JP2017096785A - Tissue fibrosis screening method and anti-tissue fibrosis agent and functional food - Google Patents

Tissue fibrosis screening method and anti-tissue fibrosis agent and functional food Download PDF

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琳 倉原
Rin Kurahara
琳 倉原
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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a screening method of an anti-tissue fibrosis material via a TRPA1 channel and a screening kit for an anti-tissue fibrosis measurement and to provide an anti-tissue fibrosis agent and a functional food.SOLUTION: A screening method of an anti-tissue fibrosis material comprises: screening of a TRPA1 channel activation material having a TRPA1 channel activation action by using mesenchymal cells to express a TRPA1 channel; and screening of the anti-tissue fibrosis material by suppressing a tissue fibrosis marker while stimulating the acquired TRPA1 channel activation material with a fibrosis cytokine TGF-β1. The anti-tissue fibrosis agent and the functional food according to the present invention contain an alcohol extraction of a rosemary, a sage or a mace as a main ingredient, which is an anti-tissue fibrosis material.SELECTED DRAWING: None

Description

本発明は、組織線維化スクリーニング方法および抗組織線維化薬剤ならびに機能性食品に関するものである。更に詳細には、本発明は、間葉系細胞TRPA1チャネルの活性化を介する組織線維化スクリーニング方法および抗組織線維化薬剤ならびに機能性食品に関するものである。   The present invention relates to a tissue fibrosis screening method, an anti-tissue fibrosis drug, and a functional food. More specifically, the present invention relates to a method for screening tissue fibrosis via an activation of mesenchymal cell TRPA1 channel, an anti-tissue fibrosis drug, and a functional food.

間葉系細胞（主に線維芽細胞や筋線維芽細胞）は臓器線維化の過程で重要な役割を果す。臓器の線維化は肝臓・心臓・肺臓・腎臓・血管・消化管・皮膚など多くの組織に見られる。線維化病変は、放置すれば死の機転をとる重篤な慢性疾患である場合も多いけれども、現在ところ選択的な治療薬は存在しない。   Mesenchymal cells (mainly fibroblasts and myofibroblasts) play an important role in the process of organ fibrosis. Organ fibrosis is found in many tissues such as the liver, heart, lungs, kidneys, blood vessels, gastrointestinal tract, and skin. Although fibrotic lesions are often a serious chronic disease that can be fatal if left untreated, there are currently no selective therapeutic agents.

肝炎に伴う肝硬変で見られる肝臓の線維化には、甘草の抽出成分であるグリチルリチン、膚の瘢痕化・消化管瘢痕狭窄・肺線維症にはステロイドが用いられ、他に肺線維症に用いられるピルフェニドンなど作用ターゲットが不明な抗線維化薬が存在する。しかし、いずれの薬の抗線維化の作用機序は明らかにされておらず、ステロイドの強い副作用が問題となっている。   Glycyrrhizin, an extract component of licorice, is used for liver fibrosis in liver cirrhosis associated with hepatitis. Steroids are used for scarring of the skin, digestive tract scar stenosis, and pulmonary fibrosis. There are antifibrotic drugs with unknown targets such as pirfenidone. However, the antifibrotic mechanism of action of any drug has not been clarified, and the strong side effects of steroids are problematic.

一方、一過性受容器電位(Transient Receptor Potential)イオンチャネルのスーパーファミリーに属する非選択性陽イオンチャネルの一つとしてTRPA1（Transient Receptor Potential Ankyrin 1）チャネルが知られている。   On the other hand, a TRPA1 (Transient Receptor Potential Ankyrin 1) channel is known as one of the non-selective cation channels belonging to the superfamily of transient receptor potential ion channels.

このTRPA1チャネルは、侵害受容ニューロンにおいて低温受容器（17℃）として見出された（非特許文献１）。またTRPA1チャネルは、リガンド依存性イオンチャネルであり、リガンドが結合することにより構造変化を惹起し、その結果チャネルが開口し、カルシウムイオンやナトリウムイオンなどの陽イオンを細胞内に流し、細胞の膜電位を調節する作用を有している。   This TRPA1 channel was found as a cold receptor (17 ° C.) in nociceptive neurons (Non-patent Document 1). The TRPA1 channel is a ligand-gated ion channel that induces a structural change when the ligand binds. As a result, the channel opens, allowing cations such as calcium ions and sodium ions to flow into the cell, and the cell membrane. Has the effect of adjusting the potential.

TRPA1リガンドとしては、例えば、アリルイソチオシアネート（AITC）、シンナムアルデヒド等の刺激性天然物、ホルマリン、アクロレイン等の環境刺激物などが挙げられる。さらにTRPA1チャネルは、冷刺激、細胞内カルシウムイオンなどによっても活性化されることも知られている（非特許文献２）。   Examples of the TRPA1 ligand include stimulating natural products such as allyl isothiocyanate (AITC) and cinnamaldehyde, and environmental stimulating products such as formalin and acrolein. Furthermore, it is known that the TRPA1 channel is also activated by cold stimulation, intracellular calcium ions, and the like (Non-patent Document 2).

またパラベン類やアルカリ剤が配合された化粧料などの外用剤を皮膚に用いた場合、使用者によっては皮膚に不快な刺激を感じることがあるが、かかる不快な刺激にTRPA1チャネルの活性化が関連していることが報告されている（例えば、特許文献１〜４参照）。   In addition, when external preparations such as cosmetics containing parabens and alkaline agents are used on the skin, some users may feel unpleasant irritation to the skin, but activation of the TRPA1 channel is caused by such unpleasant irritation. It is reported that it is related (for example, refer patent documents 1-4).

このようにTRPA1チャネルがパラベン類やアルカリ剤に応答することから、TRPA1チャネルはこれらの化合物による刺激を抑制する物質のスクリーニングに利用することが可能であることが報告されている（非特許文献１、３）。   As described above, since the TRPA1 channel responds to parabens and alkaline agents, it has been reported that the TRPA1 channel can be used for screening for substances that suppress stimulation by these compounds (Non-patent Document 1). 3).

このように様々な物理化学刺激によって活性化されるTRPA1チャネルついて研究の結果、本発明者らはTRPA1チャネルが組織の線維化に深く関与することを見出した（非特許文献４、５）。   As a result of studies on the TRPA1 channel activated by various physicochemical stimuli as described above, the present inventors have found that the TRPA1 channel is deeply involved in tissue fibrosis (Non-patent Documents 4 and 5).

TRPA1チャネルは筋線維芽細胞に多く発現しており、AITCなどTRPA1を活性化する刺激は線維化マーカーを抑制し、抗線維化作用が確認された。また、TRPA1チャネルは細胞外のコラーゲンの濃度の増加によって発現が増し、抗線維化作用を示して自らのコラーゲン産生を抑制することから、コラーゲンのネガティブフィードバック調節因子であることが分かった。   TRPA1 channels are abundantly expressed in myofibroblasts. Stimulations that activate TRPA1 such as AITC suppress fibrosis markers, confirming antifibrotic effects. In addition, the expression of TRPA1 channel is increased by increasing the concentration of extracellular collagen, and it exhibits an antifibrotic effect and suppresses its own collagen production, indicating that it is a negative feedback regulator of collagen.

さらに、これらの知見から、本発明者らは、TRPA1チャネルを活性化する化合物や物質から組織線維化予防・治療に有用な化合物や物質をスクリーニングすることが可能ではないかとの仮説を立てて研究を開始することにした。   Furthermore, from these findings, the present inventors have made a hypothesis that it would be possible to screen compounds and substances useful for the prevention and treatment of tissue fibrosis from compounds and substances that activate the TRPA1 channel. Decided to start.

まず、胃腸の機能回復やイレウス・線維化狭窄の緩和に良く使われる薬であって、乾姜・人参・山椒の乾燥エキスや日局コウイによって構成されている大建中湯という漢方薬は、消化管運動促進や血流増加、ホルモン分泌促進などの効果が報告されている上、その薬効が即効性であることから、この漢方薬は消化管へ直接作用する可能性が強く示されている（非特許文献４）。そこで、大建中湯について粘膜上皮化に発現するこの筋線維芽細胞に対する直接作用を検討した。   First, a medicine that is often used to restore gastrointestinal function and relieve ileus / fibrotic stenosis, a traditional Chinese medicine called Daikenchuto, which consists of dried extract of ginger, carrot, and yam, and JP The effects of promoting vasomotion, increasing blood flow, promoting hormone secretion, etc. have been reported, and their medicinal effects are immediate, indicating that this herbal medicine has the potential to directly affect the gastrointestinal tract (non- Patent Document 4). Accordingly, Daikenchuto was examined for its direct action on myofibroblasts expressed in mucosal epithelialization.

この結果、大建中湯およびその構成薬である乾姜、人参、山椒エキスのエタノール抽出成分においては、TRPA1チャネルは筋線維芽細胞InMyoFib細胞に対し効果を有することが確認された。また、大建中湯や生姜、山椒の抽出成分はTRPA1を介するカルシウム流入を惹起することも確認された。   As a result, it was confirmed that the TRPA1 channel has an effect on myofibroblast InMyoFib cells in Daikenchuto and its constituents, ethanol extract components of pomegranate, carrot and yam extract. It was also confirmed that Daikenchuto, ginger, and yam extract components cause calcium influx via TRPA1.

さらに、大建中湯によるTGF受容体下流の線維化シグナルに対するTRPA1チャネルの影響について検討した結果、大建中湯エキスの濃度に依存してTGF-β1（5 ng/ml, 24 hr）刺激下のSmad-2リン酸化レベルが有意に抑制されることも確認された（非特許文献４）。   Furthermore, as a result of examining the effect of TRPA1 channel on the fibrosis signal downstream of TGF receptor by Daikenchuto, under the stimulation of TGF-β1 (5 ng / ml, 24 hr) depending on the concentration of Daikenchuto extract It was also confirmed that the Smad-2 phosphorylation level was significantly suppressed (Non-patent Document 4).

ところで、自己免疫異常に起因する難治性疾患として、クローン病(CD)や潰瘍性大腸炎(UC)などの炎症性腸疾患(IBD)がある。IBDは、若年で発症し頑固な下痢や便秘を繰り返す経過を辿ることから、長年に亘り生活の質を劣化させる難治性の疾患として問題になっていた。   Incidentally, refractory diseases caused by autoimmune abnormalities include inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn's disease (CD) and ulcerative colitis (UC). IBD has been a problem as an intractable disease that degrades the quality of life for many years because it develops at a young age and traces stubborn diarrhea and constipation.

このIBDの治療法として抗TNFα抗体療法が現在最も注目を浴びている。この抗TNF抗体療法は、IBDの炎症に対しては顕著な効果を奏するが、線維化による腸狭窄という大きな問題が解決されずに残されたままである。   Anti-TNFα antibody therapy is currently receiving the most attention as a treatment method for this IBD. Although this anti-TNF antibody therapy has a remarkable effect on the inflammation of IBD, the major problem of intestinal stenosis due to fibrosis remains unresolved.

そこで、クローン病患者の組織を生検して、非狭窄部位（non-stenosis）と狭窄部位（stenosis）におけるTRPA1およびその他の遺伝子のmRNA発現量をマイクロアレイ解析して比較したところ（図１）、線維化芽細胞や筋線維芽細胞が狭窄部に多く集積していて、それらの細胞の多くで見られるTRPA1、I型コラーゲン、α-SMA（平滑筋型アクチン）、N-CadherinのmRNA発現が線維化狭窄部位で著しく増加していることが確認された（図２）。   Therefore, a biopsy of the tissues of Crohn's disease patients, and the mRNA expression levels of TRPA1 and other genes at the non-stenosis site (non-stenosis) and stenosis site (stenosis) were compared by microarray analysis (FIG. 1). Many fibroblasts and myofibroblasts accumulate in the stenosis, and mRNA expression of TRPA1, type I collagen, α-SMA (smooth muscle actin), and N-cadherin is found in many of these cells. It was confirmed that there was a marked increase at the fibrotic stenosis site (FIG. 2).

さらに、組織の線維化を評価するモデルとして非常に有用である細胞として、消化管筋線維芽細胞（InMyoFib）が知られている。この細胞は、TGF-β1で刺激すると、細胞が敷石状の形態から細長い線維状の形態に変化し（図３）、線維化マーカーの上昇が観察される（Kurahara, L.H., et al. Inflammatory Bowel Diseases, 21(3):496-506, 2015）。この細胞を用いてTGF-β1で刺激したところ、この細胞で最も多く発現するTRPチャネルがTRPA1チャネルであることがマイクロアレイ解析で示唆された（図４）。   Furthermore, gastrointestinal myofibroblasts (InMyoFib) are known as cells that are very useful as models for evaluating tissue fibrosis. When these cells are stimulated with TGF-β1, the cells change from a cobblestone form to an elongated fibrous form (FIG. 3), and an increase in fibrosis markers is observed (Kurahara, LH, et al. Inflammatory Bowel Diseases, 21 (3): 496-506, 2015). When this cell was used to stimulate with TGF-β1, microarray analysis suggested that the TRP channel most expressed in this cell was the TRPA1 channel (FIG. 4).

上記知見から、本発明者らは、TRPA1チャネルが、組織の線維化を評価する１つの有力な指標となりえるとの前提のもとに、本発明を完成するに至った。   From the above findings, the present inventors have completed the present invention on the premise that the TRPA1 channel can be one powerful index for evaluating tissue fibrosis.

特開２００８−７９５２８号公報JP 2008-79528 A 特開２００９−８２０５３号公報JP 2009-82053 A 特開２００９−２２５７３３号公報JP 2009-225733 A 特開２０１１−１４０４７１号公報JP 2011-140471 A

Story et al. 2003, Cell 112, 819-829Story et al. 2003, Cell 112, 819-829 Bandell, M., et al., Neuron, 2004 Mar 25; 41(6):849-57Bandell, M., et al., Neuron, 2004 Mar 25; 41 (6): 849-57 Kwan et al. 2006, Neuron 50, 277-289.Kwan et al. 2006, Neuron 50, 277-289. 倉原（海）琳、住吉美保、青柳邦彦、平石敬三、井上隆司 : 大建中湯の抗線維化・抗狭窄作用における消化管筋線維芽細胞TRPA1の役割 /第67回日本薬理学会西南部会 / 2014年11月 / 北九州Kurahara (Kai), Sumiyoshi Miho, Aoyagi Kunihiko, Hiraishi Keizo, Inoue Takashi: Role of Gastrointestinal Myofibroblast TRPA1 in Antifibrosis and Antistenosis of Daikenchuyu / The 67th Pharmacological Society of Southwest Japan / November 2014 / Kitakyushu 倉原（海）琳、住吉美保、青柳邦彦、平石敬三、井上隆司 : 大建中湯の抗線維化狭窄作用に関わる消化管筋線維芽細胞TRPA1の分子機序 / 第56回日本平滑筋学会総会 / 2014年8月 / 横浜Mura Kurahara, Miho Sumiyoshi, Kunihiko Aoyagi, Keizo Hiraishi, Takashi Inoue: Molecular mechanism of gastrointestinal myofibroblast TRPA1 involved in anti-fibrotic stenosis of Daikenchuyu / The 56th Annual Meeting of the Japanese Society of Smooth Muscle Research / August 2014 / Yokohama

したがって、本発明は、１つの形態として、TRPA1チャネルを発現する間葉系細胞を用いてTRPA1チャネル活性化作用を有するTRPA1チャネル活性化物質をスクリーニングし、得られたTRPA1チャネル活性化物質を線維化サイトカインTGF-β1刺激下で組織線維化マーカーを抑制することにより抗組織線維化物質をスクリーニングすることからなる抗組織線維化物質のスクリーニング方法を提供することを目的とする。   Therefore, the present invention, as one form, screens a TRPA1 channel activator having TRPA1 channel activation action using mesenchymal cells that express the TRPA1 channel, and fibrosis the obtained TRPA1 channel activator. An object of the present invention is to provide a screening method for an anti-tissue fibrosis substance, which comprises screening an anti-tissue fibrosis substance by suppressing a tissue fibrosis marker under stimulation with the cytokine TGF-β1.

本発明は、その別の形態として、TRPA1発現間葉系細胞、TRPA1チャネル活性化測定剤および組織線維化マーカーとしての組織もしくは細胞からなる抗組織線維化測定用スクリーニングキットを提供することを目的とする。   Another object of the present invention is to provide a screening kit for measuring an anti-tissue fibrosis comprising a TRPA1-expressing mesenchymal cell, a TRPA1 channel activation measuring agent, and a tissue or cell as a tissue fibrosis marker. To do.

本発明は、そのさらに別の形態として、TRPA1チャネルを活性化しかつ組織線維化マーカーを抑制する抗組織線維化物質を主成分として含有することからなる抗組織線維化薬剤を提供することを目的とする。   Another object of the present invention is to provide an anti-tissue fibrosis drug comprising, as a main component, an anti-tissue fibrosis substance that activates a TRPA1 channel and suppresses a tissue fibrosis marker. To do.

本発明は、そのさらに別の形態として、TRPA1チャネルを活性化しかつ組織線維化マーカーを抑制する抗組織線維化物質を主成分として含有することからなる抗組織線維化機能性食品を提供することを目的とする。   Another aspect of the present invention is to provide an anti-tissue fibrosis functional food comprising, as a main component, an anti-tissue fibrosis substance that activates a TRPA1 channel and suppresses a tissue fibrosis marker. Objective.

上記目的を達成するために、本発明は、１つの形態として、TRPA1チャネルを発現する間葉系細胞を用いてTRPA1チャネル活性化作用を有するTRPA1チャネル活性化物質をスクリーニングし、得られたTRPA1チャネル活性化物質を線維化サイトカインTGF-β1刺激下で組織線維化マーカーを抑制することにより抗組織線維化物質をスクリーニングすることからなる抗組織線維化物質のスクリーニング方法を提供する。   To achieve the above object, the present invention, as one form, screens a TRPA1 channel activator having a TRPA1 channel activating action using mesenchymal cells that express the TRPA1 channel, and the obtained TRPA1 channel An anti-tissue fibrosis substance screening method comprising screening an anti-tissue fibrosis substance by suppressing a tissue fibrosis marker under stimulation of a fibrosis cytokine TGF-β1 with an activator.

本発明は、別の形態として、TRPA1発現間葉系細胞と、線維化サイトカインTGF-β1を含む構成からなる抗組織線維化測定用スクリーニングキットを提供する。   As another embodiment, the present invention provides a screening kit for measuring anti-fibrotic fibrosis comprising a composition containing TRPA1-expressing mesenchymal cells and fibrotic cytokine TGF-β1.

本発明は、さらに別の形態として、TRPA1チャネルを活性化しかつ組織線維化マーカーを抑制する抗組織線維化物質を主成分として含有することからなる抗組織線維化薬剤を提供する。   As yet another embodiment, the present invention provides an anti-tissue fibrosis drug comprising, as a main component, an anti-tissue fibrosis substance that activates TRPA1 channels and suppresses tissue fibrosis markers.

本発明は、さらに別の形態として、TRPA1チャネルを活性化しかつ組織線維化マーカーを抑制する抗組織線維化物質を主成分として含有することからなる抗組織線維化機能性食品を提供する。   As yet another embodiment, the present invention provides an anti-tissue fibrosis functional food comprising an anti-tissue fibrosis substance that activates a TRPA1 channel and suppresses a tissue fibrosis marker as a main component.

本発明に係る抗組織線維化物質のスクリーニング方法および抗組織線維化測定用スクリーニングキットは、任意の物質からTRPA1チャネル活性化方法によりTRPA1チャネル活性化物質を選択し、選択したTRPA1チャネル活性化物質から線維化サイトカインTGF-β1刺激下で組織線維化マーカーを抑制する抗組織線維化物質をスクリーニングすることができ、得られた抗組織線維化物質は、抗組織線維化薬剤または抗組織線維化機能性食品として有用である。   The screening method for anti-tissue fibrosis substance and the screening kit for measuring anti-tissue fibrosis according to the present invention select a TRPA1 channel activator from any substance by the TRPA1 channel activation method, and select from the selected TRPA1 channel activator. Anti-tissue fibrosis substance that suppresses tissue fibrosis marker under the stimulation of fibrosis cytokine TGF-β1 can be screened, and the obtained anti-tissue fibrosis substance is an anti-tissue fibrosis drug or anti-tissue fibrosis functionality Useful as food.

図１は、クローン病患者の炎症組織部位の非狭窄部位（non-stenosis）（左側）と狭窄部位（stenosis）（右側）を示す図である。（参考例１）FIG. 1 is a diagram showing a non-stenosis site (left side) and a stenosis site (right side) of an inflammatory tissue site of a Crohn's disease patient. (Reference Example 1) 図２は、非狭窄部位と狭窄部位におけるTRPA1、MYOCD（Myocardin）、I型コラーゲン、α-SMA（平滑筋型アクチン）、およびN-CadherinのmRNA発現をそれぞれ示すグラフである。（参考例１）FIG. 2 is a graph showing the mRNA expression of TRPA1, MYOCD (Myocardin), type I collagen, α-SMA (smooth muscle actin), and N-Cadherin at the non-stenotic site and the stenotic site, respectively. (Reference Example 1) 図３は、消化器筋線維芽細胞（InMyoFib）をTGF-β1で刺激した状態と未刺激状態を示す細胞染色図である。（参考例２）FIG. 3 is a cell staining diagram showing a state in which digestive organ myofibroblasts (InMyoFib) are stimulated with TGF-β1 and an unstimulated state. (Reference Example 2) 図４は、筋線維芽細胞（InMyoFib）におけるTRPAファミリーのmRNAの定量化発現量を比較したマイクロアレイ解析結果を示す図である。（参考例２）FIG. 4 shows the results of microarray analysis comparing the quantified expression levels of TRPA family mRNA in myofibroblasts (InMyoFib). (Reference Example 2) 図５は、筋線維芽細胞（InMyoFib）を用いたカルシウムイメージング及びパッチクランプの結果を説明する図である。（参考例３）FIG. 5 is a diagram for explaining the results of calcium imaging and patch clamping using myofibroblasts (InMyoFib). (Reference Example 3) 図６は、TRPA1siを導入した筋線維芽細胞（InMyoFib）を用いたTRPA1siRNA干渉実験を説明する図である。（参考例４）FIG. 6 is a diagram for explaining a TRPA1 siRNA interference experiment using myofibroblasts (InMyoFib) into which TRPA1si has been introduced. (Reference Example 4) 図７は、TRPA1チャネルがTGF-β1下流のリン酸化シグナルに対して抑制的であることを示唆している図である。（参考例５）FIG. 7 is a diagram suggesting that TRPA1 channel is suppressive to phosphorylation signal downstream of TGF-β1. (Reference Example 5) 図８は、TRPA1やI型コラーゲンのタンパク質発現を示す免疫プロット図（左図）とそれを定量化した図（右図）である。（参考例６）FIG. 8 is an immunoplot diagram (left diagram) showing protein expression of TRPA1 and type I collagen and a diagram (right diagram) quantifying it. (Reference Example 6) 図９は、筋線維芽細胞（InMyoFib）にコラーゲンを添加した場合、組織線維化マーカーであるI型コラーゲン（COL1A1）、α-SMA（ACTA2）、N-カドヘリン（CDH2）ならびに線維化マスター転写因子MYOCA（Myocardin）の発現が抑制されるが、TRPA1siRNAで前処理した細胞ではこのような抑制作用が認められないことを示す図である。（参考例７）FIG. 9 shows that when collagen is added to myofibroblasts (InMyoFib), tissue fibrosis markers, type I collagen (COL1A1), α-SMA (ACTA2), N-cadherin (CDH2), and fibrosis master transcription factor It is a figure which shows that although the expression of MYOCA (Myocardin) is suppressed, such a suppressive effect is not recognized in the cell pre-treated with TRPA1 siRNA. (Reference Example 7) 図１０は、ローズマリーのエタノール抽出液の1000倍希釈を用いたカルシウム（Ca2+）イメージング実験の結果を示す図である。（実施例１）FIG. 10 shows the results of a calcium (Ca 2+ ) imaging experiment using a 1000-fold dilution of rosemary ethanol extract. Example 1 図１１は、ローズマリーのエタノール抽出液の希釈液を用いた線維化マーカーの定量PCR実験の結果を説明するグラフである。（実施例１）FIG. 11 is a graph illustrating the results of a quantitative PCR experiment for fibrosis markers using a diluted solution of rosemary ethanol extract. (Example 1) 図１２は、セージのエタノール抽出液の希釈液を用いたカルシウム（Ca2+）イメージング実験の結果を説明するグラフである。（実施例２）FIG. 12 is a graph illustrating the results of a calcium (Ca 2+ ) imaging experiment using a diluted solution of an ethanol extract of sage. (Example 2) 図１３は、メースのエタノール抽出液の希釈液を用いた線維化マーカーの定量PCR実験の結果を説明するグラフである。（実施例３）FIG. 13: is a graph explaining the result of the quantitative PCR experiment of the fibrosis marker using the dilution liquid of the ethanol extract of Mace. Example 3 図１４は、甘草（リコリス）のエタノール抽出液が筋線維芽細胞（InMyoFib）においてTRPA1チャネルを活性化することを説明するカルシウム（Ca2+）イメージング実験の結果図である。（実施例４）FIG. 14 is a result of a calcium (Ca 2+ ) imaging experiment explaining that an ethanol extract of licorice (licorice) activates the TRPA1 channel in myofibroblasts (InMyoFib). Example 4 図１５は、甘草（リコリス）のエタノール抽出液が線維化マーカーα-SMA発現を濃度依存的に抑制することを説明する図である。（実施例４）FIG. 15 is a diagram for explaining that an ethanol extract of licorice (licorice) suppresses fibrosis marker α-SMA expression in a concentration-dependent manner. Example 4 図１６は、グリチルレチン酸が筋線維芽細胞（InMyoFib）においてTRPA1チャネルを活性化して、線維化マーカーを抑制する定量PCR実験の結果を説明するすることを説明する図である。（実施例５）FIG. 16 is a diagram for explaining the results of a quantitative PCR experiment in which glycyrrhetinic acid activates a TRPA1 channel in myofibroblasts (InMyoFib) and suppresses fibrosis markers. (Example 5) 図１７は、グリチルリチンが筋線維芽細胞（InMyoFib）においてTRPA1チャネルを活性化することを説明する図である。（実施例６）FIG. 17 is a diagram illustrating that glycyrrhizin activates the TRPA1 channel in myofibroblasts (InMyoFib). (Example 6) 図１８は、プレドニゾロンが筋線維芽細胞（InMyoFib）においてTRPA1チャネルを活性化することを説明する図である。（実施例７）FIG. 18 is a diagram illustrating that prednisolone activates a TRPA1 channel in myofibroblasts (InMyoFib). (Example 7) 図１９は、ビルフェニドンが筋線維芽細胞（InMyoFib）においてTRPA1チャネルを活性化することを説明する図である。（実施例８）FIG. 19 is a diagram illustrating that bilfenidone activates TRPA1 channels in myofibroblasts (InMyoFib). (Example 8)

本発明に係る抗組織線維化物質のスクリーニング方法は、TRPA1チャネルを発現する間葉系細胞を用いてTRPA1チャネル活性化作用を有するTRPA1チャネル活性化物質をスクリーニングし、得られたTRPA1チャネル活性化物質を線維化サイトカインTGF-β1刺激下で組織線維化マーカーを抑制することにより抗組織線維化物質をスクリーニングすることからなる。   The screening method for an anti-tissue fibrosis substance according to the present invention comprises screening a TRPA1 channel activator having a TRPA1 channel activation action using a mesenchymal cell expressing a TRPA1 channel, and the obtained TRPA1 channel activator Screening for anti-tissue fibrosis substances by inhibiting tissue fibrosis markers under stimulation of the fibrotic cytokine TGF-β1.

本明細書において使用する用語「TRPA1チャネル」は、前述したように、一過性受容器電位(Transient Receptor Potential)イオンチャネルのスーパーファミリーに属する非選択性陽イオンチャネルの一つを意味する。   As used herein, the term “TRPA1 channel” refers to one of the non-selective cation channels belonging to the superfamily of transient receptor potential ion channels, as described above.

本明細書における用語「TRPA1チャネル活性化」は、ある物質がTRPA1チャネル活性化方法によりTRPA1チャネルが活性化される現象と、TRPA1チャネルが活性化された現象の両者を意味して使用されるが、どちらの意味に該当するかは通常文面によって解釈することができる。   In this specification, the term “TRPA1 channel activation” is used to mean both a phenomenon in which a TRPA1 channel is activated by a TRPA1 channel activation method and a phenomenon in which a TRPA1 channel is activated. Which meaning is applicable can usually be interpreted by text.

本明細書において使用する用語「物質」は、本発明によってTRPA1チャネルが活性化されるもしくは活性化される物質、例えば原料植物の乾燥物もしくはその抽出物などの物質ばかりではなく、TRPA1チャネルが活性化されるもしくは活性化される化合物自体をも意味している。つまり、本発明においては、特段の定めがない限りまた文面から一般的には、かかる物質ならびに化合物を包含して一括して単に「物質」という。したがって、用語「TRPA1チャネルが活性化物質」は、TRPA1チャネルが活性化されるもしくは活性化される原料植物などの物質ならびにTRPA1チャネルが活性化されるもしくは活性化される化合物自体をも意味している。   As used herein, the term “substance” refers to a substance in which the TRPA1 channel is activated or activated according to the present invention, for example, a substance such as a dried plant material or an extract thereof, as well as an active TRPA1 channel. It also means the compound itself to be activated or activated. In other words, in the present invention, unless otherwise specified, and generally in terms of text, such substances and compounds are collectively referred to simply as “substances”. Therefore, the term “TRPA1 channel activated substance” also means a substance such as a plant plant in which the TRPA1 channel is activated or activated as well as the compound itself in which the TRPA1 channel is activated or activated. Yes.

したがって、本発明に係る抗組織線維化物質のスクリーニング方法に供することができる物質は、特定の物質に限定されるものではなく、TRPA1チャネル活性化される物質であればいずれでも使用することができる。本発明において、スクリーニング法自体も、また物質がTRPA1チャネル活性化されるかどうかも、当該技術分野で慣用されている手法に従って測定することができる。   Therefore, the substance that can be used in the screening method for an anti-tissue fibrosis substance according to the present invention is not limited to a specific substance, and any substance that can activate a TRPA1 channel can be used. . In the present invention, both the screening method itself and whether or not a substance is activated by the TRPA1 channel can be measured according to a method commonly used in the art.

本発明において使用される原料植物としては、成分としてTRPA1チャネル活性化化合物を含有する植物であれば特に限定されるものではなく、例えば、ローズマリー、セージ、メース、甘草、乾姜、山椒などが挙げられる。また植物といっても、その部位も特に限定されるものではなく、例えば、葉部、茎部、枝部、根部、花部、芽部、種子などであってもよい。   The raw material plant used in the present invention is not particularly limited as long as it contains a TRPA1 channel activating compound as a component, and examples thereof include rosemary, sage, mace, licorice, psoriasis, yam, and the like. Can be mentioned. Moreover, even if it says a plant, the site | part is not specifically limited, For example, a leaf part, a stem part, a branch part, a root part, a flower part, a bud part, a seed, etc. may be sufficient.

本発明に使用される原料植物などの物質の乾燥物とは、原料植物などの物質を乾燥したものであって、具体的には、天日乾燥、加熱乾燥、フリーズドライなどの公知の乾燥方法で乾燥したものである。かかる乾燥物は、通常、粉砕して粉末化され、乾燥粉末として使用するのがよい。   The dried material of a material such as a raw material plant used in the present invention is a material obtained by drying a material such as a raw material plant, and specifically, a known drying method such as sun drying, heat drying or freeze drying. And dried. Such a dried product is usually pulverized into powder and used as a dry powder.

本発明に使用される原料植物などの物質の抽出物とは、原料植物などの物質を、必要に応じて乾燥、細切し、抽出溶媒を用いて抽出することにより得られるものを意味する。本発明にいて原料植物などから抽出物を抽出する方法は特に限定されず、常法に従って行なうことができる。例えば、原料植物を抽出溶媒に浸漬し、室温あるいは加熱して原料植物に含まれる可溶性成分を抽出する方法が挙げられる。このように溶媒抽出によって得られた抽出液はそのまま利用してもよいが、常法に従って希釈、濃縮、乾燥、精製などの処理を施してもよい。したがって、本発明でいう「抽出物」は、抽出液をそのまま利用する溶媒抽出物、またかかる溶媒抽出物を希釈液で希釈した希釈物もしくはかかる溶媒抽出物を濃縮した濃縮物もしくはかかる溶媒抽出物、希釈物、濃縮物などをフリーズドライした乾燥物をも包含している。   The extract of a substance such as a raw material plant used in the present invention means a substance obtained by drying, chopping a substance such as a raw material plant, if necessary, and using an extraction solvent. In the present invention, a method for extracting an extract from a raw plant or the like is not particularly limited, and can be performed according to a conventional method. For example, the raw material plant is immersed in an extraction solvent, and the method of extracting the soluble component contained in a raw material plant by heating at room temperature or is mentioned. Thus, the extract obtained by solvent extraction may be used as it is, but may be subjected to treatments such as dilution, concentration, drying, and purification according to a conventional method. Therefore, the “extract” as used in the present invention is a solvent extract using the extract as it is, a diluted product obtained by diluting the solvent extract with a diluent, a concentrated product obtained by diluting the solvent extract, or a solvent extract. In addition, a dry product obtained by freeze-drying a dilution, a concentrate and the like is also included.

本発明において、物質の抽出に使用する抽出溶媒としては、例えば、水、エタノール、プロパノール等のアルコールなどが挙げられる。これらの抽出溶媒は単独またはこれら２種以上の混合物として使用することができる。これらの抽出溶媒のうち、エタノールと水の混合溶媒が、抽出効率が高くかつヒトに対して安全なことから好ましい。   In the present invention, examples of the extraction solvent used for the extraction of substances include water, alcohols such as ethanol and propanol. These extraction solvents can be used alone or as a mixture of two or more thereof. Of these extraction solvents, a mixed solvent of ethanol and water is preferable because of its high extraction efficiency and safety for humans.

本発明におけるTRPA1チャネル活性化化合物の例としては、グリセルリチン、グリチルレチン酸、プレドニゾロンやメチルプレドニゾロン等のステロイド、抗線維化薬ピルフェニドンなどが挙げられる。   Examples of the TRPA1 channel activating compound in the present invention include glycerritin, glycyrrhetinic acid, steroids such as prednisolone and methylprednisolone, and the antifibrotic drug pirfenidone.

本発明のTRPA1チャネル活性化物質は、TRPA1発現細胞において、線維化サイトカインTGF-β1刺激下で組織線維化マーカーを抑制するかどうかがスクリーニングされる。   The TRPA1 channel activator of the present invention is screened for whether or not it suppresses a tissue fibrosis marker in TRPA1-expressing cells under stimulation of the fibrotic cytokine TGF-β1.

本発明において使用することができるTRPA1チャネルを発現する間葉系細胞としては、TRPA1チャネルが機能的に作用する細胞であれば特に限定されるものではなく、例えば、線維芽細胞や筋線維芽細胞などが挙げられる。またかかる細胞の由来も特に限定されるものではなく、例えば、大腸等の消化器、心臓、角膜、肺臓などの組織由来のものがよいが、消化器由来の間葉系細胞、特に筋線維芽細胞（InMyoFib）が好ましい。   The mesenchymal cells that express the TRPA1 channel that can be used in the present invention are not particularly limited as long as the TRPA1 channel functions functionally. For example, fibroblasts and myofibroblasts Etc. In addition, the origin of such cells is not particularly limited, and for example, those derived from tissues such as digestive organs such as the large intestine, heart, cornea, and lungs are preferable, but mesenchymal cells derived from digestive organs, particularly myofibroblasts. Cells (InMyoFib) are preferred.

なお、筋線維芽細胞（InMyoFib）においてTRPA1チャネルが機能的に作用することは確認している。つまり、筋線維芽細胞におけるカルシウムイメージングの結果から、TRPA1チャネルアゴニスト（アリルイソチオシアネート：AITC）がカルシウムイオン（Ca2+）流入を大きく促進し、そのカルシウムイオン流入が、TRPA1特異的なブロッカーによって有意に抑制される（図５の上段左図）と共に、またTRPA1のRNA干渉実験（図５の下段左図）によっても有意に抑制されることが示された。また、パッチクランプのデータから、筋線維芽細胞において、TRPA1チャネルアゴニストはTRPA1の性質を持つ電流を活性化し、その電流はTRPA1特異的なブロッカーHによって有意に抑制されることが分かった（それぞれ図５の上段ならびに下段の右図）。これらの結果から、筋線維芽細胞（InMyoFib）においてTRPA1チャネルは機能的に作用することを確認することができる。 It has been confirmed that TRPA1 channels function in myofibroblasts (InMyoFib). In other words, from the results of calcium imaging in myofibroblasts, TRPA1 channel agonist (allyl isothiocyanate: AITC) greatly promotes calcium ion (Ca 2+ ) influx, which is significantly affected by TRPA1-specific blockers (FIG. 5 upper left diagram) and also TRPA1 RNA interference experiment (lower left diagram in FIG. 5) showed significant inhibition. The patch clamp data also showed that in myofibroblasts, TRPA1 channel agonists activated currents with TRPA1 properties, which were significantly suppressed by TRPA1-specific blocker H (Fig. (5) Upper and lower right figures). From these results, it can be confirmed that TRPA1 channel functions functionally in myofibroblasts (InMyoFib).

さらに、本発明のスクリーニング方法においては、TRPA1チャネル活性化物質が線維化サイトカインTGF-β1刺激下で組織線維化マーカーを抑制するかどうかがスクリーニングされる。本発明において組織の線維化を評価する１つの指標となるのが組織線維化マーカーである。本発明の組織線維化マーカーとしては、例えば、α-SMA（平滑筋型アクチン）、I型コラーゲン、TGF受容体下流のリン酸化シグナル、N-カドヘリンなどが使用することができる。   Furthermore, in the screening method of the present invention, it is screened whether a TRPA1 channel activator suppresses a tissue fibrosis marker under the stimulation of the fibrotic cytokine TGF-β1. In the present invention, one index for evaluating tissue fibrosis is a tissue fibrosis marker. As the tissue fibrosis marker of the present invention, for example, α-SMA (smooth muscle type actin), type I collagen, phosphorylation signal downstream of TGF receptor, N-cadherin and the like can be used.

さらにまた、図６に示すように、TRPA1siを導入した筋線維芽細胞（InMyoFib）を用いたTRPA1siRNA干渉実験において、線維化のマスター転写因子であるMYOCD（Myocardin）の発現が有意に増加し（左図）、また線維化マーカーであるα-SMAとI型コラーゲンのmRNA発現が増加している（右図）のが確認された。これらの結果から、TRPA1チャネルはTGF-β1刺激下流の線維化シグナルに対して抑制的に機能することが分かった。   Furthermore, as shown in FIG. 6, in TRPA1 siRNA interference experiments using TRPA1si-introduced myofibroblasts (InMyoFib), the expression of MYOCD (Myocardin), a master transcription factor for fibrosis, was significantly increased (left). (Fig.), And mRNA expression of α-SMA and type I collagen, which are fibrosis markers, increased (right diagram). From these results, it was found that the TRPA1 channel functions suppressively to the fibrosis signal downstream of TGF-β1 stimulation.

また、一般的に、TGF受容体の下流には多くのリン酸化シグナルが存在し、線維化を促進することが知られている。筋線維芽細胞（InMyoFib）において、TGF-β1下流のSmad-2のリン酸化がTRPA1チャネルのsiRNA導入によって著しく促進され、TRPA1チャネルはTGF-β1下流のリン酸化シグナルに対して抑制的であることが示唆された（図７）。   In general, many phosphorylation signals exist downstream of the TGF receptor, and it is known to promote fibrosis. In myofibroblasts (InMyoFib), Smad-2 phosphorylation downstream of TGF-β1 is markedly promoted by siRNA introduction of TRPA1 channel, and TRPA1 channel is inhibitory to phosphorylation signal downstream of TGF-β1 Was suggested (FIG. 7).

TRPA1は、細胞外のコラーゲンの量の増加に伴って増加し、筋線維芽細胞自体のコラーゲン放出を抑制することから、TRPA1チャネルはコラーゲン産生のネガティブフィードバック調節因子としての役割を持っている（図８）。   TRPA1 increases as the amount of extracellular collagen increases, and suppresses collagen release from the myofibroblast itself. Therefore, TRPA1 channel has a role as a negative feedback regulator of collagen production (Fig. 8).

さらに、筋線維芽細胞（InMyoFib）にコラーゲン添加すると、組織線維化マーカーであるI型コラーゲン（COL1A1）、α-SMA（ACTA2）ならびにN-カドヘリン（CDH2）、また線維化マスター転写因子MYOCA（Myocardin）の発現がTGF刺激の有無に関係なく抑制されるが、TRPA1siRNAで前処理した細胞ではこのような抑制作用は認められなかった（図９）。   Furthermore, when collagen is added to myofibroblasts (InMyoFib), tissue fibrosis markers, type I collagen (COL1A1), α-SMA (ACTA2) and N-cadherin (CDH2), and fibrosis master transcription factor MYOCA (Myocardin) ) Is suppressed regardless of the presence or absence of TGF stimulation, but such a suppressive effect was not observed in cells pretreated with TRPA1 siRNA (FIG. 9).

上述した知見に基づいて、本発明に係る抗組織線維化物質のスクリーニング方法は、抗組織線維化作用を有する物質をスクリーニングすることができる。したがって、本発明のスクリーニング方法によってスクリーニングして得られた抗組織線維化作用を有する物質は、抗組織線維化薬剤または機能性食品として有用である。   Based on the above-described findings, the screening method for an anti-tissue fibrosis substance according to the present invention can screen for a substance having an anti-tissue fibrosis action. Therefore, the substance having an anti-tissue fibrosis action obtained by screening by the screening method of the present invention is useful as an anti-tissue fibrosis drug or a functional food.

本発明に係る抗組織線維化薬剤は、本発明によりスクリーニングされた抗組織線維化作用を有する物質を常法に従って製剤することによって調製することができる。   The anti-tissue fibrosis drug according to the present invention can be prepared by formulating a substance having an anti-tissue fibrosis action screened according to the present invention according to a conventional method.

本発明に係る抗組織線維化薬剤としては、その投与形態ならびに剤型は、特に限定するものではないが、例えば、粉末剤、細粒剤、顆粒剤、丸剤、錠剤、カプセル剤等の固形製剤、または液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等の液剤およびゼリー剤等の半固形製剤などの経口投与用製剤などが挙げられる。これらの製剤は、必要に応じて薬理学的に許容される担体を用いて、常法により調製することができる。   The dosage form and dosage form of the anti-tissue fibrosis drug according to the present invention are not particularly limited. For example, solids such as powders, fine granules, granules, pills, tablets, capsules, etc. Preparations or liquid preparations such as liquids, suspensions, emulsions, syrups, and preparations for oral administration such as semi-solid preparations such as jelly preparations can be mentioned. These preparations can be prepared by a conventional method using a pharmacologically acceptable carrier as necessary.

薬学的に許容される坦体としては、製剤の素材として慣用されている各種有機あるいは無機坦体物質が用いられる。固形製剤には、例えば、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤など、また液状製剤には、例えば、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤などを配合することができる。また必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤等の添加物を用いることもできる。   As the pharmaceutically acceptable carrier, various organic or inorganic carrier substances commonly used as a raw material for preparations are used. For solid preparations, for example, excipients, lubricants, binders, disintegrants, etc., and for liquid preparations, for example, solvents, solubilizers, suspending agents, tonicity agents, buffers, painless An agent and the like can be blended. If necessary, additives such as preservatives, antioxidants, colorants, sweeteners and the like can be used.

賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、Ｄ−マンニトール、デンプン、結晶セルロース、軽質無水ケイ酸などが挙げられる。滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカなどが挙げられる。結合剤としては、例えば、白糖、Ｄ−マンニトール、デキストリン、結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。崩壊剤としては、例えば、デンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウムなどが挙げられる。溶剤としては、例えば、注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油などが挙げられる。溶解補助剤としては、例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。懸濁化剤としては、例えば、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリンなどの界面活性剤、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の親水性高分子などが挙げられる。等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトールなどが挙げられる。緩衝剤としては、例えば、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩等の緩衝液などが挙げられる。無痛化剤としては、例えば、ベンジルアルコールなどが挙げられる。防腐剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが挙げられる。抗酸化剤としては、例えば、トコフェロール類、亜硫酸塩、アスコルビン酸などが挙げられる。   Examples of the excipient include lactose, sucrose, D-mannitol, starch, crystalline cellulose, light anhydrous silicic acid and the like. Examples of the lubricant include magnesium stearate, calcium stearate, talc, colloidal silica, and the like. Examples of the binder include sucrose, D-mannitol, dextrin, crystalline cellulose, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, and polyvinylpyrrolidone. Examples of the disintegrant include starch, carboxymethyl cellulose, and carboxymethyl cellulose calcium. Examples of the solvent include water for injection, alcohol, propylene glycol, macrogol, sesame oil, corn oil and the like. Examples of the solubilizer include polyethylene glycol, propylene glycol, D-mannitol, benzyl benzoate, ethanol, trisaminomethane, cholesterol, triethanolamine, sodium carbonate, sodium citrate and the like. Examples of the suspending agent include surfactants such as stearyltriethanolamine, sodium lauryl sulfate, laurylaminopropionic acid, lecithin, benzalkonium chloride, benzethonium chloride, glyceryl monostearate, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, carboxy Examples thereof include hydrophilic polymers such as sodium methylcellulose, methylcellulose, hydroxymethylcellulose, hydroxyethylcellulose, and hydroxypropylcellulose. Examples of the isotonic agent include sodium chloride, glycerin, D-mannitol and the like. Examples of the buffer include buffer solutions of phosphate, acetate, carbonate, citrate, and the like. Examples of soothing agents include benzyl alcohol. Examples of the preservative include p-hydroxybenzoates, chlorobutanol, benzyl alcohol, phenethyl alcohol, dehydroacetic acid, sorbic acid and the like. Examples of the antioxidant include tocopherols, sulfites, ascorbic acid and the like.

本発明の抗組織線維化薬剤の投与量は、成分として大人一日当たり約1mg/kg〜500mg/kg、好ましくは5mg/kg〜300mg/kgであるのがよい。   The dosage of the anti-tissue fibrosis drug of the present invention is about 1 mg / kg to 500 mg / kg, preferably 5 mg / kg to 300 mg / kg per adult day as a component.

本発明に係る抗組織線維化機能性食品とは、組織線維化の予防もしくは治療の目的で摂取する食品および／または飲料を意味し、保健機能食品である特定保健用食品や栄養機能食品などを意味している。なお、本発明において、機能性食品としてとして製品化する場合には、食品に一般的に用いられる添加剤、例えば、着色料、保存料、増粘安定剤、酸化防止剤漂白剤、防菌防黴剤、酸味料、調味料、乳化剤、強化剤、製造用剤、香料等の添加剤を添加していてもよい。   The anti-tissue fibrosis functional food according to the present invention means foods and / or beverages to be ingested for the purpose of preventing or treating tissue fibrosis. I mean. In the present invention, when commercialized as a functional food, additives commonly used in food, such as colorants, preservatives, thickening stabilizers, antioxidant bleaches, antibacterial agents, etc. Additives such as glazes, acidulants, seasonings, emulsifiers, reinforcing agents, production agents, and fragrances may be added.

本発明の抗組織線維化機能性食品の形態は、経口投与可能な形態であれば特に制限されるものではなく、例えば、粉末状、顆粒状、カプセル状、タブレット状、グミ状、ガム状、キャンディー状、丸剤、錠剤状、棒状、板状、液状、クリーム状、軟膏状、シート状等の剤型、形態をとることができる。   The form of the anti-tissue fibrosis functional food of the present invention is not particularly limited as long as it is an orally administrable form. For example, powder, granule, capsule, tablet, gummy, gum, The dosage form and form such as candy, pill, tablet, bar, plate, liquid, cream, ointment, and sheet can be used.

本発明の抗組織線維化機能性食品は、日常的に経口摂取しやいように、各種の食品、飲料と混ぜて機能性食品とすることで、長期的に摂取することも可能である。食品としては、例えば、ソーセージ、ハム、魚介加工品、ゼリー、キャンディー、チューインガムなどが挙げられる。また、飲料としては、例えば、茶類、清涼飲料水、酒類、栄養ドリンクなどが挙げられる。   The anti-tissue fibrosis functional food of the present invention can be ingested over a long period of time by mixing it with various foods and beverages to make it functional food so that it can be taken orally on a daily basis. Examples of food include sausage, ham, processed seafood, jelly, candy, and chewing gum. Examples of the beverage include teas, soft drinks, alcoholic beverages, and energy drinks.

本発明の抗組織線維化機能性食品の摂取量は、対象者の年齢、性別などの個別差にもよるが、成分重量換算で、0.2〜3.0g/１日程度であるのがよい。   The intake of the anti-tissue fibrosis functional food of the present invention is preferably about 0.2 to 3.0 g / day in terms of component weight, although it depends on individual differences such as the age and sex of the subject.

本発明に係る抗組織線維化測定用スクリーニングキットは、TRPA1を発現する線維芽細胞、筋線維芽細胞などの間葉系細胞と、線維化サイトカインTGF-β1を含む構成にするのがよい。   The screening kit for measurement of anti-tissue fibrosis according to the present invention preferably comprises mesenchymal cells such as fibroblasts and myofibroblasts expressing TRPA1 and fibrosis cytokine TGF-β1.

以下、本発明を参考例と実施例により詳細に説明するが、本発明は下記実施例で一切限定されるものではなく、下記実施例は本発明を例示的に説明するだけである。   Hereinafter, although a reference example and an example explain the present invention in detail, the present invention is not limited at all by the following example, and the following example only explains the present invention exemplarily.

〔参考例１〕
本参考例においては、クローン病患者の組織を生検して、図１に示すような非狭窄部位（non-stenosis）と狭窄部位（stenosis）におけるTRPA1およびその他の遺伝子のmRNA発現量を定量PCRによって解析した。その結果、線維化芽細胞や筋線維芽細胞が多く集積している線維化狭窄部位に、それらの細胞の多くで見られるTRPA1（TRPA1）、I型コラーゲン（COL1A1）、α-SMA（平滑筋型アクチン）（ACTA2）ならびにN-Cadherin（CDH2）のmRNA発現が著しく増加していることが確認されたが、線維化マスター転写因子Myocardin（MYOCA）のmRNA発現は非狭窄部位と狭窄部位との間では大した差異は認められなかった（図２）。 [Reference Example 1]
In this reference example, biopsy of Crohn's disease patient tissue and quantitative PCR of mRNA expression levels of TRPA1 and other genes at non-stenosis and stenosis as shown in FIG. Analyzed by: As a result, TRPA1 (TRPA1), type I collagen (COL1A1), α-SMA (smooth muscle) found in many of these cells at the fibrotic stenosis site where many fibroblasts and myofibroblasts are concentrated. Type actin) (ACTA2) and N-Cadherin (CDH2) mRNA expression was confirmed to be significantly increased, but the fibrosis master transcription factor Myocardin (MYOCA) mRNA expression was observed between the non-stenotic and stenotic sites. There was no significant difference between the two (Figure 2).

定量PCRは次のように行った。RNeasy RNA Extraction Kit (QIAGEN, Venlo, The Netherlands)を用いてInMyoFib細胞からTotal RNA を抽出した。逆転写後にBioMarkTM HD System (Fluidigm)を用いた定量PCR実験を行った。定量PCRに用いた温度サイクルを以下に示す。ステップ１は95℃を60秒；ステップ２は、１サイクルを、96℃を５秒、60℃を20秒として35サイクルを行った。定量PCRには、TaqMan（登録商標）Gene Expression Assay kits（Life Technologies社）：TRPA1 (Hs00175798_m1),MYOCD(myocardin;Hs00538071_m1),ACTA2(α-SMA;Hs00426835_g1), CDH2(N-cadherin; Hs00983056_m1),COL1A1(Hs00164004_m1)を用いた。 Quantitative PCR was performed as follows. Total RNA was extracted from InMyoFib cells using RNeasy RNA Extraction Kit (QIAGEN, Venlo, The Netherlands). After reverse transcription, quantitative PCR experiments using BioMark ™ HD System (Fluidigm) were performed. The temperature cycle used for quantitative PCR is shown below. Step 1 was conducted at 95 ° C. for 60 seconds; Step 2 was carried out for 35 cycles of 1 cycle at 96 ° C. for 5 seconds and 60 ° C. for 20 seconds. For quantitative PCR, TaqMan (registered trademark) Gene Expression Assay kits (Life Technologies): TRPA1 (Hs00175798_m1), MYOCD (myocardin; Hs00538071_m1), ACTA2 (α-SMA; Hs00426835_g1), CDH2 (N-cadherin; Hs00983056_m1), COL1A1 (Hs00164004_m1) was used.

〔参考例２〕
本参考例では、組織線維化の評価モデルとして非常に有用な細胞である消化器筋線維芽細胞を用いたマイクロアレイ解析によって、当該細胞に最も多く発現するTRPチャネルの形態を調べた。その結果、マイクロアレイ解析によって消化器筋線維芽細胞に最も多く発現するTRPチャネルがTRPA1チャネルであることが示唆された（図３）。図３中、上図は筋線維芽細胞（InMyoFib）を未処理の状態で細胞染色したコントロールを示し、下図は筋線維芽細胞（InMyoFib）をTGF-β1（5 ng/ml, 48 hr）で刺激した状態で細胞染色した図を示している。また、上下の図中、左側の図は明視野の細胞像、中央の図は線維化マーカーα-SMA（平滑筋型アクチン）とDAPI(核の染色)、および右側の図はビメンチンとDAPI(核の染色)をそれぞれ染色する薬剤で染色した状態を示す図である。この結果から、筋線維芽細胞（InMyoFib）は、TGF-β1で刺激することによって敷石状の形態から細長い線維状の形態に変化しているのが分かる。 [Reference Example 2]
In this reference example, the form of the TRP channel most expressed in the cells was examined by microarray analysis using digestive myofibroblasts, which are cells very useful as an evaluation model of tissue fibrosis. As a result, it was suggested by microarray analysis that the TRP channel most expressed in digestive myofibroblasts was the TRPA1 channel (FIG. 3). In FIG. 3, the upper figure shows a control in which myofibroblasts (InMyoFib) were stained without treatment, and the lower figure shows myofibroblasts (InMyoFib) with TGF-β1 (5 ng / ml, 48 hr). The figure which stained the cell in the stimulated state is shown. In the upper and lower figures, the left figure shows the bright-field cell image, the middle figure shows the fibrosis markers α-SMA (smooth muscle actin) and DAPI (nuclear staining), and the right figure shows vimentin and DAPI ( It is a figure which shows the state dye | stained with the chemical | medical agent which dye | stains each (staining of a nucleus). From this result, it can be seen that myofibroblasts (InMyoFib) are changed from a cobblestone form to an elongated fibrous form by stimulation with TGF-β1.

マイクロアレイ解析の結果、筋線維芽細胞（InMyoFib）において、TRPファミリーのmRNAの発現量を定量化して比較したところ、TRPファミリーのうち最も多く発現しているのがTRPA1であることが示唆された（図４）。   As a result of microarray analysis, the amount of TRP family mRNA expressed in myofibroblasts (InMyoFib) was quantified and compared, suggesting that TRPA1 is the most highly expressed TRP family ( FIG. 4).

上記マイクロアレイ解析実験は Human Genomic U133 Plus 2.0 Array 6800 GeneChips (Affymetrix) を用いて行い、そのデータ解析はGeneSpring v.7.3 software (Agilent Technologies)を用いて行った。   The microarray analysis experiment was performed using Human Genomic U133 Plus 2.0 Array 6800 GeneChips (Affymetrix), and the data analysis was performed using GeneSpring v.7.3 software (Agilent Technologies).

〔参考例３〕
本参考例では、筋線維芽細胞（InMyoFib）を用いてカルシウムイメージングを行った。カルシウムイメージングは、Fura-2 AMを用いたデジタル蛍光イメージングにより行い、InMyoFib細胞内カルシウム濃度を測定した。InMyoFib細胞をpoly-L-lysine (Sigma) でコートしたガラスチャンバー内に播種し、蛍光顕微鏡のステージ上にセットした。InMyoFib 細胞に5 μM Fura-2/AMを添加して室温・遮光状態で30分インキュベーションし、励起波長:340 nm / 380 nm, 蛍光波長:510 nm でInMyoFib細胞内カルシウム濃度の測定を行った。その結果、カルシウムイオン濃度が高くなると、340 nm 励起の蛍光強度は上昇し、380 nm 励起の蛍光強度は低下した。そのときの蛍光強度比(R=Fex.340nm/Fex.380nm)を蛍光顕微鏡(DMI600B, Leica)、EMCCDカメラ(Nippon Roper, Tokyo, Japan)で測定した。採取したデータはSlideBook 4.2 software (Intelligent Imaging Innovation Inc., Denver, CO, USA)で解析を行った。細胞外液の組成は以下に示すとおりであった (単位 mM): 140 NaCl, 5 KCl, 1 CaCl2, 1.2 MgCl2, 10 HEPES, 10 glucose (Tris base でpH = 7.4に調節)。 [Reference Example 3]
In this reference example, calcium imaging was performed using myofibroblasts (InMyoFib). Calcium imaging was performed by digital fluorescence imaging using Fura-2 AM, and the InMyoFib intracellular calcium concentration was measured. InMyoFib cells were seeded in a glass chamber coated with poly-L-lysine (Sigma) and set on the stage of a fluorescence microscope. 5 μM Fura-2 / AM was added to InMyoFib cells and incubated for 30 minutes at room temperature and in the light-shielded state. InMyoFib intracellular calcium concentration was measured at excitation wavelength: 340 nm / 380 nm and fluorescence wavelength: 510 nm. As a result, as the calcium ion concentration increased, the fluorescence intensity at 340 nm excitation increased and the fluorescence intensity at 380 nm excitation decreased. The fluorescence intensity ratio (R = F ex.340 nm / F ex.380 nm ) at that time was measured with a fluorescence microscope (DMI600B, Leica) and an EMCCD camera (Nippon Roper, Tokyo, Japan). The collected data was analyzed with SlideBook 4.2 software (Intelligent Imaging Innovation Inc., Denver, CO, USA). The composition of the extracellular fluid was as follows (unit: mM): 140 NaCl, 5 KCl, 1 CaCl 2 , 1.2 MgCl 2 , 10 HEPES, 10 glucose (adjusted to pH = 7.4 with Tris base).

カルシウムイメージングの結果は図５に示すとおりである。図５において、上段左図は、筋線維芽細胞において、TRPA1チャネルアゴニスト（AITC）がカルシウムイオン（Ca2+）流入を大きく促進しているとともに、そのカルシウムイオン流入がTRPA1特異的なブロッカー（HC-030031）によって有意に抑制されていることを示すカルシウムイメージング；下段左図は、カルシウムイオン流入がTRPA1のRNA干渉実験で有意に抑制されることを示す図；上段右図は、TRPA1チャネルアゴニストがTRPA1の性質を持つ電流を活性化することを示すパッチクランプデータ；下段右図は、その電流がTRPA1特異的なブロッカーによって有意に抑制されることを示すパッチクランプデータを示している。これらの結果から、筋線維芽細胞（InMyoFib）において、TRPA1チャネルが機能的に作用していることが確認された。 The results of calcium imaging are as shown in FIG. In FIG. 5, the upper left figure shows that in myofibroblasts, TRPA1 channel agonist (AITC) greatly promotes calcium ion (Ca 2+ ) influx, and the calcium ion influx is a TRPA1-specific blocker (HC). -030031) Calcium imaging showing that it is significantly suppressed; lower left figure shows that calcium ion influx is significantly suppressed in TRPA1 RNA interference experiments; upper right figure shows TRPA1 channel agonist Patch clamp data showing that a current having the properties of TRPA1 is activated; the lower right figure shows patch clamp data showing that the current is significantly suppressed by a TRPA1-specific blocker. From these results, it was confirmed that TRPA1 channel is functionally acting in myofibroblasts (InMyoFib).

〔参考例４〕
本参考例は、TRPA1siを導入した筋線維芽細胞（InMyoFib）において、TRPA1チャネルがTGF-β1刺激下で線維化シグナルに対して抑制的に作用するかどうかを調べるTRPA1siRNA干渉実験に関するものである。 [Reference Example 4]
This reference example relates to a TRPA1 siRNA interference experiment for examining whether TRPA1 channel acts suppressively on fibrosis signal under TGF-β1 stimulation in myofibroblasts (InMyoFib) into which TRPA1si has been introduced.

TRPA1siRNA干渉実験の結果を図６に示す。TRPA1siRNA干渉実験では、TRPA1siを導入した筋線維芽細胞（InMyoFib）において線維化マスター転写因子であるMYOCD（Myocardin）の発現が有意に増加していると同時に（図６左図）、線維化マーカーであるα-SMA（平滑筋型アクチン）とI型コラーゲンのmRNA発現も増加しているのが確認された（図６右図）。これらの結果から、TRPA1チャネルはTRPA1siを導入した筋線維芽細胞（InMyoFib）においてTGF-β1刺激下で線維化シグナルに対して抑制的に作用することが確認された。   The results of the TRPA1 siRNA interference experiment are shown in FIG. In the TRPA1siRNA interference experiment, the expression of MYOCD (Myocardin), a fibrosis master transcription factor, was significantly increased in myofibroblasts (InMyoFib) into which TRPA1si had been introduced (FIG. 6, left figure), and at the same time, with fibrosis markers. It was confirmed that mRNA expression of certain α-SMA (smooth muscle type actin) and type I collagen was also increased (the right diagram in FIG. 6). From these results, it was confirmed that the TRPA1 channel acts on the fibrosis signal under stimulation of TGF-β1 in myofibroblasts (InMyoFib) introduced with TRPA1si.

TRPA1siRNA干渉実験では、Human Stealth TRPA1 siRNAs: TRPA1 HSS113276 (5’-GGAGCAAUUGCUGUUUACUUCUAUU-3’および5’-AAUAGAAGUAAACAGCAAUUGCU- CC-3’)（Invitrogen；Carlsbad, CA, USA）を遺伝子導入試薬Lipofectamine（登録商標） 3000を用いてInMyoFib細胞に導入し、TRPA1の遺伝子発現を抑制するかどうかを調べた。TRPA1遺伝子発現の抑制がMYOCD, COL1A1, ACTA2の遺伝子発現に及ぼす効果は定量PCR（上述）によって測定を行った。   In the TRPA1 siRNA interference experiment, Human Stealth TRPA1 siRNAs: TRPA1 HSS113276 (5'-GGAGCAAUUGCUGUUUACUUCUAUU-3 'and 5'-AAUAGAAGUAAACAGCAAUUGCU-CC-3') (Invitrogen; Carlsbad, CA, USA) was introduced as Lipofectamine (registered trademark) 3000 Was introduced into InMyoFib cells to examine whether or not to suppress TRPA1 gene expression. The effect of suppression of TRPA1 gene expression on gene expression of MYOCD, COL1A1, and ACTA2 was measured by quantitative PCR (described above).

〔参考例５〕
本参考例は、TRPA1チャネルがTGF-β1刺激下流でリン酸シグナルに対して抑制的に作用するかどうかを調べる実験である。一般的には、TGF受容体の下流において、多くのリン酸シグナルが存在していて線維化を促進していることが知られている。本参考例は、筋線維芽細胞（InMyoFib）において、TGF-β1下流のSmad-2のリン酸化がTRPA1チャネルのsiRNA導入により著しく促進され、TRPA1チャネルはTGF-β1下流のリン酸シグナルに対して抑制的であることを示唆している（図７）。 [Reference Example 5]
This reference example is an experiment to examine whether TRPA1 channel acts to suppress the phosphate signal downstream of TGF-β1 stimulation. In general, it is known that many phosphate signals exist downstream of the TGF receptor and promote fibrosis. In this reference example, in myofibroblasts (InMyoFib), phosphorylation of Smad-2 downstream of TGF-β1 is significantly promoted by introduction of siRNA into the TRPA1 channel, and TRPA1 channel responds to the phosphate signal downstream of TGF-β1. This suggests that it is inhibitory (FIG. 7).

免疫ブロットは、InMyoFib細胞におけるSmad2のリン酸化レベルを調べるためにSmad-2/3や phospho-Smad-2の免疫ブロット法実験で行った。細胞の全分画を溶菌バッファで溶解し、5% (v/v) 2-mercaptoethanol や 1% (w/v) bromophenol blue を含むサンプルバッファ中でタンパク質を変性させた後に10% (w/v) SDS-PAGEゲルで電気泳動を行った。電気泳動したサンプルはPVDF膜へ転写し、Blocking One (Nacalai Tesque) 中で室温1時間ブロッキングを行った後、一次抗体と反応させた。その後HRP標識の二次抗体と室温で45分間反応させ、ECL試薬 (GE Healthcare, Little Chalfont, UK)で現像して結果を観察した。なお、使用した抗体は、β-actin (Abcam), Smad-2/3, phospho-Smad-2 (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA)である。   Immunoblotting was performed in Smad-2 / 3 and phospho-Smad-2 immunoblotting experiments to examine the phosphorylation level of Smad2 in InMyoFib cells. All cell fractions are lysed with lysis buffer and 10% (w / v) after protein denaturation in sample buffer containing 5% (v / v) 2-mercaptoethanol or 1% (w / v) bromophenol blue. ) Electrophoresis was performed on SDS-PAGE gel. The electrophoresed sample was transferred to a PVDF membrane, blocked in Blocking One (Nacalai Tesque) for 1 hour at room temperature, and then reacted with the primary antibody. Thereafter, it was reacted with an HRP-labeled secondary antibody at room temperature for 45 minutes, developed with ECL reagent (GE Healthcare, Little Chalfont, UK), and the results were observed. The antibodies used were β-actin (Abcam), Smad-2 / 3, and phospho-Smad-2 (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA).

〔参考例６〕
本参考例は、TRPA1が細胞外のコラーゲンの量の増加に伴って増加すると共に筋線維芽細胞自体のコラーゲン放出を抑制すること示している（図８）。このことから、TRPA1チャネルは、コラーゲン産生のネガティブフィードバック調節因子の役割を有することが分かる。 [Reference Example 6]
This reference example shows that TRPA1 increases with increasing amount of extracellular collagen and suppresses collagen release of myofibroblasts themselves (FIG. 8). This indicates that the TRPA1 channel has a role of a negative feedback regulator of collagen production.

なお、免疫ブロット実験は上述した方法により行った。使用した抗体は、TRPA1 (mouse; Sigma-Aldrich), β-actin (Abcam), Collagen I (Abcam)である。   The immunoblot experiment was performed by the method described above. The antibodies used were TRPA1 (mouse; Sigma-Aldrich), β-actin (Abcam), Collagen I (Abcam).

〔参考例７〕
本参考例では、筋線維芽細胞（InMyoFib）外にコラーゲンを添加し、上記同様に定量PCR実験をしたところ、組織線維化マーカーであるI型コラーゲン（COL1A1）、α-SMA（ACTA2）ならびにN-カドヘリン（CDH2）および線維化マスター転写調節因子であるミオカルディン（MYOCD）の発現はTGF-β1刺激の有無に関係なく抑制されたが、TRPA1siRNAで前処理した細胞ではこの抑制作用は認められなかった（図９）。 [Reference Example 7]
In this reference example, collagen was added outside of myofibroblasts (InMyoFib), and quantitative PCR experiments were performed in the same manner as described above. As a result, tissue fibrosis markers, type I collagen (COL1A1), α-SMA (ACTA2) and N -Cadherin (CDH2) and myocardin (MYOCD), a fibrosis master transcriptional regulator, were suppressed with or without TGF-β1 stimulation, but this effect was not observed in cells pretreated with TRPA1 siRNA (FIG. 9).

〔実施例１〕
実施例１では、筋線維芽細胞（InMyoFib）を用いてローズマリーのエタノール抽出成分の抗線維化作用を調べた。本実施例で使用したローズマリーのエタノール抽出成分は、ローズマリーの葉の粉末1gを100％エタノール20ml中で５分間ソニケーションして、室温で１時間撹拌し、3000rpmで5分間遠心分離した上清を採取し抽出して作製した。なお、上記遠心分離後の沈殿は再度10mlエタノールで撹拌・遠心し上清も回収した。 [Example 1]
In Example 1, the anti-fibrotic effect of the rosemary ethanol extract component was examined using myofibroblasts (InMyoFib). The rosemary ethanol extract used in this example was prepared by sonicating 1 g of rosemary leaf powder in 20 ml of 100% ethanol for 5 minutes, stirring at room temperature for 1 hour, and centrifuging at 3000 rpm for 5 minutes. Qing was collected and extracted. The precipitate after the centrifugation was stirred and centrifuged again with 10 ml ethanol, and the supernatant was also collected.

本実施例の実験の詳細は次の通りである。上記で得た試料１ｇをエタノール20ｍｌ中で５分間ソニケーションし、その後室温で１時間3000rpmで５分間遠心分離した。遠心分離後の上清は、上記と同様に定量し、分注して保存した。一方、遠心分離後の沈殿は、エタノール10ｍｌで洗浄し、５分間3000rpmで遠心分離し、その上清を、上記と同様に定量し、分注して保存した。   The details of the experiment of this example are as follows. 1 g of the sample obtained above was sonicated in 20 ml of ethanol for 5 minutes and then centrifuged at 3000 rpm for 5 minutes at room temperature. The supernatant after centrifugation was quantified in the same manner as above, dispensed and stored. On the other hand, the precipitate after centrifugation was washed with 10 ml of ethanol, centrifuged at 3000 rpm for 5 minutes, and the supernatant was quantified in the same manner as above, dispensed and stored.

本実施例で得られたローズマリーのエタノール抽出液を細胞外液(単位 mM): 140 NaCl, 5 KCl, 1 CaCl2, 1.2 MgCl2, 10 HEPES, 10 glucose (Tris base でpH = 7.4に調節)で1000倍希釈した希釈液を用いて上記と同様にカルシウム（Ca2+）イメージング実験を実施した。カルシウムイメージング実験の結果は図１０に示すとおりである。 Rosemary ethanol extract obtained in this example was extracellular solution (unit: mM): 140 NaCl, 5 KCl, 1 CaCl 2 , 1.2 MgCl 2 , 10 HEPES, 10 glucose (pH adjusted to 7.4 with Tris base ), The calcium (Ca 2+ ) imaging experiment was performed in the same manner as described above using the diluted solution diluted 1000 times. The results of the calcium imaging experiment are as shown in FIG.

上記カルシウムイメージング実験の結果から、ローズマリーのエタノール抽出成分は高い抗線維化作用を有すると共に、その作用機序は間葉系TRPA1チャネル活性化を介していることが確認された。つまり、ローズマリーのエタノール抽出成分によって起こる細胞内へのカルシウム（Ca2+）流入は、すべてTRPA1チャネル特異的なアンタゴニストHC-030031によって有意に抑制された。 From the results of the calcium imaging experiment, it was confirmed that the ethanol extract component of rosemary has a high antifibrotic effect and that the mechanism of action is mediated by activation of the mesenchymal TRPA1 channel. That is, calcium (Ca 2+ ) influx into cells caused by rosemary ethanol extract components was all significantly suppressed by the TRPA1 channel-specific antagonist HC-030031.

同様に、ローズマリーのエタノール抽出成分の5000倍、2000倍、1000倍希釈液についてそれぞれ抗線維化作用を調べた結果、いずれもTGF-β1（5ng/ml）刺激によって起こる線維化マーカーの上昇に対して、濃度依存的に抑制効果が観察された（図１１）。   Similarly, as a result of investigating the anti-fibrotic activity of each of the 5000-fold, 2000-fold, and 1000-fold diluted solutions of the rosemary ethanol extract, all of them increased fibrosis markers caused by TGF-β1 (5 ng / ml) stimulation. On the other hand, an inhibitory effect was observed in a concentration-dependent manner (FIG. 11).

〔実施例２〕
実施例１と同様に、セージのエタノール抽出成分によって起こる細胞内へのカルシウム（Ca2+）流入は、すべてTRPA1チャネル特異的なアンタゴニストHC-030031によって有意に抑制された。セージのエタノール抽出液の1000倍、2000倍および5000倍希釈液について、抗組織線維化作用を調べた。その結果を図１２に示す。その結果、セージのエタノール抽出液の希釈液と同様な結果が得られた。 [Example 2]
As in Example 1, all intracellular calcium (Ca 2+ ) influx caused by the ethanol extract of sage was significantly suppressed by the TRPA1 channel-specific antagonist HC-030031. The anti-tissue fibrosis action was examined for 1000 times, 2000 times and 5000 times dilutions of the sage ethanol extract. The result is shown in FIG. As a result, the same result as the diluted solution of the sage ethanol extract was obtained.

〔実施例３〕
実施例１と同様に、メースのエタノール抽出成分によって起こる細胞内へのカルシウム（Ca2+）流入は、すべてTRPA1チャネル特異的なアンタゴニストHC-030031によって有意に抑制された。メースのエタノール抽出液の1000倍、2000倍、5000倍および10000倍希釈液について、抗組織線維化作用を調べた。その結果を図１３に示す。その結果、メースのエタノール抽出液の希釈液と同様な結果が得られた。 Example 3
As in Example 1, all intracellular calcium (Ca 2+ ) influx caused by the ethanol extract of mace was significantly suppressed by the TRPA1 channel-specific antagonist HC-030031. Anti-tissue fibrosis action was examined for 1000-fold, 2000-fold, 5000-fold and 10000-fold dilutions of the ethanol extract of mace. The result is shown in FIG. As a result, the same result as that of the diluted solution of the mace ethanol extract was obtained.

〔実施例４〕
実施例１と同様にして、甘草（リコリス）のエタノール抽出液について筋線維芽細胞（InMyoFib）においてTRPA1チャネルが活性化し、線維化マーカーが発現するかどうか調べた。その結果、図１４で示すように、甘草（リコリス）のエタノール抽出液が筋線維芽細胞（InMyoFib）においてTRPA1チャネルを活性化することが確認された。また、図１５に示すように、甘草（リコリス）のエタノール抽出液は、線維化マーカーα-SMAの発現を濃度依存的に抑制した。 Example 4
In the same manner as in Example 1, it was examined whether TRPA1 channel was activated in fibroblasts (InMyoFib) and expressed fibrosis markers in an ethanol extract of licorice (licorice). As a result, as shown in FIG. 14, it was confirmed that the ethanol extract of licorice (licorice) activates the TRPA1 channel in myofibroblasts (InMyoFib). Moreover, as shown in FIG. 15, the ethanol extract of licorice (licorice) suppressed the expression of the fibrosis marker α-SMA in a concentration-dependent manner.

〔実施例５〕
甘草に含まれる18βグリチルレチン酸について筋線維芽細胞（InMyoFib）においてTRPA1チャネルを活性化するかどうかをカルシウムイメージング法にて上記と同様に調べた。その結果は図１６に示す。 Example 5
Whether or not 18β-glycyrrhetinic acid contained in licorice activates the TRPA1 channel in myofibroblasts (InMyoFib) was examined by the calcium imaging method as described above. The result is shown in FIG.

〔実施例６〕
実施例５と同様にして、グリチルリチンについて筋線維芽細胞（InMyoFib）においてTRPA1チャネルを活性化するかどうか調べた結果、図１７に示すように、TRPA1チャネルを介するカルシウム（Ca2+）流入が活性化した。 Example 6
In the same manner as in Example 5, whether or not TRPA1 channel was activated in myofibroblasts (InMyoFib) for glycyrrhizin was examined. As shown in FIG. 17, calcium (Ca 2+ ) influx through TRPA1 channel was active. Turned into.

〔実施例７〕
実施例５と同様にして、プレドニゾロンについて筋線維芽細胞（InMyoFib）においてTRPA1チャネルを活性化するかどうか調べた結果、図１８に示すように、TRPA1チャネルを介するカルシウム（Ca2+）流入が活性化した。 Example 7
In the same manner as in Example 5, it was examined whether prednisolone activates the TRPA1 channel in myofibroblasts (InMyoFib). As a result, as shown in FIG. 18, calcium (Ca 2+ ) influx through the TRPA1 channel is active. Turned into.

〔実施例８〕
実施例５と同様にして、ビルフェニドンについて筋線維芽細胞（InMyoFib）においてTRPA1チャネルを活性化するかどうか調べた結果、図１９に示すように、TRPA1チャネルを介するカルシウム（Ca2+）流入が活性化した。 Example 8
In the same manner as in Example 5, it was examined whether or not TRPA1 channel was activated in myofibroblasts (InMyoFib) for bilfenidone. As a result, as shown in FIG. 19, calcium (Ca 2+ ) influx through TRPA1 channel was active. Turned into.

本発明に係る抗組織線維化物質のスクリーニング方法および抗組織線維化測定用スクリーニングキットは、任意の物質からTRPA1チャネル活性化方法によりTRPA1チャネル活性化物質を選択し、選択したTRPA1チャネル活性化物質から線維化サイトカインTGF-β1刺激下で組織線維化マーカーを抑制する抗組織線維化物質をスクリーニングすることができ、得られた抗組織線維化物質は、抗組織線維化薬剤または抗組織線維化機能性食品として有用である。   The screening method for anti-tissue fibrosis substance and the screening kit for measuring anti-tissue fibrosis according to the present invention select a TRPA1 channel activator from any substance by the TRPA1 channel activation method, and select from the selected TRPA1 channel activator. Anti-tissue fibrosis substance that suppresses tissue fibrosis marker under the stimulation of fibrosis cytokine TGF-β1 can be screened, and the obtained anti-tissue fibrosis substance is an anti-tissue fibrosis drug or anti-tissue fibrosis functionality Useful as food.

Claims (16)

TRPA1チャネルを発現する間葉系細胞を用いてTRPA1チャネル活性化作用を有するTRPA1チャネル活性化物質をスクリーニングし、得られたTRPA1チャネル活性化物質を線維化サイトカインTGF-β1刺激下で組織線維化マーカーを抑制することにより抗組織線維化物質をスクリーニングすることからなる抗組織線維化物質のスクリーニング方法。   Screening for TRPA1 channel activator having TRPA1 channel activation action using mesenchymal cells expressing TRPA1 channel, and treating the resulting TRPA1 channel activator with tissue fibrosis marker under fibrosis cytokine TGF-β1 stimulation A screening method for an anti-tissue fibrosis substance comprising screening an anti-tissue fibrosis substance by inhibiting 請求項１に記載のスクリ−ニング方法であって、前記間葉系細胞が線維芽細胞または筋線維芽細胞であることを特徴とする抗組織線維化物質のスクリーニング方法。   The screening method according to claim 1, wherein the mesenchymal cells are fibroblasts or myofibroblasts. 請求項１または２に記載のスクリ−ニング方法であって、前記間葉系細胞が消化器由来の間葉系細胞であることを特徴とする抗組織線維化物質のスクリーニング方法。   3. The screening method according to claim 1 or 2, wherein the mesenchymal cells are digestive organ-derived mesenchymal cells. 請求項１ないし３のいずれか１項に記載のスクリ−ニング方法であって、前記TRPA1チャネル活性化物質が、TRPA1チャネルが活性化されるもしくは活性化している物質であることを特徴とする抗組織線維化物質のスクリーニング方法。   The screening method according to any one of claims 1 to 3, wherein the TRPA1 channel activating substance is a substance in which the TRPA1 channel is activated or activated. Screening method for tissue fibrosis substance. 請求項１ないし４のいずれか１項に記載のスクリ−ニング方法であって、前記TRPA1チャネル活性化物質が、TRPA1チャネルが活性化されるもしくは活性化している植物抽出物または化合物であることを特徴とする抗組織線維化物質のスクリーニング方法。   The screening method according to any one of claims 1 to 4, wherein the TRPA1 channel activator is a plant extract or compound in which the TRPA1 channel is activated or activated. A screening method for a characteristic anti-tissue fibrosis substance. 請求項５に記載のスクリ−ニング方法であって、前記植物抽出物が、植物の水、アルコールまたはこれらの混合物による抽出物であることを特徴とする抗組織線維化物質のスクリーニング方法。   6. The screening method according to claim 5, wherein the plant extract is an extract of plant water, alcohol or a mixture thereof. 請求項６に記載のスクリーニング方法であって、前記アルコールがエタノールであることを特徴とする抗組織線維化物質のスクリーニング方法。   The screening method according to claim 6, wherein the alcohol is ethanol. 請求項１ないし７のいずれか１項に記載のスクリ−ニング方法であって、前記TRPA1チャネル活性化物質が、ローズマリー、セージ、メースまたは甘草の抽出物であることを特徴とする抗組織線維化物質のスクリーニング方法。   8. The screening method according to any one of claims 1 to 7, wherein the TRPA1 channel activator is an extract of rosemary, sage, mace or licorice. Screening method for chemical substances. ローズマリー、セージまたはマースの抽出物であって、該抽出物がTRPA1チャネル活性化作用を有すると共に、抗組織線維化作用を有する抽出物を主成分とすることを特徴とする抗組織線維化薬剤。   An anti-tissue fibrosis drug comprising an extract of rosemary, sage, or mars, the extract having a TRPA1 channel activating action and an extract having an anti-tissue fibrosis action as a main component . 請求項９に記載の抗組織線維化薬剤であって、前記抽出物がアルコール抽出物であることを特徴とする抗組織線維化薬剤。   The anti-tissue fibrosis drug according to claim 9, wherein the extract is an alcohol extract. 請求項９または１０に記載の抗組織線維化薬剤であって、前記抽出物がエタノール抽出物であることを特徴とする抗組織線維化薬剤。   The anti-tissue fibrosis drug according to claim 9 or 10, wherein the extract is an ethanol extract. ローズマリー、セージまたはマースの抽出物であって、該抽出物がTRPA1チャネル活性化作用を有すると共に、抗組織線維化作用を有する抽出物を主成分とすることを特徴とする抗組織線維化機能性食品。   An anti-tissue fibrosis function comprising an extract of rosemary, sage or mars, the extract having a TRPA1 channel activating action and an extract having an anti-tissue fibrosis action as a main component Sex food. 請求項１２に記載の抗組織線維化機能性食品であって、前記抽出物がアルコール抽出物であることを特徴とする抗組織線維化機能性食品。   The anti-tissue fibrosis functional food according to claim 12, wherein the extract is an alcohol extract. 請求項１２または１３に記載の抗組織線維化機能性食品であって、前記抽出物がエタノール抽出物であることを特徴とする抗組織線維化機能性食品。   The anti-tissue fibrosis functional food according to claim 12 or 13, wherein the extract is an ethanol extract. TRPA1チャネルを発現する間葉系細胞および線維化サイトカインTGF-βを含むことを特徴とする抗組織線維化測定用スクリーニングキット。   A screening kit for measuring an anti-tissue fibrosis, comprising a mesenchymal cell expressing a TRPA1 channel and a fibrotic cytokine TGF-β. 請求項１５に記載の抗組織線維化測定用スクリーニングキットであって、前記間葉系細胞が線維芽細胞又は筋線維芽細胞であることを特徴とする抗組織線維化測定用スクリーニングキット。   The screening kit for anti-tissue fibrosis measurement according to claim 15, wherein the mesenchymal cells are fibroblasts or myofibroblasts.
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