JP2017023131A - 細胞培養装置 - Google Patents

Abstract

【課題】インキュベータ内に設置された培養バッグ中の培地を簡易に交換する。【解決手段】細胞を培養するための培地を保持する培地保持手段と、該培地保持手段と連結し、前記培地保持手段から排出された培地を培養バッグに供給する培地供給手段と、該培地供給手段と接続する供給口と、内部から培地を排出するための排出口を備えた培養バッグと、前記培養バッグの前記排出口に陰圧を供給する陰圧供給手段と、前記培養バッグの前記排出口からの培地を保持する廃液保持手段を備えた細胞培養システムを提供する。【選択図】図１

Description

本発明は、培養バッグ（細胞培養バッグ）内の培地を自動交換可能な細胞培養装置に関するものである。

近年、幹細胞研究や再生医療の進展に伴い、臨床用途の細胞を大量に調製することが要求されている。臨床用途の細胞の調製には厳しい基準に適った環境での作業が求められ、そのため、作業者が作業空間に立ち入る際には使い捨ての作業着に着替えたりするなど大変な手間とコストが発生している。また、作業者による作業工程は培養系が汚染される機会となっている。したがって、作業者が作業空間に立ち入り作業をする回数をできる限り少なくし、可能な作業については人手によらず自動で行うことが求められている。
細胞を培養するには定期的に培地（細胞培養液）の交換が必要となるが、培地交換は培養系の汚染（コンタミネーション）のリスクを伴い、可能な限り人手を介さずに自動で行えることが望ましい。自動で培地を交換するシステムとして、搬送ロボットにより培養容器をインキュベータと培地交換ロボットの間で移動させるシステムが知られている（特許文献１）。

特開２００２−２６２８５６号公報

臨床用途の細胞の調製には厳しい基準が設定されており、培養系が汚染されるリスクはなるべく排除する必要があるため、培地交換の過程を自動化することが有利となるが、特許文献１のような自動培地交換システムでは、搬送ロボット等を採用するためシステムが非常に複雑となり、システムエラーを起こすリスクが高くなる。また、培養容器をインキュベータから出し入れするため、培養容器内の細胞に温度変化のよるストレスがかかることになる。それをさけるためにシステムをインキュベータ内に設置すると、インキュベータ内は多湿の環境にあるため、機械的、電気的な構造物がトラブルを起こすリスクがあり、インキュベータ内のシステム構成物はなるべく簡単な構成が好ましい。

本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、細胞培養空間における培養バッグ（細胞培養バッグ）内の培地を簡易に自動で交換することができるとともに、装置を簡単な構成とすることでシステムトラブルの発生リスクを軽減できる細胞培養装置を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。本発明の一態様は、
細胞を培養するための培地を保持する培地保持手段と、
該培地保持手段と連結し、前記培地保持手段から排出された培地を培養バッグに供給する培地供給手段と、
該培地供給手段と接続する供給口と、内部から培地を排出するための排出口を備えた培養バッグと、
前記培養バッグの前記排出口に陰圧を供給する陰圧供給手段と、
前記培養バッグの前記排出口からの培地を保持する廃液保持手段を備えた細胞培養装置を提供する。

本態様によれば、簡単な構成によって培養バッグの培地を交換することができる。

また、上記態様においては、前記培地供給手段が、培養バッグへ培地を供給する速度を調整する供給速度調整手段を備えていても良い。このことにより、培養バッグへの培地の供給速度を任意に変えることができるので、培地の排出速度より供給速度を遅く調整することで培養バッグ内の培地の交換効率を上げることができる。

また、上記態様においては、前記培養バッグの前記排出口の口径が、前記供給口の口径より大きく設定しても良い。このことにより、培地の培養バッグからの排出速度より培養バッグへの供給速度を遅くすることができ、培養バッグ内の培地の交換効率を上げることができる。

また、上記態様においては、培地を保存に適した温度に維持し前記培地保持手段に培地を供給する培地保存手段と、前記培地保持手段内の培地の量を検出する液量センサと、をさらに備え、前記培地保存手段から前記培地保持手段に供給された培地量が所定の量に達したときに、前記液量センサがそれを検出し、前記陰圧供給手段を作動させても良い。このことにより、簡単な構成によって、所望の周期で培地を断続的に供給、排出することができる。

また、上記態様においては、培地を保存に適した温度に維持し前記培地保持手段に培地を供給する培地保存手段と、前記培地保持手段内の培地の量を検出する液量センサと、をさらに備え、前記培地保存手段から前記培地保持手段に供給された培地量が所定の量に達したときに、前記液量センサがそれを検出し、前記陰圧供給手段および前記供給速度調整手段を作動させても良い。このことにより、簡単な構成によって、所望の周期で培地を断続的に供給、排出することができる。

また、上記態様においては、前記培養バッグの前記排出口からの培地が、前記廃液保持手段内の空間を滴下されても良い。このことにより、培地の逆流を防ぐことができ、培養バッグ内が汚染される（コンタミネーションが起こる）ことを防止することができる。

本発明によれば、簡単なシステムの構成によって培養バッグの培地を交換することができるので、システムエラーのリスクを軽減することができ、エラーにより培養条件に影響を及ぼしてしまうリスクを回避することができる。

本発明の第１実施形態にかかる細胞培養装置の概略構成を示す説明図である。 本発明の陰圧供給手段の例の概略構成を示す説明図である。 本発明の第２実施形態にかかる細胞培養装置の概略構成を示す説明図である。 本発明の供給速度調整手段の例の概略構成を示す説明図である。 本発明の第３実施形態にかかる細胞培養装置の概略構成を示す説明図である。 本発明の第３実施形態にかかる細胞培養装置の変形例の概略構成を示す説明図である。 本発明の各実施形態の変形例の概略構成を示す説明図である。 本発明の各実施形態の変形例の概略構成を示す説明図である。 本発明で使用可能な培養バッグの概略構成を示す説明図である。

本発明の実施形態に係る細胞培養装置について、図面を参照して以下に説明する。
（第１実施形態）
本実施形態に係る細胞培養装置１００は、図１に示される構成の装置であり、インキュベータ内に設置された培養バッグ（細胞培養バッグ）内の培地を交換する装置である。

培地保持手段３は、インキュベータ１の内部に設置されており、内部に培地（細胞培養液）を保持するためのものである。培地の温度をインキュベータ１の内部の温度（例えば３７℃）に維持する。

培地保持手段３で細胞培養に適したインキュベータ１の内部の温度（例えば３７℃）に温められた培地は、インキュベータ１内で培地供給手段４を介して培養バッグ２に供給される。培地保持手段３は培地供給手段４に培地を排出する排出口３ａを備えている。排出口３ａの設置場所は、内部の培地を最後まで排出できる場所、つまり、培地保持手段３の底面または、側面の下部が好ましい。

培地供給手段４は、培地保持手段３の排出口３ａと培養バッグ２の供給口２ａをつなぐチューブ等の管状部材を備え、複数の培養バッグ２を使用する場合は、培地保持手段３の排出口３ａからの管状部材４ａが分岐部４ｃで複数の管状部材４ｂに分岐し、それぞれが異なる培養バッグ２の供給口２ａに接続している。

培養バッグ２は培地供給手段４の管状部材４ｂと接続する供給口２ａと、培養バッグ２外に培地を排出する排出口２ｂを有している。供給口２ａと排出口２ｂの設置位置は任意であるが、互いに可能な限り距離を離して設置した方が培地の交換効率を上げることができる。
また、排出口２ｂの口径（または断面面積）は供給口２ａの口径（または断面面積）より大きいことが好ましい。こうすることで、新しい培地の供給より早く培養バッグ２内の古い培地が排出されるようになり、培地の交換効率を上げることができる。
なお、培養バッグ２は接着細胞用の培養バッグであり、細胞が接着しやすいように表面加工がされていることが好ましい。

培養バッグ２内の培地は、培地排出手段により排出口２ｂから排出される。培地排出手段は、廃液保持手段５と陰圧供給手段６を備えている。
廃液保持手段５は培養バッグ２からのチューブ等の管状部材と接続する廃液供給口５ａと、廃液保持手段５外に培地を排出する廃液排出口５ｂを有している。廃液供給口５ａは廃液保持手段５の上面に設置されており、廃液供給口５ａから供給された培地は廃液保持手段５内の空間を滴下され、廃液排出口５ｂより排出される。このように、培地が廃液保持手段５内の空間を滴下されることで、培地の逆流を防ぐことができ、培養バッグ２内が汚染される（コンタミネーションが起こる）ことを防止することができる。
廃液排出口５ｂは陰圧供給手段６に接続されている。

陰圧供給手段６としては、図２に示すようなポンプ６１と廃液容器６２を備えた手段を例示することができる。陰圧供給手段６の吸引口６３を廃液保持手段５の廃液排出口５ｂと接続して廃液保持手段５内を陰圧にし、培養バッグ２の排出口２ｂを陰圧にすることで培養バッグ２から培地を吸引することが可能である。
陰圧供給手段のポンプとしてペリスタポンプ等の送液ポンプを使用しても良い。この場合、送液ポンプを吸引口６３の管状部材に設置しても良い。

次に、本実施形態に係る細胞培養装置１００を用いて培地を交換する手順について一例を説明する。
本装置のユーザは、まず培地及び細胞（接着細胞）が入った培養バッグ２を用意し、インキュベータ１内で培養バッグ２の供給口２ａを培地供給手段４の管状部材４ｂに、培養バッグ２の排出口２ｂを管状部材５ｃを介して廃液保持手段５の廃液供給口５ａに接続する。
培地交換が必要になった際、ユーザはまず陰圧供給手段６を作動させ、廃液保持手段５内を陰圧にする。このことにより、培養バッグ２内の培地が管状部材５ｃを介して廃液保持手段５内に吸引される。同時に、培養バッグ２内も陰圧になり、培地保持手段３内の培地が培地供給手段４を介して培養バッグ２内に供給される。
ユーザは培養バッグ２内の培地が適量排出された段階で陰圧供給手段６を停止する。このことにより、廃液保持手段５内の陰圧が解除され、培養バッグ２内からの培地の排出が停止する。また、培養バッグ２内が常圧に戻ると培養バッグ２内への培地の供給も停止する。

本実施形態において、陰圧供給手段６を遠隔的に操作する制御部を備えていても良い。こうすることで、ユーザは、例えば図示しないモニタリングシステムで遠隔監視しながら、所望のタイミングで培地交換をすることができる。
また、あらかじめ設定したプログラムにより制御部が陰圧供給手段６を自動制御しても良い。

（第２実施形態）
本実施形態に係る細胞培養装置２００は、図３に示される構成の装置であり、培地供給手段４の管状部材に供給速度調整手段１０を備えた点で第１実施形態と異なっている。それ以外は、第１実施形態と同様である。

供給速度調整手段１０は培地供給手段４の管状部材（チューブ等）に配置されており、管状部材に外力を加えて変形させ、管状部材内腔の断面積を小さくすることで溶液の流量を制限して流速を抑制する。逆に外力を解除すると、管状部材の弾性力により管状部材が元の状態に戻り、流速を上げることができる。このように、供給速度調整手段１０は管状部材に対する外力の強弱により管状部材内に流れる溶液の流速を調整する。供給速度調整手段１０による管状部材への外力の加え方について図４に例を示す。（ａ）は２枚の板状部材２１により管状部材２０を挟む例、（ｂ）は複数の球状（または円柱状）部材２２により貫通穴２３に通した管状部材２０を挟む例、（ｃ）はシャッター状部材２４で貫通穴２５に通した管状部材２０を挟む例、（ｄ）は管状部材２０を通した貫通穴２６の内径が小さくなり管状部材を変形させる例である。これ以外でも外力を加えて管状部材を変形させることができる機構であれば良い。

ユーザは供給速度調整手段１０により培養バッグ２への培地供給速度を調整することができる（培地供給速度を０にして供給を止めることもできる）。培養バッグ２へ培地が供給される速度を培養バッグ２から培地が排出される速度より遅くすれば、古い培地と新しい培地の交換効率をあげることができる。

本実施形態に係る培地交換装置２００を用いて培地を交換する手順については第１実施形態と同様であるが、本実施形態においては、ユーザは供給速度調整手段１０により培養バッグ２への培地供給速度を調整することができる。

本実施形態において、陰圧供給手段６および供給速度調整手段１０を遠隔的に操作する制御部を備えていても良い。こうすることで、ユーザは、例えば図示しないモニタリングシステムで遠隔監視しながら、所望のタイミングで培地交換をすることができる。
また、あらかじめ設定したプログラムにより制御部が陰圧供給手段６および供給速度調整手段１０を自動制御しても良い。

（第３実施形態）
本実施形態に係る細胞培養装置３００は、図５に示される構成の装置であり、培地保存手段３１を備え、培地保持手段３内に液量センサ３２を備えた点で第１実施形態と異なっている。それ以外は、第１実施形態と同様である。

培地保存手段３１は培地保存容器３１ａを備え、チューブ等の管状部材３１ｃを介して培地保持手段３の開口部（供給口３ｂ）に接続している。管状部材３１ｃにはペリスタポンプ等の送液ポンプ３１ｄを備えられ、培地保存容器３１ａ内の培地を培地保持手段３に供給することができる。培地保存容器３１ａ内の培地は、温度調節手段３１ｂにより培地の保存に適した温度（例えば４℃）に維持されている。
培地保持手段３の供給口３ｂの設置位置は任意であるが、供給された培地が培地保持手段３内の空間を滴下するように、培地保持手段３の上面部にあることが好ましい。このことにより、培地の逆流を防ぐことができ、培地保存容器３１ａ内が汚染される（コンタミネーションが起こる）ことを防止することができる。

液量センサ３２は培地保持手段３内の培地量を検出するセンサであり、培地保持手段３内の培地量が所定量に達した際にそれを検知し、陰圧供給手段６へ情報を送ることで陰圧供給手段６を作動させることができる。陰圧供給手段６は作動開始してから所定時間経過後に停止するようになっていても良いし、液量センサ３２が培地保持手段３内の培地量が所定量まで減少した際にそれを検知し、陰圧供給手段６へ情報を送ることで陰圧供給手段６を停止させても良い。液量センサ３２から陰圧供給手段６への情報の伝達は有線でも無線でも良い。

液量センサ３２の例としては、光学的や電気的に培地保持手段３内の培地上面の液面を検出できるセンサを挙げることができる。所定位置に設置した電極に培地が接触することで生じる通電を検出したり、静電容量の変化で液面位置を検出したり、液面からの反射光により光学的に液面位置を検出したり、超音波や電波を液面に反射させて反射時間を検出したりするセンサなどがある。また、培地保持手段３内の培地にフロートを浮かべてフロートの位置を検出したり、培地保持手段３の重量変化（圧力変化）を検出したりしても良い。

次に、本実施形態に係る培地交換装置３００を用いて培地を交換する手順について一例を説明する。
本装置のユーザは、まず培地及び細胞（接着細胞）が入った培養バッグ２を用意し、インキュベータ１内で培養バッグ２の供給口２ａを培地供給手段４の管状部材４ｂに、培養バッグ２の排出口２ｂを管状部材５ｃを介して廃液保持手段５の廃液供給口５ａに接続する。
培地保存手段３１を培地保持手段３の供給口３ｂに接続し、送液ポンプ３１ｄを作動させて培地保持手段３へ培地の供給を開始する。培地保持手段３へ供給された培地はインキュベータ１内の温度（細胞培養に適した温度）に暖められる。培地保持手段３内の培地が所定量に達すると液量センサ３２がそれを検知し、陰圧供給手段６へ情報を送ることで陰圧供給手段６を作動させ、廃液保持手段５内を陰圧にする（液量センサ３２が作動する前は、陰圧供給手段６は停止した状態となっている）。このことにより、培養バッグ２内の培地が管状部材５ｃを介して廃液保持手段５内に吸引される。同時に、培養バッグ２内も陰圧になり、培地保持手段３内の培地が培地供給手段４を介して培養バッグ２内に供給される。
陰圧供給手段６は作動開始してから所定時間経過後に停止する。このことにより、廃液保持手段５内の陰圧が解除され、培養バッグ２内からの培地の排出が停止する。また、培養バッグ２内が常圧に戻ると培養バッグ２内への培地の供給も停止し、培地保持手段３内の培地量が増加し始める。培地保持手段３内の培地が所定量に達すると液量センサ３２がそれを検知し、上記ステップを繰り返す。

本実施形態の変形例を図６に示す。
本変形例に係る細胞培養装置３１０は、図６に示される構成の装置であり、培地供給手段４の管状部材に供給速度調整手段３３をさらに備え、液量センサ３２が供給速度調整手段３３による培養バッグ２への培地供給速度を調整することができる（培地供給速度を０にして供給を止めることもできる）装置である。

本変形例によれば、培地保持手段３内の培地が所定量に達すると液量センサ３２がそれを検知し、陰圧供給手段６および供給速度調整手段３３へ情報を送ることで陰圧供給手段６および供給速度調整手段３３を作動させ、培養バッグ２内からの培地の排出および培養バッグ２内への培地の供給を制御することができる。

次に、液量センサ３２による陰圧供給手段６および供給速度調整手段３３の制御の一例を示す。
液量センサ３２が作動する前は、陰圧供給手段６は停止した状態で、供給速度調整手段３３は培地の供給を止めた状態（流路を閉じ培地供給速度を０にした状態）となっている。培地保持手段３内の培地が所定量に達すると液量センサ３２がそれを検知し、陰圧供給手段６へ情報を送ることで陰圧供給手段６を作動させ、廃液保持手段５内を陰圧にする。このことにより、培養バッグ２内の培地が管状部材５ｃを介して廃液保持手段５内に吸引される。液量センサ３２は陰圧供給手段６へ情報を送ってから所定の時間間隔をおいてから供給速度調整手段３３へ情報を送り、流路を開いた状態にして培地の供給を開始する。陰圧供給手段６および供給速度調整手段３３は、液量センサ３２から情報を受けてから所定時間経過後に停止する様になっており、それらが停止すると培地保持手段３内の培地量が増加し始める。培地保持手段３内の培地が所定量に達すると液量センサ３２がそれを検知し、上記ステップを繰り返す。
このように、陰圧供給手段６および供給速度調整手段３３の作動のタイミングをずらすことにより、培地の交換効率をよくすることができる。

ここで、液量センサ３２が陰圧供給手段６および供給速度調整手段３３に時間差をつけて情報を発信することにかえ、液量センサ３２が陰圧供給手段６および供給速度調整手段３３に同時に情報を発信し、供給速度調整手段３３が情報を受けてから所定時間経過後に作動する様にしても良い。

液量センサ３２、陰圧供給手段６、供給速度調整手段３３はタイマーを備えていることが好ましい。

陰圧供給手段６および供給速度調整手段３３が作動開始してから所定時間経過後に停止することにかえ、液量センサ３２が培地保持手段３内の培地量が所定量まで減少した際にそれを検知し、陰圧供給手段６および供給速度調整手段３３へ情報を送ることで陰圧供給手段６および供給速度調整手段３３を停止させても良い。

本実施形態および変形例において、送液ポンプ３１ｄを遠隔的に操作する制御部を備えていても良い。こうすることで、ユーザは、例えば図示しないモニタリングシステムで遠隔監視しながら、所望のタイミングで培地交換をすることができる。
また、あらかじめ設定したプログラムにより制御部が送液ポンプ３１ｄを自動制御しても良い。

なお、液量センサ３２から陰圧供給手段６や供給速度調整手段３３への情報の伝達は有線でも無線でも良い。

本実施形態および変形例によれば、培地保存手段３１から培地保持手段３への培地供給速度を調整することで、所望の周期で培養バッグ内の培地の交換を行うことが可能となる。

上記各実施形態において、培地排出手段はインキュベータの内外いずれに設置しても良い。
また、陰圧供給手段６が廃液容器６２を備えている場合、廃液保持手段５を採用せず、廃液容器６２が廃液保持手段５の機能を有していても良い。この場合、廃液容器６２内に供給された培地が廃液容器６２内の空間を滴下される構成となっていることが好ましい。このことにより、培地の逆流を防ぐことができ、培養バッグ２内が汚染される（コンタミネーションが起こる）ことを防止することができる。

上記各実施形態において、複数の培養バッグ２を使用する場合、培地保持手段３の排出口３ａからの管状部材４ａが分岐部４ｃで複数の管状部材４ｂに分岐し、それぞれが異なる培養バッグ２の供給口２ａに接続している態様を示したが、例えば図７に示すように、培地保持手段３が複数の排出口３ａを備え、それぞれが管状部材を介して異なる培養バッグ２の供給口２ａに接続している態様でも良い。
また、培養バッグは１つでも良い。

上記各実施形態において、陰圧供給手段６の操作は、ポンプ６１を作動・停止させることで陰圧の供給を制御しても良い。または、図８に示すように、廃液保持手段につながる管状部材に流路開閉ゲート８１を設置し、ポンプ６１を作動させた状態で、管状部材の流路を開閉することにより陰圧の供給を制御しても良い。
流路開閉ゲート８１の例としては、供給速度調整手段と同様であれば良く、図４に示す態様を例示できる。
また、流路開閉ゲート８１は制御部により遠隔的に制御されていても良い。遠隔的な制御は無線でも有線でも良い。

本発明の制御部としては、ＰＣを例示することができる。例えばＣＰＵとメモリを有するＰＣが、メモリに記憶された制御プログラムをＣＰＵが実行することで制御部としての機能を実現しても良い。

本発明に使用可能な培養バッグとしては、例えば図９に示したような内部に流路を有する培養バッグ９１を例示することができる。このように流路を形成することにより、培地の交換効率を上げることができる。培養バッグの対峙した面同士を一部癒着させることで培養バッグ内の空間に境界線９２をつくり、流路を形成しても良い。培養バッグ９１の開口部である供給口９３、排出口９４は、流路上で互いに離れた位置に設置すると培地に交換効率を上げることができる。また、排出口９４の口径（または断面面積）が、供給口９３の口径（または断面面積）より大きくても良い。

本発明において、供給速度調整手段１０、３３は、ペリスタルティックポンプ等の送液ポンプであっても良い。

１ インキュベータ
２ 培養バッグ
３ 培地保持手段
４ 培地供給手段
５ 培地排出手段
６ 陰圧供給手段
１０ 供給速度調整手段
３１ 培地保存手段
３１ａ 培地保存容器
３１ｂ 温度調節手段
３１ｃ 管状部材
３１ｄ 送液ポンプ
３２ 液量センサ
３３ 供給速度調整手段
４１ 開閉ゲート
６１ ポンプ
６２ 廃液容器
６３ 吸引口
８１ 流路開閉ゲート
９１ 培養バッグ
９２ しきい
９３ 供給口
９４ 排出口

Claims (6)

1. 細胞を培養するための培地を保持する培地保持手段と、
   該培地保持手段と連結し、前記培地保持手段から排出された培地を培養バッグに供給する培地供給手段と、
   該培地供給手段と接続する供給口と、内部から培地を排出するための排出口を備えた培養バッグと、
   前記培養バッグの前記排出口に陰圧を供給する陰圧供給手段と、
   前記培養バッグの前記排出口からの培地を保持する廃液保持手段を備えた細胞培養装置。
2. 前記培地供給手段が、培養バッグへ培地を供給する速度を調整する供給速度調整手段を備えた請求項１に記載の細胞培養装置。
3. 前記培養バッグの前記排出口の口径が、前記供給口の口径より大きい請求項１に記載の細胞培養装置。
4. 培地を保存に適した温度に維持し前記培地保持手段に培地を供給する培地保存手段と、
   前記培地保持手段内の培地の量を検出する液量センサと、をさらに備え、
   前記培地保存手段から前記培地保持手段に供給された培地量が所定の量に達したときに、前記液量センサがそれを検出し、前記陰圧供給手段を作動させる請求項１に記載の細胞培養装置。
5. 培地を保存に適した温度に維持し前記培地保持手段に培地を供給する培地保存手段と、
   前記培地保持手段内の培地の量を検出する液量センサと、をさらに備え、
   前記培地保存手段から前記培地保持手段に供給された培地量が所定の量に達したときに、前記液量センサがそれを検出し、前記陰圧供給手段および前記供給速度調整手段を作動させる請求項２に記載の細胞培養装置。
6. 前記培養バッグの前記排出口からの培地が、前記廃液保持手段内の空間を滴下される請求項１から５のいずれか一項に記載の細胞培養装置。