JP2017506262A - タンパク質の選択的還元 - Google Patents
タンパク質の選択的還元 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2017506262A JP2017506262A JP2016568485A JP2016568485A JP2017506262A JP 2017506262 A JP2017506262 A JP 2017506262A JP 2016568485 A JP2016568485 A JP 2016568485A JP 2016568485 A JP2016568485 A JP 2016568485A JP 2017506262 A JP2017506262 A JP 2017506262A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- cysteine
- modified
- modified cysteine
- uncapped
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
- A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
- A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
- A61K47/6817—Toxins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/06—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents
- C07K1/08—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents using activating agents
- C07K1/086—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents using activating agents containing sulfur
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
- C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
- C07K1/1133—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by redox-reactions involving cystein/cystin side chains
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/34—Extraction; Separation; Purification by filtration, ultrafiltration or reverse osmosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
- C07K2317/53—Hinge
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Water Supply & Treatment (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
Description
本出願は、2014年2月11日に提出された米国特許出願第61/938,378号に関する優先権を主張し、この内容は、参照により全体が本明細書に組込まれる。
本発明は、とりわけ、抗体、例えば、モノクローナル抗体における改変されたシステイン残基から、スルフィドキャップを選択的に除去するための方法を提供する。ある選択的除去は、低濃度での小分子チオールへの抗体の長期暴露の後に観察されるが、完全なキャップ除去は、静的反応混合物においては発生しない。好都合には、改変されたシステインのほぼ完全な活性化が、還元副産物を除去しながら、還元剤濃度が維持されている本発明の方法を用いることにより達成され得る。改変されたシステインの実質的にすべてを活性化することが所望されない実施態様によれば、本発明の方法は、活性化のレベルを調節するために使用され得る。驚くべきことには、未キャップの抗体が、抗体構造を保持し、そして薬物、又は他の機能性薬剤との抗体のコンジュゲートの前、再酸化工程の必要性を除去する、無傷(intact)の鎖間ジスルフィド結合により得られる。とりわけ、本発明の方法は、抗体複合体、例えば、抗体薬物複合体の調製のための現在の製造基準の有意な簡略化を提供する。
本明細書において使用される場合、用語「抗体(antibody)」とは、完全な(intact)モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一特異性抗体、多重特異性抗体(すなわち、二重特異性抗体)、及び所望する生物学的活性(すなわち、標的抗原に対する特異的結合)を示し、そして少なくとも1つの生来の鎖間ジスルフィド結合を有する抗体フラグメントを広範囲には意味する。完全な抗体は、典型的には、4個のポリペプチド鎖(2つのH鎖及び2つのL鎖)から構成され、各ポリペプチドは、主に2つの領域、すなわち、可変領域、及び定常領域を有する。可変領域は、標的抗原に対して特異的に結合し、そしてそれと相互作用する。可変領域は、特定の抗原上の特異的結合部位を認識し、そしてそれに結合する相補性決定領域(CDR)を含む。定常領域は、免疫系により認識され、そして、それと相互作用することができる(例えば、Janeway et al., 2001, Immuno. Biology, 5th Ed., Garland Publishing, New Yorkを参照のこと)。4個のポリペプチド鎖は、鎖間ジスルフィド結合を通して、お互いに共有結合される。抗体は、任意のタイプ(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD及びIgA)、クラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1 及び IgA2)又はサブクラスのものであり得る。抗体は、任意の適切な種に由来することができる。いくつかの実施態様によれば、抗体は、ヒト、又はネズミ起源のものである。モノクローナル抗体は、例えば、ヒト、ヒト化、又はキメラ性であり得る。属性に依存して、用語「抗体」とは、単一の抗体分子、又は抗体分子の集合体、例えば、抗体溶液を意味する。
とりわけ、本発明は、改変されたシステイン抗体を選択的に還元し、それにより、未キャップの抗体調製物を形成する方法を提供する。前記方法は、還元剤と改変されたシステイン抗体分子とを接触させ、各抗体分子は、少なくとも1つのキャップされ、改変されたシステイン残基、及び少なくとも1つの鎖間ジスルフィド結合を有し;そして、前記還元剤と前記抗体分子とを、改変されたシステイン残基のキャップを取り、そして、キャップ副産物を形成するのに十分な条件下で、反応せしめることを包含する。還元反応の間、キャップ副産物は除去され、それにより、新たに形成されたチオールの再キャッピングを妨げる。キャップ副産物と共に排除される還元剤は、還元反応を先に進めるために配置される。還元剤及び条件は、改変されたシステイン残基が、選択的に還元される(すなわち、選択的に活性化される)ように選択される。結果として、別個の再酸化工程は、還元工程に続いて、鎖間ジスルフィド結合を再形成するために必要とされない。キャップされ、改変されたシステイン残基を有する抗体分子に存在する、鎖間ジスルフィド結合の実質的にすべてが、未キャップの抗体調製物に保持される。用語「保持する(retain)」の使用により、鎖間ジスルフィド結合は、還元反応の間、必ず無傷のままであることを意味するものではない。結合は、還元の間、破壊され得るが、しかしそれらは、一対の遊離チオールへの変換の前、再形成する。結合再形成は、個別の再酸化工程に依存しないが、しかしながら、スキーム2に示されるように、還元反応の間、発生する。
任意の適切な還元剤が、本発明の方法に使用され得る。還元剤の例は、モノチオール還元剤、例えば、システイン、N−アセチルシステイン、システアミン、β−メルカプトエタノール、2−メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム塩、及び同様のものを包含するが、但しそれらだけには制限されない。軽度の還元剤、例えば、システイン、及び同様のものが、鎖間ジスルフィド結合を還元しないで、キャップされたシステイン残基(例えば、キャップされ、改変されたシステイン残基)から、キャップを除くために特に適している。より強い還元剤、例えば、ジチオトレイトール(DTT)、ジチオエリトリトール(DTE)、及びビス(2−メルカプトエチルスルホン)は、多くの場合、早すぎる鎖間ジスルフィド結合の還元をもたらす。スキーム2の中間体6の混合されたジスルフィドが形成しないか、又は単に一時的に形成する還元剤、例えば、TCEP及びDTTは、キャップされたシステインを選択的に脱キャップする可能性は低い。いくつかの実施態様によれば、還元剤は、システイン、システアミン、β−メルカプトエタノール、2−メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム塩、及びそれらの混合物から選択される。
多くのモノチオールが、選択的活性化のために使用されるが、図1におけるグラフは、異なったチオールが改変されたシステインを異なった速度で、及び異なった最大レベルに活性化することを示す。従って、改変されたシステイン残基の活性化のための適切な条件の特定は、適切な還元剤の特定、及び還元剤の適切な濃度の特定を包含する。
抗体上の未キャップの改変されたシステイン残基は、種々の機能剤、例えばイメージング剤(例えば、発色団及び蛍光団)、診断剤(例えば、MRI造影試薬及び放射性同位体)、安定剤(例えば、ポリエチレングリコールポリマー)及び治療剤のインストールのための有用な手段として役に立つ。未キャップのシステイン残基を有する抗体は、抗体−機能剤−複合体を形成するために、機能剤にコンジュゲートされ得る。機能剤(例えば、薬物、検出剤、安定剤)は、改変されたシステイン残基の部位で、抗体にコンジュゲートされる(共有結合される)。機能剤は、リンカーを通して間接的に、又は機能剤上のチオール反応性基を通して直接的に、結合され得る。
抗体当たりの薬物−リンカー分子の平均数(又は平均薬物負荷)は、標的細胞に送達され得る薬物の量の主要決定因子であるので、ADC組成物の重要な特性である。平均薬物負荷は、改変されたシステイン残基にコンジュゲートされる薬物、及び意図される改変されたシステイン残基以外の部位にコンジュゲートされる薬物、及び組成物における未コンジュゲートの抗体の量を包含する。抗体当たり約2つの薬物の平均薬物負荷が標的化される場合、2つの改変されたシステイン残基を有する抗体(例えば、各H鎖上の1つの部位又は各L鎖上の1つの部位)が、ADC組成物を調製するために使用され得る。抗体当たり約4個の薬物の平均薬物負荷が、標的化される場合、4個の改変されたシステイン残基を有する抗体(例えば、各H鎖上の2つの部位、又はL鎖上の2つの部位、又はH鎖上の1つの部位及びL鎖上の1つの部位)が、ADC組成物を調製するために使用され得る。当業者は、他のレベルの薬物負荷(例えば、2以下の薬物負荷レベル及び4以上の薬物負荷レベルを包含する)が、特定の抗体又は特定の薬物に依存して、治療的に有用であることを理解しているである。薬物複合体のために部位は、H鎖における複数の部位又は2以上の部位で、改変されたシステインを配置することにより、又はL鎖における上記部位で、改変されたシステインを配置することにより、又は両者により、抗体に導入され得る。重要なことは、上記の改変されたシステイン残基の脱キャッピングのレベルは、有用な薬物負荷を有するADC組成物の調製を可能にする。
多くの適切な抗体が、本発明の方法に使用され得る。本発明の方法に使用される抗体は、特徴的抗原に関連する疾患及び病状についてのインビトロ又はインビボ診断、インビボイメージング、及び治療を包含する多くの用途のために有用である。5種のヒト抗体クラス(IgG、IgA、IgM、IgD及びIgE)、及びそれらのクラス内の種々のサブクラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及びIgA2)は、構造的差異、例えば、単一の抗体分子における免疫グロブリン単位の数、個々の単位のジスルフィド架橋構造、及び鎖長及び配列における差異に基づいて認識される。抗体のクラス及びサブクラスは、抗体アイソタイプと呼ばれる。
改変されたシステインの部位は、ADCの性質に対する影響を有することができる。例えば、タンパク質の構造に完全に埋め込まれた、改変されたシステインは、溶媒への不良な接近のために、コンジュゲートするのに困難であるが、ところが抗体の外表面上の改変されたシステインは、血漿における物質への長期の暴露のために、安定性を損なっているADCをもたらすことができる。また、高く表面暴露された、改変されたシステインを有するecomAbから調製されたADCは、薬物の疎水性に対して敏感であるが、ところが、より保護された位置での改変されたシステインは、溶液中の他の材料への接近が制限されるので、薬物の性質に対してあまり敏感でない。改変されたシステイン残基の位置はまた、特定のACDについての所望のようなエフェクター機能を調節するためにも使用され得る。例えば、エフェクター機能結合ドメインにおける改変されたシステイン残基への薬物−リンカーのコンジュゲートは、エフェクター機能介在受容体への結合を阻止するために使用され得る。
本明細書に記載される工程は、抗体に関して例示されているが、それは、発現又は製造の間、チオールによりキャップされる、改変された、又は生来の不対システイン(タンパク質内で、一般的に鎖間又は鎖内結合を形成しないシステイン)を有する任意のタンパク質のために、都合よく使用され得ることは、当業者により理解されるであろう。この工程が特に有用であるタンパク質は、不対システインを含む他に、鎖間ジスルフィド結合、特に、タンパク質のアンフォールディングをすぐにはもたらさないで切断され得る結合を形成する、生来のシステインを含むタンパク質である。非抗体タンパク質を意味する場合、用語、鎖間ジスルフィド結合とは、隣接するポリペプチド鎖上の2つのシステイン残基間の共有結合を意味する。候補体非抗体タンパク質は、生来の折畳まれたコンフォメーションでの安定性が、キャップされたチオールのコンフォメーションに匹敵する、溶媒暴露されたジスルフィド結合を含むそれらのタンパク質を包含する。改変されたシステインタンパク質とは、本明細書において使用される場合、タンパク質における選択されたアミノ酸が、システインに変異されるタンパク質である。典型的なタンパク質は、また、Fc−融合タンパク質、例えば、所望する標的に対する特異性を提供するタンパク質に共有結合される抗体のFc領域を含むタンパク質を包含する。
実施例1:選択的還元を実施するための典型的な方法
反応容器を、接線流濾過(TFF)装置に連結し、そして限外濾過膜を設置する(例えば、88cm2、Millipore Pelicon 3、再生セルロース)。(適切なサイズを有する多くの異なった膜型が、この抗体に使用され得る。還元剤についての添加速度の計算のために必要とされる流出速度及び篩分け係数は、透過流束で、及びこの工程に使用されるであろう膜型、及び表面積で決定されるべきである)。膜を、製造業者の指示に従って、フラッシュし、そして平衡化する。ダイアフィルトレーション緩衝液リザーバーを、緩衝液(例えば、50mMのトリス/5mMのEDTA、pH8.0)を含むよう設定する。それを、反応容器に、管を介して連結し、そしてその管を通しての流れを、蠕動ポンプ(例えば、ダイアフィルトレーション緩衝ポンプ)により制御する。キャップされ、改変されたシステインを含むmAbを、反応容器に配置する。反応を室温で行い、反応混合物を、約20psiの膜貫通圧力を維持するためにくびれた保持液ラインにより、限外濾過膜を通してポンプで連続的に送る。
S239C改変されたシステイン抗体(部位239で改変されたシステイン残基を有するIgG1抗体;EU指標に従って番号付け)20mg(15mg/mlで135nモル)を、pH8.0及び室温で8時間、33μlの100mM(3.3μモル)のシステイン、N−アセチルシステイン、又はシステアミンにより処理した。サンプルを、1時間の間隔で除去し、精製し、過剰のSGD−1269とコンジュゲートし、そして凍結貯蔵した。精製及びコンジュゲートが、還元反応を停止し、還元工程により生成されたチオールを保存した。コンジュゲートされたサンプルを、変性条件([rPLRP])下で、逆相HPLCにより分析し、これから、改変されたシステイン脱キャッピングの程度を推定した(H0のH1への変換)。鎖間ジスルフィド切断の程度を、コンジュゲートされた1以上のmcMMAFを有するH鎖の量から決定した(mcMMAFは、薬物モノメチルアウリスタチンFに結合されたマレイミドカプロン酸リンカーである)。コンジュゲートされた2以上のmcMMAF分子を有するH鎖は、観察されなかった。静的溶液還元実験からの結果を、図1に示す。結果は、3個のチオールの個々が、改変されたシステインを脱キャップするために、ecmAbと反応することができるが、しかしながら、それらの3個のチオールは、非常に異なった挙動性を有することを示す。NACは、スキーム1における第1反応により、最も直接的に記載される態様で挙動する:反応は、十分な濃度のジスルフィド4が蓄積するまで、進行し、次に、順方向及び逆方向の反応が、同じ速度で発生するので、停止する。システインは、NACよりもより強力な還元剤として挙動するが、しかしながら、部分的に活性化されたecmAbでの停止の代わりに、反応は逆転し、ecmAbを再生する。この逆転は、システインにより、追加の反応、すなわち、還元剤の自動酸化が関与することを示唆する。
反応容器を、接線流濾過(TFF)装置に連結し、そして限外濾過膜を設置した(例えば、88cm2、Millipore Pelicon 3、再生セルロース)。膜を、製造業者の指示に従って、フラッシュし、そして平衡化した。ダイアフィルトレーション緩衝液リザーバーを、50mMのトリス/5mMのEDTA、pH8.0を含むように設定した。それを、反応容器に、管を介して連結し、そしてその管を通しての流れを、蠕動ポンプ(例えば、ダイアフィルトレーション緩衝ポンプ)により制御した。キャップされた、改変されたシステインを含む、改変されたシステインmAb(h2H12 S239C ecMab、h1F6 239 ecMab、h2H12 K326C ecMab又はh2H12 A327C ecMab;EU指標に従って番号付け)を、約15mg/mlの濃度で反応容器に配置し、そして、pHを8.0に調節した。反応を室温で行い、反応混合物を、約20psiの膜貫通圧力を維持するためにくびれた保持液ラインにより、限外濾過膜を通して、ポンプで連続的に送った。
システインを、反応混合物に、システインが、透過ラインを通して損なわれる同じ速度で添加した。透過ラインを通して分析物の損失の初期速度を、式2から計算し、この式は一定体積ダイアフィルトレーションによるクリアランスのための理論式、すなわち式1から誘導され得る。システインストック溶液が、初期システイン濃度を維持するために、反応混合物中にポンプ輸送される速度が、式3により与えられる。
式4:R = C0- * r * S/[Cys] = (0.8 mM) * (720 mL/hr) * (0.8)/(100 mM) = 4.61 mL/hr。
ecmAb中の改変されたシステインの選択的活性化は、工程を通してダイアフィルトレーション緩衝液中にシステインを補充しながら、反応の間、ecmAbを連続してダイアフィルトレートすることにより達成された。ダイアフィルトレーションは、反応副産物を連続して枯渇させた。システイン添加速度は、反応混合物中のシステインの一定濃度を提供するために、ダイアフィルトレーションによるシステインのクリアランスの理論的速度に基づいて計算された。図2は、鎖間ジスルフィド結合の無視できる切断(%H2により示される)を伴って、4.5時間後の利用可能な改変されたシステインの約80%の活性化(%H1)を示す。この実験が、長期間、0.6mMのシステインを用いて反復され、類似する結果が得られた(図3)。より高い濃度で、反応は早く且つ、やや低い特異性であった。反応混合物は、システイン供給ポンプを介して反応混合物に入り、そしてTFF膜(浸透する)を介して反応混合物を出るシステイン溶液と共に、工程を通してフラックスの状態で存在し、結果的に、その濃度は反応の間、多少変動することができるが、しかし、それにもかかわらず、活性化条件は一般的に公称濃度近くに保持され得ることは、理解されているであろう。1.5〜2mM、及びそれよりも高いシステイン濃度は、高められた鎖間ジスルフィド切断をもたらした。図4は、改変されたシステイン活性化は、抗体の同一性にもかかわらず、種々の部位で選択的に達成され得ることを示す。活性化時間の経過と共に、K326変異体は、活性化がS239又はA327部位でよりもこの部位で、より早いことを示唆する。これは、たぶん、K326部位がより溶媒接近性であるが、しかしながら、それにもかかわらず、その方法が所望する選択的活性化を達成する事実のためである。図5は、反応が、長時間にわたって低濃度の還元剤を用いることにより、非常に良好な選択性を伴って、改変されたシステインの100%に非常に近い活性化まで進み得ることを示す。
Claims (43)
- タンパク質の選択的還元方法であって、前記方法が、以下のステップ:
a)還元剤とタンパク質分子とを接触させ、各タンパク質分子は、少なくとも1つのキャップされたシステイン残基、及び少なくとも1つの鎖間ジスルフィド結合を有し;
b)前記還元剤と前記タンパク質分子とを、システイン残基のキャップを取り、そしてキャップ副産物を形成するのに十分な条件下で、反応させ;そして
c)前記還元反応の間、キャップ副産物を除去する;
ことを含み、それにより、未キャップのシステインタンパク質調製物が形成され、そして前記還元反応の前、タンパク質分子に存在する鎖間ジスルフィド結合の実質的にすべてが、前記未キャップのシステインタンパク質調製物に保持されている、方法。 - キャップ副産物を除去しながら、追加の還元剤を還元反応に補充する、請求項1に記載の方法。
- 前記キャップされたシステイン残基の少なくとも約60%が、脱キャップされる、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記キャップされたシステイン残基の少なくとも約70%が、脱キャップされる、請求項3に記載の方法。
- 前記キャップされたシステイン残基の少なくとも約80%が、脱キャップされる、請求項3に記載の方法。
- 前記タンパク質が、抗体であり、前記キャップされた及び未キャップのシステイン残基が、改変されたシステイン残基であり、そして前記未キャップのシステインタンパク質調製物が、未キャップの改変されたシステイン抗体調製物である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記未キャップの改変されたシステイン抗体の調製物が、以下の:
少なくとも2つの未キャップの改変されたシステイン残基を有し、そしてキャップされ、改変されたシステイン残基を有さない抗体分子;
少なくとも2つのキャップされ、改変されたシステイン残基を有し、そして未キャップの改変されたシステイン残基を有さない抗体分子;及び
少なくとも1つのキャップされ、改変されたシステイン残基、及び少なくとも1つの未キャップの改変されたシステイン残基を有する抗体分子
から成る群から選択される複数のメンバーを含む、請求項6に記載の方法。 - 前記還元反応の前、前記抗体分子に存在する鎖間ジスルフィド結合の少なくとも80%(好ましくは、少なくとも85%、又は少なくとも90%)が、前記未キャップの改変されたシステイン抗体調製物に保持される、請求項6又は7に記載の方法。
- 前記抗体調製物に存在する遊離チオールの少なくとも90%が、改変されたシステイン残基に由来する、請求項6〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記還元反応の間、前記キャップ副産物の除去が、透析又はダイアフィルトレーションを含む、請求項6〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記還元反応の前、各抗体分子が、少なくとも3個の鎖間ジスルフィド結合を含む、請求項6〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記還元反応の前、各抗体分子が、少なくとも4個の鎖間ジスルフィド結合を含む、請求項6〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記還元剤及び還元条件が、前記抗体分子に存在する鎖間ジスルフィド結合の約20%以下が、還元反応の間、一対の遊離チオールに変換されるように選択される、請求項6〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記還元剤及び還元条件が、前記抗体分子に存在する鎖間ジスルフィド結合の約15%以下が、還元反応の間、一対の遊離チオールに変換されるように選択される、請求項6〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記還元剤及び還元条件が、前記抗体分子に存在する鎖間ジスルフィド結合の約10%以下が、還元反応の間、一対の遊離チオールに変換されるように選択される、請求項6〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記還元剤及び還元条件が、前記抗体分子に存在する鎖間ジスルフィド結合の約5%以下が、還元反応の間、一対の遊離チオールに変換されるように選択される、請求項6〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 各抗体分子が、少なくとも2つの改変されたシステイン残基を有する、請求項6〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 各抗体分子が、4つの改変されたシステイン残基を有する、請求項6〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 前記改変されたシステイン残基が、前記抗体分子のH鎖定常領域に存在する、請求項6〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 前記改変されたシステイン残基が、前記抗体分子のH鎖又はL鎖可変領域に存在する、請求項6〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 前記還元剤が、システイン、システアミン、βメルカプトエタノール、2−メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム塩、及びそれらの混合物から成る群から選択される、請求項1〜20のいずれか1項に記載の方法。
- 前記還元反応の間、タンパク質の濃度よりも約5倍〜約15倍高い濃度で還元剤を維持することを含む、請求項21に記載の方法。
- 前記還元反応の間、タンパク質の濃度よりも約5倍〜約10倍高い濃度で還元剤を維持することを含む、請求項21に記載の方法。
- 前記還元剤がシステインである、請求項21〜23のいずれか1項に記載の方法。
- 前記システインの濃度が、前記還元反応の間、0.5mM〜約1.5mMの濃度で維持される、請求項24に記載の方法。
- 前記キャップ副産物の濃度が、再キャッピングが改変されたシステイン残基のさらなる活性化を妨げる濃度以下で維持される、請求項1〜25のいずれか1項に記載の方法。
- 前記未キャップの改変されたシステイン抗体調製物が、モノクローナル抗体調製物である、請求項6〜26のいずれか1項に記載の方法。
- 前記未キャップの改変されたシステイン抗体調製物から残留還元剤を除去する工程をさらに含む、請求項6〜27のいずれか1項に記載の方法。
- 前記タンパク質調製物を精製する工程をさらに含む、請求項1〜28のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項6〜29のいずれか1項に記載の方法に従って調製される未キャップの抗体調製物。
- 抗体−薬剤複合体を形成するのに十分な条件下で、未キャップ抗体と薬物−リンカー化合物とを組合せることをさらに含む、請求項6〜29のいずれか1項に記載の方法。
- 前記抗体−薬剤複合体の平均薬物負荷が、抗体当たり約4の薬物部分である、請求項31に記載の方法。
- 前記抗体−薬剤複合体の平均薬物負荷が、抗体当たり約3.6〜4.2の薬物部分である、請求項31に記載の方法。
- 前記抗体−薬剤複合体の平均薬物負荷が、抗体当たり約2の薬物部分である、請求項31に記載の方法。
- 前記抗体−薬剤複合体の平均薬物負荷が、抗体当たり約1.5〜2.2の薬物部分である、請求項31に記載の方法。
- 前記抗体−薬物複合体が、溶液中に存在する、請求項31〜35のいずれか1項に記載の方法。
- 改変されたシステイン抗体の改変されたシステイン残基の選択的活性化方法であって、前記方法が、以下のステップ:
(a)改変されたシステイン抗体と緩衝液との混合物をダイアフィルトレートし;
(b)前記混合物に還元剤を、(b)の前、前記改変されたシステイン抗体に存在する実質的にすべての鎖間ジスルフィド結合を保持しながら、利用可能な改変されたシステイン残基の一部を活性化する濃度及び速度で添加し;そして
(c)工程(b)の間、前記混合物のダイアフィルトレーションを維持して、改変されたシステイン残基を選択的に活性化することを含む、方法。 - 前記改変されたシステイン残基の少なくとも60%が活性化される、請求項37に記載の方法。
- 前記改変されたシステイン残基の少なくとも75%が活性化される、請求項37に記載の方法。
- 前記鎖間ジスルフィド結合の約20%未満(好ましくは、15%未満、又は10%未満)が、一対の遊離チオールに変換される、請求項37、38又は39に記載の方法。
- 前記改変されたシステイン残基の少なくとも75%が活性化され、そして前記鎖間ジスルフィド結合の20%未満(好ましくは、15%未満、又は10%未満)が一対の遊離チオールに変換される、請求項37に記載の方法。
- 前記還元剤がシステインである、請求項37〜41のいずれか1項に記載の方法。
- 前記還元剤がシステインであり、前記改変されたシステイン残基の少なくとも75%が活性化され、そして前記鎖間ジスルフィド結合の20%未満(好ましくは、15%未満、又は10%未満)が一対の遊離チオールに変換される、請求項37に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201461938378P | 2014-02-11 | 2014-02-11 | |
US61/938,378 | 2014-02-11 | ||
PCT/US2015/015369 WO2015123265A1 (en) | 2014-02-11 | 2015-02-11 | Selective reduction of proteins |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2020094209A Division JP2020143145A (ja) | 2014-02-11 | 2020-05-29 | タンパク質の選択的還元 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2017506262A true JP2017506262A (ja) | 2017-03-02 |
JP6713931B2 JP6713931B2 (ja) | 2020-06-24 |
Family
ID=53800577
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016568485A Active JP6713931B2 (ja) | 2014-02-11 | 2015-02-11 | タンパク質の選択的還元 |
JP2020094209A Withdrawn JP2020143145A (ja) | 2014-02-11 | 2020-05-29 | タンパク質の選択的還元 |
JP2022125651A Pending JP2022153663A (ja) | 2014-02-11 | 2022-08-05 | タンパク質の選択的還元 |
Family Applications After (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2020094209A Withdrawn JP2020143145A (ja) | 2014-02-11 | 2020-05-29 | タンパク質の選択的還元 |
JP2022125651A Pending JP2022153663A (ja) | 2014-02-11 | 2022-08-05 | タンパク質の選択的還元 |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US10464997B2 (ja) |
EP (2) | EP4190809A1 (ja) |
JP (3) | JP6713931B2 (ja) |
KR (2) | KR102532137B1 (ja) |
CN (3) | CN106456725B9 (ja) |
CA (2) | CA3211226A1 (ja) |
HK (1) | HK1231400A1 (ja) |
MX (2) | MX2016010295A (ja) |
WO (1) | WO2015123265A1 (ja) |
Families Citing this family (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105848671B (zh) | 2013-08-28 | 2019-12-13 | 艾伯维施特姆森特克斯有限责任公司 | 位点特异性抗体缀合方法和组合物 |
PE20160870A1 (es) | 2013-11-06 | 2016-09-09 | Abbvie Stemcentrx Llc | Anticuerpos anti-claudina novedosos y metodos de uso |
CN109575136A (zh) | 2013-12-12 | 2019-04-05 | 艾伯维施特姆森特克斯有限责任公司 | 新型抗dpep3抗体和使用方法 |
KR102532137B1 (ko) | 2014-02-11 | 2023-05-12 | 씨젠 인크. | 단백질의 선택적 환원 |
MX2016010677A (es) | 2014-02-21 | 2017-04-10 | Abbvie Stemcentrx Llc | Conjugados de anticuerpos anti-drosophila similar a delta 3 (anti-dll3) y medicamentos para usarse en el tratamiento contra melanoma. |
TW201617368A (zh) | 2014-09-05 | 2016-05-16 | 史坦森特瑞斯公司 | 新穎抗mfi2抗體及使用方法 |
LT3268047T (lt) * | 2015-03-09 | 2023-11-10 | Heidelberg Pharma Research Gmbh | Amatoksino-antikūno konjugatai |
SG11201809830WA (en) | 2016-02-12 | 2018-12-28 | Synthon Biopharmaceuticals Bv | Selective reduction of cysteine-engineered antibodies |
US20190127476A1 (en) * | 2016-05-06 | 2019-05-02 | Abbvie Stemcentrx Llc | Novel anti-tnfrsf21 antibodies and methods of use |
CA3041533A1 (en) * | 2016-11-07 | 2018-05-11 | Seattle Genetics, Inc. | Distribution of engineered-cysteine caps |
BR112019015044A2 (pt) * | 2017-02-08 | 2020-03-10 | Pfizer Inc. | Processo de produção em grande escala para cisteínas de anticorpo capeadas e não capeadas e seu uso na conjugação de proteínas terapêuticas |
CN107247144B (zh) * | 2017-05-16 | 2019-12-24 | 上海科华生物工程股份有限公司 | 一种预处理丙肝抗原的方法和检测试剂盒 |
RU2771310C2 (ru) * | 2017-05-23 | 2022-04-29 | Байондис Б. В. | Способ двойной конъюгации для получения конъюгатов антитело-лекарственное средство |
EP3661562A1 (en) * | 2017-08-04 | 2020-06-10 | Amgen Inc. | Method of conjugation of cys-mabs |
CN107746424A (zh) * | 2017-10-30 | 2018-03-02 | 上海药明生物技术有限公司 | 一种IgG4抗体的生物偶联方法 |
EP3924378A4 (en) | 2019-02-15 | 2023-04-05 | WuXi Biologics Ireland Limited | METHODS FOR THE PRODUCTION OF ANTIBODY-DRUG CONJUGATES WITH IMPROVED HOMOGENEITY |
CN113189184B (zh) * | 2021-04-28 | 2022-09-09 | 浙江大学 | 含有半胱氨酸的毛细管凝胶电泳样品缓冲液 |
WO2023167564A1 (ko) * | 2022-03-04 | 2023-09-07 | 앱티스 주식회사 | 티올 반응성 에디티브를 이용한 항체-약물 컨쥬게이트의 제조 수율을 높이는 방법 |
CN114878728A (zh) * | 2022-05-06 | 2022-08-09 | 浙江大学 | 一种新型的抗体肽图检测还原方法 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008544976A (ja) * | 2005-07-06 | 2008-12-11 | ユセベ ファルマ ソシエテ アノニム | タンパク質にエフェクター分子を結合させる方法 |
JP2011509675A (ja) * | 2008-01-18 | 2011-03-31 | メディミューン,エルエルシー | 部位特異的コンジュゲーションのためのシステイン操作抗体 |
Family Cites Families (31)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB8308235D0 (en) | 1983-03-25 | 1983-05-05 | Celltech Ltd | Polypeptides |
US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
GB8720833D0 (en) | 1987-09-04 | 1987-10-14 | Celltech Ltd | Recombinant dna product |
US5530101A (en) | 1988-12-28 | 1996-06-25 | Protein Design Labs, Inc. | Humanized immunoglobulins |
EP1690935A3 (en) | 1990-01-12 | 2008-07-30 | Abgenix, Inc. | Generation of xenogeneic antibodies |
US6111166A (en) | 1994-09-19 | 2000-08-29 | Medarex, Incorporated | Transgenic mice expressing human Fcα and β receptors |
GB9422383D0 (en) * | 1994-11-05 | 1995-01-04 | Wellcome Found | Antibodies |
US6130237A (en) | 1996-09-12 | 2000-10-10 | Cancer Research Campaign Technology Limited | Condensed N-aclyindoles as antitumor agents |
US20030083263A1 (en) | 2001-04-30 | 2003-05-01 | Svetlana Doronina | Pentapeptide compounds and uses related thereto |
US6884869B2 (en) | 2001-04-30 | 2005-04-26 | Seattle Genetics, Inc. | Pentapeptide compounds and uses related thereto |
US20030105017A1 (en) * | 2001-07-10 | 2003-06-05 | Gregory Conn | Purification of human Troponin I |
DK1545613T3 (da) | 2002-07-31 | 2011-11-14 | Seattle Genetics Inc | Auristatinkonjugater og deres anvendelse til behandling af cancer, en autoimmun sygdom eller en infektiøs sygdom |
US8088387B2 (en) | 2003-10-10 | 2012-01-03 | Immunogen Inc. | Method of targeting specific cell populations using cell-binding agent maytansinoid conjugates linked via a non-cleavable linker, said conjugates, and methods of making said conjugates |
DK1725249T3 (en) | 2003-11-06 | 2014-03-17 | Seattle Genetics Inc | Monomethylvaline compounds capable of conjugating to ligands. |
RU2402548C2 (ru) | 2004-05-19 | 2010-10-27 | Медарекс, Инк. | Химические линкеры и их конъюгаты |
KR101270829B1 (ko) | 2004-09-23 | 2013-06-07 | 제넨테크, 인크. | 시스테인 유전자조작 항체 및 접합체 |
DK1871418T3 (da) | 2005-04-19 | 2014-06-10 | Seattle Genetics Inc | Humaniserede anti-cd70-bindende midler og anvendelser deraf |
EP1893632B1 (en) | 2005-06-17 | 2015-08-12 | Novo Nordisk Health Care AG | Selective reduction and derivatization of engineered factor vii proteins comprising at least one non-native cysteine |
US8343928B2 (en) | 2005-07-07 | 2013-01-01 | Seattle Genetics, Inc. | Monomethylvaline compounds having phenylalanine side-chain replacements at the C-terminus |
WO2007008848A2 (en) | 2005-07-07 | 2007-01-18 | Seattle Genetics, Inc. | Monomethylvaline compounds having phenylalanine carboxy modifications at the c-terminus |
ES2374964T3 (es) | 2006-01-25 | 2012-02-23 | Sanofi | Agentes citotóxicos que comprenden nuevos derivados de tomaimicina. |
WO2008025020A2 (en) | 2006-08-25 | 2008-02-28 | Seattle Genetics, Inc. | Cd30 binding agents and uses thereof |
PT2211904T (pt) | 2007-10-19 | 2016-11-02 | Seattle Genetics Inc | Agentes de ligação a cd19 e seus usos |
ES2647927T3 (es) | 2008-03-18 | 2017-12-27 | Seattle Genetics, Inc. | Conjugados enlazadores del fármaco auriestatina |
AU2010210646B2 (en) | 2009-02-05 | 2015-10-29 | Immunogen, Inc. | Novel benzodiazepine derivatives |
FR2949469A1 (fr) | 2009-08-25 | 2011-03-04 | Sanofi Aventis | Derives anticancereux, leur preparation et leur application en therapeutique |
GB0920127D0 (en) | 2009-11-17 | 2009-12-30 | Ucb Pharma Sa | Antibodies |
JP6014596B2 (ja) * | 2010-11-09 | 2016-10-25 | メディミューン,エルエルシー | 均一コンジュゲーションのための抗体足場 |
SI2675479T1 (sl) | 2011-02-15 | 2016-04-29 | Immunogen, Inc. | Citotoksični derivati benzodiazepina |
US20130309223A1 (en) | 2012-05-18 | 2013-11-21 | Seattle Genetics, Inc. | CD33 Antibodies And Use Of Same To Treat Cancer |
KR102532137B1 (ko) | 2014-02-11 | 2023-05-12 | 씨젠 인크. | 단백질의 선택적 환원 |
-
2015
- 2015-02-11 KR KR1020167022728A patent/KR102532137B1/ko active IP Right Grant
- 2015-02-11 CA CA3211226A patent/CA3211226A1/en active Pending
- 2015-02-11 CN CN201580008306.4A patent/CN106456725B9/zh active Active
- 2015-02-11 KR KR1020237015699A patent/KR20230088389A/ko not_active Application Discontinuation
- 2015-02-11 JP JP2016568485A patent/JP6713931B2/ja active Active
- 2015-02-11 WO PCT/US2015/015369 patent/WO2015123265A1/en active Application Filing
- 2015-02-11 CA CA2938450A patent/CA2938450C/en active Active
- 2015-02-11 CN CN202010117289.0A patent/CN111187348A/zh active Pending
- 2015-02-11 CN CN202110215052.0A patent/CN112979786A/zh active Pending
- 2015-02-11 MX MX2016010295A patent/MX2016010295A/es active IP Right Grant
- 2015-02-11 EP EP22202155.2A patent/EP4190809A1/en active Pending
- 2015-02-11 EP EP15749202.6A patent/EP3104881A4/en not_active Withdrawn
- 2015-02-11 US US15/117,254 patent/US10464997B2/en active Active
-
2016
- 2016-08-09 MX MX2020002791A patent/MX2020002791A/es unknown
-
2017
- 2017-05-22 HK HK17105164.0A patent/HK1231400A1/zh unknown
-
2019
- 2019-09-24 US US16/580,290 patent/US11667696B2/en active Active
-
2020
- 2020-05-29 JP JP2020094209A patent/JP2020143145A/ja not_active Withdrawn
-
2022
- 2022-08-05 JP JP2022125651A patent/JP2022153663A/ja active Pending
-
2023
- 2023-04-26 US US18/139,592 patent/US20230391848A1/en active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008544976A (ja) * | 2005-07-06 | 2008-12-11 | ユセベ ファルマ ソシエテ アノニム | タンパク質にエフェクター分子を結合させる方法 |
JP2011509675A (ja) * | 2008-01-18 | 2011-03-31 | メディミューン,エルエルシー | 部位特異的コンジュゲーションのためのシステイン操作抗体 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
MX2016010295A (es) | 2016-10-17 |
EP4190809A1 (en) | 2023-06-07 |
CN106456725B9 (zh) | 2022-08-09 |
JP2022153663A (ja) | 2022-10-12 |
WO2015123265A1 (en) | 2015-08-20 |
US20160347824A1 (en) | 2016-12-01 |
US20200115438A1 (en) | 2020-04-16 |
CN106456725A (zh) | 2017-02-22 |
CN111187348A (zh) | 2020-05-22 |
KR20160136289A (ko) | 2016-11-29 |
CN106456725B (zh) | 2021-03-12 |
EP3104881A1 (en) | 2016-12-21 |
EP3104881A4 (en) | 2017-09-27 |
KR102532137B1 (ko) | 2023-05-12 |
US11667696B2 (en) | 2023-06-06 |
CA2938450A1 (en) | 2015-08-20 |
HK1231400A1 (zh) | 2017-12-22 |
CA2938450C (en) | 2023-10-17 |
US10464997B2 (en) | 2019-11-05 |
CA3211226A1 (en) | 2015-08-20 |
JP6713931B2 (ja) | 2020-06-24 |
MX2020002791A (es) | 2020-07-22 |
US20230391848A1 (en) | 2023-12-07 |
KR20230088389A (ko) | 2023-06-19 |
JP2020143145A (ja) | 2020-09-10 |
CN112979786A (zh) | 2021-06-18 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11667696B2 (en) | Selective reduction of proteins | |
JP2023052645A (ja) | 薬剤の少なくとも1つのトリスルフィド結合を含むタンパク質中のチオール部分へのコンジュゲーション方法 | |
TWI763732B (zh) | 工程化半胱胺酸帽之分佈 | |
JP2017526652A5 (ja) |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20180126 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20181218 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20190313 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190520 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20190806 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20191025 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200206 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20200407 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20200507 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20200604 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6713931 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |