ｍｍの直径を有する測定窓が生じている。 Example D: Measurement with two fluorescent markers The following microtiter plate according to the invention is used for the measurement: one containing 384 wells (measuring chamber) and a structural element produced by thermoforming Black microtiter plate (Greiner BioONE, part number 781000-06) with a bottom of the figure. This structural element has the form of a tetrahedral pyramid on a square base. The measurement chamber is provided with a non-light-transmitting paint layer on its lower surface, in which case the layer is not applied to the square base surface of the structural element, so that the base has about 2. A measuring window with a diameter of 5 mm is produced.

このアッセイを、すでに乾燥された状態でマイクロタイタープレートに装入されている粒子を用いて行う。そのために、それぞれプロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）４Ｂ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ Ｂｅａｄｓの懸濁液３０μＬをマイクロタイタープレート上で摂氏３５度で乾燥させる。１．６μＬの第１の蛍光マーカー、すなわちＡｌｅｘａ ４８８ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２ ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、品番１０９−５４６−０９７）と、３．９３μＬの第２の蛍光マーカー、すなわちＲ−フィコエリトリンＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ、Ｆｃγ Ｆｒａｇｍｅｎｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、品番１０９−１１６−１７０）とからのストック溶液を１６０７μＬの緩衝液に追加し、そこからそれぞれ５４μＬを、リツキシマブ（Ｍａｂｔｈｅｒａ（登録商標））の検量系列からの各６μＬのサンプルと共にシェーカーＶａｒｉｏｍａｇ Ｍｏｎｏｓｈａｋｅ（Ｈ＋Ｐ社）で３０分間インキュベートする。続いて、マイクロタイタープレートを１５分間静置することにより粒子の沈降を待ち、次いで測定を行った。 The assay is performed using particles that are already dried and loaded into a microtiter plate. To that end, 30 μL each of a suspension of Protein A-Sepharose® 4B Fast Flow Beads is dried at 35 degrees Celsius on a microtiter plate. 1.6 μL of the first fluorescent marker, namely Alexa 488 AffiniPure F (ab ′) 2 Fragment Goat Anti-Human IgG, F (ab ′) 2 specific (Jackson Immuno Research, part number 109-546-097); 93 μL of a second fluorescent marker, namely R-phycoerythrin AffiniPure F (ab ′) 2 Fragment Goat Anti-Human IgG, Fcγ Fragment specific (Lack of Buffer No. 109-116 from Jackson ImmunoResearch, part number 109-170) 54 μL each from there, 6 μL each from a calibration series of rituximab (Mabthera®) Incubate with sample on shaker Variomag Monoshake (H + P) for 30 minutes. Subsequently, the microtiter plate was allowed to stand for 15 minutes to wait for the particles to settle, and then measurement was performed.

水溶液として、以下の緩衝液を使用する：１０ｍＭ トリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ウシアルブミン（ＢＳＡ）、０．０５％ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）、蒸留水中でｐＨ７．４。   The following buffers are used as aqueous solutions: 10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.1% bovine albumin (BSA), 0.05% polysorbate 20 (Tween® 20), pH 7.4 in distilled water.

この測定を、Ｔｅｃａｎ Ｓａｆｉｒｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｒｅａｄｅｒにおいて、４９０ｎｍの励起波長で、かつ、第１の蛍光マーカー（＝Ａｌｅｘａ ６４７標識抗体フラグメント（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）ｓｐｅｃｉｆｉｃ ４８８）の検出の際には５３５ｎｍの放射波長で、また第２の蛍光マーカー（＝Ｒ−フィコエリトリン）の検出については５８０ｎｍの放射波長で行う。 This measurement was performed on a Tecan Safari Fluorescence reader at an excitation wavelength of 490 nm and a first fluorescent marker (= Alexa 647 labeled antibody fragment (Jackson Immuno Research, Affini Pure F (ab ′) 2 Fragment Gait Hum ') When detecting specific 488), the emission wavelength is 535 nm, and for detecting the second fluorescent marker (= R-phycoerythrin), the emission wavelength is 580 nm.

実施例ＡおよびＢと同様に、それぞれの校正関数を求める。相応する検量線を図５ｄに示す。図５ｄはさらに、検体（ここではリツキシマブ（Ｍａｂｔｈｅｒａ（登録商標）））上の異なる結合部位を同様の検量線を用いて同時に検出することが可能であることを示す。   Similar to Examples A and B, respective calibration functions are obtained. The corresponding calibration curve is shown in FIG. FIG. 5d further shows that different binding sites on the specimen (here Rituximab (Mabthera®)) can be detected simultaneously using a similar calibration curve.

実施例Ｅ：非透光性の層を有しないマイクロタイタープレートにおけるアッセイの測定
この測定のために、実施例Ｄに記載した構造要素を有するマイクロタイタープレートを使用するが、但し、非透光性の塗料層なしで行う。 Example E: Assay measurement in a microtiter plate without a non-translucent layer For this measurement, a microtiter plate with the structural elements described in Example D is used, provided that it is non-translucent Without the paint layer.

水溶液として、以下の緩衝液を使用する：１０ｍＭ トリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ウシアルブミン（ＢＳＡ）、０．０５％ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）、蒸留水中でｐＨ７．４。   The following buffers are used as aqueous solutions: 10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.1% bovine albumin (BSA), 0.05% polysorbate 20 (Tween® 20), pH 7.4 in distilled water.

アッセイを、実施例Ａに相応して、機能化された粒子および蛍光マーカーを有する以下のストック溶液を使用して行う：４７８μＬの緩衝液中の、プロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）４Ｂ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ Ｂｅａｄｓの予備希釈懸濁液６００μＬ、および蛍光マーカーＡｌｅｘａ４８８ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ， Ｆ（ａｂ’）２ ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、品番１０９−５４６−０９７）１．０６μＬ。そこからそれぞれ５４μＬを、実施例Ａに記載したとおり、リツキシマブ（Ｍａｂｔｈｅｒａ（登録商標））の検量系列からの各６μＬのサンプルと共にシェーカーＶａｒｉｏｍａｇ Ｍｏｎｏｓｈａｋｅ（Ｈ＋Ｐ社）で３０分間インキュベートする。続いて、マイクロタイタープレートを１５分間静置することにより粒子の沈降を待ち、次いで測定を行う。 The assay is performed according to Example A using the following stock solution with functionalized particles and fluorescent markers: Protein A-Sepharose® 4B Fast Flow Beads in 478 μL of buffer. And a fluorescent marker Alexa488 AffiniPure F (ab ′) 2 Fragment Goat Anti-Human IgG, F (ab ′) 2 specific (Jackson Immuno Research, product number 109-546-097) 1.06 μL. From there, each 54 μL is incubated with a 6 μL sample of each from a calibration series of rituximab (Mabthera®) for 30 minutes on a shaker Variomag Monoshake (H + P) as described in Example A. Subsequently, the microtiter plate is allowed to stand for 15 minutes to wait for particles to settle, and then measurement is performed.

測定のために、ＮｙＯＮＥ型の自動化蛍光顕微鏡（ＳｙｎｅｎＴｅｃ社、ドイツ連邦共和国エルムスホルン所在）を使用する。Ｏｌｙｍｐｕｓ社の１０倍対物レンズを用いて、ウェルの中央に位置する中心の画像をその都度１つ撮影し、該画像内の蛍光強度を測定する。   An NyONE type automated fluorescence microscope (SynenTec, Elmshorn, Germany) is used for the measurement. Using an Olympus 10 × objective lens, one image of the center located at the center of the well is taken each time, and the fluorescence intensity in the image is measured.

実施例Ａと同様に校正関数を求める。相応する検量線を図５ｅに示す。   A calibration function is obtained in the same manner as in Example A. A corresponding calibration curve is shown in FIG. 5e.

Claims (23)

１つ以上の機能化された表面の存在下に水溶液中で生物学的検体の定量分析を行うための方法であって、前記水溶液は少なくとも１種類の生物学的検体および少なくとも１種類の蛍光マーカーを含有する前記方法において、前記１つ以上の生物学的検体の量および／または濃度を分析するために未結合の蛍光マーカーの蛍光放射を測定することを特徴とする前記方法。   A method for quantitative analysis of a biological specimen in an aqueous solution in the presence of one or more functionalized surfaces, the aqueous solution comprising at least one biological specimen and at least one fluorescent marker Wherein the fluorescence emission of unbound fluorescent markers is measured to analyze the amount and / or concentration of the one or more biological analytes. 機能化された表面として、ポリマーまたはポリマー混合物からの機能化された粒子であって該粒子の表面上にスカベンジャー分子が存在している粒子を使用し、前記スカベンジャー分子が１つ以上の生物学的検体および／または１つ以上の蛍光マーカーと結合することを特徴とする、請求項１に記載の方法。   As a functionalized surface, use is made of a functionalized particle from a polymer or polymer mixture in which a scavenger molecule is present on the surface of the particle, wherein the scavenger molecule is one or more biological 2. A method according to claim 1, characterized in that it binds to the analyte and / or one or more fluorescent markers. 以下：
（ａ）少なくとも１種類の機能化された粒子を測定チャンバ（１０１）に導入するステップであって、前記測定チャンバは、前記測定チャンバの底部を通じて光が到達する検出領域（１０６）と光が到達しない分離除去領域（２０５）とを有するものとするステップ；
（ｂ）少なくとも１種類の生物学的検体を含有するサンプルを前記測定チャンバに導入するステップ；
（ｃ）少なくとも１種類の蛍光マーカーを前記測定チャンバに導入するステップ；
（ｃ’）前記機能化された粒子、サンプルおよび蛍光マーカーを前記測定チャンバ内で混合するステップ；
（ｃ’’）未結合の蛍光マーカーと結合した蛍光マーカーとを分離することによって、前記結合した蛍光マーカーが前記分離除去領域（２０５）内に存在するステップ；
（ｄ）前記未結合の蛍光マーカーの蛍光放射を前記検出領域（１０６）内で測定するステップ；および
（ｅ）前記１つ以上の生物学的検体の量および／または濃度を分析するステップ
を含む、請求項１または２に記載の方法。 Less than:
(A) introducing at least one functionalized particle into the measurement chamber (101), the measurement chamber reaching the detection region (106) where the light reaches through the bottom of the measurement chamber; A separation removal region (205) not to be removed;
(B) introducing a sample containing at least one biological analyte into the measurement chamber;
(C) introducing at least one fluorescent marker into the measurement chamber;
(C ′) mixing the functionalized particles, sample and fluorescent marker in the measurement chamber;
(C ″) separating the unbound fluorescent marker from the bound fluorescent marker so that the bound fluorescent marker is present in the separation and removal region (205);
(D) measuring the fluorescence emission of the unbound fluorescent marker within the detection region (106); and (e) analyzing the amount and / or concentration of the one or more biological analytes. The method according to claim 1 or 2. 前記ステップ（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を逐次的に行うか、または前記ステップの少なくとも２つを同時に行うことを特徴とする、請求項３に記載の方法。   4. A method according to claim 3, characterized in that said steps (a), (b) and (c) are performed sequentially or at least two of said steps are performed simultaneously. ステップ（ａ）および／またはステップ（ｃ）を、その他のステップの前に、かつ前記その他のステップと時間的間隔を大きくあけて行うことを特徴とする、請求項３に記載の方法。   4. The method according to claim 3, characterized in that step (a) and / or step (c) are performed before the other steps and at a large time interval from the other steps. 請求項１から５までのいずれか１項に記載の方法であって、該方法が、直接イムノアッセイ、サンドイッチイムノアッセイ、置換イムノアッセイまたはディスプレイスメントイムノアッセイ、競合イムノアッセイおよび二次イムノアッセイである、前記方法。   6. The method according to any one of claims 1 to 5, wherein the method is a direct immunoassay, a sandwich immunoassay, a displacement immunoassay or a displacement immunoassay, a competitive immunoassay and a secondary immunoassay. 機能化された磁性粒子を使用することを特徴とする、請求項１から６までのいずれか１項に記載の方法。   7. A method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that functionalized magnetic particles are used. ステップ（ｃ’’）を、沈降により、および一時的または永続的な磁場の印加により行ことを特徴とする、請求項７に記載の方法。   8. A method according to claim 7, characterized in that step (c '') is performed by sedimentation and by application of a temporary or permanent magnetic field. デバイス（１０２）と前記デバイスを包囲する少なくとも１つの側壁（１０８）とを含む測定チャンバ（１０１）の、請求項１から７までのいずれか１項に記載の方法を実施するための使用において、前記デバイスの基部は前記測定チャンバの基部を形成することができ、前記デバイスは少なくとも部分的に透光性である構造要素（１０３）を有し、かつ前記デバイスの基部は前記構造要素の底面（１１０、３０３）を除いて非透光性である、前記使用。   Use of a measuring chamber (101) comprising a device (102) and at least one side wall (108) surrounding the device for carrying out the method according to any one of claims 1-7. The base of the device can form the base of the measurement chamber, the device having a structural element (103) that is at least partially translucent, and the base of the device is the bottom surface of the structural element ( 110, 303), wherein said use is non-translucent. 構造要素（１０３）が上方に向かって先細状の突出部として構成されており、前記突出部の横断面は任意の形状を有することができ、基部とは反対側の構造要素端部（３０４）は該端部に試験成分が堆積しない状態にあることを特徴とする、請求項９に記載の測定チャンバ（１０１）の使用。   The structural element (103) is configured as a projecting portion that tapers upward, and the cross section of the projecting portion may have any shape, and the structural element end (304) opposite to the base portion. Use of a measuring chamber (101) according to claim 9, characterized in that the test component is not deposited on the end. デバイスの基部が測定チャンバの基部を形成するか、または、デバイスの基部は測定チャンバの基部ではなくもう１つの基部が存在する、請求項９または１０に記載の測定チャンバ（１０１）の使用。   Use of a measurement chamber (101) according to claim 9 or 10, wherein the base of the device forms the base of the measurement chamber or the base of the device is not the base of the measurement chamber but another base. 請求項１から７までのいずれか１項に記載の方法を実施するためのマイクロタイタープレート（４０１）の使用において、前記マイクロタイタープレート（４０１）が、請求項９から１１までのいずれか１項に定義される少なくとも１つの測定チャンバ（１０１）を有する、前記使用。   Use of a microtiter plate (401) for carrying out the method according to any one of claims 1 to 7, wherein the microtiter plate (401) is any one of claims 9 to 11. Said use comprising at least one measuring chamber (101) as defined in. 請求項６から８までのいずれか１項に記載の方法を実施するための測定チャンバ（１０１）の使用において、前記測定チャンバの基部に、固定されているかまたは取り外し可能な非透光性の磁性の層が存在し、前記層が透光性の測定窓（１０４）を有する、前記使用。   Use of a measuring chamber (101) for carrying out the method according to any one of claims 6 to 8, wherein the measuring chamber is fixed or removable at the base of the measuring chamber. Wherein said layer is present and said layer has a translucent measuring window (104). 請求項１から７までのいずれか１項に記載の方法を実施するためのマイクロタイタープレート（４０１）の使用において、前記マイクロタイタープレート（４０１）が、請求項１０に記載の少なくとも１つの測定チャンバ（１０１）を有する、前記使用。   Use of a microtiter plate (401) for performing the method according to any one of claims 1 to 7, wherein the microtiter plate (401) is at least one measuring chamber according to claim 10. (101). 請求項１から７までのいずれか１項に記載の方法を実施するためのマイクロタイタープレートであって、前記マイクロタイタープレートの少なくとも１つの凹部内にデバイス（１０２）が導入されており、前記デバイスは少なくとも部分的に透光性である構造要素（１０３）を有し、前記構造要素は上方に向かって先細状の突出部として構成されており、かつ前記突出部の横断面は任意の形状を有することができ、基部とは反対側の構造要素端部（３０４）は該端部に実質的に試験成分が堆積しない状態にあり、かつ前記デバイスの基部は前記構造要素の底面（１１０、３０３）を除いて非透光性であり、かつ前記凹部の縁部が測定チャンバの側壁を形成することを特徴とする、前記マイクロタイタープレート。   A microtiter plate for carrying out the method according to any one of claims 1 to 7, wherein a device (102) is introduced into at least one recess of the microtiter plate, Has a structural element (103) that is at least partially translucent, said structural element being configured as a tapered protrusion upwards, and the cross section of said protrusion having an arbitrary shape The structural element end (304) opposite the base may be substantially free of test components deposited on the end, and the base of the device may be the bottom surface (110, 303) of the structural element. The microtiter plate according to claim 1, wherein the microtiter plate is non-light-transmitting except that the edge of the recess forms a side wall of the measurement chamber. 請求項１５に記載のマイクロタイタープレートにおいて、前記マイクロタイタープレートの元の底部が、構造要素を有する一体型の基部に置き換えられており、前記マイクロタイタープレートのすべての凹部の中に１つの構造要素が存在し、前記基部は、前記構造要素の底面を除いて非透光性となるように被覆されていることを特徴とする、前記マイクロタイタープレート。   16. The microtiter plate according to claim 15, wherein the original bottom of the microtiter plate is replaced by an integral base having structural elements, and one structural element is present in all recesses of the microtiter plate. The microtiter plate is characterized in that the base portion is coated so as to be non-translucent except for the bottom surface of the structural element. 請求項１から８までのいずれか１項に記載の方法を実施するためのマイクロタイタープレート（１０１）であって、前記マイクロタイタープレートの少なくとも１つの凹部が測定チャンバである前記マイクロタイタープレートにおいて、前記マイクロタイタープレートの基部に、固定されているかまたは取り外し可能な非透光性の磁性の層が施与されており、前記層が少なくとも１つの測定窓を有することを特徴とする、前記マイクロタイタープレート。   A microtiter plate (101) for carrying out the method according to any one of claims 1 to 8, wherein at least one recess of the microtiter plate is a measurement chamber, The microtiter plate is provided with a fixed or removable non-translucent magnetic layer on the base of the microtiter plate, the layer having at least one measuring window plate. 請求項１５から１７までのいずれか１項に記載のマイクロタイタープレートにおいて、少なくとも１つの測定チャンバ内に、機能化された表面または機能化された粒子および／または蛍光マーカーが乾燥された形態で存在することを特徴とする、前記マイクロタイタープレート。   The microtiter plate according to any one of claims 15 to 17, wherein the functionalized surface or functionalized particles and / or fluorescent markers are present in a dried form in at least one measuring chamber. The microtiter plate is characterized in that: 請求項１から８までのいずれか１項に記載の方法を実施するためのキットであって、請求項１５から１７までのいずれか１項に記載のマイクロタイタープレートと、少なくとも１種類の機能化された表面または少なくとも１種類の機能化された粒子と、少なくとも１種類の蛍光マーカーと、反応緩衝液とを含む、前記キット。   A kit for carrying out the method according to any one of claims 1 to 8, comprising the microtiter plate according to any one of claims 15 to 17 and at least one functionalization. Said kit comprising a modified surface or at least one functionalized particle, at least one fluorescent marker, and a reaction buffer. 請求項１から８までのいずれか１項に記載の方法を実施するためのキットであって、請求項１８に記載のマイクロタイタープレートと反応緩衝液とを含む、前記キット。   A kit for carrying out the method according to any one of claims 1 to 8, comprising the microtiter plate according to claim 18 and a reaction buffer. 請求項１から８までのいずれか１項に記載の方法を実施するためのマイクロタイタープレートの使用であって、前記マイクロタイタープレートの少なくとも１つの凹部内にデバイス（１０２）が導入されており、前記デバイスは透光性の構造要素（１０３）を有し、前記構造要素は上方に向かって先細状の突出部として構成されており、前記突出部の横断面は任意の形状を有することができ、基部とは反対側の構造要素端部（３０４）は該端部に試験成分が堆積しない状態にあり、かつ前記凹部の縁部が測定チャンバの側壁を形成し、未結合の蛍光マーカーの蛍光放射を検出領域において蛍光読取り装置を用いて行い、前記蛍光読取り装置の光学的配置は、前記検出領域内の蛍光放射のみが測定されうるように構成されている、前記使用。   Use of a microtiter plate for carrying out the method according to any one of claims 1 to 8, wherein a device (102) is introduced in at least one recess of the microtiter plate, The device has a translucent structural element (103), the structural element is configured as a tapered projecting portion upward, and the cross section of the projecting portion can have any shape. The structural element end (304) opposite the base is in a state in which no test component is deposited on the end, and the edge of the recess forms the sidewall of the measurement chamber, and the fluorescence of the unbound fluorescent marker The use, wherein the radiation is performed in a detection region with a fluorescence reader, and the optical arrangement of the fluorescence reader is configured such that only the fluorescence radiation in the detection region can be measured. 請求項２１に定義されるマイクロタイタープレート（１０１）の使用であって、前記マイクロタイタープレートの元の底部が、構造要素を含む一体型の基部に置き換えられている、前記使用。   Use of a microtiter plate (101) as defined in claim 21, wherein the original bottom of the microtiter plate is replaced by an integral base comprising structural elements. 請求項２１または２２に記載の使用において、蛍光読取り装置が蛍光顕微鏡であることを特徴とする、前記使用。   23. Use according to claim 21 or 22, characterized in that the fluorescence reader is a fluorescence microscope.
JP2016574350A 2014-03-10 2015-03-05 Methods and devices for analyzing biological specimens Active JP6667460B2 (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP14158692 2014-03-10
EP14158692.5 2014-03-10
PCT/EP2015/054671 WO2015135840A1 (en) 2014-03-10 2015-03-05 Method and device for determining biological analytes

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2017508993A true JP2017508993A (en) 2017-03-30
JP2017508993A5 JP2017508993A5 (en) 2018-04-12
JP6667460B2 JP6667460B2 (en) 2020-03-18

Family

ID=50276937

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2016574350A Active JP6667460B2 (en) 2014-03-10 2015-03-05 Methods and devices for analyzing biological specimens

Country Status (4)

Country Link
US (2) US10914732B2 (en)
EP (1) EP3116650B1 (en)
JP (1) JP6667460B2 (en)
WO (1) WO2015135840A1 (en)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108368470B (en) 2016-02-29 2021-07-09 惠普发展公司，有限责任合伙企业 Liquid-conducting sample container
KR101913296B1 (en) * 2016-02-29 2018-10-31 프리시젼바이오 주식회사 Sample mixing cartridge
JP7058662B2 (en) * 2017-02-08 2022-04-22 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー Dry dye reagent device, and how to manufacture and use it
WO2023079052A1 (en) 2021-11-07 2023-05-11 Paia Biotech Gmbh Method for the qualitative and quantitative determination of protein aggregates

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5674699A (en) * 1993-06-08 1997-10-07 Chronomed, Inc. Two-phase optical assay
JP2006162466A (en) * 2004-12-08 2006-06-22 Kyowa Medex Co Ltd Method for measuring substance to be measured and measurement reagent
JP2007155549A (en) * 2005-12-06 2007-06-21 Hitachi Maxell Ltd Quantitative analysis using infrared phosphor
US20070154356A1 (en) * 2005-12-30 2007-07-05 Modavis Robert A Optically readable microplate
US20100028935A1 (en) * 2006-11-23 2010-02-04 Carlo Ciaiolo Convex bottom microwell

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3840462A1 (en) 1988-12-01 1990-06-07 Berthold Lab Prof R METHOD AND DEVICE FOR MEASURING CHEMILUMINESCENCE
US5319436A (en) * 1992-05-28 1994-06-07 Packard Instrument Company, Inc. Microplate farming wells with transparent bottom walls for assays using light measurements
US5792426A (en) * 1994-10-11 1998-08-11 Schweizerische Eidgenossenschaft Vertreten Durch Das Ac-Laboratorium Spiez Der Gruppe Rustung Multi-well titerplate for instrumental analysis
GB2319836B (en) * 1996-11-25 2001-04-04 Porvair Plc Microplates
WO2000052451A1 (en) 1999-03-03 2000-09-08 Evotec Analytical Systems Gmbh Homogeneous fluorescence assay
EP1239284A1 (en) * 2001-03-08 2002-09-11 The Technology Partnership Public Limited Company Non-separation assay method and system using opaque particles
JP2006507504A (en) * 2002-11-22 2006-03-02 ソルス バイオシステムズ インコーポレーテッド High-throughput screening by parallel vibrational spectroscopy
JP5189201B2 (en) * 2008-04-02 2013-04-24 アボット ポイント オブ ケア インコーポレイテッド Virtual separation of bound and free labels in ligand assays to perform immunoassays of biological fluids containing whole blood
US8035811B2 (en) * 2008-09-22 2011-10-11 Helixis, Inc. Devices and methods for visualization of a sample in a microplate
GB201102037D0 (en) * 2011-02-07 2011-03-23 Multi Sense Technologies Ltd Microfluidics based assay device

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5674699A (en) * 1993-06-08 1997-10-07 Chronomed, Inc. Two-phase optical assay
JP2006162466A (en) * 2004-12-08 2006-06-22 Kyowa Medex Co Ltd Method for measuring substance to be measured and measurement reagent
JP2007155549A (en) * 2005-12-06 2007-06-21 Hitachi Maxell Ltd Quantitative analysis using infrared phosphor
US20070154356A1 (en) * 2005-12-30 2007-07-05 Modavis Robert A Optically readable microplate
US20100028935A1 (en) * 2006-11-23 2010-02-04 Carlo Ciaiolo Convex bottom microwell

Also Published As

Publication number Publication date
JP6667460B2 (en) 2020-03-18
WO2015135840A1 (en) 2015-09-17
US10914732B2 (en) 2021-02-09
US20170016890A1 (en) 2017-01-19
EP3116650A1 (en) 2017-01-18
US20210072237A1 (en) 2021-03-11
EP3116650B1 (en) 2020-03-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20200096502A1 (en) Analyte Detection
US20210072237A1 (en) Method and device for determining biological analytes
US9678068B2 (en) Ultra-sensitive detection of molecules using dual detection methods
ES2400919T3 (en) Device and procedure for the detection of mycotoxins
Cretich et al. Digital detection of biomarkers assisted by nanoparticles: application to diagnostics
CA2905165A1 (en) Automated immunoanalyzer system for performing diagnostic assays for allergies and autoimmune diseases
JP6417725B2 (en) Analyte detection method
US20120316077A1 (en) System And Method For Detection And Analysis Of A Molecule In A Sample
WO2013135371A1 (en) Real time diagnostic assays using an evanescence biosensor
EP2224241B1 (en) Carrier for use in measurement of analyte, and method for production thereof
JP4068148B2 (en) Assay method
JP2007155691A (en) Substance measuring method, and measuring composition
US20130122517A1 (en) Method of performing an assay
US11125744B2 (en) Device, system and method for detecting an analyte in a body fluid sample containing a plurality of cells
JP2019007984A (en) Detection method of analysis object and test strip for lateral flow
US20220365092A1 (en) A method for detecting an analyte
US20240060891A1 (en) A method for detecting an analyte
JP2013181889A (en) Immunoassay of ck-mb (creatine kinase isozyme mb) using spfs (surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectrometry)
WO2023180747A1 (en) A method for detecting an analyte
JP2015500499A (en) Attenuating dyes and corresponding methods for examining fluorescence from multiple surfaces
CN116420066A (en) Method and device for detecting target substance, and reagent
CN117529663A (en) Method for digital immunosensory of single molecules using label immobilization and amplification strategies
Baldini et al. An optical platform based on fluorescence anisotropy for C—reactive protein assay
MX2008008004A (en) Device and method for identifying mycotoxins

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20180227

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20180227

A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20181212

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20190204

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20190424

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20190625

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20190805

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20200127

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20200225

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6667460

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250