JP5830329B2 - A new marker of kidney damage - Google Patents

Description

本発明は、腎障害の新規マーカーに関するものであり、当該新規マーカーを用いて腎障害を検査する方法、当該マーカーを指標として腎障害のための治療剤等をスクリーニングする方法に関するものである。   The present invention relates to a novel marker for renal injury, and relates to a method for examining renal injury using the novel marker, and a method for screening therapeutic agents for renal injury using the marker as an index.

我が国において腎疾患の患者数は年々増加しており、国民の死因の第８位を占めている。例えば慢性腎臓病患者数は１３００万人と推測され、２６万人以上が透析を受けるなど、国民の健康に重大な影響を及ぼしている。腎疾患の予防・診断・治療法の確立は、国民の健康推進活動において極めて重要な課題である。   In Japan, the number of patients with kidney disease is increasing year by year, and is the eighth leading cause of death. For example, the number of patients with chronic kidney disease is estimated to be 13 million, and more than 260,000 people undergo dialysis, which has a significant impact on national health. Establishing prevention, diagnosis, and treatment methods for kidney disease is an extremely important issue in public health promotion activities.

腎疾患では、蛋白尿などの腎障害の存在を示す所見が得られる。慢性腎臓病患者においては、蛋白尿が多いほど心血管合併症の発症率が高く、逆に薬剤等により蛋白尿を減少させると、末期腎不全や心血管合併症の発症率が下がることが分かってきた。蛋白尿の制御が、腎疾患進行や心血管合併症の制御につながると考えられる。   In kidney disease, findings indicating the presence of kidney disorders such as proteinuria are obtained. In patients with chronic kidney disease, the higher the proteinuria, the higher the incidence of cardiovascular complications. Conversely, reducing proteinuria with drugs, etc., decreases the incidence of end-stage renal failure and cardiovascular complications. I came. Control of proteinuria is thought to lead to control of renal disease progression and cardiovascular complications.

血液は、腎糸球体中に入った後、糸球体内皮細胞、基底膜、上皮細胞を通って濾過され、尿となる。糸球体上皮細胞の足突起と足突起の間には、スリット膜という網の目構造がある。スリット膜は血漿蛋白の通過を最小限に抑えて、蛋白の尿への漏出を防ぐのに重要であると近年考えられるようになってきた。   After entering the glomeruli, the blood is filtered through glomerular endothelial cells, basement membranes, and epithelial cells to form urine. There is a mesh structure called a slit membrane between the foot processes of glomerular epithelial cells. Slit membranes have recently been considered to be important in minimizing plasma protein passage and preventing protein leakage into the urine.

ネフローゼ症候群または腎症の原因遺伝子として、NPHS1遺伝子（遺伝子産物はネフリン）およびNPHS2遺伝子（遺伝子産物はポドシン）などが報告されている（特許文献１，２）。ネフリンとポドシンは、細胞の膜表面に存在して、スリット膜の形成や細胞機能の維持に役割を果たしていると考えられている。ネフリン分子は、スリット膜のバリアー構造維持に直接関与している分子と考えられている。ポドシンはネフリンと結合性を持つことが報告されており、ネフリンを細胞質側から支えて、ネフリンの機能を維持する分子であると考えられている。しかしながら、これらの分子が細胞膜、特にスリット膜にどのようにして運搬されるのかは全く分かっていない。   As causative genes of nephrotic syndrome or nephropathy, NPHS1 gene (gene product is nephrin) and NPHS2 gene (gene product is podosin) have been reported (Patent Documents 1 and 2). Nephrin and podosin are thought to exist on the cell membrane surface and play a role in the formation of slit membranes and the maintenance of cell function. Nephrin molecules are considered to be directly involved in maintaining the barrier structure of the slit membrane. Podosine has been reported to bind to nephrin, and is thought to be a molecule that supports nephrin from the cytoplasmic side and maintains nephrin function. However, it is completely unknown how these molecules are transported to cell membranes, especially slit membranes.

スリット膜の構成における、ネフリンやポドシンの細胞膜への運搬機序が明らかになれば、蛋白尿などの腎障害の発症機序の解明につながり、その早期発見もしくは予防、症状軽減化が可能になると期待される。   If the mechanism of delivery of nephrin and podocin to the cell membrane in the structure of the slit membrane is clarified, it will lead to the elucidation of the onset mechanism of renal disorders such as proteinuria, and it will be possible to detect or prevent it early and reduce symptoms Be expected.

特開２００８−１６７７５９号公報JP 2008-167759 A 特表２００２−５０６８８３号公報Japanese translation of PCT publication No. 2002-506883

本発明の課題は、腎障害の新規マーカーを提供することである。   The subject of this invention is providing the novel marker of a renal disorder.

本願発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、生体分子を運搬する機能を持つEG5が正常ポドシンと結合し得ることに着目し、当該EG5が腎障害の新規マーカーとなり得ることを見出し、本発明を完成した。   As a result of intensive studies in view of the above problems, the inventors of the present application have found that EG5 having a function of transporting biomolecules can bind to normal podosin, and found that EG5 can be a novel marker of renal damage. The present invention has been completed.

すなわち、本発明は以下よりなる。
１．ポドシンと相互作用するEG5をマーカーとする、腎障害の検査方法。
２．EG5の発現量、EG5の糸球体上皮細胞における局在、EG5のポドシンへの結合能、EG5へのポドシンの結合能、およびEG5とポドシンとが結合してなる結合複合体の量からなる群から選択されるいずれか１の指標を検出することにより、EG5のポドシンとの相互作用が確認される、請求項１に記載の腎障害の検査方法。
３．EG5の糸球体上皮細胞における局在を検出することによる、請求項２に記載の腎障害の検査方法。
４．EG5とポドシンとが結合してなる、結合複合体。
５．EG5とポドシンとが結合してなる結合複合体をマーカーとする、腎障害の検査方法。
６．以下の工程を含む、被検物質の腎障害に対する作用を評価する方法：
被検物質の存在下で、EG5とポドシンを接触させる工程、
被検物質の非存在下と比べて、被検物質の存在下において、EG5の発現量が変化している場合、EG5の局在が変化している場合、もしくはEG5とポドシンとの結合複合体の量が変化している場合に、被検物質が腎障害に作用を有するものと判定される工程。
７．EG5とポドシンとの相互作用を変化させる物質を選択することによる、腎障害治療剤をスクリーニングする方法。
８．以下の工程を含む、請求項７に記載の腎障害治療剤をスクリーニングする方法：
被検物質の存在下において、EG5とポドシンを接触させる工程、
被検物質の非存在下よりも被検物質の存在下で、EG5の発現量が増加している被検物質、EG5の局在が回復傾向を示している被検物質、もしくはEG5とポドシンとが結合してなる結合複合体量が変化している被検物質を、選択する工程。
９．EG5発現増強剤からなる、ポドシンの機能調節剤。
１０．EG5発現増強剤が、EG5をコードする遺伝子を含む核酸である、請求項９に記載のポドシンの機能調節剤。
１１．EG5からなる、ポドシンの機能調節剤。 That is, this invention consists of the following.
1. A method for examining renal injury, using EG5 interacting with podocin as a marker.
2. EG5 expression level, localization of EG5 in glomerular epithelial cells, ability of EG5 to bind to podocin, ability to bind pod5 to EG5, and the amount of binding complex formed by binding of EG5 and podocin The method for examining renal injury according to claim 1, wherein the interaction of EG5 with podocin is confirmed by detecting any one of the selected indices.
3. The method for examining renal injury according to claim 2, wherein the localization of EG5 in glomerular epithelial cells is detected.
4). A binding complex consisting of EG5 and podocin.
5. A method for examining renal injury, wherein a marker is a binding complex formed by binding EG5 and podocin.
6). A method for evaluating the effect of a test substance on renal damage, comprising the following steps:
A step of contacting EG5 and podocin in the presence of a test substance,
When the expression level of EG5 is changed, the localization of EG5 is changed, or the binding complex of EG5 and podosin in the presence of the test substance compared to the absence of the test substance A step in which the test substance is determined to have an effect on kidney damage when the amount of the substance is changed.
7). A method for screening for a renal disorder therapeutic agent by selecting a substance that alters the interaction between EG5 and podocin.
8). A method for screening for a renal disorder therapeutic agent according to claim 7, comprising the following steps:
A step of contacting EG5 and podocin in the presence of a test substance,
A test substance in which the expression level of EG5 is increased in the presence of the test substance than in the absence of the test substance, a test substance in which the localization of EG5 shows a recovery tendency, or EG5 and podosin A step of selecting a test substance in which the amount of the bound complex formed by binding is changed.
9. A podosin function regulator comprising an EG5 expression enhancer.
10. 10. The function regulator of podosin according to claim 9, wherein the EG5 expression enhancer is a nucleic acid containing a gene encoding EG5.
11. Podosine function regulator consisting of EG5.

本発明により、腎障害についての新規マーカーEG5が提供されるため、腎障害を早期に診断することが可能となり、また腎障害の重症度等の腎障害についての情報を取得することが可能となる。また、EG5とポドシンとの相互作用に着目することにより、腎障害の治療剤をスクリーニングすることが可能となる。さらにEG5とポドシンとの相互作用について研究を進めることにより、腎障害の発症や進展のメカニズムを明らかにし、より有効な診断や、治療・予防等が可能になるものと考えられる。   According to the present invention, since a new marker EG5 for renal injury is provided, it becomes possible to diagnose renal injury early, and it is possible to obtain information about renal injury such as the severity of renal injury. . Further, by paying attention to the interaction between EG5 and podocin, it becomes possible to screen for a therapeutic agent for renal injury. Furthermore, by conducting research on the interaction between EG5 and podocin, it is considered that the mechanism of the onset and progression of renal damage will be clarified, and more effective diagnosis, treatment and prevention, etc. will be possible.

ステロイド剤抵抗性ネフローゼ症候群患者のNPHS2（ポドシン）遺伝子について変異解析した結果を示す図である。（実施例１）It is a figure which shows the result of carrying out the mutation analysis about the NPHS2 (podosin) gene of a steroid drug resistant nephrotic syndrome patient. (Example 1) 変異ポドシンには結合せず、正常ポドシンにのみ結合する蛋白質の同定過程を示す写真である。（実施例１）It is a photograph which shows the identification process of the protein which does not couple | bond with a mutant | denatured podocine but couple | bonds only with a normal podocine. (Example 1) EG5がポドシンに結合することを確認した結果を示す写真である。（実施例１）It is a photograph showing the result of confirming that EG5 binds to podosin. (Example 1) マウス腎糸球体における、EG5の局在を免疫組織染色により確認した結果を示す写真である。（実施例２）It is a photograph showing the result of confirming the localization of EG5 in mouse kidney glomeruli by immunohistochemical staining. (Example 2) ヒト腎組織におけるEG5の免疫組織染色の結果を示す写真である。（実施例３）It is a photograph showing the result of immunohistochemical staining of EG5 in human kidney tissue. (Example 3) 腎糸球体におけるスリット膜の構造の模式図である。It is a schematic diagram of the structure of the slit membrane in the kidney glomerulus. 腎細胞の培養系におけるEG5発現抑制のポドシンへの影響を確認した写真である。（実施例４）It is the photograph which confirmed the influence on the podocine of EG5 expression suppression in the culture system of a renal cell. (Example 4) 腎細胞の培養系におけるEG5過剰発現のポドシンへの影響を確認した写真である。（実施例５）It is the photograph which confirmed the influence of EG5 overexpression on the podocine in the culture system of a renal cell. (Example 5) 腎細胞の培養系におけるEG5過剰発現のポドシンへの影響を確認した写真である。（実施例５）It is the photograph which confirmed the influence on the podocine of the overexpression of EG5 in the culture system of a renal cell. (Example 5)

腎糸球体において血漿蛋白が通過して尿中に漏出するのを防ぐバリアーとして、糸球体上皮細胞と糸球体上皮細胞との間のスリット膜が重要であると考えられている（図６、Nat Genet. 2000 Apr;24(4):333-5. Getting a foothold in nephrotic syndrome. Somlo S, Mundel P.）。スリット膜の構成分子として、ネフリンとポドシンが知られている。ポドシンはNPHS2遺伝子によりコードされる蛋白質であり、ネフリンと結合性を持つことが明らかにされている。ポドシンは、ネフリンを細胞質側から支え、ネフリンのバリアー機能を維持すると考えられている。   The slit membrane between glomerular epithelial cells and glomerular epithelial cells is considered to be important as a barrier that prevents plasma proteins from passing through and leaking into the urine in the glomeruli (FIG. 6, Nat. Genet. 2000 Apr; 24 (4): 333-5. Getting a foothold in nephrotic syndrome. Somlo S, Mundel P.). Nephrin and podosin are known as constituent molecules of the slit membrane. Podosine is a protein encoded by the NPHS2 gene and has been shown to bind to nephrin. Podosine is believed to support nephrin from the cytoplasmic side and maintain the barrier function of nephrin.

蛋白尿発症時のポドシンの動態について、抗ポドシン抗体を用いた二重染色蛍光抗体法により観察されている。正常な糸球体ではポドシンが係蹄にそった線状のパターンで観察され、ネフリンの近傍に存在することが明らかにされている。本発明の発明者らが、ステロイド剤抵抗性ネフローゼ症候群患者（症例１）の腎組織を抗ポドシン抗体で免疫組織染色したところ、係蹄に沿った染色は全く観察されず、糸球体上皮細胞体部にのみ限局して染色が観察された。係蹄とは、糸球体内皮細胞と基底膜と糸球体上皮細胞をまとめて指すものである。   The dynamics of podocin at the onset of proteinuria has been observed by the double-staining fluorescent antibody method using an anti-podosin antibody. In normal glomeruli, podosin is observed in a linear pattern along the snare, and it has been clarified that it exists in the vicinity of nephrin. When the inventors of the present invention immunohistochemically stained the renal tissue of a steroid-resistant nephrotic syndrome patient (case 1) with an anti-podosin antibody, no staining along the snare was observed, and the glomerular epithelial cell body Staining was observed only in the part. A snare refers to a glomerular endothelial cell, a basement membrane, and a glomerular epithelial cell collectively.

症例１に関し、ポドシンをコードするNPHS2遺伝子を解析したところ、R168H変異（アミノ酸配列の168番目のアルギニンがヒスチジンに変異）とR168C変異（アミノ酸配列の168番目のアルギニンがシステインに変異）の複合へテロ変異を有していた。   Analysis of the NPHS2 gene that encodes podosin for case 1 revealed that R168H mutation (the 168th arginine in the amino acid sequence was mutated to histidine) and the R168C mutation (the 168th arginine in the amino acid sequence was mutated to cysteine) It had a mutation.

Zhang et al. Kidney Int (2004) 66:945-954には、ポドシン遺伝子の塩基配列の467番と468番の間にチミジンが挿入されてフレームシフトがおこり、166番のアミノ酸がストップコドンにかわる変異と、R168Sの複合へテロ変異を持つ患者（症例２）について記載されている。症例２の腎組織では、症例１と同様に糸球体上皮細胞体部のみ限局して抗ポドシン抗体の染色が観察されている。ポドシン遺伝子の塩基配列の419番のグアニンが欠失してフレームシフトがおこり、164、173、178番にアルギニン、170番にリジンが出現し、180番のアミノ酸がストップコドンに変わる変異を持つ患者（症例３）についても記載されているが、症例３の腎組織では、ある程度係蹄に沿って抗ポドシン抗体の染色が観察されている。症例２と症例３は、ポドシンの染色性がかなり違うにもかかわらず、臨床経過は似ており重篤である。Zhangらによると、V180M変異とR138Q変異の複合ヘテロ変異を持つ患者（症例４）の腎組織では、少しだけ（症例２と症例３の間程度）係蹄に沿って抗ポドシン抗体の染色が観察されたことが報告されており、症例４は、ネフローゼ症候群発症が７歳で、末期腎不全が１７歳と進行がかなり遅かった。   In Zhang et al. Kidney Int (2004) 66: 945-954, a thymidine was inserted between positions 467 and 468 of the base sequence of the podocin gene, resulting in a frameshift, and the amino acid at position 166 replaced the stop codon. It describes a patient (case 2) with a mutation and a composite heterozygous R168S mutation. In the kidney tissue of case 2, as in case 1, staining of the anti-podosin antibody is observed only in the glomerular epithelial cell body. A patient with a mutation that causes a frameshift due to deletion of 419th guanine in the base sequence of the podocin gene, arginine appears at positions 164, 173, and 178, lysine appears at position 170, and amino acid at position 180 changes to a stop codon Although (Case 3) is also described, in the renal tissue of Case 3, anti-podosin antibody staining is observed to some extent along the snare. Cases 2 and 3 have a similar clinical course and are severe, although the staining properties of podosin are quite different. According to Zhang et al., Anti-podosin antibody staining was observed along the snare only slightly (in cases 2 and 3) in the renal tissue of patients with a heterozygous V180M and R138Q mutation (case 4). In case 4, the onset of nephrotic syndrome was 7 years old, and end-stage renal failure was 17 years old.

症例１〜４から、ポドシンの係蹄における染色性の程度と臨床の重症度は相関していないことが分かった。症例１は、168番アルギニンしか変異が起こっていないにもかかわらず、ポドシンの係蹄における染色性が非常に悪く、少なくとも１歳半までにネフローゼ症候群を発症しており重篤である。これらのことから、168番アルギニンの異常により、ポドシンが糸球体上皮細胞の表面に運ばれる機構が非常に障害される可能性が高いと考えた。   From cases 1 to 4, it was found that the degree of staining of podosin's snare and the clinical severity were not correlated. Case 1 is severely affected by necrosis syndrome by at least one and a half years, even though only 168 arginine is mutated, and the staining of podocin on the snare is very poor. Based on these facts, we thought that the abnormality of No. 168 arginine is highly likely to impair the mechanism by which podosin is transported to the glomerular epithelial cell surface.

そこで本発明者らは、168番アルギニンが変異したポドシンには結合しないが、正常ポドシンに結合する蛋白質を探索したところ、運搬蛋白として知られているキネシンのファミリーであるEG5を同定した。また免疫組織染色により、EG5が腎糸球体に発現・局在していることを確認した。さらに症例１の腎組織を用いてEG5について免疫組織染色を行ったところ、EG5の染色強度が均一ではなくむらがあることが分かった。これに対して、現時点では蛋白尿の症状がない症例の腎組織については、EG5が比較的均一な線状のパターンで染色されることがわかった。従って、EG5がポドシンの糸球体上皮細胞の表面への運搬に関与していることが示唆され、EG5が腎障害の新規マーカーとなり得ることが明らかになった。   Therefore, the present inventors searched for a protein that does not bind to podosin mutated in 168 arginine but binds to normal podosin, and identified EG5, a family of kinesins known as carrier proteins. Immunohistochemical staining confirmed that EG5 was expressed and localized in the glomeruli. Further, when immunohistochemical staining of EG5 was performed using the kidney tissue of Case 1, it was found that the staining intensity of EG5 was not uniform and uneven. On the other hand, it was found that EG5 was stained in a relatively uniform linear pattern in the renal tissue of cases without proteinuria at present. Therefore, it was suggested that EG5 is involved in the transport of podosin to the surface of glomerular epithelial cells, and it became clear that EG5 can be a novel marker of renal damage.

腎障害の新規マーカーであるEG5は、腎障害に関する種々の用途に利用することができる。例えば、腎障害の診断・検査方法、腎障害の治療・予防剤のスクリーニング方法に利用可能であり、腎障害の新規マーカーEG5は腎障害についての研究ツールとしても利用可能である。EG5は、ポドシンの糸球体上皮細胞の表面への運搬に関与していると考えられることから、EG5の機能の異常を検出することにより、早期に腎障害を診断したり、腎障害の重症度や進行を予測することが可能となる。また、ポドシンの糸球体上皮細胞の表面への運搬異常を改善することにより、根本的に腎障害を改善できる可能性がある。さらに、EG5が関与するような腎障害の発症・進行のメカニズムを新たに明らかにすることにより、より有効な診断方法や治療方法を確立することができると考えられる。   EG5, which is a novel marker for renal damage, can be used for various applications related to renal damage. For example, it can be used for diagnosis / inspection methods for renal disorders and screening methods for therapeutic / preventive agents for renal disorders, and the new marker EG5 for renal disorders can also be used as a research tool for renal disorders. Since EG5 is thought to be involved in the transport of podocin to the surface of glomerular epithelial cells, it can be diagnosed early by detecting abnormal EG5 function, and the severity of kidney damage And progress can be predicted. Moreover, it may be possible to fundamentally improve renal damage by improving abnormal transport of podocin to the surface of glomerular epithelial cells. Furthermore, it is considered that a more effective diagnostic method and therapeutic method can be established by newly elucidating the onset / progression mechanism of renal disorder in which EG5 is involved.

（腎障害の検査方法）
本発明は、EG5をマーカーとする、腎障害の検査方法に関する。EG5は、進化上保存されたサブファミリーを形成するＭ期キネシンの１つであり、ヒト正常組織におけるEG5の発現は、精巣や胸腺などに限定されると考えられていた。EG5は新規Ｍ期作用薬の標的分子とされ、EG5阻害剤は癌などの細胞増殖制御の異常が原因となる疾患の治療剤として有望と考えられてきた。本発明では、糸球体上皮細胞にEG5が局在していること、および、EG5がスリット膜構成分子であるポドシンと結合して相互作用していることが明らかにされ、EG5がポドシンと相互作用していることが示唆された。 (Examination method of renal disorder)
The present invention relates to a method for examining renal injury using EG5 as a marker. EG5 is one of M-phase kinesins that form an evolutionarily conserved subfamily, and expression of EG5 in normal human tissues was thought to be limited to the testis and thymus. EG5 is considered as a target molecule for a novel M-phase agonist, and EG5 inhibitors have been considered promising as therapeutic agents for diseases caused by abnormal cell growth control such as cancer. In the present invention, it has been clarified that EG5 is localized in glomerular epithelial cells, and that EG5 binds and interacts with podosin, which is a slit membrane constituent molecule, and EG5 interacts with podosin. It was suggested that

ポドシンと相互作用するEG5のアミノ酸配列、または該アミノ酸配列をコードする塩基配列についての情報は、例えば、公共の遺伝子データベースを利用して適宜取得することができる。本発明においてマーカーとしては、蛋白質であっても、核酸であってもよい。例えば、本発明のマーカーとして利用可能なEG5の塩基配列、アミノ酸配列は、Genbankアクセッション番号 NM_004523（Homo sapiens kinesin family member 11 (KIF11), mRNA）（配列番号１，３）、NM_010615（XM_129251）（Mus musculus kinesin family member 11 (Kif11), mRNA）（配列番号２，４）である。   Information about the amino acid sequence of EG5 that interacts with podosin or the base sequence encoding the amino acid sequence can be appropriately obtained using, for example, a public gene database. In the present invention, the marker may be a protein or a nucleic acid. For example, the base sequence and amino acid sequence of EG5 that can be used as a marker of the present invention are Genbank accession number NM_004523 (Homo sapiens kinesin family member 11 (KIF11), mRNA) (SEQ ID NO: 1 and 3), NM_010615 (XM_129251) ( Mus musculus kinesin family member 11 (Kif11), mRNA) (SEQ ID NOs: 2, 4).

本発明におけるEG5として、上記のEG5に相当するホモログ蛋白質を適宜利用することができる。該ホモログ蛋白質として、例えば、配列表に記載された配列番号１または２と高い相同性（通常70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上）を有し、かつ、上記EG5が有する機能（例えば、ポドシンとの結合性等）を持つ蛋白質が、本発明におけるEG5として利用可能である。上記ホモログ蛋白質とは、例えば、配列番号１または２に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が付加、欠失、置換、挿入されたアミノ酸配列からなる蛋白質であって、通常変化するアミノ酸数が30アミノ酸以内、好ましくは10アミノ酸以内、より好ましくは5アミノ酸以内、最も好ましくは3アミノ酸以内である。   As EG5 in the present invention, a homologous protein corresponding to the above EG5 can be appropriately used. The homologous protein has, for example, high homology (usually 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, most preferably 95% or more) with SEQ ID NO: 1 or 2 described in the sequence listing. In addition, a protein having the function of EG5 (for example, binding property to podosin) can be used as EG5 in the present invention. The homologous protein is, for example, a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are added, deleted, substituted, or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2, and the number of normally changing amino acids is Within 30 amino acids, preferably within 10 amino acids, more preferably within 5 amino acids, most preferably within 3 amino acids.

本発明におけるEG5をコードする遺伝子には、例えば、配列番号３または４の塩基配列自体、あるいは、配列番号３または４のいずれかに記載の塩基配列からなる核酸に対応する他の生物における内在性の遺伝子（ホモログ等）が含まれる。   The gene encoding EG5 in the present invention includes, for example, the endogenous nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 or 4 or the endogenous sequence in another organism corresponding to the nucleic acid comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 or 4. Genes (such as homologues).

また、配列番号３または４のいずれかに記載の塩基配列に対応する他の生物の内在性の核酸は、一般的に、それぞれ配列番号３または４のいずれかに記載の塩基配列からなる核酸と高い相同性を有する。高い相同性とは、50％以上、好ましくは70％以上、さらに好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上（例えば、95％以上、さらには96％、97％、98％または99％以上）の相同性を意味する。この相同性は、mBLASTアルゴリズム（Altschul et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-8; Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-7）によって決定することができる。   In addition, the endogenous nucleic acid of another organism corresponding to the base sequence described in either SEQ ID NO: 3 or 4 is generally a nucleic acid comprising the base sequence described in either SEQ ID NO: 3 or 4, respectively. Has high homology. High homology means 50% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, more preferably 90% or more (for example, 95% or more, further 96%, 97%, 98% or 99% or more). ) Homology. This homology is determined by the mBLAST algorithm (Altschul et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-8; Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-7 ) Can be determined.

当業者は、上記の高い相同性を持つ蛋白質から、EG5に機能的に同等な蛋白質を、ポドシンとの結合性の有無を指標として適宜選択し、本発明におけるEG5として利用することができる。   A person skilled in the art can appropriately select a protein functionally equivalent to EG5 from the above-mentioned proteins having high homology, using as an index the presence or absence of binding to podosin, and use it as EG5 in the present invention.

なお本発明においては、EG5とポドシンの結合複合体も、本発明のマーカーとして利用可能である。EG5については上述の通りである。ポドシンのアミノ酸配列、または該アミノ酸配列をコードするDNA配列についての情報は、例えば、公共の遺伝子データベースを利用して適宜取得することができる。本発明においてポドシンは、蛋白質であっても、核酸であってもよい。例えば、本発明において利用可能なポドシンの塩基配列、アミノ酸配列は、Genbankアクセッション番号 NM_014625（Homo sapiens nephrosis 2, idiopathic, steroid-resistant (podocin) (NPHS2), mRNA）（配列番号５，７）またはNM_130456（Mus musculus nephrosis 2 homolog, podocin (human) (Nphs2), mRNA）（配列番号６，８）である。本発明においてEG5と結合複合体をなすポドシンとして、上記のポドシンに相当するホモログ蛋白質も適宜利用することができる。該ホモログ蛋白質として、例えば、配列番号５または６に記載されたアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が付加、欠失、置換、挿入されたアミノ酸配列からなる蛋白質であってもよい。   In the present invention, a binding complex of EG5 and podocin can also be used as the marker of the present invention. EG5 is as described above. Information on the amino acid sequence of podosin or the DNA sequence encoding the amino acid sequence can be appropriately obtained using, for example, a public gene database. In the present invention, podosin may be a protein or a nucleic acid. For example, the base sequence and amino acid sequence of podosin usable in the present invention are Genbank accession number NM_014625 (Homo sapiens nephrosis 2, idiopathic, steroid-resistant (podocin) (NPHS2), mRNA) (SEQ ID NO: 5, 7) or NM — 130456 (Mus musculus nephrosis 2 homolog, podocin (human) (Nphs2), mRNA) (SEQ ID NOs: 6 and 8). In the present invention, a homologous protein corresponding to the above-described podosin can be used as appropriate as podosin forming a binding complex with EG5. The homologous protein may be, for example, a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are added, deleted, substituted, or inserted in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 5 or 6.

本発明におけるポドシンをコードする遺伝子には、例えば、配列番号７または８の塩基配列自体あるいは、配列番号７または８のいずれかに記載の塩基配列からなる核酸に対応する他の生物における内在性の遺伝子（ホモログ等）が含まれる。配列番号７または８のいずれかに記載の核酸に対応する他の生物の内在性の遺伝子は、一般的に、それぞれ配列番号７または８のいずれかに記載の核酸と高い相同性を有する。   The gene encoding podosin in the present invention includes, for example, the endogenous sequence in other organisms corresponding to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 or 8 or the nucleic acid comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 or 8. Genes (such as homologs) are included. The endogenous genes of other organisms corresponding to the nucleic acid described in either SEQ ID NO: 7 or 8 generally have high homology with the nucleic acid described in either SEQ ID NO: 7 or 8, respectively.

当業者は、上記の高い相同性を持つ蛋白質から、ポドシンに機能的に同等な蛋白質を、EG5との結合性の有無を指標として適宜選択し、EG5と当該蛋白質との結合複合体を、本発明のマーカーとして利用することが可能である。   A person skilled in the art appropriately selects a protein functionally equivalent to podosin from the above-mentioned highly homologous proteins using the presence or absence of the binding property to EG5 as an index, and forms a binding complex between EG5 and the protein. It can be used as a marker of the invention.

本発明の検査方法において、EG5またはEG5とポドシンとの結合複合体をマーカーとするとは、個体から採取された被検試料について、EG5に関する指標、例えば、EG5の発現量、EG5の糸球体上皮細胞における局在、EG5のポドシンへの結合能、EG5へのポドシンの結合能、およびEG5とポドシンとが結合してなる結合複合体の量からなる群から選択されるいずれか１の指標を検出することにより、EG5のポドシンとの相互作用を確認することを意味する。   In the test method of the present invention, EG5 or a binding complex of EG5 and podosin is used as a marker for a test sample collected from an individual, an index relating to EG5, for example, expression level of EG5, glomerular epithelial cells of EG5 Any one index selected from the group consisting of localization in EG5, binding ability of EG5 to podocin, binding ability of podocin to EG5, and the amount of binding complex formed by binding of EG5 and podocin This means that the interaction of EG5 with podosin is confirmed.

腎障害とは、腎臓に疾病・外傷等で何らかの異常が生じ、腎臓としての機能に障害が出た状態であり、主に蛋白尿などの尿異常の状態を意味する。腎障害を呈する疾患としては、慢性腎臓病（ＣＫＤ）、急性腎不全など様々な疾患があり、糖尿病性腎症、膜性腎症、巣状糸球体硬化症、膜性増殖性糸球体腎炎、ループス腎炎、ＩｇＡ腎症、糸球体腎炎、糸球体に病的な物質が沈着して起こるアミロイド腎症、糖尿病性糸球体腎症、ネフローゼ症候群、抗生物質を含む薬剤などによる間質性腎炎や腎障害などの腎疾患が挙げられる。また腎障害は、糖尿病、高血圧、痛風、肝疾患、SLEや慢性関節リウマチ、膠原病などの腎疾患以外の疾患に伴って起こる場合もある。   Kidney disorder is a condition in which some abnormality has occurred in the kidney due to illness or trauma, and the function of the kidney is impaired, and mainly means a state of urine abnormality such as proteinuria. There are various diseases such as chronic kidney disease (CKD) and acute renal failure as diseases that cause renal disorder, such as diabetic nephropathy, membranous nephropathy, focal glomerulosclerosis, membranoproliferative glomerulonephritis, Lupus nephritis, IgA nephropathy, glomerulonephritis, amyloid nephropathy caused by the deposition of pathological substances in the glomerulus, diabetic glomerulonephropathy, nephrotic syndrome, drugs containing antibiotics, etc. Examples include renal diseases such as disability. Renal disorders may also occur with diseases other than renal diseases such as diabetes, hypertension, gout, liver disease, SLE, rheumatoid arthritis, and collagen disease.

本発明において検査の対象となる「個体」とは、通常ヒトであるが、本発明の検査方法は必ずしもヒトのみを被検対象とする方法に限定されない。ヒト以外の生物（好ましくは、哺乳動物であり、より好ましくはマウス、ラット、サル、イヌ、ネコ等の脊椎動物や実験動物）を検査対象とすることもできる。   In the present invention, the “individual” to be tested is usually a human, but the testing method of the present invention is not necessarily limited to a method in which only humans are tested. Living organisms other than humans (preferably mammals, more preferably vertebrates such as mice, rats, monkeys, dogs, cats, and experimental animals) can also be examined.

本発明における個体は、既に何らかの疾患に罹患している患者であってもよいし、疾患についての診断がなされていない個体であってもよい。   The individual in the present invention may be a patient who already suffers from some kind of disease, or may be an individual who has not been diagnosed for the disease.

本発明において個体から採取される被検試料としては、例えば、血液、尿、代謝物、手術等により採取あるいは切除した組織（好ましくは腎組織）または細胞（例えば、腎由来細胞）、検査等の目的で採取された体液等を例示することができる。   Examples of test samples collected from an individual in the present invention include, for example, tissues (preferably kidney tissues) or cells (eg, kidney-derived cells) or cells collected or excised by blood, urine, metabolites, surgery, etc. Examples include body fluids collected for the purpose.

本発明の検査方法において、EG5の発現量、EG5の糸球体上皮細胞における局在、EG5のポドシンへの結合能、EG5へのポドシンの結合能、およびEG5とポドシンとが結合してなる結合複合体の量等の指標の測定は、当業者に公知の技術を用いて適宜実施することが可能である。   In the test method of the present invention, the expression level of EG5, the localization of EG5 in glomerular epithelial cells, the ability of EG5 to bind to podocin, the ability to bind podocin to EG5, and the binding complex formed by binding of EG5 and podocin Measurement of an index such as the amount of body can be appropriately performed using techniques known to those skilled in the art.

例えば、上記指標は、EG5を認識する抗体、EG5とポドシンとの結合複合体を認識する抗体、もしくはポドシンを認識する抗体等を用いて測定することができる。これらの抗体を用いて、例えば、ウェスタンブロッティング法、ELISA法、免疫組織染色法等を実施して、上記指標を測定することが可能である。
当業者に周知の方法、例えば、酵素結合免疫測定法(ELISA)、二重モノクローナル抗体サンドイッチイムノアッセイ法、モノクローナルポリクローナル抗体サンドイッチアッセイ法、免疫蛍光法、ウェスタンブロッティング法、ドットブロッティング法、免疫沈降法、プロテインチップによる解析法（蛋白質 核酸 酵素 Vol.47 No.5（2002）、蛋白質 核酸 酵素 Vol.47 No.8（2002））、2次元電気泳動法、SDSポリアクリルアミド電気泳動法、免疫組織染色法が挙げられるが、これらに限定されない。 For example, the index can be measured using an antibody that recognizes EG5, an antibody that recognizes a binding complex of EG5 and podosin, an antibody that recognizes podosin, or the like. Using these antibodies, for example, Western blotting method, ELISA method, immunohistochemical staining method and the like can be performed to measure the index.
Methods well known to those skilled in the art, such as enzyme-linked immunoassay (ELISA), double monoclonal antibody sandwich immunoassay, monoclonal polyclonal antibody sandwich assay, immunofluorescence, western blotting, dot blotting, immunoprecipitation, protein Analysis methods using chips (Protein Nucleic Acid Enzyme Vol.47 No.5 (2002), Protein Nucleic Acid Enzyme Vol.47 No.8 (2002)), 2D electrophoresis, SDS polyacrylamide electrophoresis, immunohistochemical staining For example, but not limited to.

本発明の検査方法に用いる抗体としては、特に制限はないが、例えばモノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体の両方を利用することができる。本発明のマーカーに結合する抗体は、当業者に公知の方法により調製することが可能である。本発明の抗体の形態には、特に制限はなく、本発明の検査方法に用いることが可能であれば、上記ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のほかに、ヒト抗体、遺伝子組み換えによるヒト型化抗体、さらにその抗体断片や抗体修飾物も含まれる。また市販されている抗体を適宜使用することも可能である。   The antibody used in the test method of the present invention is not particularly limited. For example, both a monoclonal antibody and a polyclonal antibody can be used. Antibodies that bind to the marker of the present invention can be prepared by methods known to those skilled in the art. The form of the antibody of the present invention is not particularly limited, and if it can be used in the test method of the present invention, in addition to the polyclonal antibody and the monoclonal antibody, a human antibody, a humanized antibody by genetic recombination, Such antibody fragments and modified antibodies are also included. Commercially available antibodies can also be used as appropriate.

本発明の検査方法に用いられる抗体は必要に応じ、PEG等により修飾されていてもよい。また、β−ガラクトシダーゼ、マルトース結合蛋白質、GST、緑色蛍光蛋白質(GFP)等との融合蛋白質として製造して、二次抗体を用いずに検出できるようにすることも可能である。また、ビオチン等により抗体を標識することによりアビジン、ストレプトアビジン等を用いて抗体の検出、回収を行い得るように改変することもできる。   The antibody used in the test method of the present invention may be modified with PEG or the like, if necessary. It can also be produced as a fusion protein with β-galactosidase, maltose binding protein, GST, green fluorescent protein (GFP), etc. so that it can be detected without using a secondary antibody. Further, by labeling the antibody with biotin or the like, it can be modified so that the antibody can be detected and recovered using avidin, streptavidin or the like.

被検試料中の上記指標の測定方法の別の態様としては、EG5やEG5とポドシンとの結合複合体に対して特異的に結合する物質（核酸、ペプチド、蛋白質、化合物等）に化学標識させ、その標識された複合体を検出することによっても行うことができる。   As another embodiment of the method for measuring the above-mentioned index in a test sample, a substance (nucleic acid, peptide, protein, compound, etc.) that specifically binds to a binding complex of EG5 or EG5 and podosin is chemically labeled. It can also be carried out by detecting the labeled complex.

上記指標は、蛋白質以外にEG5やポドシンをコードする遺伝子を対象として解析することにより検出することも可能である。遺伝子の解析は、当業者においては公知の技術を用いて適宜実施することが可能である。   The index can also be detected by analyzing a gene encoding EG5 or podosin in addition to the protein. Those skilled in the art can appropriately perform gene analysis using known techniques.

例えば、遺伝子の発現量を、該遺伝子の転写産物（mRNA）の生成量を指標として測定する場合、例えば、被検試料からRNA試料を調製し、該RNA試料に含まれるEG5やポドシンをコードするRNAの量を測定する。また、被検試料からcDNA試料を調製し、該cDNA試料に含まれる本発明のマーカーをコードするcDNAの量を測定することによって、発現量を評価することも可能である。被検試料からのRNA試料やcDNA試料は、個体から採取された被検試料から、当業者に周知の方法で調製することができる。このような方法としては、当業者に周知の方法、例えばノーザンブロッティング法、RT-PCR法、DNAアレイ法、in situ ハイブリダイゼーション等を挙げることができる。   For example, when measuring the expression level of a gene using the gene transcription product (mRNA) production amount as an index, for example, an RNA sample is prepared from a test sample and EG5 or podosin contained in the RNA sample is encoded. Measure the amount of RNA. It is also possible to evaluate the expression level by preparing a cDNA sample from the test sample and measuring the amount of cDNA encoding the marker of the present invention contained in the cDNA sample. RNA samples and cDNA samples from test samples can be prepared from test samples collected from individuals by methods well known to those skilled in the art. Examples of such methods include methods well known to those skilled in the art, such as Northern blotting, RT-PCR, DNA array, in situ hybridization, and the like.

本発明の検査方法の一態様として、例えば、腎障害の存在を判定する方法が例示される。腎障害の存在を判定する方法は、以下の工程を含むものである。
（ａ）個体から採取された被検試料について、EG5に関する指標を測定する工程。
（ｂ）EG5に関する指標が異常を示す場合には、腎障害が存在すると判定する工程。 As one aspect | mode of the test | inspection method of this invention, the method of determining presence of a renal disorder is illustrated, for example. The method for determining the presence of a renal disorder includes the following steps.
(A) A step of measuring an index relating to EG5 for a test sample collected from an individual.
(B) A step of determining that a renal disorder is present when the index regarding EG5 indicates abnormality.

「EG5に関する指標が異常を示す」とは正常な個体から採取された被検試料と比較して異常であることを意味し、例えばEG5の発現量が変化している（低い、もしくは、高い）、EG5が係蹄に沿ってではなく、糸球体上皮細胞の内部に局在している割合が高い、EG5のポドシンへの結合能が変化（低下もしくは昂進）している、EG5へのポドシンの結合能が変化（低下もしくは昂進）している、あるいはEG5とポドシンとが結合してなる結合複合体の量が変化（低下もしくは増加）している、等が例示される。   “An index related to EG5 shows an abnormality” means that it is abnormal as compared to a test sample collected from a normal individual. For example, the expression level of EG5 is changed (low or high). EG5 is located along glomerular epithelial cells, not along the snares, but has a high proportion of EG5 binding to podosin (decreased or promoted). Examples thereof include a change in binding ability (decrease or increase), or a change (decrease or increase) in the amount of binding complex formed by binding of EG5 and podosin.

また、本発明の検査方法を、例えば、腎障害の進行度を判定する方法に用いることも可能である。腎障害の進行度を判定する方法は例えば、間隔をおいて個体から採取された被検試料について、EG5に関する指標を測定し、前に採取した被検試料と後に採取した被検試料のEG5に関する指標の変化を検出することにより、腎障害の進行を判定することが可能と考えられる。   Moreover, it is also possible to use the inspection method of this invention for the method of determining the progression degree of a renal disorder, for example. The method for determining the degree of progression of kidney damage is, for example, measuring an index relating to EG5 for a test sample collected from an individual at intervals, and relating to EG5 of the test sample collected before and after the test sample collected It is considered possible to determine the progression of renal damage by detecting changes in the index.

後に採取した被検試料におけるEG5に関する指標が、前に採取した被検試料と比較して異常な方向へ変化している場合には、腎障害が進行することが可能と考えられる。腎障害が進行しているとは、例えば、軽微な状態から重篤な状態へ進行していることを意味する。逆に、後に採取した被検試料におけるEG5に関する指標が、前に採取した被検試料と比較して正常な方向へ変化している場合には、腎障害が回復に向かっている、つまり軽微な状態へと向かっていると判定される。またこの場合は、EG5の代償機構の破綻等により、EG5の指標自体は正常化するものの腎障害自体は悪化しているというような状態も想定し得る。   If the index regarding EG5 in the test sample collected later changes in an abnormal direction as compared with the test sample collected earlier, it is considered that renal damage can progress. The progression of kidney damage means, for example, that it has progressed from a minor condition to a severe condition. Conversely, if the index related to EG5 in the test sample collected later changes in the normal direction compared to the test sample collected earlier, the renal disorder is recovering, that is, it is minor. It is determined that it is heading to the state. In this case, due to the failure of the compensation mechanism of EG5 and the like, it may be assumed that the EG5 index itself is normalized but the renal disorder itself is getting worse.

腎障害の進行度を判定する方法においては、複数回個体から被検試料を採取せずとも、採取した被検試料におけるEG5に関する指標を、対照と比較することによって、腎障害の進行度を判定することも可能である。即ち、一回の測定によって、進行度の判定を行うこともできる。例えば、健常者に由来する試料を対照とした際には、取得した試料におけるEG5に関する指標が異常である場合に、疾患が進行しているものと判定される。他方、EG5に関する指標が対照と比較して変わらない、もしくは異常ではない場合に、疾患から回復している、もしくは快方に向かっているものと判定される。   In the method of determining the degree of progression of kidney damage, the degree of progression of kidney damage can be determined by comparing the EG5 index in the collected sample with the control without collecting the sample from multiple individuals. It is also possible to do. That is, the degree of progress can be determined by a single measurement. For example, when a sample derived from a healthy person is used as a control, it is determined that the disease is progressing when the index related to EG5 in the obtained sample is abnormal. On the other hand, when the index regarding EG5 does not change or is not abnormal as compared with the control, it is determined that the disease has recovered from the disease or is heading toward improvement.

抗EG5抗体を用いて腎組織を免疫組織染色することにより、EG5の糸球体上皮細胞における局在を確認することが可能である。係蹄に沿って比較的均一な線状のパターンで染色が確認された場合は、正常な腎組織と判定され、染色強度が均一ではなく、むらがある場合は、EG5の局在が異常であり、腎障害である、もしくは、腎障害進行していると判定することが可能である。   It is possible to confirm the localization of EG5 in glomerular epithelial cells by immunohistochemically staining renal tissue with an anti-EG5 antibody. If staining is confirmed in a relatively uniform linear pattern along the snare, it is determined that the kidney tissue is normal, and if the staining intensity is not uniform and uneven, the localization of EG5 is abnormal. Yes, it is possible to determine that it is a renal disorder or that the renal disorder is progressing.

本発明の検査方法を用いることで、腎障害の存在の有無や、進行度について検査することが可能となる。本発明の検査方法は、腎障害の予防や治療におけるより効率的な戦略、治療方針を決める手助けとなる。   By using the inspection method of the present invention, it is possible to inspect for the presence or absence of kidney injury and the degree of progression. The test method of the present invention helps to determine a more efficient strategy and treatment policy in the prevention and treatment of renal disorders.

（被検物質の腎障害に対する作用を評価する方法、および腎障害治療剤をスクリーニングする方法）
さらに本発明には、EG5とポドシンの結合を指標として、被検物質の腎障害に対する作用を評価する方法が含まれる。被検物質の腎障害に対する作用を評価する方法としては、以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む方法が例示される。
（ａ）被検物質の存在下で、EG5とポドシンを接触させる工程。
（ｂ）被検物質の非存在下と比べて、EG5の発現量が変化している場合、EG5の局在が変化している場合もしくは被検物質の存在下においてEG5とポドシンとの結合複合体の量を変化させる場合に、被検物質が腎障害に作用を有するものと判定される工程。
好ましくは工程（ｂ）は、被検物質の非存在下と比べて、被検物質の存在下において、EG5の発現量が増加している、EG5の局在が回復傾向を示している、または、EG5とポドシンとの結合複合体量が正常化している場合に、被検物質が腎障害に治療効果を有するものと判定される工程である。 (Method for evaluating the effect of test substance on renal injury and screening for therapeutic agent for renal injury)
Furthermore, the present invention includes a method for evaluating the effect of a test substance on renal injury using the binding of EG5 and podosin as an index. Examples of the method for evaluating the effect of the test substance on renal damage include a method including the following steps (a) and (b).
(A) A step of bringing EG5 and podocin into contact in the presence of a test substance.
(B) Compared with the absence of the test substance, when the expression level of EG5 is changed, when the localization of EG5 is changed, or in the presence of the test substance, the binding complex of EG5 and podosin A step in which it is determined that the test substance has an action on kidney damage when the amount of the body is changed.
Preferably, in the step (b), the expression level of EG5 is increased in the presence of the test substance compared to the absence of the test substance, the localization of EG5 shows a recovery tendency, or This is a step in which the test substance is determined to have a therapeutic effect on kidney damage when the amount of the combined complex of EG5 and podocin is normalized.

なお上記（ｂ）の工程において、被検物質の存在下におけるEG5の局在の観察もしくはEG5とポドシンとの結合複合体量の測定は、観察時もしくは測定時には被検物質が存在しない状況を含むことを意味する。例えば、腎由来細胞に被検物質を接触させた後にEG5の発現量を測定する場合や、モデルマウスに被検物質を投与して、腎組織を免疫染色する場合などを含み得る。   In the step (b), the observation of the localization of EG5 in the presence of the test substance or the measurement of the binding complex amount of EG5 and podosin includes the situation where the test substance does not exist at the time of observation or measurement. Means that. For example, it may include a case where the expression level of EG5 is measured after contacting a test substance with kidney-derived cells, or a case where a test substance is administered to a model mouse to immunostain kidney tissue.

本発明における被検物質としては、既存の種々の薬物であってもよいし、新たに合成される薬物や化合物であってもよい。本発明の被検物質の腎障害に対する作用を評価する方法では、種々の化合物について、腎疾患の治療効果の程度を評価したり、被検物質の副作用の確認をすることが可能である。また、本発明の方法に供する被検物質は、例えば、DNAもしくはRNA等の核酸、または、核酸を内包したリポソーム（リン脂質小胞体）等であってもよい。本発明の方法によって、例えば、核酸を成分とする遺伝子治療剤について、腎障害の治療効果を検査することができる。   The test substance in the present invention may be various existing drugs, or newly synthesized drugs or compounds. In the method for evaluating the action of the test substance on renal damage of the present invention, it is possible to evaluate the degree of the therapeutic effect of renal diseases and confirm the side effects of the test substance for various compounds. In addition, the test substance used in the method of the present invention may be, for example, a nucleic acid such as DNA or RNA, or a liposome (phospholipid vesicle) encapsulating a nucleic acid. By the method of the present invention, for example, the therapeutic effect of renal disorder can be examined for a gene therapy agent containing nucleic acid as a component.

本方法におけるEG5の発現量、EG5の局在の観察もしくはEG5とポドシンの結合複合体の量の測定は、上述のとおりに実施することができる。例えば、EG5とポドシンとを接触させた試料について、EG5に対する抗体で免疫沈降を行い、その後沈降画分についてSDS-PAGEを行い、ポドシンと反応する抗体を用いて、ポドシンを検出するシステムなどを使用することができる。この際、ポドシンにはFLAGタグ（FLAG-tag）等が融合されていてもよく、ポドシンと反応する抗体として、FLAGタグに反応する抗FLAG抗体を使用して、間接的に結合複合体を検出してもよい。   The expression level of EG5, the observation of the localization of EG5, or the measurement of the binding complex of EG5 and podosin in the present method can be performed as described above. For example, a sample in which EG5 and podocin are brought into contact is immunoprecipitated with an antibody against EG5, then SDS-PAGE is performed on the precipitated fraction, and a system that detects podocin using an antibody that reacts with podocin is used. can do. At this time, a FLAG tag (FLAG-tag) or the like may be fused to the podosin, and the binding complex is detected indirectly by using an anti-FLAG antibody that reacts with the FLAG tag as an antibody that reacts with the podosin. May be.

EG5の発現量、EG5の局在の観察もしくはEG5とポドシンの結合複合体の量を測定するその他の方法として、例えば、腎由来細胞を用いた培養系や腎障害のモデル動物を利用して行うことも可能である。即ち、腎障害モデル動物に対して被検物質を投与し、該動物から取得された試料について、EG5の局在を観察する方法もしくはEG5とポドシンとの結合複合体の量を測定する方法が例示される。対照あるいは投与前と比べて、EG5の局在が回復傾向を示している場合（例えば、係蹄に沿って比較的均一な線状のパターンでEG5の染色が確認された場合）もしくは結合複合体の量が正常化している（例えば有意に増加している）場合には、該物質は腎障害に対して治療効果があるものと判定される。   Other methods for observing the expression level of EG5, the localization of EG5, or the amount of the binding complex of EG5 and podosin, for example, using a culture system using kidney-derived cells or a model animal of renal injury It is also possible. That is, examples include a method of administering a test substance to a kidney injury model animal and observing the localization of EG5 or measuring the amount of the binding complex of EG5 and podosin in a sample obtained from the animal. Is done. When the localization of EG5 shows a tendency to recover compared to control or pre-dose (eg, when EG5 staining is confirmed in a relatively uniform linear pattern along the snare) or binding complex If the amount of is normalized (eg, significantly increased), the substance is determined to have a therapeutic effect on kidney damage.

本発明において「治療」とは、腎障害に対して、必ずしも完全な治療効果を有する場合に限定せず、部分的な効果あるいは改善効果、または疾患進行を止める効果を有する場合も含まれる。また、該治療効果には、予防効果も含まれる。本発明の方法を用いることで、薬物の腎障害治療効果を効率的に判定することが可能となる。本発明の方法により、腎障害に有効な治療剤を効率的に選択することが可能となり、腎障害の治療におけるより効率的な戦略、治療を進める手助けになる。   In the present invention, “treatment” is not necessarily limited to a case having a complete therapeutic effect on a renal disorder, but also includes a case in which it has a partial effect or an improvement effect, or an effect to stop disease progression. The therapeutic effect includes a preventive effect. By using the method of the present invention, it becomes possible to efficiently determine the therapeutic effect of a drug on renal damage. According to the method of the present invention, it is possible to efficiently select a therapeutic agent effective for renal disorder, which helps to advance a more efficient strategy and treatment in the treatment of renal disorder.

また本発明には、EG5とポドシンとの相互作用を変化させる物質を選択することによる、腎障害治療剤をスクリーニングする方法も含まれる。腎障害治療剤のスクリーニング方法は、上記評価方法を利用することにより行うことができる。本スクリーニング方法は、上記評価方法における工程（ａ）および（ｂ）を含むことが好ましい。上記工程（ｂ）は、被検物質の非存在下よりも被検物質の存在下で、EG5の発現量が増加している被検物質、EG5の局在が回復傾向を示している被検物質もしくはEG5とポドシンとが結合してなる結合複合体量が変化している被検物質を選択することを意味する。   The present invention also includes a method of screening for a renal disorder therapeutic agent by selecting a substance that changes the interaction between EG5 and podocin. A screening method for a renal disorder therapeutic agent can be performed by utilizing the above evaluation method. The screening method preferably includes steps (a) and (b) in the evaluation method. In the step (b), the test substance in which the expression level of EG5 is increased in the presence of the test substance than in the absence of the test substance, and the test in which the localization of EG5 shows a recovery tendency This means selecting a test substance in which the amount of the binding complex formed by binding of the substance or EG5 and podosin is changed.

また本発明は、EG5を検出する各種抗体や、EG5とポドシンの結合複合体を検出する各種抗体を、腎障害の診断用、治療効果判定用または進行度判定用試薬として使用することにも及ぶ。   The present invention also extends to the use of various antibodies for detecting EG5, and various antibodies for detecting a binding complex of EG5 and podocin as reagents for diagnosis of renal injury, determination of therapeutic effect, or determination of progress. .

（ポドシンの機能調節剤）
さらに本発明は、EG5発現増強剤からなる、ポドシンの機能調節剤にも及ぶ。EG5発現増強剤は、EG5の発現量を増加させ得る物質であればいかなるものであってもよいが、好ましくはEG5をコードする遺伝子を含む核酸である。EG5をコードする遺伝子を含む核酸は、EG5をコードする遺伝子を含むものであればいかなるものであってもよい。当該EG5をコードする遺伝子を含む核酸は、EG5をコードする遺伝子を細胞等に導入するために使用され、例えばベクターに担持されていてもよい。また本発明は、EG5のタンパク質自体からなる、ポドシンの機能調節剤にも及ぶ。
本発明におけるポドシンの機能調節剤とは、ポドシンの細胞膜における発現を調節する薬剤であり、好ましくはポドシンの細胞膜における発現を増大させる薬剤である。生体内においては、ポドシンの糸球体上皮細胞の表面に局在することにより腎糸球体の機能が維持されていると考えられている。本発明のポドシンの機能調節剤は、腎糸球体の機能調節に作用し得るものと考えられ、腎障害の予防または治療剤として利用することが期待される。 (Podosine function regulator)
Furthermore, the present invention extends to a function regulator of podosin, which comprises an EG5 expression enhancer. The EG5 expression enhancer may be any substance that can increase the expression level of EG5, but is preferably a nucleic acid containing a gene encoding EG5. The nucleic acid containing the gene encoding EG5 may be any nucleic acid as long as it contains the gene encoding EG5. The nucleic acid containing the gene encoding EG5 is used for introducing the gene encoding EG5 into a cell or the like, and may be carried on a vector, for example. The present invention also extends to a podocyn function regulator comprising the EG5 protein itself.
The agent for regulating the function of podosin in the present invention is an agent that regulates the expression of podosin in the cell membrane, preferably an agent that increases the expression of podosin in the cell membrane. In vivo, it is considered that the function of renal glomeruli is maintained by localizing on the surface of glomerular epithelial cells of podosin. The function-regulating agent for podosin of the present invention is considered to be capable of acting on the function of renal glomerulus and is expected to be used as a preventive or therapeutic agent for renal damage.

本発明のポドシンの機能調節剤は、経口、皮下注射、静脈注射、局所投与等のいずれの経路で投与してもよい。また、製剤としては、通常、製薬的に許容される担体や賦形剤、その他添加剤を用いて製造した散剤、錠剤、細粒剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤等の経口剤、点眼剤、注射剤、坐剤等の非経口剤とすることができる。製薬的に許容される担体や賦形剤、その他添加剤としては、グルコース、ラクトース、ゼラチン、マンニトール、でんぷんペースト、トリケイ酸マグネシウム、コーンスターチ、ケラチン、コロイド状シリカ等があり、さらには、安定剤、増量剤、着色剤及び芳香剤の様な補助剤が挙げられる。これらの製剤は、各々当業者に公知慣用の製造方法により製造できる。本発明のポドシンの機能調節剤中に含まれる有効成分の配合量としては、適宜設定することができるが、０．１〜１００重量％が好適である。また、１日当たりの投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別等によって異なり一概に決定できないが、通常成人１日当り０．１〜１０００ｍｇ、好ましくは１〜６００ｍｇを１回または２〜４回程度に分けて投与するのが好ましい。   The function-regulating agent for podosin of the present invention may be administered by any route such as oral, subcutaneous injection, intravenous injection, and local administration. In addition, as preparations, oral preparations such as powders, tablets, fine granules, pills, capsules, granules, etc., usually produced using pharmaceutically acceptable carriers and excipients and other additives, eye drops It can be used as a parenteral agent such as an agent, injection, and suppository. Examples of pharmaceutically acceptable carriers and excipients, and other additives include glucose, lactose, gelatin, mannitol, starch paste, magnesium trisilicate, corn starch, keratin, colloidal silica, and the like. Adjuvants such as extenders, colorants and fragrances can be mentioned. Each of these preparations can be produced by a conventional production method known to those skilled in the art. The compounding amount of the active ingredient contained in the function regulator of podosin of the present invention can be appropriately set, but is preferably from 0.1 to 100% by weight. The daily dose varies depending on the patient's symptom, weight, age, sex, etc., and cannot be determined unconditionally, but is usually 0.1 to 1000 mg, preferably 1 to 600 mg, 1 to 2 or 4 times per day for an adult. It is preferable to administer it in divided portions.

以下、本発明を完成するに至る経緯と本発明の内容を実施例に示して、具体的に本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。   Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples of the background to the completion of the present invention and the contents of the present invention, but the present invention is not limited thereto.

（実施例１）ポドシンに結合する分子の同定
ポドシンが糸球体上皮細胞体部に限局している、ステロイド剤抵抗性ネフローゼ症候群患者（症例１）について、ポドシンをコードする遺伝子（NPHS2遺伝子）を解析した。その結果、患者はR168H（168番目のアルギニン（コドン：CGT）がヒスチジン（コドン：CAT）へ変異）とR168C（168番目のアルギニン（コドン：CGT）がシステイン（コドン：TGT）へ変異）の複合へテロ変異を持っていること、R168Hは父親から、R168Cは母親から遺伝したことがわかった（図１）。このことより、168番のアルギニンの異常により、ポドシンの細胞表面への運搬が障害されると考えられた。そこで、正常ポドシンには結合するが、168番のアルギニン異常のあるポドシンには結合しない蛋白質を同定した。 (Example 1) Identification of a molecule that binds to podosin Analysis of a gene encoding podosine (NPHS2 gene) in a steroid-resistant nephrotic syndrome patient (case 1) in which podosin is localized in the glomerular epithelial cell body did. As a result, the patient had a combination of R168H (168th arginine (codon: CGT) mutated to histidine (codon: CAT)) and R168C (168th arginine (codon: CGT) mutated to cysteine (codon: TGT)). It was found that it had a heterozygous mutation, R168H was inherited from the father, and R168C was inherited from the mother (Fig. 1). From this, it was considered that the transport of podosin to the cell surface was hindered by the abnormality of No.168 arginine. Therefore, a protein that binds to normal podosine but does not bind to 168 arginine abnormal podocine was identified.

FLAGtagのついたpCMV-tag2 vectorにNPHS2（ポドシン）cDNAを挿入したベクター、R168HもしくはR168Cの変異を持つ変異NPHS2（ポドシン）cDNAを挿入したベクター、または、pCMV-tag2 vectorそのもの（空ベクター）を、HEK293細胞にリポフェクタミンでトランスフェクションした。その後、Anti-FLAG M2 Agarose beads（SIGMA社）を使用して、FLAG結合蛋白質を抽出し、SDS-PAGEで、蛋白質を分離した。正常ポドシンを発現させた細胞にのみ確認されるバンドを切り出した（図２）。切り出したバンド（図２、バンド１１）に含まれる蛋白質について、Agilent 社製のLC/MS（岡山大学医学部共同実験室内にある）で、質量分析を行い、蛋白質を同定したところ、EG5（KIF11）が同定された。この分子は、キネシンの仲間で、細胞骨格を伝って、分子を運搬する役割があることが知られている。   The pCMV-tag2 vector with FLAGtag is inserted with the NPHS2 (podosin) cDNA, the mutated NPHS2 (podocin) cDNA with R168H or R168C mutation, or the pCMV-tag2 vector itself (empty vector), HEK293 cells were transfected with lipofectamine. Subsequently, FLAG binding protein was extracted using Anti-FLAG M2 Agarose beads (SIGMA), and the protein was separated by SDS-PAGE. A band that was confirmed only in cells expressing normal podosin was excised (FIG. 2). The protein contained in the cut out band (FIG. 2, band 11) was subjected to mass spectrometry using Agilent LC / MS (in the collaborative laboratory of Okayama University School of Medicine), and the protein was identified. EG5 (KIF11) Was identified. This molecule is a member of kinesin and is known to play a role in transporting the molecule through the cytoskeleton.

次に、EG5を認識する２種の抗体（ウサギ抗EG5抗体：AKINO03-A Cytoskeleton、ヤギ抗EG抗体：EG5(K-20):sc-31643 santa cruz ）を使って、免疫沈降を行った。免疫沈降で利用する抗体のサイズとポドシンのサイズが重なり、判別が難しかったため、NPHS2（ポドシン）cDNAの後ろにGFPtag、FLAG-tag、S-tagをつけ、発現する蛋白質のサイズを大きくした正常ポドシン遺伝子発現ベクターを以下の様に作製した。
ヒトのポドシン遺伝子（GenBankアクセッション番号NM_014625；配列番号５）を基に、以下に示す蛋白合成開始領域に設定したセンスプライマー（配列番号９、制限酵素EcoRI認識配列を含む）、および、終止コドンを含まないように設定したアンチセンスプライマー（配列番号１０、制限酵素XhoI認識配列を含む）を用いて、ヒトcDNAライブラリーを用いたPCRによりポドシン遺伝子領域を増幅した。PCR産物は、制限酵素EcoRVにより平滑末端処理されたpBluescriptKSにクローニングされ、シークエンシング解析により正しいDNA配列であることが確認された。その後、制限酵素EcoRIとXhoIによりポドシン遺伝子は切り出され、EcoRIとXhoIにより切断されたpCMVscript-GFPベクターに挿入された。シークエンシング解析により、挿入されたポドシン遺伝子領域は蛍光蛋白GFP、FLAG-tag、S-tagにアミノ酸フレームが一致していること、すなわち、融合蛋白として正しく発現されることが確認された。ここで、正常ポドシン遺伝子の発現ベクターをpCMVscript-GFP-野生型Podocinとした。
＜使用したプライマー＞
配列番号９；GAATTCGCCACCATGGAGAGGAGGGCGCGGAGCT
配列番号１０；CTCGAGTAACATGGGAGAGTCTTTCTT

次に、pcDNA3.1 にNPHS1（ネフリン）cDNAを挿入したベクターとpCMVscript-GFP-野生型Podocinを一緒に、HEK293細胞にトランスフェクションした。これらの細胞から、２種の抗体とプロテインGに吸着させて、蛋白質を抽出した。Negative controlとして、２種の抗体と同じウサギIgG、ヤギIgGを使用した。Positive controlとして、すでにポドシンに結合することが知られているネフリンに対する抗体（抗ネフリン抗体）を使用した。 Next, immunoprecipitation was performed using two types of antibodies that recognize EG5 (rabbit anti-EG5 antibody: AKINO03-A Cytoskeleton, goat anti-EG antibody: EG5 (K-20): sc-31643 santa cruz). Because the size of the antibody used for immunoprecipitation overlaps with the size of podosin, it was difficult to discriminate, so normal podosine with GFPHS, FLAG-tag, and S-tag added to the NPHS2 (podosin) cDNA to increase the size of the expressed protein. A gene expression vector was prepared as follows.
Based on the human podocin gene (GenBank accession number NM_014625; SEQ ID NO: 5), a sense primer (SEQ ID NO: 9, including restriction enzyme EcoRI recognition sequence) set in the protein synthesis initiation region shown below, and a stop codon The podosin gene region was amplified by PCR using a human cDNA library using an antisense primer (SEQ ID NO: 10, including a restriction enzyme XhoI recognition sequence) set so as not to contain it. The PCR product was cloned into pBluescriptKS that had been blunt-ended with the restriction enzyme EcoRV, and the correct DNA sequence was confirmed by sequencing analysis. Thereafter, the podosin gene was excised with restriction enzymes EcoRI and XhoI and inserted into the pCMVscript-GFP vector cleaved with EcoRI and XhoI. Sequencing analysis confirmed that the inserted podocyn gene region has the same amino acid frame as the fluorescent proteins GFP, FLAG-tag, and S-tag, that is, is correctly expressed as a fusion protein. Here, the expression vector of the normal podosin gene was pCMVscript-GFP-wild type Podocin.
<Primers used>
Sequence number 9; GAATTCGCCACCATGGAGAGGAGGGCGCGGAGCT
Sequence number 10; CTCGAGTAACATGGGAGAGTCTTTCTT

Next, a vector in which NPHS1 (nephrin) cDNA was inserted into pcDNA3.1 and pCMVscript-GFP-wild type Podocin were transfected into HEK293 cells. Proteins were extracted from these cells by adsorbing them to two types of antibodies and protein G. As negative control, the same rabbit IgG and goat IgG as the two kinds of antibodies were used. As a positive control, an antibody against nephrin (anti-nephrin antibody) that is already known to bind to podosin was used.

図３に示すように、２種の抗EG5抗体で免疫沈降した蛋白を泳動したレーンに、抗EG5抗体を反応させたところ、EG5のサイズと一致するバンドが認められ、２種の抗EG5抗体がEG5を認識すること、EG5が免疫沈降されていることが明らかになった（図３下段：レーン２，３）。そこで、この２種の抗EG5抗体で免疫沈降した蛋白質を泳動したレーンに抗FLAG-HRP抗体を反応させたところ、FLAG-ポドシンにサイズが一致するバンドが認められた（図３上段：レーン２，３）
以上の結果より、ヒトポドシンがヒトEG5と結合することが明らかになった。 As shown in FIG. 3, when the anti-EG5 antibody was reacted with the lane in which the protein immunoprecipitated with two types of anti-EG5 antibodies was run, a band corresponding to the size of EG5 was observed, and two types of anti-EG5 antibodies were observed. Was recognized to recognize EG5 and that EG5 was immunoprecipitated (FIG. 3, bottom: lanes 2 and 3). Thus, when the anti-FLAG-HRP antibody was reacted with the lane in which the protein immunoprecipitated with these two types of anti-EG5 antibodies was run, a band having the same size as FLAG-podosin was observed (upper lane: lane 2). , 3)
From the above results, it was revealed that human podocin binds to human EG5.

（実施例２）マウス組織におけるEG5の局在の確認
EG5の局在を、Balbcマウスの組織を用いて検討した。６週齢のマウスの腎臓組織を用いて、抗EG5抗体（(K-20):sc-31643 santa cruz）で、定法により免疫組織染色した。また同じ組織について、糸球体内皮細胞マーカーである抗PECAM1抗体(PECAM-1 (M-20): sc-1506 -R santa cruz)を用いて、定法により二重染色を行った。 (Example 2) Confirmation of localization of EG5 in mouse tissue
The localization of EG5 was examined using tissues of Balbc mice. Using 6-week-old mouse kidney tissue, immunohistochemical staining was performed with an anti-EG5 antibody ((K-20): sc-31643 santa cruz) by a conventional method. The same tissue was double-stained by a conventional method using an anti-PECAM1 antibody (PECAM-1 (M-20): sc-1506-R santa cruz) which is a glomerular endothelial cell marker.

図４に示したように、EG5は、抗PECAM1抗体（赤色）により染色された部分から離れてボウマン腔側に染色され、糸球体上皮細胞（ポドサイト）に存在することが明らかになった。緑色は、抗EG5抗体で染色した部分である。   As shown in FIG. 4, EG5 was stained on the Bowman cavity side away from the portion stained with the anti-PECAM1 antibody (red), and was found to be present in glomerular epithelial cells (podocytes). Green is the part stained with anti-EG5 antibody.

（実施例３）症例１の組織におけるEG5の局在
実施例１において解析を行った症例１の腎組織について、EG5の局在を実施例２と同様に定法により検出した。対照として、過去に大量の蛋白尿を呈していたが、現時点では蛋白尿を呈していない２例についてEG5の局在を確認した。抗EG5抗体としては(K-20):sc-31643 santa cruzを使用した。 (Example 3) Localization of EG5 in the tissue of Case 1 The localization of EG5 was detected in the same manner as in Example 2 in the renal tissue of Case 1 analyzed in Example 1. As a control, the localization of EG5 was confirmed in 2 cases which had a large amount of proteinuria in the past but not presently at present. (K-20): sc-31643 santa cruz was used as an anti-EG5 antibody.

図５に示すとおり、蛋白尿を呈していない２例のEG5の局在は、係蹄に沿って比較的均一な線状のパターンを示したが、症例１では、均一ではなくむらのある局在を示した。   As shown in FIG. 5, the localization of EG5 in two cases not presenting proteinuria showed a relatively uniform linear pattern along the snare, but in case 1, it was not uniform and was uneven. I was present.

（実施例４）EG5発現抑制による腎細胞への影響
腎細胞の培養系において、EG5の発現を抑制した場合の腎細胞への影響を確認した。コラーゲン上でHEK293細胞（ヒト胎児腎臓由来細胞）を培養し、実験を行った。培養を開始した日を0日目とする。0日目にHEK293細胞（ヒト胎児腎臓由来細胞）に、EG5に対するsiRNA（Dharmacon）をLipofectamine 2000（Invitrogen）を用いて導入した。培養2日目に、再びsiRNAを導入した。培養3日目にpCMVscript-GFP-野生型Podocinを、Lipofectamine 2000（Invitrogen）を用いて導入した。培養4日目に細胞を観察した。コントロールとして、non targeting RNAを導入した。 (Example 4) Influence on kidney cells by suppression of EG5 expression In a kidney cell culture system, the influence on kidney cells when EG5 expression was suppressed was confirmed. Experiments were performed by culturing HEK293 cells (human embryonic kidney-derived cells) on collagen. The day when culture is started is defined as day 0. On day 0, siRNA (Dharmacon) for EG5 was introduced into HEK293 cells (human embryonic kidney-derived cells) using Lipofectamine 2000 (Invitrogen). On the second day of culture, siRNA was again introduced. On the third day of culture, pCMVscript-GFP-wild type Podocin was introduced using Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Cells were observed on the fourth day of culture. As a control, non targeting RNA was introduced.

細胞を観察した結果を、図７に示す。写真の上段はコントロールの実験結果を示し、下段はEG5のsiRNAを導入した結果を示す。右側の写真は左側の写真の拡大像を示す。siRNAによりEG5の発現を抑制した場合、腎細胞の形態が変化していた。またEG5の発現を抑制した場合は、GFP -野生型Podocin蛋白の細胞膜への発現が減少していた。   The results of observing the cells are shown in FIG. The upper part of the photograph shows the experimental results of the control, and the lower part shows the results of introducing EG5 siRNA. The photo on the right shows an enlarged image of the photo on the left. When the expression of EG5 was suppressed by siRNA, the morphology of kidney cells was changed. When EG5 expression was suppressed, the expression of GFP-wild-type Podocin protein on the cell membrane was decreased.

（実施例５）EG5過剰発現による腎細胞への影響
まず、ヒトの変異型ポドシンcDNA発現ベクターを以下の様に作製した。正常ポドシン遺伝子の168番目のコドンcgtのアルギニンが、catのシステインに変異している変異型（R168C）と、 tgtのヒスチジンに変異している変異型（R168H）のcDNAを用いて、実施例１に従い、変異型ポドシンcDNA発現ベクターを作製した。シークエンシング解析により、正しいDNA配列であること、挿入されたポドシン遺伝子領域は蛍光蛋白GFP、FLAG-tag、S-tagにアミノ酸フレームが一致していること、すなわち、融合蛋白として正しく発現されることが確認された。ここで、変異型ポドシン遺伝子の発現ベクターをpCMVscript-GFP-変異型Podocin（R168C、および、R168H）とした。
次に、EG5の塩基配列（Genbankアクセッション番号 NM_004523；配列番号１）に基づき、ヒトcDNAライブラリーを用いたPCRにてEG5 cDNAを増幅後、pEBGベクターの Glutathione-S-transferase (GST)tagの下流に挿入した。シークエンシング解析により、正しいDNA配列であること、挿入されたEG5遺伝子領域はGST-tagにアミノ酸フレームが一致していること、すなわち、融合蛋白として正しく発現されることが確認された。ここで、正常型EG5遺伝子の発現ベクターをpGST-EG5とした。
次に腎細胞の培養系において、EG5を過剰に発現させた場合の腎細胞への影響を確認した。コラーゲン上でHEK293細胞（ヒト胎児腎臓由来細胞）を培養し、実験を行った。培養を開始した日を0日目とする。1日目にHEK293細胞（ヒト胎児腎臓由来細胞）に、GFPとFLAGペプチドの融合した野生型ポドシン（pCMVscript-GFP-野生型Podocin）か、GFPとFLAGペプチドの融合した変異型ポドシン（pCMVscript-GFP-変異型Podocin）を、GSTで標識したEG5（pGST-EG5）とともに、Lipofectamine 2000（Invitrogen）を用いて導入した。培養3日目に細胞を観察した。 (Example 5) Effect of EG5 overexpression on renal cells First, a human mutant podocin cDNA expression vector was prepared as follows. Example 1 Using the cDNA of the mutant type (R168C) in which the 168th codon cgt arginine of the normal podosin gene is mutated to cysteine in cat and the mutant type (R168H) in which argidine is mutated to tgt histidine According to the above, a mutant podocin cDNA expression vector was prepared. Sequencing analysis shows that the DNA sequence is correct, and that the inserted podocin gene region has the same amino acid frame as the fluorescent proteins GFP, FLAG-tag, and S-tag, that is, correctly expressed as a fusion protein. Was confirmed. Here, the expression vector of the mutant podocin gene was pCMVscript-GFP-mutant Podocin (R168C and R168H).
Next, based on the base sequence of EG5 (Genbank accession number NM_004523; SEQ ID NO: 1), EG5 cDNA was amplified by PCR using a human cDNA library, and then the pEBG vector Glutathione-S-transferase (GST) tag Inserted downstream. Sequencing analysis confirmed that the DNA sequence was correct and that the inserted EG5 gene region matched the GST-tag in amino acid frame, that is, correctly expressed as a fusion protein. Here, the normal EG5 gene expression vector was designated as pGST-EG5.
Next, in the kidney cell culture system, the effect on kidney cells when EG5 was overexpressed was confirmed. Experiments were performed by culturing HEK293 cells (human embryonic kidney-derived cells) on collagen. The day when culture is started is defined as day 0. On the first day, HEK293 cells (human embryonic kidney-derived cells) were either wild-type podocin fused with GFP and FLAG peptide (pCMVscript-GFP-wild-type Podocin) or mutated podocine fused with GFP and FLAG peptide (pCMVscript-GFP) -Mutant Podocin) was introduced using Lipofectamine 2000 (Invitrogen) together with EG5 labeled with GST (pGST-EG5). Cells were observed on the third day of culture.

細胞を観察した結果を、図８に示す。写真の上段はEG5を導入しなかった場合の実験結果を示し、下段はEG5を導入した場合の結果を示す。左側は野生型ポドシンを導入した結果、中央は変異型ポドシン（R168C）を導入した結果、右側は変異型ポドシン（R168H）を導入した結果を示す。図９は、変異型ポドシンを導入した結果の拡大像を示す。EG5の過剰発現により、細胞膜における野生型ポドシンの発現の増加が認められた。また、EG5を導入していない場合は、変異型ポドシンの細胞膜での発現が高度に低下していたが、EG5の過剰発現により、細胞膜での発現の増加傾向が認められた。これらの結果は変異型ポドシンの細胞膜発現における異常を、EG5の過剰発現が改善したことを示唆している。   The results of observing the cells are shown in FIG. The upper part of the photograph shows the experimental results when EG5 is not introduced, and the lower part shows the results when EG5 is introduced. The left side shows the result of introducing wild-type podocine, the center shows the result of introducing mutated podocine (R168C), and the right side shows the result of introducing mutated podocine (R168H). FIG. 9 shows an enlarged image of the result of introduction of mutant podocine. Increased expression of wild-type podosin in the cell membrane was observed due to overexpression of EG5. In the case where EG5 was not introduced, the expression of mutant podosin at the cell membrane was highly reduced, but an increase in the expression at the cell membrane was observed due to overexpression of EG5. These results suggest that EG5 overexpression has improved abnormalities in the cell membrane expression of mutant podocins.

実施例より、キネシン（運搬蛋白）の仲間であるEG5がポドシンと結合すること、EG5がポドシンが発現している糸球体上皮細胞に発現していることが判明した。これらのことから、EG5はポドシンを運搬する機能を有すると考えられ、EG5によるポドシンの運搬が、蛋白尿発症機序に関与していると考えられた。   From the examples, it was found that EG5, which is a member of kinesin (carrying protein), binds to podosin, and that EG5 is expressed in glomerular epithelial cells in which podosin is expressed. From these facts, EG5 is considered to have a function of transporting podosin, and it was considered that transport of podosin by EG5 is involved in the pathogenesis of proteinuria.

EG5とポドシンとの結合を研究することにより、蛋白尿発症について新たな知見が得られる可能性がある。また、EG5をマーカーとすることにより、蛋白尿等の腎障害の発症や重症度、進行を検査したり、新規または既存の物質の蛋白尿に対する影響を確認することが可能となり、蛋白尿を治療したり、軽減することが可能な新たな薬剤などをスクリーニングすることが可能になると考えられる。   Studying the binding of EG5 and podocin may provide new insights into the onset of proteinuria. In addition, by using EG5 as a marker, it is possible to examine the onset, severity, and progression of renal disorders such as proteinuria, and to confirm the effects of new or existing substances on proteinuria. It will be possible to screen for new drugs that can be reduced or reduced.

Claims (10)

ポドシンと相互作用するEG5をマーカーとする、腎障害の検査方法。 A method for examining renal injury, using EG5 interacting with podocin as a marker. EG5の発現量、EG5の糸球体上皮細胞における局在、EG5のポドシンへの結合能、EG5へのポドシンの結合能、およびEG5とポドシンとが結合してなる結合複合体の量からなる群から選択されるいずれか１の指標を検出することにより、EG5のポドシンとの相互作用が確認される、請求項１に記載の腎障害の検査方法。 EG5 expression level, localization of EG5 in glomerular epithelial cells, ability of EG5 to bind to podocin, ability to bind pod5 to EG5, and the amount of binding complex formed by binding of EG5 and podocin The method for examining renal injury according to claim 1, wherein the interaction of EG5 with podocin is confirmed by detecting any one of the selected indices. EG5の糸球体上皮細胞における局在を検出することによる、請求項２に記載の腎障害の検査方法。 The method for examining renal injury according to claim 2, wherein the localization of EG5 in glomerular epithelial cells is detected. EG5とポドシンとが結合してなる結合複合体をマーカーとする、腎障害の検査方法。 A method for examining renal injury, wherein a marker is a binding complex formed by binding EG5 and podocin. 以下の工程を含む、被検物質の腎障害に対する作用を評価する方法：
被検物質の存在下で、EG5とポドシンを接触させる工程、
被検物質の非存在下と比べて、被検物質の存在下において、EG5の発現量が変化している場合、EG5の局在が変化している場合、もしくはEG5とポドシンとの結合複合体の量が変化している場合に、被検物質が腎障害に作用を有するものと判定される工程。 A method for evaluating the effect of a test substance on renal damage, comprising the following steps:
A step of contacting EG5 and podocin in the presence of a test substance,
When the expression level of EG5 is changed, the localization of EG5 is changed, or the binding complex of EG5 and podosin in the presence of the test substance compared to the absence of the test substance A step in which the test substance is determined to have an effect on kidney damage when the amount of the substance is changed. EG5とポドシンとの相互作用を変化させる物質を選択することによる、腎障害治療剤をスクリーニングする方法。 A method for screening for a renal disorder therapeutic agent by selecting a substance that alters the interaction between EG5 and podocin. 以下の工程を含む、請求項６に記載の腎障害治療剤をスクリーニングする方法：
被検物質の存在下において、EG5とポドシンを接触させる工程、
被検物質の非存在下よりも被検物質の存在下で、EG5の発現量が増加している被検物質、EG5の局在が回復傾向を示している被検物質、もしくはEG5とポドシンとが結合してなる結合複合体量が変化している被検物質を、選択する工程。 A method for screening a therapeutic agent for renal injury according to claim 6 , comprising the following steps:
A step of contacting EG5 and podocin in the presence of a test substance,
A test substance in which the expression level of EG5 is increased in the presence of the test substance than in the absence of the test substance, a test substance in which the localization of EG5 shows a recovery tendency, or EG5 and podosin A step of selecting a test substance in which the amount of the bound complex formed by binding is changed. EG5発現増強剤からなる、ポドシンの機能調節剤。 A podosin function regulator comprising an EG5 expression enhancer. EG5発現増強剤が、EG5をコードする遺伝子を含む核酸である、請求項８に記載のポドシンの機能調節剤。 The function regulator of podosin according to claim 8 , wherein the EG5 expression enhancer is a nucleic acid containing a gene encoding EG5. EG5からなる、ポドシンの機能調節剤。 Podosine function regulator consisting of EG5.