JP2017209049A - Method for identifying target biomolecule, bead for specifying target biomolecule, set of beads, and target biomolecule identification apparatus - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、標的生体分子の特定方法、標的生体分子特定用ビーズ、ビーズのセット、及び標的生体分子特定装置に関する。 The present invention relates to a target biomolecule identification method, a target biomolecule identification bead, a bead set, and a target biomolecule identification apparatus.
ハイスループットで核酸分析を行う方法としては、光切断部位を介してビーズにプライマーを結合し、プライマーに試料中の核酸を捕捉させた後、プライマーを光誘導切断してＰＣＲを行い、標的核酸を増幅して増幅産物を分析する技術が知られている（特許文献１参照）。しかしながら、特許文献１に記載の技術では、増幅産物の分析を行う場合には、ビーズエマルジョンを回収して配列解析等を行う必要があった。
For high-throughput nucleic acid analysis, a primer is bound to a bead via a photocleavage site, the primer captures the nucleic acid in the sample, the primer is photoinduced cleaved, PCR is performed, and the target nucleic acid is A technique for amplifying and analyzing an amplification product is known (see Patent Document 1). However, in the technique described in
本発明の一実施態様は、標的生体分子の特定方法であって、
（ａ）生体分子を含む試料を、前記複数の標的生体分子の１つと結合し得るリガンドが固定化された、複数のビーズと接触させる工程と、
（ｂ）前記試料と接触させたビーズを、ビーズ毎に、個別の反応槽に配置する工程と、
（ｃ）前記ビーズが配置された前記反応槽に、核酸伸長反応に必要な試薬を添加する工程と、
（ｄ）前記ビーズが配置された反応槽内で核酸伸長反応を行う工程と、
（ｅ）前記核酸伸長反応中の各反応槽におけるプロトン発生量を測定する工程と、
（ｆ）前記プロトン発生量に基づいて、各反応槽内における核酸伸長の有無を判定する工程と、を含み、
前記複数のビーズは、各々電気特性の異なる材料を含み、
個々のビーズの少なくとも１種の電気特性を測定することにより、ビーズに固定化されたリガンドの種類を反応槽毎に特定する、標的生体分子の特定方法である。
One embodiment of the present invention is a method for identifying a target biomolecule comprising:
(A) contacting a sample containing a biomolecule with a plurality of beads on which a ligand capable of binding to one of the plurality of target biomolecules is immobilized;
(B) placing the beads brought into contact with the sample into individual reaction vessels for each bead;
(C) adding a reagent necessary for a nucleic acid extension reaction to the reaction vessel in which the beads are arranged;
(D) performing a nucleic acid extension reaction in a reaction vessel in which the beads are disposed;
(E) measuring a proton generation amount in each reaction tank during the nucleic acid extension reaction;
(F) determining the presence or absence of nucleic acid elongation in each reaction tank based on the proton generation amount,
Each of the plurality of beads includes materials having different electrical characteristics,
This is a target biomolecule identification method in which at least one electrical property of each bead is measured to identify the type of ligand immobilized on the bead for each reaction tank.
また、本発明の一実施態様は、所定の電気特性を有するビーズ体に当該電気特性に対応する種類のリガンドが固定化された、標的リガンド特定用ビーズである。 One embodiment of the present invention is a target ligand identifying bead in which a type of ligand corresponding to the electrical property is immobilized on a bead body having predetermined electrical property.
また、本発明の一実施態様は、所定の電気特性を有するビーズ体に当該電気特性に対応する種類のリガンドが固定化された、標的生体分子特定用ビーズを複数含む、標的生体分子を特定するためのビーズのセットである。 In one embodiment of the present invention, a target biomolecule including a plurality of target biomolecule identifying beads in which a ligand corresponding to the electrical property is immobilized on a bead body having a predetermined electrical property is specified. A set of beads for.
また、本発明の一実施態様は、複数の標的生体分子の１つと結合し得る標的リガンドが固定化されたビーズであって、固定化された前記リガンドの種類に対応する種類の電気特性をそれぞれ有する複数のビーズが、当該ビーズ毎に配置される反応槽と、前記ビーズが配置された前記反応槽内での核酸伸長反応によって生じるプロトンを前記反応槽毎に検出する検出部と、前記ビーズの電気特性を前記反応槽毎に測定する電気特性測定部と、前記検出部が検出する前記反応槽毎のプロトンの発生量に基づいて、前記反応槽内における核酸伸長の有無を前記反応槽毎に判定する核酸伸長判定部と、前記ビーズ核酸伸長判定部が判定する核酸伸長の有無に基づいて、前記ビーズ特定用核酸の配列を前記反応槽毎に特定するビーズ特定部と、前記電気特性測定部が測定する前記ビーズの電気特性に基づいて、前記リガンドの種類を前記反応槽毎に特定する標的生体分子特定部と、を備える標的核酸配列特定装置である。 One embodiment of the present invention is a bead on which a target ligand capable of binding to one of a plurality of target biomolecules is immobilized, each having an electrical characteristic of a type corresponding to the type of the immobilized ligand. A plurality of beads having a reaction vessel arranged for each bead, a detection unit for detecting, for each reaction vessel, protons generated by a nucleic acid extension reaction in the reaction vessel in which the beads are arranged, The presence or absence of nucleic acid elongation in the reaction tank is determined for each reaction tank based on the amount of protons generated for each reaction tank detected by the detection section and the electric characteristic measurement section that measures electric characteristics for each reaction tank. A nucleic acid extension determination unit for determining; a bead specifying unit for specifying the sequence of the bead specifying nucleic acid for each reaction tank based on presence or absence of nucleic acid extension determined by the bead nucleic acid extension determination unit; Based on the electrical properties of the beads sex measuring unit measures a target biomolecule specifying unit that specifies a type of the ligand for each of the reaction vessel, the target nucleic acid sequence specific apparatus comprising a.
＜第１実施形態＞
一例として、本実施形態の方法における標的生体分子は、所望の標的核酸配列を有する核酸である。また、標的生体分子と結合し得るリガンドは、当該標的核酸配列にアニーリングし得るプライマー（以下「標的核酸用プライマー」という）である。本実施形態においては、標的生体分子が核酸である場合について説明する。
<First Embodiment>
As an example, the target biomolecule in the method of the present embodiment is a nucleic acid having a desired target nucleic acid sequence. The ligand capable of binding to the target biomolecule is a primer that can anneal to the target nucleic acid sequence (hereinafter referred to as “target nucleic acid primer”). In the present embodiment, a case where the target biomolecule is a nucleic acid will be described.
本実施形態の方法は、（ａ１）核酸を含む試料を、前記複数の標的核酸配列の１つとアニーリングし得る標的核酸用プライマーが固定化された、複数のビーズと接触させる工程と、（ｂ１）前記試料と接触させたビーズを、ビーズ毎に、個別の反応槽に配置する工程と、（ｃ１）前記ビーズが配置された前記反応槽に、核酸伸長反応に核酸伸長に必要な試薬を添加する工程と、（ｄ１）前記ビーズが配置された反応槽内で核酸伸長反応を行う工程と、（ｅ１）前記核酸伸長反応中の各反応槽におけるプロトン発生量を測定する工程と、（ｆ１）前記プロトン発生量に基づいて、各反応槽内における核酸伸長の有無を判定する工程と、の各工程を有する。また、前記複数のビーズは、各々電気特性の異なる材料を含み、個々のビーズの少なくとも１種の電気特性を測定することにより、ビーズに固定化された標的核酸用プライマーの配列を反応槽毎に特定する。以下、各工程について説明する。 The method of this embodiment comprises (a1) contacting a sample containing a nucleic acid with a plurality of beads on which a target nucleic acid primer capable of annealing with one of the plurality of target nucleic acid sequences is immobilized, and (b1) A step of placing beads brought into contact with the sample into individual reaction vessels for each bead; and (c1) adding a reagent necessary for nucleic acid extension to the reaction vessel in which the beads are arranged. A step, (d1) performing a nucleic acid extension reaction in a reaction vessel in which the beads are arranged, (e1) measuring a proton generation amount in each reaction vessel during the nucleic acid extension reaction, (f1) And determining the presence or absence of nucleic acid elongation in each reaction tank based on the amount of proton generation. Further, each of the plurality of beads includes materials having different electric characteristics, and by measuring at least one kind of electric characteristics of each bead, the sequence of the target nucleic acid primer immobilized on the beads is determined for each reaction vessel. Identify. Hereinafter, each step will be described.
［標的核酸用プライマーとのアニーリング］
工程（ａ１）は、核酸を含む試料を、複数の標的核酸配列の１つとアニーリングし得る標的核酸用プライマーが固定化された、複数のビーズと接触させる工程である。
[Annealing with target nucleic acid primer]
Step (a1) is a step of bringing a sample containing nucleic acid into contact with a plurality of beads on which a target nucleic acid primer capable of annealing with one of a plurality of target nucleic acid sequences is immobilized.
まず、本実施形態で用いるビーズについて、図１を参照して説明する。図１中、１はビーズ、２は標的核酸用プライマー、１００はビーズ１に標的核酸用プライマー２が固定化されたビーズ体を示す。
First, the beads used in this embodiment will be described with reference to FIG. In FIG. 1, 1 is a bead, 2 is a target nucleic acid primer, and 100 is a bead body in which a target
本実施形態において、ビーズ１は、標的核酸用プライマー２が固定化するための担体として用いられる。一例として、ビーズ１の形状は、球状又はそれに近い形状である。ビーズ１の形状は、これに限るものではない。一例として、ビーズ１の大きさは、平均直径１〜２５０μｍである。また一例として、ビーズ１の大きさは、平均直径３０〜８０μｍである。ビーズ１の大きさは、これらに限るものではない。
In this embodiment, the
ビーズ１の材質は、特に限定されないが、例えば、ケイ素、二酸化チタン、酸化アルミニウム、ガラス、ポリスチレン、セルロース、ポリアミド等を挙げることができる。また、反応槽への配置の観点から、磁性ビーズを用いてもよい。ビーズ１は、１種類の物質のみならず、２種類以上の物質からなるものであってもよい。また、ビーズ１は、表面コーティングされたものであってもよい。なお、工程（ｂ）において、反応槽へのビーズ体１００の配置に、誘電泳動を利用する場合には、ビーズ１の材質には、高い誘電率を有する強誘電体材料が用いられる。そのような強誘電体材料の例としては、例えば、チタン酸バリウム、リン酸二水素カリウム等を挙げることができる。また、ビーズ種類の特定を、ビーズ１のインピーダンスで行う場合には、ビーズ１の材質としては、ポリスチレン、ラテックス等の樹脂系材料を挙げることができる。本実施形態においては、ビーズ１毎に材料や材料配分を変化させることにより、ビーズ１毎に固有の電気特性を有するように調製される。
また、ビーズ種類の特定を、ビーズ１のインピーダンスで行う場合には、ビーズ種類毎に異なるインピーダンスを有するビーズが必要となる。そのようなビーズを作製するには、上述の強誘電体材料と、金、銀などの導電性粒子が、それぞれ異なる含有率で配合される。このことにより、ビーズの誘電率および導電率を独立したパラメータとして設定することが可能となり、識別可能なビーズ種類が増えることに寄与する。ビーズ１の基材としては、ポリスチレン、ラテックス等の樹脂系材料を挙げることができる。本実施形態においては上述のように、ビーズ１毎に材料や材料配合を変化させることにより、ビーズ１毎に固有の電気特性を有するように調製される。
The material of the
Further, when specifying the bead type with the impedance of the
図１に示すように、ビーズ１には、標的核酸用プライマー２が固定化されている。これらの核酸のビーズ１への固定化は、公知の方法を用いて行うことができる。例えば、標的核酸用プライマー２をビオチン修飾し、ビーズ１の表面をアビジンでコーティングすることにより、アビジン−ビオチン結合を利用して、ビーズ１への両核酸の固定化を行うことができる。また、標的核酸用プライマー２をアミノ基、ホルミル基、ＳＨ基などの官能基で修飾し、ビーズ１をアミノ基、ホルミル基、エポキシ基などを有するシランカップリング剤で表面処理することにより、固定化を行ってもよい。
As shown in FIG. 1, a target
標的核酸用プライマー２は、目的とする標的核酸配列にアニーリングし得る配列を有する。一例として、標的核酸用プライマー２は、標的核酸配列の一部に相補的な配列を有する核酸である。一例として、標的核酸用プライマー２は、ＤＮＡである。標的核酸用プライマー２は、標的核酸配列にアニーリングし、標的核酸配列を鋳型とした核酸伸長反応を誘導する。標的核酸用プライマー２の配列は、目的とする標的核酸配列に応じて、適宜選択することができる。本実施形態においては、個々のビーズ１には、それぞれ異なる配列を有する標的核酸用プライマー２が固定化されている。
The target
なお、図１では、ビーズ１に対して、標的核酸用プライマー２が１分子しか固定化されていないが、ビーズ１に対して固定化される標的核酸用プライマー２の分子数は１つに限定されず、２分子以上を固定化することができる。一例として、本実施形態では、標的核酸用プライマー２は、２分子以上固定化される。ビーズ１の表面積に応じて、標的核酸のアニーリング及び伸長反応を妨げない程度の密度で、固定化されていればよい。なお、ビーズ１に対して、２分子以上の標的核酸用プライマー２を固定化する場合、固定化される標的核酸用プライマー２は、全て同一の標的核酸配列を標的とする。
In FIG. 1, only one molecule of the target
本工程では、ビーズ１に標的核酸用プライマー２が固定化されたビーズ体１００を、核酸を含む試料と接触させる。本実施形態において、核酸を含む試料は、特に限定されず、例えば、生体サンプルや環境サンプルからの核酸抽出物等を含む試料等を使用することができる。一例として、試料に含まれる核酸は、ＤＮＡである。ＤＮＡの例としては、ｃＤＮＡやゲノムＤＮＡを挙げることができる。試料に含まれる核酸は、ＤＮＡに限定されず、ＲＮＡや修飾核酸であってもよい。
In this step, the
ビーズ体１００と核酸を含む試料との接触は、例えば、ビーズ体１００と核酸を含む試料とを混合することにより行うことができる。一例として、混合物は、標的核酸用プライマー２が標的核酸とアニーリングし得る条件に置かれる。アニーリング条件は、標的核酸用プライマー２の長さ等に応じて、適宜設定することができる。試料中に標的核酸用プライマー２の標的核酸が含まれている場合には、図２に示すように、標的核酸用プライマー２が標的核酸３にアニーリングし、ビーズ体１００に標的核酸３が捕捉される。一方、試料中に標的核酸用プライマー２の標的核酸が含まれていない場合には、標的核酸用プライマー２は試料中の核酸とはアニーリングしない。したがって、複数のビーズ体を試料と接触させた場合、標的核酸用プライマー２が標的核酸にアニーリングしているビーズ体１００と、標的核酸用プライマー２に標的核酸がアニーリングしていないビーズ体１００との混合物が形成される。なお、試料と接触させるビーズ体１００の数は、検出したい標的核酸の数に応じて、適宜選択することができる。
The contact between the
［反応槽へのビーズの配置］
工程（ｂ１）は、核酸を含む試料と接触させたビーズ体１００を、ビーズ毎に、個別の反応槽に配置する工程である。本実施形態の工程（ｂ１）を、図３を参照して、説明する。図３中、２０はビーズ配置用基板であり、２１は反応槽である。この一例においては、ビーズ配置用基板２０は、ｍ×ｎ個（ｍ、ｎはいずれも自然数。）の反応槽２１を備える。この反応槽２１をウエルＷともいう。
[Placement of beads in the reaction vessel]
Step (b1) is a step of placing the
また、反応槽２１は、水素濃度を検知するためのセンサ３０を備えている。反応槽２１のうち、例えば、ウエルＷ１１は、センサ３０−１１を備える。ウエルＷｍｎは、センサ３０−ｍｎを備える。一例として、センサ３０は、反応槽２１の底面に配設される。また、一例として、センサ３０は、イオン感応性電界効果トランジスタ（Ｉｏｎ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｆｉｅｌｄ Ｅｆｆｅｃｔ Ｔｒａｎｓｉｓｔｏｒ；ＩＳＦＥＴ）である。
In addition, the
本実施形態において、ビーズ配置用基板２０の材質は、特に限定されないが、ガラス、シリコン、ポリマー等とすることができる。なお、ビーズ配置用基板２０にエラストラマー材料を用いる場合、微小なゴミなどの粒子が反応槽２１とビーズ配置用基板２０との間に挟まれたときに生じる反応槽２１全体のビーズ配置用基板２０との密着性に及ぼす悪影響がエラストラマーの局所的な変形により回避される利点がある。
In the present embodiment, the material for the
ビーズ配置用基板２０には、複数の反応槽２１が配設されている。配設される反応槽２１の数は、標的核酸用プライマーとのアニーリング工程で使用したビーズ体１００の数以上である必要がある。一例として、反応槽２１のサイズは、ビーズ１よりも若干大きいサイズである。一例として、反応槽２１のサイズは、ビーズ１のサイズの１〜２倍程度であり、１個のビーズ１を収納可能な程度の大きさとなっている。なお、ビーズ配置用基板２０の表面や反応槽２１の内壁は、核酸等の非特異的吸着を防止するブロッキング剤、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）や２−メテクリオイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）等でコーティングされていてもよい。このようなコーティングが施してあることで、ビーズ配置用基板２０の表面や反応槽２１の内壁への核酸の非特異的吸着を抑制することができる。また、一例として、反応槽２１の内壁は、親水化されている。内壁が親水化されていることにより、ビーズ体１００の分散液をビーズ配置用基板２０上に滴下した際、反応槽２１内部へのビーズ体１００の充填効率が向上する。
A plurality of
本実施形態の工程（ｂ１）では、図３に示すように、核酸を含む試料と接触させた複数のビーズ体１００を、反応槽２１に、１個ずつ配置する。反応槽２１に、ビーズ体１００を配置する方法は、特に限定されず、例えば、ビーズ体１００を分散させた液体を、ビーズ配置用基板２０上に滴下し、撹拌、振盪、遠心分離等の手段により、ビーズ体１００を反応槽２１に誘導してもよい。あるいは、ビーズ体１００の分散液にビーズ配置用基板２０を浸漬し、撹拌、振盪、遠心分離等の手段を用いてもよい。
反応槽２１のうち、例えば、ウエルＷ１１には、ビーズ体１００−１１が配置される。ウエルＷｍｎには、ビーズ体１００−ｍｎが配置される。
In the step (b1) of the present embodiment, as shown in FIG. 3, a plurality of
In the
また、ビーズ１に磁気ビーズを用いた場合には、ビーズ配置用基板２０の基板材料下に磁性体板と磁石を配置し、該磁石による磁力によりビーズ体１００を反応槽に誘導することもできる。この場合、基板材料下の磁石をビーズ配置用基板２０に対して平行方向に動かすことで、ビーズ体が分散し、反応槽２１へのビーズ体の充填効率が向上する。磁石によりビーズ配置用基板２０に印加する磁場の強さは、特に限定されないが、一例として、１００〜１００００ガウスである。また、磁石を取り除いた後も磁性体板の磁化は残るため、ビーズ体１００は安定した配置を保持し続けることが可能となる。かかる磁性体の材料としては、ニッケル、ニッケル合金、鉄および鉄合金などの金属を用いることができる。
When magnetic beads are used for the
［反応槽へのビーズの配置：変形例］
なお、反応槽２１にビーズ体１００を配置する工程において、図４に示すように誘電泳動によるソーティングを行ってもよい。この変形例では、ビーズ体１００は、標的核酸用プライマー２の配列の種類ごとに異なる誘電率を有している。例えば、ビーズ体１００Ａの誘電率は、誘電率εＡ、ビーズ体１００Ｂの誘電率は、誘電率εＢ、ビーズ体１００Ｃの誘電率は、誘電率εＣ、ビーズ体１００Ｄの誘電率は、誘電率εＤである。
互いに異なる誘電率を持つビーズを作製する方法としては、例えば、ビーズ材料に占める強誘電体の含有率が異なるビーズを作製することで実現可能である。
[Placement of beads in reaction vessel: modified example]
In the step of placing the
A method for producing beads having different dielectric constants can be realized, for example, by producing beads having different ferroelectric content in the bead material.
ここで、誘電泳動を用いて誘電率に応じたソーティングを行う方法について説明する。誘電体粒子に働く誘電泳動力は、印加される外部電界の強度、周波数、粒子の誘電率に依存する。電極間に一定の電圧および周波数が印加される場合を考えると、異なる誘電率を持つビーズには異なる大きさの誘電泳動力が働くことになる。適切な周波数に設定すれば、強電界部分から排除される方向に誘電泳動力が働く（負の誘電泳動）。誘電泳動理論の詳細については「AC Electrokinetic: Colloids and Nanoparticles, Research Studies Pr」等を参照されたい。そこで、図４のように、流路中に電極対を配置し、負の誘電泳動力が働くような周波数を印加すると、ビーズには流れに対して斜め方向に力が働くことになり、結果としてビーズの流路中での軌跡が変わることとなる。さらには、ビーズの誘電率によって働く誘電泳動力の大きさが変わるため、ビーズの種類毎に異なる軌跡で移動させることが可能となるため、結果としてビーズ種毎にソーティングが可能となる。この時、異なる電圧、周波数を印加する電極対を複数設ける（例えば、電極対ＥＰＡ及び電極対ＥＰＢを設ける）ことによって、ソーティング可能なビーズの種類を増やすことができる。
つまり、この変形例によれば、ビーズ体１００に固定されている標的核酸用プライマー２の配列の種類を、誘電率によって選別することができる。
Here, a method of performing sorting according to the dielectric constant using dielectrophoresis will be described. The dielectrophoretic force acting on the dielectric particles depends on the strength of the external electric field applied, the frequency, and the dielectric constant of the particles. Considering the case where a constant voltage and frequency are applied between the electrodes, dielectrophoretic forces of different magnitudes act on beads having different dielectric constants. If an appropriate frequency is set, the dielectrophoretic force acts in the direction of exclusion from the strong electric field portion (negative dielectrophoresis). For details of the dielectrophoresis theory, refer to “AC Electrokinetic: Colloids and Nanoparticles, Research Studies Pr” and the like. Therefore, as shown in FIG. 4, when a pair of electrodes are arranged in the flow path and a frequency at which a negative dielectrophoretic force acts is applied, a force acts on the beads in an oblique direction with respect to the flow. As a result, the trajectory of the beads in the flow path changes. Furthermore, since the magnitude of the dielectrophoretic force that works depending on the dielectric constant of the beads changes, the beads can be moved along different trajectories for each type of beads, and as a result, sorting is possible for each type of bead. At this time, by providing a plurality of electrode pairs to which different voltages and frequencies are applied (for example, by providing the electrode pair EPA and the electrode pair EPB), the types of beads that can be sorted can be increased.
That is, according to this modification, the type of sequence of the target
［核酸伸長反応に必要な試薬の添加］
工程（ｃ１）は、ビーズが配置された反応槽に、核酸伸長反応に必要な試薬を添加する工程である。
本実施形態においては、核酸伸長反応に必要な試薬として、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、適切なバッファ等を挙げることができる。一例として、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼ等の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼである。核酸伸長反応に必要な試薬は、後述の工程（ｄ１）で行う核酸伸長反応の方法に応じて、適宜選択することができる。なお、一例として、ＤＮＡポリメラーゼなどの一部の試薬は、本工程で添加せず、あらかじめ反応槽２１の内壁に結合させておいてもよい。
[Addition of reagents necessary for nucleic acid extension reaction]
Step (c1) is a step of adding a reagent necessary for the nucleic acid extension reaction to the reaction vessel in which the beads are arranged.
In the present embodiment, examples of reagents necessary for the nucleic acid extension reaction include DNA polymerase, deoxynucleoside triphosphate, an appropriate buffer, and the like. As an example, the DNA polymerase is a heat-resistant DNA polymerase such as Taq polymerase or a strand displacement DNA polymerase. The reagent necessary for the nucleic acid extension reaction can be appropriately selected according to the method of the nucleic acid extension reaction performed in the step (d1) described later. As an example, some reagents such as DNA polymerase may not be added in this step but may be bonded to the inner wall of the
一例として、核酸伸長反応としてＰＣＲ法や等温増幅法等の核酸増幅反応を行う場合は、本工程において、リバースプライマーを添加するもできる。リバースプライマーは、全ての標的核酸配列に共通なユニバーサルプライマーとしてもよく、各標的核酸配列に特異的なプライマーとしてもよい。 As an example, when a nucleic acid amplification reaction such as a PCR method or an isothermal amplification method is performed as a nucleic acid extension reaction, a reverse primer can be added in this step. The reverse primer may be a universal primer common to all target nucleic acid sequences, or may be a primer specific for each target nucleic acid sequence.
リバースプライマーは、一例として、ビーズ１に固定化しておくこともできる。また、リバースプライマーが、全ての標的核酸配列に共通なユニバーサルプライマーである場合には、一例として、当該ユニバーサルリバースプライマーは、反応槽２１の内壁に固定化しておくこともできる。リバースプライマーをビーズ１又は反応槽２１の内壁に固定化する場合、リバースプライマーは、一例として、ビーズ１側又は反応槽２１の内壁側に光切断部位を有する。光切断部位とは、紫外線などの光を照射すると切断される性質を有する基をいい、かかる基を用いたものとしては、例えば、ＰＣ Ｌｉｎｋｅｒ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ（Ｇｌｅｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ社）、フラーレンを含有してなる核酸の光切断用組成物（核酸の光切断用組成物：特開２００５−２４５２２３）、特許文献１に記載のものなどを挙げることができる。あるいは、リバースプライマーは、１本鎖核酸切断酵素切断部位を有していてもよい。１本鎖核酸切断酵素切断部位とは、デオキシリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼなどの１本鎖核酸切断酵素により切断されることができる核酸基をいい、ヌクレオチドおよびその誘導体が含まれる。そのような核酸基としては、例えば、エンドヌクレアーゼＶに認識されるデオキシイオシンなどを挙げることができる。核酸増幅反応開始前に、光照射又は１本鎖核酸切断酵素処理を行って、リバースプライマーをビーズ１から切り離すことにより、核酸増幅反応を効率よく行うことが可能になる。
As an example, the reverse primer can be immobilized on the
［核酸伸長反応］
工程（ｄ１）は、ビーズが配置された反応槽内で核酸伸長反応を行う工程である。
核酸伸長反応は、ＤＮＡポリメラーゼ等を用いた公知の方法により行うことができる。核酸伸長反応の条件は、用いる方法に応じて、適宜設定することができる。例えば、反応槽２１内の温度を５５〜７０℃程度に維持して、核酸伸長反応を行ってもよい。
[Nucleic acid elongation reaction]
Step (d1) is a step of performing a nucleic acid extension reaction in a reaction vessel in which beads are arranged.
The nucleic acid extension reaction can be performed by a known method using DNA polymerase or the like. The conditions for the nucleic acid extension reaction can be appropriately set according to the method used. For example, the nucleic acid extension reaction may be performed while maintaining the temperature in the
反応槽２１には、ビーズ体１００が1個ずつ配置されている。標的核酸用プライマー２が標的核酸３にアニーリングしているビーズ体１００では、標的核酸３を鋳型として、核酸伸長反応が起こる。一方、標的核酸用プライマー２が標的核酸３にアニーリングしていないビーズ体１００では、核酸伸長反応は起こらない。
One
本実施形態において、核酸伸長反応は、必ずしも核酸増幅反応である必要はない。ビーズ１に固定化された標的核酸用プライマー２の密度が高い場合には、１度の伸長反応で検出に十分なプロトンが発生する。核酸伸長反応を１回しか行わない場合には、反応槽２１にリバースプライマーを添加する必要はない。
In the present embodiment, the nucleic acid extension reaction is not necessarily a nucleic acid amplification reaction. When the density of the target
一方、本実施形態では、核酸増幅反応を行うこともできる。核酸増幅反応の方法には、公知の方法を用いることができる。一例として、核酸増幅反応には、ＰＣＲ法を用いる。また、他の例として、ＬＡＭＰ法等の等温増幅法を用いる。なお、核酸増幅反応を行う場合には、上記のとおり、反応槽２１内にリバースプライマーを存在させておく必要がある。
On the other hand, in this embodiment, a nucleic acid amplification reaction can also be performed. A publicly known method can be used for the method of nucleic acid amplification reaction. As an example, the PCR method is used for the nucleic acid amplification reaction. As another example, an isothermal amplification method such as the LAMP method is used. In addition, when performing nucleic acid amplification reaction, it is necessary to make a reverse primer exist in the
［プロトン発生量の測定］
工程（ｅ１）は、核酸伸長反応の各反応槽におけるプロトン発生量を測定する工程である。核酸伸長反応によって核酸が１塩基伸長すると、１分子のプロトンが発生する。反応槽２１内のプロトン発生量は、センサ３０によって検出される。一例として、センサ３０は、ＩＳＦＥＴである。本実施形態に使用可能なＩＳＦＥＴとしては、例えば、国際公開公報ＷＯ２００８／１０７０１４号に記載のもの等を挙げることができる。
[Measurement of proton generation amount]
Step (e1) is a step of measuring the amount of proton generation in each reaction tank of the nucleic acid extension reaction. When the nucleic acid is extended by one base by the nucleic acid extension reaction, one molecule of proton is generated. The amount of proton generation in the
センサ３０がＩＳＦＥＴである場合の、プロトン発生量の測定例について説明する。図５に、各反応槽２１に備えられるセンサ３０の構成を示す。センサ３０は、ゲート絶縁膜ＧＩＦと、Ｎ型半導体ＳＮ（ソースｓｒｃ）と、ソース端子ＴＳと、Ｎ型半導体ＳＮ（ドレインｄｒｎ）と、ドレイン端子ＴＤと、Ｐ型半導体ＳＰと、参照電極ＥＲと、ゲート電源ＶＧと、バイアス電源ＶＢと、電流検出器ＣＤとを備える。これら各部の構成については、既知のＩＳＦＥＴと同様であるため、説明を省略する。センサ３０は、溶液とゲート絶縁膜ＧＩＦとの間に発生する界面電位に応じた電流値のドレイン電流を電流検出器ＣＤによって検出することにより、プロトン発生量を測定する。
A measurement example of the proton generation amount when the
［核酸伸長の有無の判定］
工程（ｆ１）は、測定された前記プロトン発生量に基づいて、各反応槽における核酸伸長の有無を判定する工程である。センサ３０による反応槽２１内のプロトン発生量の測定値が上昇したか否かに基づいて、反応槽２１内での核酸伸長の有無を判定する。反応槽２１内のプロトン発生量が上昇した場合には、核酸伸長が生じたと判定され、反応槽２１内のプロトン発生量の上昇が検出されない場合には、核酸伸長が生じていないと判定される。
[Determination of nucleic acid elongation]
Step (f1) is a step of determining the presence or absence of nucleic acid elongation in each reaction vessel based on the measured amount of proton generation. The presence or absence of nucleic acid elongation in the
本実施形態においては、反応槽２１毎に配置されたセンサ３０によって、個々の反応槽２１内のプロトン発生量の変化を検出し、反応槽２１毎に、核酸伸長の有無を判定する。
なお、センサ３０は、電流検出器ＣＤによって検出されるドレイン電流の大きさに応じて、反応槽２１内に存在する核酸伸長が生じたビーズ体１００の数を検出する構成であってもよい。
In the present embodiment, a
The
［ビーズの種類の判定］
なお、ビーズ体１００は、標的核酸用プライマー２の配列の種類ごとに異なるインピーダンスを有していてもよい。この場合には、ビーズ体１００のインピーダンスを測定することにより、ビーズ体１００に固定化された標的核酸用プライマー２の配列の種類を特定することができる。図６に示すように、各反応槽２１には、インピーダンス測定用の端子ＥＺＡ及び端子ＥＺＢが備えられる。インピーダンス測定部４０は、端子ＥＺＡと、端子ＥＺＢとの間のインピーダンス、すなわち反応槽２１内のインピーダンスを測定する。各反応槽２１に１つのビーズ体１００が配置される場合、反応槽２１内のインピーダンスを測定すれば、反応槽２１に配置されたビーズ体１００のインピーダンスを測定することができる。
[Determination of bead type]
The
ここで、図７に示すように、ビーズ体１００は、ビーズ体１００の種類毎に互いに異なるインピーダンス特性を有する。例えば、ビーズ体１００Ａは、インピーダンスＺＡを有する。ビーズ体１００ＢはインピーダンスＺＢを、ビーズ体１００ＣはインピーダンスＺＣを、ビーズ体１００ＤはインピーダンスＺＤを、それぞれ有する。ビーズ体１００のインピーダンスを図７に例示する複素平面上にプロットすれば、ビーズ体１００の種類を判別することができる。
Here, as shown in FIG. 7, the
ビーズ体１００のインピーダンスと、ビーズ体１００に固定化された標的核酸用プライマー２の配列の種類とが対応付けられているため、ビーズ体１００のインピーダンスを測定することにより、標的核酸用プライマー２の配列の種類を判定することができる。つまり、ビーズ体１００のインピーダンスは、そのビーズ体１００に固定された標的核酸用プライマー２の配列の種類を示す。
Since the impedance of the
反応槽２１は、センサ３０を構成するために半導体上に形成される。したがって、インピーダンス測定部をこの半導体によって構成すれば、反応槽２１毎にインピーダンス測定部４０を形成することが容易である。反応槽２１毎にインピーダンス測定部４０を形成することにより、各反応槽２１においてビーズ体１００のインピーダンスを測定することができる。つまり、反応槽２１毎にインピーダンス測定部４０を形成すれば、どのような種類のビーズ体１００が、どの反応槽２１に配置されたのかを判定することができる。また、反応槽２１毎にインピーダンス測定部４０を形成すれば、ビーズ体１００の種類毎に、その数又は全ビーズ体１００の数に対する割合を算出することができる。
また、反応槽２１毎に、センサ３０とインピーダンス測定部４０とが形成されていれば、ビーズ体１００の種類と、そのビーズ体１００における核酸伸長の有無とを同時に判定することができる。
The
Moreover, if the
本実施形態の方法によれば、核酸を含む試料の標的核酸配列の種類を、簡便に判定することができる。また、本実施形態の方法によれば、ビーズ１を反応槽２１に配置する前に、試料と標的核酸用プライマー２が固定化されたビーズ１とを接触させることができるため、標的核酸に対する標的核酸用プライマー２のアニーリングを効率よく行うことができる。
According to the method of the present embodiment, the type of target nucleic acid sequence of a sample containing nucleic acid can be easily determined. In addition, according to the method of the present embodiment, since the sample and the
本実施形態の方法は、感染症の原因となる病原体遺伝子の検出・同定や癌などの疾患関連遺伝子の検出・同定、疾患関連遺伝子の発現解析等に利用することができ、感染症や癌などの疾患の診断や治療効果のモニタリング等に有用である。
＜第２実施形態＞
一例として、本実施形態の方法における標的生体分子は、所望のタンパク質である。また、標的生体分子と結合し得るリガンドは、当該タンパク質に結合し得る抗体（以下「標的抗原検出用抗体」という）である。本実施形態においては、標的生体分子がタンパク質である場合について説明する。
The method of this embodiment can be used for detection / identification of pathogen genes causing infectious diseases, detection / identification of disease-related genes such as cancer, expression analysis of disease-related genes, etc. It is useful for diagnosis of diseases and monitoring of therapeutic effects.
Second Embodiment
As an example, the target biomolecule in the method of the present embodiment is a desired protein. The ligand capable of binding to the target biomolecule is an antibody that can bind to the protein (hereinafter referred to as “target antigen detection antibody”). In this embodiment, a case where the target biomolecule is a protein will be described.
本実施形態の方法は、（ａ２）タンパク質を含む試料を、前記複数の標的タンパク質の１つと結合し得る標的抗原検出用抗体が固定化された、複数のビーズと接触させる工程と、（ｂ２）前記試料と接触させたビーズを、ビーズ毎に、個別の反応槽に配置する工程と、（ｃ２）前記ビーズが配置された前記反応槽に、核酸伸長反応に核酸伸長に必要な試薬を添加する工程と、（ｄ２）前記ビーズが配置された反応槽内で核酸伸長反応を行う工程と、（ｅ２）前記核酸伸長反応中の各反応槽におけるプロトン発生量を測定する工程と、（ｆ２）前記プロトン発生量に基づいて、各反応槽内における核酸伸長の有無を判定する工程の各工程を有する。また、前記複数のビーズは、各々電気特性の異なる材料を含み、個々のビーズの少なくとも１種の電気特性を測定することにより、ビーズに固定化された標的抗原検出用抗体の種類を反応槽毎に特定する。以下、各工程について説明する。 The method of this embodiment comprises (a2) contacting a sample containing a protein with a plurality of beads on which a target antigen detection antibody capable of binding to one of the plurality of target proteins is immobilized; (b2) A step of placing the beads in contact with the sample in a separate reaction tank for each bead; and (c2) adding a reagent necessary for nucleic acid extension to the reaction tank in which the beads are arranged. A step, (d2) performing a nucleic acid extension reaction in a reaction vessel in which the beads are disposed, (e2) measuring a proton generation amount in each reaction vessel during the nucleic acid extension reaction, and (f2) the above Each step of the step of determining the presence or absence of nucleic acid elongation in each reaction tank based on the proton generation amount is included. Further, each of the plurality of beads includes materials having different electric characteristics, and by measuring at least one electric characteristic of each bead, the type of target antigen detection antibody immobilized on the beads is determined for each reaction tank. To be specific. Hereinafter, each step will be described.
［標的タンパク質との抗原抗体反応］
工程（ａ２）は、タンパク質を含む試料を、複数の標的タンパク質の１つと結合し得る標的抗原検出用抗体が固定化された、複数のビーズと接触させる工程である。
[Antigen-antibody reaction with target protein]
Step (a2) is a step of bringing a sample containing a protein into contact with a plurality of beads on which a target antigen detection antibody capable of binding to one of the plurality of target proteins is immobilized.
まず、本実施形態で用いるビーズについて、図１０を参照して説明する。図１０中、１はビーズ、５は標的抗原検出用抗体、１００ａはビーズ１に標的抗原検出用抗体５が固定化されたビーズ体、４００は標的タンパク質を示す。
First, the beads used in this embodiment will be described with reference to FIG. In FIG. 10, 1 is a bead, 5 is an antibody for target antigen detection, 100a is a bead body in which the target
本実施形態においては、第１実施形態の標的核酸用プライマー２に替り、標的抗原検出用抗体５がビーズ１に固定化されている。標的抗原検出用抗体５は、目的とする標的タンパク質に特異的に結合し得る抗体である。標的抗原検出用抗体５は、公知の抗体取得方法により、得ることができる。また、標的抗原検出用抗体５は、どのような動物由来のものであってもよい。マウス抗体、ニワトリ抗体、ウサギ抗体等、当技術分野で一般的に用いられる抗体を使用することができる。また、標的抗原検出用抗体５は、キメラ抗体、ヒト化抗体等の組み換え抗体であってもよい。また、標的抗原検出用抗体５は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、一本鎖抗体等の抗体断片であってもよい。本明細書において、「抗体」という用語は、抗原に対する特異性及び結合性が維持されるこれらの抗体断片を包含する。
In this embodiment, instead of the target
標的抗原検出用抗体５のビーズ１への固定化は、公知の方法を用いて行うことができる。例えば、第１実施形態の標的核酸用プライマー２と同様に、アビジン-ビオチン結合を利用した固定化することができる。また、標的抗原検出用抗体５をアミノ基、ホルミル基、ＳＨ基などの官能基で修飾し、ビーズ１をアミノ基、ホルミル基、エポキシ基などを有するシランカップリング剤で表面処理することにより、固定化を行ってもよい。
Immobilization of the target
標的抗原検出用抗体５は、ビーズ１に対して、複数分子を固定化することができる。一例として、標的抗原検出用抗体５は、２分子以上がビーズ１に固定化される。標的抗原検出用抗体５は、ビーズ１の表面積に応じて、標的タンパク質４００との結合を妨げない程度の密度で、固定化されていればよい。なお、ビーズ１に対して、２分子以上の標的抗原検出用抗体５を固定化する場合、１つのビーズ１に固定化される標的抗原検出用抗体５は、全て同一のタンパク質を標的とする。
The target
ビーズ１については、第１実施形態と同様である。本実施形態においては、固定化される標的抗原検出用抗体５の標的タンパク質の種類毎に、ビーズ１が固有の電気特性を有するように調製される。
The
本実施形態の工程（ａ２）では、ビーズ１に標的抗原検出用抗体５が固定化されたビーズ体１００ａを、タンパク質を含む試料と接触させる。本実施形態において、タンパク質を含む試料は、特に限定されず、例えば、生体サンプルや環境サンプルからのタンパク質抽出物等を含む試料等を使用することができる。試料に含まれるタンパク質は、天然タンパク質に限定されず、修飾タンパク質や組み換えタンパク質等であってもよい。
In the step (a2) of this embodiment, the
ビーズ体１００ａとタンパク質を含む試料との接触は、例えば、ビーズ体１００ａとタンパク質を含む試料とを混合することにより行うことができる。一例として、ビーズ体１００とタンパク質を含む試料との混合物は、標的抗原検出用抗体５が標的タンパク質に結合し得る条件に置かれる。結合条件は、標的抗原検出用抗体５の種類等に応じて、適宜設定することができる。
The contact between the
図１０において、ビーズ体１００ａをタンパク質を含む試料と接触させると、該試料に標的タンパク質４００が含まれている場合、標的抗原検出用抗体５は、標的タンパク質４００に結合する。すなわち、標的タンパク質４００は、標的抗原検出用抗体５に結合し、ビーズ体１００ａに捕捉される。一方、試料中に標的タンパク質４００が含まれていない場合には、標的抗原検出用抗体５には何も結合しない。したがって、複数のビーズ体１００ａを試料と接触させた場合、標的抗原検出用抗体５が標的タンパク質４００に結合しているビーズ体１００ａと、標的抗原検出用抗体５が標的タンパク質４００に結合していないビーズ体１００ａとの混合物が形成される。なお、試料と接触させるビーズ体１００ａの数は、検出したい標的タンパク質の数に応じて、適宜選択することができる。
In FIG. 10, when the
［反応槽へのビーズの配置］
本実施形態の工程（ｂ２）は、第１実施形態の工程（ｂ１）と同様に行うことができる。
[Placement of beads in the reaction vessel]
The step (b2) of the present embodiment can be performed in the same manner as the step (b1) of the first embodiment.
［核酸伸長反応に必要な試薬の添加］
工程（ｃ２）は、ビーズが配置された反応槽に、核酸伸長反応に必要な試薬を添加する工程である。
[Addition of reagents necessary for nucleic acid extension reaction]
Step (c2) is a step of adding a reagent necessary for the nucleic acid extension reaction to the reaction vessel in which the beads are arranged.
本実施形態の工程（ｃ２）では、第１実施形態の工程（ｃ１）で添加する試薬に加えて、シグナル生成用核酸３１０を結合させた２次抗体３０１を添加する。２次抗体３０１は、標的タンパク質４００に特異的に結合し得る抗体である。２次抗体３０１は、標的抗原検出用抗体５と同じ抗体であってもよく、違う抗体であってもよい。一例として、２次抗体３０１は、標的抗原検出用抗体５と同一のタンパク質に結合し、異なるエピトープを有する抗体である。
In step (c2) of the present embodiment, in addition to the reagent added in step (c1) of the first embodiment,
２次抗体３０１には、一例として、図１０に示すように、シグナル生成用核酸３１０が結合されている。２次抗体３０１とシグナル生成用核酸３１０との結合は、一例として、アビジン-ビオチン結合を利用して行うことができる。
As an example, as shown in FIG. 10, a signal generating
シグナル生成用核酸３１０は、一例として、図１０に示すように、プライマーアニーリング領域３１１とシグナル生成用配列３１２とを含む。プライマーアニーリング領域３１１は、シグナル生成用核酸３１０の３’側に位置している。シグナル生成用核酸３１０は、一例として、全ての種類の２次抗体に対して、同じ配列であることができる。また、シグナル生成用核酸３１０は、一例として、プライマーアニーリング領域３１１が、全ての種類の２次抗体に対して、同じ配列である。シグナル生成用核酸３１０の配列は、特に限定されず、適宜選択することができる。なお、図１０において、３００は、２次抗体３０１にシグナル生成用核酸３１０を結合させた複合体プローブを示す。
As an example, the signal generating
本工程では、一例として、複合体プローブ３００は、核酸伸長反応に必要な他の試薬を添加する前に、反応槽２１に添加される。この場合、一例として、ビーズ１が磁気ビーズであれば、ビーズ１を反応槽２１に固定して、反応槽２１を洗浄することにより、標的タンパク質４００に結合していない複合体プローブ３００を反応槽２１から除去することができる。なお、複合体プローブ３００は、後述する工程（ｄ２）の核酸伸長反応の前であれば、どのようなタイミングで、試料又は反応槽２１に添加してもよい。
In this step, as an example, the
本工程においては、複合体プローブ３００に加えて、さらに、シグナル生成用プライマー３２０を添加する。シグナル生成用プライマー３２０は、複合体プローブ３００の添加後に反応槽２１に添加される。一例として、シグナル生成用プライマー３２０の添加前に、標的タンパク質４００に結合していない複合体プローブ３００は、洗浄により反応槽２１から除去される。シグナル生成用プライマー３２０の反応槽２１への添加は、一例として、他の核酸伸長に必要な試薬と共に行うことができる。
In this step, in addition to the
上記以外の核酸伸長反応に必要な試薬については、第１実施形態の工程（ｃ１）と同じである。 The reagents necessary for the nucleic acid extension reaction other than the above are the same as those in the step (c1) of the first embodiment.
［核酸伸長反応］
工程（ｄ２）は、ビーズが配置された反応槽内で核酸伸長反応を行う工程である。
本工程は、第１実施形態の工程（ｄ１）と同様に行うことができる。なお、本工程では、図１０に示すように、シグナル生成用配列３１２を鋳型とする核酸伸長反応が起こる。第１実施形態と同様に、標的抗原検出用抗体５に標的タンパク質４００が結合していない場合には、核酸伸長反応は起こらない。
[Nucleic acid elongation reaction]
Step (d2) is a step of performing a nucleic acid extension reaction in a reaction vessel in which beads are arranged.
This process can be performed similarly to the process (d1) of 1st Embodiment. In this step, as shown in FIG. 10, a nucleic acid extension reaction using the
［プロトン濃度の検出］
工程（ｅ２）は、核酸伸長反応の各反応槽におけるプロトン発生量の測定をする工程である。本工程は、第１実施形態の工程（ｅ１）と同様に行うことができる。
[Detection of proton concentration]
Step (e2) is a step of measuring the amount of proton generation in each reaction tank of the nucleic acid extension reaction. This process can be performed similarly to the process (e1) of 1st Embodiment.
［核酸増幅の有無の判定］
工程（ｆ２）は、工程（ｅ２）で測定されたプロトン発生量に基づいて、各反応槽内における核酸伸長の有無を判定する工程である。本工程は、第１実施形態の工程（ｆ１）と同様に行うことができる。
[Determination of nucleic acid amplification]
Step (f2) is a step of determining the presence or absence of nucleic acid elongation in each reaction tank based on the proton generation amount measured in step (e2). This process can be performed similarly to the process (f1) of 1st Embodiment.
［ビーズの種類の判定］
ビーズ種類の判定は、第１実施形態における標的核酸用プライマー２に替えて、標的抗原検出用抗体５を用いる以外は、第１実施形態と同様に行うことができる。すなわち、第１実施形態と同様に、各反応槽におけるビーズ１の電気特性を特定し、該ビーズ１の電気特性に基づいて、各反応槽における標的抗原検出用抗体５の種類を特定することができる。
[Determination of bead type]
The bead type can be determined in the same manner as in the first embodiment, except that the target
そして、工程（ｆ２）により判定された各反応槽２１における核酸伸長の有無と、本工程により特定された各反応槽２１内の標的抗原検出用抗体５の種類との照合により、核酸伸長有と判定された反応槽２１内の標的抗原検出用抗体５の種類が特定される。すなわち、タンパク質を含む試料中に含まれる標的タンパク質を特定することができる。
The presence / absence of nucleic acid extension is determined by comparing the presence / absence of nucleic acid extension in each
本実施形態の方法によれば、いずれの種類のビーズ１が、いずれの反応槽２１に配置されるのかが特定されていなくても、標的タンパク質４００が結合した標的抗原検出用抗体５を特定することができる。つまり本実施形態の方法によれば、ビーズ１の種類と反応槽２１の番号との対応関係が特定されていなくても、試料中に含まれていた標的タンパク質を特定することができる。
According to the method of the present embodiment, the target
本実施形態の方法によれば、ビーズ１を反応槽２１に配置する前に、試料と標的抗原検出用抗体５が固定化されたビーズ１とを接触させることができるため、標的タンパク質に対する標的抗原検出用抗体５の結合を効率よく行うことができる。
本実施形態の方法によれば、タンパク質を含む試料において、複数の標的タンパク質を効率よく検出することができる。
According to the method of the present embodiment, since the sample and the
According to the method of this embodiment, a plurality of target proteins can be efficiently detected in a sample containing proteins.
本実施形態の方法は、感染症の原因となる病原体抗原の検出・同定や癌などの疾患関連遺伝子の検出・同定、疾患関連遺伝子の発現解析等に利用することができ、感染症や癌などの疾患の診断や治療効果のモニタリング等に有用である。 The method of this embodiment can be used for detection / identification of pathogen antigens causing infectious diseases, detection / identification of disease-related genes such as cancer, expression analysis of disease-related genes, etc. It is useful for diagnosis of diseases and monitoring of therapeutic effects.
＜標的生体分子特定装置＞
［標的核酸配列特定装置の構成例］
上述した第１実施形態の方法を実現する標的核酸配列特定装置２００の構成の一例について、図８及び図９を参照して説明する。
図８は、本実施形態における標的核酸配列特定装置２００の構成の一例を示す図である。標的核酸配列特定装置２００は、ビーズ配置用基板２０と、演算装置２１０とを備える。
ビーズ配置用基板２０は、反応槽２１と、センサ３０とをそれぞれ複数備える。このセンサ３０とは、検出部の一例である。１つの反応槽２１には、１つのビーズ１が配置される。このビーズ１には、上述した標的核酸用プライマー２が固定化されている。このビーズ１は、ビーズ１に固定化されている標的核酸用プライマー２の核酸の配列に応じた電気特性を有する。つまり、反応槽２１には、標的核酸用プライマー２が固定化され、当該標的核酸用プライマー２の核酸の配列に応じた電気特性を有するビーズ１が配置される。標的核酸用プライマー２の核酸の配列と、ビーズ１の電気特性との対応関係は、演算装置２１０が備える核酸配列記憶部２１４に記憶されている。この核酸配列記憶部２１４の構成の具体例について、図９を参照して説明する。
<Target biomolecule identification device>
[Configuration Example of Target Nucleic Acid Sequence Identification Device]
An example of the configuration of the target nucleic acid
FIG. 8 is a diagram illustrating an example of the configuration of the target nucleic acid
The
図９は、本実施形態における核酸配列記憶部２１４の構成の一例を示す図である。核酸配列記憶部２１４には、ビーズＩＤと、ビーズ１の電気特性を示す情報と、標的核酸用プライマー２の配列を示す情報とが、互いに対応付けられて記憶されている。ここで、ビーズＩＤとは、ビーズ１の種類、すなわち、ビーズ１に固定化されている標的核酸用プライマー２の配列の種類を識別する情報である。より具体的には、ビーズＩＤ−１００Ａには、電気特性Ａと、標的核酸用プライマー配列Ａとが対応付けられている。つまり、核酸配列記憶部２１４に記憶されている情報によれば、ビーズ１の電気特性を特定すれば、この電気特性に対応する標的核酸用プライマー２の配列を特定することができる。
FIG. 9 is a diagram illustrating an example of the configuration of the nucleic acid
図８に戻り、演算装置２１０は、例えばＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｕｎｉｔ）を備えており、その機能部としての核酸伸長判定部２１１と、標的核酸配列特定部２１２とを備えている。
核酸伸長判定部２１１は、センサ３０が検出する反応槽２１毎のプロトンの発生量に基づいて、反応槽２１内における核酸伸長の有無を反応槽２１毎に判定する。具体的には、核酸伸長判定部２１１は、センサ３０の出力電流値と、プロトンの発生量との対応を示す情報を予め有している。核酸伸長判定部２１１は、センサ３０の出力電流値を取得し、取得した出力電流値に基づいて、プロトンの発生量を推定する。核酸伸長判定部２１１は、推定したプロトンの発生量に基づいて、核酸伸長の有無を判定する。ここで、センサ３０は反応槽２１毎に備えられている。核酸伸長判定部２１１は、反応槽２１毎にセンサ３０の出力電流値を取得することにより、核酸伸長の有無を反応槽２１毎に判定する。
Returning to FIG. 8, the
The nucleic acid
標的核酸配列特定部２１２は、インピーダンス測定部４０が測定するビーズ１の電気特性に基づいて、標的核酸用プライマー２の配列を反応槽２１毎に特定する。このインピーダンス測定部４０とは、電気特性測定部の一例である。具体的には、標的核酸配列特定部２１２は、インピーダンス測定部４０が測定したビーズ１の電気特性を示す情報を取得する。標的核酸配列特定部２１２は、取得したビーズ１の電気特性を示す情報を検索キーにして核酸配列記憶部２１４を検索する。上述したように、核酸配列記憶部２１４には、ビーズ１の電気特性を示す情報と、標的核酸用プライマー２の配列を示す情報とが、互いに対応付けられて記憶されている。したがって、標的核酸配列特定部２１２は、ビーズ１の電気特性を示す情報を検索キーにした核酸配列記憶部２１４の検索の結果、ビーズ１の電気特性を示す情報に対応する標的核酸用プライマー２の配列を示す情報を得る。つまり、標的核酸配列特定部２１２は、ビーズ１の電気特性に対応する標的核酸用プライマー２の配列を特定する。標的核酸配列特定部２１２は、反応槽２１毎に上述の手順を繰り返すことにより、反応槽２１毎にビーズ１の電気特性に対応する標的核酸用プライマー２の配列を特定する。なお、インピーダンス測定部４０によるビーズ１の電気特性の測定の具体的な手順については、上述の［ビーズの種類の判定］において詳細に説明したため、ここでの説明を省略する。
The target nucleic acid
本実施形態の標的核酸配列特定装置２００によれば、いずれの種類のビーズ１が、いずれの反応槽２１に配置されるのかが特定されていない場合に、反応槽２１の番号と、当該反応槽２１に配置されたビーズ１の種類との対応関係を特定することができる。
According to the target nucleic acid
なお、演算装置２１０は、その機能部としての伸長核酸種類特定部２１３を更に備えていてもよい。伸長核酸種類特定部２１３は、核酸伸長判定部２１１の判定結果と、標的核酸配列特定部２１２が特定する標的核酸用プライマー２の配列とに基づいて、核酸伸長有又は核酸伸長無と判定されたビーズ１の標的核酸配列を特定する。この伸長核酸種類特定部２１３を備えることにより、複数の種類の標的核酸用プライマー２のうち、いずれの標的核酸用プライマー２によって核酸伸長が生じたのか（又は、生じなかったのか）を判定することができる。つまり本実施形態の標的核酸配列特定装置２００によれば、ビーズ１の種類と反応槽２１の番号との対応関係が特定されていなくても、試料中に含まれていた標的核酸配列を特定することができる。
Note that the
［標的タンパク質特定装置の構成例］
上述した第２実施形態の方法を実現する標的タンパク質特定装置２００−２の構成は、上述の標的核酸配列特定装置２００において、核酸配列記憶部２１４に替えて抗原記憶部２１４−２、標的核酸配列特定部２１２に替えて標的タンパク質特定部２１２−２、伸長核酸種類特定部２１３に替えて結合タンパク質種類特定部２１３−２を備えたものとすることができる。この標的タンパク質特定部２１２−２とは、標的リガンド特定部の一例である。
図１１は、本実施形態における標的タンパク質特定装置２００−２の構成の一例を示す図である。また、図１２は、抗原記憶部２１４−２の構成の一例を示す図である。抗原記憶部２１４−２には、ビーズＩＤと、ビーズ１の電気特定を示す情報と、標的抗原検出用抗体５の抗原を示す情報とが、互いに対応付けられて記憶されている。
[Configuration example of target protein identification device]
The configuration of the target protein identification device 200-2 that realizes the method of the second embodiment described above is the same as that of the target nucleic acid
FIG. 11 is a diagram illustrating an example of the configuration of the target protein identification device 200-2 in the present embodiment. FIG. 12 is a diagram illustrating an example of the configuration of the antigen storage unit 214-2. In the antigen storage unit 214-2, a bead ID, information indicating electrical identification of the
なお、本発明の実施形態における標的核酸配列特定装置２００及び標的タンパク質特定装置２００−２の各処理を実行するためのプログラムをコンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録して、当該記録媒体に記録されたプログラムをコンピュータシステムに読み込ませ、実行することにより、上述した種々の処理を行ってもよい。
In addition, the program for executing each process of the target nucleic acid
なお、ここでいう「コンピュータシステム」とは、ＯＳや周辺機器等のハードウェアを含むものであってもよい。また、「コンピュータシステム」は、ＷＷＷシステムを利用している場合であれば、ホームページ提供環境（あるいは表示環境）も含むものとする。また、「コンピュータ読み取り可能な記録媒体」とは、フレキシブルディスク、光磁気ディスク、ＲＯＭ、フラッシュメモリ等の書き込み可能な不揮発性メモリ、ＣＤ−ＲＯＭ等の可搬媒体、コンピュータシステムに内蔵されるハードディスク等の記憶装置のことをいう。 Here, the “computer system” may include an OS and hardware such as peripheral devices. Further, the “computer system” includes a homepage providing environment (or display environment) if a WWW system is used. The “computer-readable recording medium” means a flexible disk, a magneto-optical disk, a ROM, a writable nonvolatile memory such as a flash memory, a portable medium such as a CD-ROM, a hard disk built in a computer system, etc. This is a storage device.
さらに「コンピュータ読み取り可能な記録媒体」とは、インターネット等のネットワークや電話回線等の通信回線を介してプログラムが送信された場合のサーバやクライアントとなるコンピュータシステム内部の揮発性メモリ（例えばＤＲＡＭ（Dynamic Random Access Memory））のように、一定時間プログラムを保持しているものも含むものとする。また、上記プログラムは、このプログラムを記憶装置等に格納したコンピュータシステムから、伝送媒体を介して、あるいは、伝送媒体中の伝送波により他のコンピュータシステムに伝送されてもよい。ここで、プログラムを伝送する「伝送媒体」は、インターネット等のネットワーク（通信網）や電話回線等の通信回線（通信線）のように情報を伝送する機能を有する媒体のことをいう。また、上記プログラムは、前述した機能の一部を実現するためのものであっても良い。さらに、前述した機能をコンピュータシステムにすでに記録されているプログラムとの組み合わせで実現できるもの、いわゆる差分ファイル（差分プログラム）であってもよい。 Further, the “computer-readable recording medium” means a volatile memory (for example, DRAM (Dynamic DRAM) in a computer system that becomes a server or a client when a program is transmitted through a network such as the Internet or a communication line such as a telephone line. Random Access Memory)), etc., which hold programs for a certain period of time. The program may be transmitted from a computer system storing the program in a storage device or the like to another computer system via a transmission medium or by a transmission wave in the transmission medium. Here, the “transmission medium” for transmitting the program refers to a medium having a function of transmitting information, such as a network (communication network) such as the Internet or a communication line (communication line) such as a telephone line. The program may be for realizing a part of the functions described above. Furthermore, what can implement | achieve the function mentioned above in combination with the program already recorded on the computer system, what is called a difference file (difference program) may be sufficient.
以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述したが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、この発明の要旨を逸脱しない範囲の設計等も含まれる。 As mentioned above, although embodiment of this invention was explained in full detail with reference to drawings, the concrete structure is not restricted to this embodiment, The design etc. of the range which does not deviate from the summary of this invention are included.
１…ビーズ、２…標的核酸用プライマー２…標的核酸、５…標的抗原検出用抗体、２０…ビーズ配置用基板、２１…反応槽、３０…センサ、１００，１００ａ…ビーズ体、２００…標的核酸配列特定装置、２００−２…標的タンパク質特定装置、２１１…核酸伸長判定部、２１２…標的核酸配列特定部、２１２−２…標的タンパク質特定部、２１３…伸長核酸種類特定部、２１３−２…結合タンパク質種類特定部、２１４…核酸配列記憶部、２１４−２…抗原記憶部、３００…複合体プローブ、３０１…２次抗体、３１０…シグナル生成用核酸、３１１…プライマーアニーリング領域、３１２…シグナル生成用配列、３２０…シグナル生成用プライマー、４００…標的タンパク質
DESCRIPTION OF
Claims (13)
（ａ）生体分子を含む試料を、複数の標的生体分子の１つと結合し得るリガンドが固定化された、複数のビーズと接触させる工程と、
（ｂ）前記試料と接触させたビーズを、ビーズ毎に、個別の反応槽に配置する工程と、
（ｃ）前記ビーズが配置された前記反応槽に、核酸伸長反応に核酸伸長に必要な試薬を添加する工程と、
（ｄ）前記ビーズが配置された反応槽内で核酸伸長反応を行う工程と、
（ｅ）前記核酸伸長反応中の各反応槽におけるプロトン発生量を測定する工程と、
（ｆ）前記プロトン発生量に基づいて、各反応槽内における核酸伸長の有無を判定する工程と、を含み、
前記複数のビーズは、各々電気特性の異なる材料を含み、
個々のビーズの少なくとも１種の電気特性を測定することにより、ビーズに固定化されたリガンドの種類を反応槽毎に特定する、
標的生体分子の特定方法。 A method for identifying a target biomolecule,
(A) contacting a sample containing a biomolecule with a plurality of beads on which a ligand capable of binding to one of a plurality of target biomolecules is immobilized;
(B) placing the beads brought into contact with the sample into individual reaction vessels for each bead;
(C) adding a reagent necessary for nucleic acid extension to the nucleic acid extension reaction to the reaction vessel in which the beads are arranged;
(D) performing a nucleic acid extension reaction in a reaction vessel in which the beads are disposed;
(E) measuring a proton generation amount in each reaction tank during the nucleic acid extension reaction;
(F) determining the presence or absence of nucleic acid elongation in each reaction tank based on the proton generation amount,
Each of the plurality of beads includes materials having different electrical characteristics,
By measuring at least one electrical property of each bead, the type of ligand immobilized on the bead is identified for each reaction vessel.
Identification method of target biomolecule.
前記ビーズが配置された前記反応槽内での核酸伸長反応によって生じるプロトンを前記反応槽毎に検出する検出部と、
前記ビーズの電気特性を前記反応槽毎に測定する電気特性測定部と、
前記検出部が検出する前記反応槽毎のプロトンの発生量に基づいて、前記反応槽内における核酸伸長の有無を前記反応槽毎に判定する核酸伸長判定部と、
前記電気特性測定部が測定する前記ビーズの電気特性に基づいて、前記標的リガンドの種類を前記反応槽毎に特定する標的リガンド特定部と、
を備える標的生体分子特定装置。 A bead in which a ligand capable of binding to one of a plurality of biomolecules is immobilized, and a plurality of beads each having a kind of electrical property corresponding to the kind of the immobilized ligand is arranged for each bead. A reaction tank,
A detection unit that detects, for each reaction tank, protons generated by a nucleic acid extension reaction in the reaction tank in which the beads are disposed;
An electrical property measurement unit for measuring electrical properties of the beads for each reaction vessel;
Based on the amount of protons generated for each of the reaction vessels detected by the detection unit, a nucleic acid elongation determination unit that determines for each reaction vessel whether or not there is nucleic acid elongation in the reaction vessel;
Based on the electrical properties of the beads measured by the electrical property measuring unit, a target ligand identifying unit that identifies the type of the target ligand for each reaction vessel,
A target biomolecule identification device comprising:
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