JP2017024991A - Anti-cadherin-17 antibody and extra-corporeal imaging agent for gastric cancer - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、胃がん細胞に特異的な抗カドヘリン１７抗体及びこれを用いた胃がん診断薬に関する。 The present invention relates to an anti-cadherin 17 antibody specific to gastric cancer cells and a diagnostic agent for gastric cancer using the same.
胃がんは、我が国で最も多いがんであり、その死亡率も肺がんに次いで２番目に高い。胃がんの治療法は、原則外科的手術であり、内視鏡での早期がんの切除、腹腔鏡での手術も行われているものの、基本的には広範な切除が行われており、患者への負担は大きい。胃がんの切除術では、がん組織自体の切除に加えて、転移の可能性もありリンパ節も切除する必要がある。 Gastric cancer is the most common cancer in Japan, and its mortality rate is the second highest after lung cancer. Treatment of gastric cancer is basically a surgical operation. Although early cancer resection with an endoscope and laparoscopic surgery are also performed, basically a wide range of resection is performed. The burden on is great. In gastric cancer resection, in addition to the removal of the cancer tissue itself, there is a possibility of metastasis and it is necessary to remove lymph nodes.
しかしながら、胃がんの切除術においては、術中に胃組織が大きく移動し、脂肪組織中の胃がん組織の発見は容易ではない。さらに、転移可能性のあるリンパ節の発見も困難である場合が多い。従って、手術前及び手術中における胃がん部位及び転移部位の特定は、手術時間の短縮、患者への負担軽減の点から極めて重要である。 However, in gastric cancer resection, gastric tissue moves greatly during the operation, and it is not easy to find gastric cancer tissue in adipose tissue. In addition, it is often difficult to find lymph nodes that can metastasize. Therefore, identification of the stomach cancer site and the metastatic site before and during the operation is extremely important from the viewpoint of shortening the operation time and reducing the burden on the patient.
胃がん部位の特定手段として、がんのグルコース代謝を利用して18Ｆ−ＦＤＧ（フルオロデオキシグルコース）を用いたＰＥＴイメージングによりリンパ節転移を診断する検査が広く行われている。 As a means for identifying a gastric cancer site, a test for diagnosing lymph node metastasis by PET imaging using 18 F-FDG (fluorodeoxyglucose) using glucose metabolism of cancer is widely performed.
一方、モノクローナル抗体を用いたがん治療は、２１世紀にはいって遺伝子工学によるヒト化や改変抗体などの技術の進歩とあいまって、有効な治療法として受け入れられるようになった。がん表面抗原をターゲットとする抗体は特異性が高く、バイオ医薬品として有効な親和性を有している。抗体を用いた診断技術としては、ハーセプチンにＰＥＴ核種を付与したプローブにより、転移巣のイメージングが有効であることが報告されている（非特許文献１）。イメージングによりがんへの集積がみられれば、治療核種（β線核種あるいはα線核種）による放射線内用療法（ＲＩＴ）の適応も考えられる。これまで、抗体を用いた診断は、セバリンによる悪性リンパ腫のＲＩＴを行う術前診断として、骨髄抑制などの副作用の診断として用いられるものが一般的であり、がんの診断目的で使用されるものは抗ＣＥＡ抗体のＦｍｂ化したものなどがあるが、有効な診断法として一般化されていない。 On the other hand, cancer treatment using monoclonal antibodies has been accepted as an effective treatment method in the 21st century, coupled with advances in technology such as humanization and genetic modification by genetic engineering. Antibodies targeting cancer surface antigens are highly specific and have an affinity that is effective as a biopharmaceutical. As a diagnostic technique using an antibody, it has been reported that imaging of metastases is effective using a probe in which a PET nuclide is added to Herceptin (Non-patent Document 1). If accumulation in cancer is seen by imaging, indication of radiotherapy (RIT) with therapeutic nuclides (β-ray nuclides or α-ray nuclides) may be considered. Until now, diagnosis using antibodies has been generally used as a preoperative diagnosis for malignant lymphoma-induced RIT with sebaline as a diagnosis of side effects such as myelosuppression, and is used for the purpose of cancer diagnosis There are FCEs of anti-CEA antibodies, but they are not generalized as effective diagnostic methods.
また、カドヘリン（Ｃａｄｈｅｒｉｎ）は、細胞表面に発現するＣａ2+依存的な接着分子である。当該カドヘリンには、Ｅカドヘリン、Ｎカドヘリン、Ｐカドヘリン（ＣＤＨ３）等のクラシックカドヘリンの他にプロトカドヘリン、デスモソームカドヘリン等が知られている。これらのカドヘリンは、ホモフィリックに結合し、アドヘレンス・ジャンクションを形成し、細胞内のカテニンを介して細胞内骨格系（アクチン繊維）に連結することが知られており、このような機序により細胞接着を司っていると考えられる。 Cadherin is a Ca 2+ -dependent adhesion molecule expressed on the cell surface. In addition to classic cadherins such as E cadherin, N cadherin, and P cadherin (CDH3), protocadherin, desmosomal cadherin, and the like are known as the cadherin. These cadherins are known to bind homophilicly, form adherence junctions, and connect to the intracellular skeletal system (actin fibers) via intracellular catenin. It is thought that it governs the bonding.
またカドヘリンは細胞接着以外に、胚発生、形態形成、シナプス形成、シナプス可塑性、さらには癌の浸潤、転移にも関与しているといわれている。従って、抗カドヘリン抗体は、癌治療に有用であることが報告されている（特許文献１〜３）。 In addition to cell adhesion, cadherin is said to be involved in embryogenesis, morphogenesis, synapse formation, synaptic plasticity, as well as cancer invasion and metastasis. Therefore, it has been reported that anti-cadherin antibodies are useful for cancer treatment (Patent Documents 1 to 3).
しかしながら、従来の抗カドヘリン抗体の癌治療効果は十分とは言えず、また診断薬としても十分なものとは言えなかった。
従って、本発明の課題は、胃がんに特異的であり、胃がん組織集積性が高い抗カドヘリン抗体並びにそれを用いた診断薬及び治療薬を提供することにある。
However, it cannot be said that conventional anti-cadherin antibodies have a sufficient cancer therapeutic effect and are not sufficient as diagnostic agents.
Accordingly, an object of the present invention is to provide an anti-cadherin antibody that is specific to gastric cancer and has high gastric cancer tissue accumulation, and a diagnostic and therapeutic agent using the same.
そこで本発明者は、数多くの抗カドヘリン抗体を作製し、その胃がん組織集積性、胃がん特異性を検討してきたところ、特定のＣＤＲを有する抗カドヘリン１７抗体が、胃がんに対する特異性が高く、かつ胃がん組織集積性に優れ、当該抗体の放射性金属標識体を用いれば胃がん組織のイメージング及び胃がん治療が可能になることを見出し、本発明を完成した。 Therefore, the present inventors have prepared a number of anti-cadherin antibodies and studied their gastric cancer tissue accumulation and gastric cancer specificity. As a result, the anti-cadherin 17 antibody having a specific CDR has high specificity for gastric cancer and gastric cancer. The present inventors have found that it is excellent in tissue accumulation and that imaging of gastric cancer tissue and gastric cancer treatment can be performed by using the radioactive metal label of the antibody.
すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔５〕を提供するものである。 That is, the present invention provides the following [1] to [5].
〔１〕重鎖が下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）であり、軽鎖が下記（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）である抗カドヘリン１７抗体又はその改変体。
（ａ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７及び１９から選ばれるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲを有する重鎖、
（ｂ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７及び１９から選ばれるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加された重鎖ＣＤＲを有する重鎖、
（ｃ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７及び１９から選ばれるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有する重鎖ＣＤＲを有する重鎖、
（ｄ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８及び２０から選ばれるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲを有する軽鎖、
（ｅ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８及び２０から選ばれるアミノ酸配列において２１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加された軽鎖ＣＤＲを有する軽鎖、
（ｆ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８及び２０から選ばれるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有する軽鎖ＣＤＲを有する軽鎖。
〔２〕放射性金属元素が金属キレート試薬を介して〔１〕記載の抗カドヘリン１７抗体又はその改変体に結合してなる、放射性金属標識抗カドヘリン１７抗体又はその改変体。
〔３〕〔２〕記載の放射性金属標識抗カドヘリン１７抗体又はその改変体を有効成分とする胃がん診断薬。
〔４〕胃がん体外イメージング剤である〔３〕記載の診断薬。
〔５〕〔２〕記載の放射性金属標識抗カドヘリン１７抗体又はその改変体を有効成分とする胃がん治療薬。
[1] An anti-cadherin 17 antibody having a heavy chain of the following (a), (b) or (c) and a light chain of the following (d), (e) or (f) or a variant thereof:
(A) a heavy chain having a heavy chain CDR having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, and 19.
(B) a heavy chain in which 1 to several amino acids are deleted, substituted, and / or added in the amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, and 19. Heavy chain with CDRs,
(C) a heavy chain having a heavy chain CDR having 90% or more identity with an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, and 19.
(D) a light chain having a light chain CDR having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, and 20.
(E) a light chain in which 21 to several amino acids are deleted, substituted, and / or added in an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, and 20. A light chain having a CDR,
(F) A light chain having a light chain CDR having 90% or more identity with an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, and 20.
[2] A radioactive metal-labeled anti-cadherin 17 antibody or a variant thereof, wherein the radioactive metal element is bound to the anti-cadherin 17 antibody or the variant thereof according to [1] via a metal chelating reagent.
[3] A diagnostic agent for gastric cancer comprising the radioactive metal-labeled anti-cadherin 17 antibody or a variant thereof according to [2] as an active ingredient.
[4] The diagnostic agent according to [3], which is an in vitro imaging agent for gastric cancer.
[5] A therapeutic agent for gastric cancer comprising the radioactive metal-labeled anti-cadherin 17 antibody or a variant thereof according to [2] as an active ingredient.
本発明の抗体は、胃がん組織に特異的に結合し、かつ胃がん組織集積性が高いため、胃がん部位を選択的にイメージングでき、また胃がん治療薬としても有用である。 Since the antibody of the present invention specifically binds to gastric cancer tissue and has high gastric cancer tissue accumulation properties, it can selectively image a gastric cancer site and is also useful as a gastric cancer therapeutic agent.
本明細書において、アミノ酸、ペプチド、タンパク質は下記に示すＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会（ＣＢＮ）で採用された略語を用いて表される。また、特に断りがない限り、ペプチド及びタンパク質のアミノ酸残基の配列は、左端から右端に向かってＮ末端からＣ末端となるように記載される。
Ａｌａ又はＡ：アラニン
Ｖａｌ又はＶ：バリン
Ｌｅｕ又はＬ：ロイシン
Ｉｌｅ又はＩ：イソロイシン
Ｐｒｏ又はＰ：プロリン
Ｐｈｅ又はＦ：フェニルアラニン
Ｔｒｐ又はＷ：トリプトファン
Ｍｅｔ又はＭ：メチオニン
Ｇｌｙ又はＧ：グリシン
Ｓｅｒ又はＳ：セリン
Ｔｈｒ又はＴ：トレオニン
Ｃｙｓ又はＣ：システイン
Ｇｌｎ又はＱ：グルタミン
Ａｓｎ又はＮ：アスパラギン
Ｔｙｒ又はＹ：チロシン
Ｌｙｓ又はＫ：リシン
Ａｒｇ又はＲ：アルギニン
Ｈｉｓ又はＨ：ヒスチジン
Ａｓｐ又はＤ：アスパラギン酸
Ｇｌｕ又はＥ：グルタミン酸
In the present specification, amino acids, peptides and proteins are represented using abbreviations adopted by the IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Committee (CBN) shown below. Unless otherwise specified, the amino acid residue sequences of peptides and proteins are described from the N-terminus to the C-terminus from the left end to the right end.
Ala or A: alanine Val or V: valine Leu or L: leucine Ile or I: isoleucine Pro or P: proline Phe or F: phenylalanine Trp or W: tryptophan Met or M: methionine Gly or G: glycine Ser or S: serine Thr or T: Threonine Cys or C: Cysteine Gln or Q: Glutamine Asn or N: Asparagine Tyr or Y: Tyrosine Lys or K: Lysine Arg or R: Arginine His or H: Histidine Asp or D: Aspartate Glu or E: Glutamic acid
本発明の抗体は、抗カドヘリン１７抗体であり、好ましくは抗ヒトカドヘリン１７抗体である。当該抗体には、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体が含まれるが、モノクローナル抗体が好ましい。また天然型抗体、遺伝子組み換え技術を用いて製造され得るキメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆ（ａｂ）2、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ｓｃＦｖ等が挙げられる。また、抗体の改変体としては、ダイアボディ、バイスペシフィックダイアボディ、ミニボディ、ペプチドボディ、シメティボディ等が挙げられる。 The antibody of the present invention is an anti-cadherin 17 antibody, preferably an anti-human cadherin 17 antibody. Such antibodies include monoclonal antibodies and polyclonal antibodies, with monoclonal antibodies being preferred. Further, natural antibodies, chimeric antibodies that can be produced using genetic recombination techniques, humanized antibodies, single chain antibodies, F (ab ′) 2 , F (ab) 2 , Fab, Fab ′, Fv, scFv, etc. It is done. Examples of the modified antibody include diabody, bispecific diabody, minibody, peptide body, and sicibody.
本発明の抗カドヘリン１７抗体は、重鎖が下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）であり、軽鎖が下記（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）である。
（ａ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７及び１９から選ばれるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲを有する重鎖、
（ｂ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７及び１９から選ばれるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加された重鎖ＣＤＲを有する重鎖、
（ｃ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７及び１９から選ばれるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有する重鎖ＣＤＲを有する重鎖、
（ｄ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８及び２０から選ばれるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲを有する軽鎖、
（ｅ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８及び２０から選ばれるアミノ酸配列において２１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加された軽鎖ＣＤＲを有する軽鎖、
（ｆ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８及び２０から選ばれるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有する軽鎖ＣＤＲを有する軽鎖。
In the anti-cadherin 17 antibody of the present invention, the heavy chain is the following (a), (b) or (c), and the light chain is the following (d), (e) or (f).
(A) a heavy chain having a heavy chain CDR having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, and 19.
(B) a heavy chain in which 1 to several amino acids are deleted, substituted, and / or added in the amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, and 19. Heavy chain with CDRs,
(C) a heavy chain having a heavy chain CDR having 90% or more identity with an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, and 19.
(D) a light chain having a light chain CDR having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, and 20.
(E) a light chain in which 21 to several amino acids are deleted, substituted, and / or added in an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, and 20. A light chain having a CDR,
(F) A light chain having a light chain CDR having 90% or more identity with an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, and 20.
前記重鎖及び軽鎖の組み合わせは、配列番号１と２（Ｄ２１０１）、配列番号３と４（Ｄ２１１１）、配列番号５と６(Ｄ２００５)、配列番号７と８（Ｄ２００８）、配列番号９と１０（Ｄ２１０５）、配列番号１１と１２（Ｄ２１０６）、配列番号１３と１４（Ｄ２１０７）、配列番号１５と１６（Ｄ２１１４）、配列番号１７と１８（Ｄ２０２５）、配列番号１９と２０（Ｄ２１６３）である。
このうち、配列番号１と２（Ｄ２１０１）、配列番号３と４（Ｄ２１１１）、配列番号５と６（Ｄ２００５）、配列番号７と８（Ｄ２００８）、配列番号９と１０（Ｄ２１０５）、配列番号１１と１２（Ｄ２１０６）、及び配列番号１３と１４（Ｄ２１０７）がより好ましい。このうち、配列番号１と２の組み合わせ（Ｄ２１０１）、及び配列番号３と４の組み合わせ（Ｄ２１１１）がさらに好ましい。
The combinations of heavy chain and light chain are as follows: SEQ ID NO: 1 and 2 (D2101), SEQ ID NO: 3 and 4 (D2111), SEQ ID NO: 5 and 6 (D2005), SEQ ID NO: 7 and 8 (D2008), SEQ ID NO: 9 10 (D2105), SEQ ID NO: 11 and 12 (D2106), SEQ ID NO: 13 and 14 (D2107), SEQ ID NO: 15 and 16 (D2114), SEQ ID NO: 17 and 18 (D2025), SEQ ID NO: 19 and 20 (D2163) is there.
Among these, SEQ ID NO: 1 and 2 (D2101), SEQ ID NO: 3 and 4 (D2111), SEQ ID NO: 5 and 6 (D2005), SEQ ID NO: 7 and 8 (D2008), SEQ ID NO: 9 and 10 (D2105), SEQ ID NO: 11 and 12 (D2106) and SEQ ID NOs: 13 and 14 (D2107) are more preferred. Of these, the combination of SEQ ID NOs: 1 and 2 (D2101) and the combination of SEQ ID NOs: 3 and 4 (D2111) are more preferable.
前記アミノ酸が欠失、置換及び／又は付加される場合（改変）のアミノ酸の改変の個数は１〜数個であるが、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個である。また、改変されたアミノ酸配列の同一性は、前記各アミノ酸配列と９０％以上であるが、９２％以上が好ましく、９５％以上がより好ましい。 When the amino acid is deleted, substituted and / or added (modified), the number of amino acid modifications is 1 to several, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and still more preferably. 1 to 3 pieces. The identity of the modified amino acid sequence is 90% or more with each amino acid sequence, preferably 92% or more, and more preferably 95% or more.
本発明の抗カドヘリン１７抗体は、胃がん、特にヒト胃がん組織に特異的に結合し、かつ胃がん組織への集積性が高い点で、従来の抗カドヘリン１７抗体、例えば市販の抗カドヘリン１７抗体と明確に相違する。 The anti-cadherin 17 antibody of the present invention is clearly different from conventional anti-cadherin 17 antibodies, for example, commercially available anti-cadherin 17 antibodies, in that they bind specifically to gastric cancer, particularly human gastric cancer tissue, and have high accumulation in gastric cancer tissue. Is different.
本発明の抗カドヘリン１７抗体は、任意の適当な方法、例えば、インビボ、培養細胞、インビトロ翻訳反応、および組換えＤＮＡ発現系により製造することができる。 The anti-cadherin 17 antibody of the present invention can be produced by any appropriate method, for example, in vivo, cultured cells, in vitro translation reaction, and recombinant DNA expression system.
モノクローナル抗体および抗体産生細胞（ハイブリドーマ）を製造する手法は当該技術分野においてよく知られている（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８４；Ｓｔ．Ｇｒｏｔｈ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３５：１−２１，１９８０）。カドヘリン１７遺伝子によりコードされる蛋白質またはフラグメントを免疫原として用いて、抗体を生成することが知られている任意の動物（マウス、ウサギ等）に皮下または腹腔内注射することにより免疫することができる。免疫に際してアジュバントを用いてもよく、そのようなアジュバントは当該技術分野においてよく知られている。 Techniques for producing monoclonal antibodies and antibody-producing cells (hybridomas) are well known in the art (Campbell, “Monoclonal Technology Technologies, Laboratory Technology in Biochemistry, Biochemistry, Bioscience, Biosciences, Biosciences, Biosciences, Biosciences, Biosciences, Biosciences, Biomolecules, Biomolecules, Biomolecules, Biomolecules, Biomolecules, Biomolecules, Biomolecules, Biomolecules, Biomolecules, Biomolecules, Biomolecules, Biomolecules, Biomolecules, Biomolecules, Biomolecules, Biomolecules, Biomolecules, Biomolecules, and Biomolecules. St. Groth et al., J. Immunol. Methods 35: 1-21, 1980). The protein or fragment encoded by the cadherin 17 gene can be used as an immunogen to immunize by subcutaneous or intraperitoneal injection into any animal (mouse, rabbit, etc.) known to produce antibodies. . Adjuvants may be used during immunization and such adjuvants are well known in the art.
ポリクローナル抗体は、免疫した動物から抗体を含有する抗血清を単離し、ＥＬＩＳＡアッセイ、ウエスタンブロット分析、またはラジオイムノアッセイ等の当該技術分野においてよく知られる方法を用いて、所望の特異性を有する抗体の存在についてスクリーニングすることにより得ることができる。 Polyclonal antibodies are obtained by isolating antisera containing antibodies from immunized animals and using methods well known in the art such as ELISA assay, Western blot analysis, or radioimmunoassay to detect antibodies with the desired specificity. It can be obtained by screening for the presence.
モノクローナル抗体は、免疫した動物から脾臓細胞を切除し、ミエローマ細胞と融合させ、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を作製することにより得ることができる。ＥＬＩＳＡアッセイ、ウエスタンブロット分析、またはラジオイムノアッセイ等の当該技術分野においてよく知られる方法を用いて、目的とする蛋白質またはそのフラグメントを認識する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を選択する。所望の抗体を分泌するハイブリドーマをクローニングし、適切な条件下で培養し、分泌された抗体を回収し、当該技術分野においてよく知られる方法、例えばイオン交換カラム、アフィニティークロマトグラフィー等を用いて精製することができる。あるいは、ゼノマウス株を用いてヒト型モノクローナル抗体を製造してもよい（Ｇｒｅｅｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１：１１−２３，１９９９；Ｗｅｌｌｓ，Ｅｅｋ，Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２０００ Ａｕｇ；７（８）：Ｒ１８５−６を参照）。また、免疫を行わないファージディスプレイに基づいたモノクローナル抗体の作製も現在行われており、本発明のモノクローナル抗体は、単一の抗体産生細胞または、それから得られた抗体をコードするＤＮＡを用いて生産される単一分子種の抗体を示し、前述の方法のいずれで製造されてもかまわない。 Monoclonal antibodies can be obtained by excising spleen cells from immunized animals and fusing them with myeloma cells to produce hybridoma cells that produce monoclonal antibodies. Using methods well known in the art such as ELISA assay, Western blot analysis, or radioimmunoassay, hybridoma cells producing an antibody that recognizes the protein of interest or a fragment thereof are selected. A hybridoma that secretes the desired antibody is cloned, cultured under appropriate conditions, and the secreted antibody is recovered and purified using methods well known in the art, such as ion exchange columns, affinity chromatography, and the like. be able to. Alternatively, a human monoclonal antibody may be produced using a xenomous strain (Green, J. Immunol. Methods 231: 11-23, 1999; Wells, Eek, Chem Biol 2000 Aug; 7 (8): R185-6. See). In addition, monoclonal antibodies based on phage display without immunization are currently being produced, and the monoclonal antibodies of the present invention are produced using single antibody-producing cells or DNA encoding the antibodies obtained therefrom. Which may be produced by any of the methods described above.
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、慣用な方法（例えば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いて）により容易に単離、配列決定できる。ハイブリドーマ細胞はこのようなＤＮＡの好ましい出発材料である。一度単離したならば、ＤＮＡを発現ベクターに挿入し、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または形質転換されなければ免疫グロブリンを産生しないミエローマ細胞等の宿主細胞へ組換え、組換え宿主細胞からモノクローナル抗体を産生させる。また別の態様として、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５４（１９９０））により記載された技術を用いて製造された抗体ファージライブラリーより抗体、または抗体断片は単離することができる。 DNA encoding the monoclonal antibody can be easily isolated and sequenced by conventional methods (eg, using oligonucleotide probes capable of specifically binding to the genes encoding the heavy and light chains of the monoclonal antibody). it can. Hybridoma cells are a preferred starting material for such DNA. Once isolated, the DNA is inserted into an expression vector. Recombinant host cells such as E. coli cells, monkey COS cells, Chinese hamster ovary (CHO) cells or myeloma cells that do not produce immunoglobulin unless transformed, and produce monoclonal antibodies from the recombinant host cells. In another embodiment, an antibody or antibody fragment can be isolated from an antibody phage library produced using the technique described by McCafferty et al. (Nature 348: 552-554 (1990)).
モノクローナル抗体発現に使用する宿主細胞系は、哺乳動物起源のものを用いるのが好ましい。発現させたいモノクローナル抗体に最も適する宿主細胞系を選択できる。一般的な宿主細胞系としては、ＣＨＯ由来細胞株（チャイニーズハムスター卵巣細胞系）、ＣＶ１（サル腎臓系）、ＣＯＳ（ＳＶ４０Ｔ抗原をするＣＶ１の誘導体）、ＳＰ２／０（マウスミエローマ）、Ｐ３ｘ６３−Ａｇ３．６５３（マウスミエローマ）、および２９３（ヒト腎臓）、２９３Ｔ（ＳＶ４０Ｔ抗原をする２９３の誘導体）が挙げられるがそれらに限定されない。宿主細胞系は商業施設やｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から、または発表された文献の発表機関から入手することができる。 The host cell system used for monoclonal antibody expression is preferably of mammalian origin. A host cell line may be selected that is most suitable for the monoclonal antibody desired to be expressed. Common host cell lines include CHO-derived cell lines (Chinese hamster ovary cell line), CV1 (monkey kidney line), COS (derivative of CV1 that carries SV40T antigen), SP2 / 0 (mouse myeloma), P3x63-Ag3 .653 (mouse myeloma), and 293 (human kidney), 293T (a derivative of 293 that carries the SV40T antigen), but is not limited thereto. Host cell lines can be obtained from commercial institutions, the American Tissue Culture Collection (ATCC), or from published publication agencies.
好ましい宿主細胞系はｄｈｆｒ遺伝子の発現欠損であるＣＨＯ由来細胞株かＳＰ２／０のいずれかである。Ｕｒｌａｎｄ，Ｇ．ら、Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｇａｍｍａ ｒａｙｓ ａｔ ｔｈｅ ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｌｏｃｕｓ：ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｉｎｖｅｒｓｉｏｎｓ，Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｖｏｌ．１２，１９８６，ｐ５５５５−５６６、および、Ｓｃｈｕｌｍａｎ，Ｍ．ら、Ａ ｂｅｔｔｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｆｏｒ ｍａｋｉｎｇ ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｖｏｌ．２７６，１９７８，ｐ２６９−２７０をそれぞれ参照のこと。最も好ましくは、宿主細胞系はＤＨＦＲ欠失ＣＨＯである。宿主細胞中へのプラスミドのトランスフェクションは、任意の技術を使って行うことができる。具体的な方法としては、トランスフェクション（リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ法、リポフェクション、およびエレクトロポレーションを含む）、センダイウイルス等のエンベロープを利用してＤＮＡを導入する方法、マイクロインジェクション、およびレトロウイルスウイルスやアデノウイルス等のウイルスベクターを用いた感染が挙げられるがそれらに限定されない。Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ ９ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｉｎｔｏ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．を参照のこと。最も好ましいのは、エレクトロポレーションによる宿主中へのプラスミド導入である。 Preferred host cell lines are either CHO-derived cell lines that are deficient in the expression of the dhfr gene or SP2 / 0. Urban, G.M. Et al., Effect of gamma rays at the dihydroformate reduce locus: selections and inversions, Somat. Cell. Mol. Genet. Vol. 12, 1986, p5555-566, and Schulman, M .; Et al., A better cell line for making hybridomas secreting specific antibodies, Nature Vol. 276, 1978, p269-270, respectively. Most preferably, the host cell line is DHFR deficient CHO. Transfection of the plasmid into the host cell can be performed using any technique. Specific methods include transfection (including calcium phosphate method, DEAE method, lipofection, and electroporation), a method of introducing DNA using an envelope such as Sendai virus, microinjection, retrovirus virus, adeno Examples include, but are not limited to, infection using virus vectors such as viruses. Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 9 Introduction of DNA into Mammalian Cells, John Wiley and Sons, Inc. checking ... Most preferred is the introduction of the plasmid into the host by electroporation.
本発明の抗カドヘリン１７抗体の改変体、例えばキメラ抗体、ヒト化抗体、ｓｃＦｖ、ダイボディ、ミニボディ等の改変体もそれ自体公知の手段により製造することができる。 Modifications of the anti-cadherin 17 antibody of the present invention, such as chimeric antibodies, humanized antibodies, scFvs, dibodies, minibodies, etc., can also be produced by means known per se.
本発明の抗カドヘリン１７抗体又はその改変体は、前述のように胃がん組織に特異的に結合し、かつ胃がん組織集積性が高いので、胃がん診断薬及び胃がん治療薬として有用である。胃がん診断薬とする場合には、放射性金属標識抗カドヘリン１７抗体又はその改変体を用いる体外イメージング剤とするのが好ましい。また、胃がん治療薬とする場合は、放射性金属標識抗カドヘリン１７抗体又はその改変体を用いるのが好ましい。 The anti-cadherin 17 antibody of the present invention or a variant thereof specifically binds to gastric cancer tissue as described above, and has high gastric cancer tissue accumulation, and thus is useful as a gastric cancer diagnostic agent and a gastric cancer therapeutic agent. When it is used as a diagnostic agent for gastric cancer, it is preferable to use an in vitro imaging agent using a radioactive metal-labeled anti-cadherin 17 antibody or a modified form thereof. In addition, when a gastric cancer therapeutic agent is used, it is preferable to use a radioactive metal-labeled anti-cadherin 17 antibody or a modified form thereof.
放射性金属標識抗カドヘリン１７抗体又はその改変体としては、放射性金属元素が金属キレート試薬を介して前記抗カドヘリン１７抗体又はその改変体に結合してなるものが好ましい。 As the radioactive metal-labeled anti-cadherin 17 antibody or a modified form thereof, a substance obtained by binding a radioactive metal element to the anti-cadherin 17 antibody or a modified form thereof via a metal chelating reagent is preferable.
前記抗カドヘリン１７抗体と結合させる放射性金属としては、癌治療薬として用いる場合には細胞傷害性放射性金属が好ましく、癌診断薬として用いる場合には細胞非傷害性放射性金属であるのが好ましい。
このような細胞傷害性放射性金属としては、例えばイットリウム９０（90Ｙ）、レニウム１８６（186Ｒｅ）、レニウム１８８（188Ｒｅ）、銅６７（67Ｃｕ）、鉄５９（59Ｆｅ）、ストロンチウム８９（89Ｓｒ）、金１９８（198Ａｕ）、水銀２０３（203Ｈｇ）、鉛２１２（212Ｐｂ）、ジスプロシウム１６５（165Ｄｙ）、ルテニウム１０３（103Ｒｕ）、ビスマス２１２（212Ｂｉ）、ビスマス２１３（213Ｂｉ）、ホルミウム１６６（166Ｈｏ）、サマリウム１５３（153Ｓｍ）、ルテチウム１７７（177Ｌｕ）などを挙げることができる。
これらの放射性金属の中でも、90Ｙ、153Ｓｍ、177Ｌｕが、半減期、放射線エネルギー、容易な標識反応、標識率、錯体の安定性等の点から好ましい。
The radioactive metal to be bound to the anti-cadherin 17 antibody is preferably a cytotoxic radioactive metal when used as a cancer therapeutic agent, and is preferably a non-cytotoxic radioactive metal when used as a cancer diagnostic agent.
Examples of such cytotoxic radioactive metals include yttrium 90 ( 90 Y), rhenium 186 ( 186 Re), rhenium 188 ( 188 Re), copper 67 ( 67 Cu), iron 59 ( 59 Fe), and strontium 89 ( 89 Sr), gold 198 ( 198 Au), mercury 203 ( 203 Hg), lead 212 ( 212 Pb), dysprosium 165 ( 165 Dy), ruthenium 103 ( 103 Ru), bismuth 212 ( 212 Bi), bismuth 213 ( 213 ) Bi), holmium 166 ( 166 Ho), samarium 153 ( 153 Sm), lutetium 177 ( 177 Lu), and the like.
Among these radioactive metals, 90 Y, 153 Sm, and 177 Lu are preferable from the viewpoints of half-life, radiation energy, easy labeling reaction, labeling rate, and complex stability.
一方、診断薬に用いる細胞非傷害性放射性金属としては、テクネシウム９９ｍ（99mＴｃ）、インジウム１１１（111Ｉｎ）、インジウム１１３ｍ（113mＩｎ）、ガリウム６７（67Ｇａ）、ガリウム６８（68Ｇａ）、タリウム２０１（201Ｔｌ）、クロム５１（51Ｃｒ）、コバルト５７（57Ｃｏ）、コバルト５８（58Ｃｏ）、コバルト６０（60Ｃｏ）、ストロンチウム８５（85Ｓｒ）、水銀１９７（197Ｈｇ）、銅６４（64Ｃｕ）が好適に用いられる。 On the other hand, non-cytotoxic radioactive metals used for diagnostic agents include technesium 99m ( 99m Tc), indium 111 ( 111 In), indium 113m ( 113m In), gallium 67 ( 67 Ga), gallium 68 ( 68 Ga), Thallium 201 ( 201 Tl), chromium 51 ( 51 Cr), cobalt 57 ( 57 Co), cobalt 58 ( 58 Co), cobalt 60 ( 60 Co), strontium 85 ( 85 Sr), mercury 197 ( 197 Hg), copper 64 ( 64 Cu) is preferably used.
これらの放射性金属元素を抗カドヘリン１７抗体に結合させるには、該抗体に金属キレート試薬を反応させ、これに放射性金属元素を反応させて錯体とするのが好ましい。このようにして得られた修飾抗体は、放射性金属元素が金属キレート試薬を介して抗カドヘリン抗体に結合している。 In order to bind these radioactive metal elements to the anti-cadherin 17 antibody, it is preferable to react the metal chelate reagent with the antibody and react with the radioactive metal element to form a complex. In the modified antibody thus obtained, a radioactive metal element is bound to an anti-cadherin antibody via a metal chelating reagent.
このような錯体形成に用いられる金属キレート試薬の例としては、例えば（１）８−ヒドロキシキノリン、８−アセトキシキノリン、８−ヒドロキシキナルジン、硫酸オキシキノリン、Ｏ−アセチルオキシン、Ｏ−ベンゾイルオキシン、Ｏ−ｐ−ニトロベンゾイルオキシン、キノリン骨格を有するキノロン系化合物であるノルフロキサシン、オフロキサシン、エノキサシン、シプロフロキサシン、ロメフロキサシン、トスフロキサシン、フレロキサシン、スパルフロキサシン等のキノリン誘導体；（２）クロラニル酸、アルミノン、チオ尿素、ピロガロール、クペロン、ビスムチオール（ＩＩ）、ガロイル没食子酸、チオリド、２−メルカプトベンゾチアゾール、テトラフェニルアルソニウムクロライド等の化合物；（３）エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）およびこれらに類似した骨格を有するジヒドロキシエチルグリシン、ジアミノプロパノール四酢酸、エチレンジアミン二酢酸、エチレンジアミン二プロピオン酸塩酸塩、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸、エチレンジアミンテトラキス（メチレンホスホン酸）、グリコールエーテルジアミン四酢酸、ヘキサメチレンジアミン四酢酸、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸、イミノ二酢酸、ジアミノプロパン四酢酸、ニトリロ三酢酸、ニトリロ三プロピオン酸、ニトリロトリス（メチレンスルホン酸）三ナトリウム塩、トリエチレンテトラミン六酢酸、メチルＤＴＰＡ、シクロヘキシルＤＴＰＡ、アミノベンジルＥＤＴＡ、イソチオシアノベンジルＥＤＴＡ、イソチオシアノベンジルＤＴＰＡ、メチルイソチオシアノベンジルＤＴＰＡ、シクロヘキシルイソチオシアノベンジルＤＴＰＡ、マレイミドプロピルアミドベンジルＥＤＴＡ、マレイミドペンチルアミドベンジルＥＤＴＡ、マレイミドデシルアミドベンジルＥＤＴＡ、マレイミドペンチルアミドベンジルＤＴＰＡ、マレイミドデシルアミドベンジルＥＤＴＡ、マレイミドデシルアミドベンジルＤＴＰＡ；（４）１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）、１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７−三酢酸（ＮＯＴＡ）、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−１，４，８，１１−四酢酸（ＴＥＴＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン（Ｃｙｃｌｅｎ）、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン（Ｃｙｃｌａｍ）、イソチオシアノベンジルＤＯＴＡ、イソチオシアノベンジルＮＯＴＡ等が挙げられる。 Examples of metal chelating reagents used for such complex formation include (1) 8-hydroxyquinoline, 8-acetoxyquinoline, 8-hydroxyquinaldine, oxyquinoline sulfate, O-acetyloxin, O-benzoyloxin, Op-nitrobenzoyloxins, quinoline derivatives having a quinoline skeleton such as norfloxacin, ofloxacin, enoxacin, ciprofloxacin, lomefloxacin, tosufloxacin, fleroxacin, sparfloxacin and the like; (2) chloranilic acid, aluminone , Thiourea, pyrogallol, cuperone, bismuthiol (II), galloyl gallic acid, thiolide, 2-mercaptobenzothiazole, tetraphenylarsonium chloride, etc .; (3) ethylenediamine Acetic acid (EDTA), diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA) and dihydroxyethylglycine, diaminopropanoltetraacetic acid, ethylenediaminediacetic acid, ethylenediaminedipropionate hydrochloride, hydroxyethylethylenediaminetriacetic acid, ethylenediaminetetrakis (methylenephosphone) Acid), glycol etherdiaminetetraacetic acid, hexamethylenediaminetetraacetic acid, hydroxyethyliminodiacetic acid, iminodiacetic acid, diaminopropanetetraacetic acid, nitrilotriacetic acid, nitrilotripropionic acid, nitrilotris (methylenesulfonic acid) trisodium salt, Triethylenetetramine hexaacetic acid, methyl DTPA, cyclohexyl DTPA, aminobenzyl EDTA, isothiocyanobenzyl EDTA, isothiocyanobe Gilt DTPA, methylisothiocyanobenzyl DTPA, cyclohexylisothiocyanobenzyl DTPA, maleimide propylamide benzyl EDTA, maleimide pentylamide benzyl EDTA, maleimide decylamide benzyl EDTA, maleimide pentylamide benzyl DTPA, maleimide decylamide benzyl EDTA, maleimide decylamide (4) 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (DOTA), 1,4,7-triazacyclononane-1,4,7- Triacetic acid (NOTA), 1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane-1,4,8,11-tetraacetic acid (TETA), 1,4,7,10-tetraazacyclododecane (Cycle), 1 , 4,8,11-teto Examples include laazacyclotetradecane (Cyclam), isothiocyanobenzyl DOTA, and isothiocyanobenzyl NOTA.
抗カドヘリン１７抗体への放射性金属元素の結合は、常法に従って行うことができる。例えば抗カドヘリン１７抗体に金属キレート試薬を反応させ、予め標識前駆体を調製しておき、次いで放射性金属元素を反応させることにより行うことができる。 The binding of the radioactive metal element to the anti-cadherin 17 antibody can be performed according to a conventional method. For example, it can be carried out by reacting an anti-cadherin 17 antibody with a metal chelate reagent, preparing a labeling precursor in advance, and then reacting with a radioactive metal element.
例えば、抗カドヘリン１７抗体のＤＯＴＡ化は、次のようにして行なわれる。抗体を緩衝液に溶解して抗体溶液を得る。一方で、イソチオシアノベンジルＤＯＴＡを、ＤＭＳＯに溶解する。これらの抗体溶液とイソチオシアノベンジルＤＯＴＡ溶液を混合撹拌し、２５℃で１７時間程度撹拌する。反応後、脱塩カラムで精製する。 For example, DOTA conversion of the anti-cadherin 17 antibody is performed as follows. An antibody solution is obtained by dissolving the antibody in a buffer solution. On the other hand, isothiocyanobenzyl DOTA is dissolved in DMSO. These antibody solution and isothiocyanobenzyl DOTA solution are mixed and stirred, and stirred at 25 ° C. for about 17 hours. After the reaction, it is purified with a desalting column.
本発明の癌治療薬または癌診断薬は、既標識製剤として提供する方法と、標識前駆体を含有するキット製剤として提供する方法があるが、本発明ではいずれの方法でもよい。既標識製剤として提供する場合には、標識済みの抗カドヘリン１７抗体を含有する癌治療薬または癌診断薬をそのまま投与に用いることができる。キット製剤として提供する場合には、所望の放射性金属元素で標識を行ってから投与に用いることができる。 The cancer therapeutic agent or cancer diagnostic agent of the present invention includes a method of providing as a pre-labeled preparation and a method of providing as a kit preparation containing a labeled precursor, and any method may be used in the present invention. When provided as a pre-labeled preparation, a cancer therapeutic agent or cancer diagnostic agent containing a labeled anti-cadherin 17 antibody can be used for administration as it is. When provided as a kit preparation, it can be used for administration after labeling with a desired radioactive metal element.
本発明の癌治療薬は、水性溶液、好ましくはハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理的食塩緩衝液等の生理学的に適合性の緩衝液中に溶解することができる。さらに、油性または水性のベヒクル中で、懸濁液、溶液、または乳濁液等の形状をとることができる。 The cancer therapeutics of the present invention can be dissolved in an aqueous solution, preferably a physiologically compatible buffer such as Hanks's solution, Ringer's solution, or physiological saline buffer. Furthermore, it can take the form of a suspension, solution, emulsion or the like in an oily or aqueous vehicle.
本発明癌治療薬の投与量は、患者の症状、投与経路、体重、年令等によっても異なるが、例えば、成人の１回の投与量は３７〜３７００ＭＢｑであるのが好ましい。 The dose of the cancer therapeutic agent of the present invention varies depending on the patient's symptoms, administration route, weight, age, etc. For example, it is preferable that a single dose for an adult is 37 to 3700 MBq.
本発明の癌治療薬は、通常非経口投与経路で、例えば注射剤（皮下注、静注、筋注、腹腔内注など）、経皮、経粘膜、経鼻、経肺などで投与される。 The cancer therapeutic agent of the present invention is usually administered by parenteral administration route, for example, injection (subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, etc.), transdermal, transmucosal, nasal, transpulmonary, etc. .
本発明の癌診断薬は、胃がんのイメージングに使用することができる。本発明の診断薬は胃がんに集積し、シングルフォトン断層撮像装置（ＳＰＥＣＴ）、ポジトロン断層撮像装置（ＰＥＴ）、シンチカメラ等の機器を用いて放射線を検出することにより胃がん部位を撮像することができる。 The cancer diagnostic agent of the present invention can be used for gastric cancer imaging. The diagnostic agent of the present invention accumulates in gastric cancer, and can detect a gastric cancer site by detecting radiation using a device such as a single photon tomography (SPECT), positron tomography (PET), or scintillation camera. .
投与経路は、通常は静脈から血管内に投与されるが動脈を介して投与することもできる。投与量は患者の症状、投与経路、体重、年令等によっても異なるが、例えば、成人の１回の投与量は３７〜１１２０ＭＢｑであるのが好ましい。 The route of administration is usually administered intravenously into a blood vessel, but can also be administered via an artery. The dose varies depending on the patient's symptoms, administration route, body weight, age, etc. For example, the dose for an adult is preferably 37 to 1120 MBq.
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに何ら限定されるものではない。 EXAMPLES Next, although an Example is given and this invention is demonstrated further in detail, this invention is not limited to this at all.
実施例１（完全長ヒトカドヘリン１７（以下ＣＤＨ１７）発現バキュロウイルス（以下ＣＤＨ１７ ＢＶ）の調製）
ヒトＣＤＨ１７の完全長配列（アミノ酸Ｎｏ．１〜８３２）をコードするｃＤＮＡは、ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ００１１４４６６３の塩基配列を用いて化学合成した（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）。化学合成を行なう際に、ヒトＣＤＨ１７の塩基配列についてはｓｆ９のコドンｕｓａｇｅに一部改変し、Ｎ末端にＦＬＡＧタグ、Ｃ末端にＭｙｃタグをコードする配列を付加して合成した（配列番号２１）。このｃＤＮＡをｐＦａｓｔＢａｃ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に組み込み、ｐＦａｓｔＢａｃ１−ＦＬＡＧ−ＣＤＨ１７−Ｍｙｃベクターを作製した。次に説明書（Ｂａｃ−Ｔｏ−Ｂａｃ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）に従い、ｐＦａｓｔＢａｃ１−ＦＬＡＧ−ＣＤＨ１７−ＭｙｃベクターをＤＨ１０Ｂａｃコンピテントセルにトランスフォーメーションして、組換えバクミドＤＮＡを作製した。このバクミドＤＮＡをＳｆ９細胞にトランスフェクションして、組換えバキュロウイルスを作成した。
ＣＤＨ１７遺伝子が導入された組換え発芽型バキュロウイルスの調製は、次のとおり行った。Ｓｆ９細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を２×１０6／ｍＬの細胞密度で５００ｍＬ培養し、上記で作製した組換えウイルスをＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｃｔｉｏｎ）＝５で感染させ、７２時間後に培養上清画分を４０，０００×ｇ、４０分遠心して、沈澱画分に発芽型ウイルス（ＣＤＨ１７ ＢＶ）を回収した。ＣＤＨ１７ ＢＶ におけるＣＤＨ１７蛋白質の発現は、抗ｃ−Ｍｙｃ抗体（９Ｅ１０）Ｓａｎｔａｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いて下記の記述に従ってウエスタンブロットで確認した。このＣＤＨ１７ ＢＶを免疫原として使用した。
ウエスタンブロットは下記の方法で行なった。ＣＤＨ１７ ＢＶを総蛋白量で１μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで調製し、３％ＳＤＳと３％ ２ＭＥを含むＳＤＳ−ポリアクリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）用サンプル緩衝液で２倍希釈し、１０％分離ゲルに１０μＬ／ｌａｎｅアプライしてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。その後、ニトロセルロース膜（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）へ転写し、転写膜への非特異結合をブロックエース（大日本ファーマ社製）でブロッキングした後、４０％ブロックエース／Ｔｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（以下ＴＢＳ）で１μｇ／ｍＬに調製した抗Ｍｙｃ（９Ｅ１０）モノクローナル抗体を１次抗体として１．５ｍＬ加え、室温で１時間振とう反応させた。ＴＢＳ−Ｔ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を添加した１０ｍＭ ＴＢＳ）で５分間３回洗浄後、２次抗体としてｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（以下ＨＲＰ）標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を１０％ブロックエース／ＴＢＳで１００００倍希釈したものを１．５ｍＬ添加し、室温で１時間振とう反応させた。ＴＢＳ−Ｔで５分間３回洗浄後、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｄｕｒａｔｉｏｎ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ社製） を用いて検出した。
Example 1 (Preparation of full-length human cadherin 17 (hereinafter CDH17) expression baculovirus (CDH17 BV))
The cDNA encoding the full-length sequence of human CDH17 (amino acids No. 1 to 832) is an accession no. Chemical synthesis was performed using the base sequence of NM001144663 (GenScript). During chemical synthesis, the base sequence of human CDH17 was partially modified to the codon usage of sf9 and synthesized by adding a sequence encoding a FLAG tag at the N-terminus and a Myc tag at the C-terminus (SEQ ID NO: 21). . This cDNA was incorporated into pFastBac1 (manufactured by Invitrogen Life Technologies) to prepare a pFastBac1-FLAG-CDH17-Myc vector. Next, according to the instructions (Bac-To-Bac Baculovirus Expression System), the pFastBac1-FLAG-CDH17-Myc vector was transformed into a DH10Bac competent cell to produce recombinant bacmid DNA. This bacmid DNA was transfected into Sf9 cells to produce a recombinant baculovirus.
Preparation of recombinant germinated baculovirus into which the CDH17 gene was introduced was performed as follows. Sf9 cells (manufactured by Invitrogen Life Technologies) were cultured at 500 mL at a cell density of 2 × 10 6 / mL, and the recombinant virus prepared above was infected with MOI (multiplicity of infection) = 5, and the culture supernatant was 72 hours later. The fraction was centrifuged at 40,000 × g for 40 minutes, and germinating virus (CDH17 BV) was recovered in the precipitated fraction. The expression of CDH17 protein in CDH17 BV was confirmed by Western blot according to the following description using an anti-c-Myc antibody (9E10) manufactured by Santacruz Biotechnology). This CDH17 BV was used as an immunogen.
Western blotting was performed by the following method. CDH17 BV was prepared with PBS so that the total amount of protein was 1 μg / mL, diluted twice with a sample buffer for SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) containing 3% SDS and 3% 2ME, and 10 % Separation gel was applied with 10 μL / lane and separated by SDS-PAGE. Then, after transferring to a nitrocellulose membrane (GE Healthcare) and blocking non-specific binding to the transfer membrane with Block Ace (Dainippon Pharma), 40% Block Ace / Tris buffered saline (hereinafter TBS) 1.5 mL of anti-Myc (9E10) monoclonal antibody prepared to 1 μg / mL was added as a primary antibody, and the mixture was shaken at room temperature for 1 hour. After washing with TBS-T (10 mM TBS supplemented with 0.05% Tween20) for 5 minutes three times, a horseradish peroxidase (hereinafter HRP) -labeled goat anti-mouse IgG (H + L) antibody (Jackson ImmunoResearch Laboratories) was used as the secondary antibody. 1.5 mL of 10% Block Ace / TBS diluted 10000-fold was added and shaken at room temperature for 1 hour. After washing 3 times with TBS-T for 5 minutes, detection was performed using SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate (manufactured by Thermo).
実施例２（抗ＣＤＨ１７マウスモノクローナル抗体の作製）
ＣＤＨ１７ ＢＶ ７０μｇにアジュバントとして０．１μｇの百日咳毒素（フナコシ社製）を混合し、ｇｐ６４トランスジェニックマウス（自家調製，Ｓａｉｔｏｈ Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄ，３２２，１０４−１１７，２００７）の腹腔内に投与、免疫した。追加免疫はアジュバントを含まない７０μｇのＣＤＨ１７ＢＶを２週間間隔で１回または２回投与した。最終免疫から３日後に脾細胞を採取し、ポリエチレングリコール（ロッシュ社製）を用いた標準的な方法（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７，１９７５）に従いマウスミエローマ細胞ＮＳ−１（大日本ファーマ社製）と細胞融合した。融合細胞はＨＡＴ選択培地（０．１ｍＭ ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ，０．１ｍＭ ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎｅ，ａｎｄ ０．１６ｍＭ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）で７日間培養した。細胞融合から８日後、ハイブリドーマの培養上清を回収し、ヒト由来の癌細胞株を９６ ウェルプレートに固相化したｃｅｌｌ ＥＬＩＳＡ法によってスクリーニングを行なった。
Ｃｅｌｌ ＥＬＩＳＡは下記（Ａ−１）の記述に従って行なった。癌細胞株は、ＣＤＨ１７蛋白質を発現している株としてＨｕｈ６（肝臓癌）およびＡＧＳ（胃癌）、ＣＤＨ１７を発現していない株としてＨｅｐＧ２（肝臓癌）およびＭＫＮ７４（胃癌）を用いた。各細胞株は、ＬＳＢＭデータベース（図１）を参照してＣＤＨ１７のｍＲＮＡの発現が陽性および陰性のものを選抜し、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）より購入した。ＣＤＨ１７蛋白質の発現は、市販の抗ヒトＣＤＨ１７モノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ社製）を用い後記段落（００５３）に従ってフローサイトメトリーで確認した。Ｃｅｌｌ ＥＬＩＳＡにより、ＣＤＨ１７を発現している細胞株に対して陽性、発現していない細胞株に対して陰性のウェルを選別した。計１７５９ウェルのハイブリドーマに対して、１１４の抗体産生陽性ウェルが選別された。
陽性１１４ウェルのうち３２ウェルについてコロニーピッキングを行なった。陽性のコロニーをピッキングすることに成功した２５ウェルについて、限界希釈法でクローニングを行い、２５クローンの抗ＣＤＨ１７抗体産生ハイブリドーマを樹立した。
ハイブリドーマ細胞をＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（日本クレア社製）に接種し腹水を調製し、５０％硫酸アンモニウム塩析精製を２回行ない、１５０ｍＭ ＮａＣｌに透析して抗体蛋白質を調製した。イメージング実験には、さらにＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ＨＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて精製を加えたものを使用した。
Example 2 (Preparation of anti-CDH17 mouse monoclonal antibody)
CDH17 BV 70 μg was mixed with 0.1 μg of pertussis toxin (Funakoshi) as an adjuvant, and gp64 transgenic mice (self-prepared, Saitoh R. et al. J. Immunol. Method, 322, 104-117, 2007) It was administered and immunized intraperitoneally. For booster immunization, 70 μg of CDH17BV without adjuvant was administered once or twice at 2-week intervals. Three days after the final immunization, spleen cells were collected and mouse myeloma cells NS-1 (Dainippon Pharma Co., Ltd.) according to a standard method (Nature, 256, 495-497, 1975) using polyethylene glycol (Roche). ) And cell fusion. The fused cells were cultured in a HAT selective medium (0.1 mM hypoxanthine, 0.1 mM aminopterine, and 0.16 mM thymidine) for 7 days. Eight days after cell fusion, the culture supernatant of the hybridoma was collected, and screening was performed by a cell ELISA method in which a human-derived cancer cell line was immobilized on a 96-well plate.
Cell ELISA was performed according to the description of the following (A-1). As cancer cell lines, Huh6 (liver cancer) and AGS (gastric cancer) were used as strains expressing CDH17 protein, and HepG2 (liver cancer) and MKN74 (gastric cancer) were used as strains not expressing CDH17. Each cell line was selected from those with positive and negative expression of CDH17 mRNA with reference to the LSBM database (FIG. 1), and purchased from ATCC (American Type Culture Collection). The expression of the CDH17 protein was confirmed by flow cytometry using a commercially available anti-human CDH17 monoclonal antibody (manufactured by R & D System) according to paragraph (0053) below. Cell ELISA was used to select positive wells for cell lines expressing CDH17 and negative wells for non-expressing cell lines. 114 antibody-producing positive wells were selected from a total of 1759 wells.
Colony picking was performed on 32 of the 114 positive wells. 25 wells that succeeded in picking positive colonies were cloned by limiting dilution to establish 25 clones of anti-CDH17 antibody-producing hybridomas.
Hybridoma cells were inoculated into BALB / c nude mice (manufactured by Claire Japan), ascites was prepared, 50% ammonium sulfate salting-out purification was performed twice, and dialyzed against 150 mM NaCl to prepare antibody protein. In the imaging experiment, a product further purified using HiTrap Protein G HP (manufactured by GE Healthcare) was used.
（Ａ−１）マウスｗｈｏｌｅ抗体のｂｉｎｄｉｎｇ ＥＬＩＳＡ
ヒト癌細胞株Ｈｕｈ６およびＨｅｐＧ２をＲＰＭＩ１６４０ １０％ ＦＢＳ添加培地で、ＡＧＳおよびＭＫＮ７４をＤＭＥＭ １０％ ＦＢＳ添加培地でそれぞれ培養し、ｐｏｌｙ−Ｄ−ｌｙｓｉｎｅコート９６穴プレート（ＢＩＯＣＯＡＴ ｐｏｌｙ−Ｄ−ｌｙｓｉｎｅ ｃｏａｔｅｄ ｐｌａｔｅ；Ｆａｌｃｏｎ ３５６４６１）に０．３×１０5ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、３７℃で１６〜２４時間培養した。培養上清を捨て、生理的食塩水を２５０μＬ／ｗｅｌｌ加えて細胞を１回洗浄後、固定液（４％パラホルムアルデヒド／Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（以下ＰＢＳ））を５０μＬ加え、室温で１０分間静置して固定化した。固定液を捨て、生理的食塩水を２５０μＬ／ｗｅｌｌ加えて細胞を３回洗浄後、４０％ブロックエース（大日本ファーマ社製）／ＴＢＳを１００μＬ／ｗｅｌｌ加えて室温で１時間静置し、ブロッキングを行なった。洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を添加した生理的食塩水）を２５０μＬ／ｗｅｌｌ添加して細胞を３回洗浄後、１次抗体として抗ＣＤＨ１７抗体溶液（またはハイブリドーマ培養上清）を４０％ブロックエース／ＴＢＳで適宜希釈調製したものを５０μＬずつに添加し、室温で１時間振とう反応を行なった。洗浄液を２５０μＬ／ｗｅｌｌ添加して細胞を３回洗浄後、２次抗体としてＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を１０％ブロックエース／ＴＢＳで１０００倍希釈したものを５０μＬ／ｗｅｌｌ加え、室温で１時間振とう反応を行なった。洗浄液を２５０μＬ／ｗｅｌｌ添加して細胞を４回洗浄後、生理的食塩水（Ｔｗｅｅｎ２０無添加）で１回洗浄した。基質液（ＴＭＢ Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｒｅａｇｅｎｔ；ＳｃｙＴｅｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、室温暗所で３０分静置して呈色反応を行なった後、反応停止液（ＳｃｙＴｅｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、よく撹拌後マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｒａｋ ＩＩ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）により４５０ｎｍの吸光度（以下Ａ４５０）を測定した。
(A-1) Binding ELISA for mouse whole antibody
Human cancer cell lines Huh6 and HepG2 were cultured in RPMI1640 10% FBS-added medium, AGS and MKN74 were cultured in DMEM 10% FBS-added medium, respectively, and poly-D-lysine-coated 96-well plate (BIOCOAT poly-D-lysine coated plate; Falcon 356461) was seeded at 0.3 × 10 5 cells / well and cultured at 37 ° C. for 16 to 24 hours. After discarding the culture supernatant, adding 250 μL / well of physiological saline to wash the cells once, adding 50 μL of a fixative (4% paraformaldehyde / phosphate buffered saline (hereinafter PBS)), and allowing to stand at room temperature for 10 minutes. And fixed. Discard the fixative, add 250 μL / well of physiological saline, wash the cells 3 times, add 100 μL / well of 40% Block Ace (manufactured by Dainippon Pharma) / TBS, and let stand at room temperature for 1 hour, blocking. Was done. After washing the cells three times by adding 250 μL / well of a washing solution (physiological saline supplemented with 0.05% Tween 20), an anti-CDH17 antibody solution (or hybridoma culture supernatant) was used as a primary antibody in 40% Block Ace / 50 μL each of which was appropriately diluted with TBS was added and shaken at room temperature for 1 hour. After washing the cells three times by adding 250 μL / well of washing solution, HRP-labeled goat anti-mouse IgG F (ab ′) 2 (Jackson ImmunoResearch Laboratories) as a secondary antibody was diluted 1000 times with 10% Block Ace / TBS. 50 μL / well was added, and the reaction was shaken at room temperature for 1 hour. The washing solution was added at 250 μL / well to wash the cells 4 times, and then washed once with physiological saline (without Tween 20 added). A substrate solution (TMB Soluble Reagent; manufactured by ScyTek Laboratories) was added at 50 μL / well, allowed to stand for 30 minutes in a dark place at room temperature, and then a color reaction was performed. Then, a reaction stop solution (produced by ScyTek Laboratories) was added at 50 μL / well After adding and stirring well, the absorbance at 450 nm (hereinafter referred to as A450) was measured with a microplate reader (Biotrak II, manufactured by GE Healthcare).
実施例３（ＣＤＲの解析）
ハイブリドーマ細胞ペレットを氷上で融解後，ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてｍＲＮＡを抽出した。κ鎖配列を解析する際には、ミエローマ細胞由来のｐｓｅｕｄｏｇｅｎｅにハイブリダイズする短鎖配列とのインキュベーション、ＲＮａｓｅＨによる処理を行い、さらにＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔにより精製した。続いて、ＦｉｒｓｔＣｈｏｉｃｅ（登録商標）ＲＬＭ Ｒａｃｅ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）によって可変部領域をコードするｃＤＮＡを取得した。取得したｃＤＮＡはｐＧＥＭ（登録商標）−ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によりモノクローナルとし、シークエンサーによる配列解析を行った。その結果、各クローンのＣＤＲは次表のアミノ酸配列を有することが判明した。
Example 3 (Analysis of CDR)
After the hybridoma cell pellet was thawed on ice, mRNA was extracted using RNeasy Mini Kit (Qiagen). When analyzing the kappa chain sequence, it was incubated with a short chain sequence that hybridizes to pseudogene derived from myeloma cells, treated with RNase H, and further purified with RNeasy Mini Kit. Subsequently, cDNA encoding the variable region was obtained by FirstChoice (registered trademark) RLM Race Kit (Ambion). The obtained cDNA was made monoclonal by pGEM (registered trademark) -t Easy Vector System (Promega), and sequence analysis was performed with a sequencer. As a result, it was found that the CDR of each clone had the amino acid sequence shown in the following table.
実施例４（ｓｃＦｖの作製）
可変領域をコードする遺伝子から、ＶＨ−（ＧＧＧＧＳ）３−ＶＬとなるように遺伝子を作製し、さらにこれをｐＧＥＭ−２由来のベクターに載せ替え、Ｃ末端にＨｉｓ−ｔａｇが付加された遺伝子とした。また、Ｎ末端には、ｐｅｌ−Ｂリーダー配列が付加される場合もある。このベクターをＢＬ２１（ＤＥ３）等の適切な大腸菌株へ形質転換し、培養し、イソプロピル−β−チオガラクトピラノシドによる誘導後、培地上清もしくは大腸菌体に発現しているｓｃＦｖを精製した。
（１）Ｄ２１１１−ｓｃＦｖの作製
ｐｅｌ−Ｂリーダー配列を付加したベクターを用い、上記のプロトコルに従ってＢＬ２１（ＤＥ３）による発現後、大腸菌内に生成される封入体を超音波破砕、遠心分離し、さらに２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、アセトン、超純水で洗浄した。これを既報の手法（Ｔｓｕｍｏｔｏ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，（１９９８））により巻き戻し、ＨｉＬｏａｄ ２６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ｐｒｅｐ ｇｒａｄｅ（ＧＥヘルスケア）によるゲルろ過クロマトグラフィーによって単量体として取得した。
（２）Ｄ２１０１−ｓｃＦｖの作製
ｐｅｌ−Ｂリーダー配列を付加したベクターを用い、さらに発現量向上のためのアミノ酸変換を行ったものに関して、（１）と同様の手法により取得した。Ｄ２１０１の軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列は、ＬＳ２２Ｒ変異体が安定発現した。
（３）Ｄ２１０７−ｓｃＦｖの作製
ｐｅｌ−Ｂリーダー配列を有しないベクターを用い、さらに発現量向上のためのアミノ酸変換を行ったものに関して、上記のプロトコルにしたがってＢＬ２１（ＤＥ３）による発現後、大腸菌体を超音波破砕し、取得される可溶性画分を金属イオンアフィニティークロマトグラフィーにより精製後、ＨｉＬｏａｄ ２６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ｐｒｅｐ ｇｒａｄｅ（ＧＥヘルスケア）によるゲルろ過クロマトグラフィーによって単量体として取得した。Ｄ２１０７の重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列はＨＣ２２Ａ変異体が、軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列はＬＳ２２Ｔ変異体が安定発現した。
Example 4 (Production of scFv)
From the gene encoding the variable region, a gene was prepared so as to be VH- (GGGGGS) 3-VL, and this was replaced with a vector derived from pGEM-2, and a gene with His-tag added to the C-terminus did. In addition, a pel-B leader sequence may be added to the N-terminus. This vector was transformed into an appropriate Escherichia coli strain such as BL21 (DE3), cultured, and after induction with isopropyl-β-thiogalactopyranoside, scFv expressed in the culture supernatant or Escherichia coli was purified.
(1) Preparation of D2111-scFv Using a vector to which a pel-B leader sequence has been added, inclusion bodies produced in E. coli after ultrasonic expression according to the above protocol are subjected to ultrasonic disruption and centrifugation. Washed with 2% Triton-X100, acetone, and ultrapure water. This was unwound by a previously reported method (Tsumoto, K. et al., J. Immunol. Methods, (1998)), and the monomer was subjected to gel filtration chromatography using HiLoad 26/600 Superdex 75 prep grade (GE Healthcare). Acquired as.
(2) Production of D2101-scFv A vector to which a pel-B leader sequence was added and further subjected to amino acid conversion for improving the expression level were obtained by the same method as in (1). The LS22R mutant was stably expressed in the amino acid sequence of the light chain CDR of D2101.
(3) Preparation of D2107-scFv A vector that does not have a pel-B leader sequence and that has been subjected to amino acid conversion for further improvement in expression level, is expressed in Escherichia coli after expression by BL21 (DE3) according to the above protocol. Was purified by metal ion affinity chromatography and then obtained as a monomer by gel filtration chromatography using HiLoad 26/600 Superdex 75 prep grade (GE Healthcare). The amino acid sequence of the heavy chain CDR of D2107 was stably expressed by the HC22A mutant, and the amino acid sequence of the light chain CDR was stably expressed by the LS22T mutant.
実施例５（反応特異性の評価）
新規に取得した抗ＣＤＨ１７モノクローナル抗体について、反応特異性をヒト由来の癌細胞株を用いてフローサイトメトリーで評価した。フローサイトメトリーは下記に記述の方法に従って行なった。癌細胞株は、ＣＤＨ１７蛋白質を発現している株としてＨｕｈ６（肝臓癌）およびＡＧＳ（胃癌）、ＣＤＨ１７を発現していない株としてＨｅｐＧ２（肝臓癌）およびＭＫＮ７４（胃癌）を用いた。抗ヒトＣＤＨ１７モノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ社製）および抗ヒトＣａｄｈｅｒｉｎ１（以下ＣＤＨ１）モノクローナル抗体（ＬｉｆｅＳｐａｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ社製）についても同様にフローサイトメトリーで評価し、新規に取得した抗体と比較した。
Example 5 (Evaluation of reaction specificity)
The reaction specificity of the newly obtained anti-CDH17 monoclonal antibody was evaluated by flow cytometry using a human-derived cancer cell line. Flow cytometry was performed according to the method described below. As cancer cell lines, Huh6 (liver cancer) and AGS (gastric cancer) were used as strains expressing CDH17 protein, and HepG2 (liver cancer) and MKN74 (gastric cancer) were used as strains not expressing CDH17. Anti-human CDH17 monoclonal antibody (manufactured by R & D System) and anti-human cadherin1 (hereinafter CDH1) monoclonal antibody (manufactured by LifeSpan BioScience) were similarly evaluated by flow cytometry and compared with newly obtained antibodies.
結果を図２に示した。新規の抗ＣＤＨ１７抗体（Ｄ２１０１、Ｄ２１１１、Ｄ２００５、Ｄ２００８、Ｄ２１０５、Ｄ２１０６、Ｄ２１０７、Ｄ２１１４、Ｄ２０２５及びＤ２１６２）については、いずれも、Ｈｕｈ６およびＡＧＳに対しては良好なピークシフトが観られたが、ＨｅｐＧ２およびＭＫＮ７４に対してはピークシフトは全く観られず、ＣＤＨ１７に対して特異性高く反応することが確認された。一方、市販の抗ＣＤＨ１７抗体については、Ｈｕｈ６およびＡＧＳに対しては新規抗体と同等に良好なシフトが観られたが、ＣＤＨ１７蛋白質の発現が陰性の細胞株ＨｅｐＧ２およびＭＫＮ７４に対しても弱いシフトが観られ、ＣＤＨ１７に対する特異性は新規抗体の方が優れていることが判った。
また新規の抗ＣＤＨ１７抗体は、胃がんの転移をイメージングで診断する目的で使用するので、正常な胃に高発現な他のカドヘリン、ＣＤＨ１には交差反応しないことを確認する必要がある。まず上記の癌細胞株においてＣＤＨ１蛋白質が発現しているかどうかを、市販の抗ＣＤＨ１抗体を用いたフローサイトメトリーにより確認したところ、Ｈｕｈ６、ＨｅｐＧ２、ＭＫＮ７４においてピークシフトが観られ、ＣＤＨ１が発現していることが確認された。特に胃がんの細胞株ＭＫＮ７４では高発現である事が判った。新規の抗ＣＤＨ１７抗体については、これらのうちＣＤＨ１７の発現が陰性のＨｅｐＧ２とＭＫＮ７４に対しては、前述のとおり全くシフトが観られなかったので、ＣＤＨ１とは交差反応しないことが確認された。
以上により、新規に取得した抗ＣＤＨ１７モノクローナル抗体は既存のモノクローナル抗体よりも特異性が優れ、イメージングによる胃がん転移の診断用抗体として適していることが証明された。
The results are shown in FIG. For the new anti-CDH17 antibodies (D2101, D2111, D2005, D2008, D2105, D2106, D2107, D2114, D2025 and D2162), a good peak shift was observed for Huh6 and AGS, but HepG2 No peak shift was observed with respect to MKN74 and it was confirmed that it reacted with high specificity to CDH17. On the other hand, as for the commercially available anti-CDH17 antibody, the same good shift was observed for Huh6 and AGS as the new antibody, but there was also a weak shift for cell lines HepG2 and MKN74 in which CDH17 protein expression was negative. It was observed that the specificity for CDH17 was superior to the new antibody.
Moreover, since the novel anti-CDH17 antibody is used for the purpose of diagnosing gastric cancer metastasis by imaging, it is necessary to confirm that it does not cross-react with other cadherins and CDH1 that are highly expressed in the normal stomach. First, whether or not CDH1 protein is expressed in the above cancer cell lines was confirmed by flow cytometry using a commercially available anti-CDH1 antibody. As a result, peak shifts were observed in Huh6, HepG2, and MKN74, and CDH1 was expressed. It was confirmed that In particular, it was found to be highly expressed in the gastric cancer cell line MKN74. As for the novel anti-CDH17 antibody, no shift was observed with respect to HepG2 and MKN74, in which CDH17 expression was negative, as described above, and thus it was confirmed that they did not cross-react with CDH1.
From the above, it was proved that the newly obtained anti-CDH17 monoclonal antibody is superior in specificity to existing monoclonal antibodies and is suitable as an antibody for diagnosis of gastric cancer metastasis by imaging.
フローサイトメトリーは下記の方法で行なった。ヒト癌細胞株（Ｈｕｈ６、ＨｅｐＧ２、ＡＧＳおよびＭＫＮ７４）の細胞２．５×１０5個に対して抗ヒトＣＤＨ１７モノクローナル抗体（本特許に記載の新たに取得した抗体）、市販の抗ヒトＣＤＨ１７モノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ社製）および抗ヒトＣａｄｈｅｒｉｎ１（以下ＣＤＨ１）モノクローナル抗体（ＬｉｆｅＳｐａｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ社製）を１次抗体として１００μＬ添加し、室温で１時間静置反応させた。１次抗体は、ＰＢＳに２％ウシ血清アルブミンを添加した緩衝液（以下１％ ＢＳＡ／ＰＢＳ）で３μｇ／ｍＬに調製して用いた。１％ ＢＳＡ／ＰＢＳで３回洗浄後、２次抗体を１００μＬ添加し、暗所で室温１時間静置反応させた。２次抗体は、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（以下ＦＩＴＣ）標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を１％ ＢＳＡ／ＰＢＳで２００倍希釈して用いた。細胞を１％ ＢＳＡ／ＰＢＳで３回洗浄後同緩衝液を２００μＬ添加し、フローサイトメーター（ＧＵＡＶＡ ＥａｓｙＣｙｔｅ（登録商標） Ｐｌｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で分析した。 Flow cytometry was performed by the following method. Anti-human CDH17 monoclonal antibody (a newly acquired antibody described in this patent), commercially available anti-human CDH17 monoclonal antibody against 2.5 × 10 5 cells of human cancer cell lines (Huh6, HepG2, AGS and MKN74) 100 μL of R & D System (manufactured by R & D System) and anti-human cadherin1 (hereinafter CDH1) monoclonal antibody (LifeSpan BioScience) were added as primary antibodies and allowed to stand at room temperature for 1 hour. The primary antibody was prepared to 3 μg / mL with a buffer solution (hereinafter, 1% BSA / PBS) in which 2% bovine serum albumin was added to PBS. After washing 3 times with 1% BSA / PBS, 100 μL of the secondary antibody was added and allowed to stand at room temperature for 1 hour in the dark. The secondary antibody used was a fluorescein-isothiocyanate (hereinafter FITC) -labeled anti-mouse IgG antibody (Jackson ImmunoResearch Laboratories) diluted 200-fold with 1% BSA / PBS. The cells were washed 3 times with 1% BSA / PBS, 200 μL of the same buffer was added, and analyzed with a flow cytometer (GUAVA EasyCyte (registered trademark) Plus System, manufactured by Millipore).
実施例６（イメージングのための抗体セレクション）
抗ＣＤＨ１７抗体は、放射性同位元素64Ｃｕで標識してイメージング実験に用いられる。64Ｃｕ標識は、まず抗体に金属キレート試薬ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸）を結合させ、次に64Ｃｕを配位させるという方法で行なわれる。ｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＯＴＡ（Ｍｉｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ社製）の−ＳＣＮ基は、抗体蛋白質を構成するアミノ酸残基のうち、リジン残基の側鎖のアミノ基とアミド結合する。抗体をＤＯＴＡ化した場合に、抗原認識にとって重要な部位にＤＯＴＡが結合すると抗原抗体反応に悪影響を及ぼす場合があるため、フローサイトメトリーの評価結果が良好であった５クローン（Ｄ２００１、Ｄ２０１３、Ｄ２１０１、Ｄ２１０３、Ｄ２１１１）についてＤＯＴＡ化を行い、ＤＯＴＡ化した場合としない場合（ｎａｋｅｄ）の抗原に体する結合活性を、ＥＬＩＳＡにて比較した。ＤＯＴＡ化は、前記の方法で行なった。ＥＬＩＳＡについては、上記（Ａ−１）の記述に従ってＡＧＳ細胞固定化プレートを調製し、抗ＣＤＨ１７抗体各種（ＤＯＴＡ化有り／無し）の希釈列を作製し１次抗体として反応させて行なった。
結果を図３に示した。いずれの抗体についてもＤＯＴＡ化有り／無しで同等の反応曲線が得られ、ＤＯＴＡ化により結合活性は影響を受けないことが確認された。以上により、５種類の抗体のうちで反応曲線の立ち上がりの最も早いＤ２１１１およびＤ２１０１をイメージング用抗体として選別した。
Example 6 (Antibody Selection for Imaging)
The anti-CDH17 antibody is labeled with a radioisotope 64 Cu and used for imaging experiments. 64 Cu labeling means that the metal chelate reagent DOTA (1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid) is first bound to the antibody, and then 64 Cu is coordinated. Done in the way. The -SCN group of p-SCN-Bn-DOTA (manufactured by Microcyclics) forms an amide bond with the amino group of the side chain of the lysine residue among the amino acid residues constituting the antibody protein. When an antibody is converted to DOTA, if DOTA binds to a site important for antigen recognition, the antigen-antibody reaction may be adversely affected. Therefore, 5 clones (D2001, D2013, D2101) with favorable flow cytometry evaluation results were obtained. , D2103 and D2111) were subjected to DOTA, and the binding activity to the antigens with and without DOTA was compared by ELISA. DOTA conversion was performed by the method described above. The ELISA was performed by preparing an AGS cell-immobilized plate according to the description in (A-1) above, preparing dilution columns of various anti-CDH17 antibodies (with / without DOTA), and reacting them as primary antibodies.
The results are shown in FIG. For all antibodies, an equivalent reaction curve was obtained with and without DOTA, and it was confirmed that the binding activity was not affected by DOTA. As described above, D2111 and D2101 having the earliest rise of the reaction curve among the five types of antibodies were selected as imaging antibodies.
実施例７（エピトープ分類）
まず初めに、新規に取得した２５種類の抗ＣＤＨ１７抗体のエピトープが、Ｄ２１１１抗体と同じであるかどうかを調べた。
上記（Ａ−１）の記載に従って調製したＡＧＳ固定化プレートに、新規に取得した抗体２５種類（Ｄ２１１１を含む）の非標識抗体を終濃度２０μｇ／ｍＬとなるように添加した。次に下記（Ａ−２）の記述に従ってビオチン標識Ｄ２１１１抗体を加え、競合法のＥＬＩＳＡを行なった。非標識抗体のエピトープがＤ２１１１（ビオチン標識）と同じかあるいは至近である場合、各々の抗体がいずれもＡＧＳ細胞表面上のＣＤＨ１７抗原の同じエピトープと反応しようとするが、非標識抗体の添加量の方が大過剰であるため、ビオチン標識Ｄ２１１１はＡＧＳ固定化プレートと反応できずＡ４５０のシグナルは出ない。一方非標識抗体のエピトープがＤ２１１１と異なる場合には、非標識抗体、ビオチン標識Ｄ２１１１抗体のいずれもＡＧＳ細胞固定化プレートと反応できるため、Ａ４５０のシグナルが出る。結果、全２５種類中１９種類がＤ２１１１と同じかあるいは至近なエピトープを認識していることが判明した。
残り６種類の抗体（Ｄ２００５、Ｄ２００８、Ｄ２１０５、Ｄ２１０６、Ｄ２１０７、Ｄ２１０８）についてそれぞれにビオチン標識抗体を調製し、Ｄ２１１１を含む合計７種類の標識抗体に、同７種類の非標識の抗体をそれぞれ終濃度２０μｇ／ｍＬで添加し、競合法のＥＬＩＳＡを行なった。ある標識抗体に対して別種の非標識抗体で競合が観られた場合には、両者は同じエピトープを認識する抗体として分類されるが、競合が観られない場合には別のエピトープを認識する抗体と分類される。
Example 7 (Epitope classification)
First, it was examined whether the epitopes of 25 types of newly obtained anti-CDH17 antibodies were the same as those of the D2111 antibody.
To the AGS-immobilized plate prepared according to the description in (A-1) above, 25 newly obtained unlabeled antibodies (including D2111) were added to a final concentration of 20 μg / mL. Next, biotin-labeled D2111 antibody was added according to the description in (A-2) below, and competitive ELISA was performed. If the epitope of the unlabeled antibody is the same as or close to that of D2111 (biotin label), each antibody will try to react with the same epitope of the CDH17 antigen on the AGS cell surface. The biotin-labeled D2111 cannot react with the AGS-immobilized plate, and no A450 signal is produced. On the other hand, when the epitope of the unlabeled antibody is different from D2111, both the unlabeled antibody and the biotin-labeled D2111 antibody can react with the AGS cell-immobilized plate, and thus an A450 signal is output. As a result, it was found that 19 out of 25 types recognize the same or close epitope as D2111.
Biotin-labeled antibodies are prepared for the remaining 6 types of antibodies (D2005, D2008, D2105, D2106, D2107, D2108), and the 7 unlabeled antibodies are terminated on a total of 7 types of labeled antibodies including D2111. It was added at a concentration of 20 μg / mL, and a competitive ELISA was performed. An antibody that recognizes another epitope when a competition is observed with another type of unlabeled antibody against a labeled antibody, but both are classified as antibodies that recognize the same epitope. Classified.
結果を図４に示した。Ｄ２１１１、Ｄ２００５、Ｄ２００８、Ｄ２０１６、Ｄ２１０７については同じ抗体同士では競合がかかるが、別種の抗体同士では競合がかからなかったので、それぞれに別のエピトープを認識している抗体であることが判った（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅの５グループ）。Ｄ２１０５、Ｄ２１０８においては相互に競合がかかったので、両者は同じエピトープを認識していることが判った。またＤ２１０５およびＤ２１０８のビオチン標識抗体に対してはＤ２１１１でも完全に競合がかかった。しかしＤ２１１１のビオチン標識抗体に対しては、Ｄ２１０５およびＤ２１０８ではある程度の競合はかかるが、完全には競合がかからなかったため、「Ｄ２１１１」と「Ｄ２１０５およびＤ２１０８」のエピトープは至近であるが完全に同じではないとして、グループＡ’と判定した。以上により、新たに取得した抗ＣＤＨ１７抗体については、合計５種類（ＡまたはＡ’、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅの５種類）の異なるエピトープを認識するグループに分類され、多様な抗体が取得できたことが判った。 The results are shown in FIG. Regarding D2111, D2005, D2008, D2016, and D2107, the same antibodies compete with each other, but different types of antibodies did not compete with each other, so it was found that each antibody recognizes a different epitope. (5 groups of A, B, C, D, E). Since D2105 and D2108 competed with each other, it was found that both recognized the same epitope. In addition, D2111 completely competed with the biotin-labeled antibodies D2105 and D2108. However, D2111 and D2108 have some competition with the D2111 biotin-labeled antibody, but they did not compete completely, so the epitopes of “D2111” and “D2105 and D2108” are close but completely Since it is not the same, it was determined as group A ′. As described above, the newly obtained anti-CDH17 antibodies are classified into groups that recognize different epitopes of a total of 5 types (A or A ′, B ′, C, D, and E), and various antibodies can be acquired. I found out.
（Ａ−２）競合法ＥＬＩＳＡ
上記（Ａ−１）の記述に従って、ＡＧＳ細胞固定化プレートを作製し、ブロッキング、洗浄を行なった。１次抗体として、まずビオチン標識されていない抗ＣＤＨ１７抗体（クローンＮｏ．Ｄ２１１１、Ｄ２００５、Ｄ２００８、Ｄ２１０５、Ｄ２１０６、Ｄ２１０７およびＤ２１０８）を、４０％ブロックエース／ＴＢＳを用いて４０μｇ／ｍＬに調製し、２５μＬ／ｗｅｌｌ加えた。次にビオチン標識された抗ＣＤＨ１７抗体（クローンＮｏ．Ｄ２１１１、Ｄ２００５、Ｄ２００８、Ｄ２１０５、Ｄ２１０６、Ｄ２１０７およびＤ２１０８）を、標識抗体毎に設定された濃度（後述）で２５μＬ／ｗｅｌｌ加えてよく撹拌し、室温で１時間振とう反応を行なった。洗浄液を２５０μＬ／ｗｅｌｌ添加して細胞を３回洗浄後、２次反応試薬としてＨＲＰ標識ストレプトアビジン（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を１０％ブロックエース／ＴＢＳで１０００倍希釈したものを５０μＬ／ｗｅｌｌ添加して室温で１時間振とう反応させた。洗浄液を２５０μＬ／ｗｅｌｌ添加して細胞を４回洗浄後、生理的食塩水（Ｔｗｅｅｎ２０無添加）で１回洗浄した。上記（Ａ−１）の記載に従って呈色反応を行い、Ａ４５０値を測定した。ビオチン標識抗体の添加濃度については各抗体毎に予め検討を行なった。すなわち、ＡＧＳ細胞固定化プレートに対してビオチン標識抗体の希釈列を反応させた後、ＨＲＰ標識ストレプトアビジンを反応させ、Ａ４５０値を測定した。ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅにおいて直線範囲のＡ４５０値を与える濃度を各抗体毎に求め、ビオチン標識抗体添加濃度として設定した。ビオチン標識は、Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を用い、使用説明書に従って調製した。
(A-2) Competition method ELISA
According to the description in (A-1) above, an AGS cell-immobilized plate was prepared, blocked and washed. First, anti-CDH17 antibody (clone No. D2111, D2005, D2008, D2105, D2106, D2107 and D2108) not labeled with biotin was prepared as a primary antibody at 40 μg / mL using 40% Block Ace / TBS, 25 μL / well was added. Next, biotin-labeled anti-CDH17 antibody (clone Nos. D2111, D2005, D2008, D2105, D2106, D2107 and D2108) was added at 25 μL / well at a concentration set for each labeled antibody (described later), and stirred well. Shaking reaction was performed at room temperature for 1 hour. After washing the cells 3 times by adding 250 μL / well of washing solution, 50 μL / well of HRP-labeled streptavidin (manufactured by GE Healthcare) diluted 1000 times with 10% Block Ace / TBS as a secondary reaction reagent was added. The reaction was shaken at room temperature for 1 hour. The washing solution was added at 250 μL / well to wash the cells 4 times, and then washed once with physiological saline (without Tween 20 added). A color reaction was performed according to the description in (A-1) above, and the A450 value was measured. The addition concentration of the biotin-labeled antibody was examined in advance for each antibody. That is, after reacting a dilution series of biotin-labeled antibody with the AGS cell-immobilized plate, HRP-labeled streptavidin was reacted, and the A450 value was measured. In the titration curve, the concentration giving an A450 value in the linear range was determined for each antibody, and set as the biotin-labeled antibody addition concentration. The biotin label was prepared using Sulfo-NHS-LC-Biotin (manufactured by Thermo) according to the instruction manual.
実施例８（ＰＥＴイメージング）
Ａ．材料と方法
抗ＣＤＨ１７ ＩｇＧ Ｄ２１１１およびＤ２１０１を使用した。抗体は１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）または１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７−三酢酸（ＮＯＴＡ）によるキレート化の後、陽電子放出核種64Ｃｕで標識し、それぞれ64Ｃｕ−Ｄ２１１１、64Ｃｕ−Ｄ２１０１としてＰＥＴイメージングに使用した。標識した抗体の結合活性が低下していないことを確認し、ＰＥＴイメージング実験ではマウス１匹あたり７−８ＭＢｑ（７０−８０μｇ）を尾静脈より投与した。
Example 8 (PET imaging)
A. Materials and Methods Anti-CDH17 IgG D2111 and D2101 were used. The antibody can be 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (DOTA) or 1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid (NOTA). ) And then labeled with positron emitting nuclide 64 Cu and used for PET imaging as 64 Cu-D2111 and 64 Cu-D2101, respectively. After confirming that the binding activity of the labeled antibody had not decreased, 7-8 MBq (70-80 μg) per mouse was administered from the tail vein in a PET imaging experiment.
（１）64Ｃｕ−Ｄ２１１１のＣＤＨ１７陽性腫瘍におけるＰＥＴイメージング実験
64Ｃｕ−Ｄ２１１１の腫瘍細胞表面抗原への結合性を確認するため、ＣＤＨ１７陽性ＡＧＳ細胞株移植ヌードマウスに投与した。64Ｃｕ−Ｄ２１１１の投与直後から最大３日目まで、小動物用ＰＥＴ装置ＩＮＶＥＯＮ（Ｓｉｅｍｅｎｓ，ＵＳＡ，Ｉｎｃ）を用いて、ヌードマウス全身の撮像を行った。ネガティブコントロールとして、ＣＤＨ１７陰性ＭＫＮ細胞株移植ヌードマウスに64Ｃｕ−Ｄ２１１１を投与し、同様の撮像を実施した。
（２）64Ｃｕ−Ｄ２１０１のＣＤＨ１７陽性腫瘍におけるＰＥＴイメージング実験
64Ｃｕ−Ｄ２１０１の腫瘍細胞表面抗原への結合性を確認するため、ＣＤＨ１７陽性ＡＧＳ移植ヌードマウスに投与した。64Ｃｕ−Ｄ２１０１の投与直後から最大３日目まで、小動物用ＰＥＴ装置ＩＮＶＥＯＮ （Ｓｉｅｍｅｎｓ，ＵＳＡ，Ｉｎｃ）を用いて、ヌードマウス全身の撮像を行った。
（３）画像再構成と画像データ解析
収集したＰＥＴデータは、上記Ｓｔｕｄｙ １、Ｓｔｕｄｙ ２の一連のデータ収集後、Ｆｉｌｔｅｒｅｄ Ｂａｃｋ Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ法または２Ｄ Ｏｒｄｅｒｅｄ Ｓｕｂｓｅｔ Ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ Ｍａｘｉｍｉｚａｔｉｏｎ法によって３Ｄ画像へと再構成した。画像表示、臓器および腫瘍の関心領域（ＲＯＩ）の設定は、ＰＥＴ用解析ソフトウェアであるＡｓｉｐｒｏ（Ｓｉｅｍｅｎｓ，ＵＳＡ，Ｉｎｃ）またはＰＭＯＤ（ＰＭＯＤ ｇｒｏｕｐ）を用いて行った。各臓器および腫瘍への本薬剤の集積率は、単位組織重量当たりの投与放射能集積比率％ Ｉｎｊｅｃｔｅｄ Ｄｏｓｅ／ｇ（％ ＩＤ／ｇ）として算出した。
(1) PET imaging experiment in CDH17 positive tumor of 64 Cu-D2111
In order to confirm the binding of 64 Cu-D2111 to the tumor cell surface antigen, it was administered to CDH17-positive AGS cell line transplanted nude mice. The whole body of nude mice was imaged using a small animal PET apparatus INVEON (Siemens, USA, Inc) from immediately after the administration of 64 Cu-D2111 to a maximum of 3 days. As a negative control, 64 Cu-D2111 was administered to nude mice transplanted with CDH17-negative MKN cell line, and the same imaging was performed.
(2) PET imaging experiment in CDH17 positive tumor of 64 Cu-D2101
In order to confirm the binding of 64 Cu-D2101 to the tumor cell surface antigen, it was administered to CDH17-positive AGS-transplanted nude mice. The whole body of nude mice was imaged using a small animal PET apparatus INVEON (Siemens, USA, Inc.) from immediately after administration of 64 Cu-D2101 to a maximum of 3 days.
(3) Image reconstruction and image data analysis The collected PET data was reconstructed into a 3D image by the filtered back projection method or the 2D ordered subset extraction method after the series of data of Study 1 and Study 2 was collected. Image display, organ and tumor region of interest (ROI) were set using Asipro (Siemens, USA, Inc) or PMOD (PMOD group), which is an analysis software for PET. The accumulation rate of this drug in each organ and tumor was calculated as the dose radioactivity accumulation ratio% Injected Dose / g (% ID / g) per unit tissue weight.
Ｂ．結果
（１）64Ｃｕ−Ｄ２１１１のＰＥＴイメージング実験
ＣＤＨ１７陽性ＡＧＳ移植腫瘍への64Ｃｕ−Ｄ２１１１の集積は投与直後から時間経過と共に増強し、集積率は投与後６時間、２４時間、４８時間、７２時間でそれぞれ４．０１％ ＩＤ／ｇ、５．６７％ ＩＤ／ｇ、６．１６％ ＩＤ／ｇ、６．５３％ ＩＤ／ｇだった（図５、６）。血中の放射能濃度の代替として、心縦隔の集積率を算出したところ、投与後６時間、２４時間、４８時間、７２時間でそれぞれ１１．１％ ＩＤ／ｇ、７．３％ ＩＤ／ｇ、５．９％ ＩＤ／ｇ、４．４％ ＩＤ／ｇであり、時間経過と共に低下した。肝臓における64Ｃｕ−Ｄ２１１１の集積率も時間経過と共に低下し、投与後６時間、２４時間、４８時間、７２時間でそれぞれ１５．２％ ＩＤ／ｇ、１２．７％ ＩＤ／ｇ、１１．４％ ＩＤ／ｇ、９．８７％ ＩＤ／ｇであった。
B. Results (1) 64 64 Cu-D2111 accumulation of Cu-D2111 to PET imaging experiments CDH17 positive AGS transplantation tumors enhances with time from immediately after administration, the integrated rate 6 hours after administration, 24 hours, 48 hours, 72 They were 4.01% ID / g, 5.67% ID / g, 6.16% ID / g, and 6.53% ID / g, respectively, over time (FIGS. 5 and 6). As an alternative to the radioactivity concentration in the blood, the accumulation rate of the cardiac mediastinum was calculated. g, 5.9% ID / g, 4.4% ID / g, and decreased with time. The accumulation rate of 64 Cu-D2111 in the liver also decreased with time, 15.2% ID / g, 12.7% ID / g, 11.4 at 6 hours, 24 hours, 48 hours, and 72 hours after administration, respectively. % ID / g, 9.87% ID / g.
ＡＧＳ移植腫瘍へのＲＩの集積が長時間維持、増強されたのに対し、心縦隔および肝臓への集積は比較的速やかに減少した。遊離したと思われる64Ｃｕは投与６時間までに膀胱から速やかに***され、それ以外の非標的臓器への非特異的集積は認められなかった。このことから、本抗体のＡＧＳ腫瘍への特異的集積が達成される可能性が示された。 While the accumulation of RI in AGS transplanted tumors was maintained and enhanced for a long time, accumulation in the cardiac mediastinum and liver decreased relatively quickly. 64 Cu which seems to have been released was rapidly excreted from the bladder by 6 hours after administration, and non-specific accumulation in other non-target organs was not observed. From this, it was shown that the specific accumulation of this antibody in the AGS tumor could be achieved.
ＣＤＨ１７陽性ＡＧＳ移植腫瘍とＣＤＨ１７陰性ＭＫＮ移植腫瘍への64Ｃｕ−Ｄ２１１１の集積を、集積の腫瘍−心縦隔比を指標として比較した（図７）。その結果、ＡＧＳ移植腫瘍の腫瘍−心縦隔比は投与後６時間、２４時間、４８時間、７２時間でそれぞれ０．３６、０．７８、１．０４、１．５０であった結果に対し、ＭＫＮ移植腫瘍の腫瘍−心縦隔比は投与後６時間、２４時間、４８時間、７２時間でそれぞれ０．１７、０．５２、０．６３、０．８９であり、ＡＧＳ移植腫瘍の腫瘍−心縦隔比の方がいずれの時間でも大きかった。このことから、本抗体のＣＤＨ１７陽性腫瘍への特異的集積が達成される可能性が示された。 The accumulation of 64 Cu-D2111 in CDH17 positive AGS transplanted tumors and CDH17 negative MKN transplanted tumors was compared using the tumor-cardiac mediastinal ratio as an index (FIG. 7). As a result, the tumor-cardiac mediastinal ratio of the AGS transplanted tumor was 0.36, 0.78, 1.04, and 1.50 at 6 hours, 24 hours, 48 hours, and 72 hours after administration, respectively. The tumor-cardiac mediastinal ratio of the MKN-transplanted tumor was 0.17, 0.52, 0.63, and 0.89 at 6 hours, 24 hours, 48 hours, and 72 hours after administration, respectively. -The mediastinum was greater at any time. From this, it was shown that the specific accumulation of this antibody in CDH17 positive tumors could be achieved.
（２）64Ｃｕ−Ｄ２１０１のＰＥＴイメージング実験
（１）で２０．７％だった標識率を９８．９％に向上させ、64Ｃｕ−Ｄ２１０１のＰＥＴイメージング実験を実施した。
ＡＧＳ移植腫瘍への64Ｃｕ−Ｄ２１０１の集積は投与直後から時間経過と共に増強し、集積率は投与直後、投与後６時間、２４時間、４８時間、７２時間でそれぞれ１．３１％ ＩＤ／ｇ、８．１４％ ＩＤ／ｇ、１４．３％ ＩＤ／ｇ、２０．６％ ＩＤ／ｇ、２６．６％ ＩＤ／ｇだった（図８）。血中の放射能濃度を測定するため、心縦隔にＲＯＩを設定し集積率を算出したところ、投与直後、投与後６時間、２４時間、４８時間、７２時間でそれぞれ１８．０％ ＩＤ／ｇ、１４．３％ ＩＤ／ｇ、８．１４％ ＩＤ／ｇ、６．７６％ ＩＤ／ｇ、５．６％ ＩＤ／ｇであり、時間経過と共に低下した。肝臓における64Ｃｕ−Ｄ２１０１の集積率は時間経過と共に低下し、投与直後、投与後６時間、２４時間、４８時間、７２時間でそれぞれ１０．６％ ＩＤ／ｇ、８．２０％ ＩＤ／ｇ、６．４３％ ＩＤ／ｇ、５．７０％ ＩＤ／ｇ、５．５３％ ＩＤ／ｇだった（図９）。
(2) PET imaging experiment of 64 Cu-D2101 The labeling rate, which was 20.7% in (1), was improved to 98.9%, and a PET imaging experiment of 64 Cu-D2101 was performed.
The accumulation of 64 Cu-D2101 in AGS transplanted tumors increased with time from immediately after administration, and the accumulation rate was 1.31% ID / g immediately after administration, 6 hours, 24 hours, 48 hours, and 72 hours after administration, respectively. 8.14% ID / g, 14.3% ID / g, 20.6% ID / g, and 26.6% ID / g (FIG. 8). In order to measure the radioactivity concentration in the blood, ROI was set in the mediastinum and the accumulation rate was calculated. Immediately after administration, 6 hours, 24 hours, 48 hours, and 72 hours after administration, 18.0% ID / g, 14.3% ID / g, 8.14% ID / g, 6.76% ID / g, 5.6% ID / g, and decreased with time. The accumulation rate of 64 Cu-D2101 in the liver decreases with the passage of time, and 10.6% ID / g, 8.20% ID / g immediately after administration, 6 hours, 24 hours, 48 hours, and 72 hours after administration, It was 6.43% ID / g, 5.70% ID / g, 5.53% ID / g (FIG. 9).
ＡＧＳ移植腫瘍へのＲＩの集積が長時間維持、増強されたのに対し、心縦隔および肝臓への集積は比較的速やかに減少した。また、非標的臓器への集積も認められなかった（図１０）。このことから、本抗体により高い腫瘍−組織比率（ｔｕｍｏｒ ｔｏ ｔｉｓｓｕｅ ｒａｔｉｏ）が達成できる可能性が示された。 While the accumulation of RI in AGS transplanted tumors was maintained and enhanced for a long time, accumulation in the cardiac mediastinum and liver decreased relatively quickly. In addition, accumulation in non-target organs was not observed (FIG. 10). This indicated the possibility of achieving a high tumor to tissue ratio with this antibody.
（１）でネガティブコントロールとして実施した64Ｃｕ−Ｄ２１１１のＭＫＮ移植腫瘍への集積と比較を行った。64Ｃｕ−Ｄ２１１１のＭＫＮ移植腫瘍への集積は最大で６．４３％ ＩＤ／ｇ（４８時間）であり、64Ｃｕ−Ｄ２１０１のＡＧＳ移植腫瘍への集積率とは明らかな差が認められた。このことから、64Ｃｕ−Ｄ２１０１はＡＧＳ移植腫瘍への特異的な集積性を有していると考えられる。 This was compared with the accumulation of 64 Cu-D2111 in the MKN-transplanted tumor performed as a negative control in (1). The maximum accumulation of 64 Cu-D2111 in MKN-transplanted tumors was 6.43% ID / g (48 hours), and a clear difference was observed from the accumulation rate of 64 Cu-D2101 in AGS-transplanted tumors. From this, it is considered that 64 Cu-D2101 has a specific accumulation property to the AGS transplanted tumor.
Claims (5)
（ａ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７及び１９から選ばれるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲを有する重鎖、
（ｂ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７及び１９から選ばれるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加された重鎖ＣＤＲを有する重鎖、
（ｃ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７及び１９から選ばれるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有する重鎖ＣＤＲを有する重鎖、
（ｄ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８及び２０から選ばれるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲを有する軽鎖、
（ｅ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８及び２０から選ばれるアミノ酸配列において２１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加された軽鎖ＣＤＲを有する軽鎖、
（ｆ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８及び２０から選ばれるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有する軽鎖ＣＤＲを有する軽鎖。 The anti-cadherin 17 antibody or its variant whose heavy chain is the following (a), (b) or (c) and whose light chain is the following (d), (e) or (f).
(A) a heavy chain having a heavy chain CDR having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, and 19.
(B) a heavy chain in which 1 to several amino acids are deleted, substituted, and / or added in the amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, and 19. Heavy chain with CDRs,
(C) a heavy chain having a heavy chain CDR having 90% or more identity with an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, and 19.
(D) a light chain having a light chain CDR having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, and 20.
(E) a light chain in which 21 to several amino acids are deleted, substituted, and / or added in an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, and 20. A light chain having a CDR,
(F) A light chain having a light chain CDR having 90% or more identity with an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, and 20.
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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-
2015
- 2015-07-15 JP JP2015141557A patent/JP2017024991A/en active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112625131A (en) * | 2020-08-10 | 2021-04-09 | 北京鼎成肽源生物技术有限公司 | Anti-human c-Met human-mouse chimeric monoclonal antibody and application thereof |
| CN112625131B (en) * | 2020-08-10 | 2021-08-17 | 北京鼎成肽源生物技术有限公司 | Anti-human c-Met human-mouse chimeric monoclonal antibody and application thereof |
| CN113999308A (en) * | 2021-12-30 | 2022-02-01 | 深圳市人民医院 | Nano antibody targeting cadherin 17 and application thereof |
| CN113999308B (en) * | 2021-12-30 | 2022-03-11 | 深圳市人民医院 | Nano antibody targeting cadherin 17 and application thereof |
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