JP2017116517A - 電気化学測定方法、電気化学測定装置及びトランスデューサ - Google Patents

Abstract

【課題】溶液中の生体サンプルで生成または消費される化学物質を電気化学的に測定する電気化学測定において、測定感度の向上を図る方法を提供する。
【解決手段】化学物質と電子の授受を行なって酸化還元反応をさせる作用極の電極面の寸法と、生体サンプルの寸法とを与件に含み、生体サンプルにおいて化学物質が生成または消費される化学反応の速度と、溶液中の化学物質の濃度分布の変化と、電極面における化学物質との電子の授受の速度とに基いて作用極に流れる電流を計算するシミュレーションを、生体サンプルと電極面との電極面に対する垂直方向距離を変数として行って、電流が最大値となる点を含み電流が最大値の９０％以上の大きさとなる垂直方向距離の範囲を求め、溶液中において生体サンプルを、電極面から電極面に対する垂直方向に前記範囲に属する距離だけ離間させて測定を実行する。
【選択図】なし

Description

この発明は、細胞や細胞塊、組織片その他の生体サンプル及び生体関連物質を含む非生体サンプル（以下、本願では一括して単に「生体サンプル」という。）で生成または消費される化学物質を電気化学的に測定する電気化学測定方法、電気化学測定装置及び電気化学測定に用いるトランスデューサに関する。

細胞で生成または消費される化学物質を定量的に評価する技術の構築は、基礎生化学の発展のみならず、がん検診等で用いられる細胞診断、再生医療や免疫細胞治療等に用いられる移植用細胞の品質評価、薬効評価や毒性評価における動物実験の代替として利用するなど、医療やライフサイエンス領域の発展に大きく貢献する。

しかしながら、細胞の生理活性は、温度、ｐＨ、培地組成、隣接する細胞、細胞外マトリクス等の細胞を取り巻く環境によって変化するばかりか、遺伝子導入、薬物曝露、応力付与等の外部刺激や細胞***、細胞死等の細胞イベントに応じて経時的にも変化する。

このため、実際に生体内で働く細胞の真の性質を評価するためには、サンプルである細胞を生きたまま（細胞生理活性を保ったまま）生体内と可能な限り近い環境に設置し、さらにその細胞で生成または消費される化学物質を外部刺激や細胞イベントに対してリアルタイムで測定することが重要となる。

サンプルである細胞を生体内に近い環境に設置する手法の一つとして、サンプルに単一細胞ではなく、複数の細胞と細胞外マトリクス（extracellular matrix：ＥＣＭ）成分の凝集体である細胞塊（スフェロイド）を選ぶことが広く行われている。

これは、細胞が示す種々の生理活性の中には接触する隣接細胞やＥＣＭとの相互作用を経るものが多いことから、それらの凝集体である細胞塊の方が生体内の環境をより忠実に再現すると考えられるためである。

このような細胞塊として、例えば膵臓より採取される膵島細胞、受精卵、細胞培養によって得られた肝細胞や神経細胞のスフェロイド、ＥＳ（embryonic stem）細胞の胚様体等を挙げることができる。

これら細胞塊の直径は、構成細胞の種類、生体内における採取部位、培養条件等によって異なるが、細胞活性の評価に用いられる場合は１００〜６００μｍ程度の直径のものが使用されることが多い。これは、直径１００μｍ以下の小さな細胞塊では、構成細胞数が少なすぎるために細胞塊特有の生理活性が現われにくく、また直径６００μｍ以上の大きな細胞塊では、細胞塊中心部の細胞にまで酸素が拡散されなくなり、細胞が壊死しやすくなってしまうからである。

細胞で生成または消費される化学物質をリアルタイムで測定する手法として、電気化学的手法が用いられる。この電気化学的手法では、サンプルと同一溶液内に設置され、サンプルの様々な電気化学的シグナルを検出するための電極（作用極）を必要とする。ここで、この作用極の電位制御あるいは電流制御の違いにより、様々な検出法が存在する。細胞等の代謝活性に関わる測定においては、その比較性の高さ、解析の簡易さから、クロノアンペロメトリー法やサイクリックボルタンメトリー法に代表される電位規制電解法（定電位電解法）が使用されてきた。この電位規制電解法では、作用極の電位を時間の関数とし
て制御し、この時、作用極に生じる電流値を検出する。

一般的な細胞塊で生成または消費される化学物質の電気化学的な測定においては、細胞塊の物質代謝に伴い、細胞塊内あるいは細胞塊表面にて酸化還元活性を有する化学物質が生成されるような反応系が組まれており、これが作用極上で酸化あるいは還元されて電流を生じるようになっている。

細胞の物質代謝に伴い、酸化還元活性を有する化学物質が生成するような反応系には、注目する代謝系により様々な系が設計され得るが、なかでも極微量な代謝物質を高感度に検出することを目的とした場合、酵素反応を利用した系が好んで用いられている。

例えば、マウスＥＳ細胞より作製される細胞塊である胚様体では、分化状態に応じて細胞表面に存在する酵素であるアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の量が増減する。

そこで、胚様体の分化状態を評価する目的で、しばしばＡＬＰ生成量の電気化学的評価が行われている（非特許文献１）。この評価系では、胚様体を基質であるｐ−アミノフェニルホスフェート（ＰＡＰＰ）が溶解する溶液中に置くことで、ＡＬＰ酵素活性によりＰＡＰＰの脱リン酸反応を進行させ、結果として酸化還元活性を有するｐ−アミノフェノール（ＰＡＰ）を生成させている。

溶液中におけるＰＡＰＰ濃度が十分に高ければ、たとえ細胞が生成するＡＬＰ量が極微量であったとしても、その酵素活性により酸化還元活性を有する化学物質であるＰＡＰの量を時間とともに積算することが可能であるため、結果としてＡＬＰ存在量を高感度に検出することが可能となる。

Ｍ．Ｓｅｎ，ｅｔ ａｌ．，"Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ" ２０１３年，４８巻，ｐ．１２−１８

ところで、細胞で生成または消費される酸化還元活性を有する化学物質は、外部からの特別な水力学的な作用を与えない限り、拡散作用により細胞を中心として溶液中に放射状に広がっていき、その一部が作用極まで到達して酸化もしくは還元を受ける。このため、この時生じる電流量は、化学物質の生成または消費量及び化学物質の作用極までの拡散距離に大きく影響を受けることになる。

しかしながら、基板上に作用極が形成されている場合、作用極にサンプルを近接させると、サンプルと基板との間隔が狭いことにより、溶液中に溶解されている基質のサンプルへの供給が阻害されるため、酵素反応によりサンプルより生成される化学物質の量は、サンプルが基板と遠く離れて溶液中に浮遊している場合と比較して低下してしまう。また、サンプルと作用極の間の空間の体積が微小であるため、生成された化学物質の多くはこの空間内に滞留することができずに遠方へと散逸してしまう。散逸した化学物質は作用極までの距離が長くなるため、結果として作用極まで到達する量が減少し、感度が低下してしまう（問題点１）。

さらに、サンプル表面の凹凸の影響や、サンプル形状が必ずしも球形でないことから、作用極とサンプルの間の垂直方向距離の制御精度には限界がある。この垂直方向距離は一般的には、測定をするたびに少なくとも数μｍ程度は変動し得るため、これによって化学
物質の拡散距離が一定ではなくなり、測定の比較性、再現性が低下してしまう（問題点２）。

非特許文献１では、基板上の作用極により化学物質の量を測定しており、上述したような問題点１，２を有するものとなっている。

一方、基板上の作用極ではなく、プローブ状の作用極（プローブ電極）を用いる場合もある。一般に、プローブ電極の先端はサンプルに比べ、非常に微細なため、プローブ電極さらにはその支持体による溶液中の溶質のサンプルへの供給阻害は、基板上の電極の場合と比べて小さい。このため、上述した問題点１は大きな問題とならない。また、一般にプローブ電極のサンプルに対する位置は、マニピュレータによってμｍオーダで精細に制御される。このため、上述した問題点２も問題とならない。

しかしながら、プローブ電極の位置制御には、マニピュレータ、プローブ先端位置を観測するための顕微鏡システム等、高価な設備が必要である。また、プローブ電極は、経験に乏しい使用者によりしばしば破損されることもある。

この発明の目的はこのような状況に鑑み、作用極としてプローブ電極を用いるのではなく、例えば基板上に形成されて溶液中に固定配置された作用極を用いる電気化学測定において、従来より感度、比較性及び再現性を向上させることができるようにした電気化学測定方法、電気化学測定装置及び電気化学測定に用いるトランスデューサを提供することにある。

請求項１の発明によれば、溶液中の生体サンプルで生成または消費される化学物質を電気化学的に測定する電気化学測定方法は、化学物質と電子の授受を行なって酸化還元反応をさせる作用極の電極面の寸法と、生体サンプルの寸法とを与件に含み、生体サンプルにおいて化学物質が生成または消費される化学反応の速度と、溶液中の化学物質の濃度分布の変化と、電極面における化学物質との電子の授受の速度とに基いて作用極に流れる電流を計算するシミュレーションを、生体サンプルと電極面との電極面に対する垂直方向距離を変数として行って、電流が最大値となる点を含み電流が最大値の９０％以上の大きさとなる垂直方向距離の範囲を求め、溶液中において生体サンプルを、電極面から電極面に対する垂直方向に前記範囲に属する距離だけ離間させて測定を実行する。

請求項２の発明によれば、溶液中の、１００μｍ以上６００μｍ以下の径寸法を有する生体サンプルで生成または消費される化学物質を、化学物質と電子の授受を行って酸化還元反応をさせる８０μｍ以下の径寸法ｄ_ｅｌを有する電極面を備えた作用極を用いて、電気化学的に測定する電気化学測定方法において、電極面に対する垂直方向距離ｈ_１が、

を満たす輪郭面をもち、輪郭面の電極面側の領域において生体サンプルの侵入を阻止し、溶液中の溶質の拡散を許容するスペーサを溶液中に設置し、生体サンプルを、スペーサの輪郭面沿いに位置させた状態で測定を実行する。

請求項３の発明によれば、溶液中の、１００μｍ以上６００μｍ以下の径寸法を有する生体サンプルで生成または消費される化学物質を、化学物質と電子の授受を行って酸化還元反応をさせる８０μｍ以下の径寸法ｄ_ｅｌを有する電極面を備えた作用極を用いて、電
気化学的に測定する電気化学測定方法において、電極面の中心からの電極面に対する平行方向距離ｍに依存して、電極面に対する垂直方向距離ｈ_２が、
ｈ_２＝√｛（１．０５ｄ_ｅｌ＋６．８９）ｍ｝−０．４８ｄ_ｅｌ−２．３８±５ ［μｍ］
を満たす、すり鉢型の形状を描く輪郭面をもち、輪郭面の電極面側の領域において生体サンプルの侵入を阻止し、溶液中の溶質の拡散を許容するスペーサを溶液中に設置し、生体サンプルを、スペーサの輪郭面沿いに電極面の中心の直上に位置させた状態で測定を実行する。

請求項４の発明によれば、溶液中の生体サンプルで生成または消費される化学物質を、化学物質と電子の授受を行って酸化還元反応をさせる電極面を備えた作用極を用いて電気化学的に測定する電気化学測定装置において、電極面は８０μｍ以下の径寸法ｄ_ｅｌを有し、溶液と生体サンプルとを収容する溶液槽には、電極面に対する垂直方向距離ｈ_１が、

を満たす輪郭面をもち、輪郭面の電極面側の領域において生体サンプルの侵入を阻止し、溶液中の溶質の拡散を許容するスペーサが設けられる。

請求項５の発明によれば、溶液中の生体サンプルで生成または消費される化学物質を、化学物質と電子の授受を行って酸化還元反応をさせる電極面を備えた作用極を用いて電気化学的に測定する電気化学測定装置において、電極面は８０μｍ以下の径寸法ｄ_ｅｌを有し、溶液と生体サンプルとを収容する溶液槽には、電極面の中心からの電極面に対する平行方向距離ｍに依存して、電極面に対する垂直方向距離ｈ_２が
ｈ_２＝√｛（１．０５ｄ_ｅｌ＋６．８９）ｍ｝−０．４８ｄ_ｅｌ−２．３８±５ ［μｍ］
を満たす、すり鉢型の形状を描く輪郭面をもち、輪郭面の電極面側の領域において生体サンプルの侵入を阻止し、溶液中の溶質の拡散を許容するスペーサが設けられる。

請求項６の発明では請求項４または請求項５の発明において、スペーサは電極面に対する垂直方向に延伸され、１００μｍ未満の間隔で林立する一群の柱状構造物よりなるものとされる。

請求項７の発明では請求項４または請求項５の発明において、スペーサは１００μｍ未満の孔径を有する多孔質状構造体よりなるものとされる。

請求項８の発明によれば、溶液と溶液中に浸漬される生体サンプルとを収容することができる溶液槽がＬＳＩチップ上に搭載されてなり、生体サンプルで生成または消費される化学物質の電気化学測定に用いるトランスデューサにおいて、溶液槽には、ＬＳＩチップに設けられて溶液槽の底面に位置し、８０μｍ以下の電極面の径寸法ｄ_ｅｌを有する電極と、電極の上方に構築され、電極面に対する垂直方向距離ｈ_１が、

を満たす輪郭面をもち、輪郭面の電極面側の領域において生体サンプルの侵入を阻止し、溶液中の溶質の拡散を許容するスペーサとが具備されているものとされる。

請求項９の発明によれば、溶液と溶液中に浸漬される生体サンプルとを収容することができる溶液槽がＬＳＩチップ上に搭載されてなり、生体サンプルで生成または消費される化学物質の電気化学測定に用いるトランスデューサにおいて、溶液槽には、ＬＳＩチップに設けられて溶液槽の底面に位置し、８０μｍ以下の電極面の径寸法ｄ_ｅｌを有する電極と、電極の上方に構築され、電極面の中心からの電極面に対する平行方向距離ｍに依存して、電極面に対する垂直方向距離ｈ_２が、
ｈ_２＝√｛（１．０５ｄ_ｅｌ＋６．８９）ｍ｝−０．４８ｄ_ｅｌ−２．３８±５ ［μｍ］
を満たす、すり鉢型の形状を描く輪郭面をもち、輪郭面の電極面側の領域において生体サンプルの侵入を阻止し、溶液中の溶質の拡散を許容するスペーサとが具備されているものとされる。

請求項１０の発明では請求項８または請求項９の発明において、スペーサは電極面に対する垂直方向に延伸され、１００μｍ未満の間隔で林立する一群の柱状構造物よりなるものとされる。

請求項１１の発明では請求項８または請求項９の発明において、スペーサは１００μｍ未満の孔径を有する多孔質状構造体よりなるものとされる。

この発明による電気化学測定方法は、生体サンプルを、作用極の電極面から電極面に対する垂直方向に所定距離、離間させて測定を実行するものとなっており、これにより溶液中の溶質が拡散できるスペースが確保され、生体サンプルへの溶質の供給が十分に行われるものとなっている。

よって、作用極の電極面に生体サンプルを近接させて測定を行っていた従来の電気化学測定方法に比し、この発明による電気化学測定方法によれば、生体サンプルで生成または消費されて作用極で検出される化学物質の量を増大させることができるため、その分、測定感度の向上を図ることができる。

加えて、生体サンプルを作用極の電極面から所定距離、離間させることにより、生体サンプルを作用極の電極面に近接させていた従来の電気化学測定方法に比し、生体サンプルの形状や表面状態等に基因する作用極と生体サンプル間の垂直方向距離の変動に伴う化学物質の拡散距離の変動の影響を低減することができ、その点で測定の比較性及び再現性を向上させることができる。

また、この発明による電気化学測定装置及びトランスデューサによれば、このような電気化学測定を良好に実行することができる。

電極とサンプル間の距離ｚと電流値Ｉの関係を示すグラフ。 サンプル直径ｄ_ｓｐと効果的な電極とサンプル間の距離ｚの範囲の関係を示すグラフ。 電極直径ｄ_ｅｌと効果的な電極とサンプル間の距離ｚの範囲の関係を示すグラフ。 電極とサンプル間の距離ｚと電流値Ｉ、反応速度Ｖ_ｍａｘとの関係を示すグラフ。 電極とサンプル間の距離ｚと電流値Ｉ、拡散係数Ｄとの関係を示すグラフ。 均一な高さを有するスペーサの構成例及び配置を説明するための模式図。 すり鉢型のスペーサの構成例及び配置を説明するための模式図。 Ａはこの発明によるトランスデューサの一実施例を示す平面図、Ｂはその断面図。 図８に示したトランスデューサの斜視図。

電気化学測定において、サンプルにて生じる化学反応に関わる溶液中の溶質の拡散過程と基板上の電極に流れる電流との関係を詳しく解析したところ、電極直径とサンプル直径とによって決定されるある特定の距離だけ、サンプルを電極より電極面に対して垂直方向に離して配置し、サンプル下に溶液が自由に拡散するための経路を形成させることにより、サンプルが電極の直上に近接している時と比較して電流量が増大し、測定の感度が向上することを発見した。

また、サンプルを電極より電極面に対して垂直方向に離して配置することにより、サンプルの電極に対する位置制御の精度の低さに起因する電流値のバラつきが、サンプルが電極の直上に近接している時のバラつきと比較して減少し、測定の比較性、及び再現性が向上することを発見した。

以下、まず、最初にこのような発見に至ったシミュレーションの結果を説明する。

シミュレーションにはシミュレーションソフトCOMSOL Multiphysicsを用いた。モデル
サンプルとして、マウスＥＳ細胞より形成される胚様体を選んだ。また、サンプルより生成される化学物質として、サンプル表面に存在するＡＬＰ酵素反応により生じるＰＡＰを選んだ。サンプルより生成された化学物質は電極（作用極）まで拡散した後、電極上にて酸化還元反応を生じ、電流値として検出されるものとした。その他の条件は以下のとおりとした。

＜酵素反応＞
サンプル表面では、溶液中の溶質であるＰＡＰＰを基質としたＡＬＰ酵素反応が進行し、ＰＡＰが生成される。その反応速度（生成速度）ｖは、下記に示すミカエリス・メンテンの式（１）に従うものとした。

ここで、Ａ_ＳＰはサンプルの表面積、Ｖ_ｍａｘは基質濃度が無限大の時の、サンプルの単位表面積あたりの反応速度、Ｋ_ｍはＡＬＰ酵素反応のミカエリス定数、［Ｓ］は基質濃度である。Ｖ_ｍａｘ、Ｋ_ｍの値はそれぞれ２．６５×１０^−７ｍｏｌ／（ｓ・ｍ^２）、１．７×１０^−３ｍｏｌ／Ｌとした。また、［Ｓ］の初期値は５．０×１０^−３ｍｏｌ／Ｌとした。

＜電極反応＞
電極上では、サンプルより生成されたＰＡＰの二電子酸化反応が進行するとした。電極電位は、反応が完全な拡散律速となるほど十分高いと仮定した。この時の電流値Ｉは下記の式（２）、式（３）に従うとした。

ここで、ｉ（ｘ，ｙ）、ｃ（ｘ，ｙ）は電極表面上の任意の点（ｘ，ｙ）における電流密度及び検出対象の化学物質濃度、Ａ_ｅｌは電極面積、ｎは反応に関わる電子数、Ｆはファラデー定数、Ｄは溶液中における検出対象の化学物質の拡散係数である。ｎ、Ｆ、Ｄはそれぞれ２、９．６４×１０^４Ｃ／ｍｏｌ、６．４７×１０^−１０ｍ^２／ｓとした。また、測定結果には電極反応開始から２００秒後における電流値Ｉを示した。

＜その他＞
サンプル形状：直径ｄ_ｓｐ＝２００μｍ球状
電極（電極面）形状：直径ｄ_ｅｌ＝２０μｍ円状
電極位置：電極面中心座標とサンプル中心座標（ｘ，ｙ）の水平距離が０となるように設定
電極面とサンプルの下端との距離ｚ：０〜８０μｍとした。

サンプルより生成される化学物質の酸化還元反応による電流値Ｉが、電極とサンプル下端との距離ｚによってどのように変化するかを調べた。図１に、電流値Ｉと距離ｚの関係を表したシミュレーション結果を示す。

結果より、電流値Ｉはｚ＝１６μｍにピークを有する山型の曲線を描くことが分かる。これより、サンプルをピーク電流値が得られる最適距離に設置すれば、測定の感度を距離ｚ＝０μｍの時と比較して大幅に向上させることができることが判明した。この様なｚの傾向は、電極直径ｄ_ｅｌ及びサンプル直径ｄ_ｓｐを変化させても同様であった。

さらに、ｚが上述の最適距離の近傍であれば、ｚが上下に変動した場合の電流値Ｉの変動は、ｚ＝０μｍの時と比べて大幅に小さくなることが分かる。細胞、細胞塊、組織片等をサンプルとした場合、サンプル表面の凹凸の影響や、サンプル形状が必ずしも球形でないことから、ｚを数μｍの精度で制御することは困難である。しかしながら、上述のようにｚを最適距離近傍に設定すれば、ｚの制御性の低さに起因する電流値Ｉのバラつきを低減することができ、結果として測定の相対的な定量性及び再現性を向上させることができる。

この相対的な定量性及び再現性向上の効果は、ｚが最適距離に近いほど高くなるが、とりわけ、電流値がピーク電流値の９０％以上となるｚの範囲において顕著である。このため、ｚをこの範囲内の値に設定すれば、感度の向上並びに相対的定量性と再現性の向上に関し、高い効果が得られることが分かる。

ここで、種々行ったシミュレーション結果により、上述の効果的なｚの範囲は、測定条件、特に電極直径とサンプル直径によって大きく変化することが分かっている。このため、特定の直径を有するサンプルを評価するには、適切な直径を有する電極及び適切なｚを提供する必要がある。

しかしながら、サンプルが細胞、細胞塊、組織片等の生体サンプルである場合、その直径は構成する細胞の種類、状態により大きく異なる。さらには、同一検体の同一箇所から
採取された場合であっても、あるいは同一の培養条件によって得られた場合であっても、サンプル間の直径には数μｍ〜数百μｍのバラつきがある。このようなサンプルの直径を測定前に全て調べ、それぞれに適切な電極直径、ｚを設定することは、コストの面から現実的でない。また、異なる電極直径、ｚにより得られた測定結果同士は、互いに定量的に比較することが著しく困難となってしまう。

これらの問題を解決するためには、直径が常識的な範囲内において様々であるサンプル全てに対して、本発明の高い効果を提供することが可能な電極直径及びｚの範囲を求め、これによって同一構成の電気化学測定装置により種々のサンプルを測定することが有効である。

そこで、本発明では、生体内における生理活性をより正確に再現するといわれている細胞塊サンプルに対し、その直径が一般的によく用いられる１００〜６００μｍの範囲で変化したとしても、依然として高い感度、相対的定量性、及び再現性向上の効果が得られる電極直径及びｚの範囲を求めた。以下に、その手順を説明する。

初めに、電極直径ｄ_ｅｌが２０μｍの時、サンプル直径ｄ_ｓｐによって効果的なｚの範囲の下限値ｚ_ｍｉｎ及び上限値ｚ_ｍａｘがどのように変化するかを調べた。図２にそのシミュレーション結果を示す。ｄ_ｅｌが２０μｍである時、各ｄ_ｓｐに対し、ｚが図２に示すｚ_ｍｉｎ以上ｚ_ｍａｘ以下であれば、電流値Ｉがピーク電流値の９０％以上となる効果を提供できる。（ｚ_ｏｐｔがピーク電流値を作るｚの最適距離である。）さらに、ｄ_ｓｐが１００μｍのときのｚ_ｍａｘをｚ_ｍａｘ ^＊、ｄ_ｓｐが６００μｍのときのｚ_ｍｉｎをｚ_ｍｉｎ ^＊とすると、ｄ_ｓｐが１００〜６００μｍの間のいかなる値であったとしても、z
がｚ_ｍｉｎ ^＊、ｚ_ｍａｘ ^＊を下限値、上限値とする図２中に斜線で示した範囲内であれば、やはり電流値Ｉがピーク電流値の９０％以上となる効果を提供できる。

次に、ｄ_ｅｌによってこのｚ_ｍｉｎ ^＊及びｚ_ｍａｘ ^＊がどのように変化するかを調べた。図３にそのシミュレーション結果を示す。ｄ_ｅｌが０〜８０μｍの範囲内におけるいかなる値であっても、ｚが図３に示すｚ_ｍｉｎ ^＊以上ｚ_ｍａｘ ^＊以下の範囲内であれば、ｄ_ｓｐ＝１００〜６００μｍのサンプルに対し、本発明の高い効果を提供できる。非線形最小二乗法を用いたフィッティング操作により、この範囲はｄ_ｅｌの関数としておおよそ次の式（４）によって表される。

このため、ｚは式（４）で表される範囲に設定すればよい。但し、ｚ＞０とする。

なお、図３からわかるように、上述の式（４）は電極直径ｄ_ｅｌが約８０μｍ以上の時には使えない。しかしながら、細胞等の微小なサンプルを対象とした電気化学測定では、ｄ_ｅｌ＝５０μｍ以下の電極を使用するのが一般的である。これは、電流値のＳ／Ｎ比（検出対象の化学物質の酸化還元反応によって生じるファラデー電流と、非検出対象である電解質によって生じる充電電流の比）が、ｄ_ｅｌ＝５０μｍ以下の電極において有意に増大するからである。よって、上述の式（４）は電極直径ｄ_ｅｌが約８０μｍ以上の時には使えないものの、特に問題はない。

電極直径ｄ_ｅｌ、サンプル直径ｄ_ｓｐの他に、サンプルによる化学物質の生成速度ｖ、化学物質の拡散係数Ｄによっても、効果的なｚの範囲は変化し得るが、その影響は限定的である。

基質濃度［Ｓ］が十分に高い場合、ｖは基質濃度無限大における反応速度Ｖ_ｍａｘによってほぼ決定されることが式（１）よりわかる。そこで、効果的なｚの範囲がＶ_ｍａｘによってどのように変化するかを調べた。図４に、様々なＶ_ｍａｘ、ｚにおける電流値Ｉのシミュレーション結果を示す。ここで、グラフの縦軸は、Ｖ_ｍａｘによって規格化されたIとした。図４より、Ｖ_ｍａｘが変化しても、Ｖ_ｍａｘによって規格化されたＩとｚの関
係性はほとんど変化がなく、従って効果的なｚの範囲もほぼ変化しないことがわかる。

同様に、効果的なｚの範囲がＤによってどのように変化するかを調べた。図５に、様々なＤ、ｚにおけるＩのシミュレーション結果を示す。ＰＡＰ、鉄錯体、ルテニウム錯体、過酸化水素等、医療、ライフサイエンス分野で使用される一般的な検出対象の化学物質のＤの値は、概ね１〜２０×１０^−１０ｍ^２／ｓの範囲にあるが、図５より、Ｄがこの範囲において変化しても、Ｉとｚの関係性ははほとんど変化がなく、従って効果的なzの範囲
もほぼ変化しないことが分かる。

これらの結果より、直径１００〜６００μｍのサンプルに対し、本発明の高い効果を提供するために満たすべきｚとｄ_ｅｌの関係性を示した式（４）は、様々なｖ、Ｄを有する測定系に関しても同様に有用であることが分かる。

以上説明したシミュレーション結果に基づき、この発明では溶液中の、１００μｍ以上６００μｍ以下の径寸法（直径）を有する生体サンプルで生成または消費される化学物質を、化学物質と電子の授受を行って酸化還元反応をさせる８０μｍ以下の径寸法（直径）ｄ_ｅｌを有する電極面を備えた作用極を用いて、電気化学的に測定する電気化学測定方法において、電極面に対する垂直方向距離ｈ_１が式（４）に示したｚの範囲を満たす輪郭面をもち、輪郭面の電極面側の領域において生体サンプルの侵入を阻止し、溶液中の溶質の拡散を許容するスペーサを溶液中に設置し、生体サンプルをスペーサの輪郭面沿いに位置させた状態で測定を実行するものとする。

図６はスペーサ１０を一群の柱状構造物１１で構成した例を示したものであり、均一な高さを有する柱状構造物１１は作用極２１が形成された基板２０上に、作用極２１の電極面２１ａに対する垂直方向に延伸され、１００μｍ未満の間隔で林立されている。図６中、破線は垂直方向距離ｈ_１の輪郭面を示す。また３０は生体サンプルを示す。

顕微鏡下におけるピペッティング操作あるいはガイドを使用するなどし、作用極２１と生体サンプル３０との水平距離（電極面２１ａに対する平行方向距離）が０となるように、生体サンプル３０を作用極２１の上方に設置すれば、他に何ら特別な操作を行わなくても、作用極２１と生体サンプル３０の下端との垂直距離ｚを、前述の式（４）の範囲に制御することができる。これにより、生体サンプル３０と作用極２１の間に、溶液中の溶質が供給されるための拡散経路が形成されるため、結果として生体サンプル３０より生成される検出対象の化学物質の量が増加する。さらに、生体サンプル３０と作用極２１の間の空間体積が増加するため、生成された化学物質のうち、この空間内に滞留する量が増加する。これら２つの作用は、作用極２１に到達する化学物質の量の増加に寄与する。

一方で、スペーサ１０により生体サンプル３０と作用極２１の間における拡散行程が長くなるため、作用極２１に到達せず、遠方に散逸してしまう化学物質の量は増加していると考えられる。しかしながら、スペーサ１０により距離ｈ_１は適切な範囲に制御されているため、前述２つの作用が優勢となり、結果として作用極２１に到達する化学物質の量が増加すると考えられる。

以上、平面内において高さが均一なスペーサを用いた場合の効果について説明したが、
スペーサの高さは電極面が位置する平面上の全領域で均一である必要はなく、低い領域と高い領域があったり、あるいは高さが段階的に変化する様な領域があったりしてもよい。

例えば、電極面の中心に位置するスペーサの高さが最も低く、電極面の中心より外周方向へ離れるに従い、徐々に高くなるような、すり鉢型構造としてもよい。このようなスペーサを備えた作用極上に、細胞等、溶液より比重の高い生体サンプルをピペット等にて展開すれば、何ら特別な機構を使用することなく、生体サンプルを自重によりスペーサが最も低い位置、すなわち電極面の中心へと落とし込むことが可能である。これにより、電極面に対する生体サンプルの位置関係について、垂直方向の距離のみならず、水平方向の距離をも制御することができる。

さらに、この時、電極面が位置する平面上のある地点から電極面の中心までの水平距離（電極面に対する平行方向距離）ｍと、その地点におけるスペーサの高さの関係を適切に設定すれば、サンプル直径ｄ_ｓｐが１００〜６００μｍの範囲におけるいかなる値であったとしても、ｚが上述のシミュレーションで求めた効果的なｚの範囲となるように制御することも可能である。

図７はこのようなすり鉢型構造のスペーサ４０を例示したものであり、図７ではすり鉢型構造のスペーサ４０は高さが順次変わる一群の柱状構造物４１によって構成されている。柱状構造物４１は作用極２１が形成された基板２０上に、作用極２１の電極面２１ａに対する垂直方向に延伸され、１００μｍ未満の間隔で林立されている。

図７には直径ｄ_ｓｐが大小２つの値の生体サンプル３０を示しているが、この値を上記の１００〜６００μｍの範囲で適宜に数点選び、それらの各ｄ_ｓｐに対応する式（４）のzの中央値の高さに各生体サンプルを配置した場合の全生体サンプルの外形に外接する曲
線、すなわち図７中に破線で示したようなｈ_２をフィッティングすると、おおよそ次の式（５）の中央値のとおりとなる。
ｈ_２＝√｛（１．０５ｄ_ｅｌ＋６．８９）ｍ｝−０．４８ｄ_ｅｌ−２．３８±５ ［μｍ
］…（5）
即ち、作用極の電極面の中心からの電極面に対する平行方向距離ｍに依存して、電極面に対する垂直方向距離ｈ_２が、（５）式を満たす、すり鉢型の形状を描く輪郭面をもち、輪郭面の電極面側の領域において生体サンプルの侵入を阻止し、溶液中の溶質の拡散を許容するスペーサを溶液中に設置し、生体サンプルを、スペーサの輪郭面沿いに電極面の中心の直上に位置させた状態で電気化学測定を実行するようにしてもよい。

生体サンプル３０を設置する際、何ら特別な操作を行わなくても、生体サンプル３０を自重により、すり鉢型のスペーサ４０の凹部へ落とし込むことができる。この時、作用極２１と生体サンプル３０との電極面２１ａに対する平行方向距離ｍは０となる。なお、サンプル直径ｄ_ｓｐによって生体サンプル３０とスペーサ４０が接する位置は変化するため、作用極２１と生体サンプル３０の下端との距離ｚはｄ_ｓｐによって変化することになる。

この図７に示した構成も図６に示した構成と同様、生体サンプル３０と作用極２１の間に、溶液中の溶質が供給されるための拡散経路が形成されるため、生体サンプル３０より生成される検出対象の化学物質の量が増加する。さらに、生体サンプル３０と作用極２１の間の空間体積が増加するため、生成された化学物質のうち、この空間内に滞留する量が増加する。これら２つの作用は、作用極２１に到達する化学物質の量の増加に寄与する。

一方で、スペーサ４０により生体サンプル３０と作用極２１の間における拡散行程が長くなるため、作用極２１に到達せず、遠方に散逸してしまう化学物質の量は増加している
と考えられる。しかしながら、すり鉢型のスペーサ４０により距離ｈ_２が適切な範囲に制御されているため、前述２つの作用が優勢となり、結果として作用極２１に到達する化学物質の量が増加すると考えられる。

スペーサは上記においては、一群の柱状構造物よりなるものとしているが、これに限らず、例えば１００μｍ未満の孔径の無数の孔を有する多孔質状構造体をスペーサとして用いてもよい。
・発明に必要な構成の具体例
生体サンプルで生成または消費される化学物質そのものが電気化学活性を有するか、あるいは電気化学活性を有する他の化学物質に変換されるという条件を満たせば、生体サンプル、生体サンプルで検出対象の化学物質が生成または消費される機構、作用極及び作用極が形成される基板等がいかなる構成であっても、上述の効果が期待できる。例えば次に挙げる構成が考えられる。

＜生体サンプル＞
シミュレーションではマウスＥＳ細胞より形成された胚様体を選んだが、これが他の細胞塊、単一細胞、組織片、微生物、または生体関連物質を含む非生体サンプル等であってもよい。

＜生体サンプルより化学物質が生成または消費される機構＞
シミュレーションではサンプル上のＡＬＰ酵素反応による生成機構を選択したが、これが他のタンパク質、ペプチド、ＲＮＡ等による酵素反応、あるいはサンプル上白金薄膜、酸化チタン薄膜等による触媒反応等による生成または消費等であってもよい。

また、サンプルが細胞等であった場合、この化学物質は細胞内の様々な代謝経路やシグナル伝達経路を経て生成または消費されるものであってもよい。例えば、解糖系の代謝経路におけるプロトンの放出や、神経細胞によるドーパミンの放出等がこれにあたる。
＜作用極＞
シミュレーションではその材料を特に指定しなかったが、金、白金等の貴金属、あるいはグラファイト、不純物をドープしたダイヤモンド、カーボンナノチューブ等、炭素を主体とした無機物、あるいはポリピロール、ポリアニリン、ポリチオフェン等の導電性高分子など、電気化学測定の作用極に使用され得るものであれば何でもよい。

作用極の電極面の形状は円形に限るものではなく、楕円形、多角形等であってもよい。円形以外の場合、この発明で規定する径寸法ｄ_ｅｌは形状中心からの差し渡し寸法の一周の平均値とする。

＜作用極形成基板＞
シミュレーションではその材料を特に指定しなかったが、石英、ガラス、シリコン、その他セラミックス等、電気化学測定の作用極支持体に使用され得るものであれば何でもよい。
・スペーサ構築法の具体例
スペーサは、本発明の高い効果を得るために、高さをμｍレベルで制御し得る手法によって構築されるべきである。また、スペーサは溶液透過性を有し、即ち溶液中の溶質の拡散を許容する必要があり、さらに電極上に接触して構築される場合は絶縁性を有する必要がある。これらの条件を満たせば、スペーサはその構築手法、材料に関わらず、目的とする効果を得られる。以下に、好適と思われるスペーサ構築手法及びその材料を例示する。

＜成膜→保護層パターニング→エッチングによる一群の柱状構造物よりなるスペーサの構築＞
１）基板上に、ＣＶＤにより膜厚が制御され、かつ均一な窒化ケイ素膜を成膜
２）窒化ケイ素膜上に、フォトリソグラフィー法によりエッチング保護層をパターニング３）リアクティブイオンエッチングにより、保護層により被覆されていない領域の窒化ケイ素膜をエッチングし、柱状構造物を構築
４）保護層を除去
絶縁膜材料（柱状構造物の構成材料）は窒化ケイ素の他、酸化ケイ素、酸化チタン等であってもよい。

成膜手法はＣＶＤの他、スパッタ、蒸着等の真空成膜手法あるいはスピンオングラス等であってもよい。

保護層のパターニング手法はフォトリソグラフィー法の他、スクリーン印刷法、インクジェット法等であってもよい。

エッチング手法はリアクティブイオンエッチングの他、プラズマエッチング、スパッタエッチング、イオンビームエッチング、あるいはウェットエッチングでもよい。

＜感光性樹脂による構造体パターニングによる一群の柱状構造物よりなるスペーサの構築＞
１）電流検出素子を有するＬＳＩ上に、スピンコートにより感光性樹脂をコーティング
２）フォトリソグラフィー法により柱状構造物を構築
感光性樹脂は一般的なフォトリソグラフィーに用いられる絶縁性、感光性を有する樹脂であれば何でもよく、必要とされる分解能を得るのに必要な感光性樹脂が選択されるべきである。柱状構造物の化学的安定性の観点から、ネガ型の永久レジストとして使用されるエポキシ系化学増幅型感光樹脂が好適と思われる。

コーティング手法はμｍオーダーで膜厚を制御できる手法であればなんでもよい。膜厚の制御性の高さから、スピンコート、スプレーコートが好適かと思われるが、ディップコート、スクリーンコート、ロールコート等でもよい。

＜ゲルコーティングによる多孔質状構造体よりなるスペーサの構築＞
１）アガロースの水希釈液を調整し、これを８０℃以上に加熱してゾル化する。
２）８０℃とした基板上に、上述のアガロース水溶液を滴下し、スピンコートにより薄膜を形成する。この時、基板の温度は常に８０℃以上を保つようにする。
３）基板を室温にまで放冷し、アガロースゲルによる多孔質状スペーサを得る。

基板上に滴下されるゾルは、スピンコート後に多孔質状のゲルとなるものであればなんでもよく、また加熱温度もその種類によって適切に選ばれるべきである。調整の簡易さ、生体適合性の高さから、アガロース、ポリビニルアルコール、セルロース等が好ましい。

コーティング手法はμｍオーダーで膜厚を制御でき、かつコーティング操作中にゾルの温度を一定に保つ機構を備える手法であればなんでもよい。膜厚の制御性の高さから、スピンコート、スプレーコートが好適かと思われるが、ディップコート、スクリーンコート、ロールコート等でもよい。

＜その他＞
柱状構造物よりなるスペーサは他にも、ナノインプリントやモールドイン等の成型、スクリーン印刷やインクジェット印刷等の印刷、機械加工等によって構築されてもよい。また、多孔質状構造体よりなるスペーサは他にも、あらかじめ成型された多孔質シリカ、ニトロセルロースメンブレン等の多孔質体を、基板上に設置することによって得てもよい。
・柱状構造物よりなるスペーサの仕様
スペーサとして一群の柱状構造物を用いる場合、その間隔、形状は以下のようにして決定されるべきである。

＜間隔＞
間隔は１００μｍ未満とするが、より高い感度を得るためには、柱状構造物による生体サンプル周りの溶質の拡散阻害を最小化するという観点から、柱状構造物の間隔は広いほど好ましい。

また、柱状構造物の間隔が均一である必要はなく、柱状構造物が密に存在する領域と疎に存在する領域あるいは全く存在しない領域があってもよい。

例えば、電極面の直上の領域のみ柱状構造物を形成せず、従って生体サンプルの保持は電極面周辺の柱状構造物によってのみ、なされるような構造とした場合、生体サンプル直下における溶質の拡散阻害を効果的に防ぎ、より高い感度を得ることができる。

＜直径＞
生体サンプルを電極面から離して保持できるだけの強度が確保できるようであれば、柱状構造物の直径に特に制約はない。ただし、より高い感度を得るには、柱状構造物によるサンプル周りの溶質の拡散阻害を最小化するという観点から、柱状構造物の直径は小さいほど好ましい。

＜上面形状＞
柱状構造物の上面の形状に関しても特に制約はない。円形、三角、四角、その他多角形であっても、本発明の効果は得られる。

また、柱状構造物は上面と下面の形状及び面積が同一な柱状構造である必要はない。例えば、作成時に絶縁層のエッチング条件を変える等して、意図的に上面面積を減少させる、あるいは先鋭化させてもよい。

生体サンプルが細胞、組織片等であった場合、柱状構造物の先鋭化により生体サンプルと柱状構造物との接触面積及び接着力を減じることができる。この効果は、生体サンプルを測定した後、生体サンプルを回収する際、生体サンプル剥離に必要な力を減じ、従って生体サンプルへのダメージを減じるのに好適である。

次に、生体サンプルで生成または消費される化学物質の電気化学測定に用いるこの発明によるトランスデューサの具体的な構成を図８及び図９を参照して説明する。

このトランスデューサは、溶液５１と溶液５１中に浸漬される生体サンプルとを収容することができる溶液槽５０がＬＳＩチップ６０上に搭載された構成となっている。溶液槽５０の中央には穴５２が形成されており、ＬＳＩチップ６０はこの穴５２の下端に穴５２を塞ぐように配置されている。

ＬＳＩチップ６０及び溶液槽５０は基板７０上に搭載固定されており、基板７０にはトランスデューサの制御を行う外部装置との接続用の多数の配線パターン７１が形成されている。図８Ｂ中、８０はＬＳＩチップ６０と配線パターン７１とを接続するボンディングワイヤを示す。

ＬＳＩチップ６０の上面にはセンサ領域６１が構成されている。図８Ａではセンサ領域６１をハッチングを付して示しており、溶液槽５０の底面の穴５２の位置にセンサ領域６
１は画定されている。詳細図示を省略しているが、この例ではセンサ領域６１に電極（作用極）が形成され、さらに作用極の上方に前述の一群の柱状構造物よりなるスペーサが構築されている。ＬＳＩチップ６０は作用極への電圧印加機能、作用極での反応を電流値として検出し、増幅する機能等を備えている。

なお、スペーサを構成する一群の柱状構造物は均一な高さであってもよく、またすり鉢型の輪郭面を描くものであってもよい。さらに、柱状構造物ではなく、多孔質状構造体によってスペーサを構成してもよい。

１０ スペーサ １１ 柱状構造物
２０ 基板 ２１ 作用極
２１ａ 電極面 ３０ 生体サンプル
４０ スペーサ ４１ 柱状構造物
５０ 溶液槽 ５１ 溶液
５２ 穴 ６０ ＬＳＩチップ
６１ センサ領域 ７０ 基板
７１ 配線パターン ８０ ボンディングワイヤ

Claims (11)

1. 溶液中の生体サンプルで生成または消費される化学物質を電気化学的に測定する電気化学測定方法であって、
   前記化学物質と電子の授受を行なって酸化還元反応をさせる作用極の電極面の寸法と、前記生体サンプルの寸法とを与件に含み、前記生体サンプルにおいて前記化学物質が生成または消費される化学反応の速度と、前記溶液中の前記化学物質の濃度分布の変化と、前記電極面における前記化学物質との電子の授受の速度とに基いて前記作用極に流れる電流を計算するシミュレーションを、前記生体サンプルと前記電極面との前記電極面に対する垂直方向距離を変数として行って、前記電流が最大値となる点を含み前記電流が前記最大値の９０％以上の大きさとなる前記垂直方向距離の範囲を求め、
   前記溶液中において前記生体サンプルを、前記電極面から前記電極面に対する垂直方向に前記範囲に属する距離だけ離間させて測定を実行することを特徴とする電気化学測定方法。
2. 溶液中の、１００μｍ以上６００μｍ以下の径寸法を有する生体サンプルで生成または消費される化学物質を、前記化学物質と電子の授受を行って酸化還元反応をさせる８０μｍ以下の径寸法ｄ_ｅｌを有する電極面を備えた作用極を用いて、電気化学的に測定する電気化学測定方法であって、
   前記電極面に対する垂直方向距離ｈ_１が、
   

   

   
   を満たす輪郭面をもち、前記輪郭面の前記電極面側の領域において前記生体サンプルの侵入を阻止し、前記溶液中の溶質の拡散を許容するスペーサを前記溶液中に設置し、
   前記生体サンプルを、前記スペーサの前記輪郭面沿いに位置させた状態で測定を実行することを特徴とする電気化学測定方法。
3. 溶液中の、１００μｍ以上６００μｍ以下の径寸法を有する生体サンプルで生成または消費される化学物質を、前記化学物質と電子の授受を行って酸化還元反応をさせる８０μｍ以下の径寸法ｄ_ｅｌを有する電極面を備えた作用極を用いて、電気化学的に測定する電気化学測定方法であって、
   前記電極面の中心からの前記電極面に対する平行方向距離ｍに依存して、前記電極面に対する垂直方向距離ｈ_２が、
   ｈ_２＝√｛（１．０５ｄ_ｅｌ＋６．８９）ｍ｝−０．４８ｄ_ｅｌ−２．３８±５ ［μｍ］
   を満たす、すり鉢型の形状を描く輪郭面をもち、前記輪郭面の前記電極面側の領域において前記生体サンプルの侵入を阻止し、前記溶液中の溶質の拡散を許容するスペーサを前記溶液中に設置し、
   前記生体サンプルを、前記スペーサの前記輪郭面沿いに前記電極面の中心の直上に位置させた状態で測定を実行することを特徴とする電気化学測定方法。
4. 溶液中の生体サンプルで生成または消費される化学物質を、前記化学物質と電子の授受を行って酸化還元反応をさせる電極面を備えた作用極を用いて電気化学的に測定する電気化学測定装置であって、
   前記電極面は８０μｍ以下の径寸法ｄ_ｅｌを有し、
   前記溶液と前記生体サンプルとを収容する溶液槽には、前記電極面に対する垂直方向距離ｈ_１が、
   

   

   
   を満たす輪郭面をもち、前記輪郭面の前記電極面側の領域において前記生体サンプルの侵入を阻止し、前記溶液中の溶質の拡散を許容するスペーサが設けられていることを特徴とする電気化学測定装置。
5. 溶液中の生体サンプルで生成または消費される化学物質を、前記化学物質と電子の授受を行って酸化還元反応をさせる電極面を備えた作用極を用いて電気化学的に測定する電気化学測定装置であって、
   前記電極面は８０μｍ以下の径寸法ｄ_ｅｌを有し、
   前記溶液と前記生体サンプルとを収容する溶液槽には、前記電極面の中心からの前記電極面に対する平行方向距離ｍに依存して、前記電極面に対する垂直方向距離ｈ_２が、
   ｈ_２＝√｛（１．０５ｄ_ｅｌ＋６．８９）ｍ｝−０．４８ｄ_ｅｌ−２．３８±５ ［μｍ］
   を満たす、すり鉢型の形状を描く輪郭面をもち、前記輪郭面の前記電極面側の領域において前記生体サンプルの侵入を阻止し、前記溶液中の溶質の拡散を許容するスペーサが設けられていることを特徴とする電気化学測定装置。
6. 請求項４または請求項５記載の電気化学測定装置において、
   前記スペーサは前記電極面に対する垂直方向に延伸され、１００μｍ未満の間隔で林立する一群の柱状構造物よりなることを特徴とする電気化学測定装置。
7. 請求項４または請求項５記載の電気化学測定装置において、
   前記スペーサは１００μｍ未満の孔径を有する多孔質状構造体よりなることを特徴とする電気化学測定装置。
8. 溶液と前記溶液中に浸漬される生体サンプルとを収容することができる溶液槽がＬＳＩチップ上に搭載されてなり、前記生体サンプルで生成または消費される化学物質の電気化学測定に用いるトランスデューサであって、
   前記溶液槽には、前記ＬＳＩチップに設けられて前記溶液槽の底面に位置し、８０μｍ以下の電極面の径寸法ｄ_ｅｌを有する電極と、前記電極の上方に構築され、前記電極面に対する垂直方向距離ｈ_１が、
   

   

   
   を満たす輪郭面をもち、前記輪郭面の前記電極面側の領域において前記生体サンプルの侵入を阻止し、前記溶液中の溶質の拡散を許容するスペーサとが具備されていることを特徴とするトランスデューサ。
9. 溶液と前記溶液中に浸漬される生体サンプルとを収容することができる溶液槽がＬＳＩチップ上に搭載されてなり、前記生体サンプルで生成または消費される化学物質の電気化学測定に用いるトランスデューサであって、
   前記溶液槽には、前記ＬＳＩチップに設けられて前記溶液槽の底面に位置し、８０μｍ以下の電極面の径寸法ｄ_ｅｌを有する電極と、前記電極の上方に構築され、前記電極面の中心からの前記電極面に対する平行方向距離ｍに依存して、前記電極面に対する垂直方向距離ｈ_２が、
   ｈ_２＝√｛（１．０５ｄ_ｅｌ＋６．８９）ｍ｝−０．４８ｄ_ｅｌ−２．３８±５ ［μ
   ｍ］
   を満たす、すり鉢型の形状を描く輪郭面をもち、前記輪郭面の前記電極面側の領域において前記生体サンプルの侵入を阻止し、前記溶液中の溶質の拡散を許容するスペーサとが具備されていることを特徴とするトランスデューサ。
10. 請求項８または請求項９記載のトランスデューサにおいて、
    前記スペーサは前記電極面に対する垂直方向に延伸され、１００μｍ未満の間隔で林立する一群の柱状構造物よりなることを特徴とするトランスデューサ。
11. 請求項８または請求項９記載のトランスデューサにおいて、
    前記スペーサは１００μｍ未満の孔径を有する多孔質状構造体よりなることを特徴とするトランスデューサ。

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