CN108474759B - 电化学测定方法、电化学测定装置以及传感器 - Google Patents
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Abstract
一种电化学测定方法,通过电化学方式测定溶液中的生物样品所生成或消耗的化学物质,作为已知条件包含与化学物质发生电子的转移而使氧化还原反应进行的工作电极的电极面尺寸和生物样品的尺寸,以生物样品与电极面的沿着相对于电极面垂直的方向距离为变量,基于在生物样品中生成或消耗化学物质的化学反应的速度、溶液中的化学物质的浓度分布的变化、电极面上的与化学物质发生电子转移的速度而进行计算出在工作电极中流通的电流的模拟,求出包括电流达到最大值的点在内、电流达到最大值的90%以上的大小的垂直方向距离的范围,在溶液中使生物样品与电极面在相对于电极面垂直的方向上分开属于所述范围的距离而进行测定。
Description
技术领域
该发明涉及通过电化学方式测定细胞和细胞团、组织片等其他生物样品以及包含生物相关物质的非生物样品(以下,在本申请中一并简称为“生物样品”)所生成或消耗的化学物质的电化学测定方法、电化学测定装置以及在电化学测定中使用的传感器。
背景技术
对在细胞中生成或消耗的化学物质进行定量评价的技术的构筑不仅有助于基础生化学的发展,也对在癌症诊查等中使用的细胞诊断,在再生医疗、免疫细胞治疗等中使用的移植用细胞的品质评价、药效评价和毒性评价中作为动物实验的替代品应用等医疗和生命科学领域的发展有着极大贡献。
然而,细胞的生理活性不仅随着温度、pH、培养基成分、相邻的细胞、细胞外基质等细胞所处的环境而变化,也会根据基因转移、药物曝露、应力施加等外部刺激和细胞***、细胞死亡等细胞活动而经时变化。
因此,为了对在生物体内实际工作的细胞的真正性质进行评价,重要的是将作为样本的细胞设置在与保持活性(保持细胞生理活性)的生物体内尽可能接近的环境,进而相对于外部刺激和细胞活动,对该细胞生成或消耗的化学物质进行实时测定。
作为将样品即细胞设置在接近生物体内的环境的一种方法,通常不选择单一细胞作为样品,而是选择多个细胞和细胞外基质(extracellular matrix:ECM)成分的凝集体即细胞团(球状体)作为样品。
这是由于细胞所表示的各种生理活性中大多会与所接触的相邻细胞或ECM进行相互作用,因此认为它们的凝集体即细胞团更能忠实地再现生物体内的环境。
作为这样的细胞团,能够举出例如由胰腺提取的胰岛细胞、受精卵、通过细胞培养而得到的肝细胞和神经细胞球状体、ES(embryonic stem;胚胎干)细胞的胚状体等。
这些细胞团的直径根据构成细胞的种类、生物体内的提取部位、培养条件等而不同,但在用于细胞活性的评价的情况下大多使用直径在100-600μm左右的细胞团。这是由于,在直径100μm以下的小的细胞团中构成细胞数过少而难以显现细胞团特有的生理活性,并且在直径为600μm以上的大的细胞团中,氧难以扩散到细胞团中心部的细胞,细胞容易坏死。
作为对在细胞中生成或消耗的化学物质进行实时测定的一种方法,使用电化学方法。在该电化学方法中,需要与样品设置在同一溶液内并且用于检测样品的各种电化学信号的电极(工作电极)。在这里,由于该工作电极的电位控制或电流控制的差异,存在各种检测方法。在与细胞等的代谢活性有关的测定中,出于比较性的高低、解析的容易性,一直以来使用以计时安培分析法和循环伏安法为代表的控制电位电解法(定电位电解法)。在该控制电位电解法中,以时间函数对工作电极的电位进行控制,此时,检测在工作电极产生的电流值。
在一般的细胞团中生成或消耗的化学物质的电化学测定中,伴随着细胞团的物质代谢,组成在细胞团内或细胞团表面生成具有氧化还原活性的化学物质的反应***,它们在工作电极上发生氧化或还原而产生电流。
在伴随着细胞的物质代谢而生成具有氧化还原活性的化学物质的反应***中,通过所关注的代谢***而能够设计出各种***,其中在以高灵敏度检测极微量的代谢物质为目的的情况下,优选使用利用酶促反应的***。
例如,在由鼠ES细胞制成的细胞团即胚状体中,存在于细胞表面的酶即碱性磷酸酶(ALP)的量随着分化状态而增减。
于是,以评价胚状体的分化状态为目的,屡次进行ALP生成量的电化学的评价(非专利文献1)。在该评价***中,通过将胚状体放置于基质即对-氨基苯丙酮(PAPP)所溶解的溶液中,通过ALP酶活性使PAPP的脱磷反应进行,结果生成具有氧化还原活性的对-氨基苯酚(PAP)。
如果溶液中的PAPP浓度充分高,即使细胞所生成的ALP量是极微量,通过该酶的活性也能够使具有氧化还原活性的化学物质即PAP的量随着时间累积,因此最终能够高精度地检测ALP存在量。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1:M.Sen,etal.,“BiosensorsandBioelectronics”2013年,48卷,p.12-18
发明内容
发明所要解决的技术问题
然而,在细胞中生成或消耗的具有氧化还原活性的化学物质只要不受到来自外部的特别的水力学的作用,就会由于扩散作用而以细胞为中心在溶液中呈放射状扩散,其一部分到达工作电极而氧化或还原。因此,此时产生的电流量很大程度上受到化学物质生成或消耗量以及化学物质到工作电极的扩散距离的影响。
然而,在基板上形成工作电极的情况下,如果使样品接近工作电极,则样品与基板的间隔变小,样品向溶液中所溶解的基质的供给受阻,因此通过酶促反应而由样品生成的化学物质的量比样品远离基板而在溶液中浮游的情况要低。并且,由于样品与工作电极之间的空间体积小,因此所生成的化学物质的大部分不能在该空间内滞留而向远方逸散。由于逸散的化学物质到工作电极的距离变长,其结果是,到达工作电极的量减少、灵敏度降低(问题点1)。
另外,由于样品表面凹凸的影响和样品形状不一定是球形,工作电极与样品之间的垂直方向距离的控制精度存在极限。一般来说,该垂直方向距离在每次测定时至少以数μm程度波动,由此化学物质的扩散距离不是一定的,测定的比较性、再现性低下(问题点2)。
在非专利文献1中,通过基板上的工作电极来测定化学物质的量,具有上述问题点1、2。
另一方面,也存在使用探针状的工作电极(探针电极)而非基板上的工作电极的情况。一般来说,与样品相比,探针电极的前端极为微细,探针电极进而其支撑体对样品向溶液中的溶质的供给阻碍与基板上的电极的情况相比要小。因此,上述问题点1不会成为大的问题。并且,一般来说,探针电极相对于样品的位置能够通过计算机以μm的指令进行精细控制。因此,上述问题点2也不会成为问题。
然而,在探针电极的位置控制中,需要机械手、用于观测探针前端位置的显微镜***等昂贵的设备。另外,如果是缺乏经验的使用者,则探针电极经常会破损。
该发明的目的在于提供一种电化学测定方法、电化学测定装置以及在电化学测定中使用的传感器,在不使用探针电极作为工作电极、而是使用例如在基板上形成而固定配置在溶液中的工作电极的电化学测定中,与以往相比能够使灵敏度、比较性以及再现性提高。
用于解决技术问题的技术方案
根据该发明第一观点的电化学测定方法,通过电化学方式对溶液中的生物样品生成或消耗的化学物质进行测定的电化学测定方法,作为已知条件包含与化学物质发生电子的转移而使氧化还原反应进行的工作电极的电极面的尺寸和生物样品的尺寸,以生物样品与电极面的相对于电极面垂直的方向的距离为变量,基于在生物样品中生成或消耗化学物质的化学反应的速度、溶液中的化学物质的浓度分布的变化和电极面上的与化学物质发生电子的转移的速度,进行计算出在工作电极中流通的电流的模拟,求出包含电流达到最大值的点在内、电流达到最大值的90%以上的大的垂直方向距离的范围,在溶液中使生物样品与电极面在相对于电极面垂直的方向上分开属于所述范围的距离而进行测定。
根据该发明第二观点的电化学测定方法,使用具备与化学物质发生电子的转移而使氧化还原反应进行且具有80μm以下的径尺寸del的电极面的工作电极通过电化学方式测定溶液中的、具有100μm以上600μm以下的径尺寸的生物样品生成或消耗的化学物质,在该电化学测定方法中,在溶液中设置隔片,所述隔片具有相对于电极面的垂直方向距离h1满足
[计算式1]
的轮廓面,并且在轮廓面的电极面侧的区域阻止生物样品侵入、容许溶液中的溶质扩散,在使生物样品沿着隔片的轮廓面的状态下进行测定。
根据该发明第三观点的电化学测定方法,使用具备与化学物质发生电子的转移而使氧化还原反应进行且具有80μm以下的径尺寸del的电极面的工作电极通过电化学方式测定溶液中的、具有100μm以上600μm以下的径尺寸的生物样品所生成或消耗的化学物质,在该电化学测定方法中,在溶液中设置隔片,所述隔片具有取决于与电极面的中心的相对于电极面平行的方向的距离m、相对于电极面垂直的方向的距离h2满足h2=√{(1.05del+6.89)m}-0.48del-2.38±5[μm]、描绘研钵型的形状的轮廓面,并且在轮廓面的电极面侧的区域阻止生物样品侵入、容许溶液中的溶质扩散,在使生物样品沿着隔片的轮廓面位于电极面的中心的正上方的状态下进行测定。
根据该发明第二观点的电化学测定装置,使用具备与化学物质发生电子的转移而使氧化还原反应进行的电极面的工作电极通过电化学方式测定溶液中的生物样品所生成或消耗的化学物质,在该电化学测定装置中,电极面具有80μm以下的径尺寸del,在收纳溶液和生物样品的溶液槽设有隔片,所述隔片具有相对于电极面的垂直方向距离h1满足
[计算式2]
的轮廓面,并且在轮廓面的电极面侧的区域阻止生物样品侵入、容许溶液中的溶质扩散。
根据该发明第三观点的电化学测定装置,使用具备与化学物质发生电子的转移而使氧化还原反应进行的电极面的工作电极通过电化学方式测定溶液中的生物样品所生成或消耗的化学物质,在该电化学测定装置中,电极面具有80μm以下的径尺寸del,在收纳溶液和生物样品的溶液槽设有隔片,所述隔片具有取决于与电极面的中心的相对于电极面平行的方向的距离m、相对于电极面垂直的方向的距离h2满足h2=√{(1.05del+6.89)m}-0.48del-2.38±5[μm]、描绘研钵型的形状的轮廓面,并且在轮廓面的电极面侧的区域阻止生物样品侵入、容许溶液中的溶质扩散。
根据该发明第二观点的传感器,在LSI芯片上搭载有能够收纳溶液和浸渍于溶液中的生物样品的溶液槽,并且用于生物样品所生成或消耗的化学物质的电化学测定,在该传感器中,在溶液槽中具备:电极,其设置于LSI芯片而位于溶液槽的底面,并且具有80μm以下的电极面的径尺寸del的电极;隔片,其在电极的上方构筑,具有相对于电极面垂直的方向的距离h1满足
[计算式3]
的轮廓面,并且在轮廓面的电极面侧的区域阻止生物样品侵入、容许溶液中的溶质扩散。
根据该发明第三观点的传感器,在LSI芯片上搭载有能够收纳溶液和浸渍于溶液中的生物样品的溶液槽,并且用于生物样品所生成或消耗的化学物质的电化学测定,在该传感器中,在溶液槽中具备:电极,其设置于LSI芯片而位于溶液槽的底面,并且具有80μm以下的电极面的径尺寸del的电极;隔片,其在电极的上方构筑,具有取决于与电极面的中心的相对于电极面平行的方向的距离m、相对于电极面垂直的方向的距离h2满足h2=√{(1.05del+6.89)m}-0.48del-2.38±5[μm]、描绘研钵型的形状的轮廓面,并且在轮廓面的电极面侧的区域阻止生物样品侵入、容许溶液中的溶质扩散。
发明的效果
该发明的电化学测定方法使生物样品与工作电极的电极面沿着相对于电极面垂直的方向分开规定距离而进行测定,由此能够确保溶液中的溶质能够扩散的空间,充分地进行溶质向生物样品的供给。
因此,与使生物样品接近工作电极的电极面而进行测定的现有的电化学测定方法相比,根据该发明的电化学测定方法,能够使在生物样品中生成或消耗而通过工作电极检测到的化学物质的量增大,因此能够相应地实现测定灵敏度的提高。
而且,通过使生物样品与工作电极的电极面分开规定的距离,与使生物样品与工作电极的电极面接近的现有的电化学测定方法相比,能够降低由生物样品的形状和表面状态等引起的伴随着工作电极与生物样品之间的垂直方向距离的变动的化学物质的扩散距离变动的影响,在这一点能够使测定的比较性和再现性提高。
另外,根据该发明的电化学测定装置和传感器,能够良好地执行这样的电化学测定。
附图说明
图1是表示电极与样品之间的距离z和电流值I的关系的曲线图。
图2是表示样品直径dsp和有效的电极与样品之间的距离z的范围的关系的曲线图。
图3是表示电极直径del和有效的电极与样品之间的距离z的范围的关系的曲线图。
图4是表示电极与样品之间的距离z和电流值I、反应速度Vmax的关系的曲线图。
图5是表示电极与样品之间的距离z和电流值I、扩散系数D的关系的曲线图。
图6是用于对具有表示均一的高度的隔片的结构例和配置进行说明的示意图。
图7是用于对研钵型的隔片的结构例和配置进行说明的模式图。
图8A是表示该发明的传感器的一实施例的平面图。图8B是图8A所示的传感器的剖面图。
图9是图8A所示的传感器的立体图。
具体实施方式
在电化学测定中,对在样品发生化学反应的溶液中的溶质的扩散过程和在基板上的电极中流通的电流的关系详细地进行分析发现,通过使样品从电极向相对于电极面垂直的方向分开由电极直径和样品直径决定的某一特定的距离配置,在样品下形成供溶液自由扩散的通路,由此与样品接近电极的正上方时相比电流量增大、测定的灵敏度提高。
并且,通过使样品从电极向相对于电极面垂直的方向分开配置,由样品相对于电极的位置控制精度低引起的电流值的不均比样品接近电极正上方时的不均减少,测定的比较性和再现性提高。
以下,首先,对最初得到这样的发现的模拟结果进行说明。
在模拟中使用模拟软件COMSOL Multiphysics。作为模型样品,选择由鼠ES细胞形成的胚状体。另外,作为由样品生成的化学物质,选择存在于样品表面的由ALP酶促反应产生的PAP。在由样品生成的化学物质扩散到电极(工作电极)后,在电极上发生氧化还原反应,作为电流值而被检测。其他条件如下。
<酶促反应>
在样品表面,进行以溶液中的溶质即PAPP为基质的ALP酶促反应,生成PAP。其反应速度(生成速度)v满足以下所示的米氏方程式(1)。
[计算式4]
在这里,ASP为样品的表面积,Vmax为基质浓度无限大时的样品的单位表面积的反应速度,Km为ALP酶促反应的米氏常数,[S]为基质浓度。Vmax、Km的值分别为2.65×10-7mol/(s·m2)、1.7×10-3mol/L。并且,[S]的初始值为5.0×10-3mol/L。
<电极反应>
在电极上,进行由样品生成的PAP的二电子氧化反应。假设电极电位充分高,达到反应完全扩散律速。此时的电流值I满足以下式(2)、式(3)。
[计算式5]
在这里,i(x,y)、c(x,y)为电极表面上任意点(x,y)处的电流密度和检测对象的化学物质浓度,Ael为电极面积,n为与反应相关的电子数,F为法拉第常数,D为溶液中的检测对象的化学物质的扩散系数。n、F、D分别为2、9.64×104C/mol、6.47×10-10m2/s。并且,在测定结果中表示的是从电极反应开始到200秒后的电流值I。
<其他>
样品形状:直径dsp=200μm球状
电极(电极面)形状:直径del=20μm圆状
电极位置:设定为电极面中心坐标与样品中心左右(x,y)的水平距离为0
电极面与样品的下端的距离z:0-80μm。
对由样品生成的化学物质的氧化还原反应得到的电流值I随着电极与样品下端的距离z以何种方式变化进行研究。在图1中示出表示电流值I与距离z的关系的模拟结果。
根据结果可知,电流值I描绘在z=16μm具有峰值的山形曲线。由此判定,如果将样品设置在能够得到峰值电流值的最佳距离,则与距离z=0μm时相比能够使测定的灵敏度大幅提高。这样的z的倾向在使电极直径del和样品直径dsp变化时也是同样的。
另外,如果z在上述最佳距离附近,可知在z上下波动的情况下的电流值I的波动与z=0μm时相比大幅减小。在以细胞、细胞团、组织片等为样品的情况下,由于样品表面的凹凸的影响和样品形状不一定为球形,难以以数μm的精度对z进行控制。然而,如果如上所述地将所述z设定在最佳距离附近,则能够降低由z的控制性低引起的电流值I的不均,其结果是能够使测定的相对定量性和再现性提高。
该相对定量性和再现性提高的效果在z越接近最佳距离时越好,尤其是在电流值为峰值电流值的90%以上的z的范围内最为显著。因此可知,将z设定为该范围内的值,关系到灵敏度的提高以及相对定量性和再现性的提高,能够得到好的效果。
在这里,根据各种进行模拟的结果可知,上述效果的z的范围随着测定条件、尤其是电极直径和样品直径大幅变化。因此,为了对具有特定直径的样品进行评价,需要提供具有适当直径的电极和适当的z。
然而,在样品为细胞、细胞团、组织片等生物样品的情况下,其直径取决于构成细胞的种类、状态而有很大差异。另外,即使在从同一被检测体的同一部分提取的情况下或者通过同一培养条件而得到的情况下,样品之间的直径存在数μm至数百μm的偏差。在测定前调查所有这样的样品的直径、设定与其匹配的的电极直径和z从成本方面考虑是不现实的。并且,由不同的电极直径、z所得到的测定结果彼此之间难以定量地进行比较。
为了解决这些问题,相对于直径在常识范围内为各种值的所有样品,求出能够提供本发明的高的效果的电极直径和z的范围,由此利用同一结构的电化学测定装置对各种样品进行测定是有效的。
于是,在本发明中,相对于被称为能够更准确地再现生物体内的生理活性的细胞团样品,求出即使其直径在一般使用的100-600μm的范围内变化,仍然能够得到高灵敏度、相对的定量性以及及再现性提高的效果的电极直径和z的范围。以下,对该顺序进行说明。
首先,在电极直径del为20μm时,利用样品直径dsp对有效的z的范围的下限值zmin和上限值zmax如何变化进行研究。图2表示其模拟结果。在del为20μm时,相对于各dsp,如果z为图2所示的zmin以上zmax以下,则能够提供电流值I为峰值电流值的90%以上的效果(zopt为得到峰值电流值的z的最佳距离)。另外,在以dsp为100μm时的zmax为zmax *、dsp为600μm时的zmin为zmin *时,即使dsp为100-600μm之间的任何值,只要z在以zmin *、zmax *为下限值、上限值的图2中斜线所示的范围内,能够提供电流值I为峰值电流值的90%以上的效果。
接着,通过del对该zmin *和zmax *如何变化进行研究。在图3中表示其模拟结果。del为0-80μm范围内的任何值,只要z在图3所示的zmin *以上zmax *以下的范围内,就能够相对于dsp=100-600μm的样品提供本发明的好的效果。通过使用非线性最小二乘法的拟合操作,该范围作为del的函数大致以下式(4)表示。
[计算式6]
因此,z设定在式(4)所示的范围即可。其中,z>0。
需要说明的是,由图3可知,上述式(4)在电极直径del为约80μm以上时不能使用。然而,在以细胞等微小的样品为对象的电化学测定中,一般使用del=50μm以下的电极。这是由于,电流值的S/N比(由检测对象的化学物质的氧化还原反应产生的法拉第电流与由非检测对象即电解质产生的充电电流的比)在del=50μm以下的电极中有意地增大。因此,上述式(4)虽然在电极直径del为约80μm以上时不能使用,但没有问题。
除了电极直径del、样品直径dsp之外,有效的z的范围也会根据样品的化学物质的生成速度v、化学物质的扩散系数D而变化,但其影响是有限的。
在基质浓度[S]充分高的情况下,由式(1)可知,v大致由基质浓度无限大时的反应速度Vmax决定。于是,对有效的z的范围根据Vmax如何变化进行调查。图4表示各种Vmax、z时的电流值I的模拟结果。在这里,曲线图的纵轴是由Vmax标定的I。根据图4,即使Vmax发生变化,由Vmax标定的I与z的关系几乎不发生变化,由此可知有效的z的范围几乎不发生变化。
同样,对有效的z的范围根据D如何变化进行了调查。图5表示各种D、z时I的模拟结果。PAP、铁络合物、钌络合物、过氧化氢等在医疗、生命科学中使用的一般的检测对象的化学物质的D的值大概处于1-20×10-10m2/s的范围,但根据图5可知,即使D在该范围内发生变化,I与z的关系性几乎不发生变化,因此有效的z的范围几乎不发生变化。
根据这些结果可知,相对于直径100-600μm的样品,为了提供本发明的高的效果而应满足的表示z与del的关系性的式(4)在具有各种v、D的测定***中也同样是有效的。
基于以上所说明的模拟结果,在该发明中,在使用具备与化学物质发生电子转移而使氧化还原反应发生且具有80μm以下的径尺寸(直径)del的电极面的工作电极,通过电化学方式对溶液中的、具有100μm以上600μm以下的径尺寸(直径)的生物样品中生成或消耗的化学物质进行测定的电化学测定方法中,在溶液中设置具有相对于电极面的垂直的方向距离h1满足式(4)所示的z的范围的轮廓面、在轮廓面的电极面侧的区域阻止生物样品侵入、容许溶液中的溶质扩散的隔片,以使生物样品沿着隔片的轮廓面的状态执行测定。
图6表示隔片10包含一组柱状构造物11的例子,具有均一的高度的柱状构造物11在形成有工作电极21的基板20上沿相对于工作电极21的电极面21a垂直的方向延伸,以小于100μm的间隔林立。图6中,虚线表示垂直方向距离h1的轮廓面。另外,附图标记30表示生物样品。
通过进行显微镜下的移送操作或使用引导工具等,以工作电极21与生物样品30的水平距离(相对于电极面21a平行的方向的距离)为0的方式将生物样品30设置在工作电极21的上方,即使不另外进行其他特别的操作,也能够将工作电极21与生物样品30的下端的垂直距离z控制在前述式(4)的范围。由此,由于在生物样品30与工作电极21之间形成用于供给溶液中的溶质的扩散路径,其结果是由生物样品30生成的检测对象的化学物质的量增加。另外,由于生物样品30与工作电极21之间的空间体积增加,因此所生成的化学物质中、滞留在该空间内的量增加。这两个作用有助于到达工作电极21的化学物质的量的增加。
另一方面,由于隔片10,生物样品30与工作电极21之间的扩散行程变长,因此认为不到达工作电极21而逸散到远方的化学物质的量增加。然而,利用隔片10将距离h1控制在适当的范围,因此前述两个作用成为优势,认为最终到达工作电极21的化学物质的量增加。
以上,对使用在平面内高度均一的隔片的情况下的效果进行了说明,
但隔片的高度不需要在电极面所处的平面上的所有区域均一,可以存在低的区域和高的区域、或者高度阶段性地变化的区域。
例如,可以成为位于电极面的中心的隔片的高度最低、随着从电极面的中心向外周方向而逐渐变高的研钵型构造。在具备这样的隔片的工作电极上,利用移液管等将细胞等比溶液比重高的生物样品展开,不使用任何特别的机构就能够使生物样品利用自重落入隔片最低的位置、即电极面的中心。由此,对于相对于电极面的生物样品的位置关系,不仅是垂直方向的距离,也能够控制水平方向的距离。
另外,此时,适当地设定从电极面所处的平面上的某一地点到电极面的中心的水平距离(相对于电极面平行的方向的距离)m与该地点处的隔片的高度关系,即使样品直径dsp是100-600μm范围内的任何值,都能够将z控制为通过上述模拟求出的有效的z的范围。
图7例示的是这样的研钵型构造的隔片40,在图7中研钵型构造的隔片40包含高度依次变化的一组柱状构造物41。柱状构造物41在形成有工作电极21的基板20上沿相对于工作电极21的电极面21a垂直的方向延伸,以小于100μm的间隔林立。
在图7中表示的是直径dsp为大小两个值的生物样品30,在上述100-600μm范围内适当地选择数个点,拟合在将各生物样品配置在与这些各dsp对应的式(4)的z的中央值的高度的情况下与所有生物样品的外形外接的曲线、即图7中以虚线所示的h2,大致成为以下式(5)的中央值。
h2=√{(1.05del+6.89)m}-0.48del-2.38±5[μm]…(5)
即,在溶液中设置具有取决于在相对于电极面平行的方向上与工作电极的电极面的中心的距离m、相对于电极面垂直的方向的距离h2满足式(5)的、描绘研钵型的形状的轮廓面,并且在轮廓面的电极面侧的区域阻止生物样品侵入、容许溶液中的溶质扩散的隔片,在使生物样品沿着隔片的轮廓面位于电极面中心的正上方状态下进行电化学测定。
在设置生物样品30时,即使不进行任何特别的操作,也能够使生物样品30利用自重落入研钵型的隔片40的凹部。此时,工作电极21与生物样品30的相对于电极面21a平行的方向的距离m为0。需要说明的是,由于生物样品30与隔片40相接触的位置随着样品直径dsp变化,因此工作电极21与生物样品30的下端的距离z随着dsp变化。
该图7所示的结构与图6所示的结构相同,在生物样品30与工作电极21之间形成有用于供给溶液中的溶质的扩散路径,因此由生物样品30生成的检测对象的化学物质的量增加。另外,由于生物样品30与工作电极21之间的空间体积增加,因此所生成的化学物质中滞留在该空间内的量增加。这两个作用有助于到达工作电极21的化学物质的量的增加。
另一方面,由于隔片40,生物样品30与工作电极21之间的扩散行程变长,因此认为不到达工作电极21而逸散到远方的化学物质的量增加。然而,由于利用研钵型的隔片40将距离h2控制为适当的范围,因此前述两个作用成为优势,认为最终到达工作电极21的化学物质的量增加。
如上所述,隔片包含一组柱状构造物,但不限于此,例如可以使用具有无数个小于100μm的孔径的孔的多孔质状构造体作为隔片。
·发明必要构成的具体例
只要满足生物样品所生成或消耗的化学物质自身具有电化学活性、或者变换为具有电化学活性的其他化学物质的条件,则生物样品、利用生物样品生成或消耗检测对象的化学物质的机构、工作电极和形成有工作电极的基板等为任何结构都能够实现上述效果。例如考虑以下所示的结构。
<生物样品>
在模拟中选择由鼠ES细胞形成的胚状体,但也可以选择其他细胞团、单一细胞、组织片、微生物或含有生物关联物质的非生物样品等。
<利用生物样品生成或消耗化学物质的机构>
在模拟中选择了利用样品上的ALP酶促反应的生成机构,但也可以选择利用其他蛋白质、肽、RNA等的酶促反应或样品上的白金薄膜、氧化钛薄膜等的触媒反应等来生成或消耗等。
另外,在样品为细胞等的情况下,该化学物质可以是经过细胞内的各种代谢路径和信号传递路径而生成或消耗的物质。例如,为糖酵解的代谢路径中放出的质子和神经细胞放出的多巴胺等。
<工作电极>
在模拟中没有特别地指定其材料,但只要是金、白金等贵金属,或者石墨、添加了杂质的金刚石、碳纳米管等以碳元素为主体的无机物,或者聚吡咯、聚苯胺、聚噻吩等导电性高分子等能够用于电化学测定的工作电极即可。
工作电极的电极面的形状不限于圆形,还可以是椭圆形、多边形等。在圆形之外的情况下,在该发明中规定的径尺寸del为从形状中心的直径尺寸的一周的平均值。
<工作电极形成基板>
在模拟中没有特别地指定其材料,但可以是石英、玻璃、硅、其他陶瓷等能够用于电化学测定的工作电极支撑体的材料。
·隔片构筑法的具体例
为了得到本发明的高的效果,应当通过能够以μm水平控制高度的手法来构筑隔片。并且,隔片需要具有溶液渗透性、即容许溶液中的溶质扩散,另外与电极上接触而构筑的情况下需要具有绝缘性。只要满足这些条件,无论隔片的构筑手法、材料如何,都能够得到目的效果。以下,对认为合适的隔片的构筑手法及其材料进行举例说明。
<成膜→保护层图案形成→通过蚀刻构筑包含一组柱状构造物的隔片>
1)在基板上形成膜厚由CVD控制且均一的氮化硅膜;
2)在氮化硅膜上通过照相平版印刷法对蚀刻保护层进行图案形成;
3)通过反应离子蚀刻对未被保护层覆盖的区域的氮化硅膜进行蚀刻,构筑柱状构造物;
4)除去保护层。
绝缘膜材料(柱状构造物的构成材料)除了氮化硅之外,还可以是氧化硅、氧化钛等。
成膜手法除了CVD之外,还可以是溅射淀积、蒸镀等真空成膜手法或形成自旋玻璃态等。
保护层的图案形成手法除了照相平版印刷法之外,还可以是丝网印刷法、喷墨法等。
蚀刻手法除了反应离子蚀刻之外,还可以是等离子蚀刻、溅射蚀刻、离子束蚀刻或湿法腐蚀。
<由感光性树脂通过构造体图案形成来构筑包含一组柱状构造物的隔片>
1)在具有电流检测元件的LSI上通过旋压覆盖来涂覆感光性树脂;
2)通过照相平板印刷法来构筑柱状构造物。
感光性树脂只要是能够在一般的照相平板印刷中使用的具有绝缘性、感光性的树脂即可,为了得到所需的分解能应选择感光性树脂。从柱状构造物的化学稳定性的观点出发,认为作为底片型的永久保护涂层而使用的环氧树脂类化学放大型感光树脂是合适的。
涂覆手法只要是能够以μm指令对膜厚进行控制的手法即可。从膜厚的控制性的高低的观点出发,认为旋压涂覆、喷涂涂覆是合适的,但也可以是浸渍涂覆、丝网涂覆、辊式涂覆等。
<通过凝胶涂覆来构筑包含多孔质状构造体的隔片>
1)调制琼脂的水稀释液,将其加热至80℃以上而溶胶化。
2)在成为80℃的基板上,滴下上述凝胶水溶液,通过旋压涂覆形成薄膜。此时,将基板的温度一直保持在80℃以上。
3)放置基板使其冷却至室温,得到琼脂凝胶的多孔质状隔片。
滴落到基板上的溶胶只要在旋压涂覆后成为多孔质状的凝胶即可,并且加热温度也应根据其种类适当地进行选择。从调制的简易性和生物相容性的高低出发,优选为琼脂、聚乙烯醇、纤维素等。
涂覆手法只要是能够以μm指令对膜厚进行控制并且具有在涂覆操作中将溶胶的温度保持为一定的机构的手法即可。从膜厚的控制性的高低的观点出发,认为旋压涂覆、喷涂涂覆是合适的,但也可以是浸渍涂覆、丝网涂覆、辊式涂覆等。
<其他>
包含柱状构造物的隔片除此之外还可以通过纳米压印、嵌套成型等成型,丝网印刷、喷墨印刷等印刷、机械加工等来构筑。并且,包含多孔质状构造体的隔片除此之外还可以通过将预先成型的多孔质二氧化硅、硝化纤维素膜等多孔质体设置在基板上而得到。
·包含柱状构造物的隔片的规格
在使用一组柱状构造物作为隔片的情况下,其间隔、形状应按照以下方式决定。
<间隔>
虽然使间隔小于100μm,但从为了得到更高的灵敏度、使柱状构造物对生物样品周边的溶质的扩散阻碍最小化的观点出发,柱状构造物的间隔越宽越为优选。
并且,柱状构造物的间隔不需要是均一的,可以存在柱状构造物密集存在的区域、稀疏存在的区域或完全不存在的区域。
例如,仅在电极面的正上方的区域形成柱状构造物,因此在采用生物样品的保持仅由电极面周边的柱状构造物进行的构造的情况下,能够有效地防止生物样品正下方的溶质的扩散受到阻碍,能够得到更高的灵敏度。
<直径>
只要确保能够离开电极面地对生物样品进行保持的强度,则对柱状构造物的直径没有特别的限制。但是,从为了得到更高的灵敏度、使柱状构造物对样品周围的溶质的扩散阻碍最小化的观点出发,柱状构造物的直径越小越为优选。
<上表面形状>
对于柱状构造物的上表面的形状没有特别的限制。圆形、三角形、四边形、其他多边形都能够得到本发明的效果。
并且,柱状构造物的上表面和下表面的形状和面积不需要为同一柱状构造。例如,在制作时可以改变绝缘层的蚀刻条件等而有意使上表面面积减少或使前端变尖。
在生物样品为细胞、组织片等的情况下,由于柱状构造物的顶端变尖而能够减小生物样品与柱状构造物的接触面积和粘接力。该效果能够减小在对生物样品进行测定之后、对生物样品进行回收时剥离生物样品所需的力,因此能够减小对生物样品的损伤,因此优选。
接着,参照图8A、图8B和图9对用于通过电化学方式测定生物样品生成或消耗的化学物质的该发明的传感器的具体结构进行说明。
该传感器成为能够收纳溶液51和浸渍于溶液51中的生物样品的溶液槽50搭载在LSI芯片60上的结构。在溶液槽50的中央形成有孔52,LSI芯片60配置为在该孔52的下端封堵孔52。
LSI芯片60和溶液槽50搭载固定在基板70上,在基板70上形成有用于与进行传感器的控制的外部装置连接的多个配线图案71。在图8B中,附图标记80表示将LSI芯片60与配线图案71连接的接合线。
在LSI芯片60的上表面构成有传感器区域61。在图8A中以阴影线表示传感器区域61,在溶液槽50的底面的孔52的位置划定传感器区域61。虽然省略了详细的图示,但在该例子中在传感器区域61形成有电极(工作电极),进一步在工作电极的上方构筑包含前述一组柱状构造物的隔片。LSI芯片60具备向工作电极施加电压的功能、将工作电极上的反应作为电流值检测而对其进行放大的功能等。
需要说明的是,构成隔片的一组柱状构造物可以为均一的高度,也可以描绘研钵形的轮廓面。另外,可以不由柱状构造物而是由多孔质状构造体来构成隔片。
Claims (11)
1.一种电化学测定方法,通过电化学方式测定溶液中的生物样品所生成或消耗的化学物质,该电化学测定方法的特征在于,
作为已知条件包含与所述化学物质发生电子的转移而使氧化还原反应进行的工作电极的电极面的尺寸和所述生物样品的尺寸,以所述生物样品与所述电极面的相对于所述电极面垂直的方向的距离为变量,基于在所述生物样品中生成或消耗所述化学物质的化学反应的速度、所述溶液中的所述化学物质的浓度分布的变化和所述电极面上的与所述化学物质发生电子的转移的速度,进行计算出在所述工作电极中流通的电流的模拟,求出包含所述电流达到最大值的点在内、所述电流达到所述最大值的90%以上的大小的所述垂直方向距离的范围,
在所述溶液中使所述生物样品与所述电极面在相对于所述电极面垂直的方向上分开属于所述范围的距离而执行测定。
3.一种电化学测定方法,使用具备与所述化学物质发生电子的转移而使氧化还原反应进行且具有80μm以下的径尺寸del的电极面的工作电极,通过电化学方式测定溶液中的、具有100μm以上600μm以下的径尺寸的生物样品所生成或消耗的化学物质,该电化学测定方法的特征在于,
在所述溶液中设置隔片,所述隔片具有取决于与所述电极面的中心的相对于所述电极面平行的方向的距离m、相对于所述电极面垂直的方向的距离h2满足
描绘研钵型的形状的轮廓面,并且在所述轮廓面的所述电极面侧的区域阻止所述生物样品侵入、容许所述溶液中的溶质扩散,
在使所述生物样品沿着所述隔片的所述轮廓面位于所述电极面的中心的正上方的状态下进行测定。
6.根据权利要求4或5所述的电化学测定装置,
所述隔片包含沿相对于所述电极面垂直的方向延伸、并且以小于100μm的间隔林立的一组柱状构造物。
7.根据权利要求4或5所述的电化学测定装置,其特征在于,
所述隔片包含具有小于100μm的孔径的多孔质状构造体。
10.根据权利要求8或9所述的传感器,
所述隔片包含沿着相对于所述电极面垂直的方向延伸、且以小于100μm的间隔林立的一组柱状构造物。
11.根据权利要求8或9所述的传感器,
所述隔片包含具有小于100μm的孔径的多孔质状构造体。
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