JP2017039652A - Edible composition for prevention or improvement of metabolic syndrome - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To identify a biological functional component and make it available, and provide a new use for a pig bone extract comprising non-carboxylated or undercaroxylated osteocalcin (GluOC).SOLUTION: The present invention provides an edible composition for the prevention or improvement of metabolic syndrome, comprising a pig bone extract comprising non-carboxylated or undercaroxylated osteocalcin (GluOC).SELECTED DRAWING: None

Description

本発明は、GluOCおよび／または豚骨抽出物を有効成分とするメタボリックシンドロームの予防または改善のための食用組成物に関する。本発明は、メタボリックシンドロームに関する医療、保健、健康増進、食品、機能性食品等の分野で有用である。   The present invention relates to an edible composition for preventing or improving metabolic syndrome, which contains GluOC and / or pork bone extract as an active ingredient. The present invention is useful in the fields of medicine, health, health promotion, food, functional food and the like related to metabolic syndrome.

近年、骨はホルモンを分泌する能動的な内分泌器官であることが明らかになり、注目を集めている。中でもオステオカルシン（OC）は、糖・エネルギー代謝活性化作用をもつことが知られている。OCは骨中に豊富に存在する非コラーゲン性タンパク質の一つであり、ヒトでは49アミノ酸からなる分子量約5,500のタンパク質である。骨形成細胞である骨芽細胞で合成され、ビタミンK-依存性の翻訳後修飾を受けて、分子中に含まれる3つのグルタミン酸残基（17、21、24位）がγ−カルボキシル化される。その後に開口分泌によって細胞外に放出される。この修飾によってCa²⁺に対する強い親和性を獲得してヒドロキシアパタイトと強固に結合し、大部分は骨マトリックス中に堆積しているが、わずかな部分が、骨のリモデリングにより骨吸収窩から放出されたものも一緒になって血中を循環している。血中OCは、低（非）カルボキシル化状態のもの（GluOC、約5％）と3つのグルタミン酸残基すべてがカルボキシル化されたGlaOC（約95％）の2つの形態で存在しているが、ホルモンとしての活性を持つのはGluOCのみである。 In recent years, it has become clear that bone is an active endocrine organ that secretes hormones, and has attracted attention. Among them, osteocalcin (OC) is known to have a sugar / energy metabolism activation effect. OC is one of the non-collagenous proteins abundant in bones. In humans, it is a protein consisting of 49 amino acids and having a molecular weight of about 5,500. Synthesized by osteoblasts, which are osteogenic cells, undergoes vitamin K-dependent post-translational modification, and γ-carboxylates three glutamic acid residues (positions 17, 21, 24) in the molecule . Thereafter, it is released out of the cell by exocytosis. This modification gains a strong affinity for Ca ²⁺ and binds strongly to hydroxyapatite, mostly deposited in the bone matrix, but a small portion is released from the bone resorption fossa by bone remodeling What has been circulated in the blood together. Blood OC exists in two forms: low (non-) carboxylated (GluOC, approximately 5%) and GlaOC (approximately 95%) in which all three glutamate residues are carboxylated, Only GluOC has hormonal activity.

非カルボキシル化OCは、受容体として機能する分子の一つとして同定されたGRPC6Aを介して膵臓β細胞、脂肪細胞、骨格筋、および腸内分泌細胞に直接作用し、グルコースおよびエネルギーの代謝を活性化することが報告されている。非カルボキシル化OCを、野生型および食餌誘導性肥満のマウスに対して浸透圧ポンプを用いて持続的に4週間に渡って投与すると、インスリンの発現・分泌上昇、膵臓b細胞の増殖、耐糖能およびインスリン抵抗性の改善が見られた（非特許文献1）。また、食餌性肥満マウスに非カルボキシル化OCを毎日腹腔内注射すると、4週間で肥満および各種糖代謝指標の改善が見られ、14週間で高脂肪食による脂肪肝が劇的に改善された（非特許文献2）。   Uncarboxylated OC acts directly on pancreatic beta cells, adipocytes, skeletal muscle, and enteroendocrine cells via GRPC6A, identified as one of the molecules that function as a receptor, and activates glucose and energy metabolism It has been reported to do. When non-carboxylated OC is administered to wild-type and diet-induced obese mice using an osmotic pump continuously for 4 weeks, insulin expression / secretion increase, pancreatic b cell proliferation, glucose tolerance In addition, improvement in insulin resistance was observed (Non-patent Document 1). Moreover, daily intraperitoneal injection of non-carboxylated OC into diet-induced obese mice showed improvement in obesity and various glucose metabolism indices in 4 weeks, and drastically improved fatty liver due to a high-fat diet in 14 weeks ( Non-patent document 2).

一方、活性型オステオカルシンといわれる、3つのグルタミン酸残基がすべてカルボキシル化された、カルボキシル化OCに関しては、豚骨からのオステオカルシンの抽出方法が知られている（特許文献1、2）。   On the other hand, with regard to carboxylated OC, which is called active osteocalcin, in which all three glutamic acid residues are carboxylated, a method for extracting osteocalcin from porcine bone is known (Patent Documents 1 and 2).

特許5421109号公報Japanese Patent No. 5421109 特開2009-159942号公報JP2009-159942 国際公開WO2008/108395International Publication WO2008 / 108395

Ferron, M., Hinoi, E., Karsenty, G., Ducy, P., Osteocalcin differentially regulates β cell and adipocyte gene expression and affects the development of metabolic diseases in wild-type mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008, 105, 5266-5270Ferron, M., Hinoi, E., Karsenty, G., Ducy, P., Osteocalcin differentially regulates β cell and adipocyte gene expression and affects the development of metabolic diseases in wild-type mice.Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008, 105, 5266-5270 Ferron, M., McKee, M.D., Levine, R.L., Ducy, P. et al., Intermittent injections of osteocalcin improve glucose metabolism and prevent type 2 diabetes in mice. Bone. 2012, 50, 568-575Ferron, M., McKee, M.D., Levine, R.L., Ducy, P. et al., Intermittent injections of osteocalcin improve glucose metabolism and prevent type 2 diabetes in mice.Bone. 2012, 50, 568-575 Mizokami, A., Yasutake, Y., Gao, J., Matsuda M. et al., Osteocalcin Induces Release of Glucagon-Like Peptide-1 and Thereby Stimulates Insulin Secretion in Mice. PLoS ONE. 2013, 8, e57375Mizokami, A., Yasutake, Y., Gao, J., Matsuda M. et al., Osteocalcin Induces Release of Glucagon-Like Peptide-1 and compress Stimulates Insulin Secretion in Mice. PLoS ONE. 2013, 8, e57375 Mizokami, A., Yasutake, Y., Higashi, S., Kawakubo-Yasukochi, T. et al., Oral administration of osteocalcin improves glucose utilization by stimulating glucagon-like peptide-1 secretion. Bone 2014, 69, 68-79.Mizokami, A., Yasutake, Y., Higashi, S., Kawakubo-Yasukochi, T. et al., Oral administration of osteocalcin improves glucose utilization by stimulating glucagon-like peptide-1 secretion. Bone 2014, 69, 68-79 . Engelke, J.A., Hale, J.E., Suttie, J.W., Price, P.A. Vitamin K-dependent carboxylase: utilization of decarboxylated bone Gla protein and matrix Gla protein as substrates. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure and Molecular Enzymology. 1991,1078,31-34.Engelke, JA, Hale, JE, Suttie, JW, Price, PA Vitamin K-dependent carboxylase: utilization of decarboxylated bone Gla protein and matrix Gla protein as substrates.Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Protein Structure and Molecular Enzymology.1991, 1078,31-34. Ferron, M., Wei, J., Yoshizawa, T., Fattore, A.D. et al., Insulin signaling in osteoblasts integrates bone remodeling and energy metabolism. Cell. 2010, 142, 296-308Ferron, M., Wei, J., Yoshizawa, T., Fattore, A.D. et al., Insulin signaling in osteoblasts integrates bone remodeling and energy metabolism. Cell. 2010, 142, 296-308

経口投与は受け手にとってストレスが少なく、簡便かつ安全な薬物投与方法であるが、消化管における分解を受けるために十分な血中濃度が得にくいという欠点がある。しかし、本発明者らは、経口投与した非カルボキシル化OCの一部が有効な形で小腸へと到達し、腸内分泌細胞からのグルカゴン様ペプチド-1（GLP-1）の分泌を促進することを示した（非特許文献3）。消化管ホルモンであるGLP-1は強力にインスリン分泌を促すホルモンとして知られているが、その作用は血糖値依存的であるため、低血糖発作をおこしにくく糖尿病治療薬のターゲットとなっている。   Oral administration is a convenient and safe drug administration method with less stress for the recipient, but has a drawback that it is difficult to obtain a sufficient blood concentration to undergo degradation in the digestive tract. However, the inventors have found that a portion of the non-carboxylated OC administered orally reaches the small intestine in an effective manner and promotes the secretion of glucagon-like peptide-1 (GLP-1) from enteroendocrine cells. (Non-Patent Document 3). GLP-1, which is a gastrointestinal hormone, is known as a hormone that strongly promotes insulin secretion, but its action is dependent on blood glucose level, and therefore it is difficult to cause hypoglycemic attacks and has become a target for therapeutic drugs for diabetes.

普通食で飼育したマウスに非カルボキシル化OCを長期間にわたって経口投与すると、空腹時血糖の低下、耐糖能の改善、β細胞の増殖とそれに伴うインスリン分泌の増加、性腺周囲脂肪の減少、脂肪細胞の小型化が認められた。高脂肪高ショ糖食で飼育した肥満モデルマウスでも同様の改善効果が得られた（非特許文献4）。   Oral administration of non-carboxylated OC to mice fed on a normal diet over a long period of time reduces fasting blood glucose, improves glucose tolerance, increases β-cell proliferation and associated insulin secretion, decreases perigonal fat, adipocytes Downsizing was recognized. Similar improvement effects were obtained even in obese model mice bred with a high-fat and high-sucrose diet (Non-Patent Document 4).

骨に存在するOCのほぼ全てはGlaOCであるが、GlaOCの一部は酸性pHによって脱カルボキシル化され、GluOCとなることが報告されている（非特許文献5）。つまり、胃内の酸性環境によって脱カルボキシル化されGluOCとなる可能性が高い。実際、GlaOCを経口投与するとGLP-1およびインスリン分泌促進効果が見られたが、腹腔内注射では無効であった（非特許文献3）。   Almost all of the OC present in bone is GlaOC, but it has been reported that a part of GlaOC is decarboxylated by acidic pH to become GluOC (Non-patent Document 5). In other words, there is a high possibility of decarboxylation to GluOC by the acidic environment in the stomach. In fact, when GlaOC was orally administered, GLP-1 and insulin secretion-promoting effects were seen, but intraperitoneal injection was ineffective (Non-patent Document 3).

非カルボキシル化OCは経口投与でも糖代謝改善効果を発揮するため、肥満・メタボリックシンドローム予防への応用が期待されるが、49アミノ酸（マウスに関しては46）のペプチドの化学合成による大規模な商業的生産は困難であり高価である。また、それに代わる非カルボキシル化OCの実用的な製造方法は知られていない。   Since non-carboxylated OC exerts an effect of improving glucose metabolism even when administered orally, it is expected to be applied to the prevention of obesity and metabolic syndrome, but large-scale commercialization by chemical synthesis of a peptide of 49 amino acids (46 for mice) Production is difficult and expensive. Further, there is no known practical method for producing non-carboxylated OC instead.

OCは骨中の非コラーゲン性タンパク質の約20％を占めるといわれており、相当な量のOCが畜産動物の骨から得ることができる。日本にはスープをはじめとする豚骨の食文化が根付いており、大量（1日15トン〜）の豚骨が廃棄物として排出される。抽出後の骨の残渣の一部は肥料として使用されるが、それらのほとんどは有効な用途がなく、廃棄物として投棄される。即ち、これらの残渣の有効利用が長い間望まれてきた。また、食品は、第一次機能としての栄養性、第二次機能としての嗜好性に加えて、第三次機能として、生体調節作用を有しており、当該機能性を利用した種々の製品がいわゆる健康食品等として、広く一般に受け入れられ、利用されてきている。食経験の比較的長い食品由来の成分の利用は特に、生活習慣病のような比較的長期にわたり処置を必要とする疾患または状態に対し、繰り返し長期間使用するに際して安心感がある点でも、好ましいと考えられる。   OC is said to account for about 20% of non-collagenous proteins in bone, and a significant amount of OC can be obtained from bones of livestock animals. In Japan, soup and other pork bone food culture has taken root, and a large amount (15 tons per day) of pork bone is discharged as waste. Some of the bone residues after extraction are used as fertilizer, but most of them have no effective use and are dumped as waste. That is, effective utilization of these residues has been desired for a long time. In addition to nutrition as a primary function and palatability as a secondary function, foods have a bioregulatory effect as a tertiary function, and various products using this functionality Have been widely accepted and used as so-called health foods. Use of ingredients derived from foods with a relatively long dietary experience is particularly preferable in terms of reassurance over repeated long-term use for diseases or conditions that require treatment over a relatively long period of time, such as lifestyle-related diseases. it is conceivable that.

本発明は以下を提供する。
[１] 非または低カルボキシル化オステオカルシン（GluOC）を含有する豚骨抽出物を含む、メタボリックシンドロームの予防または改善のための食用組成物。
[２] 一日当たりの摂取量中、10μg〜5,000μgのGluOCを含有する、１に記載の食用組成物。
[３] GluOC含有骨抽出物が、アミノ酸組成において、グリシン１質量部に対して０．１〜１質量部のグルタミン酸を含む、１または２に記載の食用組成物。
[４] GluOC含有骨抽出物が、γ−カルボキシル化オステオカルシン（GlaOC）を含む、１〜３のいずれか１項に記載の食用組成物。
[５] サプリメント、ドリンク食用組成物、または飲料の形態である、１〜４のいずれか１項に記載の食用組成物。 The present invention provides the following.
[1] An edible composition for preventing or improving metabolic syndrome, comprising a pork bone extract containing non- or low-carboxylated osteocalcin (GluOC).
[2] The edible composition according to 1, comprising 10 μg to 5,000 μg of GluOC in a daily intake.
[3] The edible composition according to 1 or 2, wherein the GluOC-containing bone extract contains 0.1 to 1 part by mass of glutamic acid with respect to 1 part by mass of glycine in the amino acid composition.
[4] The edible composition according to any one of 1 to 3, wherein the GluOC-containing bone extract contains γ-carboxylated osteocalcin (GlaOC).
[5] The edible composition according to any one of 1 to 4, which is in the form of a supplement, a drink edible composition, or a beverage.

生の豚骨および煮た豚骨からのオステオカルシンの抽出。1gの材料から抽出された(A)Gluおよび(B)Glaオステオカルシンの量。ミキサーで粉砕した骨を0.2 M炭酸緩衝液（pH 9.5）中で室温において24時間抽出した。スープは、ミキサーで粉砕した生の骨を湯の中で6時間煮ることによって得た。(C)各豚骨抽出物に含まれる全OC中のGluOCのパーセンテージ。*P<0.05, ***P<0.005, ‡‡‡P<0.005対生骨および煮骨の両者。Extraction of osteocalcin from raw and boiled pork bones. The amount of (A) Glu and (B) Gla osteocalcin extracted from 1 g of material. The bones ground with a mixer were extracted in 0.2 M carbonate buffer (pH 9.5) for 24 hours at room temperature. The soup was obtained by boiling raw bones crushed with a mixer in hot water for 6 hours. (C) Percentage of GluOC in the total OC contained in each pork bone extract. * P <0.05, *** P <0.005, ‡‡‡ P <0.005 vs both raw and boiled bones. 豚骨抽出物の経口投与後の小腸のオステオカルシン。(A)豚骨抽出物100μl（17.5μgのGluOCを含有）の経口投与から3、6、および24時間後の小腸内容物中に含まれるGluOCの量。(B)各時間点における全OC中に占めるGluOCの割合（％）。データは4−5匹のマウスに関しての平均 ± SEMである。*P<0.05, **P<0.01, スチューデントt検定。Osteocalcin in the small intestine after oral administration of pork bone extract. (A) The amount of GluOC contained in the small intestinal contents at 3, 6, and 24 hours after oral administration of 100 μl of pork bone extract (containing 17.5 μg of GluOC). (B) The ratio (%) of GluOC in the total OC at each time point. Data are mean ± SEM for 4-5 mice. * P <0.05, ** P <0.01, Student t test. 普通食飼育マウスに対する豚骨抽出物長期間投与による各種代謝指標の変化。6−8週齢の雌性マウス1匹あたり、1.2μgのGluOCを含む100μlの豚骨抽出液を4週間に渡って毎日経口投与した。対照マウスは生理食塩水100μlを経口投与した。 (A)投与中の体重変化。投与開始時の体重を100％とし、その後4週間の体重変化を示した。黒丸および白丸はそれぞれ実験マウスおよび対照マウスを表す。以下の図面においても同様ある。（B）摂食時および空腹時（22時間絶食）血糖値。(C)空腹時のおよびグルコース（体重1kgあたり3g）腹腔内投与15分後の血中インスリン濃度。(D)腹腔内グルコース負荷試験（IPGTT、グルコース注射：2g/kg）。曲線下面積を挿入図中に示す。(E)インスリン負荷試験（ITT、インスリン注射: 0.4U/kg）。全てのデータは5−6匹のマウスに関しての平均 ± SEMである。*P<0.05対対照マウスに関しての対応する値（スチューデントt検定、二元配置分散分析）。Changes in various metabolic indices by long-term administration of pork bone extract to normal-fed mice. For each 6-8 week old female mouse, 100 μl of porcine bone extract containing 1.2 μg of GluOC was orally administered daily for 4 weeks. Control mice were orally administered 100 μl of physiological saline. (A) Change in body weight during administration. The body weight at the start of administration was taken as 100%, and then the body weight change was observed for 4 weeks. Black and white circles represent experimental mice and control mice, respectively. The same applies to the following drawings. (B) Blood sugar levels during feeding and fasting (fasted for 22 hours). (C) Blood insulin concentrations on fasting and 15 minutes after intraperitoneal administration of glucose (3 g / kg body weight). (D) Intraperitoneal glucose tolerance test (IPGTT, glucose injection: 2 g / kg). The area under the curve is shown in the inset. (E) Insulin tolerance test (ITT, insulin injection: 0.4 U / kg). All data are mean ± SEM for 5-6 mice. * P <0.05 vs corresponding values for control mice (Student t test, two-way analysis of variance). HFS飼育雌性マウス（肥満モデルマウス）に対する豚骨抽出物長期間投与による各種代謝指標の変化。6−8週齢の雌性マウスに対して、高脂肪高ショ糖による飼育開始から6週間後より、1匹あたり1.2μgのGluOCを含む100μlの豚骨抽出液を4週間に渡って毎日経口投与した。(A)摂食時および空腹時（22時間絶食）血糖値。*P<0.05, **P<0.01, スチューデントt検定。（B）空腹時血中GLP-1濃度。P<0.05、スチューデントt検定。(C)空腹時血中インスリン濃度。(D)単位面積あたりの膵臓ランゲルハンス島の数および(E)膵臓組織切片におけるβ細胞の占める面積の割合（％）。(F)投与期間終了後の腹腔内グルコース負荷試験（IPGTT）。曲線下面積を挿入図中に示す。(G)インスリン負荷試験（インスリン注射: 1.5U/kg）。曲線下面積を挿入図中に示す。全てのデータは5−6匹のマウスに関しての平均 ± SEMである。*P<0.05, *P<0.01対対照マウスに関しての対応する値（スチューデントt検定、二元配置分散分析）。Changes in various metabolic indices by long-term administration of porcine bone extract to HFS-fed female mice (obese model mice). 6- to 8-week-old female mice are orally administered daily for 4 weeks with 100 μl of porcine bone extract containing 1.2 μg of GluOC per animal starting 6 weeks after the start of feeding with high-fat and high-sucrose did. (A) Blood glucose level during feeding and fasting (fasted for 22 hours). * P <0.05, ** P <0.01, Student t test. (B) Fasting blood GLP-1 concentration. P <0.05, Student t test. (C) Fasting blood insulin concentration. (D) Number of pancreatic islets of Langerhans per unit area and (E) Percentage of area occupied by β cells in pancreatic tissue section (%). (F) Intraperitoneal glucose tolerance test (IPGTT) after the end of the administration period. The area under the curve is shown in the inset. (G) Insulin tolerance test (insulin injection: 1.5 U / kg). The area under the curve is shown in the inset. All data are mean ± SEM for 5-6 mice. * P <0.05, * P <0.01 vs corresponding values for control mice (Student t test, two-way analysis of variance). 豚骨抽出物長期間投与による内臓脂肪（性腺周囲脂肪組織）に対する効果。 (A)普通食飼育群の性腺周囲脂肪組織の切片標本をヘマトキシリン-エオシン（HE）染色し、脂肪細胞一つあたりの面積を算出した。（上）HE染色像。（下）脂肪細胞面積の分布。（右）脂肪細胞一つあたりの平均面積。黒棒は豚骨抽出液物を投与したマウス、白棒は対照マウスを表し、以下の図も同様である。(B)高脂肪高ショ糖食飼育群。（上）HE染色像。（下）脂肪細胞面積の分布。(右)脂肪細胞一つあたりの平均面積。一群あたり6匹のマウスからの少なくとも3つの切片を試験し、そしてスライドあたり50の脂肪細胞を測定した。平均の脂肪細胞面積のデータは平均 ± SEMである。*P<0.05, ***P<0.005（スチューデントt検定）。Effect on visceral fat (peritoneal adipose tissue) by long-term administration of porcine bone extract. (A) A section sample of perigonal adipose tissue in a group fed with a normal diet was stained with hematoxylin-eosin (HE), and the area per adipocyte was calculated. (Top) HE stained image. (Bottom) Distribution of adipocyte area. (Right) Average area per fat cell. The black bars represent mice administered with pork bone extract, the white bars represent control mice, and the following figures are the same. (B) High fat high sucrose diet group. (Top) HE stained image. (Bottom) Distribution of adipocyte area. (Right) Average area per fat cell. At least 3 sections from 6 mice per group were tested and 50 adipocytes were measured per slide. Average adipocyte area data are mean ± SEM. * P <0.05, *** P <0.005 (Student t test). HFS飼育雄性マウスに対する豚骨抽出物長期間投与による糖代謝指標の変化。(A)4週間の投与期間終了後の腹腔内グルコース負荷試験（IPGTT）。 (G)インスリン負荷試験（インスリン注射: 1.5U/kg）。曲線下面積を挿入図中に示す。Changes in glucose metabolism index by long-term administration of porcine bone extract for HFS-bred male mice. (A) Intraperitoneal glucose tolerance test (IPGTT) after the end of the 4-week administration period. (G) Insulin tolerance test (insulin injection: 1.5 U / kg). The area under the curve is shown in the inset. 妊娠期間中GluOCを経口投与したことによる、仔への影響。C57BL/6マウスを妊娠期間中普通食あるいはHFSで飼育し、それぞれをさらに2群に分け、一方には妊娠期間中毎日GluOCを経口投与し、他方には生理食塩水を投与した。仔は、離乳後に雌雄とも2群に分けて普通食と高脂肪食を与えて飼育した。それぞれの群の生後34日、69日、95日の体重を示す。*P<0.05, ***P<0.005（スチューデントt検定）。Effects on the offspring of oral administration of GluOC during pregnancy. C57BL / 6 mice were bred on a normal diet or HFS during pregnancy, and each was further divided into two groups, one of which was orally administered GluOC daily during pregnancy and the other was administered physiological saline. After weaning, both males and females were divided into two groups and fed with a normal diet and a high fat diet. The weights of 34 days, 69 days and 95 days after birth of each group are shown. * P <0.05, *** P <0.005 (Student t test).

％および部は、特に記載した場合を除き、質量を基準としている。数値範囲「X〜Y」は、特に記載した場合を除き、両端の値XおよびYを含む。「Aおよび／またはB」は、特に記載した場合を除き、A、Bのうち少なくとも一方が存在することを指し、AとBの双方が存在する場合も含む。食用組成物は、固形の食品と飲料およびスープのような液状の経口摂取物を含み、また、そのまま摂取される形態のもの（例えば、調理済みの各種の食品、サプリメント、ドリンク食用組成物）のみならず、食品添加物、発酵調味料組成物、飲料濃縮物も含む。さらに、ヒトのみならず、非ヒト動物（ペット、家畜等）のためのものも含む。食用組成物はまた、一般食品（いわゆる健康食品を含む。）のほか、保健機能食品（機能性表示食品、栄養機能食品、および特定保健用食品を含む。）を含む。抽出物というとき、形態は特に限定されず、液状であってもよく、固体状であってもよい。抽出物は、意図した効果を発揮しうる限り、種々の処理を経たもの、例えば抽出液を脱塩、濃縮、殺菌、成分調整および／または乾燥したものであってもよい。   Unless otherwise indicated,% and parts are based on mass. The numerical range “X to Y” includes the values X and Y at both ends unless otherwise specified. “A and / or B” refers to the presence of at least one of A and B, unless otherwise specified, and includes the case where both A and B are present. The edible composition includes solid foods and liquid oral ingestions such as beverages and soups, and can be ingested as it is (for example, various cooked foods, supplements, drink edible compositions). It also includes food additives, fermented seasoning compositions, and beverage concentrates. Furthermore, not only for humans but also for non-human animals (pets, livestock, etc.). In addition to general foods (including so-called health foods), edible compositions also include health functional foods (including functional labeling foods, nutritional functional foods, and special health foods). When referred to as an extract, the form is not particularly limited, and it may be liquid or solid. The extract may have been subjected to various treatments, for example, desalted, concentrated, sterilized, component-adjusted and / or dried as long as the intended effect can be exhibited.

本発明は、非または低カルボキシル化オステオカルシン（GluOC）を有効成分とする、メタボリックシンドロームの予防または改善のため食用組成物に関する。   The present invention relates to an edible composition for preventing or improving metabolic syndrome, which comprises non- or low-carboxylated osteocalcin (GluOC) as an active ingredient.

〔GluOC〕
本発明でいう「GluOC」とは、特に記載した場合を除き、オステオカルシンの3つのグルタミン酸残基のうち、1または2個がカルボキシル化されたもの（低カルボキシル化オステオカルシン）、およびカルボキシル化されていないもの（非カルボキシル化オステオカルシン）を含む。 [GluOC]
“GluOC” as used in the present invention, unless otherwise specified, is one in which one or two of the three glutamic acid residues of osteocalcin are carboxylated (low-carboxylated osteocalcin), and is not carboxylated (Non-carboxylated osteocalcin).

オステオカルシンのアミノ酸配列を以下に示す。   The amino acid sequence of osteocalcin is shown below.

順にSEQ ID NO.:1〜7として、配列表に示す。 These are shown in the sequence listing as SEQ ID NO.

ヒトオステオカルシンでは、17、21および24位（マウスでは13、17および20位）のグルタミン酸がカルボキシル化を受ける。なお、3つのグルタミン酸残基のうち、17位（マウスでは13位）がカルボキシル化されているが、他の2つのグルタミン酸残基のうち少なくとも1つはカルボキシル化されていない（すなわち、低カルボキシル化OC）は、通常存在しないと考えられている。したがって、低カルボキシル化OCとしては、Glu-Gla-Gla, Glu-Glu-Gla, Glu-Gla-Gluが考えられる。ただし、市販のGluOCを分析するためのキットでは、それらを区別し難いものもある。例えば、本明細書の実施例の項では、GluOCおよびGluOCの測定に関し、EIAキット（タカラバイオ、滋賀、日本）を利用しているが、GluOC測定キットは21および24位にまたがるGlu残基に特異的な抗体を使用したEIAキットであり、低カルボキシル化OCと非カルボキシル化OCの区別はできない。また、GlaOC測定キットは、17位（マウスの13位）のGla残基に特異的な抗体を使用したものであるので、理論的には、17位のグルタミン酸残基がカルボキシル化されていれば、他の2つのグルタミン酸残基がカルボキシル化されていなくても認識する。しかし、実際は、17位がGlaである低カルボキシル化OC (Gla-Gla-Glu、Gla-Glu-Gla、Gla-Glu-Glu)は血中には通常存在しないと考えられている。なお、マウスにおいて、すべてがカルボキシル化されたGlaOCは無効だが、13位のグルタミン酸のみが脱カルボキシル化したGluOCが有効であるという報告がある（非特許文献6）。また、前掲非特許文献1〜4で有効性が証明されているGluOCは、非カルボキシル化OCである。   In human osteocalcin, glutamates at positions 17, 21, and 24 (positions 13, 17, and 20 in mice) are carboxylated. Of the three glutamic acid residues, position 17 (position 13 in mice) is carboxylated, but at least one of the other two glutamic acid residues is not carboxylated (ie, low carboxylation). OC) is usually considered not to exist. Accordingly, Glu-Gla-Gla, Glu-Glu-Gla, and Glu-Gla-Glu can be considered as low carboxylated OC. However, some commercially available kits for analyzing GluOC are difficult to distinguish. For example, in the Examples section of this specification, the EIA kit (Takara Bio, Shiga, Japan) is used for the measurement of GluOC and GluOC, but the GluOC measurement kit covers Glu residues spanning positions 21 and 24. This is an EIA kit that uses a specific antibody and cannot distinguish between low carboxylated and non-carboxylated OC. In addition, since the GlaOC measurement kit uses an antibody specific for the Gla residue at position 17 (mouse position 13), theoretically, if the glutamic acid residue at position 17 is carboxylated Recognize even if the other two glutamic acid residues are not carboxylated. However, in fact, it is considered that low carboxylated OC (Gla-Gla-Glu, Gla-Glu-Gla, Gla-Glu-Glu), which is Gla at position 17, is not normally present in the blood. In mice, there is a report that GlaOC, which is all carboxylated, is ineffective, but GluOC in which only glutamic acid at position 13 is decarboxylated is effective (Non-patent Document 6). In addition, GluOC, which has been proven effective in the aforementioned Non-Patent Documents 1 to 4, is non-carboxylated OC.

本発明はまた、以下のいずれかのポリペプチドまたはそのカルボキシル化体である、GluOCを提供する：
(1) 配列番号1〜7のいずれか一のアミノ酸配列からなる、ポリペプチド；
(2) 配列番号1〜7のいずれか一のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり（ただし、配列番号1においては、17、21および24位のアミノ酸は維持され、配列番号2〜7においては、配列番号1の17、21および24位に対応するアミノ酸は維持される。）、かつ対象に経口投与したときに、対象の摂食時および／または空腹時の血糖値を低下させる機能を有する、ポリペプチド；または
(3) 配列番号1〜7のいずれか一のアミノ酸配列と少なくとも85％以上（好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは98％以上）の同一性を有するアミノ酸配列からなり（ただし、配列番号1においては、17、21および24位のアミノ酸は維持され、配列番号2〜7においては、配列番号1の17、21および24位に対応するアミノ酸は維持される。）、かつ対象に経口投与したときに、対象の摂食時および／または空腹時の血糖値を低下させる機能を有する、ポリペプチド。 The present invention also provides GluOC, which is any of the following polypeptides or carboxylated forms thereof:
(1) a polypeptide comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 7;
(2) The amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 7 consists of an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted, and / or added (however, in SEQ ID NO: 1, 17, The amino acids at positions 21 and 24 are maintained, and in SEQ ID NOs: 2-7, the amino acids corresponding to positions 17, 21, and 24 of SEQ ID NO: 1 are maintained.) And when administered orally to the subject A polypeptide having the function of lowering blood sugar levels during feeding and / or fasting; or
(3) It consists of an amino acid sequence having at least 85% or more (preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 98% or more) identity with any one of SEQ ID NOs: 1 to 7 (However, in SEQ ID NO: 1, amino acids at positions 17, 21, and 24 are maintained, and in SEQ ID NOs: 2 to 7, amino acids corresponding to positions 17, 21, and 24 of SEQ ID NO: 1 are maintained). And a polypeptide having a function of lowering blood glucose levels during eating and / or fasting of a subject when orally administered to the subject.

配列番号2における、配列番号1の17、21および24位に対応するアミノ酸は、17、21および24位である。
配列番号3における、配列番号1の17、21および24位に対応するアミノ酸は、13、17および20位である。
配列番号4における、配列番号1の17、21および24位に対応するアミノ酸は、17、21および24位である。
配列番号5における、配列番号1の17、21および24位に対応するアミノ酸は、17、21および24位である。
配列番号6における、配列番号1の17、21および24位に対応するアミノ酸は、17、21および24位である。
配列番号7における、配列番号1の17、21および24位に対応するアミノ酸は、17、21および24位である。 In SEQ ID NO: 2, the amino acids corresponding to positions 17, 21, and 24 of SEQ ID NO: 1 are positions 17, 21, and 24.
In SEQ ID NO: 3, the amino acids corresponding to positions 17, 21, and 24 of SEQ ID NO: 1 are positions 13, 17, and 20.
In SEQ ID NO: 4, the amino acids corresponding to positions 17, 21, and 24 of SEQ ID NO: 1 are positions 17, 21, and 24.
In SEQ ID NO: 5, the amino acids corresponding to positions 17, 21, and 24 of SEQ ID NO: 1 are positions 17, 21, and 24.
In SEQ ID NO: 6, the amino acids corresponding to positions 17, 21, and 24 of SEQ ID NO: 1 are positions 17, 21, and 24.
In SEQ ID NO: 7, the amino acids corresponding to positions 17, 21, and 24 of SEQ ID NO: 1 are positions 17, 21, and 24.

上記のポリペプチドまたはそのカルボキシル化体のうち、特に好ましいのは豚または魚由来のものである。   Of the above-mentioned polypeptides or carboxylated forms thereof, those derived from pigs or fish are particularly preferred.

また、本発明でポリペプチドに関し、「1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列」というときの置換等されるアミノ酸の個数は、特に記載した場合を除き、いずれのタンパク質においても、そのアミノ酸配列からなるタンパク質が所望の機能を有する限り特に限定されないが、1〜9個または1〜5個程度であるか、性質の似たアミノ酸への置換であれば、さらに多くの個数の置換等がありうる。このようなアミノ酸配列に係るポリヌクレオチドまたはタンパク質を調製するための手段は、当業者にはよく知られている。   Further, regarding the polypeptide in the present invention, the number of amino acids to be substituted when referred to as “an amino acid sequence in which one or a plurality of amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added” is unless otherwise specified. Any protein is not particularly limited as long as the protein comprising the amino acid sequence has a desired function, but it is 1 to 9 or 1 to 5 or a substitution with an amino acid having similar properties. There can be a greater number of substitutions and the like. Means for preparing polynucleotides or proteins according to such amino acid sequences are well known to those skilled in the art.

本発明でアミノ酸配列に関し「「同一性」というときは、特に記載した場合を除き、いずれの塩基配列またはアミノ酸配列においても、２つの配列を最適の態様で整列させた場合（上記の[化1]参照）に、2つの配列間で共有する一致したアミノ酸の個数の百分率を意味する。すなわち、同一性＝（一致した位置の数／位置の全数）×100で算出でき、市販されているアルゴリズムを用いて計算することができる。また、このようなアルゴリズムは、Altschul et al.,J.Mol.Biol.215(1990)403-410に記載されるNBLASTおよびXBLASTプログラム中に組込まれている。より詳細には、アミノ酸配列の同一性に関する検索・解析は、当業者には周知のアルゴリズムまたはプログラムにより行うことができる。プログラムを用いる場合のパラメーターは、当業者であれば適切に設定することができ、また各プログラムのデフォルトパラメーターを用いてもよい。これらの解析方法の具体的な手法もまた、当業者には周知である。   In the present invention, the term “identity” refers to an amino acid sequence, and unless otherwise specified, when any two nucleotide sequences or amino acid sequences are aligned in an optimal manner (the above-mentioned [Chemical Formula 1] ])) Means the percentage of the number of matched amino acids shared between the two sequences. That is, identity = (number of matched positions / total number of positions) × 100, which can be calculated using a commercially available algorithm. Such algorithms are also incorporated into the NBLAST and XBLAST programs described in Altschul et al., J. Mol. Biol. 215 (1990) 403-410. More specifically, search / analysis regarding amino acid sequence identity can be performed by algorithms or programs well known to those skilled in the art. Those skilled in the art can appropriately set parameters when using a program, and the default parameters of each program may be used. Specific techniques for these analysis methods are also well known to those skilled in the art.

上記のポリペプチドまたはそのカルボキシル化体は、対象に経口投与したときに、対象の摂食時および／または空腹時の血糖値を低下させる機能を有する。この機能は、具体的には、対象を例えば6−7週齢のマウスを高脂肪高ショ糖食（HFS）で飼育したものとし、HFS開始から6週間後、マウスをランダムに2つのグループに分け、適切な量の上記のポリペプチドまたはそのカルボキシル化を毎日数週間にわたり経口投与する群と対象群とを設け、摂食時および／または空腹時の血糖値を測定し、比較することにより判断できる。より詳細な実験条件は本発明の実施例の項の記載を参考にすることができる。低下したか否かは、当業者であれば適宜判断しうるが、対象群の値に対して、例えば5％、好ましくは10％低いときに低下したと判断してもよい。   The above-mentioned polypeptide or a carboxylated form thereof has a function of lowering blood glucose level at the time of feeding and / or fasting of a subject when orally administered to the subject. Specifically, this function assumes that the subject is a 6-7 week old mouse raised on a high fat high sucrose diet (HFS), and after 6 weeks from the start of HFS, the mice are randomly divided into two groups. Separately, determine whether the appropriate amount of the above-mentioned polypeptide or its carboxylation is orally administered for several weeks every day and subject group and measure and compare blood glucose levels during feeding and / or fasting it can. For more detailed experimental conditions, the description in the Examples section of the present invention can be referred to. Whether or not it has decreased can be determined as appropriate by those skilled in the art, but it may be determined that the value has decreased when the value of the target group is, for example, 5%, preferably 10% lower.

摂食時および／または空腹時血糖値の変わりに、空腹時血中GLP-1濃度、空腹時血中インスリン濃度、単位面積あたりの膵臓ランゲルハンス島の数、膵臓組織切片におけるβ細胞の占める面積の割合（％）、または(F)投与期間終了後の腹腔内グルコース負荷試験（IPGTT）を比較してもよい。   Changes in fasting blood GLP-1 concentration, fasting blood insulin concentration, the number of pancreatic islets of Langerhans per unit area, and the area occupied by β cells in the pancreatic tissue section, instead of feeding and / or fasting blood glucose level Percent (%), or (F) Intraperitoneal glucose tolerance test (IPGTT) after the end of the administration period may be compared.

〔メタボリックシンドロームの処置〕
本発明は、メタボリックシンドロームの予防または改善のために用いうる。
メタボリックシンドロームとは、内臓肥満に高血圧・高血糖・脂質代謝異常が組み合わされ、心臓病や脳卒中などの動脈硬化性疾患をまねきやすい状態をいう。日本では平成20年（2008年）から「特定健診・特定保健指導」の中で、メタボリックシンドロームに関する対策を取り入れた。なお特定健診・特定保健指導では、メタボリックシンドロームといわず、「内臓脂肪症候群」の名称を用いている。 [Treatment of metabolic syndrome]
The present invention can be used for prevention or improvement of metabolic syndrome.
Metabolic syndrome refers to a condition in which visceral obesity is combined with hypertension, hyperglycemia, and lipid metabolism abnormalities and is likely to cause arteriosclerotic diseases such as heart disease and stroke. In Japan, since 2008 (2008), in the "specialized health checkup and specific health guidance", measures related to metabolic syndrome have been incorporated. In the specific medical examination and specific health guidance, the name “Visceral Fat Syndrome” is used instead of the metabolic syndrome.

メタボリックシンドロームの診断基準は、日本では、次のとおりである：ウエスト周囲径（臍の高さの腹囲）が男性85cm女性90cmを超え、高血圧、高血糖および脂質代謝異常の3つのうち2つに当てはまること。   The diagnostic criteria for metabolic syndrome are as follows in Japan: waist circumference (umbilical height abdominal circumference) exceeds 90cm for men, 90cm for women, and 2 out of 3 for hypertension, hyperglycemia and dyslipidemia That's true.

高血圧とは、収縮期血圧が130mmHg以上または拡張期血圧が85mmHg以上である状態をいう。脂質代謝異常（高脂血症ということもある。）とは、LDLコレステロールが140mg/dl以上の「高LDLコレステロール血症」、HDLコレステロールが40mg/dl未満の低HDLコレステロール血症、中性脂肪が150mg／dl以上の高トリグリセライド血症（高中性脂肪血症）のいずれかであることをいう。糖尿病は、空腹時高血糖が110mg/dLである場合をいい、1型糖尿病と2型糖尿病が含まれる。   Hypertension refers to a state in which systolic blood pressure is 130 mmHg or higher or diastolic blood pressure is 85 mmHg or higher. Abnormal lipid metabolism (sometimes called hyperlipidemia) is "high LDL cholesterolemia" with LDL cholesterol of 140 mg / dl or higher, low HDL cholesterolemia with HDL cholesterol of less than 40 mg / dl, neutral fat Is one of hypertriglyceridemia (hypertriglyceridemia) of 150 mg / dl or more. Diabetes refers to a fasting hyperglycemia of 110 mg / dL and includes type 1 diabetes and type 2 diabetes.

本発明者らの検討によると、GluOCを含む豚骨抽出物は、高脂肪高ショ糖食（HFS）で飼育したマウスにおいて、摂食時および空腹時の血糖値を顕著に低下させ、またインスリン濃度を増加させ、耐糖能およびインスリン感受性を改善した。さらにこのHFS飼育豚骨抽出物投与群においては、単位面積あたりのランゲルハンス島の数が増加しており、β細胞の割合も増加傾向にあった。さらに4週間にわたるGluOCを含む豚骨抽出物の経口投与によって普通食、HFS飼育の両群において脂肪細胞の大きさを減少させた。小さな脂肪細胞の割合が増加し、脂肪細胞の平均面積は減少した。したがって、GluOCは、経口投与により少なくとも内臓肥満および高血糖に対して有効であるということができる。
さらに本発明者らの検討により、妊娠母体がGluOCを摂取することでこの産仔の体重増加は回避されることもわかっている。 According to the study by the present inventors, porcine bone extract containing GluOC significantly reduced the blood glucose level during feeding and fasting in mice fed with a high-fat high sucrose diet (HFS), and insulin Concentration was increased to improve glucose tolerance and insulin sensitivity. Furthermore, in this HFS-reared pig bone extract administration group, the number of islets of Langerhans per unit area increased, and the proportion of β cells tended to increase. In addition, oral administration of porcine bone extract containing GluOC for 4 weeks reduced the size of adipocytes in both normal and HFS-fed groups. The proportion of small adipocytes increased and the average area of adipocytes decreased. Therefore, it can be said that GluOC is effective against at least visceral obesity and hyperglycemia by oral administration.
Furthermore, it has been found by the present inventors that this increase in body weight of the offspring is avoided when the pregnant mother ingests GluOC.

本発明で疾患または状態について予防または改善というときは、発症リスクの低減、発症の遅延、予防、治療、進行の停止、遅延を含む。予防または改善には、医師が行う、病気の治療を目的とした行為と、医師以外の者、例えば栄養士（管理栄養士、スポーツ栄養士を含む。）、保健師、助産師、看護師、臨床検査技師、スポーツ指導員、美容部員、エステティシャン、医薬品製造者、医薬品販売者、食品製造者、食品販売者等が行う、非治療的行為とが含まれる。また予防または改善には、獣医師が行う、非ヒト動物の病気の治療を目的としたとした行為と、獣医師以外の者、例えば獣医看護士、愛玩動物飼養管理士、厩務員、飼育員、動物医薬品製造者、動物医薬品販売者、ペット用食品製造者、ペット用食品販売者等が行う、非治療行為が含まれる。さらに予防または改善には、特定の食品の投与または摂取の推奨、食事指導、保健指導、栄養指導（傷病者に対する療養のため必要な栄養の指導、および健康の保持増進のための栄養の指導を含む。）、給食管理、給食に関する栄養改善上必要な指導を含む。   In the present invention, prevention or improvement of a disease or condition includes reduction of risk of onset, delay of onset, prevention, treatment, stop of progress, and delay. Prevention or improvement is performed by doctors for the purpose of treatment of illness and non-doctors such as dietitians (including registered dietitians and sports dietitians), public health nurses, midwives, nurses, clinical technologists. , Sports instructors, beauty staff, estheticians, pharmaceutical manufacturers, pharmaceutical sellers, food manufacturers, food sellers, and the like. For prevention or improvement, veterinarians aim to treat diseases of non-human animals and those other than veterinarians, such as veterinary nurses, pet animal care managers, general staff, Non-therapeutic actions performed by employees, veterinary drug manufacturers, veterinary drug vendors, pet food manufacturers, pet food sellers, etc. In addition, prevention or improvement includes the recommendation of the administration or intake of specific foods, dietary guidance, health guidance, nutrition guidance (nutrition guidance necessary for medical treatment for the sick and disabled, and nutrition guidance for health maintenance and promotion. ), Including guidance necessary for improving nutrition related to school lunch management and school lunches.

本発明における処置の対象は、ヒト（個体）を含み、好ましくは、上述したいずれかの処置を施すことが望ましいか、または上述したいずれかの処置を施す必要のあるヒトである。
本発明における処置の対象は、ヒト以外の動物であってもよく、この例としては、イヌ、ネコ、ウサギ、ハムスター、モルモット、リス等のペット（愛玩動物、コンパニオンアニマルということもある。）、牛、豚等の家畜、マウス、ラット等の実験動物、動物園等で飼育されている動物が挙げられる。対象となる非ヒト動物の成長段階には特に限定がなく、本発明の処置の対象は、例えば、幼犬、成犬、高齢犬、幼猫、成猫、高齢猫であり得る。
本発明による処置の対象は男性および女性を含む。本発明者らの検討によると、マウスを用いた実験では、メスに効果が見られた。したがって、本発明は、女性に対する効果が特に期待できる。 The subject of treatment in the present invention includes humans (individuals), and is preferably a human in whom it is desirable to perform any of the above-mentioned treatments or in need of any of the above-mentioned treatments.
The subject of treatment in the present invention may be an animal other than a human, and examples thereof include pets such as dogs, cats, rabbits, hamsters, guinea pigs, and squirrels (also referred to as companion animals and companion animals). Examples include livestock such as cattle and pigs, laboratory animals such as mice and rats, and animals raised in zoos. The growth stage of the target non-human animal is not particularly limited, and the subject of the treatment of the present invention can be, for example, a young dog, an adult dog, an old dog, a young cat, an adult cat, or an old cat.
Subjects for treatment according to the present invention include men and women. According to the study by the present inventors, an effect was seen in a female in an experiment using a mouse. Therefore, the present invention can be particularly expected to have an effect on women.

〔製造方法〕
本発明は、GluOC含有骨抽出物またはGluOC（以下、「GluOC等」ということがある。）の製造方法を提供する。本発明の製造方法は、次の工程を含む：
生の、または加熱処理済の、動物の骨を水系溶媒で抽出処理し、GluOCを含有する骨抽出物を得る工程。 〔Production method〕
The present invention provides a method for producing a GluOC-containing bone extract or GluOC (hereinafter sometimes referred to as “GluOC etc.”). The production method of the present invention includes the following steps:
A process of extracting a bone extract containing raw or heat-treated animal bone with an aqueous solvent to obtain a bone extract containing GluOC.

本発明において原料として、動物の骨を使用することができる。OCは骨中の非コラーゲン性タンパク質の約20％を占めるといわれており、相当な量のOCを動物の骨（硬骨）から得ることができる。使用される動物の骨は、GluOCを含むものであれば特に限定はなく、例えば、哺乳類、鳥類、魚類等の脊椎動物の骨、より具体的には豚、牛、鶏、魚の骨が使用できる。使用される骨の部位に特に制限はなく、骨膜、骨質、骨髄または軟骨を含んでいてもよく、頭部の骨、体幹部の骨、上肢の骨、下肢の骨のいずれであってもよい。本発明者らの検討によると、頭部の骨および脊椎は比較的柔らかくて粉砕しやすく、そのためGluOC等収量が高いが、四肢は硬くて粉砕しづらく収量が落ちる傾向がある。したがって、収量が高いという観点からは、頭部の骨および／または体幹部の骨を原料とすることが好ましい。   Animal bones can be used as a raw material in the present invention. OC is said to account for about 20% of non-collagenous proteins in bone, and a considerable amount of OC can be obtained from animal bone (bone). The bone of the animal used is not particularly limited as long as it contains GluOC, and for example, bones of vertebrates such as mammals, birds, and fish, more specifically, bones of pigs, cows, chickens, and fish can be used. . There are no particular limitations on the bone site used, which may include periosteum, bone quality, bone marrow, or cartilage, and may be any of the bones of the head, trunk, bones of the upper limbs, and bones of the lower limbs. . According to the study by the present inventors, the bone and spine of the head are relatively soft and easily pulverized, and thus the yield of GluOC and the like is high, but the limbs are hard and difficult to pulverize, and the yield tends to decrease. Therefore, from the viewpoint of high yield, it is preferable to use the bones of the head and / or trunk as raw materials.

原料としての骨は、加熱処理していない生のものであってもよく、熱水処理や加圧熱水処理後の骨であってもよい。加熱処理した骨は、通常、余分な脂肪分が比較的少ない点で、GluOCを抽出する原料として適している。加熱処理した骨の例としては、湿式加熱処理、例えば熱水処理、加圧熱水処理および／または加圧水蒸気処理を施された骨が挙げられる。また、加熱処理した骨の例として、骨からスープ等を抽出した残渣が挙げられる。なお、骨の抽出残渣のことを煮骨ということがある。   The bone as a raw material may be a raw bone that has not been heat-treated, or may be a bone after a hot water treatment or a pressurized hot water treatment. Heat-treated bone is usually suitable as a raw material for extracting GluOC because it has relatively little excess fat. Examples of heat-treated bone include bone that has been subjected to wet heat treatment, such as hot water treatment, pressurized hot water treatment and / or pressurized steam treatment. Moreover, the residue which extracted soup etc. from the bone is mentioned as an example of the heat-processed bone. The extracted bone residue is sometimes called boiled bone.

本発明の原料として加熱処理した骨を用いる場合、加熱条件にもとくに限定はなく、例えば温度は、80℃〜150℃、好ましくは85℃〜140℃、より好ましくは110℃〜130℃であり、時間は、15分〜24時間、好ましくは30分〜10時間、より好ましくは1〜8時間で処理することができる。   When heat-treated bone is used as the raw material of the present invention, the heating conditions are not particularly limited, for example, the temperature is 80 ° C to 150 ° C, preferably 85 ° C to 140 ° C, more preferably 110 ° C to 130 ° C. , The treatment time can be 15 minutes to 24 hours, preferably 30 minutes to 10 hours, more preferably 1 to 8 hours.

GluOC等の製造においては、原料としての骨は、抽出効率を高める観点から、細断または粉砕することができる。抽出に際し、目的の物質が十分に抽出できる限り溶媒に特に制限はないが、水系溶媒を公的に用いることができる。水系溶媒の例としては、各種アルカリ性水溶液、水、塩酸水溶液、酢酸水溶液、燐酸水溶液、乳酸水溶液、クエン酸水溶液、ギ酸水溶液、アスコルビン酸水溶液が挙げられる。好ましくは、後述するpHのアルカリ性水溶液が用いられる。   In the production of GluOC or the like, the bone as a raw material can be shredded or pulverized from the viewpoint of increasing extraction efficiency. In the extraction, the solvent is not particularly limited as long as the target substance can be sufficiently extracted, but an aqueous solvent can be used publicly. Examples of the aqueous solvent include various alkaline aqueous solutions, water, aqueous hydrochloric acid, aqueous acetic acid, aqueous phosphoric acid, aqueous lactic acid, aqueous citric acid, aqueous formic acid, and aqueous ascorbic acid. Preferably, an alkaline aqueous solution having a pH described later is used.

アルカリ性水溶液は、好ましくは食品または医薬として許容されるpH調整のための成分により調製されていることが好ましい。この例としては、炭酸塩および／または重炭酸塩の水溶液、ホウ酸カリウム、ホウ酸ナトリウム等のホウ酸塩の水溶液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、並びに酢酸エタノールアミン緩衝液が挙げられる。炭酸塩の例としては、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸マグネシウム、炭酸アンモニウム、炭酸カルシウム、および炭酸バリウムが挙げられ、重炭酸塩の例としては、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、および炭酸水素カルシウムが挙げられる。   The alkaline aqueous solution is preferably prepared with a food or pharmaceutically acceptable component for pH adjustment. Examples of this include aqueous solutions of carbonate and / or bicarbonate, aqueous solutions of borates such as potassium borate, sodium borate, glycine-sodium hydroxide buffer, and ethanolamine acetate buffer. Examples of carbonates include sodium carbonate, potassium carbonate, magnesium carbonate, ammonium carbonate, calcium carbonate, and barium carbonate. Examples of bicarbonates include sodium bicarbonate, potassium bicarbonate, and calcium bicarbonate. Can be mentioned.

アルカリ性水溶液のpHは、pH7超〜13とすることができ、好ましくはpH8〜12であり、より好ましくはpH9〜pH11である。また、アルカリ性水溶液中の塩濃度は、0.001M以上とすることができ、好ましくは0.1〜3Mであり、より好ましくは0.2〜1Mである。   The pH of the alkaline aqueous solution can be over pH 7 to 13, preferably pH 8 to 12, and more preferably pH 9 to pH 11. The salt concentration in the alkaline aqueous solution can be 0.001M or more, preferably 0.1 to 3M, and more preferably 0.2 to 1M.

骨からGluOC等を抽出する際の抽出時間は、目的の物質が十分に抽出できる限り特に制限はないが、例えば1時間以上とすることができ、好ましくは6〜48時間であり、より好ましくは12〜24時間である。また、抽出温度も目的の物質が十分に抽出できる限り特に制限はないが、4〜120℃とすることができる。   The extraction time when extracting GluOC and the like from bone is not particularly limited as long as the target substance can be sufficiently extracted, but can be, for example, 1 hour or more, preferably 6 to 48 hours, more preferably 12-24 hours. The extraction temperature is not particularly limited as long as the target substance can be sufficiently extracted, but can be 4 to 120 ° C.

抽出に際し、溶媒としてアルカリ性水溶液を用いる場合には、得られた抽出物中のアルカリ成分を、酸により中和する工程を含んでいてもよい。中和に用いる酸としては食品または医薬として許容される成分であることが好ましく、例えば、塩酸、硫酸、硝酸等の無機酸、アジピン酸、クエン酸、グルコン酸、コハク酸、ギ酸、酢酸、酒石酸、乳酸、リンゴ酸、アスコルビン酸等の有機酸、また陽イオン交換樹脂、陽イオン交換繊維、陽イオン交換膜等の固体酸が使用可能である。特に好ましい例は、クエン酸である。   In the case of using an alkaline aqueous solution as a solvent at the time of extraction, a step of neutralizing an alkali component in the obtained extract with an acid may be included. The acid used for neutralization is preferably a food or pharmaceutical acceptable component, for example, inorganic acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, adipic acid, citric acid, gluconic acid, succinic acid, formic acid, acetic acid, tartaric acid Organic acids such as lactic acid, malic acid, and ascorbic acid, and solid acids such as cation exchange resin, cation exchange fiber, and cation exchange membrane can be used. A particularly preferred example is citric acid.

得られた抽出物は、必要に応じ、脱塩、固形物の分離（濾過、遠心分離等の操作による）、濃縮等の処理を行ってもよい。脱塩方法には特に限定はないが、限外濾過、電気透析、ゲル濾過、イオン交換樹脂を用いることができる。   The obtained extract may be subjected to treatment such as desalting, separation of solids (by filtration, centrifugation, etc.), concentration, etc., as necessary. The desalting method is not particularly limited, and ultrafiltration, electrodialysis, gel filtration, and ion exchange resin can be used.

本発明の製造方法によれば、GluOC等を効率よく抽出することができる。GluOC等の抽出効率は、原料として使用される骨の状態や部位等にも拠るが、例えば豚の煮骨1g（湿重量）から、10〜200μgのGluOCを得ることができる。   According to the production method of the present invention, GluOC and the like can be extracted efficiently. The extraction efficiency of GluOC and the like depends on the state and part of the bone used as a raw material, but 10 to 200 μg of GluOC can be obtained from, for example, 1 g (wet weight) of boiled pork.

本発明の抽出物は、GluOCを多く含む。抽出物中にはGlaOCが含まれていてもよく、また、コラーゲンやその他の骨由来の成分が含まれていてもよい。本発明者らの検討によると、豚骨抽出物を経口投与した際に小腸におけるGlaおよびGluOC量を測定したところ、小腸内容物中においてはGluOCの比率が約4倍増加することが分かっている。すなわち、経口投与されたClaOCは、腸内で脱カルボキシル化され、GluOCとなり、目的の効果を発揮することができる。   The extract of the present invention is rich in GluOC. GlaOC may be contained in the extract, and collagen and other bone-derived components may be contained. According to the study by the present inventors, when the amount of Gla and GluOC in the small intestine was measured when the porcine bone extract was orally administered, it was found that the ratio of GluOC in the small intestine contents increased by about 4 times. . That is, ClaOC administered orally is decarboxylated in the intestine to become GluOC, and can exert the intended effect.

〔食用組成物〕
本発明で「食用組成物」というときは、特に記載した場合を除き、動物の骨抽出物そのものである場合と、GluOCまたは骨抽出物と、それら以外の成分とを含む場合とがあるが、GluOCおよび骨抽出物自体は含まず、またGluOCまたは骨抽出物を含有する既存の食品は含まない。 [Edible composition]
The term `` edible composition '' in the present invention, unless otherwise specified, may be an animal bone extract itself, or may contain GluOC or bone extract and other components, Does not include GluOC and bone extract itself, and does not include existing foods that contain GluOC or bone extract.

有効成分であるGluOC骨抽出物の摂取量は、目的の効果が発揮される量であればよい。GluOCに関しては、体重1kgあたり1μg/day以上とすることができ、3μg/day以上とすることが好ましく、30μg/day以上とすることがより好ましく、60μg/day以上とすることがより好ましい。いずれの場合であっても、1,000μg/day以下とすることができ、500μg/day以下とすることが好ましく、200μg/day以下とすることがより好ましく、100μg/day以下とすることがさらに好ましい。摂取は、一日に1〜数回に分けて行うことができる。   The intake amount of the GluOC bone extract, which is an active ingredient, may be an amount that exhibits the desired effect. Regarding GluOC, it can be 1 μg / day or more per 1 kg of body weight, preferably 3 μg / day or more, more preferably 30 μg / day or more, and more preferably 60 μg / day or more. In any case, it can be 1,000 μg / day or less, preferably 500 μg / day or less, more preferably 200 μg / day or less, and even more preferably 100 μg / day or less. . Ingestion can be divided into one to several times a day.

本発明の食用組成物には、目的の効果を発揮しうる限り、有効成分以外の他の成分を配合することができる。他の成分は、食品として許容される種々の添加食用組成物、または医薬として許容される種々の添加食用組成物であり得る。この例には、賦形食用組成物、酸化防止食用組成物抗（酸化食用組成物）、香料、調味料、甘味料、着色料、増粘安定食用組成物、発色食用組成物、漂白食用組成物、防かび食用組成物、ガムベース、苦味料等、酵素、光沢食用組成物、酸味料、乳化食用組成物、強化食用組成物、製造用食用組成物、結合食用組成物、緊張化食用組成物（等張化食用組成物）、緩衝食用組成物、溶解補助食用組成物、防腐食用組成物、安定化食用組成物、凝固食用組成物等である。   In the edible composition of the present invention, other components than the active ingredient can be blended as long as the desired effect can be exhibited. The other ingredient may be a variety of edible compositions that are pharmaceutically acceptable or a variety of edible compositions that are pharmaceutically acceptable. Examples include shaped edible compositions, anti-oxidant edible compositions (oxidized edible compositions), flavorings, seasonings, sweeteners, colorants, thickened stable edible compositions, colored edible compositions, bleached edible compositions. , Antifungal edible composition, gum base, bitter, etc., enzyme, glossy edible composition, acidulant, emulsified edible composition, enhanced edible composition, edible composition for manufacture, combined edible composition, strained edible composition (Isotonic edible composition), buffered edible composition, solubilized edible composition, anticorrosive composition, stabilized edible composition, coagulated edible composition, and the like.

他の成分は、GluOC、または豚骨抽出物以外の機能性成分であってもよい。他の機能性成分に例としては、カテキン類、アミノ酸類（例えば、分岐鎖アミノ酸類、オルニチン）、不飽和脂肪酸類（例えば、ARA、EPA、DHA、αリノレン酸、オメリノール酸、オレイン酸）、ビタミン類、微量金属類、ポリフェノール類、卵黄抽出物、はちみつ加工品、黒糖、オリゴ糖、食物繊維、コンドロイチン硫酸類、CoQ10、フコイダン、フコキサンチン、アスタキサンチン、セサミン、プラセンタ、酵母エキス、黒酢濃縮物、ニンニク抽出物、イチョウ葉抽出物、ビルベリー抽出物、ブルーベリー抽出物、各種人参抽出物、マカ抽出物、豆種皮抽出物、セントジョーンズワート抽出物、松樹皮抽出物、アサイー抽出物、ノニ抽出物等が挙げられる。   The other component may be a functional component other than GluOC or pork bone extract. Examples of other functional ingredients include catechins, amino acids (eg, branched chain amino acids, ornithine), unsaturated fatty acids (eg, ARA, EPA, DHA, α-linolenic acid, omelenoleic acid, oleic acid), Vitamins, trace metals, polyphenols, egg yolk extract, processed honey, brown sugar, oligosaccharide, dietary fiber, chondroitin sulfate, CoQ10, fucoidan, fucoxanthin, astaxanthin, sesamin, placenta, yeast extract, black vinegar concentrate , Garlic extract, Ginkgo biloba extract, Bilberry extract, Blueberry extract, Various carrot extracts, Maca extract, Bean seed coat extract, St. John's wort extract, Pine bark extract, Acai extract, Noni extract, etc. Is mentioned.

本発明の食用組成物が有効成分と有効成分以外の他の成分からなる場合、有効成分の含有量は、当業者であれば、製造し安さ、用いやすさ等の点から適宜設計でき、例えば、0.1〜99.9％とすることができ、また1〜95％とすることができ、また10％〜90％とすることができる。   When the edible composition of the present invention comprises an active ingredient and other ingredients other than the active ingredient, the content of the active ingredient can be appropriately designed by those skilled in the art from the viewpoint of ease of manufacture, ease of use, etc. 0.1-99.9%, 1-95%, and 10% -90%.

本発明の食用組成物は、上述したように、豚骨抽出物および豚骨抽出物を含有する既存の食品を除き、種々の形態であり得る。例えば、本発明の食用組成物は、それ自体で経口医薬品または食品であり得る。また本発明の食用組成物は、経口医薬品または食品に添加するために用いることができる。本発明で「食品」というときは、特に記載した場合を除き、固形物のみならず、液状のもの、例えばスープ、飲料およびドリンク食用組成物を含む。また、本発明で「食品」というときは、特に記載した場合を除き、ヒトを対象としたものと、非ヒト動物を対象としたものを含む。さらに本発明で「食品」というときは、特に記載した場合を除き、健康食品、サプリメント、保健機能食品（栄養機能食品および特定保健用食品を含む。）、一般食品（医薬品（新指定医薬部外品を含む）ではなく、かつ保健機能食品ではない食品）を含み、また治療食（治療の目的を果たすもの。医師が食事箋を出し、それに従い栄養士等が作成した献立に基づいて調理されたもの。）、食事療法食、成分調整食、減塩食、介護食、減カロリー食、ダイエット食を含む。非ヒト動物を対象とした食品は、ペットフード、ペット用飲料、ペット用サプリメント、飼料を含む。本発明で「医薬（品）」というときは、特に記載した場合を除き、ヒト用のものと動物用のものとを含む。   As described above, the edible composition of the present invention can be in various forms except for pork bone extract and existing food containing pork bone extract. For example, the edible composition of the present invention may itself be an oral pharmaceutical or food product. Moreover, the edible composition of this invention can be used in order to add to an oral pharmaceutical or a foodstuff. The term “food product” in the present invention includes not only solid substances but also liquid substances such as soups, beverages and drink edible compositions, unless otherwise specified. In addition, the term “food” in the present invention includes those intended for humans and those intended for non-human animals, unless otherwise specified. Furthermore, in the present invention, “food” refers to health foods, supplements, health functional foods (including nutritional functional foods and foods for specified health use), general foods (pharmaceuticals (newly designated quasi-drugs), unless otherwise specified. Foods that are not health functional foods) and are treated meals (to serve the purpose of treatment; prepared by a doctor and according to a menu prepared by a dietitian, etc.) Food), dietary diet, ingredient adjusted diet, low salt diet, nursing diet, reduced calorie diet, diet diet. Foods intended for non-human animals include pet food, pet beverages, pet supplements, and feed. In the present invention, the term “medicament (product)” includes those for humans and those for animals, unless otherwise specified.

本発明により提供される食用組成物が、経口医薬品、健康食品、サプリメントの形態である場合、その食用組成物形の例としては、カプセル食用組成物（軟カプセル食用組成物、硬カプセル食用組成物）、錠食用組成物（タブレット）、丸食用組成物、粉末食用組成物、顆粒食用組成物、細粒食用組成物、ゼリー食用組成物、チューブ入り食用組成物、ドリンク食用組成物を挙げることができる。   When the edible composition provided by the present invention is in the form of an oral pharmaceutical, health food, or supplement, examples of the edible composition include capsule edible compositions (soft capsule edible composition, hard capsule edible composition). ), Tablet edible compositions (tablets), round edible compositions, powdered edible compositions, granular edible compositions, fine edible compositions, jelly edible compositions, edible compositions in tubes, and edible drink compositions. it can.

軟カプセル食用組成物、硬カプセル食用組成物、錠食用組成物または丸食用組成物等の形態とする場合、有効成分であるGluOCの一食用組成物当たりの含量は、1μg以上とすることができ、3μg以上とすることが好ましく、30μg以上とすることがより好ましく、60μg以上とすることがより好ましく、200μg以上とすることがより好ましく、300μg以上とすることがより好ましく、600μg以上とすることがより好ましく、800μg以上とすることがより好ましく、1,000μg以上とすることがさらに好ましい。いずれの場合であっても、2,000μg以下とすることができ、1,800μg以下とすることが好ましく、1,600μg以下とすることがより好ましく、1,500μg以下とすることがさらに好ましい。   In the case of a soft capsule edible composition, a hard capsule edible composition, a tablet edible composition or a round edible composition, the content of GluOC as an active ingredient per edible composition can be 1 μg or more. 3 μg or more, preferably 30 μg or more, more preferably 60 μg or more, more preferably 200 μg or more, more preferably 300 μg or more, and 600 μg or more. Is more preferably 800 μg or more, and even more preferably 1,000 μg or more. In any case, it can be 2,000 μg or less, preferably 1,800 μg or less, more preferably 1,600 μg or less, and even more preferably 1,500 μg or less.

本発明により提供される食用組成物が、ペット用のものである場合、その形態の具体的な例としては、缶詰、ドライフード、レトルトフード食用組成物、豚骨抽出物茶葉製品、缶詰、ドライフード、レトルトフード、またはカプセル食用組成物もしくはタブレットを挙げることができる。   When the edible composition provided by the present invention is for pets, specific examples of the form include canned food, dry food, retort food edible composition, pork bone extract tea leaf product, canned food, dry food, Mention may be made of retort food or capsule edible compositions or tablets.

ペット用食品の形態とする場合、有効成分の含量は、一食としての摂取量を勘案して設計することができる。ペット用食品の形態とする場合、GluOCの一食用組成物当たりの含量は、10μg以上とすることができ、20μg以上とすることが好ましく、40μg/g以上とすることがより好ましく、80μg/g以上とすることがより好ましく120μg/g以上とすることがより好ましく、160μg/g以上とすることがより好ましく200μg/g以上とすることがより好ましく、240μg/g以上とすることがより好ましく、300μg以上とすることがさらに好ましい。いずれの場合であっても、4000μg以下とすることができ、3000μg/g以下とすることが好ましく、2000μg/g以下とすることがより好ましく、1500μg/g以下とすることがさらに好ましい。   In the case of a pet food form, the content of the active ingredient can be designed in consideration of the amount of intake as a meal. In the case of a pet food form, the content of GluOC per edible composition can be 10 μg or more, preferably 20 μg or more, more preferably 40 μg / g or more, and 80 μg / g. More preferably, it is more preferably 120 μg / g or more, more preferably 160 μg / g or more, more preferably 200 μg / g or more, more preferably 240 μg / g or more, More preferably, it is 300 μg or more. In any case, it can be 4000 μg or less, preferably 3000 μg / g or less, more preferably 2000 μg / g or less, and even more preferably 1500 μg / g or less.

本発明の食用組成物は、食事と共に、例えば、食前、食事中、食後に、摂取することができる。本発明の食用組成物は、メタボリックシンドロームの状態となる前に、メタボリックシンドロームとなるリスクの低減や予防等を目的として、対象に摂取させることができ、またメタボリックシンドロームの状態となる前に、またはそれに起因した疾患の発症後に、諸症状を改善すること等を目的として、対象に摂取させることができる。   The edible composition of the present invention can be taken with a meal, for example, before, during, or after a meal. The edible composition of the present invention can be ingested by a subject for the purpose of reducing or preventing the risk of becoming a metabolic syndrome before becoming a metabolic syndrome state, or before becoming a metabolic syndrome state, or After the onset of the disease resulting therefrom, the subject can be ingested for the purpose of improving various symptoms.

本発明の食用組成物には、上述の疾患または状態の処置のために用いることができる旨を表示することができ、また上述の対象に対して摂取を薦める旨を表示することができる。より具体的には、本発明の食用組成物には、メタボリックシンドロームの予防等のために、またはメタボリックシンドロームを改善することを表示することができる。表示は、直接的にまたは間接的にすることができ、直接的な表示の例は、製品自体、パッケージ、容器、ラベル、タグ等の有体物への記載であり、間接的な表示の例は、ウェブサイト、店頭、展示会、看板、掲示板、新聞、雑誌、テレビ、ラジオ、郵送物、電子メール等の場所または手段よる、広告・宣伝活動を含む。   The edible composition of the present invention can display that it can be used for the treatment of the above-mentioned diseases or conditions, and can display that it is recommended for the above-mentioned subject to take. More specifically, the edible composition of the present invention can be displayed for prevention of metabolic syndrome or the like, or to improve the metabolic syndrome. The labeling can be direct or indirect, and examples of direct labeling are descriptions on tangible objects such as the product itself, packages, containers, labels, tags, etc. Includes advertising and publicity activities by places or means such as websites, storefronts, exhibitions, signboards, bulletin boards, newspapers, magazines, television, radio, mailings, e-mails, etc.

以下、本発明を実施例を用いて説明するが、本発明の範囲は実施例に記載したものに限られない。   EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated using an Example, the range of this invention is not restricted to what was described in the Example.

〔豚骨からのオステオカルシンの抽出〕
1 原料と溶媒の検討
生の豚骨および煮た豚骨（煮骨、スープを熱水抽出した残渣）は株式会社クリーン・エコバランス(福岡市、日本)から提供された。生豚骨および煮骨をミキサーで粉砕したもの3g（湿重量）に対して10mlの0.2 M 炭酸緩衝液（炭酸ナトリウム（和光純薬工業）0.275g、炭酸水素ナトリウム（和光純薬工業）0.62を蒸留水で溶解し50mlとした。pH 9.5）加え、室温で24時間撹拌しながら抽出を行った。抽出液と残渣を12,000xgにて10分間遠心分離した後、抽出液を透析（スペクトラムラボラトリーズ、ランチョ ドミンゲス、CA; 分子量カットオフ3500）により中和・脱塩し、茶色液体の豚骨抽出物、約10mlを得た。
次に、透析された溶液中のGluオステオカルシンおよびGlaオステオカルシンの含有量をEIAキット（タカラバイオ、滋賀、日本）により測定した。その結果を図1に示す。図1Aに示すように、煮骨からより多くのGlaOCが抽出された。GluOCの抽出効率は生骨と煮骨でほとんど同じであった（図1B）。生骨を熱水で6時間加熱した抽出液（スープ）中に含まれるGlaOCおよびGluOCの量も測定したが、炭酸緩衝液による抽出と比較して効率は極めて低かった（図1AおよびB）。各抽出物のGlu/Gla比に顕著な差異は観察されなかった（図1C）。 [Extraction of osteocalcin from pork bone]
1 Examination of raw materials and solvents Raw pork bones and boiled pork bones (residues obtained by extracting boiled bones and soup with hot water) were provided by Clean Eco Balance Co., Ltd. (Fukuoka City, Japan). 10 g of 0.2 M carbonate buffer (sodium carbonate (Wako Pure Chemical Industries) 0.275 g, sodium hydrogen carbonate (Wako Pure Chemical Industries) 0.62) per 3 g (wet weight) of raw pork bone and boiled bone crushed with a mixer The solution was dissolved in distilled water to make 50 ml, pH 9.5), and extracted with stirring at room temperature for 24 hours. After centrifuging the extract and the residue at 12,000xg for 10 minutes, the extract is neutralized and desalted by dialysis (Spectrum Laboratories, Rancho Dominges, CA; molecular weight cut-off 3500). About 10 ml was obtained.
Next, the contents of Glu osteocalcin and Gla osteocalcin in the dialyzed solution were measured with an EIA kit (Takara Bio, Shiga, Japan). The results are shown in FIG. As shown in FIG. 1A, more GlaOC was extracted from the boiled bone. The extraction efficiency of GluOC was almost the same between raw bone and boiled bone (Fig. 1B). The amount of GlaOC and GluOC contained in the extract (soup) obtained by heating fresh bone with hot water for 6 hours was also measured, but the efficiency was extremely low compared to extraction with carbonate buffer (FIGS. 1A and B). No significant difference was observed in the Glu / Gla ratio of each extract (FIG. 1C).

2 豚骨抽出物のアミノ酸組成
豚骨抽出物のアミノ酸組成を、HClによる加水分解の後にアミノ酸自動分析法にて測定した（日本食品分析センター）。結果を下表に示した。コラーゲンに特異的なアミノ酸であるヒドロキシプロリンは30 mg/100 gほどが検出された。コラーゲン中のヒドロキシルプロリンの含有量が約10%であること（参考文献）を考慮すると、抽出されたタンパク質の大部分がコラーゲンであると推測される。

3 経口投与された豚骨抽出物の小腸における測定
豚骨の抽出物（一回投与量100μl中に1.1±0.1μgのGluOCを含む。全OCに占めるGluOCの割合4.1±0.7％）を8−10週齢のC57BL-6Jマウスに経口投与した。投与から3、6、および24時間後、動物をセボフルランおよびペントバルビタール(40 mg/kg)により麻酔して、小腸を切除した。小腸の内容物を秤量し、内容物1gにつき1mlの割合でリン酸緩衝生理食塩水に懸濁し、20,000 xgにて30分間4℃にて遠心分離した。得られた上清の部分に含まれるGlaおよびGluOC量をEIAキット（タカラバイオ）にて測定した。その結果を図2に示す。3時間後の小腸内容物からは1.4 ± 0.1 ngのGluOCが検出され、6時間後、24時間後もほぼ同量のGluOCが検出された（図2A）。また、小腸内容物中においてはGluOCの比率が約4倍増加していた（図2B）。 2 Amino acid composition of pork bone extract The amino acid composition of pork bone extract was measured by the automatic amino acid analysis method after hydrolysis with HCl (Japan Food Analysis Center). The results are shown in the table below. About 30 mg / 100 g of hydroxyproline, an amino acid specific to collagen, was detected. Considering that the content of hydroxylproline in collagen is about 10% (reference document), it is estimated that most of the extracted protein is collagen.

3 Measurement of orally administered porcine bone extract in the small intestine Extract of porcine bone (containing 1.1 ± 0.1 µg of GluOC in a single dose of 100 µl. GluOC as a percentage of total OC 4.1 ± 0.7%) Orally administered to 10-week-old C57BL-6J mice. 3, 6, and 24 hours after dosing, animals were anesthetized with sevoflurane and pentobarbital (40 mg / kg) and the small intestine was excised. The contents of the small intestine were weighed, suspended in phosphate buffered saline at a rate of 1 ml per 1 g of the contents, and centrifuged at 20,000 xg for 30 minutes at 4 ° C. The amount of Gla and GluOC contained in the obtained supernatant was measured with an EIA kit (Takara Bio). The result is shown in FIG. 1.4 ± 0.1 ng of GluOC was detected from the contents of the small intestine after 3 hours, and almost the same amount of GluOC was detected after 6 and 24 hours (FIG. 2A). In the small intestine contents, the ratio of GluOC increased by about 4 times (FIG. 2B).

4 通常食飼育マウスに対する豚骨抽出物投与の影響
通常の食事（CRF-1;オリエンタル酵母工業）で飼育した8週齢の雌性C57BL/6Jマウスに対し、一回投与量（100μl）あたり1.2μgのブタGluOCを含む豚骨抽出物または生理食塩水を毎朝8時に4週間経口投与し、その後各種代謝関連試験を行った。血糖値はフリースタイルライト血糖測定電極（アボットラボラトリーズ、アボットパーク、IL）を用いて測定した。血中インスリン濃度はマウスインスリン用ELISAキット（メルコディア、ウプサラ、スウェーデン）を用いて測定した。その結果を図3に示す。豚骨抽出物投与によって体重（図3A）、摂食時・空腹時（22時間絶食）血糖値（図3B）、空腹時血中インスリン濃度（図3C）に変化は見られなかった。グルコース腹腔内注射（3g/kg体重）15分後の血中インスリン濃度は豚骨抽出物投与群で増加傾向にあった（図3C）。22時間絶食後に体重1kgあたり2gのグルコースを腹腔内注射してグルコース負荷試験（IPGTT）を行った結果、豚骨抽出物投与群の耐糖能が改善していた（図3D）。また、4時間絶食後に体重1kgあたり0.4Uのインスリン（ヒューマリンR、イーライリリー）を腹腔内注射してインスリン負荷試験（ITT）を行ったところ、インスリン感受性に変化は見られなかった（図3E）。 4 Effects of pig bone extract administration on normal diet-fed mice 1.2 μg per single dose (100 μl) for 8-week-old female C57BL / 6J mice raised on a normal diet (CRF-1; Oriental Yeast Co., Ltd.) Porcine bone extract or saline containing porcine GluOC was orally administered every morning for 8 weeks at 8 am, and then various metabolism-related tests were conducted. The blood glucose level was measured using a freestyle light blood glucose measuring electrode (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL). Blood insulin concentration was measured using an ELISA kit for mouse insulin (Mercodia, Uppsala, Sweden). The results are shown in FIG. There was no change in body weight (Fig. 3A), fasting (fasting for 22 hours), blood glucose level (Fig. 3B), or fasting blood insulin concentration (Fig. 3C) by pig bone extract administration. The blood insulin concentration 15 minutes after glucose intraperitoneal injection (3 g / kg body weight) tended to increase in the pig bone extract administration group (FIG. 3C). After a fasting for 22 hours, glucose tolerance test (IPGTT) was performed by intraperitoneal injection of 2 g of glucose per kg of body weight. As a result, the glucose tolerance of the pig bone extract administration group was improved (FIG. 3D). In addition, when insulin tolerance test (ITT) was performed by intraperitoneal injection of 0.4 U insulin (Humarin R, Eli Lilly) per kg of body weight after a 4-hour fast, there was no change in insulin sensitivity (Figure 3E). ).

6−7週齢の雌性C57BL/6マウスを高脂肪高ショ糖食（HFS）(F2HFHSD; 30 % 脂肪, 20 % ショ糖、オリエンタル酵母工業)で飼育し、HFS開始から6週間後、マウスをランダムに2つのグループに分け、上記と同様の量の豚骨抽出物または生理食塩水を毎日4週間にわたって経口投与した。その後の各種代謝試験の結果を図4に示す。図4Aに示すように、豚骨抽出物投与群は、摂食時および空腹時ともに血糖値が顕著に低下していた。空腹時の血清GLP-1（シバヤギ社製ELISAキットにて測定）およびインスリン濃度も豚骨抽出物投与群で増加していた（図4C）。また、豚骨抽出物投与群では、耐糖能（IPGTT、22時間絶食後、体重1kgあたりグルコース1g腹腔内注射）およびインスリン感受性（ITT、4時間絶食後、体重1kgあたりインスリン1.5U腹腔内注射）も改善していた（図4E、F）。   6-7 week-old female C57BL / 6 mice were bred on a high fat high sucrose diet (HFS) (F2HFHSD; 30% fat, 20% sucrose, Oriental Yeast Co., Ltd.). Randomly divided into two groups, the same amount of porcine bone extract or saline was orally administered daily for 4 weeks. The results of various metabolic tests thereafter are shown in FIG. As shown in FIG. 4A, in the pork bone extract administration group, the blood glucose level was significantly reduced both during feeding and during fasting. Fasting serum GLP-1 (measured with an ELISA kit manufactured by Shibayagi Co., Ltd.) and insulin concentration were also increased in the pig bone extract administration group (FIG. 4C). In addition, in the pig bone extract administration group, glucose tolerance (IPGTT, 22 hours fasting, 1 g glucose per kg body weight intraperitoneal injection) and insulin sensitivity (ITT, 4 hours fasting, 1.5 U insulin per kg body weight intraperitoneal injection) (Figs. 4E and F).

5 膵臓の組織形態計測
上記のHFS飼育豚骨抽出物投与群およびコントロール群の膵臓を摘出し、10%中性ホルマリン中にて固定後パラフィン切片（6μm）を作成した。続いて切片をウサギ-抗インスリン（#4590の1:1000希釈;セルシグナリングテクノロジー、ボストン、MA）およびABCエリートキットプラスImmPact DAB（ベクターラボラトリーズ、バーリンゲーム、CA）を用いて染色し、マイヤーズヘマトキシリン（武藤化学、東京、日本）により対比染色した。インスリン免疫染色陽性の細胞をβ細胞とし、その面積および切片全体の面積をBZ-II アナライザー （キーエンス、大阪、日本）を用いて測定した。その結果、図4Dに示すように、豚骨抽出物投与群において単位面積あたりのランゲルハンス島の数が増加していた。また、切片全体に占めるβ細胞の割合も増加傾向にあった（図4E）。 5 Measurement of pancreatic tissue morphology The pancreas of the HFS-reared pig bone extract-administered group and the control group were excised and fixed in 10% neutral formalin to prepare paraffin sections (6 μm). Subsequent sections were stained using rabbit-anti-insulin (1: 1000 dilution of # 4590; Cell Signaling Technology, Boston, MA) and ABC Elite Kit Plus ImmPact DAB (Vector Laboratories, Burlingame, CA) and Myers Hematoxylin ( Mutoh Chemical, Tokyo, Japan). Insulin immunostaining-positive cells were defined as β cells, and the area and the entire area of the section were measured using a BZ-II analyzer (Keyence, Osaka, Japan). As a result, as shown in FIG. 4D, the number of islets of Langerhans per unit area increased in the pig bone extract administration group. In addition, the proportion of β cells in the entire section tended to increase (FIG. 4E).

6 白色脂肪組織の組織形態計測
普通食飼育およびHFS飼育肥満モデルマウスに4週間にわたって毎日豚骨抽出物を経口投与した後、性腺周囲脂肪組織を摘出し、10%中性ホルマリン中で固定して6μm厚のパラフィン切片を作成した。その後、ヘマトキシリンおよびエオシン（H&E）の染色を行い、単位面積あたりの脂肪細胞の数および脂肪細胞の面積を測定した（BZ-II アナライザー、キーエンス）。図5に示すとおり、4週間にわたる豚骨抽出物の経口投与によって普通食、HFS飼育の両群において脂肪細胞の大きさを減少させた。小さな脂肪細胞の割合が増加し、脂肪細胞の平均面積は減少した。 6 White adipose tissue histomorphometry Oral administration of porcine bone extract daily for 4 weeks to obese model mice fed with normal diet and HFS, the perigonal adipose tissue was removed and fixed in 10% neutral formalin. A 6 μm thick paraffin section was prepared. Thereafter, hematoxylin and eosin (H & E) were stained, and the number of adipocytes per unit area and the area of adipocytes were measured (BZ-II analyzer, Keyence). As shown in FIG. 5, the adipocyte size was reduced in both the normal diet and HFS-fed groups by oral administration of porcine bone extract over 4 weeks. The proportion of small adipocytes increased and the average area of adipocytes decreased.

7 雄性マウスに対する豚骨抽出物の効果
6−7週齢の雄性C57BL/6マウスをHFSで飼育し、HFS開始から6週間後、マウスをランダムに2つのグループに分け、上記と同様の量の豚骨抽出物または生理食塩水を毎日4週間にわたって経口投与した。その後の各種代謝試験の結果を図5に示す。雄性マウスにおいては、豚骨抽出物を投与しても耐糖能（IPGTT、22時間絶食後、体重1kgあたりグルコース1g腹腔内注射）およびインスリン感受性（ITT、4時間絶食後、体重1kgあたりインスリン1.5U腹腔内注射）に変化が見られなかった（図6A、B）。 7 Effect of pork bone extract on male mice
6-7 week old male C57BL / 6 mice are bred in HFS, 6 weeks after the start of HFS, the mice are randomly divided into two groups, and the same amount of porcine bone extract or saline solution is administered daily. Orally administered for 4 weeks. The results of various metabolic tests thereafter are shown in FIG. In male mice, glucose tolerance (IPGTT, intraperitoneal injection of 1 g glucose per kg body weight after 22 hours fasting) and insulin sensitivity (ITT, 4 h fasting, 1.5 U insulin per kg body weight after administration of porcine bone extract) No change was observed in (intraperitoneal injection) (FIGS. 6A and B).

8 妊娠マウスに対するGluOCの効果
C57BL/6マウスを妊娠期間中普通食あるいはHFSで飼育した。それぞれをさらに2群に分け、一方には妊娠期間中毎日GluOCを経口投与し、他方には生理食塩水を投与した。出産と同時にすべての母親の食餌を普通食に変更するとともにGluOCの投与を終了し、21日間の授乳に供した。離乳後に雌雄とも2群に分けて普通食と高脂肪食を与えて約3ヶ月飼育した。普通食で飼育した仔マウスにはGluOC投与群と対照群に雌雄とも相違はなかった。しかし、高脂肪食で飼育した雌性仔マウスでは、妊娠中にHFS摂取した母親の産仔は、通常食を摂取していた母親から生まれた産仔より授乳中から体重が有意に重かった。この傾向は、仔が成獣となった後も引き続き観察された。妊娠母体がGluOCを摂取することでこの産仔の体重増加は回避された。仔の解析結果を図7に示す。 8 Effects of GluOC on pregnant mice
C57BL / 6 mice were bred on normal diet or HFS during pregnancy. Each was further divided into two groups, one was orally administered GluOC daily during pregnancy and the other was administered saline. At the same time of delivery, all mothers' diets were changed to regular diets, and GluOC administration was terminated, and the animals were fed for 21 days. After weaning, both males and females were divided into two groups and fed a normal diet and a high-fat diet for about 3 months. There was no difference between males and females in the GluOC-administered group and the control group in the pup mice raised on the normal diet. However, in female pups bred on a high-fat diet, mothers born with HFS during pregnancy were significantly heavier during breastfeeding than those born to mothers who were on a normal diet. This trend continued to be observed after the pups became adults. The increase in body weight of the pups was avoided when pregnant mothers consumed GluOC. Fig. 7 shows the analysis results of the pups.

〔食品製造例〕
(1)カプセル食用組成物（1〜3カプセル/dayを推奨）
上述の豚骨抽出物の1/20濃縮物やその乾燥物等を利用し、カプセルあたり0.6mgのGluOCを含む、カプセル食用組成物を調製する。 [Food production example]
(1) Capsule edible composition (1-3 capsules / day recommended)
A capsule edible composition containing 0.6 mg of GluOC per capsule is prepared using a 1/20 concentrate of the above pork bone extract or a dried product thereof.

(2)飲料
上述の豚骨抽出物の1/20濃縮物やその乾燥物等を、飲料原料に加え、必要に応じ無菌的に容器に充填し、または充填後レトルト殺菌する。GluOC濃度が約1.7μg/mL、一食（350 mL）あたり0.6mgのGluOCを含む、食用組成物が得られる。 (2) Beverage Add 1/20 concentrate of the above pork bone extract or dried product thereof to beverage ingredients and aseptically fill the container as necessary, or sterilize by retort after filling. An edible composition is obtained having a GluOC concentration of about 1.7 μg / mL and 0.6 mg GluOC per serving (350 mL).

SEQ ID NO.:1 human OC
SEQ ID NO.:2 pig OC
SEQ ID NO.:3 mouse OC
SEQ ID NO.:4 rat OC
SEQ ID NO.:5 bovine OC
SEQ ID NO.:6 chicken OC
SEQ ID NO.:7 monkey OC SEQ ID NO.:1 human OC
SEQ ID NO.:2 pig OC
SEQ ID NO.:3 mouse OC
SEQ ID NO.:4 rat OC
SEQ ID NO.:5 bovine OC
SEQ ID NO.:6 chicken OC
SEQ ID NO.:7 monkey OC

Claims (5)

非または低カルボキシル化オステオカルシン（GluOC）を含有する豚骨抽出物を含む、メタボリックシンドロームの予防または改善のための食用組成物。   An edible composition for preventing or ameliorating metabolic syndrome, comprising a porcine bone extract containing non- or low-carboxylated osteocalcin (GluOC). 一日当たりの摂取量中、10μg〜5,000μgのGluOCを含有する、請求項１に記載の食用組成物。   The edible composition according to claim 1, comprising 10 μg to 5,000 μg of GluOC in a daily intake. GluOC含有骨抽出物が、アミノ酸組成において、グリシン１質量部に対して０．１〜１質量部のグルタミン酸を含む、請求項１または２に記載の食用組成物。   The edible composition according to claim 1 or 2, wherein the GluOC-containing bone extract contains 0.1 to 1 part by mass of glutamic acid with respect to 1 part by mass of glycine in the amino acid composition. GluOC含有骨抽出物が、γ−カルボキシル化オステオカルシン（GlaOC）を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の食用組成物。   The edible composition according to any one of claims 1 to 3, wherein the GluOC-containing bone extract contains γ-carboxylated osteocalcin (GlaOC). サプリメント、ドリンク食用組成物、または飲料の形態である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の食用組成物。   The edible composition according to any one of claims 1 to 4, which is in the form of a supplement, a drink edible composition, or a beverage.