JP2017214337A - Muscular dystrophy treating agents - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、筋ジストロフィー治療剤に関する。また本発明は、筋ジストロフィーの診断薬に関する。さらに本発明は、筋ジストロフィーの治療薬候補のスクリーニング方法に関する。 The present invention relates to a therapeutic agent for muscular dystrophy. The present invention also relates to a diagnostic agent for muscular dystrophy. Furthermore, the present invention relates to a method for screening a therapeutic drug candidate for muscular dystrophy.
筋ジストロフィーは進行性に全身の筋萎縮と筋力低下を引き起こす遺伝性疾患の総称である。筋ジストロフィーは、ジストロフィン遺伝子変異で発症し、デュシェンヌ（Duchenne）型筋ジストロフィー（DMD）とその軽症型であるベッカー（Becker）型筋ジストロフィー（BMD）がある。DMDの筋細胞膜はジストロフィンが欠失していることにより脆弱で細胞外からのCa2+流入の影響を受けやすく、この細胞質へのCa2+流入は慢性炎症や進行性の再生不良、線維化を惹起する。Ca2+の流入は細胞膜の脆弱性だけでなく、ストレッチ活性化チャネル（stretch-activated channels）、Ca2漏出チャネル、漏出性Ca2+放出チャネルも原因として考えられ、ジストロフィン欠失による細胞内のCa2+ ([Ca2+]i)異常がDMDの発症原因として考えられている。 Muscular dystrophy is a collective term for inherited diseases that cause progressive generalized muscle atrophy and weakness. Muscular dystrophy is caused by mutations in the dystrophin gene, and includes Duchenne muscular dystrophy (DMD) and its mild form Becker muscular dystrophy (BMD). The DMD muscle cell membrane is fragile due to the lack of dystrophin and is susceptible to Ca 2+ influx from the outside of the cell, and this Ca 2+ influx into the cytoplasm is caused by chronic inflammation, progressive poor regeneration, and fibrosis To provoke. Ca 2+ influx is thought to be caused not only by the vulnerability of cell membranes but also by stretch-activated channels, Ca 2 leakage channels, and leaking Ca 2+ release channels. Ca 2+ ([Ca 2+ ] i ) abnormality is considered as the cause of DMD.
一方、DMDとBMDのような病態の重症度と[Ca2+]i濃度との関係は不明である。また、ジストロフィン遺伝子のエキソン45-55の欠失によって、骨格筋の病状が軽く、軽症のBMDとなるという報告がある（非特許文献１）が、その具体的な機構は不明である。 On the other hand, the relationship between the severity of pathological conditions such as DMD and BMD and the [Ca 2+ ] i concentration is unknown. In addition, there is a report that deletion of exon 45-55 of the dystrophin gene results in a mild skeletal muscle condition and mild BMD (Non-Patent Document 1), but the specific mechanism is unknown.
本発明は、筋ジストロフィー、特に重症型の筋ジストロフィーを治療又は診断するための方法及び手段を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a method and means for treating or diagnosing muscular dystrophy, particularly severe muscular dystrophy.
本発明者は、野生型マウス、ジストロフィン遺伝子エクソン45-55を欠失したBMDモデルマウス（Tg/mdxマウス）及びDMDモデルマウス（mdxマウス）の[Ca2+]i動態を比較することにより、DMD病態における[Ca2+]iを調節する分子を同定し、この分子を標的とした[Ca2+]i動態制御によるDMDに対する新たな治療法の開発を目指した。その結果、重症型のmdxマウスではサルコリピンレベルが高いのに対し、より軽症なTg/mdxマウスではサルコリピンレベルが野生型に類似していたことから、サルコリピンを標的として筋ジストロフィーを治療することができ、さらに重症型の筋ジストロフィーを診断できるという知見を得た。また、その過程においてリアノジン受容体アイソフォーム1（RyR1）の機能と筋小胞体/小胞体Ca2+-ATPアーゼ（SERCA）の活性の正常化が筋ジストロフィーの病態に重要であることを突き止め、SERCA活性を改善し、RyR1機能を改善する因子が筋ジストロフィーの治療薬候補となりうるという知見も得た。これらの知見から本発明を完成するに至った。 By comparing the [Ca 2+ ] i kinetics of wild-type mice, BMD model mice lacking the dystrophin gene exon 45-55 (Tg / mdx mice) and DMD model mice (mdx mice), We identified a molecule that regulates [Ca 2+ ] i in DMD pathology, and aimed to develop a new therapeutic method for DMD by controlling [Ca 2+ ] i kinetics targeting this molecule. As a result, severe mdx mice had high sarcolipin levels, while milder Tg / mdx mice had similar sarcolipin levels to wild-type, so muscular dystrophy could be treated with sarcolipin as a target. I was able to diagnose more severe muscular dystrophy. In this process, we also determined that normalization of ryanodine receptor isoform 1 (RyR1) function and sarcoplasmic reticulum / endoplasmic reticulum Ca 2+ -ATPase (SERCA) activity is important for the pathogenesis of muscular dystrophy. It was also found that factors that improve activity and improve RyR1 function could be therapeutic candidates for muscular dystrophy. These findings have led to the completion of the present invention.
すなわち本発明は以下の実施形態を包含する。
[1] サルコリピン阻害剤を有効成分として含むことを特徴とする筋ジストロフィー治療剤。
[2] サルコリピン阻害剤が、サルコリピンを阻害する化合物、サルコリピンをコードする遺伝子に対するsiRNA、miRNA及びアンチセンス核酸、抗サルコリピン抗体、並びにサルコリピンに対するアプタマーからなる群より選択される少なくとも1種である、[1]に記載の治療剤。
[2-1] サルコリピン阻害剤が、配列番号2又は3に示される塩基配列を含むsiRNAである、[1]に記載の治療剤。
[3] サンプルにおけるサルコリピンの発現を測定するための手段を含むことを特徴とする筋ジストロフィー診断薬。
[4] 測定手段がDNAプライマー及び／又はDNAプローブである、[3]に記載の診断薬。
[5] 測定手段が抗体である、[3]に記載の診断薬。
[6] サンプルが、筋サンプル、血液サンプル、血清サンプル及び体液サンプルからなる群より選択される、[3]〜[5]のいずれかに記載の診断薬。
[7] 筋ジストロフィーの診断が、筋ジストロフィーの保因の判定、筋ジストロフィーの重症度の判定又は筋ジストロフィーの重症化の予測である、[3]〜[6]のいずれかに記載の診断薬。
[8] 筋ジストロフィーの治療薬候補のスクリーニング方法であって、
被験物質又は因子の存在下にて、ジストロフィンを欠損する筋細胞における筋小胞体/小胞体Ca2+-ATPアーゼ（SERCA）の活性を測定するステップ、
被験物質又は因子の不在下におけるジストロフィンを欠損する筋細胞と比較してSERCAの活性が改善した場合に、上記被験物質又は因子を筋ジストロフィーの治療薬候補として同定するステップ
を含む方法。
[9] SERCAの活性を、リアノジン受容体アイソフォーム1（RyR1）アゴニストによる刺激後の筋小胞体へのCa2+再取り込み時間により測定する、[8]に記載の方法。
[10] 被験物質又は因子の存在下にて、ジストロフィンを欠損する筋細胞におけるリアノジン受容体アイソフォーム1（RyR1）の応答性を測定するステップ、
被験物質又は因子の不在下におけるジストロフィンを欠損する筋細胞と比較してRyR1の応答性が改善した場合に、上記被験物質又は因子を筋ジストロフィーの治療薬候補として同定するステップ
をさらに含む、[8]又は[9]に記載の方法。
[11] RyR1の応答性をRyR1アゴニストによる刺激後の細胞質Ca2+濃度により測定する、[10]に記載の方法。
[12] RyR1アゴニストがカフェインである、[9]又は[11]に記載の方法。
[13] 上記筋ジストロフィーの治療薬候補を筋ジストロフィー発症動物又は筋ジストロフィー保因動物に投与し、筋ジストロフィーの病態の変化を観察するステップをさらに含む、[8]〜[12]のいずれかに記載の方法。
[14] サルコリピン阻害剤を対象に投与することを含む、筋ジストロフィーの治療方法。
[15] 対象に由来するサンプルにおいてサルコリピンの発現を測定することを含む、対象における筋ジストロフィーを判定する方法。
That is, the present invention includes the following embodiments.
[1] A therapeutic agent for muscular dystrophy comprising a sarcolipin inhibitor as an active ingredient.
[2] The sarcolipin inhibitor is at least one selected from the group consisting of a compound that inhibits sarcolipin, a siRNA against a gene encoding sarcolipin, a miRNA and an antisense nucleic acid, an anti-sarcolipin antibody, and an aptamer against sarcolipine, [1] The therapeutic agent according to [1].
[2-1] The therapeutic agent according to [1], wherein the sarcolipin inhibitor is an siRNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 3.
[3] A diagnostic agent for muscular dystrophy comprising a means for measuring the expression of sarcolipin in a sample.
[4] The diagnostic agent according to [3], wherein the measuring means is a DNA primer and / or a DNA probe.
[5] The diagnostic agent according to [3], wherein the measuring means is an antibody.
[6] The diagnostic agent according to any one of [3] to [5], wherein the sample is selected from the group consisting of a muscle sample, a blood sample, a serum sample, and a body fluid sample.
[7] The diagnostic agent according to any one of [3] to [6], wherein the diagnosis of muscular dystrophy is determination of carrier of muscular dystrophy, determination of severity of muscular dystrophy, or prediction of muscular dystrophy.
[8] A screening method for drug candidates for muscular dystrophy,
Measuring the activity of sarcoplasmic reticulum / endoplasmic reticulum Ca 2+ -ATPase (SERCA) in dystrophin-deficient myocytes in the presence of a test substance or factor;
A method comprising the step of identifying the test substance or factor as a therapeutic drug candidate for muscular dystrophy when the activity of SERCA is improved as compared with a myocyte deficient in dystrophin in the absence of the test substance or factor.
[9] The method according to [8], wherein the activity of SERCA is measured by a Ca 2+ reuptake time into the sarcoplasmic reticulum after stimulation with a ryanodine receptor isoform 1 (RyR1) agonist.
[10] measuring the responsiveness of ryanodine receptor isoform 1 (RyR1) in dystrophin-deficient muscle cells in the presence of a test substance or factor;
Further comprising identifying the test substance or factor as a therapeutic candidate for muscular dystrophy when RyR1 responsiveness is improved as compared to a dystrophin-deficient myocyte in the absence of the test substance or factor, [8] Or the method as described in [9].
[11] The method according to [10], wherein RyR1 responsiveness is measured by a cytoplasmic Ca 2+ concentration after stimulation with a RyR1 agonist.
[12] The method according to [9] or [11], wherein the RyR1 agonist is caffeine.
[13] The method according to any one of [8] to [12], further comprising the step of administering the muscular dystrophy therapeutic drug candidate to a muscular dystrophy-onset animal or a muscular dystrophy carrier animal and observing a change in the pathological condition of the muscular dystrophy.
[14] A method for treating muscular dystrophy, comprising administering a sarcolipin inhibitor to a subject.
[15] A method for determining muscular dystrophy in a subject, comprising measuring sarcolipin expression in a sample derived from the subject.
本発明に係る筋ジストロフィー治療剤は、筋ジストロフィー、特に重症型のDMDを効果的に改善することができるものである。また本発明に係る筋ジストロフィー診断薬により、筋ジストロフィーの重症度を判定し又は重症化を予測することが可能となる。さらに本発明に係るスクリーニング方法により、筋ジストロフィーの治療薬候補を同定することができ、筋ジストロフィー治療法又は発症の予防法の開発に有用である。従って、本発明は、医療、薬学、リハビリテーションなどの分野において有用である。 The therapeutic agent for muscular dystrophy according to the present invention can effectively improve muscular dystrophy, particularly severe DMD. In addition, the diagnostic agent for muscular dystrophy according to the present invention makes it possible to determine the severity of muscular dystrophy or predict its severity. Furthermore, the screening method according to the present invention can identify a therapeutic drug candidate for muscular dystrophy, which is useful for developing a muscular dystrophy treatment method or a method for preventing the onset. Therefore, the present invention is useful in fields such as medicine, pharmacy, and rehabilitation.
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明者により作出された、ジストロフィン遺伝子エクソン45-55を欠失したBMDモデルマウス（Tg/mdxマウス）は、筋細胞膜の安定性、筋病理所見、筋機能に関して、DMDモデルマウス（mdxマウス）と比較して野生型マウスと遜色のないレベルまで回復していた。そこで、野生型マウス、ジストロフィン遺伝子エクソン45-55を欠失したBMDモデルマウス（Tg/mdxマウス）及びDMDモデルマウス（mdxマウス）の[Ca2+]i動態を比較することにより、DMD病態における[Ca2+]iを調節する分子を同定し、この分子を標的とした[Ca2+]i動態制御によるDMDに対する新たな治療法の開発を目指した。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
A BMD model mouse (Tg / mdx mouse) lacking the dystrophin gene exon 45-55 produced by the present inventor is a DMD model mouse (mdx mouse) with respect to the stability of myocyte membrane, myopathological findings, and muscle function. Compared with the wild type mouse, it recovered to a level comparable to that of the wild type mouse. Therefore, by comparing the [Ca 2+ ] i dynamics of wild-type mice, BMD model mice (Tg / mdx mice) and DMD model mice (mdx mice) lacking the dystrophin gene exon 45-55, identify molecules that modulate [Ca 2+] i, aimed at the development of new treatments of this molecule for DMD by targeting [Ca 2+] i dynamics control.
ジストロフィン糖タンパク質複合体に含まれる一酸化窒素合成酵素(nNOS)は通常ジストロフィンのエキソン42-45領域に直接結合し細胞膜に局在するものの、Tg/mdxマウスでは野生型マウスと異なりnNOSが細胞質に局在していた。このことはnNOSの結合領域を一部欠くためと考えられる。一方、mdxマウスは、ジストロフィン欠失に伴い細胞膜に局在できなくなったnNOSやマクロファージ等の浸潤細胞由来のiNOSが産生するNOが筋小胞体(SR)のリアノジン受容体(RyR1)をニトロシル化し、RyR1が漏出性になることで[Ca2+]i濃度が恒常的に高い。そこで、Tg/mdxマウスについて検討すると、mdxマウスと同程度RyR1がニトロシル化されていた。一方、Tg/mdxマウスの[Ca2+]i濃度は野生型マウスより高いものの、mdxマウスと比較すると低値で、両群の中間の値を示した。予想外にも、RyR1のアゴニストであるカフェインを用いてRyR1を刺激するとTg/mdxにおけるその応答性は、mdxより高く、野生型と同程度保たれていた。このようにTg/mdxはRyR1がmdxと同程度ニトロシル化されているものの[Ca2+]i濃度の上昇はmdxほどではなく、RyR1の機能もmdxとは異なり野生型と同レベル維持されていた。以上から、Tg/mdxとmdxとの間で細胞質からSRにCa2+を取り込む役割を担うSERCAの機能が異なることが推測される。実際、本発明者はカフェイン刺激後の細胞質に放出されたCa2+のSRへの再取り込み時間（SERCA活性の指標）を検討したところmdxではその時間が野生型と比較して長く、Tg/mdxでは野生型に近い値を示していた（実施例１、図1のB）。そこで、本発明者はmdxにおいてSERCA機能を抑制する分子としてサルコリピン（SLN）を同定した。SLNはSERCA機能を抑制的に制御することが知られており、その発現はmdxで野生型、Tg/mdxと比べて有意に高い（実施例２、図2）。このことがSERCA機能を低下させていると考えられる。続いて、siRNAを用いてmdx由来筋芽細胞のSLNの発現を抑制するとカフェイン刺激によるRyR1の応答性は回復し、その機能が回復すること（実施例３、図3）、SLN KO/mdxマウスを作出し筋機能を解析すると、mdxより筋機能が回復すること（実施例４、図4）が明らかとなった。 Nitric oxide synthase (nNOS) contained in the dystrophin glycoprotein complex normally binds directly to the exon 42-45 region of dystrophin and localizes to the cell membrane, but in the Tg / mdx mouse, nNOS is in the cytoplasm unlike the wild type mouse. It was localized. This is thought to be due to the lack of a part of the nNOS binding region. On the other hand, in mdx mice, NO produced by iNOS derived from infiltrating cells such as nNOS and macrophages that became unable to localize to the cell membrane due to dystrophin deletion nitrosylated ryanodine receptor (RyR1) of sarcoplasmic reticulum (SR), As RyR1 becomes leaky, the [Ca 2+ ] i concentration is constantly high. Therefore, when Tg / mdx mice were examined, RyR1 was nitrosylated to the same extent as mdx mice. On the other hand, although the [Ca 2+ ] i concentration of Tg / mdx mice was higher than that of wild-type mice, it was lower than that of mdx mice, indicating an intermediate value between both groups. Unexpectedly, when RyR1 was stimulated with caffeine, an agonist of RyR1, its responsiveness in Tg / mdx was higher than that of mdx, and was maintained at the same level as wild type. Thus Tg / mdx rise of [Ca 2+] i concentration although RyR1 is comparable nitrosylated and mdx is not enough mdx, it is also functions mdx Unlike wild-type and the same level maintaining RyR1 It was. From the above, it is speculated that the function of SERCA, which plays a role of taking Ca 2+ from the cytoplasm into SR, is different between Tg / mdx and mdx. In fact, the present inventor examined the reuptake time of Ca 2+ released into the cytoplasm after caffeine stimulation into SR (an index of SERCA activity), and in mdx, the time was longer than that of the wild type. In / mdx, a value close to the wild type was shown (Example 1, B in FIG. 1). Therefore, the present inventor has identified sarcolipin (SLN) as a molecule that suppresses SERCA function in mdx. SLN is known to suppress SERCA function in an inhibitory manner, and its expression is significantly higher in mdx than wild type and Tg / mdx (Example 2, FIG. 2). This is considered to reduce the SERCA function. Subsequently, suppression of SLN expression in mdx-derived myoblasts using siRNA restores the responsiveness of caffeine-stimulated RyR1, and restores its function (Example 3, Fig. 3), SLN KO / mdx When mice were created and muscle function was analyzed, it was revealed that muscle function was restored from mdx (Example 4, FIG. 4).
したがって、本発明は、一態様において、サルコリピン阻害剤を含む筋ジストロフィー治療剤に関する。本発明に関連して、「筋ジストロフィーの治療」とは、筋ジストロフィーの改善、例えば、症状の改善、発症若しくは進行の遅延を指す。筋ジストロフィーの症状としては、限定されるものではないが、筋力低下、筋委縮、運動能力の低下、歩行障害、心筋疾患などが含まれる。 Therefore, in one aspect, the present invention relates to a therapeutic agent for muscular dystrophy containing a sarcolipin inhibitor. In the context of the present invention, “treatment of muscular dystrophy” refers to amelioration of muscular dystrophy, eg, improvement of symptoms, delay of onset or progression. Symptoms of muscular dystrophy include, but are not limited to, muscle weakness, muscle atrophy, decreased exercise capacity, gait disturbance, myocardial disease, and the like.
本発明に係る筋ジストロフィー治療剤（以下、まとめ「本剤」ともいう）は、有効成分としてサルコリピン阻害剤を含むものである。有効成分であるサルコリピン阻害剤としては、サルコリピンを阻害することができる薬物又は因子であれば任意の薬物又は因子を用いることができる。好ましくは、本発明において使用するサルコリピン阻害剤は、筋細胞内のサルコリピンを阻害することができるものである。本発明において「サルコリピンの阻害」とは、サルコリピンの発現又は活性を阻害する、すなわち低減する、抑制する、排除する又は無効化することを指す。 The therapeutic agent for muscular dystrophy (hereinafter, also referred to as “this agent”) according to the present invention contains a sarcolipin inhibitor as an active ingredient. As the sarcolipin inhibitor which is an active ingredient, any drug or factor can be used as long as it is a drug or factor capable of inhibiting sarcolipine. Preferably, the sarcolipin inhibitor used in the present invention is capable of inhibiting sarcolipin in muscle cells. In the present invention, “inhibition of sarcolipin” refers to inhibiting, ie, reducing, suppressing, eliminating, or invalidating the expression or activity of sarcolipin.
サルコリピンとは、筋小胞体（SR）のCa2+ポンプ機能を調節するタンパク質である。その遺伝子及びタンパク質の配列情報も知られており、ヒトサルコリピン遺伝子はGenBankにアクセッション番号Gene ID: 6588として登録され、配列番号1に示される配列を有する。 Sarcolipin is a protein that regulates the Ca 2+ pump function of the sarcoplasmic reticulum (SR). The sequence information of the gene and protein is also known. The human sarcolipin gene is registered in GenBank as accession number Gene ID: 6588 and has the sequence shown in SEQ ID NO: 1.
サルコリピン阻害剤としては、限定されるものではないが、サルコリピン遺伝子の発現を阻害する手段、例えばアンチセンス核酸、RNAインターフェアランス（RNAi）を利用する方法（dsRNA、miRNA、siRNAなど）、及びタンパク質としてのサルコリピンの発現又は活性を阻害する手段、例えば化合物、抗体、アプタマーなどが挙げられる。 Sarcolipin inhibitors include, but are not limited to, means for inhibiting the expression of sarcolipin gene, for example, methods using antisense nucleic acid, RNA interference (RNAi) (dsRNA, miRNA, siRNA, etc.), and proteins Means for inhibiting the expression or activity of sarcolipin such as compounds, antibodies, aptamers and the like can be mentioned.
一実施形態において、サルコリピン阻害剤は、RNAiによってサルコリピン遺伝子の発現を効率的に阻害する二本鎖RNA（dsRNA）分子（例えばsiRNA、miRNAなど）を含む。具体的には、サルコリピン遺伝子に対するdsRNA分子又はサルコリピン遺伝子に対するdsRNA分子を発現可能な発現ベクターを使用することができ、サルコリピン遺伝子に対するdsRNA分子は、サルコリピン遺伝子（例えば配列番号1）の10〜100個の連続する塩基、好ましくは10〜50個の連続する塩基、より好ましくは10〜30個の連続する塩基を標的とする塩基配列を含むものである。好ましくは、サルコリピン遺伝子に対するdsRNA分子は、短鎖干渉RNA（siRNA）として短い塩基配列を含むものである。このようなdsRNA分子、例えばsiRNA分子の設計は、当技術分野で公知であり、当業者であればサルコリピン遺伝子の配列情報に基づいて適宜設計することができる。 In one embodiment, the sarcolipin inhibitor comprises a double stranded RNA (dsRNA) molecule (eg, siRNA, miRNA, etc.) that efficiently inhibits the expression of the sarcolipin gene by RNAi. Specifically, a dsRNA molecule for the sarcolipin gene or an expression vector capable of expressing a dsRNA molecule for the sarcolipin gene can be used, and the dsRNA molecule for the sarcolipin gene has 10 to 100 dsRNA molecules (for example, SEQ ID NO: 1). It comprises a base sequence that targets contiguous bases, preferably 10-50 contiguous bases, more preferably 10-30 contiguous bases. Preferably, the dsRNA molecule for the sarcolipin gene contains a short base sequence as a short interfering RNA (siRNA). The design of such dsRNA molecules, for example, siRNA molecules is known in the art, and those skilled in the art can appropriately design based on the sequence information of the sarcolipin gene.
別の実施形態において、サルコリピン阻害剤は、サルコリピン遺伝子に対するアンチセンス核酸を含む。具体的には、サルコリピン遺伝子に対するアンチセンス核酸又はサルコリピン遺伝子に対するアンチセンス核酸を発現可能な発現ベクターを使用することができ、サルコリピン遺伝子に対するアンチセンス核酸は、サルコリピン遺伝子（例えば配列番号1）又はその一部の配列に対して相補的な配列を含むものである。このようなアンチセンス核酸の設計は、当技術分野で公知であり、当業者であればサルコリピン遺伝子の配列情報に基づいて適宜設計することができる。 In another embodiment, the sarcolipin inhibitor comprises an antisense nucleic acid to the sarcolipin gene. Specifically, an expression vector capable of expressing an antisense nucleic acid against a sarcolipin gene or an antisense nucleic acid against a sarcolipin gene can be used, and the antisense nucleic acid against a sarcolipin gene is a sarcolipin gene (for example, SEQ ID NO: 1) or one of them. It includes a sequence complementary to the partial sequence. Such antisense nucleic acid design is known in the art, and those skilled in the art can appropriately design based on the sequence information of the sarcolipin gene.
さらなる実施形態において、サルコリピン阻害剤は、サルコリピンを阻害する化合物であり、例えばサルコリピンに結合する化合物、サルコリピンのSERCAに対するアフィニティを低下する化合物などが含まれる。そのような化合物としては、限定されるものではないが、アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、脂質、炭水化物（糖等）、ステロイド、グリコペプチド、糖タンパク質、プロテオグリカンなどが挙げられる。 In a further embodiment, the sarcolipin inhibitor is a compound that inhibits sarcolipin, including, for example, a compound that binds to sarcolipin, a compound that decreases the affinity of sarcolipin for SERCA, and the like. Such compounds include, but are not limited to, amino acids, peptides, oligopeptides, polypeptides, proteins, lipids, carbohydrates (such as sugars), steroids, glycopeptides, glycoproteins, proteoglycans and the like.
また別の実施形態において、サルコリピン阻害剤は、サルコリピンに対する抗体を含む。本明細書において「抗体」という用語は、抗原であるサルコリピンタンパク質又はその部分ペプチドに結合可能な抗体分子全体又はそのフラグメント（例えば、Fab、F(ab’)2フラグメント、Fvフラグメントなど）を意味する。抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよいし、さらにはヒト化又はキメラ抗体、一本鎖Fv（scFv）抗体、ドメイン抗体などであってもよい。抗サルコリピン抗体は、当業者であれば慣用的な手法に従って作製することができ、あるいは市販品としても入手可能である。 In yet another embodiment, the sarcolipin inhibitor comprises an antibody against sarcolipin. In the present specification, the term “antibody” means the whole antibody molecule or a fragment thereof (for example, Fab, F (ab ′) 2 fragment, Fv fragment, etc.) capable of binding to the antigen sarcolipin protein or a partial peptide thereof. To do. The antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, and may further be a humanized or chimeric antibody, a single chain Fv (scFv) antibody, a domain antibody, or the like. The anti-sarcolipin antibody can be prepared by a person skilled in the art according to a conventional technique, or can be obtained as a commercial product.
別の実施形態において、サルコリピン阻害剤は、サルコリピンに対するアプタマーである。アプタマーとは、被検物（本発明ではサルコリピン）と特異的に結合する分子を指す。例えば、アプタマーは、タンパク質アプタマー（抗体など）、ペプチドアプタマー、ペプチド核酸アプタマー、核酸アプタマー（DNA、RNA、DNA/RNAハイブリッド）などである。アプタマーは、例えば試験管内選抜（いわゆるin vitroセレクション又はin vitro進化）により得ることができ、一度得られた後は、当技術分野で公知のペプチド合成法又は核酸合成法を使用して作製することができる。 In another embodiment, the sarcolipin inhibitor is an aptamer to sarcolipin. An aptamer refers to a molecule that specifically binds to an analyte (in the present invention, sarcolipin). For example, the aptamer is a protein aptamer (such as an antibody), a peptide aptamer, a peptide nucleic acid aptamer, a nucleic acid aptamer (DNA, RNA, DNA / RNA hybrid), or the like. Aptamers can be obtained, for example, by in vitro selection (so-called in vitro selection or in vitro evolution), and once obtained, they can be prepared using peptide synthesis methods or nucleic acid synthesis methods known in the art. Can do.
なお、選択したサルコリピン阻害剤が好適な筋ジストロフィーの治療効果を有するか否かは、当技術分野で公知の方法により確認することができる。例えば、選択したサルコリピン阻害剤を対象（モデル動物など）に投与し、対象における筋ジストロフィーの発症、進行又は症状に影響を及ぼすか否かを判定することによって筋ジストロフィーの治療効果を確認することができる。より具体的には、例えば対象の筋重量、筋断面積、単離骨格筋の張力、筋力（例えば握力）、運動能力（例えばトレッドミル能力）などを測定することによって、筋ジストロフィーの治療効果を確認することができる。 Whether or not the selected sarcolipin inhibitor has a suitable therapeutic effect on muscular dystrophy can be confirmed by methods known in the art. For example, the therapeutic effect of muscular dystrophy can be confirmed by administering a selected sarcolipin inhibitor to a subject (such as a model animal) and determining whether it affects the onset, progression or symptoms of muscular dystrophy in the subject. More specifically, the therapeutic effect of muscular dystrophy is confirmed by measuring the muscle weight, muscle cross-sectional area, isolated skeletal muscle tension, muscle strength (eg grip strength), exercise ability (eg treadmill ability), etc. can do.
本剤は、有効成分として、1種のサルコリピン阻害剤を含有するものであってもよいし、又は2種以上のサルコリピン阻害剤を組み合わせて含有するものであってもよい。本剤は、サルコリピン阻害剤から選択される少なくとも1種の薬物又は因子を有効成分として含有する限り、上述した筋ジストロフィー治療効果を発揮する。 This agent may contain one sarcolipine inhibitor as an active ingredient, or may contain two or more sarcolipine inhibitors in combination. As long as at least one drug or factor selected from sarcolipin inhibitors is contained as an active ingredient, this agent exhibits the above-described muscular dystrophy treatment effect.
本剤は、有効成分であるサルコリピン阻害剤の他、薬学的に許容される担体又は添加物を共に含むものであってもよい。このような担体及び添加物の例として、水、薬学的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトースなどが挙げられる。使用される添加物は、剤形に応じて上記の中から適宜又は組み合わせて選択される。 This agent may contain a pharmaceutically acceptable carrier or additive in addition to the sarcolipin inhibitor which is an active ingredient. Examples of such carriers and additives include water, pharmaceutically acceptable organic solvents, collagen, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, carboxyvinyl polymer, sodium alginate, water-soluble dextran, sodium carboxymethyl starch, pectin, xanthan gum, Examples include gum arabic, casein, gelatin, agar, glycerin, propylene glycol, polyethylene glycol, petrolatum, paraffin, stearyl alcohol, stearic acid, human serum albumin, mannitol, sorbitol, and lactose. The additive to be used is appropriately or in combination selected from the above depending on the dosage form.
本剤を経口投与する場合は、錠剤、カプセル剤（硬カプセル剤、軟カプセル剤、マイクロカプセルなど）、顆粒剤、散剤、丸剤、トローチ剤、内用水剤、液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤などのいずれのものであってもよく、使用する際に再溶解させる乾燥製剤にしてもよい。また、本剤を非経口投与する場合は、例えば静脈内注射（点滴を含む）、筋肉内注射、腹腔内注射及び皮下注射用の注射剤（例えば溶液、乳剤、懸濁剤）、軟膏剤、クリーム剤、座剤、パップ剤、吸入剤、リニメント剤、エアゾル剤などの外用剤などの製剤形態を選択することができ、注射剤の場合は単位用量アンプル又は多用量容器の状態で提供される。 When this drug is administered orally, tablets, capsules (hard capsules, soft capsules, microcapsules, etc.), granules, powders, pills, troches, liquids for internal use, solutions, suspensions, emulsions, Any of syrups and the like may be used, and it may be a dry preparation which is redissolved when used. When this agent is administered parenterally, for example, intravenous injection (including infusion), intramuscular injection, intraperitoneal injection and subcutaneous injection (eg, solution, emulsion, suspension), ointment, Formulation forms such as creams, suppositories, cataplasms, inhalants, liniments, aerosols and other external preparations can be selected. In the case of injections, they are provided in the form of unit dose ampoules or multi-dose containers .
例えばサルコリピン阻害剤として核酸分子（例えば、siRNAなどのdsRNA、アンチセンス核酸など）を使用する場合には、サルコリピン阻害剤は、ex vivo（例えば、対象に由来する細胞を核酸分子又はそれを発現する発現ベクターと共に培養する）、あるいは、in vivo（例えば、核酸分子又は発現ベクターを対象に投与する）で投与することができる。 For example, when a nucleic acid molecule (eg, dsRNA such as siRNA, antisense nucleic acid, etc.) is used as a sarcolipin inhibitor, the sarcolipin inhibitor expresses the nucleic acid molecule or a cell derived from a subject ex vivo (eg, a subject-derived cell). Cultured with an expression vector) or in vivo (eg, administering a nucleic acid molecule or expression vector to a subject).
核酸分子（例えば、siRNAなどのdsRNA、アンチセンス核酸など）は、種々の公知の投与方法により標的部位（筋細胞など）に送達することができる。例えば、dsRNAは、dsRNAを発現可能な発現ベクターを用いて送達しうる。本発明において用いることができる発現ベクターの例としては、限定されるものではないが、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、及びレトロウイルスなどのRNAウイルスが挙げられる。 Nucleic acid molecules (eg, dsRNA such as siRNA, antisense nucleic acid, etc.) can be delivered to a target site (such as muscle cells) by various known administration methods. For example, dsRNA can be delivered using an expression vector capable of expressing dsRNA. Examples of expression vectors that can be used in the present invention include, but are not limited to, RNA viruses such as adenoviruses, herpesviruses, vaccinia viruses, and retroviruses.
核酸分子（例えば、siRNAなどのdsRNA、アンチセンス核酸など）を標的組織又は細胞に投与するために用いることができる遺伝子送達系の他の例としては、コロイド分散系、リポソーム誘導系、及び人工ウイルスエンベロープが挙げられる。具体的には、例えば高分子量複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを、送達系として用いることができる。 Other examples of gene delivery systems that can be used to administer nucleic acid molecules (eg, dsRNA such as siRNA, antisense nucleic acid, etc.) to target tissues or cells include colloidal dispersion systems, liposome-derived systems, and artificial viruses An envelope is mentioned. Specifically, for example, high molecular weight composites, nanocapsules, microspheres, beads, oil-in-water emulsions, micelles, mixed micelles, and liposomes can be used as delivery systems.
核酸分子又は発現ベクターは、静脈内注射（持続注入を含む）、筋肉内注射、腹腔内注射、及び皮下注射により、又は他の投与経路により直接投与することができる。 The nucleic acid molecule or expression vector can be administered directly by intravenous injection (including continuous infusion), intramuscular injection, intraperitoneal injection, and subcutaneous injection, or by other routes of administration.
あるいは、核酸分子又は発現ベクターは、対象から採取した細胞又は組織に導入することができ、次にその細胞を対象に投与しうる（ex vivo法）。核酸分子又は発現ベクターの細胞又は組織への導入は、慣用の遺伝子導入法、例えばリン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、エレクトロポレーション又はリポフェクションなどにより実施しうる。核酸分子（例えば、siRNAなどのdsRNA、アンチセンス核酸など）を発現する細胞又は組織の投与もまた、核酸分子又は発現ベクターの直接投与の場合と同様に行いうる。 Alternatively, the nucleic acid molecule or expression vector can be introduced into a cell or tissue collected from the subject, which can then be administered to the subject (ex vivo method). Introduction of a nucleic acid molecule or expression vector into a cell or tissue can be performed by a conventional gene transfer method such as calcium phosphate method, DEAE dextran method, electroporation or lipofection. Administration of cells or tissues that express nucleic acid molecules (eg, dsRNA such as siRNA, antisense nucleic acids, etc.) can also be performed in the same manner as direct administration of nucleic acid molecules or expression vectors.
上述した各種製剤は、医薬において通常用いられる賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、滑沢剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、pH調整剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、吸収促進剤、無痛化剤、安定化剤、等張化剤などを適宜選択し、常法により製造することができる。 The above-mentioned various preparations are excipients, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, lubricants, surfactants, dispersants, buffering agents, pH adjusting agents, preservatives, solubilizing aids commonly used in medicine. Agents, preservatives, flavoring agents, absorption promoters, soothing agents, stabilizers, tonicity agents and the like can be appropriately selected and produced by conventional methods.
本剤に配合するサルコリピン阻害剤は、その有効成分の種類、用途、剤形、投与経路などにより異なるが、例えば総重量を基準として0.01〜90重量％、好ましくは1〜50重量％である。 The sarcolipine inhibitor to be blended in the present agent varies depending on the type, use, dosage form, administration route and the like of the active ingredient, but is 0.01 to 90% by weight, preferably 1 to 50% by weight based on the total weight.
また、本剤の有効量（投与量又は摂取量）は、該剤に含まれる有効成分の種類、対象の年齢及び体重、症状、投与経路、投与頻度及び回数により異なり、広範囲に変更することができる。例えば、通常成人1日当たりのサルコリピン阻害剤の有効量を、1日1回又は数回に分けて、約1週間〜約1年間、好ましくは約1ヶ月〜約12ヶ月にわたり投与することができる。 In addition, the effective dose (dose or intake) of this drug varies depending on the type of active ingredient contained in the drug, the age and weight of the subject, symptoms, route of administration, frequency of administration, and frequency, and may vary over a wide range. it can. For example, an effective amount of a sarcolipin inhibitor per day, usually for an adult, can be administered once or several times daily for about 1 week to about 1 year, preferably about 1 month to about 12 months.
本剤は、使用する対象を特に限定するものではない。例えば、ヒト、及びその他の哺乳動物、例えば霊長類（サル、チンパンジーなど）、家畜動物（ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジなど）、ペット用動物（イヌ、ネコなど）、実験動物（マウス、ラット、ウサギなど）などの対象に投与する又は摂取させることができる。対象は、特に、筋ジストロフィーを発症した対象、筋ジストロフィーを保因する対象（ジストロフィン遺伝子欠損を有する対象）である。 This agent does not specifically limit the object to be used. For example, humans and other mammals such as primates (monkeys, chimpanzees, etc.), livestock animals (cattle, horses, pigs, sheep, etc.), pet animals (dogs, cats, etc.), laboratory animals (mouse, rats, Can be administered or ingested to a subject such as a rabbit). The subjects are in particular subjects who have developed muscular dystrophy and subjects who carry muscular dystrophy (subjects with a dystrophin gene deficiency).
本剤は、当技術分野で公知の他の筋ジストロフィー治療に有効な方法と組み合わせることができる。例えば、エクソンスキップ治療又はウイルスベクターを用いる遺伝子治療により行われるジストロフィン発現を誘導する治療法などと組み合わせることができる。 The agent can be combined with other muscular dystrophy treatment methods known in the art. For example, it can be combined with exon skipping therapy or a therapy that induces dystrophin expression by gene therapy using a viral vector.
本剤は、医薬組成物としての用途に限定されず、その他、例えば食品又は飼料などに配合されてもよい。「食品」及び「飼料」とは、栄養素を1種以上含む天然物及びその加工品をいい、あらゆる飲食物を含む。本剤が配合された食品又は飼料は、筋ジストロフィー改善のための健康補助製品として有用である。 This agent is not limited to the use as a pharmaceutical composition, and may be blended in other products such as food or feed. “Food” and “feed” refer to natural products containing one or more nutrients and processed products thereof, including all food and drink. A food or feed containing this agent is useful as a health supplement for improving muscular dystrophy.
以上のようにして、サルコリピン阻害剤又は本剤を対象に投与することにより、対象において筋ジストロフィーを治療することができる。 As described above, muscular dystrophy can be treated in a subject by administering the sarcolipin inhibitor or this agent to the subject.
別の態様において、本発明は、サンプルにおけるサルコリピンの発現を測定するための手段を含む筋ジストロフィー診断薬に関する。本発明では、上述のように、正常及び軽症型筋ジストロフィー（BMD）ではその発現量が低く重症型筋ジストロフィー（DMD）では高く発現されるサルコリピンタンパク質及びそれをコードする遺伝子をマーカーとして利用する。本明細書中、サルコリピン遺伝子及びサルコリピンタンパク質を「本発明のマーカー」と呼ぶ。なお、本発明のマーカーは、本明細書中「マーカー遺伝子」及び「マーカータンパク質」とも記載する。 In another aspect, the present invention relates to a diagnostic agent for muscular dystrophy comprising a means for measuring the expression of sarcolipin in a sample. In the present invention, as described above, a sarcolipin protein whose expression level is low in normal and mild muscular dystrophy (BMD) and high in severe muscular dystrophy (DMD) and a gene encoding the same are used as markers. In the present specification, the sarcolipin gene and sarcolipin protein are referred to as “markers of the present invention”. The marker of the present invention is also referred to as “marker gene” and “marker protein” in the present specification.
本発明のマーカータンパク質及びマーカー遺伝子は、当技術分野で公知であり、そのアミノ酸配列及び塩基配列も公知である。但し、本発明のマーカーについて、筋ジストロフィー、特に重症型のDMDとの関連性については報告されていない。 The marker protein and marker gene of the present invention are known in the art, and their amino acid sequences and base sequences are also known. However, regarding the marker of the present invention, there is no report on the association with muscular dystrophy, particularly severe DMD.
本発明のマーカーは、当技術分野で公知の他の筋ジストロフィーマーカーと組み合わせてもよい。他のマーカーとしては、例えば血清クレアチニンキナーゼ（CK）値が挙げられる。このようにマーカーを組み合わせることによって、筋ジストロフィーの診断をより高精度に行うことができる。 The markers of the present invention may be combined with other muscular dystrophy markers known in the art. Examples of other markers include serum creatinine kinase (CK) value. By combining markers in this way, muscular dystrophy can be diagnosed with higher accuracy.
上述の通り、本発明のマーカーは、筋ジストロフィー、特に重症度の高いDMDにおいて高レベルで発現される。本発明では、対象由来のサンプルにおいて上記のマーカーの発現を測定する。また本発明では、「マーカーの発現」とは、マーカータンパク質又はその派生物又は誘導体の発現であってもよいし、あるいは該タンパク質をコードする遺伝子（mRNA）の発現であってもよい。「派生物」又は「誘導体」とは、マーカータンパク質から派生する物質又はマーカータンパク質の由来する物質を意味し、例えばシグナルペプチドを含むタンパク質、タンパク質の特定のサブユニット分子、修飾タンパク質、タンパク質断片などが含まれるが、これに限定されるものではない。 As described above, the markers of the present invention are expressed at high levels in muscular dystrophy, particularly in severely severe DMD. In the present invention, the expression of the marker is measured in a sample derived from a subject. In the present invention, “marker expression” may be expression of a marker protein or a derivative or derivative thereof, or may be expression of a gene (mRNA) encoding the protein. “Derivative” or “derivative” means a substance derived from a marker protein or a substance derived from a marker protein, such as a protein containing a signal peptide, a specific subunit molecule of the protein, a modified protein, a protein fragment, etc. Although it is included, it is not limited to this.
従って、本発明に係る筋ジストロフィー診断薬（以下、「本診断薬」ともいう）は、対象に由来するサンプル中のサルコリピンの発現を測定するための手段を含むものである。 Accordingly, the diagnostic agent for muscular dystrophy according to the present invention (hereinafter also referred to as “the present diagnostic agent”) includes means for measuring the expression of sarcolipin in a sample derived from a subject.
使用するサンプルは、筋ジストロフィーについて診断しようとする対象に由来するサンプルであれば特に限定されるものではなく、マーカーの発現を測定するための方法又は手段の種類に応じて適宜選択される。例えば生体液サンプル（血液、血清、血漿、尿、髄液、腹水等）、組織又は細胞サンプル（筋組織又は筋細胞、例えば横隔膜の組織又は細胞等）が挙げられ、採取の容易性の点から、筋細胞、血液、血清又は血漿などをサンプルとして用いることが好ましい。血漿を使用する場合には、抗凝固剤としてEDTAを使用することが好ましいが、ヘパリン、クエン酸ナトリウムなど当該分野で公知又は汎用されているものを使用することができる。血液サンプルの場合、採血後は氷冷又は冷蔵保存することが好ましい。また、組織又は細胞サンプルは、採取後に液体窒素、ドライアイスなど当該分野で公知又は汎用されている方法で直ちに凍結し、冷凍保存することが好ましい。筋細胞は、当技術分野で公知の方法により採取することができる。 The sample to be used is not particularly limited as long as it is a sample derived from a subject to be diagnosed for muscular dystrophy, and is appropriately selected according to the type of method or means for measuring the expression of the marker. Examples include biological fluid samples (blood, serum, plasma, urine, cerebrospinal fluid, ascites, etc.), tissue or cell samples (muscle tissue or muscle cells such as diaphragm tissue or cells, etc.), from the viewpoint of ease of collection. It is preferable to use muscle cells, blood, serum or plasma as a sample. When plasma is used, EDTA is preferably used as an anticoagulant, but those known or widely used in the art such as heparin and sodium citrate can be used. In the case of a blood sample, it is preferable to store it on ice or refrigerated after blood collection. In addition, the tissue or cell sample is preferably frozen immediately after collection by a method known or widely used in the art, such as liquid nitrogen or dry ice, and stored frozen. Muscle cells can be collected by methods known in the art.
また対象は、ヒト、及びその他の哺乳動物、例えば霊長類（サル、チンパンジーなど）、家畜動物（ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジなど）、ペット用動物（イヌ、ネコなど）、実験動物（マウス、ラット、ウサギなど）であり、さらには爬虫類及び鳥類などであってもよい。 The subjects include humans and other mammals such as primates (such as monkeys and chimpanzees), livestock animals (such as cows, horses, pigs, and sheep), pet animals (such as dogs and cats), and laboratory animals (such as mice, Rat, rabbit, etc.), and also reptiles and birds.
マーカーの発現の測定は、サンプル中のマーカーの量又は濃度を、好ましくは半定量的又は定量的に測定することに関し、その量は、絶対量であってもよいし又は相対量であってもよい。測定は、直接的又は間接的に行うことができる。直接的な測定は、サンプル中に存在するマーカータンパク質又は遺伝子（mRNA）の分子数と直接相関するシグナルに基づいて、その量又は濃度を測定することに関する。そのようなシグナルは、例えばタンパク質又は遺伝子の特定の物理的又は化学的な特性に基づいている。間接的な測定は、二次成分（すなわちマーカータンパク質又はmRNA以外の成分）、例えば抗体やアプタマーなどのリガンド、標識又は酵素反応生成物から得られるシグナルの測定である。採用するマーカーの発現測定方法に応じて、本診断薬に含まれる測定手段も異なる。 Measurement of marker expression relates to measuring the amount or concentration of the marker in the sample, preferably semi-quantitatively or quantitatively, and the amount may be an absolute amount or a relative amount. Good. Measurements can be made directly or indirectly. Direct measurement involves measuring the amount or concentration of a marker protein or gene (mRNA) present in a sample based on a signal that directly correlates with the number of molecules. Such signals are based, for example, on specific physical or chemical properties of the protein or gene. An indirect measurement is a measurement of a signal obtained from a secondary component (ie, a component other than a marker protein or mRNA), for example, a ligand such as an antibody or an aptamer, a label or an enzyme reaction product. Depending on the marker expression measurement method employed, the measurement means included in the diagnostic agent is also different.
本発明の一実施形態では、マーカーの発現の測定は、サンプル中のマーカータンパク質の量を測定するための手段によって行うことができる。そのような手段は当技術分野で公知であり、例えば免疫アッセイの方法及び試薬などがある。またマーカータンパク質の発現の測定は、マーカータンパク質に特有の物理的又は化学的特性を測定するための手段、例えば正確な分子量又はNMRスペクトル等を測定するための手段によって行うことができる。マーカータンパク質の発現の測定するための手段としては、バイオセンサー、プロテインチップ、免疫アッセイと連結した光学装置、質量分析計、NMR分析計、二次元電気泳動装置又はクロマトグラフィー装置等の分析装置が挙げられる。 In one embodiment of the invention, the measurement of marker expression can be performed by means for measuring the amount of marker protein in a sample. Such means are known in the art and include, for example, immunoassay methods and reagents. The marker protein expression can be measured by means for measuring physical or chemical properties specific to the marker protein, for example, means for measuring an accurate molecular weight or NMR spectrum. Examples of the means for measuring the expression of the marker protein include biosensors, protein chips, optical devices linked to immunoassays, analyzers such as mass spectrometers, NMR analyzers, two-dimensional electrophoresis apparatuses, and chromatography apparatuses. It is done.
例えば、サンプル中のマーカータンパク質の発現の測定は、免疫アッセイ（免疫学的測定法）により行うことができる。すなわちサンプル中のマーカータンパク質と、該タンパク質に特異的に結合する抗体との反応に基づいて、該タンパク質の発現を測定する。免疫アッセイは、当該分野で汎用されている方法であれば液相系及び固相系のいずれで行ってもよい。検出の容易性の点で、固相系を利用することが好ましい。また免疫アッセイの形式も限定されるものではなく、直接固相法の他、サンドイッチ法、競合法、ウエスタンブロッティング法、ELISA（enzyme linked immunosorbent assay）法などであってもよい。 For example, the expression of marker protein in a sample can be measured by an immunoassay (immunological assay). That is, the expression of the protein is measured based on the reaction between the marker protein in the sample and an antibody that specifically binds to the protein. The immunoassay may be performed in either a liquid phase system or a solid phase system as long as it is a method widely used in the art. From the viewpoint of ease of detection, it is preferable to use a solid phase system. The format of the immunoassay is not limited, and may be a direct solid phase method, a sandwich method, a competitive method, a Western blotting method, an ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) method, or the like.
免疫アッセイを採用する場合には、本診断薬は、マーカータンパク質に対する抗体を含む。マーカータンパク質に対する抗体はモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体のいずれであってもよいし、あるいはマーカータンパク質のエピトープに結合することができるFab、Fvフラグメントなどであってもよい。一次抗体と二次抗体を使用する場合には、両方ともモノクローナル抗体を用いることもでき、あるいは、一次抗体と二次抗体のいずれか一方をポリクローナル抗体とすることもできる。抗体は、当技術分野で公知の方法により調製することができ、また市販品として入手してもよい。 When employing an immunoassay, the diagnostic agent comprises an antibody against the marker protein. The antibody against the marker protein may be either a monoclonal antibody or a polyclonal antibody, or may be a Fab or Fv fragment that can bind to the epitope of the marker protein. When using a primary antibody and a secondary antibody, both can use a monoclonal antibody, or either a primary antibody or a secondary antibody can also be made into a polyclonal antibody. The antibody can be prepared by a method known in the art or may be obtained as a commercial product.
マーカータンパク質と抗体との結合（反応）は、周知の方法に従って測定しうる。当業者であれば、採用する免疫アッセイの種類及び形式、使用する標識の種類などに応じて、各アッセイについての有効かつ最適な測定方法を決定することができる。例えば、サンプル中のマーカータンパク質と抗体との結合を容易に検出するために、該抗体を標識することにより該結合を直接検出するか、又は標識二次抗体若しくはビオチン−アビジン複合体等を用いることにより間接的に検出する。 The binding (reaction) between the marker protein and the antibody can be measured according to a well-known method. A person skilled in the art can determine an effective and optimal measurement method for each assay according to the type and format of the immunoassay employed, the type of label used, and the like. For example, in order to easily detect the binding between a marker protein and an antibody in a sample, the binding is directly detected by labeling the antibody, or a labeled secondary antibody or a biotin-avidin complex is used. It detects indirectly by.
免疫アッセイとして固相系を選択する場合には、例えばサンプル中のタンパク質成分を固相（プレート、膜、ビーズ等）に固定化することができ、あるいは、抗体を固相に固定してもよい。この方法は、いわゆる「サンドイッチ法」と呼ばれる方法であり、標識として酵素を用いる場合には、「ELISA」として広く用いられている方法である。このような固相系の方法は、極微量のタンパク質の検出と操作の簡便化のため好ましい方法である。またこのような免疫アッセイは、例えば操作が簡便なテストストリップにおいても実施することができる。 When selecting a solid phase system as an immunoassay, for example, protein components in a sample can be immobilized on a solid phase (plate, membrane, bead, etc.), or antibodies can be immobilized on a solid phase. . This method is a so-called “sandwich method”, and is a method widely used as “ELISA” when an enzyme is used as a label. Such a solid-phase method is a preferable method for detecting an extremely small amount of protein and simplifying the operation. Such an immunoassay can also be performed, for example, on a test strip that is easy to operate.
免疫アッセイとして液相系を選択する場合には、例えば、標識化抗体とサンプルとを接触させて標識化抗体とマーカータンパク質を結合させ、この結合体を分離し、標識シグナルを検出する。あるいは、マーカータンパク質に対する抗体（一次抗体）とサンプルとを接触させて一次抗体とマーカータンパク質を結合させ、この結合体に標識化抗体（二次抗体）を結合させ、この三者の結合体における標識シグナルを検出する。あるいは、さらにシグナルを増強させるためには、非標識の二次抗体を先ず抗体＋マーカータンパク質結合体に結合させ、この二次抗体に標識物質を結合させるようにしてもよい。このような二次抗体への標識物質の結合は、例えば二次抗体をビオチン化し、標識物質をアビジン化しておくことによって行うことができる。 When a liquid phase system is selected as the immunoassay, for example, the labeled antibody and the sample are contacted to bind the labeled antibody and the marker protein, the conjugate is separated, and the labeled signal is detected. Alternatively, the antibody against the marker protein (primary antibody) is contacted with the sample to bind the primary antibody and the marker protein, the labeled antibody (secondary antibody) is bound to the conjugate, and the label in the conjugate of the three components Detect the signal. Alternatively, in order to further enhance the signal, an unlabeled secondary antibody may first be bound to an antibody + marker protein conjugate, and a labeling substance may be bound to this secondary antibody. Such binding of the labeling substance to the secondary antibody can be performed, for example, by biotinylating the secondary antibody and avidinizing the labeling substance.
免疫アッセイにおいて使用する抗体を標識するための標識としては、酵素、放射性同位体、蛍光色素又はアビジン−ビオチン系を使用することができる。酵素としては、通常の酵素免疫アッセイ（EIA）に用いられる酵素、例えば、パーオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等を用いることができる。また、酵素阻害物質や補酵素等を用いることもできる。これら酵素と抗体との結合は、マレイミド化合物等の架橋剤を用いる公知の方法によって行うことができる。放射性同位体としては、125Iや3H等の通常のラジオイムノアッセイ（RIA）で用いられているものを使用することができる。蛍光色素としては、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）やテトラメチルローダミンイソチオシアネート（TRITC）等の通常の蛍光抗体法に用いられるものを使用することができる。 As a label for labeling an antibody used in an immunoassay, an enzyme, a radioisotope, a fluorescent dye, or an avidin-biotin system can be used. As the enzyme, an enzyme used in a normal enzyme immunoassay (EIA), for example, peroxidase, β-galactosidase, alkaline phosphatase and the like can be used. Moreover, an enzyme inhibitor, a coenzyme, etc. can also be used. These enzymes and antibodies can be bound by a known method using a crosslinking agent such as a maleimide compound. As the radioisotope, those used in usual radioimmunoassay (RIA) such as 125 I and 3 H can be used. As the fluorescent dye, those used in usual fluorescent antibody methods such as fluorescein isothiocyanate (FITC) and tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC) can be used.
ビオチン−アビジン複合体系を利用する場合には、ビオチン化した抗体とサンプルとを反応させ、得られた複合体に標識を付加したアビジンを反応させる。アビジンは、ビオチンと特異的に結合することができるため、アビジンに付加した標識のシグナルを検出することによって、抗体とマーカータンパク質との結合を測定することができる。アビジンに付加する標識は特に限定されるものではないが、例えば酵素標識（ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）が好ましい。 When the biotin-avidin complex system is used, the biotinylated antibody and the sample are reacted, and the resulting complex is reacted with avidin. Since avidin can specifically bind to biotin, the binding between the antibody and the marker protein can be measured by detecting the signal of the label added to avidin. Although the label added to avidin is not particularly limited, for example, an enzyme label (peroxidase, alkaline phosphatase, etc.) is preferable.
標識シグナルの検出もまた、当技術分野で公知の方法に従って行うことができる。例えば、酵素標識を用いる場合には、酵素作用によって分解して発色する基質を加え、基質の分解量を光学的に測定することによって酵素活性を求め、これを結合抗体量に換算し、標準値との比較から抗体量が算出される。基質は、使用する酵素の種類に応じて異なり、例えば酵素としてパーオキシダーゼを使用する場合には、3,3’,5,5’-テトラメチルベンジシンを、また酵素としてアルカリフォスファターゼを用いる場合には、パラニトロフェノール等を用いることができる。放射性標識を用いる場合には、放射性標識の発する放射線量をシンチレーションカウンター等により測定する。蛍光標識は、例えば蛍光顕微鏡、プレートリーダー等を用いて検出及び定量することができる。 Detection of the labeled signal can also be performed according to methods known in the art. For example, in the case of using an enzyme label, a substrate that develops color by degradation by enzymatic action is added, and the enzyme activity is obtained by optically measuring the amount of degradation of the substrate. The amount of antibody is calculated from the comparison. The substrate varies depending on the type of enzyme used.For example, when peroxidase is used as the enzyme, 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine is used, and when alkaline phosphatase is used as the enzyme. Can use paranitrophenol or the like. When a radioactive label is used, the radiation dose emitted by the radioactive label is measured with a scintillation counter or the like. The fluorescent label can be detected and quantified using, for example, a fluorescence microscope or a plate reader.
あるいは、免疫組織化学染色法（例えば免疫染色法）又は免疫電顕法のように、マーカータンパク質のin situ検出のために、マーカータンパク質に対する抗体を組織学的に用いることも可能である。in situ検出は、対象から組織学的サンプル（例えば筋組織、筋細胞、横隔膜サンプル）を切除し（組織のパラフィン包埋切片など）、それに標識した抗体を接触させることにより実施しうる。 Alternatively, an antibody against the marker protein can be used histologically for in situ detection of the marker protein, such as immunohistochemical staining (for example, immunostaining) or immunoelectron microscopy. In situ detection can be performed by excising a histological sample (eg, muscle tissue, muscle cell, diaphragm sample) from a subject (such as a paraffin-embedded section of tissue) and contacting it with a labeled antibody.
以上の免疫学的方法では、サンプル中のマーカータンパク質とマーカータンパク質に対する抗体との結合量が多いほど、サンプル中にマーカータンパク質が多く発現されていることとなる。 In the immunological method described above, the greater the amount of binding between the marker protein in the sample and the antibody against the marker protein, the more marker protein is expressed in the sample.
あるいは、マーカータンパク質の発現の測定は、質量分析法（MS）を使用して行うことができる。 Alternatively, measurement of marker protein expression can be performed using mass spectrometry (MS).
また本発明においては、マーカーの発現の測定は、サンプル中のマーカー遺伝子の量を測定するための手段によって行うことができる。そのような手段は当技術分野で公知であり、例えば、マーカー遺伝子のDNAの全部若しくは一部の配列又はその相補配列を含むプライマーDNA又はプローブDNAがある。該プライマーDNA又はプローブDNAは、対象由来のサンプル中に発現しているマーカー遺伝子のmRNA又は該mRNAに対応するcDNAと特異的に結合して、サンプル中のマーカー遺伝子の発現を検出することが可能である。 In the present invention, the expression of the marker can be measured by means for measuring the amount of the marker gene in the sample. Such means are known in the art and include, for example, primer DNA or probe DNA containing the entire or partial sequence of the DNA of the marker gene or its complementary sequence. The primer DNA or probe DNA can specifically bind to the mRNA of the marker gene expressed in the sample derived from the subject or the cDNA corresponding to the mRNA to detect the expression of the marker gene in the sample. It is.
プライマーDNA及びプローブDNAは、マーカー遺伝子のDNAの塩基配列に基づいて、公知のプログラムにより容易に設計することができ、また当業者に公知の方法に従って調製することができる。具体的には、マーカー遺伝子の塩基配列、例えば配列番号1に示される塩基配列及びその相補配列に基づいて設計することができる。プライマーとして実質的な機能を有するDNAの長さとしては、10塩基以上が好ましく、さらに好ましくは15〜50塩基であり、さらに好ましくは20〜30塩基である。またプローブとして実質的な機能を有するDNAの長さとしては、10塩基以上が好ましく、さらに好ましくは15〜50塩基であり、さらに好ましくは20〜30塩基である。さらに、当業者には周知のように、プライマーDNA又はプローブDNAには、アニーリング又はハイブリダイズする部分以外の配列、例えばタグ配列などの付加配列が含まれていてもよい。 Primer DNA and probe DNA can be easily designed by a known program based on the base sequence of the DNA of the marker gene, and can be prepared according to methods known to those skilled in the art. Specifically, it can be designed based on the base sequence of the marker gene, for example, the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and its complementary sequence. The length of DNA having a substantial function as a primer is preferably 10 bases or more, more preferably 15 to 50 bases, and further preferably 20 to 30 bases. Further, the length of DNA having a substantial function as a probe is preferably 10 bases or more, more preferably 15 to 50 bases, and further preferably 20 to 30 bases. Further, as is well known to those skilled in the art, the primer DNA or probe DNA may contain sequences other than the portion to be annealed or hybridized, for example, additional sequences such as tag sequences.
対象由来のサンプルにおけるマーカー遺伝子の発現を測定するためには、上記プライマーDNA及び／又はプローブDNAをそれぞれ増幅反応又はハイブリダイゼーション反応において用い、その増幅産物又はハイブリッド産物を検出する。そのような反応を行う場合には、通常は、当技術分野で周知の方法を使用して対象由来のサンプルからmRNA又は該mRNAに対応するcDNAを調製する。以上のように調製したサンプルを用いて、以下に示す増幅反応及び／又はハイブリダイゼーション反応を行う。 In order to measure the expression of a marker gene in a subject-derived sample, the primer DNA and / or probe DNA is used in an amplification reaction or a hybridization reaction, respectively, and the amplification product or hybrid product is detected. When performing such a reaction, mRNA or a cDNA corresponding to the mRNA is usually prepared from a sample derived from a subject using a method well known in the art. The following amplification reaction and / or hybridization reaction is performed using the sample prepared as described above.
プライマーDNAを用いてmRNA又はcDNAを鋳型とした増幅反応を行い、その特異的増幅反応を検出することにより、サンプル中のマーカー遺伝子の発現の測定を行うことができる。増幅手法としては、特に限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法の原理を利用した公知の方法（PCR、RT-PCR、リアルタイムPCRなど）を挙げることができる。増幅産物の検出には、増幅反応により得られる増幅産物を特異的に認識することができる公知の手段を用いることができる。例えば、アガロースゲル電気泳動法等を利用して、特定のサイズの増幅断片が増幅されているか否かを確認することにより、特異的な増幅反応を検出することができる。 By performing an amplification reaction using mRNA or cDNA as a template using the primer DNA and detecting the specific amplification reaction, the expression of the marker gene in the sample can be measured. The amplification method is not particularly limited, and examples thereof include known methods (PCR, RT-PCR, real-time PCR, etc.) using the principle of the polymerase chain reaction (PCR) method. For detection of the amplification product, a known means capable of specifically recognizing the amplification product obtained by the amplification reaction can be used. For example, a specific amplification reaction can be detected by confirming whether an amplified fragment of a specific size is amplified using agarose gel electrophoresis or the like.
あるいは、増幅反応の過程で取り込まれるdNTPに、放射性同位体、蛍光物質、発光物質などの標識体を作用させ、この標識体を検出することができる。放射性同位体としては、32P、125I、35Sなどを用いることができる。また蛍光物質としては、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、スルホローダミン（SR）、テトラメチルローダミン（TRITC）などを用いることができる。また発光物質としてはルシフェリンなどを用いることができる。これら標識体の種類や標識体の導入方法等に関しては、特に制限されることはなく、従来公知の各種手段を用いることができる。例えば標識体の導入方法としては、放射性同位体を用いるランダムプライム法が挙げられる。 Alternatively, a label such as a radioisotope, a fluorescent substance, or a luminescent substance can be allowed to act on dNTP incorporated during the amplification reaction to detect the label. As the radioisotope, 32 P, 125 I, 35 S and the like can be used. As the fluorescent substance, for example, fluorescein isothiocyanate (FITC), sulforhodamine (SR), tetramethylrhodamine (TRITC) and the like can be used. As the luminescent substance, luciferin or the like can be used. There are no particular restrictions on the type of the labeled body, the method for introducing the labeled body, and the like, and various conventionally known means can be used. For example, as a method for introducing a label, a random prime method using a radioisotope can be mentioned.
標識したdNTPを取り込んだ増幅産物を観察する方法としては、上述した標識体を検出するための当技術分野で公知の方法であればいずれの方法でもよい。例えば、標識体として放射性同位体を用いた場合には、放射活性を、例えば液体シンチレーションカウンター、γ-カウンターなどにより計測することができる。また標識体として蛍光を用いた場合には、その蛍光を蛍光顕微鏡、蛍光プレートリーダーなどを用いて検出することができる。 As a method for observing the amplification product incorporating the labeled dNTP, any method may be used as long as it is a method known in the art for detecting the above-mentioned labeled body. For example, when a radioisotope is used as the label, the radioactivity can be measured using, for example, a liquid scintillation counter or a γ-counter. In addition, when fluorescence is used as the label, the fluorescence can be detected using a fluorescence microscope, a fluorescence plate reader, or the like.
また、プローブDNAを用いてサンプルに対するハイブリダイゼーション反応を行い、その特異的結合（ハイブリッド）を検出することにより、マーカー遺伝子の発現を測定することもできる。ハイブリダイゼーション反応は、プローブDNAがサンプル中のマーカー遺伝子のmRNA又はcDNAのみと特異的に結合するような条件、すなわちストリンジェントな条件下で行う必要がある。ハイブリダイゼーションを行う場合には、プローブDNAに蛍光標識（フルオレセイン、ローダミンなど）、放射性標識（32Pなど）、ビオチン標識等の適当な標識を付加することができる。 Alternatively, the expression of the marker gene can be measured by performing a hybridization reaction on the sample using the probe DNA and detecting its specific binding (hybrid). The hybridization reaction needs to be performed under conditions such that the probe DNA specifically binds only to the mRNA or cDNA of the marker gene in the sample, that is, stringent conditions. When hybridization is performed, an appropriate label such as a fluorescent label (such as fluorescein or rhodamine), a radioactive label (such as 32 P), or a biotin label can be added to the probe DNA.
標識化プローブDNAを用いた検出は、サンプル又はそれから調製したmRNA若しくはcDNAとプローブDNAとをハイブリダイズ可能なように接触させることを含む。具体的には、サンプル又はmRNA若しくはcDNAを適当な固相に固定化し、標識を付加したプローブDNAを添加することにより、あるいは標識プローブDNAを適当な固相に固定化し、サンプル又はmRNA若しくはcDNAを添加することにより、プローブDNAとサンプル又はmRNA若しくはcDNAとを接触させてハイブリダイゼーション反応を行い、ハイブリダイズしなかったプローブDNAを除去した後、サンプル又はmRNA若しくはcDNAとハイブリダイズしているプローブDNAの標識を検出する。標識が検出された場合には、サンプル中にマーカー遺伝子のmRNAが発現していることとなる。標識化プローブDNAを用いた発現の測定方法の例としては、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等を挙げることができる。 The detection using the labeled probe DNA includes bringing the sample or mRNA or cDNA prepared therefrom into contact with the probe DNA so that they can be hybridized. Specifically, the sample or mRNA or cDNA is immobilized on an appropriate solid phase, and a labeled probe DNA is added, or the labeled probe DNA is immobilized on an appropriate solid phase, and the sample or mRNA or cDNA is immobilized. By adding the probe DNA and the sample or mRNA or cDNA in contact with each other, a hybridization reaction is performed to remove the probe DNA that has not hybridized, and then the probe DNA that has hybridized with the sample or mRNA or cDNA is removed. Detect the label. When the label is detected, the marker gene mRNA is expressed in the sample. Examples of the method for measuring expression using labeled probe DNA include Southern hybridization and Northern hybridization.
以上のようにして、マーカーの発現を測定する手段を用いてサンプル中のマーカーの発現を測定し、その結果に基づいて筋ジストロフィーを診断することが可能である。本診断薬により診断の対象となるのは筋ジストロフィーであり、特に重症型のデュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）である。本明細書中、「筋ジストロフィーの診断」とは、対象における筋ジストロフィーの保因を判定すること、筋ジストロフィーの重症度を判定すること、筋ジストロフィーの重症化を予測することを意味する。また本発明において「診断」は、既に診断された筋ジストロフィーの継続的なモニタリング、及び既に行った筋ジストロフィーの診断の確認も包含する。 As described above, it is possible to measure the expression of the marker in the sample using the means for measuring the expression of the marker, and to diagnose muscular dystrophy based on the result. The target of diagnosis by this diagnostic agent is muscular dystrophy, particularly severe Duchenne muscular dystrophy (DMD). In the present specification, “diagnosis of muscular dystrophy” means determining the carrier of muscular dystrophy in a subject, determining the severity of muscular dystrophy, and predicting the severity of muscular dystrophy. In the present invention, “diagnosis” also includes continuous monitoring of a previously diagnosed muscular dystrophy and confirmation of a diagnosis of a previously performed muscular dystrophy.
本発明の目的である診断は、診断しようとする対象の全て（すなわち100％）について必ず正しい結果が得られることを意図するものではない。本発明においては、「診断」は、対象を統計学的に有意な確率で診断できることを意図しており、例えば対象の少なくとも60％、少なくとも80％又は少なくとも90％を、本発明によって適切に診断することができる。 The diagnosis that is the object of the present invention is not intended to ensure that the correct results are obtained for all (ie 100%) of the objects to be diagnosed. In the present invention, “diagnosis” intends that a subject can be diagnosed with a statistically significant probability, eg, at least 60%, at least 80% or at least 90% of a subject is properly diagnosed by the present invention. can do.
診断を行う際、対象由来のサンプル中のマーカーの発現を、基準値と比較する。基準値は、健常者サンプルにおけるマーカーの発現の測定値、筋ジストロフィー（DMD、BMDなど）の保因者又は発症者であると診断がなされた患者サンプルにおけるマーカーの発現の測定値などである。個々の対象に適用する基準値は、対象の種類、年齢などの様々な生理学的パラメータに応じて変化しうる。具体的な判定基準としては、対象のサンプルにおけるマーカーの発現量が健常者のそれと比較して、10％以上、好ましくは30％以上、さらに好ましくは70％以上、最も好ましくは100％以上である場合には、重症度の筋ジストロフィーの可能性があると診断することができる。 When making a diagnosis, the expression of the marker in a sample from the subject is compared to a reference value. The reference value includes a measurement value of marker expression in a healthy sample, a measurement value of marker expression in a patient sample diagnosed as a carrier or onset of muscular dystrophy (DMD, BMD, etc.), and the like. The reference value applied to an individual subject can vary depending on various physiological parameters such as the type of subject, age, and the like. As a specific criterion, the expression level of the marker in the target sample is 10% or more, preferably 30% or more, more preferably 70% or more, and most preferably 100% or more, compared with that of a healthy subject. In some cases, it can be diagnosed that there is a possibility of severe muscular dystrophy.
さらに筋ジストロフィーの診断は、他の公知の筋ジストロフィーの診断方法と組み合わせて行ってもよい。そのような公知の診断方法としては、血清クレアチンキナーゼ（CK）値の測定、単離骨格筋の張力測定、組織学的な筋最大直径及び中心核線維の頻度の計測、
多重連鎖反応依存性プローブ増幅（Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification：MLPA）法、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法／シークエンス法による遺伝子変異の同定、あるいは抗ジストロフィン抗体を用いた免疫組織化学法又はウエスタンブロット法によるジストロフィンタンパク質の定性・定量的解析法が挙げられる。
Furthermore, the diagnosis of muscular dystrophy may be performed in combination with other known muscular dystrophy diagnosis methods. Such known diagnostic methods include measurement of serum creatine kinase (CK) levels, tension measurement of isolated skeletal muscle, measurement of histological maximum muscle diameter and frequency of central core fibers,
Identification of gene mutations using the Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) method, polymerase chain reaction (PCR) method / sequencing method, or immunohistochemistry or Western blotting using an anti-dystrophin antibody Qualitative / quantitative analysis of dystrophin protein.
本診断薬は、マーカーの発現を測定する手段以外にも診断に有用な他の成分を含んでもよく、それにより、マーカーの発現の測定を容易かつ簡便に行うことができ、筋ジストロフィーを診断することができる。 The diagnostic agent may contain other components useful for diagnosis in addition to the means for measuring the expression of the marker, whereby the measurement of the expression of the marker can be easily and easily performed to diagnose muscular dystrophy. Can do.
本診断薬の一例は、免疫アッセイ用試薬セットであり、少なくともマーカータンパク質に対する抗体試薬を含む。さらに、希釈や洗浄用緩衝液、標準抗原、各抗体試薬に特異的に結合をする標識抗体試薬、発色・発光・蛍光を生じさせる基質試薬、手順と評価方法を記載した手順書等を含んでもよい。キットに含まれる抗体は、予め標識されたものであってもよいし、又は標識されていなくてもよい。また抗体は、固相支持体（例えば、メンブレン、ビーズ等）に固定されていてもよい。また本発明の診断薬の別の例は、質量分析用試薬セットであり、例えば同位体標識試薬、分画用ミニカラム、緩衝液、手順書等により構成される。本発明の診断薬のさらに別の例は、サンプル中のマーカー遺伝子の発現を測定するための手段（プライマーDNA、プローブDNAなど）を含むものであってもよい。 An example of the present diagnostic agent is an immunoassay reagent set, which includes at least an antibody reagent against a marker protein. In addition, it may include dilution and washing buffers, standard antigens, labeled antibody reagents that specifically bind to each antibody reagent, substrate reagents that generate color, luminescence, and fluorescence, and procedures that describe procedures and evaluation methods. Good. The antibody included in the kit may be pre-labeled or unlabeled. The antibody may be immobilized on a solid support (eg, membrane, bead, etc.). Another example of the diagnostic agent of the present invention is a mass spectrometry reagent set, which includes, for example, an isotope labeling reagent, a fractionation minicolumn, a buffer, a procedure manual, and the like. Yet another example of the diagnostic agent of the present invention may include a means (primer DNA, probe DNA, etc.) for measuring the expression of a marker gene in a sample.
本発明の診断薬は、該診断薬を使用するための手順及びプロトコールを記載した説明書、筋ジストロフィーの診断において使用する基準値又は基準範囲を示した表などを含んでもよい。 The diagnostic agent of the present invention may include a manual describing a procedure and a protocol for using the diagnostic agent, a table showing a reference value or a reference range used in diagnosing muscular dystrophy, and the like.
本発明の診断薬に含まれる構成要素は、個別に提供されてもよいし、又は単一の容器内に提供されてもよい。好ましくは、本発明の診断薬は、必要な構成要素の全てを、即時に使用することができるように、例えば調整された濃度の構成要素として含む。 The components included in the diagnostic agent of the present invention may be provided separately or may be provided in a single container. Preferably, the diagnostic agent of the present invention comprises all of the necessary components, for example as adjusted concentration components, so that they can be used immediately.
さらに本発明は、別の態様において、筋ジストロフィーの治療薬候補のスクリーニング方法に関する。後述する実施例に示されるように、重症型のDMDでは、野生型及び軽症型のBMDとは異なり、細胞質から筋小胞体（SR）にCa2+を取り込む役割を担うSERCA（筋小胞体/小胞体Ca2+-ATPアーゼ）の活性が低く、またリアノジン受容体アイソフォーム1（RyR1）の機能が低下している。そのため、SERCA活性を改善し、かつRyR1機能を改善する物質又は因子は、筋ジストロフィー、特に重症型のDMDの治療薬候補となる可能性がある。 Furthermore, this invention relates to the screening method of the therapeutic agent candidate of muscular dystrophy in another aspect. As shown in the examples described later, in severe DMD, unlike wild-type and mild BMD, SERCA (muscle endoplasmic reticulum / sarcoplasmic reticulum / which plays a role of taking Ca 2+ from cytoplasm into sarcoplasmic reticulum (SR). The activity of the endoplasmic reticulum (Ca 2+ -ATPase) is low, and the function of ryanodine receptor isoform 1 (RyR1) is reduced. Therefore, a substance or factor that improves SERCA activity and improves RyR1 function may be a therapeutic drug candidate for muscular dystrophy, particularly severe DMD.
本発明に係るスクリーニング方法（以下、「本スクリーニング方法」ともいう）は、
被験物質又は因子の存在下にて、ジストロフィンを欠損する筋細胞における筋小胞体/小胞体Ca2+-ATPアーゼ（SERCA）の活性を測定するステップ、
被験物質又は因子の不在下におけるジストロフィンを欠損する筋細胞と比較してSERCAの活性が改善した場合に、上記被験物質又は因子を筋ジストロフィーの治療薬候補として同定するステップ
を含む。
The screening method according to the present invention (hereinafter also referred to as “the screening method”)
Measuring the activity of sarcoplasmic reticulum / endoplasmic reticulum Ca 2+ -ATPase (SERCA) in dystrophin-deficient myocytes in the presence of a test substance or factor;
And identifying the test substance or factor as a therapeutic drug candidate for muscular dystrophy when the activity of SERCA is improved as compared to muscle cells lacking dystrophin in the absence of the test substance or factor.
ジストロフィンを欠損する筋細胞は、当技術分野で公知の方法に従って入手し調製することができ、あるいは市販の細胞又は公に入手可能な細胞を使用することも可能である。例えば、ヒト線維芽細胞に対してMyoD遺伝子をレトロウイルスによる導入して筋芽細胞に分化させた細胞（例えば、Coriell Institute for medical researchより入手可能）などを利用することができる。あるいは、筋ジストロフィーモデル動物、好ましくは筋ジストロフィーモデル実験動物（マウス、イヌ、ラットなど）から採取された筋細胞であってもよい。例えば、筋ジストロフィーのモデルマウス（mdxマウス：Sicinski, P. et al., Science 244:1578-1580, 1989）、筋ジストロフィーのモデルイヌ（c-xmdイヌ：Komegay, J.N. et al., Muscle Nerve 11:1056-1064, 1988；CXMDJイヌ：Shimatsu Y et al., Exp Anim. 52:93-7. 2003、Shimatsu Y et al., Acta Myol. 24:145-54. 2005）、筋ジストロフィーのモデルネコ（HFMDネコ：Vos, J. H. et al., J. Comp. Pathol. 96:335-41, 1986）などが知られている。 Muscle cells deficient in dystrophin can be obtained and prepared according to methods known in the art, or commercially available cells or publicly available cells can be used. For example, cells obtained by introducing a MyoD gene into human fibroblasts by retrovirus to differentiate into myoblasts (for example, available from Coriell Institute for medical research) can be used. Alternatively, it may be a muscle cell collected from a muscular dystrophy model animal, preferably a muscular dystrophy model experimental animal (mouse, dog, rat, etc.). For example, muscular dystrophy model mice (mdx mice: Sicinski, P. et al., Science 244: 1578-1580, 1989), muscular dystrophy model dogs (c-xmd dogs: Komegay, JN et al., Muscle Nerve 11: 1056- 1064, 1988; CXMD J dogs: Shimatsu Y et al., Exp Anim. 52: 93-7. 2003, Shimatsu Y et al., Acta Myol. 24: 145-54. 2005), muscular dystrophy model cat (HFMD cat) : Vos, JH et al., J. Comp. Pathol. 96: 335-41, 1986).
本スクリーニング方法の対象となる被験物質又は因子の種類は特に限定されるものではない。例えば、被験物質又は因子は、任意の物質、具体的には、天然に生じる分子、例えば、アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、脂質、炭水化物（糖等）、ステロイド、グリコペプチド、糖タンパク質、プロテオグリカンなど；天然に生じる分子の合成アナログ又は誘導体、例えば、ペプチド擬態物、核酸分子（アプタマー、アンチセンス核酸、二本鎖RNA（RNAi）等）など；天然に生じない分子、例えば、コンビナトリアルケミストリー技術等を用いて作製した低分子有機化合物（無機及び有機化合物ライブラリー、又はコンビナトリアルライブラリー等）など；並びにそれらの混合物を挙げることができる。また被験物質又は因子は、単一物質であってもよいし、複数の物質から構成される複合体や、転写因子等であってもよい。さらに、被験物質又は因子は、放射線、紫外線、炭素濃度、温度などの環境因子であってもよい。 The type of test substance or factor that is the subject of this screening method is not particularly limited. For example, the test substance or factor can be any substance, specifically a naturally occurring molecule such as an amino acid, peptide, oligopeptide, polypeptide, protein, nucleic acid, lipid, carbohydrate (such as sugar), steroid, glycopeptide Synthetic analogs or derivatives of naturally occurring molecules, such as peptidomimetics, nucleic acid molecules (aptamers, antisense nucleic acids, double-stranded RNA (RNAi), etc.), etc .; non-naturally occurring molecules, such as And low molecular organic compounds (inorganic and organic compound libraries, combinatorial libraries, etc.) produced using combinatorial chemistry techniques and the like; and mixtures thereof. The test substance or factor may be a single substance, a complex composed of a plurality of substances, a transcription factor, or the like. Furthermore, the test substance or factor may be an environmental factor such as radiation, ultraviolet rays, carbon concentration, or temperature.
また、被験物質又は因子としては単一の被験物質又は因子を独立に試験しても、いくつかの候補となる被験物質又は因子の混合物（ライブラリーなどを含む）について試験をしてもよい。複数の被験物質又は因子を含むライブラリーとしては、合成化合物ライブラリー（コンビナトリアルライブラリーなど）、ペプチドライブラリー（コンビナトリアルライブラリーなど）などが挙げられる。 Further, as a test substance or factor, a single test substance or factor may be tested independently, or a mixture of several candidate test substances or factors (including a library or the like) may be tested. Examples of the library containing a plurality of test substances or factors include a synthetic compound library (such as a combinatorial library) and a peptide library (such as a combinatorial library).
筋細胞を被験物質又は因子の存在下に配置する場合、その条件は、その物質又は因子の種類により異なるが、当業者であれば容易に決定することができる。例えば、筋細胞を被験物質を添加した培地中で培養することにより、筋細胞を被験物質を含む溶液中に浸漬することにより、筋細胞上に被験物質を積層することにより、又は筋細胞を被験因子の存在下で培養することにより行うことができる。 When placing myocytes in the presence of a test substance or factor, the conditions vary depending on the type of the substance or factor, but can be easily determined by those skilled in the art. For example, by culturing myocytes in a medium containing a test substance, immersing myocytes in a solution containing the test substance, stacking the test substance on the myocytes, or testing myocytes It can be performed by culturing in the presence of a factor.
また、被験物質又は因子の効果及び有効性は、いくつかの条件で検討することも可能である。そのような条件としては、被験物質又は因子の存在下におく時間又は期間、量（大小）、回数などが挙げられる。例えば、被験物質の希釈系列を調製するなどして複数の用量を設定することができる。被験物質又は因子の処置期間も適宜設定することができるが、例えば、1日から数週間、数ヶ月、数年の期間にわたって処置を行うことができる。 In addition, the effect and effectiveness of the test substance or factor can be examined under several conditions. Such conditions include time or duration, amount (large or small), number of times, etc., in the presence of the test substance or factor. For example, a plurality of doses can be set by preparing a dilution series of the test substance. The treatment period of the test substance or factor can also be set as appropriate. For example, the treatment can be performed over a period of 1 day to several weeks, months, and years.
さらに、複数の物質及び／又は因子の相加作用、相乗作用などを検討する場合には、被験物質及び／又は因子を組み合わせて用いてもよい。 Furthermore, when examining the additive action and synergistic action of a plurality of substances and / or factors, the test substances and / or factors may be used in combination.
続いて、被験物質又は因子の存在下にて、ジストロフィンを欠損する筋細胞におけるSERCAの活性を測定する。SERCAの活性は、例えばリアノジン受容体アイソフォーム1（RyR1）アゴニストによる刺激後の筋小胞体へのCa2+再取り込み時間により測定することができる。Ca2+再取り込み時間が短いほどSERCAの活性は高いといえる。RyR1アゴニストとしては、限定されるものではないが、カフェインを使用することができる。例えば、被験物質又は因子の存在下にて、ジストロフィンを欠損する筋細胞をRyR1アゴニストで刺激し、その直後から5分間程度にわたって筋小胞体へのCa2+再取り込み時間を測定する。 Subsequently, the activity of SERCA in muscle cells lacking dystrophin is measured in the presence of the test substance or factor. The activity of SERCA can be measured, for example, by the time of Ca 2+ reuptake into the sarcoplasmic reticulum after stimulation with a ryanodine receptor isoform 1 (RyR1) agonist. The shorter the Ca 2+ reuptake time, the higher the activity of SERCA. The RyR1 agonist is not limited, but caffeine can be used. For example, muscle cells lacking dystrophin are stimulated with a RyR1 agonist in the presence of a test substance or factor, and the Ca 2+ reuptake time into the sarcoplasmic reticulum is measured for about 5 minutes immediately after that.
筋小胞体へのCa2+再取り込み時間は、当技術分野で公知の方法により、例えばCa2+濃度の変化により測定することができる。具体的な方法としては、例えばカルシウムと結合することにより蛍光を発するFluo-4などを使用して、筋小胞体内の蛍光強度を測定することによりCa2+濃度の変化を測定することができる。 The Ca 2+ reuptake time into the sarcoplasmic reticulum can be measured by a method known in the art, for example, by changing the Ca 2+ concentration. As a specific method, for example, using Fluo-4 that emits fluorescence by binding to calcium, the change in Ca 2+ concentration can be measured by measuring the fluorescence intensity in the sarcoplasmic reticulum. .
細胞におけるSERCAの活性を測定した後、対照と比較し、SERCAの活性を改善する、すなわち向上させる被験物質又は因子を、筋ジストロフィーの治療薬候補として選択する。対照としては、被験物質又は因子の不在下におけるジストロフィンを欠損する筋細胞などを用いることができる。 After measuring the activity of SERCA in the cells, a test substance or factor that improves, that is, enhances the activity of SERCA as compared to the control is selected as a therapeutic drug candidate for muscular dystrophy. As a control, muscle cells lacking dystrophin in the absence of the test substance or factor can be used.
本スクリーニング方法はさらに、
被験物質又は因子の存在下にて、ジストロフィンを欠損する筋細胞におけるリアノジン受容体アイソフォーム1（RyR1）の応答性を測定するステップ、
被験物質又は因子の不在下におけるジストロフィンを欠損する筋細胞と比較してRyR1の応答性が改善した場合に、上記被験物質又は因子を筋ジストロフィーの治療薬候補として同定するステップ
を含んでもよい。このRyR1の応答性は、RyR1アゴニスト（例えばカフェイン）による刺激後の細胞質Ca2+濃度により測定することができる。
The screening method further includes
Measuring the responsiveness of ryanodine receptor isoform 1 (RyR1) in dystrophin-deficient muscle cells in the presence of a test substance or factor;
When the responsiveness of RyR1 is improved as compared to muscle cells lacking dystrophin in the absence of the test substance or factor, the test substance or factor may be identified as a therapeutic drug candidate for muscular dystrophy. This responsiveness of RyR1 can be measured by the cytoplasmic Ca 2+ concentration after stimulation with a RyR1 agonist (eg caffeine).
また、本発明においては、一次スクリーニングとして、細胞を被験物質又は因子で処置し、該細胞におけるSERCA活性の改善を示した被験物質又は因子を選択し、次に二次スクリーニングとして、選択した被験物質又は因子で動物を処置し、該動物の筋細胞におけるSERCA活性を測定して改善を示した被験物質又は因子を選択してもよい。 Further, in the present invention, as a primary screening, cells are treated with a test substance or factor, a test substance or factor showing an improvement in SERCA activity in the cell is selected, and then a selected test substance is selected as a secondary screening. Alternatively, an animal may be treated with a factor, and a test substance or factor showing improvement by measuring SERCA activity in the muscle cells of the animal may be selected.
さらに、治療薬又は治療法のスクリーニングにおいては、さらに、選択された被験物質又は因子を、筋ジストロフィーモデル動物（筋ジストロフィー発症動物又は筋ジストロフィー保因動物）に投与して、被験物質又は因子がモデル動物における筋ジストロフィーの病態に影響を及ぼすか否かを判定してもよい。被験物質又は因子がモデル動物における筋ジストロフィーの病態に影響を及ぼすか否かの判定は、モデル動物の種類、判定しようとする病態、要因などにより異なるが、当業者であれば、筋ジストロフィーに及ぼす影響を適宜判定することができる。例えば、筋力、血清クレアチンキナーゼ値の測定、単離骨格筋の張力測定、組織学的な筋最大直径及び中心核線維の頻度の計測などを行うことができる。一般的には、モデル動物において被験物質又は因子の有効性が確認された後に、ヒトにおいて、例えば臨床試験などにより有効性の評価が行われる。 Further, in the screening of therapeutic agents or treatment methods, the selected test substance or factor is further administered to a muscular dystrophy model animal (muscle dystrophy-onset animal or muscular dystrophy carrier animal), and the test substance or factor is muscular dystrophy in the model animal. It may be determined whether or not the disease state is affected. The determination of whether a test substance or factor affects the pathology of muscular dystrophy in a model animal depends on the type of model animal, the pathological condition to be determined, factors, and the like. It can be determined appropriately. For example, measurement of muscle strength, serum creatine kinase level, tension measurement of isolated skeletal muscle, histological maximum muscle diameter, and frequency of central core fibers can be performed. Generally, after the effectiveness of a test substance or factor is confirmed in a model animal, the effectiveness is evaluated in a human by, for example, a clinical test.
上述のようにして、筋ジストロフィーの改善（例えば、症状の改善、発症若しくは進行の遅延）が認められる場合の被験物質又は因子は、筋ジストロフィーの治療薬の候補として選択することができる。 As described above, a test substance or factor when improvement of muscular dystrophy (for example, improvement of symptoms, delay of onset or progression) is observed can be selected as a candidate for a therapeutic agent for muscular dystrophy.
以上から、本スクリーニング方法により、筋ジストロフィーを治療又は予防するための治療薬又は治療法を同定し、さらには治療薬又は治療法の有効性を確認することができる。 From the above, this screening method can identify a therapeutic agent or therapeutic method for treating or preventing muscular dystrophy, and further confirm the effectiveness of the therapeutic agent or therapeutic method.
以下、本発明を実施例及び図面によりさらに具体的に説明する。ただし、以下の実施例は、本発明を限定するものではない。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples and drawings. However, the following examples do not limit the present invention.
なお、実施例に示す実験結果について、すべての値は平均±標準誤差（sem）として表す。有意差はStudentのt検定又は一方向ANOVAにより評価した。また、多群間の差異は、Tukey-Kramerの事後解析により及びStudentの独立t検定（unpaired t-test）により評価した。10未満（† P<0.1）、5％未満（*P<0.05）、1％未満（**P<0.01）又は0.1％未満（***P<0.001）の確率を統計学的に有意差ありと判定した。 In addition, about the experimental result shown in an Example, all the values are represented as an average +/- standard error (sem). Significant differences were evaluated by Student's t-test or one-way ANOVA. Differences between multiple groups were evaluated by Tukey-Kramer's post hoc analysis and by Student's independent t-test. Statistically significant difference in probability of less than 10 († P <0.1), less than 5% (* P <0.05), less than 1% (** P <0.01) or less than 0.1% (*** P <0.001) It was determined that there was.
［実験準備］
（１）Tg/mdxマウスの作出
エキソン45-55欠損ヒトジストロフィンを発現し正常なヒトジストロフィンを発現しないトランスジェニックマウス（Tg/mdxマウス）を以前に記載された方法（Neuromuscular Disorders 24: 791-924, 2014）に従い作出した。簡単に説明すると、pCAGGSプロモーターを用いてエキソン45-55欠損ヒトジストロフィンcDNAを過剰発現するトランスジェニックマウスを作出した。2つのトランスジェニックF0系統（△45-55Tg）を得た。トランスジェニックmdxマウス（△45-55Tg/mdx）雄マウスを得るために、△45-55Tg雄マウスを雌mdxマウス（本出願人により作出され自家繁殖されているもの）と交配した。これらのマウスを15世代を超えてC57BL/6系統と戻し交配した。C57BL/6マウス及びnNOS-nullはNihon CREA及びJackson Laboratoryからそれぞれ購入した。すべての動物は自由に食餌及び水を摂取可能とした。本研究のすべての実験プロトコルについて、国立精神・神経医療研究センターの動物実験倫理問題委員会の承認を得た。
[Experiment preparation]
(1) Generation of Tg / mdx mice Transgenic mice that express exon 45-55-deficient human dystrophin and do not express normal human dystrophin (Tg / mdx mice) have been described previously (Neuromuscular Disorders 24: 791-924 , 2014). Briefly, transgenic mice that overexpress exon 45-55 deficient human dystrophin cDNA using the pCAGGS promoter were generated. Two transgenic F0 lines (Δ45-55Tg) were obtained. In order to obtain transgenic mdx mice (Δ45-55Tg / mdx) male mice, Δ45-55Tg male mice were mated with female mdx mice (created by the applicant and self-bred). These mice were backcrossed with the C57BL / 6 strain for over 15 generations. C57BL / 6 mice and nNOS-null were purchased from Nihon CREA and Jackson Laboratory, respectively. All animals were allowed free access to food and water. All experimental protocols for this study were approved by the National Committee for Animal Experimentation Ethics, National Center for Psychiatry and Neurology.
（２）初代筋芽細胞培養物及び単離された単一線維からの培養物
マウス由来単核細胞を以前に記載のようにマウスから調製した（J. Tanihata, et al., J. Gene Med. 10, 702-13 (2008)）。初代筋芽細胞を単独で、コラーゲン被覆皿において20％ウシ胎仔血清、1％ペニシリン-ストレプトマイシン及び2.5ng/ml塩基性線維芽細胞成長因子（Invitrogen）を含有する増殖培地（GM）F-10で培養した。分化のため、培地を分化培地（DM）（2％ウシ血清及び1％ペニシリン-ストレプトマイシンを添加したDMEM）に変更し、3日間培養した。GM及びDMは24時間毎に補充した。
(2) Primary myoblast cultures and cultures from isolated single fibers Mouse-derived mononuclear cells were prepared from mice as previously described (J. Tanihata, et al., J. Gene Med). 10, 702-13 (2008)). Primary myoblasts alone in growth medium (GM) F-10 containing 20% fetal calf serum, 1% penicillin-streptomycin and 2.5 ng / ml basic fibroblast growth factor (Invitrogen) in collagen-coated dishes Cultured. For differentiation, the medium was changed to differentiation medium (DM) (DMEM supplemented with 2% bovine serum and 1% penicillin-streptomycin) and cultured for 3 days. GM and DM were replenished every 24 hours.
単一線維の調製のため、マウス由来のEDL筋を単離し、以前に記載されているように1型コラーゲンを用いた消化により解離させた（N. Ito, et al., Nat. Med. 19, 101-6 (2013)）。 For the preparation of single fibers, EDL muscle from mice was isolated and dissociated by digestion with type 1 collagen as previously described (N. Ito, et al., Nat. Med. 19 , 101-6 (2013)).
（３）組織調製
マウスを頸椎脱臼により犠牲にした。体重及び筋肉を計量した。TA筋、EDL筋、腓腹筋（GC）、ヒラメ筋（SOL）、DIA筋及び心筋を標準的な解剖方法を用いて採取し、過剰な脂肪、結合組織及び腱を除去した。いくつかの筋肉を組織学的分析のために液体窒素で冷却したイソペンタン中で凍結し、他の筋肉はRNA又はタンパク質単離のために液体窒素中で凍結し、サンプルを−80℃にて保存した。
(3) Tissue preparation Mice were sacrificed by cervical dislocation. Body weight and muscle were weighed. TA, EDL, gastrocnemius (GC), soleus (SOL), DIA and myocardium were collected using standard dissection methods to remove excess fat, connective tissue and tendons. Some muscles are frozen in isopentane cooled with liquid nitrogen for histological analysis, others are frozen in liquid nitrogen for RNA or protein isolation, and samples are stored at -80 ° C did.
［実施例１］
Tg/mdxマウスでは、mdxマウスと同程度にリアノジン受容体アイソフォーム1（RyR1）がニトロシル化されていることから（データは示さず）、Tg/mdxマウスにおけるニトロシル化RyR1の機能を調べるため、野生型（WT）マウス、Tg/mdxマウス及びmdxマウス由来の筋芽細胞の初代培養物を用いてカフェイン刺激に対する応答性を分析した。
[Example 1]
In Tg / mdx mice, ryanodine receptor isoform 1 (RyR1) is nitrosylated to the same extent as mdx mice (data not shown), so to investigate the function of nitrosylated RyR1 in Tg / mdx mice, Responsiveness to caffeine stimulation was analyzed using primary cultures of myoblasts derived from wild type (WT) mice, Tg / mdx mice and mdx mice.
簡単に説明すると、in vitro実験のため、以前に記載の方法（N. Ito, et al., Nat. Med. 19, 101-6 (2013)）をわずかに変更してFluo-4を用いて[Ca2+]cを記録した。筋管をPSS中で4μM Fluo-4 AM（Dojindo）と共に室温で30分間インキュベートし、色素の均一な細胞内分布を可能にした。37℃で5分インキュベートした後、Fluo-4が負荷された細胞を倒立顕微鏡（Olympus）のステージに載せた。蛍光強度の変化を1秒毎に測定した。カフェインを50mMの濃度でバッファーに溶解し、筋管にアプライした。データは、正規化した蛍光ΔF/F0：ΔF/F0＝(Fmax - F0)/F0（式中、Fmaxは最大蛍光であり、F0は試薬への暴露前の蛍光である）として計算した。 Briefly, for in vitro experiments, Fluo-4 was used with slight modifications to the previously described method (N. Ito, et al., Nat. Med. 19, 101-6 (2013)). [Ca 2+ ] c was recorded. Myotubes were incubated with 4 μM Fluo-4 AM (Dojindo) in PSS for 30 minutes at room temperature to allow uniform intracellular distribution of the dye. After incubating at 37 ° C. for 5 minutes, the cells loaded with Fluo-4 were placed on the stage of an inverted microscope (Olympus). Changes in fluorescence intensity were measured every second. Caffeine was dissolved in buffer at a concentration of 50 mM and applied to the myotubes. Data are normalized fluorescence ΔF / F 0 : ΔF / F 0 = (F max -F 0 ) / F 0 where F max is the maximum fluorescence and F 0 is the fluorescence before exposure to the reagent. Calculated).
その結果を図1のAに示す。図1のAは、カフェイン刺激（20mM）後のWTマウス、Tg/mdxマウス及びmdxマウス由来の筋芽細胞のCa2+応答性の最大振幅を示している。WTマウス由来の筋芽細胞をカフェインで刺激した場合、大量のCa2+が筋小胞体（SR）から細胞質へ放出されたが、mdx筋芽細胞はわずかに少量のCa2+を放出した。一方、Tg/mdxマウスから調製した筋芽細胞培養物では、予想外にもWT培養物と同様のレベルで大量のCa2+がSRから放出された（図1のA）。Tg/mdx培養物におけるRyR1はmdx培養物と同様のレベルでニトロシル化されていると考えられるが、[Ca2+]i濃度の上昇はmdxほどではなく、Tg/mdxマウスにおけるRyR1の機能はmdxマウスとは対照的に野生型と同程度に維持されていた。 The results are shown in FIG. FIG. 1A shows the maximum amplitude of Ca 2+ responsiveness of myoblasts derived from WT mice, Tg / mdx mice and mdx mice after caffeine stimulation (20 mM). When WT mouse-derived myoblasts were stimulated with caffeine, a large amount of Ca 2+ was released from the sarcoplasmic reticulum (SR) into the cytoplasm, whereas mdx myoblasts released a small amount of Ca 2+ . . On the other hand, in myoblast cultures prepared from Tg / mdx mice, a large amount of Ca 2+ was unexpectedly released from SR at the same level as WT cultures (A in FIG. 1). Although RyR1 in Tg / mdx cultures appears to be nitrosylated at levels similar to mdx cultures, the increase in [Ca 2+ ] i concentration is not as high as mdx, and the function of RyR1 in Tg / mdx mice In contrast to mdx mice, it was maintained at the same level as the wild type.
Tg/mdxとmdxとの間で細胞質から筋小胞体（SR）にCa2+を取り込む役割を担うSERCA（筋小胞体/小胞体Ca2+-ATPアーゼ）の機能が異なるという仮説をもとに、細胞質からSRへのSERCA媒介Ca2+再取り込みの機能を調べた。具体的には、筋小胞体（SR）からCa2+を放出するRyR1をそのアゴニストであるカフェインを用いて刺激することで、SR内のCa2+をすべて細胞質へ放出させた後の、細胞質からSRへのCa2+の再取り込みの時間を調べた。 Based on the hypothesis that SERCA (sarcoplasmic reticulum / endoplasmic reticulum Ca 2+ -ATPase), which plays a role in Ca 2+ uptake from cytoplasm into sarcoplasmic reticulum (SR), differs between Tg / mdx and mdx Furthermore, the function of SERCA-mediated Ca 2+ reuptake from cytoplasm to SR was investigated. Specifically, by stimulating RyR1 that releases Ca 2+ from the sarcoplasmic reticulum (SR) with its agonist caffeine, all Ca 2+ in the SR is released to the cytoplasm, The time for reuptake of Ca 2+ from the cytoplasm into the SR was examined.
その結果を図1のBに示す。図1のBは、単一指数を過渡減衰トレースにフィットすることにより測定した、WT、Tg/mdx及びmdx筋管におけるペーシング誘発性Ca2+過渡信号の平均減衰時間定数（タウ）を示すグラフであり、このパラメータがSERCA活性の指標であり、Ca2+過渡信号の平均減衰時間定数が低いほどSERCA活性は高いといえる。mdxでは、カフェイン刺激後の細胞質に放出されたCa2+のSRへの再取り込み時間が野生型と比較して長いのに対して、Tg/mdxマウスにおけるCa2+再取り込みの大部分がWTマウスのレベルに回復していた（図1のB）。このことは、mdxマウスとは異なり、Tg/mdxマウスにおけるSERCA機能が維持されたことを示唆している。 The result is shown in FIG. Figure 1B is a graph showing the average decay time constant (tau) of pacing-induced Ca 2+ transients in WT, Tg / mdx and mdx myotubes, measured by fitting a single index to the transient decay trace. This parameter is an index of SERCA activity, and the lower the average decay time constant of the Ca 2+ transient signal, the higher the SERCA activity. In mdx, the reuptake time of Ca 2+ released in the cytoplasm after caffeine stimulation into SR is longer compared to wild type, whereas the majority of Ca 2+ reuptake in Tg / mdx mice It recovered to the level of WT mice (B in Fig. 1). This suggests that SERCA function was maintained in Tg / mdx mice unlike mdx mice.
骨格筋では、SERCA2Aアイソフォームが主に興奮収縮連関の間のSRへのCa2+再取り込みに寄与していると報告されている（A. E. Rossi, et al., Muscle Nerve. 33, 715-31 (2006)）。また、ジストロフィー筋においてSERCA活性の低下が観察されており（A. Divet, et al., Pflugers Arch. 444, 634-43 (2002)；A. Divet, et al., Acta Physiol. Scand. 184, 173-86 (2005)；M. E. Kargacin, et al., Biochim. Biophys. Acta. 1290, 4-8 (1996)）、これが細胞質Ca2+レベルの上昇にいたり、筋ジストロフィーにおける欠陥Ca2+処理に寄与している（D. G. Allen, et al., Can. J. Physiol. Pharmacol. 88, 83-91 (2010)）。 In skeletal muscle, SERCA2A isoforms have been reported to contribute mainly to Ca 2+ reuptake into SR during excitation-contraction coupling (AE Rossi, et al., Muscle Nerve. 33, 715-31 (2006)). In addition, a decrease in SERCA activity has been observed in dystrophic muscle (A. Divet, et al., Pflugers Arch. 444, 634-43 (2002); A. Divet, et al., Acta Physiol. Scand. 184, 173-86 (2005); ME Kargacin, et al., Biochim. Biophys. Acta. 1290, 4-8 (1996)), which contributes to increased cytoplasmic Ca 2+ levels or to defective Ca 2+ treatment in muscular dystrophy (DG Allen, et al., Can. J. Physiol. Pharmacol. 88, 83-91 (2010)).
内腔SRのCa2+結合タンパク質であるカルセクエストリン及びサルカルメニンの発現レベルはSRのCa2+含量と相関している。カルセクエストリン及びサルカルメニンのmRNA及びタンパク質レベルは、WTマウス及びTg/mdxマウスと比較してmdxマウスでは低下していた（データは示さず）。これらの結果は、mdxマウスのものと比較してTg/mdxマウスの高いSR Ca2+貯蔵能がSERCA活性の低下により生じ、これがそれぞれの培養物の種々のカフェイン応答性を生じたことを示している。 The expression levels of calsequestrin and sarcarmenin, which are Ca 2+ binding proteins in lumen SR, correlate with the Ca 2+ content of SR. Calsequestrin and sarcalmenin mRNA and protein levels were decreased in mdx mice compared to WT and Tg / mdx mice (data not shown). These results indicate that the high SR Ca 2+ storage capacity of Tg / mdx mice compared to that of mdx mice was caused by a decrease in SERCA activity, which resulted in various caffeine responsiveness of each culture. Show.
以上から、RyR1の超ニトロシル化及びSERCA活性の低下がTg/mdxマウスにおいてCa2+動態の異常を誘導することが示された。 These results indicate that hypernitrosylation of RyR1 and a decrease in SERCA activity induce abnormal Ca 2+ kinetics in Tg / mdx mice.
［実施例２］
サルコリピン（SLN）、ホスホランバン、ミオレグリン（MLN）及びDWORFがSERCA1及び2の調節に役割を果たすことが知られていたため（D. M. Anderson et al., Cell. 160, 595-606 (2015)；B. R. Nelson et al., Science 351, 271-275 (2016)）、これらのアイソフォームの発現レベルをin vivoで調べた。
[Example 2]
Since sarcolipine (SLN), phospholamban, myoregulin (MLN) and DWORF were known to play a role in the regulation of SERCA1 and 2 (DM Anderson et al., Cell. 160, 595-606 (2015); BR Nelson et al., Science 351, 271-275 (2016)), and the expression levels of these isoforms were examined in vivo.
ウエスタンブロット分析は、以前に記載されている通りに行った（N. Ito, et al., Nat. Med. 19, 101-6 (2013)）。TA筋からの10μgのタンパク質のサンプルをMini-PROTEAN TGXプレキャストゲル（BIO-RAD）にロードし、ゲル電気泳動を行った。5mA/mm2で1時間の半乾燥ブロッティングによりサンプルをimmobilon PVDF膜（Millipore）に移した。サルコリピンに対するポリクローナルウサギ抗体（Millipore)）と共に膜を4℃で一晩インキュベートした。抗αチューブリン（SIGMA）及び抗GAPDH（Santa Cruz）をローディング対照として使用した。バンドの強度はImage Jソフトウエアを用いて解析した。 Western blot analysis was performed as previously described (N. Ito, et al., Nat. Med. 19, 101-6 (2013)). A 10 μg protein sample from TA muscle was loaded onto a Mini-PROTEAN TGX precast gel (BIO-RAD) and subjected to gel electrophoresis. Samples were transferred to immobilon PVDF membrane (Millipore) by semi-dry blotting at 5 mA / mm 2 for 1 hour. Membranes were incubated overnight at 4 ° C. with a polyclonal rabbit antibody against sarcolipin (Millipore). Anti-α tubulin (SIGMA) and anti-GAPDH (Santa Cruz) were used as loading controls. Band intensities were analyzed using Image J software.
また、mRNAの発現レベルを調べるため、総RNAをTRIzol試薬（Life Technologies）を用いて単離した。RT-PCRのために、第一鎖cDNAをQuantiTect逆転写キット（Qiagen）を用いて合成した。サルコリピンのトランスジーンの発現レベルは、MyiQシングルカラーシステム（Bio-Rad）においてSYBR Premix Ex TaqII（Takara）を用いて定量RT-PCR（qRT-PCR）により評価した。qRT-PCRのためのプライマー配列は以下の通りである：サルコリピンのフォーワードプライマー（5’-GGTCCTTGGTAGCCTGAGTG-3’：配列番号3）及びリバースプライマー（5’-CGGTGATGAGGACAACTGTG-3’：配列番号4）。遺伝子発現レベルは18S rRNAに対して正規化した。 In addition, in order to examine the expression level of mRNA, total RNA was isolated using TRIzol reagent (Life Technologies). For RT-PCR, first strand cDNA was synthesized using QuantiTect reverse transcription kit (Qiagen). The expression level of the sarcolipin transgene was evaluated by quantitative RT-PCR (qRT-PCR) using SYBR Premix Ex TaqII (Takara) in a MyiQ single color system (Bio-Rad). The primer sequences for qRT-PCR are as follows: Sarcolipin forward primer (5'-GGTCCTTGGTAGCCTGAGTG-3 ': SEQ ID NO: 3) and reverse primer (5'-CGGTGATGAGGACAACTGTG-3': SEQ ID NO: 4). Gene expression levels were normalized to 18S rRNA.
その結果、Tg/mdxマウスにおけるSERCA1及び2の発現レベルはWTマウス及びmdxマウスに類似であった（データは示さず）。しかし、mdxマウスにおけるサルコリピン（SLN）のタンパク質及びmRNAレベルは、WTマウス及びTg/mdxマウスにおいてそれぞれ20倍及び6倍であった（図2のA及びB）。さらに、TM/nNOS KOマウス及びmdx/nNOS KOマウスのSLN発現レベルはTg/mdxマウス及びmdxマウスと比較して有意に低減した（図2のA）。これらの結果は、nNOSが産生するNOが部分的にSLN発現を調節することを示唆しうる。しかしながら、ホスホランバン、MLN及びDWORFは変化しない発現レベルを示した（データは示さず）。Olsonらの研究グループは、非コードRNAによりコードされるペプチドMLN及びDWORFは、SERCA活性の活性化又は阻害による心筋及び骨格筋生理学の重要な調節因子であることを示している（Anderson et al., (2015)前掲；Nelson et al., (2016)前掲）。しかしながら、ジストロフィー筋においてのみSERCAのSLN媒介阻害が観察された。したがって、SLNはジストロフィー筋の重要な調節因子であると考えられ、DMD/BMDにおけるようなジストロフィー表現型を改善するための手段を提供する。 As a result, the expression levels of SERCA1 and 2 in Tg / mdx mice were similar to those in WT mice and mdx mice (data not shown). However, sarcolipin (SLN) protein and mRNA levels in mdx mice were 20-fold and 6-fold in WT and Tg / mdx mice, respectively (A and B in FIG. 2). Furthermore, the SLN expression level of TM / nNOS KO mice and mdx / nNOS KO mice was significantly reduced compared to Tg / mdx mice and mdx mice (A in FIG. 2). These results may suggest that the NO produced by nNOS partially regulates SLN expression. However, phospholamban, MLN and DWORF showed unchanged expression levels (data not shown). Olson et al.'S research group has shown that the peptides MLN and DWORF encoded by non-coding RNA are important regulators of myocardial and skeletal muscle physiology by activating or inhibiting SERCA activity (Anderson et al. , (2015) supra; Nelson et al., (2016) supra). However, SLN-mediated inhibition of SERCA was observed only in dystrophic muscle. Thus, SLN appears to be an important regulator of dystrophic muscle and provides a means for improving the dystrophic phenotype as in DMD / BMD.
以上から、mdxにおいてSERCA機能を抑制する分子としてサルコリピン（SLN）を同定した。SLNはSERCA機能を抑制的に制御することが知られており、その発現はmdxで野生型、Tg/mdxと比べて有意に高い（図2のA）。したがって、サルコリピンの過剰発現は、SERCA機能の低下をもたらすため、重症度の高い筋ジストロフィーの原因となる可能性がある。 Based on the above, sarcolipin (SLN) was identified as a molecule that suppresses SERCA function in mdx. SLN is known to suppress the SERCA function in an inhibitory manner, and its expression is significantly higher in mdx compared to wild type and Tg / mdx (A in FIG. 2). Therefore, overexpression of sarcolipine may cause a decline in SERCA function and may cause a highly severe muscular dystrophy.
［実施例３］
ニトロシル化RyR1機能がmdxマウスにおけるSERCAの機能的回復によりレスキューされるかどうかを調べるため、siRNAに基づくSLNノックダウンを利用してサルコリピン（SLN）を阻害した。
[Example 3]
To investigate whether nitrosylated RyR1 function is rescued by SERCA functional recovery in mdx mice, siRNA-based SLN knockdown was used to inhibit sarcolipin (SLN).
最初に、サルコリピンのsiRNAを調製した。マウスサルコリピンcDNA（配列番号5及び6、それぞれエキソン1及び2）の配列をもとに、配列番号6の208〜226番の塩基を標的とするsiRNA#2、及び配列番号6の140〜158番の塩基を標的とするsiRNA#3を設計し、製造業者（SIGMA）の推奨に従って調製した。具体的な配列は以下の通りである：
siRNA#2： 5’-CUUCCAAUGCUCUAUUGUCTT-3’（配列番号7）
5’-GACAAUAGAGCAUUGGAAGTT-3’（配列番号8）
siRNA#3： 5’-CUCGUGAGGUCCUACCAAUTT-3’（配列番号9）
5’-AUUGGUAGGACCUCACGAGTT-3’（配列番号10）
First, siRNA for sarcolipin was prepared. Based on the sequence of mouse sarcolipin cDNA (SEQ ID NOs: 5 and 6,
siRNA # 2: 5'-CUUCCAAUGCUCUAUUGUCTT-3 '(SEQ ID NO: 7)
5'-GACAAUAGAGCAUUGGAAGTT-3 '(SEQ ID NO: 8)
siRNA # 3: 5'-CUCGUGAGGUCCUACCAAUTT-3 '(SEQ ID NO: 9)
5'-AUUGGUAGGACCUCACGAGTT-3 '(SEQ ID NO: 10)
初代筋芽細胞に、陽性対照、陰性siRNA、及び2種のサルコリピンsiRNAを72時間かけてトランスフェクトした。siRNAに基づくサルコリピンのノックダウンを行ったmdx初代筋芽細胞におけるサルコリピン及びα-チューブリンのウエスタンブロッティングを実施した。その結果、SLN発現レベルは、SLN siRNAによるノックダウンにより80％まで低下した（図3のA）。 Primary myoblasts were transfected with a positive control, negative siRNA, and two sarcolipin siRNAs over 72 hours. Western blotting of sarcolipin and α-tubulin was performed in mdx primary myoblasts that had been knocked down of sarcolipin based on siRNA. As a result, the SLN expression level was reduced to 80% by knockdown with SLN siRNA (A in FIG. 3).
次に、siRNAに基づくSLNノックダウンにより、mdxマウスから調製された初代筋芽細胞培養物においてカフェインに対するRyR1応答性が変化するかを調べた。実施例２と同様の手順で行った。その結果、mdx筋芽細胞では、2種のsiRNAによるサルコリピンの阻害によってカフェイン刺激Ca2+放出の振幅が増大した（図3のB）。このことは、mdx筋芽細胞におけるRyR1機能が陰性対照と比較してSLNノックアウトにより回復したことを示している。 Next, it was examined whether or not RyR1 responsiveness to caffeine changes in primary myoblast cultures prepared from mdx mice by siRNA-based SLN knockdown. The same procedure as in Example 2 was performed. As a result, in mdx myoblasts, the amplitude of caffeine-stimulated Ca 2+ release was increased by inhibition of sarcolipin by two siRNAs (FIG. 3B). This indicates that RyR1 function in mdx myoblasts was restored by SLN knockout compared to the negative control.
また、SLNノックダウン後の、SERCA機能、すなわち細胞質からSRへのSERCA媒介Ca2+再取り込みの機能を調べた。実施例２と同様の手順で行った。その結果、mdx筋芽細胞におけるSERCA機能もまた陰性対照と比較してSLNノックダウンにより改善した（図3のC）。 Moreover, SERCA function after SLN knockdown, that is, SERCA-mediated Ca 2+ reuptake function from cytoplasm to SR was examined. The same procedure as in Example 2 was performed. As a result, SERCA function in mdx myoblasts was also improved by SLN knockdown compared to the negative control (C in FIG. 3).
以上の結果は、サルコリピンの阻害によって、SERCA活性の改善と共にSRのCa2+含量の上昇がmdxマウスにおけるRyR1の機能的回復に至ることを示唆している。 These results suggest that inhibition of sarcolipin leads to functional recovery of RyR1 in mdx mice, along with improved SERCA activity and increased SR Ca 2+ content.
［実施例４］
サルコリピンの阻害が筋ジストロフィーの表現型に影響を及ぼすか否かをさらに調べるため、サルコリピンノックアウト/ジストロフィン欠失（SLN KO/mdx）マウスを作出した。簡単に説明すると、SLN KOマウス（供与を受けたもの。Nakano H et al., 50: 337-45, 2011に記載）を前述のmdxマウス（本出願人により作出され自家繁殖されているもの）と交配してSLN KO/mdxマウスを作出した。
[Example 4]
To further investigate whether inhibition of sarcolipin affects the muscular dystrophy phenotype, we generated sarcolipine knockout / dystrophin-deficient (SLN KO / mdx) mice. In brief, SLN KO mice (donated; described in Nakano H et al., 50: 337-45, 2011) are the mdx mice (created by the applicant and self-bred). And produced SLN KO / mdx mice.
作出したSLN KO/mdxマウスの握力及びトレッドミル運動は既報（Y. Aoki et al., Mol. Ther. 18, 1995-2005 (2010)）の通りに行った。このマウスでは、mdxマウスと比較して握力及びトレッドミル能力の有意な改善が観察された（図4のA及びB）。 The grip strength and treadmill movement of the produced SLN KO / mdx mice were performed as previously reported (Y. Aoki et al., Mol. Ther. 18, 1995-2005 (2010)). In this mouse, significant improvements in grip strength and treadmill ability were observed compared to mdx mice (FIGS. 4A and B).
この実験結果により、SERCA機能の操作を利用して筋機能を改善できることが明らかとなった。したがって、SLNによるSERCA機能の調節は、DMDのための可能性のある治療法となりうる。 From this experimental result, it became clear that muscle function can be improved by using operation of SERCA function. Thus, modulation of SERCA function by SLN can be a potential therapy for DMD.
結論として、サルコリピンを下方調節する又はSERCAに対するアフィニティを低下することにより筋ジストロフィーの治療法を開発することができる。また、サルコリピンの過剰な発現は、重症度の高い筋ジストロフィーのバイオマーカーとなる。 In conclusion, treatments for muscular dystrophy can be developed by down-regulating sarcolipin or reducing affinity for SERCA. In addition, excessive expression of sarcolipin is a biomarker for highly severe muscular dystrophy.
配列番号3〜4：人工（合成オリゴヌクレオチド）
配列番号7〜10：人工（siRNA、合成オリゴヌクレオチド）
SEQ ID NOs: 3-4: Artificial (synthetic oligonucleotide)
SEQ ID NOs: 7 to 10: Artificial (siRNA, synthetic oligonucleotide)
Claims (13)
被験物質又は因子の存在下にて、ジストロフィンを欠損する筋細胞における筋小胞体/小胞体Ca2+-ATPアーゼ（SERCA）の活性を測定するステップ、
被験物質又は因子の不在下におけるジストロフィンを欠損する筋細胞と比較してSERCAの活性が改善した場合に、上記被験物質又は因子を筋ジストロフィーの治療薬候補として同定するステップ
を含む方法。 A screening method for a therapeutic drug candidate for muscular dystrophy,
Measuring the activity of sarcoplasmic reticulum / endoplasmic reticulum Ca 2+ -ATPase (SERCA) in dystrophin-deficient myocytes in the presence of a test substance or factor;
A method comprising the step of identifying the test substance or factor as a therapeutic drug candidate for muscular dystrophy when the activity of SERCA is improved as compared with a myocyte deficient in dystrophin in the absence of the test substance or factor.
被験物質又は因子の不在下におけるジストロフィンを欠損する筋細胞と比較してRyR1の応答性が改善した場合に、上記被験物質又は因子を筋ジストロフィーの治療薬候補として同定するステップ
をさらに含む、請求項8又は9に記載の方法。 Measuring the responsiveness of ryanodine receptor isoform 1 (RyR1) in dystrophin-deficient muscle cells in the presence of a test substance or factor;
The method further comprises identifying the test substance or factor as a therapeutic drug candidate for muscular dystrophy when RyR1 responsiveness is improved as compared to a dystrophin-deficient myocyte in the absence of the test substance or factor. Or the method of 9.
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2019176864A1 (en) * | 2018-03-12 | 2019-09-19 | 国立大学法人 岡山大学 | Agent for treatment or prevention of muscular-dystrophy-related cardiomyopathy |
| WO2022014703A1 (en) * | 2020-07-17 | 2022-01-20 | 田辺三菱製薬株式会社 | Agent for preventing or treating muscular disease |
-
2016
- 2016-06-01 JP JP2016110232A patent/JP2017214337A/en active Pending
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