JP2017145239A - Mucin production method and mucin - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ムチンの製造方法及びムチンに関する。より具体的には、ムチンの製造方法、ムチン、界面活性剤、イオン交換樹脂及び潤滑剤に関する。 The present invention relates to a method for producing mucin and a mucin. More specifically, the present invention relates to a mucin production method, a mucin, a surfactant, an ion exchange resin, and a lubricant.
ムチンとは、単純な繰り返し構造を持つペプチド鎖に、1〜10個程度の単糖単位からなる糖鎖が、ペプチド鎖のトレオニン(Thr)残基又はセリン(Ser)残基にO−グリコシド結合で密に結合した高分子糖タンパク質である。ムチンは、細胞や動物の粘液の成分として自然界に多種存在し、細胞組織の保湿、保護、潤滑等の物理的作用や、細菌・ウイルス等の感染を抑制する抗菌作用等を有することが知られている。このため、ムチンを、医薬品、化粧品、健康食品・サプリメント等として利用することが検討されている。 Mucin is a peptide chain having a simple repeating structure and a sugar chain composed of about 1 to 10 monosaccharide units, and an O-glycoside bond to a threonine (Thr) or serine (Ser) residue of the peptide chain. It is a high-molecular glycoprotein tightly bound. Mucin is known to exist in nature as a component of mucus in cells and animals, and has physical actions such as moisturizing, protecting and lubricating cell tissues, and antibacterial action to suppress infection with bacteria and viruses. ing. For this reason, the use of mucins as pharmaceuticals, cosmetics, health foods / supplements and the like has been studied.
ところで、クラゲは毎年大量発生し、定常的に港湾、漁業施設、発電所等に被害を与えている。陸上に引き上げられたクラゲは、産業廃棄物として取り扱われるため、大部分が水分であるにもかかわらず莫大な処理費用がかかっている。このため、クラゲを有効利用する技術の開発が求められている。例えば、特許文献1には、クラゲからムチンを抽出する方法が記載されている。
By the way, jellyfish are produced in large quantities every year and regularly damage harbors, fishing facilities, power plants, etc. Jellyfish that have been lifted to land are treated as industrial waste, so that a huge amount of processing costs are incurred despite the fact that most of them are moisture. For this reason, development of the technique which uses a jellyfish effectively is called for. For example,
しかしながら、発明者は、特許文献1に記載された方法でクラゲからムチンを抽出すると、ムチンの純度が著しく低下する場合があることを見出した。そこで、本発明は、クラゲから純度の高いムチンを製造する方法を提供することを目的とする。
However, the inventor has found that when mucin is extracted from jellyfish by the method described in
本発明は、以下の態様を含む。
(1)破砕されたクラゲを液体成分及び固体成分に分離する工程と、前記液体成分からムチンを抽出する工程と、を備える、ムチンの製造方法であって、前記クラゲが、採取直後にコラーゲン分解酵素阻害剤を接触させたクラゲである、ムチンの製造方法。
(2)前記クラゲが、採取直後にコラーゲン分解酵素阻害剤を接触させ、更にpHを6〜8に調整したクラゲである、(1)に記載のムチンの製造方法。
(3)前記コラーゲン分解酵素阻害剤がエチレンジアミン四酢酸塩である、(1)又は(2)に記載の製造方法。
(4)糖鎖が硫酸基を有するムチン。
(5)糖鎖を構成する単糖単位の30モル%以上が1つ以上の硫酸基を有する、(4)に記載のムチン。
(6)(4)又は(5)に記載のムチンを有効成分として含有する界面活性剤。
(7)(4)又は(5)に記載のムチンを有効成分として含有するイオン交換樹脂。
(8)(4)又は(5)に記載のムチンを有効成分として含有する潤滑剤。
The present invention includes the following aspects.
(1) A method for producing a mucin, comprising: a step of separating a crushed jellyfish into a liquid component and a solid component; and a step of extracting mucin from the liquid component. A method for producing mucin, which is a jellyfish in contact with an enzyme inhibitor.
(2) The method for producing a mucin according to (1), wherein the jellyfish is a jellyfish obtained by bringing a collagenolytic enzyme inhibitor into contact immediately after collection and further adjusting the pH to 6-8.
(3) The production method according to (1) or (2), wherein the collagenase inhibitor is ethylenediaminetetraacetate.
(4) Mucins whose sugar chains have sulfate groups.
(5) The mucin according to (4), wherein 30 mol% or more of the monosaccharide units constituting the sugar chain have one or more sulfate groups.
(6) A surfactant containing the mucin according to (4) or (5) as an active ingredient.
(7) An ion exchange resin containing the mucin according to (4) or (5) as an active ingredient.
(8) A lubricant containing the mucin according to (4) or (5) as an active ingredient.
本発明により、クラゲから純度の高いムチンを製造する方法を提供することができる。 According to the present invention, a method for producing highly pure mucin from jellyfish can be provided.
[ムチンの製造方法]
1実施形態において、本発明は、破砕されたクラゲを液体成分及び固体成分に分離する工程と、前記液体成分からムチンを抽出する工程と、を備える、ムチンの製造方法であって、前記クラゲが、採取直後にコラーゲン分解酵素阻害剤を接触させたクラゲである、ムチンの製造方法を提供する。本実施形態の製造方法により、クラゲから純度の高いムチンを容易に製造することができる。
[Method for producing mucin]
In one embodiment, the present invention is a method for producing a mucin, comprising: a step of separating a crushed jellyfish into a liquid component and a solid component; and a step of extracting mucin from the liquid component. The present invention provides a method for producing mucin, which is a jellyfish that has been contacted with a collagenase inhibitor immediately after collection. By the production method of the present embodiment, highly pure mucin can be easily produced from jellyfish.
本実施形態のムチンの製造方法は、採取直後のクラゲにコラーゲン分解酵素阻害剤を接触させる工程と、破砕されたクラゲを液体成分及び固体成分に分離する工程と、前記液体成分からムチンを抽出する工程と、を備える、製造方法であってもよい。 The mucin production method of the present embodiment includes a step of bringing a collagenase inhibitor into contact with a jellyfish immediately after collection, a step of separating the crushed jellyfish into a liquid component and a solid component, and extracting mucin from the liquid component A manufacturing method comprising the steps.
発明者は、クラゲ由来ムチンの製造において、ムチンの純度が著しく低下する理由の1つとして、クラゲの自己分解により低分子コラーゲンが生成し、これがムチンの精製時にムチンに混入し、ムチンの純度を低下させることを見出した。実施例において後述するように、クラゲの自己分解は、クラゲの採取後数分から数時間程度で著しく進行し、−80℃で凍結しても完全には停止せず、凍結保存状態でもコラーゲンの低分子化が進行した。 The inventor has one of the reasons that the purity of mucin is significantly reduced in the production of jellyfish-derived mucins. Low-molecular-weight collagen is produced by jellyfish autolysis, which is mixed into mucins during the purification of mucins. I found it to decrease. As described later in the Examples, jellyfish autolysis significantly progressed within minutes to several hours after collection of jellyfish, and does not stop completely even when frozen at −80 ° C. Molecularization has progressed.
発明者はまた、クラゲの自己分解が、クラゲ自身が有するコラーゲン分解酵素及びクラゲに共存する微生物により行われることを見出した。発明者は更に、採取後のクラゲの自己分解による低分子コラーゲンの生成を抑制するために、採取後のクラゲに速やかにコラーゲン分解酵素阻害剤を添加することが有効であることを見出した。 The inventor has also found that jellyfish autolysis is performed by a collagen-degrading enzyme contained in the jellyfish itself and a microorganism coexisting with the jellyfish. The inventor has further found that it is effective to quickly add a collagenase inhibitor to the jellyfish after collection in order to suppress the production of low molecular collagen due to autolysis of the jellyfish after collection.
(クラゲ)
クラゲとしては特に制限されず、例えば、ミズクラゲ、エチゼンクラゲ、アカクラゲ、スナイロクラゲ、ハブクラゲ、カミクラゲ等の、ヒドロ虫綱、鉢虫綱、箱虫綱に属する刺胞動物のいずれも用いることができる。また、クラゲは、採取直後にコラーゲン分解酵素阻害剤を接触させたものであれば、採取直後のものであってもよく、冷凍保存を経たものであってもよい。
(jellyfish)
The jellyfish is not particularly limited, and for example, any of the cnidarians belonging to the class of hydroworms, potters, and boxworms, such as moon jellyfish, echigen jellyfish, red jellyfish, snail jellyfish, jellyfish jellyfish, etc. can be used. The jellyfish may be immediately after collection or may be frozen and stored as long as it is contacted with a collagenase inhibitor immediately after collection.
(コラーゲン分解酵素阻害剤)
コラーゲン分解酵素阻害剤としては、キレート剤、コラーゲン分解酵素の阻害効果が高い化合物(キレート剤を除く。)等が挙げられる。
(Collagenase inhibitor)
Examples of the collagen degrading enzyme inhibitor include chelating agents and compounds having a high inhibitory effect on collagen degrading enzymes (excluding chelating agents).
《キレート剤》
発明者は、コラーゲン分解酵素阻害剤としてキレート剤が有効であることを見出した。これは、クラゲの体内に存在するコラーゲン分解酵素が、主にマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)であるためであると推測している。
《Chelating agent》
The inventor has found that chelating agents are effective as collagenase inhibitors. This is presumed to be because collagen degrading enzymes present in the jellyfish body are mainly matrix metalloproteinases (MMPs).
キレート剤としては、Mg2+、Ca2+、Zn2+等の金属イオンとの安定化平衡定数pKが約5以上のものが挙げられる。具体的には、エチレンジアミン、N,N’−ジメチルエチレンジアミン、N,N−ジメチルエチレンジアミン、N,N’−ジエチルエチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、トリメチレンジアミン、β,β’,β’’−トリアミノトリエチルアミン、プオピレンジアミン、1,2,3−トリアミノプロパン、o−フェナントロリン、α,α’ジピリジル、アラニン、アスパラギン、グリシン、ヒスチジン、トリプトファン、ジヨードチロシン、バリン、システイン、イミノジ酢酸、1,2−ジアミノシクロヘキサン−N,N,N’,N’−テトラ酢酸、1,3−ジアミノシクロヘキサン−N,N,N’,N’−テトラ酢酸、1,4−ジアミノシクロヘキサン−N,N,N’,N’−テトラ酢酸、エチレンジアミン−N,N’−ジ酢酸、エチレンジアミン−N,N,N’,N’−テトラ酢酸(EDTA)、エチレンジアミンジプロピオン酸、エチレンジアミンテトラプロピオン酸、グリシン−N−プロピオン酸、トリメチレンジアミンテトラ酢酸、テトラメチレンジアミンテトラ酢酸、ペンタメチレンジアミンテトラ酢酸、テトラメタリン酸、ベンゾイルアセトン、ベンゾイルトリフルオロアセトン、チオベンゾイルメタン、β−オキシキノリン、エリオクロムブラック−T、エリオクロムブラック−A、エリオクロムブラック−B、エリオクロムブラック−R、o−アミノベンゼンチオール、o−アミノフェノール、グリコールエーテルジアミン四酢酸、N−(2−ヒドロキシエチル)エチレンジアミン−N,N’,N’−三酢酸、ニトリロトリスメチルホスホン酸、ジエチレントリアミン−N,N,N’,N’’,N’’−5酢酸、ニトリロトリ酢酸、トリエチレンテトラアミン−N,N,N’,N’’,N’’’,N’’’−6酢酸、8−ヒドロキシキノリン−5硫酸等が挙げられる。 Examples of the chelating agent include those having a stabilization equilibrium constant pK of about 5 or more with metal ions such as Mg 2+ , Ca 2+ and Zn 2+ . Specifically, ethylenediamine, N, N′-dimethylethylenediamine, N, N-dimethylethylenediamine, N, N′-diethylethylenediamine, diethylenetriamine, triethylenetetramine, trimethylenediamine, β, β ′, β ″ -tri Aminotriethylamine, puopyrenediamine, 1,2,3-triaminopropane, o-phenanthroline, α, α'dipyridyl, alanine, asparagine, glycine, histidine, tryptophan, diiodotyrosine, valine, cysteine, iminodiacetic acid, 1, 2-diaminocyclohexane-N, N, N ′, N′-tetraacetic acid, 1,3-diaminocyclohexane-N, N, N ′, N′-tetraacetic acid, 1,4-diaminocyclohexane-N, N, N ', N'-tetraacetic acid, ethylenediamine-N, N'-diacetic acid, Tylenediamine-N, N, N ′, N′-tetraacetic acid (EDTA), ethylenediaminedipropionic acid, ethylenediaminetetrapropionic acid, glycine-N-propionic acid, trimethylenediaminetetraacetic acid, tetramethylenediaminetetraacetic acid, pentamethylene Diaminetetraacetic acid, tetrametaphosphoric acid, benzoylacetone, benzoyltrifluoroacetone, thiobenzoylmethane, β-oxyquinoline, eriochrome black-T, eriochrome black-A, eriochrome black-B, eriochrome black-R, o -Aminobenzenethiol, o-aminophenol, glycol ether diamine tetraacetic acid, N- (2-hydroxyethyl) ethylenediamine-N, N ', N'-triacetic acid, nitrilotrismethylphosphonic acid, diethylenetri Amine-N, N, N ′, N ″, N ″ -5 acetic acid, nitrilotriacetic acid, triethylenetetraamine-N, N, N ′, N ″, N ′ ″, N ′ ″-6 Examples include acetic acid and 8-hydroxyquinoline-5 sulfuric acid.
キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸塩が好適である。エチレンジアミン四酢酸塩としては、例えばエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸三ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム等が挙げられる。キレート剤の濃度は、終濃度で、例えば5〜100mMであってもよく、例えば5〜20mMであってもよく、例えば5〜10mMであってもよい。キレート剤は、必要濃度の10〜100倍濃度の水溶液を調製し、クラゲの質量又は体積の1/10〜1/100質量又は体積程度添加して混和すると簡便である。クラゲの身体は寒天状のゲルであり、拡散係数が大きいため、キレート剤の添加時にクラゲを破砕する必要はない。
As the chelating agent, ethylenediaminetetraacetate is preferred. Examples of ethylenediaminetetraacetate include disodium ethylenediaminetetraacetate, trisodium ethylenediaminetetraacetate, and tetrasodium ethylenediaminetetraacetate. The concentration of the chelating agent may be 5 to 100 mM, for example 5 to 20 mM, for example 5 to 10 mM, as a final concentration. The chelating agent is conveniently prepared by preparing an aqueous solution having a
キレート剤は、クラゲの採取後5時間以内に添加することが好ましく、3時間以内に添加することがより好ましく、1時間以内に添加することが更に好ましい。 The chelating agent is preferably added within 5 hours after collecting the jellyfish, more preferably within 3 hours, and even more preferably within 1 hour.
《コラーゲン分解酵素の阻害効果が高い化合物》
コラーゲン分解酵素の阻害効果が高い化合物(キレート剤を除く。)としては、例えば、Cd2+、Cu2+、Fe3+、Hg2+、Mn2+、Pb2+、Zn2+、青酸化合物、β1−アンチコラゲナーゼ、DFP(ジイソプロピルフルオロリン酸)、PMSF(フェニルメタンスルホニルフルオリド)、SBTI(ダイズトリプシンインヒビター)、TLCK(Tos−Lys−クロロメチルケトン)、TPCK(Tos−Phe−クロロメチルケトン)、N−[1(R,S)−カルボキシ−n−ブチル]−Leu−Phe−AlaNH2、[N−1(r)−カルボキシエチル−α(s)(フェニルエチル)Gly−(S)−Leu−N−フェニルアミド、[N−1(R)−カルボキシエチル−α(s)(2−フェニルエチル)Gly−Leu−N−フェニルアミド、Nα−(nデシルホスホニル)Gly−Pro−Ala、nデシルPO2Gly−Pro−Ala、2,3−ジメルカプトプロパノール、Nα(エチルホスホニル)Gly−Pro−Ala、N(2R)2[2’ヒドロキシアミノ2’オキソエチル]6フェノキシヘキサノイル−LフェニルアラニルNメチルアミド、N2−(2(5)−[(ヒドロキシカルバモイル)メチル−4−メチルバレリル]−N−1,3一ジメチルバリンアミド、Nα−(イソアミルホスホニル)−Gly−Pro−Ala、(S,S)−3−メルカプト−6−メチル−4−[[[1(S)−[(メチルアミノ)カルボニル]2(3−インドリル)エチル]アミノ]カルボニル]ヘプタン酸メチルエステル、ミノサイクリン、NN((R)−1−ホスホノプロピル)(S)Leu−(S)−3インドイルアラニン−N−メチルアミド、ホスホラミドン、Nαホスホリル−Gly−Pro−Ala−アミド、Nαホスホリル−Gly−Pro−Ala、Nαホスホリル−Gly−Pro−アミド、Z−Phe−psi−(PO2CH2)Gly−Pro−AHX、Z−Phe−psi−(PO2CH2)Gly−Pro−NLE、N−Z−Pro−Leu−Glyヒドロキマート、5−シアナミド−4−オキソ−6−フェニルヘキサノイル−Pro−Pro、ジイソプロピルフロロリン酸、N−(エトキシヒドロキシホスフィニル)−L−Ile−N−メチル−L−トリプトファンアミド、還元型グルタチオン、HS−C2H4−CO−Pro−ホモアルギニン、HS−C2H4−CO−Pro−NH−(4ニトロベンジル)、HS−C2H4−CO−Pro−4ニトロベンジルアミド、8−ヒドロキソキノリン、イソプロピルアルコール、2−メルカプトエタノール、メルカプトトリペプチド、N−(4−ニトロフェニルエチルホスホニル)Gly−L−Pro−L−2−アミノ−ヘキサン酸、N−(3フェニルプロピルホスホニル)Gly−Pro−L−2−アミノ−ヘキサン酸、トリグリコール酸、N−(4−トリフルオロメチルフェニルエチルホスホニル)−Gly−Pro−L−2−アミノヘキサン酸、Z−Gly−Leu−OH、Z−Gly−Pro−Leu−NHOH、Z−Gly−Pro−Leu−OH、Z−Gly−Pro−NHOH、シナモイル(5R,S)−5−アミノ−7−メチル−4−オキソオクタノイル−Pro−Pro、N−ベンジルオキシカルボニル−システイントリプトアミド、4−デジメチルアミノテトラサイクリン、(2R,S)−HONH−Mal(iBu)NH(CH2)7CH3、3−(N−ヒドロキシカルバモイル)−2−(R)−イソブチルプロピオニル−L−トリプトファン−N[2−(4−ヒドロキシフェニル)エチル]アミド、HSCH(CH2CH(CH3)2)CO−Ala−Gly−D−Arg−NH2、2−アミノベンジル−Gln−Gly−Pro−2−ナフチルアミド、ドキシサイクリン、ロイペプチン、キモスタチン、マトリルスタチン(Matlystatins)、マリマスタット(Marimastat)、バチマスタット(Batimastat)、セアフラビン(Theaflavin)、アクチノニン(Actinonin)、クロドロネート(Clodronate)、リファンピシン(rifampicin)、カプトプリル(Captopril)、シラシタチン(Cilastatin)、コプチシン(Coptisine)、グリチルレチン酸(Glycyrrhetinic acid)、ベツリン酸、TIMP−2、TIMP−4、AG3340、BB1101、BB1909、BB2014、CGS27023A、CT1166、FN439、FOY305、FUT175、FUT187、GM6001、RO31−4724、RO31−7467、RO31−9790、RO32−3555、RS39066、RS130830、SC40827、SE205、WS79089A、WS79089B、WS79089C等が挙げられる。これらの化合物は1種を単独で用いてもよく、2種以上を組み合わせて用いてもよい。
<Compound with high inhibitory effect on collagenase>
Examples of the compound having a high inhibitory effect on collagen degrading enzyme (excluding chelating agents) include, for example, Cd 2+ , Cu 2+ , Fe 3+ , Hg 2+ , Mn 2+ , Pb 2+ , Zn 2+ , cyanide compound, β1-anticollagenase, DFP (diisopropyl fluorophosphate), PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride), SBTI (soybean trypsin inhibitor), TLCK (Tos-Lys-chloromethyl ketone), TPCK (Tos-Phe-chloromethyl ketone), N- [1 (R, S) - carboxy -n- butyl] -Leu-Phe-AlaNH 2, [N-1 (r) - carboxyethyl -α (s) (phenylethyl) Gly- (S) -Leu-N- phenyl Amide, [N-1 (R) -carboxyethyl-α (s) (2-phenylethyl) Gly-Leu-N-phenylamide, Nα- (ndecylphosphonyl) Gly-Pro-Ala, ndecylPO 2 Gly-Pro-Ala, 2,3-dimercaptopropanol, Nα (ethylphosphonyl) Gly-Pro-Ala , N (2R) 2 [2′
採取後のクラゲに速やかにこれらの化合物を添加することにより、クラゲ自身が有するコラーゲン分解酵素や、クラゲに共存する微生物が有するコラーゲン分解酵素を阻害し、クラゲの自己分解による低分子コラーゲンの生成を抑制することができる。 By quickly adding these compounds to the jellyfish after collection, the collagen-degrading enzyme of the jellyfish itself and the collagen-degrading enzyme of microorganisms coexisting with the jellyfish are inhibited, and the production of low-molecular-weight collagen by jellyfish autolysis is prevented. Can be suppressed.
《殺菌剤》
クラゲに共存する微生物による低分子コラーゲンの生成を抑制するためには、採取後のクラゲに殺菌剤を添加することも有効である。
"Fungicide"
In order to suppress the production of low molecular weight collagen by microorganisms coexisting with jellyfish, it is also effective to add a bactericidal agent to the jellyfish after collection.
殺菌剤としては、次亜塩素酸ナトリウム水溶液等の塩素系殺菌剤、アジ化ナトリウム等を用いることができる。例えば、5%次亜塩素酸ナトリウム水溶液を、クラゲの質量又は体積の1/10〜1/100質量又は体積程度添加して混和するとよい。 As the disinfectant, a chlorine disinfectant such as a sodium hypochlorite aqueous solution, sodium azide, or the like can be used. For example, a 5% sodium hypochlorite aqueous solution may be added and mixed with about 1/10 to 1/100 mass or volume of the jellyfish mass or volume.
《pHの調製》
本実施形態のムチンの製造方法において、材料に用いるクラゲは、採取直後にコラーゲン分解酵素阻害剤を接触させ、更にpHを6〜8に調整したクラゲであることが好ましい。すなわち、本実施形態のムチンの製造方法は、採取直後のクラゲにコラーゲン分解酵素阻害剤を接触させる工程と、コラーゲン分解酵素阻害剤を接触させたクラゲのpHを6〜8に調整する工程と、破砕されたクラゲを液体成分及び固体成分に分離する工程と、前記液体成分からムチンを抽出する工程と、を備える、製造方法であってもよい。
<Preparation of pH>
In the mucin production method of the present embodiment, the jellyfish used for the material is preferably a jellyfish in which a collagenolytic enzyme inhibitor is brought into contact immediately after collection and the pH is adjusted to 6-8. That is, the method for producing the mucin of the present embodiment includes a step of bringing a collagen degrading enzyme inhibitor into contact with a jellyfish immediately after collection, a step of adjusting the pH of the jellyfish in contact with the collagen degrading enzyme inhibitor to 6 to 8, and A manufacturing method may include a step of separating the crushed jellyfish into a liquid component and a solid component and a step of extracting mucin from the liquid component.
実施例において後述するように、発明者らは、コラーゲン分解酵素阻害剤を接触させた後、直ちにpHを6〜8、好ましくはpH約7に調整することにより、製造されるムチンの硫酸基の減少を抑制することができることを明らかにした。つまり、クラゲのpHを調製することにより、硫酸基の含有量がより高いムチンを製造することが可能になる。これは、液体成分のpHを中性に調整したことにより、ムチンを構成するペプチド鎖や糖鎖の加水分解が抑制されるためであると推測される。 As will be described later in the Examples, the inventors immediately adjusted the pH to 6-8, preferably about pH 7, after contacting the collagenase inhibitor, so It was clarified that the decrease can be suppressed. That is, by adjusting the pH of the jellyfish, it becomes possible to produce a mucin having a higher sulfate group content. This is presumed to be because the hydrolysis of the peptide chain and sugar chain constituting mucin is suppressed by adjusting the pH of the liquid component to neutral.
実施例において後述するように、発明者らは、硫酸基の含有量がより高いムチンは、界面活性剤としての性能がより高く、潤滑剤としての性能もより高いことを明らかにした。 As will be described later in Examples, the inventors have revealed that mucin having a higher sulfate group content has higher performance as a surfactant and higher performance as a lubricant.
クラゲのpHの調整は、採取直後のクラゲにコラーゲン分解酵素阻害剤を接触させた後速やかに行うことが好ましい。特に、コラーゲン分解酵素阻害剤としてキレート剤を使用した場合、クラゲから分離される液体成分のpHが4程度の酸性を示すことがある。これは、キレート剤の添加により、結合していた金属イオンを放出した硫酸基、ホスホン酸基、リン酸基等が酸性を示すためであると考えられる。 It is preferable to adjust the pH of the jellyfish promptly after bringing the collagenase inhibitor into contact with the jellyfish immediately after collection. In particular, when a chelating agent is used as the collagenase inhibitor, the pH of the liquid component separated from the jellyfish may show an acidity of about 4. This is considered to be because the sulfate group, phosphonic acid group, phosphoric acid group, and the like that released the bound metal ions by the addition of the chelating agent show acidity.
pHを調整するためには、具体的には、クラゲへのキレート剤の添加と同時に、あるいは、キレート剤の添加の直後に、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等を添加すればよい。 In order to adjust the pH, specifically, sodium hydroxide, potassium hydroxide or the like may be added simultaneously with the addition of the chelating agent to the jellyfish or immediately after the addition of the chelating agent.
(破砕されたクラゲを液体成分及び固体成分に分離する工程)
まず、破砕されたクラゲを液体成分及び固体成分に分離する。クラゲの破砕方法は特に制限されず、裁断機、ミキサー等を用いて破砕されたクラゲであってもよい。破砕されたクラゲを液体成分及び固体成分に分離する方法は特に制限されず、例えば、遠心分離によって行ってもよいし、圧搾によって行ってもよいし、ろ過によって行ってもよい。
(Step of separating the crushed jellyfish into liquid and solid components)
First, the crushed jellyfish is separated into a liquid component and a solid component. The jellyfish crushing method is not particularly limited, and may be a jellyfish crushed using a cutting machine, a mixer or the like. The method for separating the crushed jellyfish into a liquid component and a solid component is not particularly limited, and may be performed, for example, by centrifugation, may be performed by pressing, or may be performed by filtration.
(高分子コラーゲンを除去する工程)
続いて、任意選択で本工程を実施してもよい。すなわち、破砕されたクラゲから得られた上記の液体成分は、そのまま、後述する金属塩を添加する工程に用いてもよい。あるいは、本工程を実施して高分子コラーゲンを除去した後に、金属塩を添加する工程に用いてもよい。本工程を実施することにより、より純度が高いムチンを製造することが容易になる。また、破砕されたクラゲには浮遊成分が発生する場合があり、この浮遊成分に高分子コラーゲンが多く含まれる場合がある。したがって、浮遊成分が発生した場合には浮遊成分も除去することが好ましい。
(Process to remove high molecular collagen)
Subsequently, this step may be optionally performed. That is, you may use said liquid component obtained from the crushed jellyfish as it is for the process of adding the metal salt mentioned later. Or after implementing this process and removing high molecular collagen, you may use for the process of adding a metal salt. By carrying out this step, it becomes easy to produce mucin with higher purity. In addition, suspended components may be generated in the crushed jellyfish, and the suspended components may contain a large amount of high molecular collagen. Therefore, when a floating component is generated, it is preferable to remove the floating component.
本工程では、破砕されたクラゲから分離した液体成分にアルコールを添加し、アルコールの濃度を50容量%程度に調整する。これにより、液体成分中の高分子コラーゲン類が沈殿する。沈殿した高分子コラーゲンは遠心分離等により除去することができる。アルコールとしては、エタノール、メタノール、プロパノール等を用いることができる。 In this step, alcohol is added to the liquid component separated from the crushed jellyfish, and the alcohol concentration is adjusted to about 50% by volume. Thereby, polymer collagens in the liquid component are precipitated. The precipitated polymer collagen can be removed by centrifugation or the like. As the alcohol, ethanol, methanol, propanol or the like can be used.
(液体成分からムチンを抽出する工程)
続いて、上述した液体成分からムチンを抽出する。ムチンの抽出方法は特に制限されず、例えば、上述した液体成分に、アルコールを添加し、アルコール濃度を75容量%程度以上に調整することによりムチンを沈殿させることができる。
(Process for extracting mucin from liquid components)
Subsequently, mucin is extracted from the liquid component described above. The method for extracting mucin is not particularly limited. For example, mucin can be precipitated by adding alcohol to the liquid component described above and adjusting the alcohol concentration to about 75% by volume or more.
ここで、上述した高分子コラーゲンを除去する工程を実施し、アルコール濃度が既に50容量%程度に調整されている場合には、アルコール濃度が75容量%程度以上となるようにアルコールを添加すればよい。ここで得られた沈殿に対して、塩を含まない蒸留水を添加してムチンを再抽出し、残った沈殿を除去する。多くの場合、抽出液はpH=4前後の酸性を示すため、ムチンの加水分解を抑制するために、適当なアルカリ溶液(水酸化ナトリウム溶液が最も好ましい。)を加えてpHを7前後に調整することが適当である。回収したムチンの溶液に対して透析等の脱塩処理を行ない、凍結乾燥することにより、純度の高いムチンを得ることができる。 Here, when the step of removing the above-described polymer collagen is performed and the alcohol concentration is already adjusted to about 50% by volume, the alcohol is added so that the alcohol concentration is about 75% by volume or more. Good. To the precipitate obtained here, distilled water containing no salt is added to re-extract mucin, and the remaining precipitate is removed. In many cases, the extract has an acidity of around pH = 4, so that an appropriate alkaline solution (sodium hydroxide solution is most preferred) is added to adjust the pH to around 7 in order to suppress mucin hydrolysis. It is appropriate to do. A highly purified mucin can be obtained by subjecting the recovered mucin solution to a desalting treatment such as dialysis and freeze-drying.
上述した液体成分からムチンを抽出する別の方法としては、液体成分に金属イオンを添加してムチンを沈殿させることが挙げられる。金属イオンは、水中で電離して金属イオンを生じる金属塩の形態で添加することが簡便である。金属イオンとしては、Ca2+、Sc3+、Ti3+、Ti4+、Ti6+、VO2+、VO3+、V3+、V4+、Cr2+、Cr3+、Mn2+、Mn3+、Fe2+、Fe3+、Co2+、Ni2+、Cu+、Cu2+、Zn2+、Ga2+、Ga3+、Ge2+、Ge4+、Sr2+、Y3+、ZrO2+、Zr4+、Nb4+、Nb5+、Mo3+、Mo5+、Tb4+、Ru3+、Rh3+、Rh4+、Rh5+、Pd2+、Ag+、Cd2+、In3+、Sn2+、Sn4+、Sb3+、Sb5+、Ba2+、La3+、Ce3+、Ce4+、Pr3+、Nd3+等が挙げられる。
Another method for extracting mucin from the liquid component described above includes adding metal ions to the liquid component to precipitate mucin. It is convenient to add the metal ion in the form of a metal salt that ionizes in water to generate a metal ion. Examples of metal ions include Ca 2+ , Sc 3+ , Ti 3+ , Ti 4+ , Ti 6+ , VO 2+ , VO 3+ , V 3+ , V 4+ , Cr 2+ , Cr 3+ , Mn 2+ , Mn 3+ , Fe 2+ , Fe 3+ , Co 2+, Ni 2+, Cu + ,
金属塩としては、上記のいずれかの金属イオンと陰イオンとのイオン結合により形成された塩が挙げられる。金属塩は水和物であってもよい。陰イオンとしては、無機アニオン及び有機アニオンが挙げられる。無機アニオンとしては、例えば、塩化物イオン、ヨウ化物イオン等のハロゲン化物イオン;硫酸イオン、リン酸イオン、硝酸イオン等が挙げられる。なお、用いた金属イオンとの結合定数が大きく水に溶けにくい難溶性塩を形成する陰イオンは選択することができない。有機アニオンとしては、メシレートイオン、ベシレートイオン、トシレートイオン、トリフレートイオン等のスルホン酸イオン;ギ酸イオン、酢酸イオン、クエン酸イオン、フマル酸イオン等のカルボン酸イオン等が挙げられる。有機アニオンについても上述した無機アニオンと同様に、用いた金属イオンとの結合定数が大きく水に溶けにくい難溶性塩を形成する陰イオンは選択することができない。 Examples of the metal salt include salts formed by ionic bonds between any of the above metal ions and anions. The metal salt may be a hydrate. Examples of the anion include inorganic anions and organic anions. Examples of inorganic anions include halide ions such as chloride ions and iodide ions; sulfate ions, phosphate ions, and nitrate ions. An anion that forms a sparingly soluble salt that has a large binding constant with the metal ion used and is hardly soluble in water cannot be selected. Examples of the organic anion include sulfonate ions such as mesylate ion, besylate ion, tosylate ion and triflate ion; carboxylate ions such as formate ion, acetate ion, citrate ion and fumarate ion. As for the organic anion, similarly to the inorganic anion described above, an anion that forms a sparingly soluble salt that has a large binding constant with the metal ion used and is hardly soluble in water cannot be selected.
金属塩としては、ほとんどの金属イオンと水に溶けやすい塩をつくり、酸化力の低い塩化物が好適である。また、従来から医薬品や食品添加物として用いられており、安全性が高く、価格も安いことから、金属塩の中でも塩化カルシウムが好適である。 As the metal salt, a salt which is easily soluble in most metal ions and water and has a low oxidizing power is suitable. In addition, calcium chloride is preferred among metal salts since it has been used as a pharmaceutical or food additive and has high safety and low price.
液体成分に金属イオンを添加してムチンを沈殿させる場合には、上述した液体成分に金属塩を投入し撹拌して速やかに溶解させる。金属塩添加時の温度は、溶解を促進するために常温でもよいが、生体分子の分解を抑えるためには低温であることが好ましい。 When adding a metal ion to a liquid component and precipitating mucin, a metal salt is thrown into the liquid component mentioned above, and it stirs and dissolves rapidly. The temperature at which the metal salt is added may be room temperature in order to promote dissolution, but it is preferably low in order to suppress biomolecule decomposition.
液体成分に金属塩を添加すると、数秒〜数10秒で沈殿が生成しはじめる。添加する金属塩の量は、ムチンを沈殿させるのに十分な量であれば特に制限されない。但し、大量の金属塩を用いて、過剰に金属イオンをムチン成分に結合させて沈殿させると、後述する、金属イオンを剥離する工程の収率が下がり支障をきたす場合がある。金属塩の添加開始からムチンの沈殿生成の完了までの時間は特に制限されないが、液体成分と金属イオンを長時間反応させると、より多数のイオンが反応して、後に沈殿から金属イオンを除去することが困難になる傾向にあることから、例えば、1時間以内であってもよい。生成した沈殿は、遠心分離、ろ過等により液体成分から回収する。 When a metal salt is added to the liquid component, a precipitate starts to form in several seconds to several tens of seconds. The amount of the metal salt to be added is not particularly limited as long as it is an amount sufficient to precipitate mucin. However, if metal ions are excessively bound to the mucin component and precipitated using a large amount of metal salt, the yield of the step of peeling the metal ions, which will be described later, may be reduced. The time from the start of the addition of the metal salt to the completion of the mucin precipitation is not particularly limited. However, when the liquid component and the metal ions are reacted for a long time, a larger number of ions react and later the metal ions are removed from the precipitate. For example, it may be within one hour. The produced precipitate is recovered from the liquid component by centrifugation, filtration or the like.
液体成分に金属イオンを添加して沈殿させたムチンは、そのまま粗精製ムチンとして使用してもよく、更に精製して純度を高めてもよい。例えば、得られた沈殿から金属イオンを剥離することが挙げられる。 Mucin precipitated by adding metal ions to the liquid component may be used as crude purified mucin as it is, or may be further purified to increase purity. For example, peeling of metal ions from the obtained precipitate can be mentioned.
沈殿から金属イオンを剥離する方法としては、例えば、沈殿に上述したキレート剤を添加する方法が挙げられる。この場合、ムチンを沈殿させるのに用いた金属イオンとの結合定数がより高いキレート剤を使用することが好適である。 Examples of the method for peeling metal ions from the precipitate include a method of adding the above-described chelating agent to the precipitate. In this case, it is preferable to use a chelating agent having a higher binding constant with the metal ion used to precipitate mucin.
沈殿から金属イオンを剥離する他の方法としては、例えば、ムチンを沈殿させるのに用いた金属イオンと結合して難溶性塩を生じる陰イオンを作用させる方法が挙げられる。 As another method for peeling metal ions from the precipitate, for example, there is a method in which an anion that binds to the metal ion used for precipitating mucin and generates a hardly soluble salt is used.
陰イオンは、水中で電離して陰イオンを生じる塩の形態で添加することが簡便である。例えば、ムチンを沈殿させるのにカルシウムイオンを用いた場合には、硫酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、リン酸カリウムナトリウム水溶液等を添加すればよい。これにより、硫酸カルシウム、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム等の難溶性塩が形成され、ムチンの沈殿から金属イオンが剥離される。 The anion is conveniently added in the form of a salt that ionizes in water to produce an anion. For example, when calcium ions are used to precipitate mucin, sodium sulfate, sodium carbonate, potassium sodium phosphate aqueous solution, or the like may be added. Thereby, sparingly soluble salts such as calcium sulfate, calcium carbonate, and calcium phosphate are formed, and the metal ions are peeled from the mucin precipitate.
沈殿から金属イオンを剥離する他の方法としては、例えば、陽イオン交換樹脂及び陰イオン交換樹脂を用いて金属イオンを剥離する方法が挙げられる。例えば、ムチンの沈殿に、陽イオン交換樹脂及び蒸留水を適量混合して、激しく振とうすることにより、ムチンを液相に溶出させることができる。 Examples of other methods for peeling metal ions from the precipitate include a method for peeling metal ions using a cation exchange resin and an anion exchange resin. For example, the mucin can be eluted into the liquid phase by mixing an appropriate amount of a cation exchange resin and distilled water into the mucin precipitate and shaking vigorously.
あるいは、ムチンの沈殿(ムチン−金属イオン複合体)を、陰イオン交換樹脂に一旦保持させ、ムチンが保持される範囲で適当なイオン濃度のナトリウムイオンを含んだ溶液(例えば塩化ナトリウム溶液)を大量に流して洗浄した後、更に高濃度のナトリウムイオンを含んだ溶液(例えば塩化ナトリウム溶液)で溶出させることにより、ムチンの沈殿に用いた金属イオンをナトリウムイオンに交換することが挙げられる。 Alternatively, the mucin precipitate (mucin-metal ion complex) is temporarily retained in an anion exchange resin, and a large amount of a solution containing sodium ions having an appropriate ion concentration within a range in which mucin is retained (for example, a sodium chloride solution). After flowing and washing, the metal ions used for precipitation of mucin can be exchanged for sodium ions by elution with a solution containing a higher concentration of sodium ions (for example, sodium chloride solution).
ムチンの沈殿から金属イオンを剥離するためには、上述した方法のいずれかを単独で行ってもよいし、複数を組み合わせて行ってもよい。上述した方法のいずれの場合においても、ムチンが溶液中に溶出される。この溶液を回収し、透析等の脱塩処理を行ない、凍結乾燥することにより、純度の高いムチンを得ることができる。但し、得られるムチンには後述する硫酸基の影響で、金属イオンがカウンターイオンとして残留する。これは上述したいずれの剥離方法においても、ムチンそのものを分解しないよう平衡過程を用いているためである。回収した溶液は、この段階でpHを中性程度に中和しておくことが望ましい。 In order to peel metal ions from the mucin precipitate, any of the above-described methods may be performed alone, or a plurality may be combined. In any of the methods described above, mucin is eluted in the solution. A highly purified mucin can be obtained by recovering this solution, subjecting it to desalination treatment such as dialysis, and freeze-drying. However, metal ions remain as counter ions in the obtained mucin due to the influence of a sulfate group described later. This is because in any of the peeling methods described above, an equilibrium process is used so as not to decompose the mucin itself. The recovered solution is desirably neutralized to a neutral pH at this stage.
[糖鎖が硫酸基を有するムチン]
1実施形態において、本発明は、糖鎖が硫酸基を有するムチンを提供する。発明者は、クラゲから製造したムチンが、糖鎖に硫酸基を有することを見出した。
[Mucin whose sugar chain has a sulfate group]
In one embodiment, the present invention provides a mucin in which the sugar chain has a sulfate group. The inventor has found that mucin produced from jellyfish has a sulfate group in the sugar chain.
上述したように、ムチンは、単純な繰り返し構造を持つペプチド鎖に、1〜10個程度の単糖単位からなる糖鎖が、ペプチド鎖のトレオニン(Thr)残基又はセリン(Ser)残基にO−グリコシド結合で密に結合した高分子糖タンパク質である。 As described above, mucin is a peptide chain having a simple repeating structure, and a sugar chain composed of about 1 to 10 monosaccharide units is used as a threonine (Thr) residue or serine (Ser) residue of the peptide chain. It is a high-molecular glycoprotein tightly bound by an O-glycoside bond.
本実施形態のムチンを構成する糖鎖は、糖鎖を構成する単糖単位の30モル%以上が1つ以上の硫酸基を有するものであってもよい。本明細書において、単糖とは、それ以上加水分解されない糖類を意味し、多糖を形成する際の構成要素となる化合物を意味する。単糖は、糖類の最小構成単位であるということもできる。また、本明細書において、「単糖単位」とは、単糖に相当する化学構造を意味する。「単糖単位」は、単糖に由来する化学構造であるということもできる。 In the sugar chain constituting the mucin of the present embodiment, 30 mol% or more of the monosaccharide units constituting the sugar chain may have one or more sulfate groups. In the present specification, the monosaccharide means a saccharide that is not hydrolyzed any more, and means a compound that is a constituent element when forming a polysaccharide. A monosaccharide can also be said to be the smallest constituent unit of a saccharide. In the present specification, the “monosaccharide unit” means a chemical structure corresponding to a monosaccharide. A “monosaccharide unit” can also be said to be a chemical structure derived from a monosaccharide.
本実施形態のムチンは、例えば、上述した製造方法によりクラゲから製造したものであってもよく、人工的に合成したものであってもよい。 The mucin of this embodiment may be manufactured from jellyfish by the manufacturing method mentioned above, for example, and may be artificially synthesized.
本実施形態のムチンは、配列番号1で表されるアミノ酸配列からなる繰り返し単位が3〜2000回繰り返したアミノ酸配列を有し、前記アミノ酸配列における1以上のアミノ酸残基に1以上の単糖単位からなる糖鎖が結合しており、前記糖鎖が硫酸基を有しているムチンであってもよい。 The mucin of this embodiment has an amino acid sequence in which the repeating unit consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is repeated 3 to 2000 times, and one or more monosaccharide units in one or more amino acid residues in the amino acid sequence It may be a mucin in which a sugar chain consisting of is bound and the sugar chain has a sulfate group.
ここで、ムチンにおける硫酸基は、6単糖から構成される糖鎖においては、単糖同士のエーテル結合又はO−グリコシド結合部位(1位)の結合にあずかっていない部位の水酸基にエステル結合している。 Here, in the sugar chain composed of 6 monosaccharides, the sulfate group in mucin is ester-bonded to a hydroxyl group at a site that is not part of the ether bond between the monosaccharides or the bond at the O-glycoside binding site (position 1). ing.
例えば、N−アセチルガラクトサミンにおいては、糖鎖のエーテル結合又はO−グリコシド結合を形成する1位を除いて、3位、4位、6位に結合する可能性があるが、このうち糖鎖の隣の糖とエーテル結合をしている部位は除かれる。 For example, in N-acetylgalactosamine, there is a possibility of binding to the 3rd, 4th and 6th positions except for the 1st position which forms an ether bond or O-glycoside bond of the sugar chain. The site having an ether bond with the adjacent sugar is excluded.
硫酸基が結合している糖鎖においては、硫酸が強い酸性を示すことから、pH=1程度の強酸性の時以外は、硫酸基は常に解離し負電荷を帯びている。そのため、ムチンの高分子が常時電荷を帯びた状態になる。これは、同様に糖鎖に結合している2−アミノエチルホスホン酸(中程度の酸)のホスホン酸基とアミノ基(弱塩基)、またペプチド主鎖に存在しているグルタミン酸のカルボキシル基(弱酸)とが中性付近でわずかに解離するのと大きく異なっている。 In the sugar chain to which the sulfate group is bonded, since the sulfuric acid exhibits strong acidity, the sulfate group is always dissociated and has a negative charge except when the acidity is about pH = 1. For this reason, the mucin polymer is always charged. This is similar to the phosphonic acid group and amino group (weak base) of 2-aminoethylphosphonic acid (medium acid) bonded to the sugar chain, and the carboxyl group of glutamic acid present in the peptide backbone ( Is slightly different from the slight dissociation in the vicinity of neutrality.
これらの電荷が糖鎖に存在することで、ムチンは巨大な高分子であるにもかかわらず水に溶けやすい。また極性基がペプチド鎖に隣接するため、著しい両親媒性(界面活性能)を示す。したがって、硫酸基の多いムチンは界面活性剤や潤滑剤として働く。 Due to the presence of these charges in the sugar chain, mucin is easily dissolved in water despite being a huge polymer. In addition, since the polar group is adjacent to the peptide chain, it exhibits remarkable amphiphilicity (surfactant activity). Therefore, mucins with many sulfate groups act as surfactants and lubricants.
また、解離状態にある硫酸基は、2価以上の金属陽イオンと効果的に結合し、結合定数の大きな陽イオン(たとえばCa2+)を効果的に吸着捕集することができる。また、これらの吸着捕集は平衡過程であるため、結合定数の大きな他の陽イオン、濃度の大きな他の陽イオン、酸、キレート剤等と接触させることで、イオン交換反応を起こすことができる。このイオン交換反応は、他のホスホン酸基、アミノ基、カルボキシル基においても部分的に起きるが、解離度の大きな硫酸基を持つムチンにおいて著しく強力に働く。 In addition, the sulfate group in a dissociated state effectively binds to a divalent or higher valent metal cation and can effectively adsorb and collect a cation having a large binding constant (for example, Ca 2+ ). In addition, since these adsorption and collection are in an equilibrium process, an ion exchange reaction can be caused by contacting with other cations having a large binding constant, other cations having a high concentration, acids, chelating agents, etc. . This ion exchange reaction partially occurs also in other phosphonic acid groups, amino groups, and carboxyl groups, but works remarkably strongly in mucins having sulfate groups with a high degree of dissociation.
すなわち、糖鎖が硫酸基を有するムチンは、他の、硫酸基を有する強酸性イオン交換樹脂(例えば、ベンゼンスルホン酸を側鎖に有するものが挙げられる。)と同様に、イオン交換樹脂として用いることができる。ただし、ペプチド鎖や糖鎖が加水分解されないpH範囲でしか使用することはできない。 That is, mucins whose sugar chains have sulfate groups are used as ion exchange resins in the same manner as other strongly acidic ion exchange resins having sulfate groups (for example, those having benzenesulfonic acid in the side chain). be able to. However, it can be used only in a pH range where peptide chains and sugar chains are not hydrolyzed.
ムチンに含まれる硫酸基は、日本薬局方(第十四日本薬局方22)、JIS(JIS K6233、JIS K7229)等に記載されている酸素フラスコ燃焼法を応用した方法により定量することができる。 The sulfate group contained in mucin can be quantified by a method applying the oxygen flask combustion method described in Japanese Pharmacopoeia (14th Japanese Pharmacopoeia 22), JIS (JIS K6233, JIS K7229) and the like.
より具体的には、酸素フラスコを用いて固体ムチンを燃焼させ、生成したガスを過酸化水素水に吸収させる。続いて、ガスを吸収した過酸化水素水をイオンクロマトグラフィーで解析し、硫酸イオンとして定量するとよい。 More specifically, solid mucin is burned using an oxygen flask, and the generated gas is absorbed into hydrogen peroxide water. Subsequently, the hydrogen peroxide solution that has absorbed the gas may be analyzed by ion chromatography and quantified as sulfate ions.
この場合、炭素由来の炭酸水素イオン(HCO3 −)、窒素由来の硝酸イオン(NO3 −)は、実験誤差内でほぼ一定であるので、それらに対する相対的な硫酸イオン(SO4 2−)量が硫黄含有量に相当する。ムチンには、メチオニン、シスチン、システイン等の含硫アミノ酸がほとんど含まれていないため、硫酸として検出される硫黄は全て糖鎖の硫酸エステルであると考えられる。 In this case, carbon-derived hydrogen carbonate ions (HCO 3 − ) and nitrogen-derived nitrate ions (NO 3 − ) are almost constant within the experimental error, and therefore relative sulfate ions (SO 4 2− ) to them. The amount corresponds to the sulfur content. Since mucin contains almost no sulfur-containing amino acids such as methionine, cystine, cysteine, etc., all sulfur detected as sulfuric acid is considered to be a sulfate ester of a sugar chain.
クラゲから抽出したムチンは、ペプチド鎖のほとんどが、配列番号1に示す8つのアミノ酸の繰り返し構造からなり、糖鎖のほとんどがGalNAcの単糖である場合が多い。そこで、単糖2つを含んだ繰り返し構造1つあたりの分子量はおよそ1200となる。この値を利用して、硫黄含有量の重量パーセントから糖鎖1個あたりの硫酸基の量を見積もることができる。 Most of mucin extracted from jellyfish has a repeating structure of 8 amino acids shown in SEQ ID NO: 1, and most of the sugar chains are GalNAc monosaccharides in many cases. Therefore, the molecular weight per repeating structure including two monosaccharides is approximately 1200. Using this value, the amount of sulfate groups per sugar chain can be estimated from the weight percent of the sulfur content.
[界面活性剤]
1実施形態において、本発明は、上述したムチンを有効成分として含有する界面活性剤を提供する。
[Surfactant]
In one embodiment, the present invention provides a surfactant containing the above-described mucin as an active ingredient.
発明者は、糖鎖が硫酸基を有するムチンが、界面活性剤としての性質を有することを見出した。本実施形態の界面活性剤は、生体由来界面活性剤であるため、例えば目の粘膜の保護等に安全に利用することができる。また、生分解性を有するため環境に放出されても環境負荷は著しく小さい。 The inventor has found that mucins whose sugar chains have sulfate groups have properties as surfactants. Since the surfactant of the present embodiment is a biologically derived surfactant, it can be safely used, for example, for protecting the mucous membrane of the eye. In addition, since it has biodegradability, the environmental load is extremely small even if it is released to the environment.
例えば、硫酸糖が結合したムチンを、ドライアイの治療又は予防用目薬に添加したり、コンタクトレンズの保存液に添加する等の利用が考えられる。 For example, it may be used such as adding mucin with sulfated sugar to eye drops for treating or preventing dry eye, or adding it to a preservation solution for contact lenses.
本実施形態の界面活性剤は、例えばクラゲ等から抽出した抽出物であってもよいが、医薬品等としての安全性を確保する観点からは、化学合成されたものであることがより好ましい。 The surfactant of this embodiment may be, for example, an extract extracted from jellyfish or the like, but is more preferably chemically synthesized from the viewpoint of ensuring safety as a pharmaceutical or the like.
[イオン交換樹脂]
1実施形態において、本発明は、上述したムチンを有効成分として含有するイオン交換樹脂を提供する。
[Ion exchange resin]
In one embodiment, the present invention provides an ion exchange resin containing the above-described mucin as an active ingredient.
上述したように、糖鎖が硫酸基を有するムチンは、カチオン交換樹脂としての機能を有している。これは、上述した、沈殿したムチンから金属イオンを剥離する工程において、ムチン上に存在するカルシウムイオンが、他のイオンに置き換わることからも明らかである。 As described above, the mucin whose sugar chain has a sulfate group has a function as a cation exchange resin. This is also clear from the fact that the calcium ions present on the mucin are replaced with other ions in the above-described step of peeling the metal ions from the precipitated mucin.
カルシウム吸着量の多いムチンは水に不溶であるため、樹脂として水中に配置することができる。この樹脂には、カルシウムイオンが吸着していない硫酸基が残っており、それらが陽イオン吸着活性を持つため、ムチン分子全体がイオン交換樹脂としての機能を有する。但し、一般的なイオン交換樹脂と異なり、中性付近以外では糖鎖やペプチド鎖が加水分解されやすいため長期間用いることができない場合がある。一方、ムチンを有効成分として含有するイオン交換樹脂は、環境中では生分解性を有するため、自然の環境中においても分解しやすく、環境負荷を与えないという利点を有する。 Mucin with a large amount of calcium adsorption is insoluble in water and can therefore be placed in water as a resin. In this resin, sulfate groups to which calcium ions are not adsorbed remain, and since they have cation adsorption activity, the entire mucin molecule has a function as an ion exchange resin. However, unlike general ion exchange resins, sugar chains and peptide chains are likely to be hydrolyzed except in the vicinity of neutrality and may not be used for a long period of time. On the other hand, an ion exchange resin containing mucin as an active ingredient is biodegradable in the environment, and therefore has an advantage that it is easily decomposed in a natural environment and does not give an environmental load.
[潤滑剤]
1実施形態において、本発明は、上述したムチンを有効成分として含有する潤滑剤を提供する。
[lubricant]
In one embodiment, the present invention provides a lubricant containing the aforementioned mucin as an active ingredient.
発明者は、糖鎖が硫酸基を有するムチンが、潤滑剤としての性質を有することを見出した。本実施形態の潤滑剤は、生体由来潤滑剤であるため、例えば関節における軟骨の保護等に安全に利用することができる。具体的には、糖鎖が硫酸基を有するムチンを、変形性膝関節症の治療のために関節に注射する等の利用が考えられる。 The inventor has found that mucins whose sugar chains have sulfate groups have properties as lubricants. Since the lubricant of the present embodiment is a living body-derived lubricant, it can be safely used for protecting cartilage in a joint, for example. Specifically, use such as injecting mucin whose sugar chain has a sulfate group into a joint for the treatment of knee osteoarthritis is conceivable.
ムチンの潤滑剤としての機能の発現は、ムチンの界面活性剤としての機能(界面活性能)に密接に関係する。すなわち、界面活性能は、固体界面等におけるムチン水溶液の濡れ性を増大させ、接触面の間に欠陥なく液膜を覆わせることができる能力でも有り、硫酸基の含有量が高いムチンでは更にその機能が増大する。 The expression of the function of mucin as a lubricant is closely related to the function (surfactant ability) of mucin as a surfactant. That is, the surface active ability is also the ability to increase the wettability of the mucin aqueous solution at the solid interface, etc., and to cover the liquid film without defects between the contact surfaces, and in the case of mucin with a high sulfate group content, Function increases.
本実施形態の潤滑剤は、例えばクラゲ等から抽出した抽出物であってもよいが、医薬品等としての安全性を確保する観点からは、化学合成されたものであることがより好ましい。 The lubricant of this embodiment may be an extract extracted from, for example, jellyfish, but is more preferably chemically synthesized from the viewpoint of ensuring safety as a pharmaceutical product.
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Next, although an Example is shown and this invention is demonstrated further in detail, this invention is not limited to a following example.
[実験例1]
(クラゲの自己分解の検討1)
採取したクラゲを、そのまま−20℃、−50℃又は−80℃で凍結保存した。凍結から図1の横軸に示す日数後に解凍し、網目2mmのザルに入れて固体成分及び液体成分に分離し、固体成分の割合(質量%)を測定した。
[Experimental Example 1]
(Examination of jellyfish autolysis 1)
The collected jellyfish was stored frozen at −20 ° C., −50 ° C. or −80 ° C. as it was. It thawed | freezes after the days shown on the horizontal axis | shaft of FIG. 1 from freezing, was put into a 2 mm mesh monkey, isolate | separated into the solid component and the liquid component, and measured the ratio (mass%) of the solid component.
図1は、固体成分の割合(質量%)の変化を示すグラフである。その結果、−20℃で保存したクラゲは、約3ヶ月後にほぼ完全に自己分解し液化してしまうことが明らかとなった。一方、−50℃及び−80℃で保存したクラゲは、最初の約1週間で固体成分が約40質量%に減少するが、それ以降は自己分解がほぼ停止することが明らかになった。 FIG. 1 is a graph showing changes in the ratio (mass%) of the solid component. As a result, it was revealed that the jellyfish stored at −20 ° C. were almost completely decomposed and liquefied after about 3 months. On the other hand, jellyfish stored at −50 ° C. and −80 ° C. showed that the solid component decreased to about 40% by mass in the first about one week, but thereafter, self-decomposition almost stopped.
[実験例2]
(クラゲの自己分解の検討2)
採取したクラゲに終濃度0.01、0.1、1及び10mMのEDTAを添加し、室温及び4℃で保存した。EDTAの添加は、採取後のクラゲに終濃度の10倍の濃度のEDTA水溶液を添加し、混和することにより行った。保存開始から図2の横軸に示す日数後に、網目2mmのザルに入れて固体成分及び液体成分に分離し、固体成分の割合(質量%)を測定した。
[Experiment 2]
(Examination of self-decomposition of jellyfish 2)
To the collected jellyfish, final concentrations of 0.01, 0.1, 1 and 10 mM EDTA were added and stored at room temperature and 4 ° C. Addition of EDTA was performed by adding an EDTA aqueous solution having a
図2は、固体成分の割合(質量%)の変化を示すグラフである。その結果、室温保存では約3〜4日で固体成分が分解した。室温保存における固体成分の分解速度は、EDTA濃度が高い方が遅かった。一方、4℃では最大10日程度固体成分が残留した。4℃における固体成分の分解速度は、EDTA濃度が高い方が遅かった。 FIG. 2 is a graph showing a change in the ratio (mass%) of the solid component. As a result, the solid components decomposed in about 3 to 4 days when stored at room temperature. The decomposition rate of the solid component during storage at room temperature was slower when the EDTA concentration was higher. On the other hand, at 4 ° C., solid components remained for about 10 days at maximum. The decomposition rate of the solid component at 4 ° C. was slower when the EDTA concentration was higher.
本実験例の結果から、EDTAの終濃度10mMにおいて、最もクラゲの自己分解を抑制する効果が高いことが示された。 From the results of this experimental example, it was shown that the effect of suppressing the autolysis of jellyfish is highest at a final concentration of EDTA of 10 mM.
[実施例3]
(クラゲの自己分解の検討3)
採取したクラゲに終濃度0、0.01、0.1、1及び10mMのEDTAを添加し、−20℃で保存した。EDTAの添加は、採取後のクラゲに終濃度の10倍の濃度のEDTA水溶液を添加し、混和することにより行った。保存開始から図3の横軸に示す日数後に、網目2mmのザルに入れて固体成分及び液体成分に分離し、固体成分の割合(質量%)を測定した。
[Example 3]
(Examination of self-decomposition of jellyfish 3)
To the collected jellyfish, final concentrations of 0, 0.01, 0.1, 1 and 10 mM EDTA were added and stored at −20 ° C. Addition of EDTA was performed by adding an EDTA aqueous solution having a
図3は、固体成分の割合(質量%)の変化を示すグラフである。その結果、EDTAの終濃度が1mM及び10mMの試料において、保存開始から2〜3ヶ月後に、EDTA無添加の試料と比較して、固体成分の割合に有意な差が生じたことが明らかとなった。また、クラゲの分解速度は、EDTA濃度が高い方が遅かった。 FIG. 3 is a graph showing a change in the ratio (mass%) of the solid component. As a result, it was clarified that the samples with the final concentrations of EDTA of 1 mM and 10 mM had a significant difference in the ratio of solid components compared to the sample without EDTA after 2-3 months from the start of storage. It was. Further, the degradation rate of jellyfish was slower when the EDTA concentration was higher.
本実験例においても、EDTAの終濃度10mMにおいて、最もクラゲの自己分解を抑制する効果が高いことが示された。 Also in this experimental example, it was shown that the effect of suppressing the autolysis of jellyfish is highest at a final concentration of EDTA of 10 mM.
[実施例4]
(クラゲの自己分解の検討4)
採取したクラゲから、そのまま何も添加しなかった群(対照)、殺菌剤のみ添加した群、終濃度10mMのEDTAのみ添加した群、終濃度1mMのEDTA及び殺菌剤を添加した群、終濃度10mMのEDTA及び殺菌剤を添加した群を調製した。殺菌剤としては、終濃度0.1%の次亜塩素酸ナトリウムを使用した。
[Example 4]
(Examination of self-decomposition of jellyfish 4)
From the collected jellyfish, a group to which nothing was added (control), a group to which only a bactericidal agent was added, a group to which only EDTA having a final concentration of 10 mM was added, a group to which EDTA having a final concentration of 1 mM and a bactericide was added, a final concentration of 10 mM Of EDTA and fungicides were prepared. As a disinfectant, sodium hypochlorite having a final concentration of 0.1% was used.
その後、各群の試料を室温で保存した。保存開始から図4の横軸に示す日数後に、網目2mmのザルに入れて固体成分及び液体成分に分離し、固体成分の割合(質量%)を測定した。 Thereafter, each group of samples was stored at room temperature. 4 days after the start of storage, it was put into a 2 mm mesh monkey and separated into a solid component and a liquid component, and the ratio (mass%) of the solid component was measured.
図4は、固体成分の割合(質量%)の変化を示すグラフである。その結果、終濃度10mMのEDTA及び殺菌剤を添加した群において、最もクラゲの自己分解を抑制する効果が高いことが示された。 FIG. 4 is a graph showing changes in the ratio (mass%) of the solid component. As a result, it was shown that in the group to which EDTA having a final concentration of 10 mM and a bactericidal agent were added, the effect of suppressing the autolysis of jellyfish was the highest.
[実施例5]
(クラゲの自己分解の検討5)
採取したクラゲから、そのまま何も添加しなかった群(対照)、殺菌剤のみ添加した群、終濃度10mMのEDTAのみ添加した群、終濃度1mMのEDTA及び殺菌剤を添加した群、終濃度10mMのEDTA及び殺菌剤を添加した群を調製した。殺菌剤としては、終濃度0.1%の次亜塩素酸ナトリウムを使用した。
[Example 5]
(Examination of self-decomposition of jellyfish 5)
From the collected jellyfish, a group to which nothing was added (control), a group to which only a bactericidal agent was added, a group to which only EDTA having a final concentration of 10 mM was added, a group to which EDTA having a final concentration of 1 mM and a bactericide was added, a final concentration of 10 mM Of EDTA and fungicides were prepared. As a disinfectant, sodium hypochlorite having a final concentration of 0.1% was used.
その後、各群の試料を4℃で保存した。保存開始から図5の横軸に示す日数後に、網目2mmのザルに入れて固体成分及び液体成分に分離し、固体成分の割合(質量%)を測定した。 Thereafter, each group of samples was stored at 4 ° C. 5 days after the start of storage, the sample was placed in a 2 mm mesh monkey and separated into a solid component and a liquid component, and the ratio (mass%) of the solid component was measured.
図5は、固体成分の割合(質量%)の変化を示すグラフである。その結果、4℃で保存した場合には、終濃度10mMのEDTA及び殺菌剤を添加した群と、終濃度10mMのEDTAのみ添加した群において、クラゲの自己分解を抑制する効果が同等であることが示された。 FIG. 5 is a graph showing a change in the ratio (mass%) of the solid component. As a result, when stored at 4 ° C., the effect of suppressing jellyfish autolysis is the same in the group to which EDTA and a bactericide at a final concentration of 10 mM are added and in the group to which only EDTA at a final concentration of 10 mM is added. It has been shown.
[実施例6]
(ムチンの製造)
同時期に採取したミズクラゲを等量の2つのグループA及びBに分けた。グループAには、終濃度10mMのEDTA及び終濃度0.1%の次亜塩素酸ナトリウムを添加した。グループBには何も添加しなかった。なお、グループAでは、pHの調整は行わなかった。続いて、各グループのクラゲをそれぞれジッパー付きビニール袋に入れ、空気を追い出してジッパーを閉じ、数回揉んだ後−20℃で凍結保存した。
[Example 6]
(Manufacture of mucin)
Moon jellyfish collected at the same time were divided into two equal groups A and B. Group A was supplemented with EDTA with a final concentration of 10 mM and sodium hypochlorite with a final concentration of 0.1%. Nothing was added to Group B. In group A, the pH was not adjusted. Subsequently, each group of jellyfish was placed in a plastic bag with a zipper, air was expelled, the zipper was closed, and the mixture was kneaded several times and stored frozen at -20 ° C.
1ヶ月後に各グループのクラゲをそれぞれ解凍して破砕し、それぞれ10000×gで遠心分離した。下記表1において、ここで得られた沈殿を「はじめの残さ」として示す。 One month later, each group of jellyfish was thawed and crushed and centrifuged at 10,000 × g. In Table 1 below, the precipitate obtained here is shown as “initial residue”.
この過程で、グループAの試料においてのみ浮遊成分が生じた。下記表1において、この浮遊成分を「浮遊成分」として示す。そこで、この浮遊成分を回収しアミノ酸分析した。その結果、この浮遊成分の主成分はコラーゲンであると考えられた。 During this process, floating components were generated only in the group A samples. In Table 1 below, this floating component is shown as “floating component”. Therefore, this floating component was recovered and analyzed for amino acids. As a result, the main component of this floating component was considered to be collagen.
続いて、グループA及びBの試料の遠心分離後の上清をそれぞれ回収し、4℃で上清の3倍容量のアルコールを徐々に添加して沈殿を生成させた。続いて、グループA及びBの試料に生じた沈殿を10000×gで遠心分離してそれぞれ回収した。 Subsequently, the supernatants after centrifugation of the samples of Group A and B were collected, and at 4 ° C., 3 times the volume of alcohol was gradually added to form a precipitate. Subsequently, the precipitates generated in the samples of Groups A and B were collected by centrifugation at 10,000 × g.
続いて、上記の沈殿に、沈殿の2倍質量の純水を添加して2時間撹拌した後、再び10000×gで遠心分離し、上清をムチン含有液としてそれぞれ回収した。また、遠心分離後に残った沈殿をアミノ酸分析した。下記表1において、この沈殿を「エタ沈残留物」として示す。その結果、この沈殿の主成分はコラーゲンであると考えられた。また、沈殿にはムチンも一部混入していると考えられた。 Subsequently, after adding pure water having twice the mass of the precipitate to the above precipitate and stirring for 2 hours, the mixture was centrifuged again at 10,000 × g, and the supernatant was recovered as a mucin-containing solution. In addition, the precipitate remaining after centrifugation was subjected to amino acid analysis. In Table 1 below, this precipitate is shown as “Etaprecipitate residue”. As a result, it was considered that the main component of the precipitate was collagen. In addition, it was considered that the mucin was partially mixed in the precipitate.
続いて、遠心分離後の上清として回収したムチンを脱塩、凍結乾燥した。下記表1において、得られたムチンを「精製ムチン」として示す。 Subsequently, the mucin collected as the supernatant after centrifugation was desalted and lyophilized. In the following Table 1, the obtained mucin is shown as “purified mucin”.
下記表1に、上記の精製過程における試料の質量及び収率を示す。収率は、材料に用いたクラゲの湿質量に対する百分率で示す。その結果、グループAの方が、グループBよりもムチンの収率が高かった。また、グループA及びグループBの試料から精製したムチンをイオン交換クロマトグラフィーにより解析した結果、グループAの試料から精製したムチンは、グループBの試料から精製したムチンと比較して、コラーゲンの混入量が有意に少なく、より純度が高いことが明らかとなった。 Table 1 below shows the mass and yield of the sample in the above purification process. The yield is expressed as a percentage with respect to the wet mass of the jellyfish used for the material. As a result, the yield of mucin was higher in group A than in group B. In addition, as a result of analyzing the mucin purified from the group A and group B samples by ion exchange chromatography, the mucin purified from the group A sample was mixed with the amount of collagen mixed with the mucin purified from the group B sample. Was found to be significantly less and more pure.
[実験例7]
(ムチンの糖鎖構造の解析)
実験例6のグループAと同様にして調製したムチンの糖鎖構造を詳細に解析した。具体的には、ムチンからヒドラジン分解及びβ脱離反応により糖鎖を切り離し、HPLCを装着したエレクトロンスプレーイオン化高分解能質量分析器(ESI−MS)で分析した。
[Experimental Example 7]
(Analysis of sugar chain structure of mucin)
The sugar chain structure of mucin prepared in the same manner as in Group A of Experimental Example 6 was analyzed in detail. Specifically, sugar chains were separated from mucin by hydrazine decomposition and β elimination reaction, and analyzed by an electron spray ionization high resolution mass spectrometer (ESI-MS) equipped with HPLC.
その結果、HPLCのいくつかのクロマトピークにおいて、SO3 −−HexNAc(301.0468)、SO3 −Hex−HexNAc(462.0996)、SO3 −HexNAc−HexNAc(504.1261)、SO3 −Hex−HexNAc−HexNAc(666.1789)の高分解能質量に対応するMSピークが存在することが確認された。ここで、Hexは6単糖を意味する。これは、本解析方法では、構成単糖が6単糖である限り、それが如何なる糖であるかを識別することが困難であるためである。 As a result, in some chromatographic peak of HPLC, SO 3 - -HexNAc (301.0468 ), SO 3 - Hex-HexNAc (462.0996), SO 3 - HexNAc-HexNAc (504.1261), SO 3 - The presence of an MS peak corresponding to the high resolution mass of Hex-HexNAc-HexNAc (666.1789) was confirmed. Here, Hex means 6 monosaccharides. This is because in this analysis method, as long as the constituent monosaccharide is 6 monosaccharides, it is difficult to identify what kind of sugar it is.
また、本解析方法では、糖鎖の脱離時に多くの硫酸基が副反応として脱離している可能性があるため、硫酸基の定量はできない。そこで、アミノ酸分析、NMR、ラマン分光により、ムチン内にシスチン及びシステインが多量に存在しないことを確認して、燃焼フラスコで燃焼させた灰を過酸化水素水溶液に吸収し、この中に含まれる硫酸イオンをイオンクロマトグラフィーで定量して、含有量を求めた。 In addition, in this analysis method, since there is a possibility that many sulfate groups are eliminated as a side reaction at the time of sugar chain elimination, the sulfate groups cannot be quantified. Therefore, it was confirmed by amino acid analysis, NMR, and Raman spectroscopy that cystine and cysteine were not present in large amounts in the mucin, and the ash burned in the combustion flask was absorbed into the aqueous hydrogen peroxide solution. Ions were quantified by ion chromatography to determine the content.
その結果、試料によって異なるが、どの試料においても全質量の約3〜5質量%が硫酸イオンであることが明らかとなった。この量を用いて概算する。2つの糖鎖が単糖GalNAcであり、1繰り返しユニットの分子量を1200と仮定すると、3%は36にあたり、硫黄原子約1個となる。この結果は、糖鎖を構成する糖鎖の約30〜50モル%が、1つは硫酸基を有することを示している。 As a result, it was clarified that about 3 to 5% by mass of the total mass was sulfate ion in any sample, although it varied depending on the sample. Estimate using this amount. Assuming that the two sugar chains are the monosaccharide GalNAc and the molecular weight of one repeating unit is 1200, 3% is 36, which is about one sulfur atom. This result indicates that about 30 to 50 mol% of the sugar chains constituting the sugar chain have one sulfate group.
[実験例8]
(ムチン水溶液の表面張力の測定1)
ムチンの界面活性剤としての性質を解析した。具体的には、ムチン水溶液の界面活性能(両親媒性)を、その表面張力を測定することにより検討した。ムチンとしては、実験例6のグループAと同様にして調製したムチンを使用した。
[Experimental Example 8]
(Measurement of surface tension of mucin aqueous solution 1)
The properties of mucin as a surfactant were analyzed. Specifically, the surface activity (amphiphilicity) of the mucin aqueous solution was examined by measuring its surface tension. As the mucin, a mucin prepared in the same manner as in Group A of Experimental Example 6 was used.
ムチン水溶液を接触角計(型式「DMs−401」、協和界面化学社製)の垂直に立てたシリンジに充填し、容量8μLの液滴をテフロン(登録商標)コート針から懸垂させ、その形状から表面張力を求めた。 A mucin aqueous solution is filled into a vertically standing syringe of a contact angle meter (model “DMs-401”, manufactured by Kyowa Interface Chemical Co., Ltd.), and a droplet of 8 μL in volume is suspended from a Teflon (registered trademark) coated needle. The surface tension was determined.
図6は、測定結果を示すグラフである。その結果、ムチンの濃度が増加するにつれて、表面張力が約71mN/mから次第に低下し、ムチン濃度10mg/mLでは、表面張力が約58mN/mにまで低下した。 FIG. 6 is a graph showing the measurement results. As a result, as the mucin concentration increased, the surface tension gradually decreased from about 71 mN / m, and at a mucin concentration of 10 mg / mL, the surface tension decreased to about 58 mN / m.
ムチンのような高分子化合物は、濃度増加に伴い粘度が増大するため、通常は、濃度が増加しても表面張力が変化しないか、わずかに増大するはずである。これに対し、濃度増加に伴って表面張力が低下したという結果は、ムチン水溶液に界面活性能があることを示す。図6に示すように、ムチンで見られた上記の結果は、ムチンと同等の条件で表面張力を測定した、ポリアニオンであるヒアルロン酸と大きく異なっていた。 Since a high molecular compound such as mucin increases in viscosity with increasing concentration, the surface tension should normally not change or increase slightly with increasing concentration. On the other hand, the result that the surface tension decreased with increasing concentration indicates that the aqueous mucin solution has a surface activity. As shown in FIG. 6, the above results seen with mucin were significantly different from hyaluronic acid, a polyanion, whose surface tension was measured under the same conditions as mucin.
[実験例9]
(クラゲ由来ムチンの沈殿の調製)
湿重量2kgのクラゲをミキサーで破砕して破砕液を調製した。続いて破砕液を遠心分離して上清を回収し、ガラス製の容器に入れた。続いて、回収した上清を激しく撹拌しながら、4℃で2Lのエタノールを30分間かけて添加した。その結果、高分子コラーゲンの沈殿が形成された。約半日静置した後、遠心分離して高分子コラーゲンの沈殿を除去し、上清を回収した。回収した上清に、塩化カルシウム粉末(CaCl2・2H2O)を10g添加し、撹拌して溶解させた。その結果、ムチンの沈殿が形成され、数分で溶液が濁り始めた。30分後、遠心分離を行って、カルシウム化したムチンの沈殿を回収した。沈殿の量は700mgであった。
[Experimental Example 9]
(Preparation of jellyfish-derived mucin precipitate)
A jellyfish having a wet weight of 2 kg was crushed with a mixer to prepare a crushed liquid. Subsequently, the crushed liquid was centrifuged and the supernatant was collected and placed in a glass container. Subsequently, 2 L of ethanol was added at 4 ° C. over 30 minutes while vigorously stirring the collected supernatant. As a result, a precipitate of high molecular collagen was formed. After allowing to stand for about half a day, the mixture was centrifuged to remove the polymer collagen precipitate, and the supernatant was collected. To the collected supernatant, 10 g of calcium chloride powder (CaCl 2 · 2H 2 O) was added and dissolved by stirring. As a result, a mucin precipitate was formed and the solution began to become cloudy within a few minutes. After 30 minutes, centrifugation was performed to recover the calcium-calcified mucin precipitate. The amount of precipitation was 700 mg.
[実験例10]
(ムチンの硫酸基の解析)
実験例6のグループAと同様にして調製したムチン、及び、ミズクラゲに終濃度10mMのEDTA及び終濃度0.1%の次亜塩素酸ナトリウムを添加し、その直後にpHを7に調整した点以外は実験例6のグループAと同様にして調製したムチンを用意した。
[Experimental Example 10]
(Analysis of the sulfate group of mucin)
The final concentration of 10 mM EDTA and the final concentration of 0.1% sodium hypochlorite were added to mucin and moon jellyfish prepared in the same manner as in Group A of Experimental Example 6, and the pH was adjusted to 7 immediately after that. A mucin prepared in the same manner as in Group A of Experimental Example 6 was prepared.
なお、実験例6のグループAでは、終濃度10mMのEDTA及び終濃度0.1%の次亜塩素酸ナトリウムを添加したミズクラゲのpHは約4であった。 In group A of Experimental Example 6, the pH of the moon jellyfish to which EDTA having a final concentration of 10 mM and sodium hypochlorite having a final concentration of 0.1% were added was about 4.
以下、実験例6のグループAと同様にして調製したムチンを「pH4で抽出したムチン」という場合がある。また、pHを7に調整して調製したムチンを「pH7で抽出したムチン」という場合がある。 Hereinafter, the mucin prepared in the same manner as in Group A of Experimental Example 6 may be referred to as “mucin extracted at pH 4”. In addition, mucin prepared by adjusting pH to 7 may be referred to as “mucin extracted at pH 7”.
続いて、イオンクロマトグラフィーにより各ムチンを解析した。イオンクロマトグラフィーでは、TSKgel Anion−PWカラム(東ソー製)及びTSKgel IC−ASガードカラム(東ソー製)を用いた。また、L−3730電導度検出器(日立製)、L−5025カラムオーブン(日立製)、CCPDポンプ(東ソー製)を用いた。また、移動相には、アニオン標準液(TSKgel eluent IC−Anion−A、東ソー製)を用いた。 Subsequently, each mucin was analyzed by ion chromatography. In the ion chromatography, a TSKgel Anion-PW column (manufactured by Tosoh) and a TSKgel IC-AS guard column (manufactured by Tosoh) were used. Further, an L-3730 conductivity detector (manufactured by Hitachi), an L-5025 column oven (manufactured by Hitachi), and a CCPD pump (manufactured by Tosoh) were used. An anion standard solution (TSKgel eluting IC-Anion-A, manufactured by Tosoh Corporation) was used as the mobile phase.
図7(a)はpH4で抽出したムチンのイオンクロマトグラムである。また、図7(b)はpH7で抽出したムチンのイオンクロマトグラムである。図7(a)及び(b)において、炭素由来の炭酸水素イオン(HCO3 −)、窒素由来の硝酸イオン(NO3 −)は、実験誤差内でほぼ一定であるので、それらに対する相対的な硫酸イオン(SO4 2−)量がムチンの硫黄含有量に相当する。 FIG. 7 (a) is an ion chromatogram of mucin extracted at pH 4. FIG. 7B is an ion chromatogram of mucin extracted at pH 7. 7 (a) and 7 (b), carbon-derived hydrogen carbonate ions (HCO 3 − ) and nitrogen-derived nitrate ions (NO 3 − ) are almost constant within the experimental error, and therefore relative to them. The amount of sulfate ion (SO 4 2− ) corresponds to the sulfur content of mucin.
ここで、クラゲ由来のムチンには含硫アミノ酸がほとんど含まれていないため、検出された硫黄は、ムチンの硫酸基に由来するとみなすことができる。 Here, since the mucin derived from jellyfish contains almost no sulfur-containing amino acid, it can be considered that the detected sulfur is derived from the sulfate group of mucin.
その結果、pH7で抽出したムチンは、pH4で抽出したムチンよりも硫酸基の含有量が高いことが明らかとなった。 As a result, it was revealed that mucin extracted at pH 7 has a higher sulfate group content than mucin extracted at pH 4.
[実験例11]
(ムチン水溶液の表面張力の測定2)
実験例6のグループAと同様にして調製したムチン(pH4で抽出したムチン)、及び、ミズクラゲに終濃度10mMのEDTA及び終濃度0.1%の次亜塩素酸ナトリウムを添加し、その直後にpHを7に調整した点以外は実験例6のグループAと同様にして調製したムチン(pH7で抽出したムチン)を用意した。
[Experimental Example 11]
(Measurement of surface tension of mucin aqueous solution 2)
A mucin (mucin extracted at pH 4) prepared in the same manner as in Group A of Experimental Example 6 and jellyfish with a final concentration of 10 mM EDTA and a final concentration of 0.1% sodium hypochlorite were added immediately thereafter. A mucin (mucin extracted at pH 7) prepared in the same manner as in Group A of Experimental Example 6 except that the pH was adjusted to 7 was prepared.
続いて、各ムチンを用いて様々な濃度の水溶液を作製し、それぞれ接触角計(型式「DMs−401」、協和界面化学社製)の垂直に立てたシリンジに充填し、容量8μLの液滴をテフロン(登録商標)コート針から懸垂させ、その形状から表面張力を求めた。 Subsequently, aqueous solutions of various concentrations were prepared using each mucin, filled in vertically standing syringes of contact angle meters (model “DMs-401”, manufactured by Kyowa Interface Chemical Co., Ltd.), and droplets with a capacity of 8 μL. Was suspended from a Teflon (registered trademark) coated needle, and the surface tension was determined from its shape.
図8は、測定結果を示すグラフである。その結果、ムチンの濃度が増加するにつれて、表面張力が約71mN/mから次第に低下した。ムチン濃度10mg/mLにおいて、pH4で抽出したムチンの表面張力は約59(mN/m)にまで低下した。また、ムチン濃度10mg/mLにおいて、pH7で抽出したムチンの表面張力は約54(mN/m)にまで低下した。 FIG. 8 is a graph showing the measurement results. As a result, as the mucin concentration increased, the surface tension gradually decreased from about 71 mN / m. At a mucin concentration of 10 mg / mL, the surface tension of mucin extracted at pH 4 decreased to about 59 (mN / m). In addition, at a mucin concentration of 10 mg / mL, the surface tension of mucin extracted at pH 7 decreased to about 54 (mN / m).
上述したように、ムチンのような高分子化合物は、濃度増加に伴い粘度が増大するため、通常は、濃度が増加しても表面張力が変化しないか、わずかに増大するはずである。これに対し、濃度増加に伴って表面張力が低下したという結果は、ムチン水溶液に界面活性能があることを示す。更に、pH7で抽出したムチンは、pH4で抽出したムチンよりも界面活性剤としての性能が高いことが明らかとなった。 As described above, since the viscosity of a polymer compound such as mucin increases with increasing concentration, usually the surface tension should not change or increase slightly with increasing concentration. On the other hand, the result that the surface tension decreased with increasing concentration indicates that the aqueous mucin solution has a surface activity. Furthermore, it was revealed that mucin extracted at pH 7 has higher performance as a surfactant than mucin extracted at pH 4.
[実施例12]
(ムチン水溶液の潤滑性の検討)
表面性測定器(型式「TRIBOGEAR TYPE:38」、新東科学株式会社)を用いて、1mg/mL及び10mg/mLのムチン水溶液の存在下で、100gの荷重をかけた直径10mmのステンレス球とステンレス平面板の間の動摩擦係数を測定した。また、対照として水を用いて同様の測定を行った。
[Example 12]
(Examination of lubricity of mucin aqueous solution)
Using a surface property measuring instrument (model “TRIBOGEAR TYPE: 38”, Shinto Kagaku Co., Ltd.), in the presence of 1 mg / mL and 10 mg / mL mucin aqueous solution, The dynamic friction coefficient between the stainless steel flat plates was measured. Moreover, the same measurement was performed using water as a control.
図9は、動摩擦係数の測定結果を示すグラフである。図9中、矢印の時点(100ストローク目)に、各濃度のムチン水溶液又は水を、ステンレス球とステンレス平面板との接触面に添加した。 FIG. 9 is a graph showing the measurement result of the dynamic friction coefficient. In FIG. 9, the mucin aqueous solution or water of each concentration was added to the contact surface between the stainless steel sphere and the stainless steel flat plate at the time of the arrow (100th stroke).
その結果、ムチン水溶液の添加後に、動摩擦係数が低下したことが明らかとなった。動摩擦係数の低下は、水を添加した場合よりもムチン水溶液を添加した場合の方が大きかった。また、ムチン濃度が高い方がより動摩擦係数の低下が大きいことが明らかとなった。 As a result, it was revealed that the coefficient of dynamic friction decreased after the addition of the mucin aqueous solution. The decrease in the coefficient of dynamic friction was greater when the mucin aqueous solution was added than when water was added. Further, it was revealed that the higher the mucin concentration, the greater the decrease in the dynamic friction coefficient.
本発明により、クラゲから純度の高いムチンを製造する方法を提供することができる。 According to the present invention, a method for producing highly pure mucin from jellyfish can be provided.
Claims (8)
前記クラゲが、採取直後にコラーゲン分解酵素阻害剤を接触させたクラゲである、ムチンの製造方法。 A method for producing a mucin comprising: a step of separating a crushed jellyfish into a liquid component and a solid component; and a step of extracting mucin from the liquid component,
A method for producing a mucin, wherein the jellyfish is a jellyfish that has been contacted with a collagenase inhibitor immediately after collection.
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