JP2017071593A - 軟骨細胞注入キット - Google Patents
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Abstract
Description
[1]魚類由来の可溶化コラーゲンを含む細胞等張性コラーゲン溶液と、軟骨細胞又は軟骨細胞への分化能を有する細胞及び細胞用培養液を含む細胞懸濁液と、を構成要素として含むことを特徴とする軟骨細胞注入キット。
[2]さらに、前記細胞等張性コラーゲン溶液が、哺乳類由来の可溶化コラーゲンを含むものである上記[1]記載の軟骨細胞注入キット。
[3]前記細胞等張性コラーゲン溶液中の魚類由来の可溶化コラーゲンと哺乳類由来の可溶化コラーゲンの質量比が、1:2〜3:1の範囲である上記[2]記載の軟骨細胞注入キット。
[4]さらに、細胞等張性コラーゲン溶液及び細胞懸濁液のうちいずれか一方又は双方が、コンドロイチン硫酸を含むものである上記[1]〜[3]のいずれか1項記載の軟骨細胞注入キット。
本発明の軟骨細胞注入キットの第一形態は、魚類由来の可溶化コラーゲンを含む細胞等張性コラーゲン溶液と、軟骨系細胞及び細胞用培養液を含む細胞懸濁液と、を構成要素として含むことを特徴とするものである。
本発明の軟骨細胞注入キットの第二形態は、第一形態において、前記細胞等張性コラーゲン溶液がさらに哺乳類由来の可溶化コラーゲンを含むものである。即ち、魚類由来の可溶化コラーゲン及び哺乳類由来の可溶化コラーゲンを含む細胞等張性コラーゲン溶液と、軟骨系細胞及び細胞用培養液を含む細胞懸濁液と、を構成要素として含むことを特徴とする軟骨細胞注入キットである。
本発明の軟骨細胞注入キットの第三形態は、第一形態又は第二形態において、細胞懸濁液及び細胞等張性コラーゲン溶液のうちいずれか一方又は双方がさらにコンドロイチン硫酸を含むものである。即ち、第三形態として、以下の(a)〜(f)の形態が挙げられる。
(a)第一形態において、細胞等張性コラーゲン溶液にコンドロイチン硫酸が含まれる形態:
魚類由来の可溶化コラーゲン及びコンドロイチン硫酸を含む細胞等張性コラーゲン溶液と、軟骨系細胞及び細胞用培養液を含む細胞懸濁液と、を構成要素として含むことを特徴とする軟骨細胞注入キット。
(b)第一形態において、細胞懸濁液にコンドロイチン硫酸が含まれる形態:
魚類由来の可溶化コラーゲンを含む細胞等張性コラーゲン溶液と、軟骨系細胞、細胞用培養液及びコンドロイチン硫酸を含む細胞懸濁液と、を構成要素として含むことを特徴とする軟骨細胞注入キット。
(c)第一形態において、細胞等張性コラーゲン溶液と細胞懸濁液の両方にコンドロイチン硫酸が含まれる形態:
魚類由来の可溶化コラーゲン及びコンドロイチン硫酸を含む細胞等張性コラーゲン溶液と、軟骨系細胞、細胞用培養液及びコンドロイチン硫酸を含む細胞懸濁液と、を構成要素として含むことを特徴とする軟骨細胞注入キット。
(d)第二形態において、細胞等張性コラーゲン溶液にコンドロイチン硫酸が含まれる形態:
魚類由来の可溶化コラーゲン、哺乳類由来の可溶化コラーゲン及びコンドロイチン硫酸を含む細胞等張性コラーゲン溶液と、軟骨系細胞及び細胞用培養液を含む細胞懸濁液と、を構成要素として含むことを特徴とする軟骨細胞注入キット。
(e)第二形態において、細胞懸濁液にコンドロイチン硫酸が含まれる形態:
魚類由来の可溶化コラーゲン及び哺乳類由来の可溶化コラーゲンを含む細胞等張性コラーゲン溶液と、軟骨系細胞、細胞用培養液及びコンドロイチン硫酸を含む細胞懸濁液と、を構成要素として含むことを特徴とする軟骨細胞注入キット。
(f)第二形態において、細胞等張性コラーゲン溶液と細胞懸濁液の両方にコンドロイチン硫酸が含まれる形態:
魚類由来の可溶化コラーゲン、哺乳類由来の可溶化コラーゲン及びコンドロイチン硫酸を含む細胞等張性コラーゲン溶液と、軟骨系細胞、細胞用培養液及びコンドロイチン硫酸を含む細胞懸濁液と、を構成要素として含むことを特徴とする軟骨細胞注入キット。
第二形態及び第三形態は、第一形態に収縮抑制の特性を付与したものである。即ち、哺乳類由来の可溶化コラーゲンとコンドロイチン硫酸は、それぞれ単独で収縮抑制作用を発揮することができるものである。また、両者を併用したときには相乗効果の発揮までは期待し難いが、少なくともいずれか大きい方の収縮抑制作用を得ることができる。
細胞等張性コラーゲン溶液は、上記のように各形態において以下の要素を含む。
・第一形態、第三(b)形態:魚類由来の可溶化コラーゲン。
・第二形態、第三(e)形態:魚類由来の可溶化コラーゲン、哺乳類由来の可溶化コラーゲン。
・第三(a)(c)形態:魚類由来の可溶化コラーゲン、コンドロイチン硫酸。
・第三(d)(f)形態:魚類由来の可溶化コラーゲン、哺乳類由来の可溶化コラーゲン、コンドロイチン硫酸。
細胞懸濁液は、上記のように各形態において以下の要素を含む。
・第一形態、第二形態、第三(a)(d)形態:軟骨系細胞、細胞用培養液。
・第三(b)(c)(e)(f)形態:軟骨系細胞、細胞用培養液、コンドロイチン硫酸。
コンドロイチン硫酸を含む形態においては、必要に応じて、細胞等張性が保持されるようにコンドロイチン硫酸の種類と量に応じた調整を行うことが好ましい。本発明の軟骨細胞注入キット中に含有されるコンドロイチン硫酸の総量は、他の要素との兼ね合いから上限は20質量%とすることが好ましい。例えば、0.1〜20質量%の範囲が好ましく、より好ましくは0.1〜10質量%の範囲であり、さらに好ましくは0.5〜5質量%の範囲である。
一般的な可溶化コラーゲン溶液と同様に、細胞等張性コラーゲン溶液も適度なイオン強度及びpHにして適度に加温するとゲル化が引き起こされる。魚類由来の可溶化コラーゲンは、線維化速度が特に速いため、注入型に特に適している。
本発明の軟骨細胞注入キットの好適な使用方法の一形態は、用時調製的使用方法、即ち、細胞等張性コラーゲン溶液と細胞懸濁液とを混合した後に患部に注入する方法である。本使用方法において、線維化速度が速い魚類由来の可溶化コラーゲンを用いることの利点が活かされる。即ち、魚類由来の可溶化コラーゲンは、細胞懸濁液と接触したときに線維化条件の1つである適度なイオン強度及びpH環境下に置かれることになり、次に患部に注入されたときに体温で加温されることによって短時間でゲル化してコラーゲンゲルが生成する。そして、コラーゲンゲルによって包埋された軟骨系細胞が注入部位に固定されることが期待される。また、コラーゲンゲルは軟骨系細胞の足場として好適であるため、軟骨系細胞の増殖及び軟骨基質産生が起き、患部の修復が期待できるものである。尚、本使用方法において、患部に注入するまでは、両液及び混合液はコラーゲンが線維化しないように低温に保つことが望ましい。簡便には、冷蔵保存から取り出した直後のものを用いればよい。注入用器具としては、両液を注入用器具の注入部位において混合できるものを用いてもよい。
以下、本発明の軟骨細胞注入キットに用いる各種原料について説明する。
魚類由来の可溶化コラーゲンは、コラーゲン含有組織から公知の方法によって取得することができるものであり、例えば、[1]希酸により抽出する方法によって得られる酸可溶化コラーゲン、[2]酵素で可溶化処理する方法によって得られる酵素可溶化コラーゲン、[3]アルカリで可溶化処理する方法によって得られるアルカリ可溶化コラーゲン等が挙げられる。好適には、コラーゲンの抗原決定基であるテロペプタイドを除去することが可能な[2]又は[3]の方法により取得されたものである。尚、ペプチド、アミノ酸、ゼラチン等が一部混入していても構わないが、それらは極力排除されていることが好ましい。
哺乳類由来の可溶化コラーゲンは、皮、骨、腱等のコラーゲンを多く含む原料から公知の方法によって取得することができるものである。例えば、原料に脱脂、脱灰等の前処理を施した後、魚類由来の可溶化コラーゲンに関する説明で挙げた上記[1]〜[3]のいずれかを適用することによって取得することができるが、好適には上記[2]又は[3]の方法により取得されたものである。
軟骨系細胞は、動物由来のものであり、動物の種類として、例えば、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、哺乳類等が挙げられるが、注入対象動物と同じ種に属する動物由来のものを用いることが望ましい。より好適には、注入対象動物自身(ヒトで云えば患者自身)から採取した、即ち、自家細胞であるところの軟骨系細胞である。本発明においては、軟骨系細胞には純粋な軟骨細胞は勿論のこと、軟骨細胞と同等の機能を有する軟骨様細胞も含まれるものとする。尚、以下で説明する「軟骨細胞への分化能を有する細胞」と「軟骨細胞」においては特に言及しないが、軟骨様細胞も含まれるものである。
細胞用培養液は、注入する軟骨系細胞に適した培養液であれば特に限定されることなく用いることができる。例えば、軟骨細胞の培養液としては、DMEM(ダルベッコ変法イーグル培地)が好適である。また、間葉系幹細胞、人工多能性幹細胞(iPS細胞)及び胚性幹細胞(ES細胞)には、それぞれの幹細胞に適した市販の培地又は独自に調合した培地を用いればよい。
コンドロイチン硫酸としては、コンドロイチン硫酸の塩を用いてもよく、好例はナトリウム塩である。コンドロイチン硫酸は、コンドロイチン硫酸A〜Eのいずれであっても構わないが、好適にはコンドロイチン硫酸A又はCであり、より好適にはコンドロイチン硫酸Cである。
本発明の軟骨細胞注入キットには、本発明の効果を損なわない範囲内において、その他要素(以下「第三要素」という)を含んでもよい。第三要素としては、例えば患部へのコラーゲンゲルの固着を促すために糊性を有するものであることが好ましいが、これに限定されるものではない。第三要素の具体例として、フィブリン、トロンビン、ゼラチン、ヒアルロン酸、アルギン酸等が挙げられる。第三要素の適用方法として、患部への注入前の細胞懸濁液と細胞等張性コラーゲン溶液との混合液に第三要素を添加・混合する方法、患部においてコラーゲンのゲル化が誘導されたところに第三要素を添加する方法等を例示することができるが、これ以外の方法も用いることができる。
ティラピアの鱗から製造された多木化学(株)製「AQ-03LE」を凍結乾燥した後、生理食塩水(大塚製薬(株)製「大塚生食注」)に溶解しpH調整を行い、コラーゲン濃度3%、pH3.3、無色透明の魚類由来の可溶化コラーゲン(以下「うろこコラーゲン」という)を含有した溶液を調製した。うろこコラーゲン溶液は細胞等張性を有するものである。
ウシの真皮から製造されたコラーゲン濃度3%の(株)高研製「コーケンアテロコラーゲンインプラント(登録商標)」を無色透明の哺乳類由来の可溶化コラーゲン(以下「牛コラーゲン」という)として用いた。牛コラーゲン溶液は細胞等張性を有するものである。
軟骨細胞は、ウサギ(日本白色家兎)の膝、股、肩関節から関節軟骨を採取し、トリプシンEDTA溶液及びコラゲナーゼ溶液で酵素処理を行い、軟骨細胞を分離・回収したものを用いた。
細胞用培養液は、10%FBS(ウシ胎児血清)含有DMEMを用いた。尚、細胞培養液には、抗生物質、緩衝液等を適宜添加している。
コンドロイチン硫酸は、生化学工業(株)製「コンドロイチン硫酸ナトリウム ND-K」を用いた。
表1に示した組成で細胞等張性コラーゲン溶液を調製した。尚、2系〜4系では、うろこコラーゲンと牛コラーゲンを混合することにより調製した。また、細胞懸濁液として、細胞用培養液とコンドロイチン硫酸の混合液を用いた。本実験では軟骨細胞を使用しなかったが、これは軟骨細胞の有無はゲル化時間にあまり影響を及ぼさないからである。尚、細胞用培養液中のコンドロイチン硫酸の濃度は3%とした。
表2に示した組成で細胞等張性コラーゲン溶液を調製した。また、細胞懸濁液として、コンドロイチン硫酸を含まない軟骨細胞及び細胞用培養液の混合液(CS濃度0%)、及び細胞懸濁液中のコンドロイチン硫酸の濃度が3%である軟骨細胞、細胞用培養液及びコンドロイチン硫酸の混合液(CS濃度3%)を用いた。尚、軟骨細胞の適用量は、細胞培養における細胞の播種密度が3×104cells/mlとなるように設定した。また、CS濃度3%は、細胞等張性が保持される範囲内であったため、塩類濃度調整は行わなかった。
表3に示した組成で細胞等張性コラーゲン溶液を調製した。また、細胞懸濁液として、細胞懸濁液中のコンドロイチン硫酸の濃度が3%である軟骨細胞、細胞用培養液及びコンドロイチン硫酸の混合液(CS濃度3%)を用いた。尚、軟骨細胞の適用量は、細胞培養における細胞の播種密度が3×104cells/mlとなるように設定した。細胞等張性コラーゲン溶液と細胞懸濁液の混合割合を表3に示した。
軟骨細胞注入キットに用いた材料は、実施例において前述した、うろこコラーゲン、牛コラーゲン及び細胞懸濁液である。この細胞懸濁液は、上記〔細胞培養実験2〕と同じく、軟骨細胞、細胞用培養液及びコンドロイチン硫酸の混合液であり、細胞懸濁液中のコンドロイチン硫酸濃度は3%である。
Claims (4)
- 魚類由来の可溶化コラーゲンを含む細胞等張性コラーゲン溶液と、
軟骨細胞又は軟骨細胞への分化能を有する細胞及び細胞用培養液を含む細胞懸濁液と、
を構成要素として含むことを特徴とする軟骨細胞注入キット。 - さらに、前記細胞等張性コラーゲン溶液が、哺乳類由来の可溶化コラーゲンを含むものである請求項1記載の軟骨細胞注入キット。
- 前記細胞等張性コラーゲン溶液中の魚類由来の可溶化コラーゲンと哺乳類由来の可溶化コラーゲンの質量比が、1:2〜3:1の範囲である請求項2記載の軟骨細胞注入キット。
- さらに、細胞等張性コラーゲン溶液及び細胞懸濁液のうちいずれか一方又は双方が、コンドロイチン硫酸を含むものである請求項1〜3のいずれか1項記載の軟骨細胞注入キット。
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