JP2017086066A - 線状コラーゲン架橋多孔体 - Google Patents
線状コラーゲン架橋多孔体 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2017086066A JP2017086066A JP2016208172A JP2016208172A JP2017086066A JP 2017086066 A JP2017086066 A JP 2017086066A JP 2016208172 A JP2016208172 A JP 2016208172A JP 2016208172 A JP2016208172 A JP 2016208172A JP 2017086066 A JP2017086066 A JP 2017086066A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- collagen
- linear
- porous body
- cell culture
- shape
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 title claims abstract description 229
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 title claims abstract description 229
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 title claims abstract description 227
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims abstract description 69
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 51
- 239000002131 composite material Substances 0.000 claims abstract description 4
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 59
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 56
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 49
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 claims description 41
- 230000003176 fibrotic effect Effects 0.000 claims description 27
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 claims description 26
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 25
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 23
- -1 alkali metal bicarbonate Chemical class 0.000 claims description 21
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 claims description 20
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 16
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims description 14
- 238000010382 chemical cross-linking Methods 0.000 claims description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 13
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 claims description 13
- 239000000512 collagen gel Substances 0.000 claims description 10
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 claims description 10
- 230000005251 gamma ray Effects 0.000 claims description 10
- 239000012567 medical material Substances 0.000 claims description 9
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 claims description 9
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 claims description 8
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 claims description 8
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 claims description 8
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 5
- 238000010894 electron beam technology Methods 0.000 claims description 5
- 238000009834 vaporization Methods 0.000 claims description 5
- 230000008016 vaporization Effects 0.000 claims description 5
- 239000004744 fabric Substances 0.000 claims description 4
- 239000004745 nonwoven fabric Substances 0.000 claims description 3
- 239000002759 woven fabric Substances 0.000 claims description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 claims 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 abstract description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 49
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 15
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 15
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 14
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 14
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical class CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 7
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 6
- DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N Tert-Butanol Chemical compound CC(C)(C)O DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 5
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 5
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 4
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 4
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 4
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 4
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002585 base Substances 0.000 description 3
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 3
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 3
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 239000011232 storage material Substances 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000276707 Tilapia Species 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 206010061592 cardiac fibrillation Diseases 0.000 description 2
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 2
- 210000003683 corneal stroma Anatomy 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000002600 fibrillogenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000002439 hemostatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 2
- 210000003041 ligament Anatomy 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 2
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 2
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- UWFRVQVNYNPBEF-UHFFFAOYSA-N 1-(2,4-dimethylphenyl)propan-1-one Chemical compound CCC(=O)C1=CC=C(C)C=C1C UWFRVQVNYNPBEF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- GUTLYIVDDKVIGB-OUBTZVSYSA-N Cobalt-60 Chemical compound [60Co] GUTLYIVDDKVIGB-OUBTZVSYSA-N 0.000 description 1
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 1
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 1
- 241000938605 Crocodylia Species 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 238000002738 Giemsa staining Methods 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000276719 Oreochromis Species 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 231100000987 absorbed dose Toxicity 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- RGCKGOZRHPZPFP-UHFFFAOYSA-N alizarin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C3=C(O)C(O)=CC=C3C(=O)C2=C1 RGCKGOZRHPZPFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 229910000288 alkali metal carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000008041 alkali metal carbonates Chemical class 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 108010045569 atelocollagen Proteins 0.000 description 1
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 1
- 238000005452 bending Methods 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 1
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000007599 discharging Methods 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 210000002242 embryoid body Anatomy 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000001879 gelation Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000006082 mold release agent Substances 0.000 description 1
- 238000000465 moulding Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 238000005192 partition Methods 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229910000028 potassium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000015497 potassium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011736 potassium bicarbonate Substances 0.000 description 1
- TYJJADVDDVDEDZ-UHFFFAOYSA-M potassium hydrogencarbonate Chemical compound [K+].OC([O-])=O TYJJADVDDVDEDZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000010349 pulsation Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000002787 reinforcement Effects 0.000 description 1
- 239000012779 reinforcing material Substances 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 235000014102 seafood Nutrition 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 1
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 1
- 238000004804 winding Methods 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
(a) 可溶化コラーゲン溶液にリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を添加してコラーゲンを線維化させた後、凍結乾燥する方法。
(b) 可溶化コラーゲン溶液にPBSを添加してコラーゲンを線維化させた後、線維化コラーゲンをエタノールシリーズ(エタノール濃度を段階的に高めたエタノールと水との混合液。エタノール濃度:50%、70%、90%、100%)で脱水・脱塩し、次に溶媒をt-ブタノールに置換し、凍結させた後、凍結乾燥する方法。
(c) 可溶化コラーゲン溶液を凍結乾燥した後、PBSでコラーゲンを線維化させる方法。
[1]架橋されているコラーゲン成形体であって、当該成形体は三次元の細胞培養が可能な多孔質構造を有し、当該成形体の外形は線状体の構造を有することを特徴とする線状コラーゲン架橋多孔体。
[2]前記線状コラーゲン架橋多孔体の走査型電子顕微鏡像における、最表面に観察される孔の数が少なくとも30個である一定区画内において、当該孔の最大個数がnであるときに、
平均孔径={Σ(孔iの最大幅+孔iの最小幅)/2}/n(但し、i=1〜n)
の数式によって算出される平均孔径が、50〜300μmの範囲である上記[1]記載の線状コラーゲン架橋多孔体。
[3]前記線状体の構造が、糸状、紐状、棒状、リボン状、コイル状及びスパイラル状からなる形状のうちのいずれか1種又はこれら形状の2種以上が組み合わされた複合形状である上記[1]又は[2]記載の線状コラーゲン架橋多孔体。
[4]前記線状コラーゲン架橋多孔体を構成するコラーゲンが、線維化コラーゲンである上記[1]〜[3]のいずれか1項記載の線状コラーゲン架橋多孔体。
[5]前記多孔質構造の少なくとも一部において、D周期性の横縞が観察されることによって、線維化コラーゲンの存在が確認されるものである上記[4]記載の線状コラーゲン架橋多孔体。
[6]培養細胞が保持された上記[1]〜[5]のいずれか1項記載の線状コラーゲン架橋多孔体。
[7]上記[1]〜[5]のいずれか1項記載の線状コラーゲン架橋多孔体を用いて作製された、組紐、織布、不織布、編物又は綿状物の構造を有する複次元コラーゲン架橋多孔体。
[8]培養細胞が保持された上記[7]記載の複次元コラーゲン架橋多孔体。
[9]上記[8]記載の複次元コラーゲン架橋多孔体であって、1本の線状コラーゲン架橋多孔体には1種類の培養細胞が保持され、且つ複次元コラーゲン架橋多孔体中の培養細胞の種類が2種類以上である、複次元コラーゲン架橋多孔体。
[10]可溶化コラーゲン溶液を線状体に成形する第一工程、凍結乾燥する第二工程、架橋処理する第三工程を含むことを特徴とする、上記[1]〜[5]のいずれか1項記載の線状コラーゲン架橋多孔体の製造方法。
[11]前記第一工程が、可溶化コラーゲン溶液とアルカリ金属重炭酸塩とを混合することによって生成する線維化コラーゲンゲルを線状体に成形する工程である上記[10]記載の線状コラーゲン架橋多孔体の製造方法。
[12]アルカリ金属重炭酸塩の適用量が、コラーゲンの分子量を30万としたときに、アルカリ金属重炭酸塩/可溶化コラーゲン溶液中のコラーゲン(モル比)=3×102〜3×104の範囲である上記[11]記載の線状コラーゲン架橋多孔体の製造方法。
[13]前記第三工程の架橋処理が、下記(1)及び(2)のうちいずれか一方又は双方である、上記[10]〜[12]のいずれか1項記載の線状コラーゲン架橋多孔体の製造方法。
(1)γ線照射、電子線照射、プラズマ照射、UV照射又は熱脱水によって物理的架橋する処理。
(2)水溶性化学架橋剤又は気化能を有する化学架橋剤によって化学的架橋する処理。
[14]上記[1]〜[5]のいずれか1項記載の線状コラーゲン架橋多孔体を細胞培養基材として用いる細胞培養方法であって、乾燥または脱水状態の当該多孔体に、細胞懸濁液を吸収させることによって、細胞を当該多孔体内で三次元的に分布させることを特徴とする細胞培養方法。
[15]上記[1]〜[5]のいずれか1項記載の線状コラーゲン架橋多孔体を渦巻状に巻回させたものを細胞培養基材として用いる細胞培養方法。
[16]上記[7]記載の複次元コラーゲン架橋多孔体を細胞培養基材として用いる細胞培養方法であって、乾燥または脱水状態の当該多孔体に、細胞懸濁液を吸収させることによって、細胞を当該多孔体内で三次元的に分布させることを特徴とする細胞培養方法。
[17]上記[1]〜[5]のいずれか1項記載の線状コラーゲン架橋多孔体を用いた細胞培養用材料。
[18]上記[1]〜[6]のいずれか1項記載の線状コラーゲン架橋多孔体を用いた医用材料。
[19]上記[7]記載の複次元コラーゲン架橋多孔体を用いた細胞培養用材料。
[20]上記[7]〜[9]のいずれか1項記載の複次元コラーゲン架橋多孔体を用いた医用材料。
以下、本発明の線状コラーゲン架橋多孔体(以下「線状多孔体」という)について詳細に説明する。
複次元コラーゲン架橋多孔体(以下「複次元多孔体」という)は、複数本の線状多孔体を用いて2次元的、3次元的に作製されたものであり、具体例として、組紐、織布、不織布、編物又は綿状物の構造を有するものが挙げられる。線状多孔体から複次元多孔体を作製する方法は、公知の方法を用いればよい。
線状多孔体及び複次元多孔体の用途として、例えば、細胞培養用材料、医用材料等を挙げることができる。各用途においては、線状多孔体又は複次元多孔体をそのまま当該用途用材料とする態様の他に、線状多孔体又は複次元多孔体を当該用途用材料を構成する一要素として用いる態様も含まれる。特に医用材料においては、線状多孔体又は複次元多孔体に培養細胞が保持された形態も含まれる。
再生医療用材料と移植用材料は、細胞を保持した材料が含まれることで共通しているが、その他材料として、前者には再生医療用の足場材料等が含まれ、後者には細胞を保持しない材料が含まれる。
細胞保存用材料は、輸送や凍結保存等の際に細胞を保護するための材料であり、細胞培養用の培養細胞と治療のために用いる細胞の両方において用いることができるものである。
組織の補填用材料は、欠損、陥没、穴隙等の患部に埋め込むための材料である。骨補填剤が一例である。
組織の補強用材料は、患部組織への貼付等による接触によって機能回復を図るための材料である。例えば、特定細胞を保持した平面状材料が挙げられ、当該材料を対象臓器(例えば、心臓等)に貼付することによって、当該臓器の機能回復を図る用例が挙げられる。
線状多孔体の製造方法の一例は、可溶化コラーゲン溶液を線状体に成形する第一工程、凍結乾燥する第二工程、架橋処理する第三工程を含むものである。
可溶化コラーゲン溶液として、ティラピアの鱗から製造された多木化学(株)製「セルキャンパス FD-08G」スポンジ品をpH3のHCl溶液に溶解し、コラーゲン濃度を1.1%に調製した無色透明溶液(以下、「コラーゲン溶液A」という)を用いた。
コラーゲン溶液A 9容量部に対し、0.5M重炭酸ナトリウム水溶液 1容量部を混合した。このとき、重炭酸ナトリウム/コラーゲン溶液A中のコラーゲン(モル比)=1.5×103であった。得られた線維化コラーゲンゲルを内径4mm、長さ100mmのプラスチック製チューブに充填した後、-35℃・3時間で凍結乾燥した。これをチューブ内から引き出して、線維化コラーゲンで構成されたコラーゲン多孔体(以下、「凍結乾燥多孔体1」という)を得た。尚、凍結乾燥多孔体1は複数本作製し、以下の実施例にも供試した。
内径4mm、長さ200mmのプラスチック製チューブを用いた以外は、実施例1と同様の方法で線状多孔体を得た。
凍結乾燥多孔体1を、減圧条件下で110℃・10時間で熱脱水架橋することによって、線状多孔体を得た。
凍結乾燥多孔体1を、10%グルタルアルデヒド溶液20mlを入れた5Lのデシケータ(密閉容器)に入れ、室温、8時間保持してグルタルアルデヒド蒸気に暴露した。これを3%グリシン水溶液で洗浄することによって、線状多孔体を得た。
生理食塩水にWSC(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, hydrochloride)を60mMになるように溶解した。これに凍結乾燥多孔体1を30℃で5時間浸漬した。これを3%グリシン水溶液で洗浄することによって、線状多孔体を得た。
PBS中に浸漬した状態で25kGyのγ線照射を行った以外は、実施例1と同様の方法で線状多孔体を得た。
コラーゲン溶液A 9容量部と10倍濃い濃度に作製したPBS 1容量部とを混合し、得られた線維化コラーゲンゲルを内径4mm、長さ100mmのプラスチック製チューブに充填した後、-35℃・3時間で凍結乾燥して、多孔体を得た。
(細胞培養基材の調製)
実施例1の線状多孔体を、細胞培養に使用する培地が入った容器に入れて、培地に浸漬した。さらにもう1回、別の容器で培地に浸漬した。この線状多孔体を12ウェルプレートのウェルに設置したセルカルチャーインサート内に、できるだけ隙間が少なくなるように渦巻状に入れた。
培地は、まずセルカルチャーインサートの外側に入れ、続いてセルカルチャーインサート内にも入れた。これを以下のマウス由来のES-D3細胞、Balb/c 3T3細胞(以下「3T3細胞」と略す)、及びHUVECの各培養試験に用いた。
渦巻き状に入れた線状多孔体の上に、予め培養しておいたマウス由来のES-D3細胞の胚様体を1〜2個播種した。培地は、Non-Essential Amino Acid(NAA)、β-Mercaptoethanol、L-Glutamineを添加したDMEMに、予め非動化した血清を容積比20%添加したものを使用した。37℃、5% CO2環境下で、一般的な手順に従って培養したところ、1週間後には脈動が確認され、心筋への分化が認められた。継続培養したところ、30日後でも細胞が生存しており、ピンセットで引き上げることが可能な力学強度を持って線状多孔体の形態を維持していた。図8は、ピペットで吸引して引き上げたときの写真である。
更に、培養後の線状多孔体を複数本用いて組合せ、立体的な構造体を作製することが出来た(図9)。
3T3細胞株は、培地として予め非動化した血清を容積比10%添加したDMEMを用いて培養した。増殖した細胞を回収し、細胞密度が1.0×107cells/mLになるように細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液を渦巻き状に入れた線状多孔体の上に滴下した。培地を添加し、37℃、5% CO2環境下で、一般的な手順に従って培養した。1週間後に観察したところ、線状多孔体内で細胞の増殖及び生存が確認された(図10)。尚、図10はギムザ染色したものである。また、ピンセットで引き上げることが可能な水準で線状多孔体の形態を維持していた。
HUVECは、培地として血管内皮細胞用基礎培地(Medium 200(Invitrogen社))と血管内皮細胞用増殖サプリメント(Invitrogen社)の混合液を用いて培養し、継代回数が5回以内のものを実験に使用した。増殖した細胞を回収し、細胞密度が1.0×106cells/mLになるように細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液を渦巻き状に入れた線状多孔体の上に滴下した。培地を添加し、37℃、5% CO2環境下で、一般的な手順に従って培養した。1週間後に観察したところ、線状多孔体内で細胞の増殖及び生存が確認された。また、ピンセットで引き上げることが可能な水準で線状多孔体の形態を維持していた。
実施例1の線状多孔体をピンセットで搾って脱水し、細胞培養に使用する培地に浸漬した。その後、ピンセットを使用して線状多孔体から培地を搾り出し、脱水状態とした。この線状多孔体を12ウェルプレートのウェルにできるだけ隙間が少なくなるように渦巻状に入れた。
この細胞懸濁液を渦巻き状に入れた線状多孔体の上に滴下して、細胞懸濁液を線状多孔体に吸収させた。3時間後、培地を添加し、37℃、5% CO2環境下で、一般的な手順に従って培養した。1週間後に観察したところ、線状多孔体内で細胞の増殖及び生存が確認された。また、ピンセットで引き上げることが可能な水準で線状多孔体の形態を維持していた。
コラーゲン溶液Aを内径4mm、長さ100mmのプラスチック製チューブに充填した後、-35℃・3時間で凍結乾燥した。これをチューブ内から引き出して、多孔質のコラーゲン凍結乾燥体を得た。
Claims (20)
- 架橋されているコラーゲン成形体であって、
当該成形体は三次元の細胞培養が可能な多孔質構造を有し、
当該成形体の外形は線状体の構造を有する
ことを特徴とする線状コラーゲン架橋多孔体。 - 前記線状コラーゲン架橋多孔体の走査型電子顕微鏡像における、最表面に観察される孔の数が少なくとも30個である一定区画内において、当該孔の最大個数がnであるときに、
平均孔径={Σ(孔iの最大幅+孔iの最小幅)/2}/n(但し、i=1〜n)
の数式によって算出される平均孔径が、50〜300μmの範囲である請求項1記載の線状コラーゲン架橋多孔体。 - 前記線状体の構造が、糸状、紐状、棒状、リボン状、コイル状及びスパイラル状からなる形状のうちのいずれか1種又はこれら形状の2種以上が組み合わされた複合形状である請求項1又は2記載の線状コラーゲン架橋多孔体。
- 前記線状コラーゲン架橋多孔体を構成するコラーゲンが、線維化コラーゲンである請求項1〜3のいずれか1項記載の線状コラーゲン架橋多孔体。
- 前記多孔質構造の少なくとも一部において、D周期性の横縞が観察されることによって、線維化コラーゲンの存在が確認されるものである請求項4記載の線状コラーゲン架橋多孔体。
- 培養細胞が保持された請求項1〜5のいずれか1項記載の線状コラーゲン架橋多孔体。
- 請求項1〜5のいずれか1項記載の線状コラーゲン架橋多孔体を用いて作製された、組紐、織布、不織布、編物又は綿状物の構造を有する複次元コラーゲン架橋多孔体。
- 培養細胞が保持された請求項7記載の複次元コラーゲン架橋多孔体。
- 請求項8記載の複次元コラーゲン架橋多孔体であって、1本の線状コラーゲン架橋多孔体には1種類の培養細胞が保持され、且つ複次元コラーゲン架橋多孔体中の培養細胞の種類が2種類以上である、複次元コラーゲン架橋多孔体。
- 可溶化コラーゲン溶液を線状体に成形する第一工程、
凍結乾燥する第二工程、
架橋処理する第三工程
を含むことを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1項記載の線状コラーゲン架橋多孔体の製造方法。 - 前記第一工程が、可溶化コラーゲン溶液とアルカリ金属重炭酸塩とを混合することによって生成する線維化コラーゲンゲルを線状体に成形する工程である請求項10記載の線状コラーゲン架橋多孔体の製造方法。
- アルカリ金属重炭酸塩の適用量が、コラーゲンの分子量を30万としたときに、アルカリ金属重炭酸塩/可溶化コラーゲン溶液中のコラーゲン(モル比)=3×102〜3×104の範囲である請求項11記載の線状コラーゲン架橋多孔体の製造方法。
- 前記第三工程の架橋処理が、下記(1)及び(2)のうちいずれか一方又は双方である、請求項10〜12のいずれか1項記載の線状コラーゲン架橋多孔体の製造方法。
(1)γ線照射、電子線照射、プラズマ照射、UV照射又は熱脱水によって物理的架橋する処理。
(2)水溶性化学架橋剤又は気化能を有する化学架橋剤によって化学的架橋する処理。 - 請求項1〜5のいずれか1項記載の線状コラーゲン架橋多孔体を細胞培養基材として用いる細胞培養方法であって、乾燥または脱水状態の当該多孔体に、細胞懸濁液を吸収させることによって、細胞を当該多孔体内で三次元的に分布させることを特徴とする細胞培養方法。
- 請求項1〜5のいずれか1項記載の線状コラーゲン架橋多孔体を渦巻状に巻回させたものを細胞培養基材として用いる細胞培養方法。
- 請求項7記載の複次元コラーゲン架橋多孔体を細胞培養基材として用いる細胞培養方法であって、乾燥または脱水状態の当該多孔体に、細胞懸濁液を吸収させることによって、細胞を当該多孔体内で三次元的に分布させることを特徴とする細胞培養方法。
- 請求項1〜5のいずれか1項記載の線状コラーゲン架橋多孔体を用いた細胞培養用材料。
- 請求項1〜6のいずれか1項記載の線状コラーゲン架橋多孔体を用いた医用材料。
- 請求項7記載の複次元コラーゲン架橋多孔体を用いた細胞培養用材料。
- 請求項7〜9のいずれか1項記載の複次元コラーゲン架橋多孔体を用いた医用材料。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2015217410 | 2015-11-05 | ||
JP2015217410 | 2015-11-05 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2017086066A true JP2017086066A (ja) | 2017-05-25 |
JP6856969B2 JP6856969B2 (ja) | 2021-04-14 |
Family
ID=58766717
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016208172A Active JP6856969B2 (ja) | 2015-11-05 | 2016-10-24 | 線状コラーゲン架橋多孔体の製造方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP6856969B2 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2019037303A (ja) * | 2017-08-22 | 2019-03-14 | 多木化学株式会社 | コラーゲン管状体 |
WO2019064807A1 (ja) * | 2017-09-29 | 2019-04-04 | 祐徳薬品工業株式会社 | コラーゲンビトリゲル及びその精製物の製造方法並びに当該方法により得られたコラーゲンビトリゲル及びその精製物 |
Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0622744A (ja) * | 1992-07-09 | 1994-02-01 | Koken Co Ltd | 細胞培養用コラ−ゲン担体及びその製造方法 |
JP2003325652A (ja) * | 2002-05-16 | 2003-11-18 | Gunze Ltd | 細胞組込型培養皮膚 |
JP2008504921A (ja) * | 2004-07-05 | 2008-02-21 | ユーシーエル ビジネス ピーエルシー | 組織等価物の細胞非依存的製造 |
JP2008079548A (ja) * | 2006-09-28 | 2008-04-10 | Osaka Univ | 細胞培養用担体 |
JP2009112569A (ja) * | 2007-11-07 | 2009-05-28 | Nipro Corp | コラーゲン繊維束の製造方法 |
JP2010045984A (ja) * | 2008-08-19 | 2010-03-04 | Gunze Ltd | 培養皮膚の製造方法、及び、弾性線維組織層を有する培養皮膚 |
WO2012114707A1 (ja) * | 2011-02-21 | 2012-08-30 | 株式会社アトリー | コラーゲン材料、及びコラーゲン材料の製造方法 |
JP2012519537A (ja) * | 2009-03-04 | 2012-08-30 | ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ | 配向されたコラーゲンゲル |
WO2013105665A1 (ja) * | 2012-01-12 | 2013-07-18 | 株式会社ニッピ | コラーゲン構造体、およびコラーゲン構造体の製造方法 |
-
2016
- 2016-10-24 JP JP2016208172A patent/JP6856969B2/ja active Active
Patent Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0622744A (ja) * | 1992-07-09 | 1994-02-01 | Koken Co Ltd | 細胞培養用コラ−ゲン担体及びその製造方法 |
JP2003325652A (ja) * | 2002-05-16 | 2003-11-18 | Gunze Ltd | 細胞組込型培養皮膚 |
JP2008504921A (ja) * | 2004-07-05 | 2008-02-21 | ユーシーエル ビジネス ピーエルシー | 組織等価物の細胞非依存的製造 |
JP2008079548A (ja) * | 2006-09-28 | 2008-04-10 | Osaka Univ | 細胞培養用担体 |
JP2009112569A (ja) * | 2007-11-07 | 2009-05-28 | Nipro Corp | コラーゲン繊維束の製造方法 |
JP2010045984A (ja) * | 2008-08-19 | 2010-03-04 | Gunze Ltd | 培養皮膚の製造方法、及び、弾性線維組織層を有する培養皮膚 |
JP2012519537A (ja) * | 2009-03-04 | 2012-08-30 | ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ | 配向されたコラーゲンゲル |
WO2012114707A1 (ja) * | 2011-02-21 | 2012-08-30 | 株式会社アトリー | コラーゲン材料、及びコラーゲン材料の製造方法 |
WO2013105665A1 (ja) * | 2012-01-12 | 2013-07-18 | 株式会社ニッピ | コラーゲン構造体、およびコラーゲン構造体の製造方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
日本機械学会 第17回バイオエンジニアリング講演会講演論文集, 2005, PP.47-48, JPN6020026674, ISSN: 0004310811 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2019037303A (ja) * | 2017-08-22 | 2019-03-14 | 多木化学株式会社 | コラーゲン管状体 |
WO2019064807A1 (ja) * | 2017-09-29 | 2019-04-04 | 祐徳薬品工業株式会社 | コラーゲンビトリゲル及びその精製物の製造方法並びに当該方法により得られたコラーゲンビトリゲル及びその精製物 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP6856969B2 (ja) | 2021-04-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6138370B2 (ja) | セリシンハイドロゲルの調製方法と使用 | |
US6136024A (en) | Artificial blood vessel | |
CN104144715B (zh) | 胶原蛋白结构体及胶原蛋白结构体的制造方法 | |
CN1105795C (zh) | 胶原材料及其制造方法 | |
ES2856873T3 (es) | Biomaterial multicapa para la regeneración de tejidos y la cicatrización de las heridas | |
JP5789799B2 (ja) | 多孔質体の製造方法、細胞又は組織供給用支持体の製造方法、及び組織供給体の製造方法 | |
JP6399653B2 (ja) | コラーゲンファイバーの製造方法 | |
CN102743796B (zh) | 用聚乙烯醇制成的丝素蛋白多孔支架及其制备方法和用途 | |
WO2019100454A1 (zh) | 一种三维肿瘤模型脱细胞多孔支架、构建方法及其应用 | |
JP2014218453A (ja) | コラーゲン成形体及びその製造方法 | |
JP6429490B2 (ja) | コラーゲン線維架橋多孔体 | |
CN104771787A (zh) | 一种含pga加强网的复合型支架、制备方法及应用 | |
CN108273132A (zh) | 一种丝素蛋白/角蛋白复合多孔材料及其制备方法 | |
JP6856969B2 (ja) | 線状コラーゲン架橋多孔体の製造方法 | |
JP4168740B2 (ja) | コラーゲン製人工血管 | |
JPWO2018211877A1 (ja) | 糸及びその製造方法 | |
US9737590B2 (en) | Self-assembly of collagen fibers from dermis, fascia and tendon for tissue augmentation and coverage of wounds and burns | |
CN102038976A (zh) | 负载rhGM-CSF的组织工程皮肤真皮替代物再生材料及其制备方法 | |
JP5236894B2 (ja) | アパタイト/コラーゲン複合体繊維を含む多孔体及びその製造方法 | |
EP3338817B1 (en) | Prosthesis with a chitosan core for regeneration of nerves and method of its manufacturing | |
JP6432967B2 (ja) | 溶解性コラーゲン線維多孔体 | |
JP2005213449A (ja) | ゼラチンスポンジ | |
CN102921047B (zh) | 一种制备多孔生物材料的方法 | |
JP2013529964A (ja) | 組織修復用の高密度フィブリル状コラーゲンマトリックスおよびその調製方法 | |
JP2008110207A (ja) | 生体注入材、及び美容・医療用バルク材 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20190830 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20200630 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20200722 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20200910 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20201016 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20210318 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20210318 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6856969 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |