JP2017079633A

JP2017079633A - Automatic perfusion culture apparatus

Info

Publication number: JP2017079633A
Application number: JP2015211091A
Authority: JP
Inventors: 起塚本; Ki Tsukamoto; 大輝川田; Daiki Kawada; 直也浅井; Naoya Asai
Original assignee: Takasago Electric Inc
Current assignee: Takasago Electric Inc
Priority date: 2015-10-27
Filing date: 2015-10-27
Publication date: 2017-05-18
Anticipated expiration: 2035-10-27
Also published as: JP6199360B2

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an automatic perfusion culture apparatus capable of perfusing at extremely low flow velocity and low flow rate, a culture medium into a culture vessel, for preferably culturing cells.SOLUTION: The automatic perfusion culture apparatus is configured to insert a culture vessel 5 having on its bottom part, a porous membrane 6 for dissemination of cells, into each well 4 of a well plate 3 which is an external vessel, then, perfuse a culture medium into each well 4 and each culture vessel 5, for culturing cells, and the apparatus comprises a liquid level detector 7 for detecting a liquid level of each well 4. An old culture medium is discharged from the culture vessel 5 of each well 4 by a discharge pump 60. On the basis of a liquid level detection signal from the liquid level detector 7 for detecting the liquid level of each well, a supply pump 40 is operated, then a new culture medium is supplied to each well 4, through a supply tube and supply nozzle 14.SELECTED DRAWING: Figure 1

Description

本発明は、細胞培養（細胞及び生体組織の培養などを含む）に使用され、培養容器内に培地(培養液)を自動的に灌流して細胞培養を行う自動灌流培養装置に関する。 The present invention relates to an automatic perfusion culture apparatus that is used for cell culture (including cell and biological tissue culture) and that automatically cultures a culture medium in a culture vessel to perform cell culture.

近年、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞などの実用化に向けた研究が推進されており、その際、細胞や生体組織を培養し、その培養物を人に移植して再生医療を行う研究が盛んに行われている。 In recent years, research for the practical application of iPS cells, ES cells, etc. has been promoted. At that time, research on regenerative medicine by culturing cells and living tissues and transplanting the culture to humans has been actively conducted. It has been broken.

この種の研究における細胞培養を行う培養工程では、培養容器内に、培地とともに、培養する細胞を播種して収容し、培養容器内の培地を定期的に交換し、或いは培養容器内に培地を略連続して供給し排出する処理が行われる。 In the culture process in which cell culture is performed in this type of research, the cells to be cultured are seeded and stored together with the medium in the culture container, the medium in the culture container is periodically replaced, or the medium is placed in the culture container. A process of supplying and discharging substantially continuously is performed.

細胞を播種した培養容器内に、培地を略連続して灌流しながら細胞培養を行う培地灌流方式の細胞培養装置は、従来、下記特許文献１で提案されている。この培養装置は、古い培地を培養容器から略連続して排出しながら、新しい培地を略連続して培養容器内に供給して細胞培養を行うように構成される。 A culture medium perfusion system cell culture apparatus that performs cell culture while perfusing a culture medium in a culture container seeded with cells has been proposed in Patent Document 1 below. The culture apparatus is configured to perform cell culture by supplying a new medium into the culture container substantially continuously while discharging the old medium from the culture container.

特開２００８−８６２６４号公報JP 2008-86264 A

上記細胞培養装置は、培養容器を気密構造とし、ポンプにより古い培地を培養容器内から排出し、培養容器内の内圧の低下に応じて、新しい培地を培養容器内に供給する。このようなポンプの一定時間の駆動によって、上記細胞培養装置は、培養容器内に培地を灌流させ、或いは古い培地を新しい培地と交換するように動作する。 In the cell culture device, the culture container has an airtight structure, an old medium is discharged from the culture container by a pump, and a new medium is supplied into the culture container as the internal pressure in the culture container decreases. By driving the pump for a certain period of time, the cell culture device operates to perfuse the culture medium in the culture container or to replace the old culture medium with a new culture medium.

しかしながら、この細胞培養装置は、培養容器内の培地の圧力変化や流速の変化を小さくして、培地灌流方式による細胞培養を行うことができるものの、ポンプの動作に伴い、培養容器内で培地が供給ポート側から排出ポート側にある程度の流速で流れる。このため、ポンプの作動による培地の流れが直接的に細胞に印加されやすく、これにより、細胞への培地の刺激が過度に発生し、細胞培養に悪影響を生じやすい課題があった。 However, although this cell culture device can perform cell culture by the medium perfusion method by reducing changes in the pressure and flow rate of the medium in the culture container, the medium is not contained in the culture container as the pump operates. It flows at a certain flow rate from the supply port side to the discharge port side. For this reason, the flow of the culture medium due to the operation of the pump is easily applied directly to the cells, thereby causing excessive stimulation of the culture medium to the cells, which tends to adversely affect the cell culture.

また、上記細胞培養装置は、培地貯留タンク内の培地をポンプにより培養容器内に供給し、培養容器の排出ポートを通して排出した古い培地を、再び培地貯留タンクに戻すように、循環させる構造のため、灌流培養工程の途中で、培地に新たな培地、別の成分培地、或いは薬剤などを加えることが難しいという課題があった。 In addition, the cell culture device has a structure in which the medium in the medium storage tank is supplied into the culture container by a pump, and the old medium discharged through the discharge port of the culture container is circulated so as to return to the medium storage tank again. In the middle of the perfusion culture process, there is a problem that it is difficult to add a new medium, another component medium, or a drug to the medium.

本発明は、上述の課題を解決するものであり、培養容器内に培地を極めて低流速且つ低流量で灌流させ、細胞に緩やかな培地の流れを付与して、良好に細胞培養を行うことができる自動灌流培養装置を提供することを目的とする。 The present invention solves the above-described problem, and allows a medium to be perfused in a culture vessel at an extremely low flow rate and a low flow rate to give a gentle flow of the medium to the cells, thereby performing cell culture well. It is an object of the present invention to provide an automatic perfusion culture apparatus that can be used.

本発明に係る自動灌流培養装置は
培地を収容する外側容器と、
該外側容器内に挿入され、細胞を播種する多孔質の膜を底部に有した培養容器と、
該外側容器内に培地を供給するように配設された供給流路と、
該供給流路を通して該外側容器内に培地を供給する供給ポンプと、
該培養容器内から培地を排出するように配設された排出流路と、
該排出流路を通して該培養容器内から培地を排出する排出ポンプと、
該外側容器内の培地の液面レベルを検出して液面検出信号を発生する液面検出手段と、
該液面検出手段の液面検出信号に基づき、該供給ポンプを制御して、該外側容器への培地の供給量を制御する制御手段と、
を備え、
該外側容器内の培地液面レベルと該培養容器内の培地液面レベルとの差に応じて、該外側容器内の培地が前記多孔質の膜を通して該培養容器内に灌流することを特徴とする。 An automatic perfusion culture apparatus according to the present invention comprises an outer container for containing a medium,
A culture vessel inserted into the outer vessel and having a porous membrane at the bottom for seeding cells;
A supply channel arranged to supply the culture medium into the outer container;
A supply pump for supplying the culture medium into the outer container through the supply channel;
A discharge channel arranged to discharge the medium from the culture vessel;
A discharge pump for discharging the medium from the culture vessel through the discharge channel;
A liquid level detecting means for detecting a liquid level of the medium in the outer container and generating a liquid level detection signal;
Control means for controlling the supply pump based on the liquid level detection signal of the liquid level detection means to control the amount of medium supplied to the outer container;
With
The medium in the outer container is perfused into the culture container through the porous membrane according to the difference between the medium liquid level in the outer container and the medium liquid level in the culture container. To do.

この発明によれば、外側容器内に培地を供給し、外側容器内の培地液面レベルと培養容器内の培地液面レベルとの間にレベル差、つまり外側容器内の培地液面レベルが培養容器内より高くなることにより、培養容器の底部の膜を通して培地が外側容器から培養容器内に灌流するので、培地の灌流は、極めて低流速で且つ低流量で行われる。 According to this invention, the medium is supplied into the outer container, and the level difference between the medium liquid level in the outer container and the medium liquid level in the culture container, that is, the medium liquid level in the outer container is cultured. Since the medium is perfused from the outer container into the culture container through the membrane at the bottom of the culture container by being higher than in the container, the medium is perfused at a very low flow rate and at a low flow rate.

このため、例えば生体細胞が血液やリンパ液の流れに接して成長或いは生存するように、膜上に播種した細胞には、緩やかな培地の流れを付与して、培地の柔らかな接触と刺激を細胞に生じさせることができる。このため、培地の供給に伴う細胞への悪影響は防止され、生体環境下に極めて近い状態で、良好に細胞培養を行うことができる。さらに、細胞培養の途中で、培地に新たな培地を加え、または別の成分培地を加え、或いは培地に薬剤などを加えて細胞培養を行うことができる。 For this reason, for example, cells that are seeded on the membrane are given a gentle flow of the medium so that the living cells grow or survive in contact with the flow of blood or lymph, and the soft contact and stimulation of the medium are applied to the cells. Can be generated. For this reason, the bad influence to the cell accompanying supply of a culture medium is prevented, and cell culture | cultivation can be performed favorably in the state very close to a biological environment. Furthermore, in the middle of cell culture, a new medium can be added to the medium, another component medium can be added, or a drug can be added to the medium to perform cell culture.

また、古い培地を培養容器から排出しつつ、外側容器内の培地の液面レベルを検出し、その液面レベルに基づき供給ポンプを制御して、新しい培地を外側容器内に供給することができるため、適正量の培地を略連続的に、極めて低流量で培養容器の底部に灌流し、培養容器の膜に播種した細胞を良好に培養することができる。 Further, while discharging the old medium from the culture container, the liquid level of the medium in the outer container can be detected, and the supply pump can be controlled based on the liquid level to supply a new medium into the outer container. Therefore, an appropriate amount of the medium can be perfused continuously at a very low flow rate to the bottom of the culture vessel, and the cells seeded on the membrane of the culture vessel can be cultured well.

またここで、上記供給流路は、上記供給ポンプに接続される供給チューブと、該供給チューブに接続され、上記外側容器内に配置される供給ノズルと、を備え、上記排出流路は、上記排出ポンプに接続される排出チューブと、該排出チューブに接続され、上記培養容器内に配置される排出ノズルと、を備えた構成とすることができる。これによれば、灌流培養装置の供給流路及び排出流路を、小型で簡単に形成することができ、簡単に取り扱うことができる。 Further, the supply flow path includes a supply tube connected to the supply pump, and a supply nozzle connected to the supply tube and disposed in the outer container, and the discharge flow path is A discharge tube connected to the discharge pump and a discharge nozzle connected to the discharge tube and disposed in the culture vessel can be provided. According to this, the supply flow channel and the discharge flow channel of the perfusion culture apparatus can be easily formed in a small size and can be easily handled.

またここで、上記供給ポンプは、培地の流路となる供給接液部と、駆動部を駆動して該供給接液部内に培地を送るように動作する供給ポンプ駆動部とが、分離可能に連結され、上記排出ポンプは、培地の流路となる排出接液部と、駆動部を駆動して該排出接液部内から培地を排出するように動作する排出ポンプ駆動部とが、分離可能に連結される構成とすることができる。これによれば、培地の接液部分の洗浄や交換を容易に行うことができる。 Further, the supply pump is configured such that the supply liquid contact part that becomes a flow path of the culture medium and the supply pump drive part that operates to drive the drive part and send the culture medium into the supply liquid contact part are separable. Connected, the discharge pump can be separated into a discharge wetted part serving as a medium flow path and a discharge pump drive that operates to drive the drive unit to discharge the medium from the discharged wetted part. It can be set as the structure connected. According to this, washing | cleaning and replacement | exchange of the liquid-contact part of a culture medium can be performed easily.

またここで、上記外側容器、上記培養容器、上記供給ポンプの供給接液部、上記供給チューブ、供給ノズル、排出ノズル、排出チューブ、及び上記排出接液部は、取り外し交換可能に配設された構成とすることができる。これによれば、培地の接液部分を容易に取り外して、その洗浄や交換を簡便に行うことができる。 Also, here, the outer container, the culture container, the supply wetted part of the supply pump, the supply tube, the supply nozzle, the discharge nozzle, the discharge tube, and the discharge wetted part are arranged to be removable and replaceable. It can be configured. According to this, the liquid contact part of a culture medium can be removed easily and the washing | cleaning and replacement | exchange can be performed simply.

またここで、上記外側容器は、複数のウエルを有したウエルプレートから構成し、各ウエル内に上記培養容器を挿入することができる。これによれば、複数の培養容器を使用して一度に多くの細胞培養を行うことができる。 Here, the outer container is constituted by a well plate having a plurality of wells, and the culture container can be inserted into each well. According to this, many cell cultures can be performed at once using a plurality of culture vessels.

またここで、上記ウエルプレートを取出可能に収納する収納室と該収納室を開閉する開閉蓋とを備えたケースが設けられ、該ケースには、少なくとも、ウエルプレート、培養容器、供給ノズル、供給チューブ、排出ノズル、排出チューブを、収納するように構成することができる。これによれば、ウエルを有したウエルプレートをケース内に収納し、当該ケース内に、少なくとも供給チューブ、供給ノズル、排出チューブ、及び排出ノズルを収納し、且つケースはコンパクトに形成することができるので、自動灌流培養装置を小型化し、構造を簡単化することができる。 Here, a case is provided that includes a storage chamber for removably storing the well plate and an open / close lid for opening and closing the storage chamber. The case includes at least a well plate, a culture vessel, a supply nozzle, a supply The tube, the discharge nozzle, and the discharge tube can be configured to be accommodated. According to this, the well plate having the well is stored in the case, and at least the supply tube, the supply nozzle, the discharge tube, and the discharge nozzle are stored in the case, and the case can be formed compact. Therefore, the automatic perfusion culture apparatus can be miniaturized and the structure can be simplified.

また、使用者は、自動灌流培養装置を小型のケースごとそのままインキュベータ内に出し入れして、簡便に使用することができる。さらに、使用後、ウエルプレート、培養容器、供給ポンプの供給接液部、供給チューブ、供給ノズル、排出ノズル、排出チューブ、排出接液部は、装置から取り出し、洗浄し或いは使い捨てするように使用することができるので、細胞のコンタミネーションを防止しつつ、安価なコストで繰り返し細胞培養に使用することができる。 In addition, the user can easily use the automatic perfusion culture apparatus by putting it in and out of the incubator as it is in the small case. Furthermore, after use, the well plate, the culture vessel, the supply wetted part of the supply pump, the supply tube, the supply nozzle, the discharge nozzle, the discharge tube, and the discharge wetted part are taken out from the apparatus and used to be washed or disposable. Therefore, it can be repeatedly used for cell culture at a low cost while preventing contamination of cells.

ここで、上記液面検出手段として、１対の電極部を有した液面検出器を配設することができ、液面検出器は、外側容器内に１対の電極部を挿入し、電極部間にパルス電圧を印加して外側容器内の液面を検出するように構成することができる。これによれば、培地の液面レベルを比較的簡単に電気的に検出することができ、また、検出時、電極部間にはシングルパルスを印加すればよく、培地に与える電流の影響を最少にすることができる。 Here, a liquid level detector having a pair of electrode portions can be disposed as the liquid level detecting means, and the liquid level detector has a pair of electrode portions inserted into the outer container, The liquid level in the outer container can be detected by applying a pulse voltage between the parts. According to this, it is possible to detect the liquid level of the medium relatively easily and electrically, and at the time of detection, a single pulse may be applied between the electrodes, and the influence of the current on the medium is minimized. Can be.

またここで、上記供給接液部及び上記排出接液部に接続される流路が各々流路マニホールドとして一体化され、流路マニホールドは取り出し交換可能に形成された構成とすることができる。これによれば、流路を簡単に取り外して洗浄し、或いは交換することができる。 Further, here, the flow paths connected to the supply liquid contact part and the discharge liquid contact part are integrated as a flow path manifold, and the flow path manifold can be taken out and replaced. According to this, the flow path can be easily removed and cleaned or replaced.

またここで、流路マニホールド内における、供給ポンプの供給接液部と前記供給ノズル間の各流路に、開閉バルブを接続することができる。これによれば、１台の供給ポンプを使用して、複数の外側容器内に適正量の培地を順に供給することができ、各外側容器について各々供給ノズルを設ける場合に比して、構成を簡単化することができる。 In addition, an open / close valve can be connected to each flow path between the supply liquid contact portion of the supply pump and the supply nozzle in the flow path manifold. According to this, a single supply pump can be used to sequentially supply an appropriate amount of culture medium into a plurality of outer containers, and the configuration can be compared with the case where a supply nozzle is provided for each outer container. It can be simplified.

またここで、上記供給ポンプは圧電ダイヤフラム式ポンプから構成され、上記供給接液部はダイヤフラムを含むポンプ室を有して構成することができる。これによれば、培地を脈動なく連続して外側容器に供給し、使用後には供給接液部を駆動部から簡単に外して洗浄し或いは交換することができる。 Here, the supply pump can be constituted by a piezoelectric diaphragm type pump, and the supply liquid contact part can be constituted by having a pump chamber containing the diaphragm. According to this, the culture medium can be continuously supplied to the outer container without pulsation, and after use, the supply liquid contact part can be easily removed from the drive part and cleaned or replaced.

また、上記液面検出手段として、参照電極と検出電極を有し、液面レベルに応じて変化する該参照電極と該検出電極間の静電容量の変化に基づき、外側容器内の液面レベルを非接触で検出する静電容量式液面センサを、配設することができる。これによれば、培地液面に電極を接触させないため、電流による培地への悪影響をなくすことができる。 In addition, the liquid level detection means includes a reference electrode and a detection electrode, and the liquid level in the outer container is changed based on a change in capacitance between the reference electrode and the detection electrode that changes according to the liquid level. A capacitance type liquid level sensor that detects non-contact can be provided. According to this, since the electrode is not brought into contact with the medium liquid level, the adverse effect on the medium due to the current can be eliminated.

またここで、上記液面検出手段として、光センサを有し、該光センサの受光信号に基づき、光学的に外側容器内の液面レベルを検出する光学式液面センサを、配設することができる。これによれば、電流や電界による培地への悪影響なしに、培地液面の検出を行うことができる。 Further, here, as the liquid level detection means, an optical sensor is provided which has an optical sensor and optically detects the liquid level in the outer container based on the light reception signal of the optical sensor. Can do. According to this, it is possible to detect the medium liquid level without adversely affecting the medium due to current or electric field.

この発明の自動灌流培養装置によれば、培養容器内に培地を極めて低流速且つ低流量で灌流させ、細胞に緩やかな培地の流れを付与して、細胞を良好に培養することができる。 According to the automatic perfusion culture apparatus of the present invention, the medium can be perfused in the culture vessel at a very low flow rate and a low flow rate, and a gentle medium flow can be imparted to the cells, so that the cells can be cultured well.

本発明の一実施形態を示す自動灌流培養装置の概略全体構成図である。1 is a schematic overall configuration diagram of an automatic perfusion culture apparatus showing an embodiment of the present invention. 同自動灌流培養装置の斜視図である。It is a perspective view of the automatic perfusion culture apparatus. 同自動灌流培養装置の斜視図である。It is a perspective view of the automatic perfusion culture apparatus. 同自動灌流培養装置の右側面図である。It is a right view of the automatic perfusion culture apparatus. 同自動灌流培養装置の背面側から見た斜視図である。It is the perspective view seen from the back side of the automatic perfusion culture apparatus. 自動灌流培養装置の平面図である。It is a top view of an automatic perfusion culture apparatus. 自動灌流培養装置の分解斜視図である。It is a disassembled perspective view of an automatic perfusion culture apparatus. ケースの蓋と支持板を外した状態の斜視図である。It is a perspective view of the state where the lid and support plate of the case were removed. 供給ポンプの分解斜視図である。It is a disassembled perspective view of a supply pump. 供給ポンプの概略断面図である。It is a schematic sectional drawing of a supply pump. 供給流路マニホールドの平面図である。It is a top view of a supply flow path manifold. 供給流路マニホールドの斜視図である。It is a perspective view of a supply channel manifold. 供給流路マニホールドの右側面図である。It is a right view of a supply flow path manifold. 排出ポンプの分解斜視図である。It is a disassembled perspective view of a discharge pump. 排出ポンプの下側から見た分解斜視図である。It is the disassembled perspective view seen from the lower side of the discharge pump. 排出ポンプの概略断面図である。It is a schematic sectional drawing of a discharge pump. 排出流路マニホールドの平面図である。It is a top view of a discharge channel manifold. 排出流路マニホールドの斜視図である。It is a perspective view of a discharge channel manifold. 排出流路マニホールドの同右側面図である。It is the same right view of a discharge channel manifold. 自動灌流培養装置の動作を示すフローチャートである。It is a flowchart which shows operation | movement of an automatic perfusion culture apparatus.

以下、本発明の一実施形態を図面に基づいて説明する。この自動灌流培養装置は、図１に示すように、上記外側容器となるウエル４を有したウエルプレート３がケース１の収納室２内に配設され、ウエルプレート３の各ウエル４内に、細胞を播種する多孔質の膜６を底部に有した培養容器５が上から挿入され、各ウエル４内に培地を供給し、各ウエル内に挿入された、培養容器底部の膜６上の細胞に対し、略連続して培地を灌流し、細胞培養を行うように構成される。ここで使用されるウエルプレート３は、６個のウエルを有して構成されが、ウエルの数は６個未満、７個以上とすることもできる。 Hereinafter, an embodiment of the present invention will be described with reference to the drawings. In this automatic perfusion culture apparatus, as shown in FIG. 1, a well plate 3 having a well 4 serving as an outer container is disposed in the storage chamber 2 of the case 1, and in each well 4 of the well plate 3, A culture vessel 5 having a porous membrane 6 at the bottom for seeding cells is inserted from above, a medium is supplied into each well 4, and cells on the membrane 6 at the bottom of the culture vessel are inserted into each well. On the other hand, the medium is perfused substantially continuously to perform cell culture. The well plate 3 used here has six wells, but the number of wells may be less than six or seven or more.

具体的には、図２〜図６に示す如く、自動灌流培養装置は、ウエルプレート３を取出可能に収納する収納室２を備えたケース１と、ケース１の収納室２を覆い開閉可能に設けられた開閉蓋１ａと、ウエルプレート３の各ウエル４内に培地を供給する供給ポンプ４０と、ウエル４内の培養容器５から培地を排出する排出ポンプ６０と、供給ポンプ４０から供給チューブ１３を通して送られた培地を各ウエル４内に供給する供給ノズル１４と、排出ポンプ６０の運転により各ウエル４内の培養容器５から培地を排出する排出ノズル２４と、ウエル４内の培地の液面レベルを検出して液面検出信号を発生する、上記液面検出手段としての液面検出器７と、を備える。また、上記供給流路は、この供給チューブ１３と供給ノズル１４を備え、上記排出流路は、この排出チューブ２３と排出ノズル２４を備えて構成される。 Specifically, as shown in FIGS. 2 to 6, the automatic perfusion culture apparatus covers the case 1 having a storage chamber 2 for storing the well plate 3 so that the well plate 3 can be removed, and the storage chamber 2 of the case 1 can be opened and closed. The provided opening / closing lid 1a, a supply pump 40 for supplying the medium into each well 4 of the well plate 3, a discharge pump 60 for discharging the medium from the culture container 5 in the well 4, and a supply tube 13 from the supply pump 40 Supply nozzle 14 for supplying the medium sent through each well 4 to each well 4, discharge nozzle 24 for discharging the medium from the culture container 5 in each well 4 by operation of the discharge pump 60, and the liquid level of the medium in the well 4 And a liquid level detector 7 as the liquid level detecting means for detecting a level and generating a liquid level detection signal. The supply flow path includes the supply tube 13 and the supply nozzle 14, and the discharge flow path includes the discharge tube 23 and the discharge nozzle 24.

ウエルプレート３を収納するケース１は、図２等に示す如く、薄型の直方体形状の箱状に、透明合成樹脂により成形され、ベース板１ｂ上に固定される。ケース１の開口した上部には、開閉蓋１ａが開閉可能に取り付けられる。ケース１、開閉蓋１ａ、及びウエルプレート３は、透明合成樹脂により形成され、細部培養時、蓋を閉じた状態で、顕微鏡下などにおいて、各培養容器５内の細胞を、容易に観察できるようになっている。 As shown in FIG. 2 and the like, the case 1 for storing the well plate 3 is formed of a transparent synthetic resin into a thin rectangular parallelepiped box and is fixed on the base plate 1b. An open / close lid 1a is attached to the open top of the case 1 so as to be openable and closable. The case 1, the opening / closing lid 1a, and the well plate 3 are formed of a transparent synthetic resin so that the cells in each culture vessel 5 can be easily observed under a microscope or the like with the lid closed at the time of detailed culture. It has become.

さらに、ケース１に隣接したベース板１ｂ上に取付台１ｄが固定され、取付台１ｄ上に、培地を供給する供給ポンプ４０、培地の供給先を各ウエル４において切り換える開閉バルブ１７、各培養容器５内から古い培地を排出する排出ポンプ６０が取り付けられる。さらに、そこに隣接して、新しい培地を入れる培地供給容器８、及び古い培地を入れる廃液容器９が、ベース板１ｂ上に取り付けられる。培地供給容器８には蓋８ａが、廃液容器９には蓋９ａが被せられる。 Further, a mounting base 1d is fixed on the base plate 1b adjacent to the case 1, a supply pump 40 for supplying the culture medium on the mounting base 1d, an opening / closing valve 17 for switching the supply destination of the culture medium in each well 4, and each culture container A discharge pump 60 for discharging the old medium from within 5 is attached. Further, a medium supply container 8 for storing a new medium and a waste liquid container 9 for storing an old medium are attached on the base plate 1b. The culture medium supply container 8 is covered with a lid 8a, and the waste liquid container 9 is covered with a lid 9a.

図８に示すように、ケース１の収納室２内に、６個のウエル４を有するウエルプレート３が収納され、６個のウエル４内には、図１のように、培養容器５が上から挿入される。各ウエル４内に培地供給用の供給ノズル１４が挿入され、各培養容器５内には排出ノズル２４が挿入される。ウエルプレート３がケース１の収納室２内に収納されることに伴い、各ウエル４内に挿入される供給ノズル１４、各培養容器５内に挿入される排出ノズル２４、及びそれらに接続される供給チューブ１３及び排出チューブ２３はケース１内に収納される。図７に示すように、各供給ノズル１４及び各排出ノズル２４は、ケース１内の支持板１ｃに取り付けられ、定位置に保持される。 As shown in FIG. 8, a well plate 3 having six wells 4 is housed in the housing chamber 2 of the case 1, and the culture vessel 5 is placed in the six wells 4 as shown in FIG. Is inserted from. A supply nozzle 14 for supplying a medium is inserted into each well 4, and a discharge nozzle 24 is inserted into each culture vessel 5. As the well plate 3 is stored in the storage chamber 2 of the case 1, the supply nozzle 14 inserted into each well 4, the discharge nozzle 24 inserted into each culture vessel 5, and connected thereto. The supply tube 13 and the discharge tube 23 are accommodated in the case 1. As shown in FIG. 7, each supply nozzle 14 and each discharge nozzle 24 are attached to the support plate 1 c in the case 1 and are held in place.

図１、図８に示すように、各ウエル４に挿入される培養容器５は、カップ状容器状に形成され、その底部には、培養する細胞を播種するために、多孔質の膜６が取り付けられる。膜６は、例えば、直径約０．３〜５μｍの多数の微細孔を有したメンブレンフィルターなどから形成され、培養しようとする細胞が膜６上に播種され、保持されるようになっている。培養容器５は、各ウエル４内に上から挿入されるが、培養容器５の底部に設けた膜６とウエル４の底面との間に、間隔をあけるように、保持される。なお、細胞の培養時、膜６の目詰まりを防止するために、細胞はゲルと混合し、細胞懸濁液として膜上に播種される。 As shown in FIG. 1 and FIG. 8, the culture container 5 inserted into each well 4 is formed in a cup-like container shape, and a porous membrane 6 is formed at the bottom for seeding cells to be cultured. It is attached. The membrane 6 is formed from, for example, a membrane filter having a large number of micropores having a diameter of about 0.3 to 5 μm, and the cells to be cultured are seeded and held on the membrane 6. The culture vessel 5 is inserted into each well 4 from above, but is held so as to leave a gap between the membrane 6 provided at the bottom of the culture vessel 5 and the bottom surface of the well 4. In order to prevent clogging of the membrane 6 during cell culture, the cells are mixed with a gel and seeded on the membrane as a cell suspension.

上記のように、図７に示す如く、ケース１の収納室２内には、各ウエル４内に培地供給用の供給ノズル１４が挿入され、各培養容器５内には排出ノズル２４が挿入される。それらの供給ノズル１４及び排出ノズル２４を支持するために、ケース１内上部に支持板１ｃがウエルプレート３の上方を覆うように配設され、図７に示すごとく、支持板１ｃ上には供給ノズル１４及び排出ノズル２４を保持する部材が設けられる。 As described above, as shown in FIG. 7, the supply nozzle 14 for supplying the medium is inserted into each well 4 and the discharge nozzle 24 is inserted into each culture vessel 5 in the storage chamber 2 of the case 1. The In order to support the supply nozzle 14 and the discharge nozzle 24, a support plate 1c is disposed in the upper part of the case 1 so as to cover the upper part of the well plate 3. As shown in FIG. 7, the supply plate 1c is supplied on the support plate 1c. A member for holding the nozzle 14 and the discharge nozzle 24 is provided.

細胞培養時、この自動灌流培養装置は、使用時、温度、湿度、炭酸ガス濃度などを管理されたインキュベータ内に入れられ、細胞培養が行われるが、図２〜図５に示すように、自動灌流培養装置は、ベース板１ｂ上にケース１、供給ポンプ４０、排出ポンプ６０等を搭載した、小型で簡単な構造となっているので、使用者は、容易にインキュベータ内に装置を出し入れすることができる。 At the time of cell culture, this automatic perfusion culture device is placed in an incubator in which temperature, humidity, carbon dioxide concentration, etc. are controlled at the time of use, and cell culture is performed. As shown in FIGS. Since the perfusion culture apparatus has a small and simple structure in which the case 1, the supply pump 40, the discharge pump 60, etc. are mounted on the base plate 1b, the user can easily put the apparatus in and out of the incubator. Can do.

さらに、図１に示す如く、各ウエル４内の培地の液面を、電気的に検出するために、液面検出手段として液面検出器７が、ケース１内に設けられる。この液面検出器７は、１対の電極部を有し、ウエルプレート３の各ウエル４内に１対の電極部を挿入し、電極部間にパルス電圧を印加してウエル内の液面を検出するように構成される。検出時に印加するパルス幅は、例えば数ｍ秒というように短く設定され、液面が１対の電極部に達したとき、電極部間の電位の低下を検出して、液面を検出する。このため、比較的簡単な構成の検出器により、培地液面を検出することができ、液面検出時に、培地に与える電流の影響を最少にすることができる。 Further, as shown in FIG. 1, a liquid level detector 7 is provided in the case 1 as a liquid level detecting means for electrically detecting the liquid level of the medium in each well 4. The liquid level detector 7 has a pair of electrode portions, and a pair of electrode portions is inserted into each well 4 of the well plate 3 and a pulse voltage is applied between the electrode portions to thereby detect the liquid level in the well. Configured to detect. The pulse width applied at the time of detection is set to be as short as, for example, several milliseconds, and when the liquid level reaches a pair of electrode parts, a drop in potential between the electrode parts is detected to detect the liquid level. Therefore, the medium liquid level can be detected by a detector having a relatively simple configuration, and the influence of the current on the medium can be minimized during the liquid level detection.

液面検出器としては、上記の電極式の液面検出器に代えて、非接触式の静電容量式液面センサを設けることもできる。この静電容量式液面センサは、参照電極と検出電極を有し、液面レベルに応じて変化する参照電極と検出電極間の静電容量の変化に基づき、各ウエル４内の培地の液面レベルを非接触で検出することができる。これによれば、電流による培地への悪影響を防止することができる。 As the liquid level detector, a non-contact capacitive liquid level sensor can be provided instead of the electrode type liquid level detector. This capacitance type liquid level sensor has a reference electrode and a detection electrode, and based on the change in the capacitance between the reference electrode and the detection electrode that changes according to the liquid level, the liquid in the medium in each well 4 The surface level can be detected without contact. According to this, the bad influence to the culture medium by an electric current can be prevented.

また、液面検出器として、光学式液面センサを使用することもできる。光学式液面センサは、光センサを有し、光センサの受光信号に基づき、光学的に各ウエル４内の液面レベルを検出するように構成される。このため、電流や電界を培地に印加せずに、液面レベルを検出するため、電界や電流による培地への悪影響をなくすことができる。 An optical liquid level sensor can also be used as the liquid level detector. The optical liquid level sensor includes an optical sensor, and is configured to optically detect the liquid level in each well 4 based on a light reception signal of the optical sensor. For this reason, since the liquid level is detected without applying an electric current or electric field to the culture medium, it is possible to eliminate adverse effects on the culture medium due to the electric field or electric current.

図８等に示すように、取付台１ｄ内に１台の圧電ダイヤフラム式の供給ポンプ４０が、培地供給容器８内の培地を各ウエル４に供給するために配設される。供給ポンプ４０は、図９、図１０に示すように、小型で薄型の圧電ダイヤフラム式ポンプから構成され、ピエゾ素子等の圧電素子５０とその振動駆動により振動するダイヤフラム４５とを備える。培地供給容器８は、取付台１ｄに隣接したベース板１ｂ上に配設され、容器には新しい培地が入れられ、蓋８ａが被せられる。 As shown in FIG. 8 and the like, one piezoelectric diaphragm type supply pump 40 is provided in the mounting base 1 d to supply the medium in the medium supply container 8 to each well 4. As shown in FIGS. 9 and 10, the supply pump 40 is constituted by a small and thin piezoelectric diaphragm type pump, and includes a piezoelectric element 50 such as a piezoelectric element and a diaphragm 45 that vibrates by its vibration drive. The culture medium supply container 8 is disposed on the base plate 1b adjacent to the mounting base 1d, and a new culture medium is put in the container and the lid 8a is covered.

圧電ダイヤフラム式の供給ポンプ４０は、図９、図１０に示す如く、圧電素子５０を設けた供給ポンプ駆動部４１と、ダイヤフラム４５、ポンプ室４６、入口ポート５４、及び出口ポート５３を設けた供給接液部４２と、が分離可能に結合される。供給ポンプ駆動部４１は、薄い方形の駆動ケース４３を外殻として形成され、駆動ケース４３内に、金属板４９が取り付けられ、金属板４９の内側に圧電素子５０が取り付けられる。さらに、金属板４９の外側に、吸着用のゴム磁石シート４８が取り付けられる。 As shown in FIGS. 9 and 10, the piezoelectric diaphragm type supply pump 40 is provided with a supply pump drive unit 41 provided with a piezoelectric element 50, a diaphragm 45, a pump chamber 46, an inlet port 54, and an outlet port 53. The wetted part 42 is detachably coupled. The supply pump drive unit 41 is formed with a thin rectangular drive case 43 as an outer shell, and a metal plate 49 is attached inside the drive case 43, and the piezoelectric element 50 is attached inside the metal plate 49. Further, a rubber magnet sheet 48 for adsorption is attached to the outside of the metal plate 49.

一方、供給接液部４２は、薄い方形板状の接液ケース４４を外殻として形成され、接液ケース４４内に、ポンプ室４６が形成される。ポンプ室４６の前面にダイヤフラム４５が張設され、ダイヤフラム４５の外側に磁性体ダイヤフラム４７が取り付けられる。接液ケース４４内のポンプ室４６に連通して出口ポート５３と入口ポート５４が設けられ、出口ポート５３に吐出弁５２が設けられ、入口ポート５４に吸入弁５１が設けられる。これにより、圧電素子５０の動作によりダイヤフラム４５が振動すると、入口ポート５４から吸入弁５１を通して培地がポンプ室４６に吸引され、出口ポート５３から吐出弁５２を通して培地が送出される。 On the other hand, the supply liquid contact portion 42 is formed with a thin rectangular plate-shaped liquid contact case 44 as an outer shell, and a pump chamber 46 is formed in the liquid contact case 44. A diaphragm 45 is stretched on the front surface of the pump chamber 46, and a magnetic material diaphragm 47 is attached to the outside of the diaphragm 45. An outlet port 53 and an inlet port 54 are provided in communication with the pump chamber 46 in the liquid contact case 44, a discharge valve 52 is provided at the outlet port 53, and a suction valve 51 is provided at the inlet port 54. As a result, when the diaphragm 45 vibrates due to the operation of the piezoelectric element 50, the culture medium is sucked into the pump chamber 46 from the inlet port 54 through the suction valve 51, and sent out from the outlet port 53 through the discharge valve 52.

供給ポンプ４０は、使用時、図１０に示すように、供給ポンプ駆動部４１と供給接液部４２が重ね合わせて組み付けられるが、供給ポンプ駆動部４１と供給接液部４２を重ね合わせたとき、供給ポンプ駆動部４１のゴム磁石シート４８と供給接液部４２側の金属板４９が吸着し、両者が正確な位置に簡単に組み付けられるようになっている。このため、供給ポンプ４０の使用後、供給接液部４２を洗浄し或いは使い捨てとする場合、供給ポンプ駆動部４１と供給接液部４２を剥がすように操作すれば、ゴム磁石シート４８と金属板４９が分離し、供給接液部４２を供給ポンプ駆動部４１から簡単に取り外して、洗浄し或いは廃棄することができる。 When the supply pump 40 is used, as shown in FIG. 10, the supply pump drive unit 41 and the supply liquid contact unit 42 are overlapped and assembled, but when the supply pump drive unit 41 and the supply liquid contact unit 42 are overlapped, The rubber magnet sheet 48 of the supply pump drive unit 41 and the metal plate 49 on the supply wetted part 42 side are adsorbed, and both can be easily assembled at an accurate position. For this reason, after the supply pump 40 is used, when the supply wetted part 42 is washed or made disposable, if the supply pump drive part 41 and the supply wetted part 42 are operated to be peeled off, the rubber magnet sheet 48 and the metal plate 49 can be separated and the supply wetted part 42 can be easily removed from the supply pump drive 41 for cleaning or disposal.

供給ポンプ４０は、図７等に示すように、供給流路マニホールド１５の下側であって、取付台１ｄ上の凹部内に配設され、その供給接液部４２の入口ポート５４には供給チューブ１３、供給流路マニホールド１５を介して培地供給容器８が接続される。また、供給接液部４２の出口ポート５３は、供給流路マニホールド１５により６チャンネルに分岐されて、６台の開閉バルブ１７に接続される。６台の開閉バルブ１７は、図７に示すように、取付台１ｄ内の凹部で、供給ポンプ４０に隣接した位置に収納され、供給流路マニホールド１５内の供給用流路１６に接続される。 As shown in FIG. 7 and the like, the supply pump 40 is disposed below the supply flow passage manifold 15 and in a recess on the mounting base 1d, and is supplied to the inlet port 54 of the supply liquid contact portion 42. The medium supply container 8 is connected via the tube 13 and the supply flow path manifold 15. The outlet port 53 of the supply liquid contact part 42 is branched into six channels by the supply flow passage manifold 15 and connected to the six open / close valves 17. As shown in FIG. 7, the six opening / closing valves 17 are recessed in the mounting base 1 d and are housed in positions adjacent to the supply pump 40, and are connected to the supply flow path 16 in the supply flow path manifold 15. .

供給流路マニホールド１５は、図１１〜図１３に示すように、合成樹脂製の直方体ブロック状に形成され、その内部に、新しい培地を流すための供給用流路１６が形成される。また、図１１の右側の側面に、供給用流路１６に繋がる入口ポート１５ｂが設けられ、この右側面の入口ポート１５ｂには、上記培地供給容器８に接続される供給チューブ１３が接続される。さらに、供給流路マニホールド１５の底部には、上記供給ポンプ４０の供給接液部４２が接続される凹部とポートが形成され、且つ６台の開閉バルブ１７が接続される凹部とポートが設けられる。供給流路マニホールド１５の正面側に、６本の出口ポート１５ａが設けられ、６台の開閉バルブ１７の吐出側は流路を介してこの６本の出口ポート１５ａに接続される。 As shown in FIGS. 11 to 13, the supply channel manifold 15 is formed in a rectangular parallelepiped block shape made of synthetic resin, and a supply channel 16 for flowing a new medium is formed therein. In addition, an inlet port 15b connected to the supply flow path 16 is provided on the right side surface in FIG. 11, and a supply tube 13 connected to the medium supply container 8 is connected to the inlet port 15b on the right side surface. . Further, a recess and a port to which the supply liquid contact part 42 of the supply pump 40 is connected are formed at the bottom of the supply flow path manifold 15, and a recess and a port to which the six open / close valves 17 are connected are provided. . Six outlet ports 15a are provided on the front side of the supply passage manifold 15, and the discharge sides of the six on-off valves 17 are connected to the six outlet ports 15a through the passages.

これにより、供給流路マニホールド１５内に形成された供給用流路１６は、培地供給容器８側の供給チューブ１３と入口ポート１５ｂを通して、培地を供給ポンプ４０の供給接液部４２の入口ポート５４に吸引し、その出口ポート５３から流路を通して６台の開閉バルブ１７に送り、各開閉バルブ１７の吐出側から出口ポート１５ａを通して培地を送出するように、流路が設けられる。 Thus, the supply flow channel 16 formed in the supply flow channel manifold 15 passes the medium through the supply tube 13 and the inlet port 15b on the medium supply container 8 side, and the inlet port 54 of the supply liquid contact portion 42 of the supply pump 40 is supplied. The flow path is provided so that the medium is sent from the outlet port 53 to the six open / close valves 17 through the flow path, and the medium is sent from the discharge side of each open / close valve 17 through the outlet port 15a.

開閉バルブ１７には、例えば形状記憶合金を駆動部に使用した小型バルブを使用することができる。この小型バルブは、例えば消費電力０．３Ｗ以下、オリフィス０．４ｍｍ程度の、非常に小型のバルブであり、安価に製造することができ、使い捨てとして使用することができる。 As the open / close valve 17, for example, a small valve using a shape memory alloy for the drive unit can be used. This small valve is a very small valve having, for example, power consumption of 0.3 W or less and an orifice of about 0.4 mm, can be manufactured at low cost, and can be used as a disposable.

上記のように、供給流路マニホールド１５内の供給用流路１６は、図１１〜図１３に示す如く、開閉バルブ１７を通して、各ウエル４の供給ノズル１４に、供給チューブ１３を介して接続され、供給ポンプ４０の動作によって、培地供給容器８内の培地が、供給流路マニホールド１５内の供給用流路１６に送られ、開閉バルブ１７を通して、順に供給ノズル１４に供給される。つまり、６台の開閉バルブ１７が順に開放されると、培地は、６チャンネルの供給チューブ１３を通り、６本の供給ノズル１４に順に送られ、各供給ノズル１４から各ウエル４内に供給されるようになっている。 As described above, the supply flow path 16 in the supply flow path manifold 15 is connected to the supply nozzle 14 of each well 4 via the supply tube 13 through the open / close valve 17 as shown in FIGS. By the operation of the supply pump 40, the culture medium in the culture medium supply container 8 is sent to the supply flow path 16 in the supply flow path manifold 15 and is sequentially supplied to the supply nozzle 14 through the open / close valve 17. That is, when the six open / close valves 17 are opened sequentially, the culture medium passes through the six-channel supply tube 13 and is sequentially sent to the six supply nozzles 14 and is supplied from the supply nozzles 14 into the wells 4. It has become so.

さらに、図７等に示す如く、取付台１ｄ上の後部に、排出ポンプ６０が取り付けられる。排出ポンプ６０は、図１４、図１５に示すように、６チャンネルの蠕動式のペリスタポンプから構成され、図１に示す如く、各ウエル４内に挿入された培養容器５内の培地を、排出チューブ２３を介して、廃液容器９に排出する。廃液容器９はベース板１ｂ上の取付台１ｄの隣接位置に配設され、廃液容器９には、蓋９ａが被せられる。 Furthermore, as shown in FIG. 7 etc., the discharge pump 60 is attached to the rear part on the mounting base 1d. As shown in FIGS. 14 and 15, the discharge pump 60 is composed of a 6-channel peristaltic peristaltic pump. As shown in FIG. 1, the medium in the culture vessel 5 inserted into each well 4 is discharged into the discharge tube. Then, the waste liquid is discharged into the waste liquid container 9. The waste liquid container 9 is disposed at a position adjacent to the mount 1d on the base plate 1b, and the waste liquid container 9 is covered with a lid 9a.

排出ポンプ６０の吐出側には、排出流路マニホールド２５が排出チューブ２３を介して接続される。排出流路マニホールド２５は、図１７〜図１９に示すように、その平面凹部内に、６本の入口ポート２５ａが設けられ、その右側面に、１本の出口ポート２５ｂが設けられ、内部に、入口ポート２５ａと出口ポート２５ｂを接続するように、排出用流路２６が形成される。 A discharge passage manifold 25 is connected to the discharge side of the discharge pump 60 via a discharge tube 23. As shown in FIGS. 17 to 19, the discharge passage manifold 25 is provided with six inlet ports 25 a in the planar recess, and one outlet port 25 b on the right side surface. The discharge channel 26 is formed so as to connect the inlet port 25a and the outlet port 25b.

排出ポンプ６０は、培地の流路となる排出接液部６２と、駆動部を駆動して排出接液部６２内から培地を排出するように動作する排出ポンプ駆動部６１とが、分離可能に結合して構成される。排出接液部６２は、図１４に示す如く、ポンプチューブ６３から構成され、ポンプケーシングの下ケース６４ｂ内及びロータ６６上に挿入され、ロータ６６の回転に応じて、ロータ６６の各ローラ６７により押圧され、送液を行う。 In the discharge pump 60, the discharge wetted part 62 serving as a medium flow path and the discharge pump drive 61 that operates to drive the drive unit and discharge the medium from the discharged wetted part 62 are separable. Composed and configured. As shown in FIG. 14, the discharge wetted part 62 is composed of a pump tube 63 and is inserted into the lower case 64 b of the pump casing and on the rotor 66, and is rotated by the rollers 67 of the rotor 66 according to the rotation of the rotor 66. It is pressed and liquid feeding is performed.

排出ポンプ駆動部６１は、図１４、図１５に示す如く、減速機付きの小型モータ６５と、小型モータ６５により低速で回転駆動されるロータ６６とを備える。ロータ６６には複数本（ここでは３本）のローラ６７が、小型モータ６５の回転軸と平行な軸により回転自在に軸支される。ロータ６６の３本のローラ６７には、各々、６チャンネルのローラ部が軸方向に並設され、小型モータ６５の回転軸は、ロータ６６の中心軸に設けた軸穴に、挿入されて連結される。 As shown in FIGS. 14 and 15, the discharge pump drive unit 61 includes a small motor 65 with a speed reducer and a rotor 66 that is rotationally driven by the small motor 65 at a low speed. A plurality of (here, three) rollers 67 are rotatably supported on the rotor 66 by an axis parallel to the rotation axis of the small motor 65. Each of the three rollers 67 of the rotor 66 has a six-channel roller portion arranged in parallel in the axial direction, and the rotation shaft of the small motor 65 is inserted into a shaft hole provided in the central axis of the rotor 66 and connected. Is done.

図１４、図１５に示すように、排出ポンプ６０のポンプケーシングは、上ケース６４ａと下ケース６４ｂとからなり、内部にロータ６６を収納する、略円柱空間状のポンプ室が形成される。排出ポンプ６０のポンプ室内には、内部に挿入されるロータ６６の３本のローラ６７の一部周りに接するように、ポンプチューブ６３がロータ６６上に挿入される。ポンプチューブ６３は、排出ポンプ６０の排出接液部６２を構成し、上ケース６４ａを取り外した状態の、下ケース６４ｂ及びロータ６６上に載置してセットされる。 As shown in FIGS. 14 and 15, the pump casing of the discharge pump 60 includes an upper case 64 a and a lower case 64 b, and a substantially cylindrical space-like pump chamber in which the rotor 66 is housed is formed. In the pump chamber of the discharge pump 60, the pump tube 63 is inserted on the rotor 66 so as to be in contact with a part of the three rollers 67 of the rotor 66 inserted inside. The pump tube 63 constitutes the discharge wetted part 62 of the discharge pump 60, and is placed and set on the lower case 64b and the rotor 66 with the upper case 64a removed.

これにより、排出ポンプ６０から排出接液部６２を分離する場合、上ケース６４ａを下ケース６４ｂ及びロータ６６から取り外せば、ポンプチューブ６３がロータ６６上に露出し、ポンプチューブ６３をポンプケーシングから簡単に取り外して分離することができる。排出ポンプ６０の作動時、小型モータ６５の駆動によりロータ６６が低速回転すると、３本のローラ６７が旋回しながら自転し、ローラ６７の各チャンネルのローラ部が、６チャンネル分のポンプチューブ６３を押し潰しながら回転し、ポンプチューブ６３内の培地を排出側に送ることとなる。 As a result, when separating the discharge wetted part 62 from the discharge pump 60, if the upper case 64a is removed from the lower case 64b and the rotor 66, the pump tube 63 is exposed on the rotor 66, and the pump tube 63 is easily removed from the pump casing. Can be removed and separated. When the discharge pump 60 is operated, when the rotor 66 is rotated at a low speed by the driving of the small motor 65, the three rollers 67 rotate while rotating, and the roller portion of each channel of the roller 67 moves the pump tube 63 for six channels. Rotating while crushing, the medium in the pump tube 63 is sent to the discharge side.

排出ポンプ６０を組み立てる場合、図１４、図１５に示す如く、ポンプチューブ６３を下ケース６４ｂ及びロータ６６上にセットした状態で、上ケース６４ａを下ケース６４ｂの上に被せ、取付板６９を押し付けるように、固定板６８のスリットに取付板６９を挿入する。そして、カバー７０とともに取付板６９を摺動させるのみで、比較的簡単に、排出ポンプ６０を組み立てることができる。カバー７０上にはツマミが突設されている。 When assembling the discharge pump 60, as shown in FIGS. 14 and 15, with the pump tube 63 set on the lower case 64b and the rotor 66, the upper case 64a is placed on the lower case 64b and the mounting plate 69 is pressed. As described above, the attachment plate 69 is inserted into the slit of the fixed plate 68. The discharge pump 60 can be assembled relatively simply by sliding the mounting plate 69 together with the cover 70. A knob is projected on the cover 70.

排出ポンプ６０の使用後には、カバー７０及び取付板６９を持って摺動させ、上ケース６４ａを下ケース６４ｂ上から取り外せば、ポンプケーシングを容易に分解することができる。そしてこの状態で、排出接液部６２のポンプチューブ６３を、ポンプケーシングから取り外し、その洗浄や交換を簡単に行うことができる。 After the discharge pump 60 is used, the pump casing can be easily disassembled by sliding it with the cover 70 and the mounting plate 69 and removing the upper case 64a from the lower case 64b. In this state, the pump tube 63 of the discharge wetted part 62 can be removed from the pump casing and can be easily cleaned and replaced.

図１に示すように、上記構成の自動灌流培養装置は、上記制御手段となるコントローラ３０により制御される。コントローラ３０は、例えばマイクロコンピュータを備えて構成され、ウエルプレート３の各ウエル４に対し自動的に培地の灌流を行い、細胞培養を実施する。 As shown in FIG. 1, the automatic perfusion culture apparatus having the above configuration is controlled by a controller 30 serving as the control means. The controller 30 includes a microcomputer, for example, and automatically perfuses the medium to each well 4 of the well plate 3 to perform cell culture.

上記供給ポンプ４０の圧電素子５０、開閉バルブ１７、排出ポンプ６０の小型モータ６５は、コントローラ３０の制御用出力ポートに接続されて制御され、コントローラ３０の制御用入力ポートには、上記液面検出器７が接続され、液面の検出信号が入力される。コントローラ３０のマイクロプロセッサは、予め記憶されたプログラムデータに基づき、下記のような細胞培養のための灌流処理を実施するように構成される。コントローラ３０とその電源（電池等）は、上記構成の自動灌流培養装置とは別置きで設置され、接続されるが、上記ベース板１ｂと一体に構成することもできる。 The piezoelectric element 50 of the supply pump 40, the on-off valve 17, and the small motor 65 of the discharge pump 60 are connected to and controlled by a control output port of the controller 30, and the liquid level detection is performed on the control input port of the controller 30. The vessel 7 is connected and a liquid level detection signal is input. The microprocessor of the controller 30 is configured to perform perfusion processing for cell culture as described below based on program data stored in advance. The controller 30 and its power source (battery or the like) are installed and connected separately from the automatic perfusion culture apparatus having the above-described configuration, but may be configured integrally with the base plate 1b.

次に、上記自動灌流培養装置の動作を、図２０のフローチャートを参照して説明する。細胞培養を行う場合、先ず、ウエルプレート３の各ウエル４の培養容器５内に、培養しようとする細胞を、その底部の膜６に播種する。 Next, the operation of the automatic perfusion culture apparatus will be described with reference to the flowchart of FIG. When cell culture is performed, first, cells to be cultured are seeded on the membrane 6 at the bottom in the culture vessel 5 of each well 4 of the well plate 3.

このとき、培養しようとする細胞は懸濁液とされ、さらにゲルと混合し、培養容器５の膜６上に播種される。細胞懸濁液をゲルと混合することにより、膜６の目詰まりを防止することができる。ウエルプレート３の各ウエル４内には、所定量の培地（培養液）が入れられ、ケース１の開閉蓋１ａが閉じられる。 At this time, the cells to be cultured are made into a suspension, further mixed with the gel, and seeded on the membrane 6 of the culture vessel 5. By mixing the cell suspension with the gel, clogging of the membrane 6 can be prevented. A predetermined amount of culture medium (culture solution) is placed in each well 4 of the well plate 3, and the open / close lid 1 a of the case 1 is closed.

この状態で、コントローラ３０が起動され、自動灌流培養装置は、所定の温度、湿度、炭酸ガス濃度に管理されたインキュベータ内に入れられ、培地灌流による細胞培養が行われる。 In this state, the controller 30 is activated, and the automatic perfusion culture apparatus is placed in an incubator controlled to a predetermined temperature, humidity, and carbon dioxide concentration, and cell culture is performed by medium perfusion.

コントローラ３０が起動し、培地灌流処理を開始すると、先ず、ステップ１００で、排出ポンプ６０が起動し、各ウエル４内の培養容器５内から培地が排出される。つまり、排出ポンプ６０が作動すると、各培養容器５の排出ノズル２４から培地が吸引され、吸引された培地は、排出チューブ２３から排出流路マニホールド２５内の排出用流路２６を通り、廃液容器９内に排出される。この培地の排出は、所定時間（例えば３０秒間）行われ、所定時間経過後に、ステップ１１０に進み、ステップ１２０で、排出ポンプ６０は停止する。このとき、略一定量の古い培地が各培養容器５から排出される。 When the controller 30 is activated and the medium perfusion process is started, first, in step 100, the discharge pump 60 is activated, and the medium is discharged from the culture container 5 in each well 4. That is, when the discharge pump 60 is activated, the medium is sucked from the discharge nozzle 24 of each culture container 5, and the sucked medium passes from the discharge tube 23 through the discharge flow path 26 in the discharge flow path manifold 25 to the waste liquid container. 9 is discharged. The medium is discharged for a predetermined time (for example, 30 seconds). After the predetermined time elapses, the process proceeds to step 110, and at step 120, the discharge pump 60 is stopped. At this time, a substantially constant amount of old medium is discharged from each culture vessel 5.

ペリスタルポンプからなる排出ポンプ６０は、各培養容器５内の古い培地を、各チャンネルのポンプチューブ６３を通して、脈動を生じさせながら排出するが、培養容器５の底部の膜６に播種された細胞の近傍を灌流する培地は、ウエル４内の液面レベルと培養容器５内の液面レベルとのレベル差に応じて、徐々に非常に低流速且つ低流量で、移動することとなり、培地の灌流に排出ポンプ６０の動作の影響が加わることは皆無である。 The discharge pump 60 composed of a peristaltic pump discharges the old medium in each culture vessel 5 through the pump tube 63 of each channel while causing pulsation, but the cells seeded on the membrane 6 at the bottom of the culture vessel 5 are discharged. The medium to be perfused in the vicinity gradually moves at a very low flow rate and a low flow rate in accordance with the level difference between the liquid level in the well 4 and the liquid level in the culture vessel 5. There is no influence on the operation of the discharge pump 60.

次に、ステップ１３０で、供給ポンプ４０が起動し、ステップ１４０で、各培養容器５の番号を示す「ｎ」を１とする。供給ポンプ４０が起動すると、供給ポンプ４０によって培地供給容器８から新しい培地が吸引され、供給流路マニホールド１５内の供給用流路１６内に吸引される。 Next, in step 130, the supply pump 40 is activated. In step 140, “n” indicating the number of each culture vessel 5 is set to 1. When the supply pump 40 is activated, a new medium is sucked from the medium supply container 8 by the supply pump 40 and is sucked into the supply channel 16 in the supply channel manifold 15.

次に、ステップ１５０で、ｎ番目のウエル４の液面検出器７に、検出用のパルス信号を印加し、次のステップ１６０で、液面検出器７から培地液面の検出信号が入力されたか否かを判定する。 Next, in step 150, a pulse signal for detection is applied to the liquid level detector 7 of the nth well 4, and in the next step 160, a medium level detection signal is input from the liquid level detector 7. It is determined whether or not.

ここで、ｎ番目のウエル４の液面レベルが低い場合、検出信号が入力されないと判定され、次に、ステップ１７０に進み、ｎ番目の開閉バルブ１７を開放する。これにより、供給ポンプ４０によって吸引された新しい培地は、供給流路マニホールド１５内の供給用流路１６からｎ番目の開閉バルブ１７を通り、供給チューブ１３から供給ノズル１４を通して、ｎ番目のウエル４内に供給される。 Here, when the liquid level of the nth well 4 is low, it is determined that the detection signal is not input, and the process proceeds to step 170, where the nth on-off valve 17 is opened. As a result, the new medium sucked by the supply pump 40 passes through the n-th opening / closing valve 17 from the supply channel 16 in the supply channel manifold 15, passes through the supply nozzle 14 from the supply tube 13, and enters the n-th well 4. Supplied in.

そして、次のステップ１８０で、所定時間（例えば１０秒間）経過したか否かを判定し、所定時間が経過するまで、ｎ番目の開閉バルブ１７を開放して、ｎ番目のウエル４内に培地を供給する。この間、ｎ番目のウエル４内に培地が供給され、その液面レベルが上昇していく。 Then, in the next step 180, it is determined whether or not a predetermined time (for example, 10 seconds) has elapsed. The n-th opening / closing valve 17 is opened until the predetermined time elapses, and the medium is placed in the n-th well 4. Supply. During this time, the medium is supplied into the nth well 4 and the liquid level rises.

このとき、図１に示すように、通常、ウエル４内の培地の液面レベルは、培養容器５内の液面レベルに比して高くなっているため、重力によりウエル４内の下部の培地は、液面レベルの低い培養容器５側に緩やかに移動し、その底部の膜６を下側から上側に通り、培養容器５の上部へと徐々に緩やかに灌流する。これにより、膜６に播種されている細胞の周囲に、新たな培地が略連続的に緩やかに付与され、細胞培養が行われる。 At this time, as shown in FIG. 1, since the liquid level of the medium in the well 4 is usually higher than the liquid level in the culture vessel 5, the medium in the lower part of the well 4 is caused by gravity. Moves slowly toward the culture vessel 5 having a low liquid level, passes through the membrane 6 at the bottom from the lower side to the upper side, and gradually perfuses gradually to the upper portion of the culture vessel 5. As a result, a new medium is gently and continuously applied around the cells seeded on the membrane 6 to perform cell culture.

一方、ステップ１８０で、所定時間（例えば１０秒間）が経過したと判定すると、次に、ステップ１５０に戻り、再び、ｎ番目のウエル４の液面検出器７に、検出用のパルス信号を印加し、次のステップ１６０で、液面検出器７から培地液面の検出信号が入力されたか否かを判定する。ここで、培地液面の検出信号が入力されない場合、上記ステップ１７０、ステップ１８０が繰り返され、ｎ番目のウエル４内に培地が供給される。 On the other hand, if it is determined in step 180 that a predetermined time (for example, 10 seconds) has elapsed, the process returns to step 150, and a pulse signal for detection is applied to the liquid level detector 7 of the nth well 4 again. In step 160, it is determined whether or not a medium level detection signal is input from the level detector 7. Here, when the medium level detection signal is not input, the above-described steps 170 and 180 are repeated, and the medium is supplied into the nth well 4.

そして、ｎ番目のウエル４の液面レベルが上昇し、その液面検出器７が液面を検出し、検出信号が出力されると、ステップ１６０からステップ１９０に進み、ｎ番目の開閉バルブ１７を閉鎖する。これにより、ｎ番目のウエル４内への培地の供給は停止する。 Then, when the liquid level of the nth well 4 rises, the liquid level detector 7 detects the liquid level and a detection signal is output, the process proceeds from step 160 to step 190, where the nth open / close valve 17 Close. Thereby, the supply of the culture medium into the nth well 4 is stopped.

そして、次に、ステップ２００に進み、各培養容器５の番号を示す「ｎ」を「ｎ＋１」とし、次のステップ２１０を経て、再びステップ１５０に戻り、ｎ＋１番目のウエル４の液面検出器７に、検出用のパルス信号を印加し、次のステップ１６０で、上記のように、液面検出器７から培地液面の検出信号が入力されたか否かを判定する。 Then, the process proceeds to step 200, where “n” indicating the number of each culture vessel 5 is set to “n + 1”, the process returns to step 150 again through the next step 210, and the liquid level detector of the (n + 1) th well 4 7, a pulse signal for detection is applied, and in the next step 160, as described above, it is determined whether the detection signal of the medium liquid level is input from the liquid level detector 7.

そして、ｎ＋１番目のウエル４の液面レベルが低い場合、上記と同様に、検出信号が入力されないと判定され、次に、ステップ１７０に進み、ｎ＋１番目の開閉バルブ１７を開放する。これにより、供給ポンプ４０によって吸引された新しい培地は、供給流路マニホールド１５内の供給用流路１６からｎ＋１番目の開閉バルブ１７を通り、供給チューブ１３から供給ノズル１４を通して、ｎ＋１番目のウエル４内に供給される。 If the liquid level of the (n + 1) th well 4 is low, it is determined that the detection signal is not input as described above, and the process proceeds to step 170, where the (n + 1) th open / close valve 17 is opened. As a result, the new culture medium sucked by the supply pump 40 passes through the supply channel 16 in the supply channel manifold 15 through the (n + 1) th open / close valve 17 and from the supply tube 13 through the supply nozzle 14 to the (n + 1) th well 4. Supplied in.

そして、次のステップ１８０で、上記と同様、所定時間（例えば１０秒間）経過したか否かを判定し、所定時間が経過するまで、ｎ＋１番目の開閉バルブ１７を開放して、ｎ＋１番目のウエル４内に培地を供給する。この間、上記と同様に、ｎ＋１番目のウエル４内に培地が供給され、その液面レベルが上昇していくこととなる。 Then, in the next step 180, as described above, it is determined whether or not a predetermined time (for example, 10 seconds) has elapsed, and until the predetermined time elapses, the (n + 1) th opening / closing valve 17 is opened and the (n + 1) th well. 4 is supplied with the culture medium. During this time, as described above, the culture medium is supplied into the (n + 1) -th well 4 and the liquid level increases.

そして、ｎ＋１番目のウエル４の液面レベルが上昇し、その液面検出器７が液面を検出し、検出信号が出力されると、上記と同様、ステップ１６０からステップ１９０に進み、ｎ＋１番目の開閉バルブ１７を閉鎖する。これにより、ｎ＋１番目のウエル４内への培地の供給は停止する。 Then, when the liquid level of the (n + 1) th well 4 rises and the liquid level detector 7 detects the liquid level and outputs a detection signal, the process proceeds from step 160 to step 190 in the same manner as described above. The on-off valve 17 is closed. Thereby, the supply of the culture medium into the (n + 1) th well 4 is stopped.

このようにして、ウエルプレート３の全て（６個）のウエル４について、上記ステップ１５０〜ステップ２１０が繰り返され、これにより、全てのウエル４内に適正量の培地が徐々に略連続して供給され、各ウエル４の液面レベルが所定レベルまで上昇した状態となる。これにより、各ウエル４内の液面レベルは、培養容器５内の液面レベルに比して高くなるため、ウエル４内の下部の培地は、重力によって、培養容器５側に移動し、その底部の膜６を下から上に通り、培養容器５内の上部へと移動する。これにより、膜６に播種されている細胞の周囲に、培地が非常に低速且つ低流量で緩やかに流れることとなる。 In this way, the above steps 150 to 210 are repeated for all (six) wells 4 of the well plate 3, whereby an appropriate amount of medium is gradually and substantially continuously supplied to all the wells 4. As a result, the liquid level in each well 4 rises to a predetermined level. As a result, the liquid level in each well 4 becomes higher than the liquid level in the culture vessel 5, so that the lower medium in the well 4 moves to the culture vessel 5 side by gravity, It passes through the bottom membrane 6 from the bottom to the top and moves to the top in the culture vessel 5. As a result, the medium slowly flows at a low speed and with a low flow rate around the cells seeded on the membrane 6.

このような図２０の培地灌流処理は、所定のルーティン時間で繰り返し実行され、その間、ウエルプレート３の各ウエル４内の培養容器５からは、古い培地が徐々に排出され、各ウエル４内には新しい培地が徐々に供給される。それに伴い、各ウエル４内の培地は、培養容器５の底部の膜６を通して、徐々に緩やかに低速、低流量で培養容器５内に灌流され、そのような動作が所定時間、所定の環境下で行われ、培養容器５内の細胞が培養される。 Such a medium perfusion process of FIG. 20 is repeatedly executed at a predetermined routine time, and during this time, the old medium is gradually discharged from the culture vessel 5 in each well 4 of the well plate 3 and is stored in each well 4. Is gradually supplied with fresh medium. Accordingly, the medium in each well 4 is gradually perfused into the culture container 5 at a low speed and a low flow rate through the membrane 6 at the bottom of the culture container 5, and such operation is performed for a predetermined time in a predetermined environment. The cells in the culture vessel 5 are cultured.

なお、上記灌流処理は、培養容器５の１回の排出時間を例えば３０秒とし、各ウエル４への供給時間を例えば１０秒とし、１回の灌流処理を約１分３０秒で実施した。このような灌流処理は、時間間隔を略ゼロとして、連続的に繰り返すことができるが、数十秒から数分間の時間間隔をおいて上記灌流処理を繰り返すこともでき、培養する細胞に応じて、任意に決めることができる。また、培養容器５の排出時間、及びウエル４への供給時間は、容器の大きさ、供給ポンプ４０や排出ポンプ６０の送液能力つまり単位時間当たりの送液量に応じて、任意に変えることができる。 The perfusion treatment was performed for about 1 minute and 30 seconds, with one discharge time of the culture vessel 5 being, for example, 30 seconds and the supply time to each well 4 being, for example, 10 seconds. Such a perfusion treatment can be repeated continuously with a time interval of approximately zero, but the perfusion treatment can be repeated with a time interval of several tens of seconds to several minutes, depending on the cells to be cultured. Can be decided arbitrarily. Further, the discharge time of the culture container 5 and the supply time to the well 4 can be arbitrarily changed according to the size of the container, the liquid supply capacity of the supply pump 40 and the discharge pump 60, that is, the liquid supply amount per unit time. Can do.

上記自動灌流培養装置は、細胞培養の処理が終了した時点で、培養装置がインキュベータから取り出され、各培養容器５内の細胞が顕微鏡下などで観察され検査などが行われる。このような細胞培養の後、培養装置は分解され、次回の使用にそなえて、ケース１内のウエルプレート３、培養容器５、培地供給容器８、廃液容器９、流路マニホールドなどが、洗浄され、或いは使い捨てとして廃棄され、次回の細胞培養時のコンタミネーションを防止する。 In the automatic perfusion culture apparatus, when the cell culture process is completed, the culture apparatus is removed from the incubator, and the cells in each culture vessel 5 are observed under a microscope or the like for inspection. After such cell culture, the culture apparatus is disassembled, and the well plate 3, the culture container 5, the medium supply container 8, the waste liquid container 9, the flow path manifold, etc. in the case 1 are washed for the next use. Alternatively, it is discarded as a single-use product to prevent contamination during the next cell culture.

使用後の自動灌流培養装置の分解は、ケース１の開閉蓋１ａを開き、ケース１内のウエルプレート３、培養容器５、供給ノズル１４、排出ノズル２４、液面検出器７、供給チューブ１３、及び排出チューブ２３を取り外し、それらを洗浄し、或いは廃棄する。さらに、ベース板１ｂ上の培地供給容器８、廃液容器９を外して洗浄或いは廃棄する。 Disassembly of the automatic perfusion culture apparatus after use opens the opening / closing lid 1a of the case 1, and the well plate 3, the culture vessel 5, the supply nozzle 14, the discharge nozzle 24, the liquid level detector 7, the supply tube 13, And remove the drain tube 23 and wash or discard them. Further, the culture medium supply container 8 and the waste liquid container 9 on the base plate 1b are removed and washed or discarded.

上記のように、供給ポンプ４０の供給接液部４２は、その供給ポンプ駆動部４１から簡単に取り外し可能な構造であり、排出ポンプ６０はその排出接液部６２を排出ポンプ駆動部６１から簡単に取り外し可能な構造である。このため、取付台１ｄ上の供給ポンプ４０、開閉バルブ１７及び排出ポンプ６０を取り外し、簡単に、供給ポンプ４０から供給接液部４２を外し、排出ポンプ６０から排出接液部６２を取り外し、それらを洗浄し或いは廃棄することができる。さらに、ベース板１ｂ上の取付台１ｄ上から、供給流路マニホールド１５、排出流路マニホールド２５を、供給チューブ１３、排出チューブ２３などとともに取り外して洗浄し、或いは使い捨てとして廃棄する。 As described above, the supply liquid contact portion 42 of the supply pump 40 has a structure that can be easily detached from the supply pump drive portion 41, and the discharge pump 60 can easily remove the discharge liquid contact portion 62 from the discharge pump drive portion 61. It is a removable structure. For this reason, the supply pump 40, the on-off valve 17 and the discharge pump 60 on the mounting base 1d are removed, the supply liquid contact part 42 is simply removed from the supply pump 40, and the discharge liquid contact part 62 is removed from the discharge pump 60. Can be washed or discarded. Further, the supply flow path manifold 15 and the discharge flow path manifold 25 are removed from the mounting base 1d on the base plate 1b together with the supply tube 13, the discharge tube 23, etc., and are cleaned or discarded as disposable.

このように、上記自動灌流培養装置は、各ウエル４内に培地を供給し、各ウエル４内に挿入された培養容器５の底部の膜６を通して培地を培養容器５内に、徐々に低速、低流量で灌流させ、膜６上に播種した細胞を良好に培養することができる。つまり、ウエル４内の培地液面レベルが培養容器５内より高くなると、培養容器５の底部の膜６を通して培地がウエル４から培養容器５内に灌流し、これにより、培地の灌流は、極めて緩やかに低流速で且つ低流量で行われる。このため、膜６上に播種した細胞には、緩やかな培地の流れが付与される。このため、膜６上の細胞には、緩やかな培地の流れによる適度な刺激が生じて、極めて良好に細胞培養を行うことができる。 As described above, the automatic perfusion culture apparatus supplies the medium into each well 4 and gradually moves the medium into the culture container 5 through the membrane 6 at the bottom of the culture container 5 inserted into each well 4. Cells perfused at a low flow rate and seeded on the membrane 6 can be cultured well. That is, when the medium liquid level in the well 4 becomes higher than that in the culture container 5, the medium is perfused from the well 4 into the culture container 5 through the membrane 6 at the bottom of the culture container 5. It is performed at a low flow rate and a low flow rate. For this reason, a gentle medium flow is imparted to the cells seeded on the membrane 6. For this reason, the cells on the membrane 6 are moderately stimulated by the gentle flow of the medium, and the cell culture can be performed very well.

また、各ウエル内に挿入された培養容器５から古い培地を排出しつつ、各ウエル４内の培地の液面レベルを検出し、その液面レベルに基づき新しい培地を各ウエル４に供給するため、適正量の培地を低速、低流量で培養容器５の底部に灌流して、培養容器５の膜６に播種した細胞を良好に培養することができる。 Further, in order to detect the liquid level of the medium in each well 4 while discharging the old medium from the culture vessel 5 inserted in each well, and supply a new medium to each well 4 based on the liquid level. The cells seeded on the membrane 6 of the culture vessel 5 can be well cultured by perfusing an appropriate amount of the medium at a low speed and a low flow rate to the bottom of the culture vessel 5.

さらに、ウエル４を有したウエルプレート３をケース１内に収納し、ケース１内に、供給チューブ１３、供給ノズル１４、排出チューブ２３、及び排出ノズル２４を収納し、且つケース１はコンパクトに形成することができる。これにより、使用者は、自動灌流培養装置を小型のケース１ごとそのままインキュベータ内に出し入れして、簡便に使用することができる。 Further, the well plate 3 having the well 4 is accommodated in the case 1, the supply tube 13, the supply nozzle 14, the discharge tube 23, and the discharge nozzle 24 are stored in the case 1, and the case 1 is compactly formed. can do. As a result, the user can use the automatic perfusion culture apparatus with the small case 1 as it is in and out of the incubator.

また、自動灌流培養装置は、構造を簡単化して小型化し、安価に製造することができるので、小規模の研究機関などでも、自動灌流培養装置による細胞培養を、簡便に行うことができる。 In addition, since the automatic perfusion culture apparatus can be simplified in structure and reduced in size and manufactured at low cost, cell culture using the automatic perfusion culture apparatus can be easily performed even in a small-scale research institution.

さらに、使用後、ウエルプレート３、培養容器５、供給ポンプ４０の供給接液部４２、供給チューブ１３、供給ノズル１４、排出ノズル２４、排出チューブ２３、排出ポンプ６０の排出接液部６２等は、供給ポンプ駆動部４１や排出ポンプ駆動部６１を除いて、灌流培養装置から簡単に取り外すことができ、取り出した部品は、洗浄し或いは廃棄して使い捨てするように使用されることができる。これにより、本自動灌流培養装置を繰り返し使用する場合、細胞のコンタミネーションを防止しつつ、安価なコストで繰り返し細胞培養に使用することができる。 Further, after use, the well plate 3, the culture vessel 5, the supply wetted part 42 of the supply pump 40, the supply tube 13, the supply nozzle 14, the discharge nozzle 24, the discharge tube 23, the discharge wetted part 62 of the discharge pump 60, etc. Except for the supply pump drive unit 41 and the discharge pump drive unit 61, they can be easily removed from the perfusion culture apparatus, and the removed parts can be used to be washed or discarded for disposable use. Thereby, when this automatic perfusion culture apparatus is repeatedly used, it can be used for repeated cell culture at a low cost while preventing cell contamination.

１ケース
１ａ開閉蓋
１ｂベース板
１ｃ支持板
１ｄ取付台
２収納室
３ウエルプレート
４ウエル
５培養容器
６膜
７液面検出器
８培地供給容器
８ａ蓋
９廃液容器
９ａ蓋
１３供給チューブ
１４供給ノズル
１５供給流路マニホールド
１５ａ出口ポート
１５ｂ入口ポート
１６供給用流路
１７開閉バルブ
２３排出チューブ
２４排出ノズル
２５排出流路マニホールド
２５ａ入口ポート
２５ｂ出口ポート
２６排出用流路
３０コントローラ
４０供給ポンプ
４１供給ポンプ駆動部
４２供給接液部
４３駆動ケース
４４接液ケース
４５ダイヤフラム
４６ポンプ室
４７磁性体ダイヤフラム
４８ゴム磁石シート
４９金属板
５０圧電素子
５１吸入弁
５２吐出弁
５３出口ポート
５４入口ポート
６０排出ポンプ
６１排出ポンプ駆動部
６２排出接液部
６３ポンプチューブ
６４ａ上ケース
６４ｂ下ケース
６５小型モータ
６６ロータ
６７ローラ
６８固定板
６９取付板
７０カバー

DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Case 1a Open / close lid 1b Base plate 1c Support plate 1d Mounting base 2 Storage chamber 3 Well plate 4 Well 5 Culture vessel 6 Membrane 7 Liquid level detector 8 Medium supply container 8a Lid 9 Waste liquid container 9a Lid 13 Supply tube 14 Supply nozzle 15 Supply passage manifold 15a Outlet port 15b Inlet port 16 Supply passage 17 Open / close valve 23 Discharge tube 24 Discharge nozzle 25 Discharge passage manifold 25a Inlet port 25b Outlet port 26 Discharge passage 30 Controller 40 Supply pump 41 Supply pump drive unit 42 Supply wetted part 43 Drive case 44 Liquid contact case 45 Diaphragm 46 Pump chamber 47 Magnetic diaphragm 48 Rubber magnet sheet 49 Metal plate 50 Piezoelectric element 51 Suction valve 52 Discharge valve 53 Outlet port 54 Inlet port 60 Exhaust pump 61 Discharge pump drive unit 62 Discharge liquid contact unit 63 Pump tube 64a Upper case 64b Lower case 65 Small motor 66 Rotor 67 Roller 68 Fixed plate 69 Mounting plate 70 Cover

Claims

培地を収容する外側容器と、
該外側容器内に挿入され、細胞を播種する多孔質の膜を底部に有した培養容器と、
該外側容器内に培地を供給するように配設された供給流路と、
該供給流路を通して該外側容器内に培地を供給する供給ポンプと、
該培養容器内から培地を排出するように配設された排出流路と、
該排出流路を通して該培養容器内から培地を排出する排出ポンプと、
該外側容器内の培地の液面レベルを検出して液面検出信号を発生する液面検出手段と、
該液面検出手段の液面検出信号に基づき、該供給ポンプを制御して、該外側容器への培地の供給量を制御する制御手段と、
を備え、
該外側容器内の培地液面レベルと該培養容器内の培地液面レベルとの差に応じて、該外側容器内の培地が前記多孔質の膜を通して該培養容器内に灌流することを特徴とする自動灌流培養装置。 An outer container containing the medium;
A culture vessel inserted into the outer vessel and having a porous membrane at the bottom for seeding cells;
A supply channel arranged to supply the culture medium into the outer container;
A supply pump for supplying the culture medium into the outer container through the supply channel;
A discharge channel arranged to discharge the medium from the culture vessel;
A discharge pump for discharging the medium from the culture vessel through the discharge channel;
A liquid level detecting means for detecting a liquid level of the medium in the outer container and generating a liquid level detection signal;
Control means for controlling the supply pump based on the liquid level detection signal of the liquid level detection means to control the amount of medium supplied to the outer container;
With
The medium in the outer container is perfused into the culture container through the porous membrane according to the difference between the medium liquid level in the outer container and the medium liquid level in the culture container. Automatic perfusion culture device.

前記供給流路は、前記供給ポンプに接続される供給チューブと、該供給チューブに接続され、前記外側容器内に配置される供給ノズルと、を備え、
前記排出流路は、前記排出ポンプに接続される排出チューブと、該排出チューブに接続され、前記培養容器内に配置される排出ノズルと、を備えたことを特徴とする請求項１記載の自動灌流培養装置。 The supply flow path includes a supply tube connected to the supply pump, and a supply nozzle connected to the supply tube and disposed in the outer container,
The automatic discharge apparatus according to claim 1, wherein the discharge flow path includes a discharge tube connected to the discharge pump, and a discharge nozzle connected to the discharge tube and disposed in the culture vessel. Perfusion culture device.

前記供給ポンプは、培地の流路となる供給接液部と、駆動部を駆動して該供給接液部内に培地を送るように動作する供給ポンプ駆動部とが、分離可能に連結され、前記排出ポンプは、培地の流路となる排出接液部と、駆動部を駆動して該排出接液部内から培地を排出するように動作する排出ポンプ駆動部とが、分離可能に連結されたことを特徴とする請求項２記載の自動灌流培養装置。 In the supply pump, a supply wetted part serving as a flow path for the culture medium and a supply pump driving part that operates to drive the drive part and send the culture medium into the supply wetted part are detachably connected, In the discharge pump, a discharge wetted part serving as a medium flow path and a discharge pump drive that operates to drive the drive unit to discharge the medium from the discharge wetted part are detachably connected. The automatic perfusion culture apparatus according to claim 2.

前記外側容器、前記培養容器、前記供給ポンプの供給接液部、前記供給チューブ、供給ノズル、排出ノズル、排出チューブ、及び前記排出ポンプの排出接液部は、取り外し交換可能に配設されたことを特徴とする請求項３記載の自動灌流培養装置。 The outer container, the culture container, the supply wetted part of the supply pump, the supply tube, the supply nozzle, the discharge nozzle, the discharge tube, and the discharge wetted part of the discharge pump were arranged to be removable and replaceable. The automatic perfusion culture apparatus according to claim 3.

前記外側容器は、複数のウエルを有したウエルプレートからなり、各ウエル内に前記培養容器が挿入されたことを特徴とする請求項２記載の自動灌流培養装置。 The automatic perfusion culture apparatus according to claim 2, wherein the outer container is formed of a well plate having a plurality of wells, and the culture container is inserted into each well.

前記ウエルプレートを取出可能に収納する収納室と該収納室を開閉する開閉蓋とを備えたケースが設けられ、該ケースには、少なくとも、該ウエルプレート、前記培養容器、供給ノズル、供給チューブ、排出ノズル、排出チューブが、収納されたことを特徴とする請求項５記載の自動灌流培養装置。 A case provided with a storage chamber for removably storing the well plate and an open / close lid for opening and closing the storage chamber is provided, and the case includes at least the well plate, the culture vessel, a supply nozzle, a supply tube, 6. The automatic perfusion culture apparatus according to claim 5, wherein the discharge nozzle and the discharge tube are accommodated.

前記供給接液部に接続される流路が供給流路マニホールドとして一体化され、該供給流路マニホールドは取り出し交換可能に形成されたことを特徴とする請求項３記載の自動灌流培養装置。 4. The automatic perfusion culture apparatus according to claim 3, wherein a flow path connected to the supply wetted part is integrated as a supply flow path manifold, and the supply flow path manifold is formed to be removable and replaceable.

前記排出接液部に接続される流路が排出流路マニホールドとして一体化され、該排出流路マニホールドは取り出し交換可能に形成されたことを特徴とする請求項３記載の自動灌流培養装置。 4. The automatic perfusion culture apparatus according to claim 3, wherein a flow path connected to the discharge wetted part is integrated as a discharge flow path manifold, and the discharge flow path manifold is formed so as to be removable and replaceable.

前記供給流路マニホールド内における、供給ポンプの供給接液部と前記供給ノズル間の各流路に、開閉バルブが接続されたことを特徴とする請求項７記載の自動灌流培養装置。 8. The automatic perfusion culture apparatus according to claim 7, wherein an open / close valve is connected to each flow path between the supply liquid contact portion of the supply pump and the supply nozzle in the supply flow path manifold.

前記供給ポンプは圧電ダイヤフラム式ポンプから構成され、前記供給接液部はダイヤフラムを含むポンプ室を有していることを特徴とする請求項３記載の自動灌流培養装置。 4. The automatic perfusion culture apparatus according to claim 3, wherein the supply pump is constituted by a piezoelectric diaphragm type pump, and the supply wetted part has a pump chamber containing the diaphragm.

前記液面検出手段として、１対の電極部が前記外側容器内に挿入され、該電極部間にパルス電圧を印加して該外側容器内の液面を検出する液面検出器が配設されることを特徴とする請求項１記載の自動灌流培養装置。 As the liquid level detecting means, a pair of electrode parts are inserted into the outer container, and a liquid level detector is provided for detecting the liquid level in the outer container by applying a pulse voltage between the electrode parts. The automatic perfusion culture apparatus according to claim 1.

前記液面検出手段として、光センサを有し、該光センサの受光信号に基づき、光学的に前記外側容器内の液面レベルを検出する光学式液面センサが、配設されたことを特徴とする請求項１記載の自動灌流培養装置。 As the liquid level detecting means, there is provided an optical liquid level sensor that has an optical sensor and optically detects a liquid level in the outer container based on a light reception signal of the optical sensor. The automatic perfusion culture apparatus according to claim 1.

前記液面検出手段として、参照電極と検出電極を有し、液面レベルに応じて変化する該参照電極と該検出電極間の静電容量の変化に基づき、前記外側容器内の液面レベルを非接触で検出する静電容量式液面センサが、配設されたことを特徴とする請求項１記載の自動灌流培養装置。

The liquid level detection means includes a reference electrode and a detection electrode. Based on a change in capacitance between the reference electrode and the detection electrode that changes according to the liquid level, the liquid level in the outer container is determined. 2. The automatic perfusion culture apparatus according to claim 1, wherein a capacitance type liquid level sensor for detecting in a non-contact manner is provided.