JP2016534729A - 最適なダイズ遺伝子座 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、米国特許法第119条(e)の下で、2013年11月4日出願の米国仮特許出願第61/899,602号に対する利益を主張し、その内容は、その全体が参照により本出願に組み込まれる。
配列表の写しは、2014年11月3日に作成されたファイル名「75608232324seqlist.txt」を有し、13.4メガバイトのサイズを有するASCIIフォーマットの配列表として、EFS−Webを介して電子工学的に提出され、本明細書と同時的に出願される。このASCIIフォーマットのドキュメント中に含まれる配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
テーブルリストの写しは、2014年11月3日に作成されたファイル名「Table3」を有し、11.6メガバイトのサイズを有する.PDFフォーマットのテーブルリストとして、EFS−Webを介して電子工学的に提出され、本明細書と同時的に出願される。この.PDFフォーマットのドキュメント中に含まれるテーブルリストは、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明を説明および特許請求する際に、以下の用語法が、以下に示す定義に従って使用される。
ダイズ植物などの双子葉植物のゲノム中の特定の位置に導入遺伝子および導入遺伝子スタックを標的化することは、トランスジェニック事象の品質を改善し、トランスジェニック事象の産生に関連する費用を低減させ、トランスジェニック植物製品を作製するための新たな方法、例えば逐次的遺伝子スタッキングを提供する。全体として、特定のゲノム部位への導入遺伝子の標的化は、商業的に有益である可能性が高い。大幅な進歩が、植物および他のゲノム中の予め選択された部位へのドナーポリヌクレオチドの付加を促進し得る、ZFN、CRISPRおよびTALENなどの部位特異的ヌクレアーゼの開発に向かって、ここ数年間になされてきた。しかし、標的化のために適切なゲノム部位の属性については、それほど知られていない。歴史的に、ゲノム中の非必須遺伝子および病原体(ウイルス)組込み部位が、標的化のための遺伝子座として使用されてきた。ゲノム中のかかる部位の数は、かなり限定的であり、したがって、ドナーポリヌクレオチド配列の標的化のために使用され得る最適なゲノム遺伝子座の同定および特徴付けが必要とされている。標的化に従順なことに加えて、最適なゲノム遺伝子座は、導入遺伝子発現および育種適用を支持し得る中立部位であると予測される。
一実施形態によれば、外因性配列の挿入のために最適な非遺伝子ダイズゲノム配列を同定するための方法が提供される。この方法は、低メチル化された、少なくとも1Kb長のダイズゲノム配列を最初に同定するステップを含む。一実施形態では、この低メチル化されたゲノム配列は、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、10、11、12、13、14、15、16または17Kb長である。一実施形態では、この低メチル化されたゲノム配列は、約1〜約5.7Kb長であり、さらなる一実施形態では、約2Kb長である。配列は、その配列内に1%未満のDNAメチル化を有する場合、低メチル化されたとみなされる。一実施形態では、このメチル化状態は、正常な対照DNAサンプル内の対応するCpGジヌクレオチド、CHGまたはCHHトリヌクレオチドにおいて見出される総シトシンの量と比較した、選択されたダイズ配列内の1または複数のCpGジヌクレオチド、CHGまたはCHHトリヌクレオチドにおける5−メチルシトシンの存在に基づいて測定される。より具体的には、一実施形態では、この選択されたダイズ配列は、500ヌクレオチドの選択されたダイズ配列当たり、1未満、2未満または3未満のメチル化されたヌクレオチドを有する。一実施形態では、この選択されたダイズ配列は、500ヌクレオチドの選択されたダイズ配列当たり、CpGジヌクレオチドにおいて、1未満、2未満または3未満の5−メチルシトシンを有する。一実施形態では、この選択されたダイズ配列は、1〜4Kb長であり、5−メチルシトシンを欠く1Kb配列を含む。一実施形態では、この選択されたダイズ配列は、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5または6Kb長であり、その全長中に1または0のメチル化されたヌクレオチドを含む。一実施形態では、この選択されたダイズ配列は、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5または6Kb長であり、その全長内にCpGジヌクレオチドにおける5−メチルシトシンを含まない。一実施形態によれば、選択されたダイズ配列のメチル化は、供給源組織に基づいて変動し得る。かかる実施形態では、配列が低メチル化されているか否かを決定するために使用されるメチル化レベルは、2以上の組織から(例えば、根および苗条から)単離された配列中のメチル化の平均量を示す。
1.最適なダイズゲノム遺伝子座(OGL)の周囲の低メチル化された領域の長さ
a.ダイズ(Glycine Max)cultivar Williams82などの双子葉植物から単離された根組織および苗条組織のDNAメチル化プロファイルを、ハイスループット全ゲノム配列決定アプローチを使用して構築した。抽出されたDNAを、メチル化されていないシトシンをウラシルに変換するが、メチル化されたシトシンには影響を与えないバイサルファイト処理に供し、次いで、Illumina HiSeqテクノロジーを使用して配列決定した(Krueger, F. et al. DNA methylome analysis using short bisulfite sequencing data. Nature Methods 9, 145-151 (2012))。生配列決定読み取りを、Bismark(商標)マッピングソフトウェア(Krueger F, Andrews SR (2011) Bismark: a flexible aligner and methylation caller for Bisulfite-Seq applications. (Bioinformatics 27: 1571-1572)に記載されるとおり)を使用して、双子葉参照配列、例えば、ダイズ(Glycine max)参照配列に対してマッピングした。OGLの各々の周囲の低メチル化された領域の長さを、記載されたメチル化プロファイルを使用して計算した。
a.各OGLについて、1Mbウインドウ内のOGLのいずれかの側上のマーカーの対を、同定した。染色体にわたるマーカーの各対の間での組換え頻度を、マーカー間の遺伝的距離(センチモルガン(cM))の、マーカー間のゲノム物理的距離(Mb)に対する比率に基づいて計算した。
a.各OGLについて、OGLのヌクレオチド配列を、BLASTベースの相同性検索を使用して、双子葉植物のゲノム、例えば、ダイズc.v.Williams82ゲノムに対してスキャンした。これらのOGL配列は、双子葉植物のゲノム、例えば、ダイズc.v.Williams82ゲノムから同定されるので、この検索を介して同定された第1のBLASTヒットは、OGL配列自体を示す。各OGLについての第2のBLASTヒットを同定し、このヒットのアラインメントカバー度を、ダイズゲノムなどの双子葉ゲノム内のOGL配列の独自性の尺度として使用した。
a.双子葉ゲノム、例えば、ダイズc.v.Williams82ゲノム中の既知の遺伝子の遺伝子注釈付け情報および位置を、公知の双子葉ゲノムデータベース、例えば、Soybean Genome Database(www.soybase.org)から抽出した。各OGLについて、その上流近隣または下流近隣における最も近い注釈付きの遺伝子を同定し、OGL配列とこの遺伝子との間の距離を(bpで)測定した。
a.各OGLについて、ヌクレオチド配列を分析して、存在するグアニン塩基およびシトシン塩基の数を推定した。この計数を、各OGLの配列長の百分率として示し、GC%についての尺度を提供する。
a.双子葉ゲノム、例えば、ダイズc.v.Williams82ゲノム中の既知の遺伝子の遺伝子注釈付け情報および位置を、公知の双子葉ゲノムデータベース、例えば、Soybean Genome Database(www.soybase.org)から抽出した。各OGLについて、OGLの周囲の40Kbウインドウを規定し、このウインドウとオーバーラップする位置を有する注釈付きの遺伝子の数を計数した。
a.ダイズ遺伝子などの双子葉遺伝子の転写物レベルでの発現を、RNAseqテクノロジーを使用して、双子葉植物組織、例えば、ダイズc.v.Williams82の根組織および苗条組織から生成したトランスクリプトームプロファイリングデータを分析することによって測定した。各OGLについて、OGLの周囲の40Kb近隣中に存在する双子葉ゲノム、ダイズc.v.Williams82ゲノム内の注釈付きの遺伝子を、同定した。ウインドウ中の遺伝子の各々についての発現レベルを、トランスクリプトームプロファイルから抽出し、平均遺伝子発現レベルを計算した。
a.特定のヌクレオチド配列についてヌクレオソーム占有率のレベルを識別することで、染色体機能および配列のゲノム情況についての情報が提供される。NuPoP(商標)統計パッケージは、任意のサイズのゲノム配列についてのヌクレオソーム占有率および最も確からしいヌクレオソームポジショニングマップを予測するためのユーザーフレンドリーなソフトウェアツールを提供する(Xi, L., Fondufe-Mittendor, Y., Xia, L., Flatow, J., Widom, J. and Wang, J.-P., Predicting nucleosome positioning using a duration Hidden Markov Model, BMC Bioinformatics, 2010, doi:10.1186/1471-2105-11-346)。各OGLについて、ヌクレオチド配列を、NuPoP(商標)ソフトウェアに供し、ヌクレオソーム占有率スコアを計算した。
a.ダイズ染色体などの双子葉染色体の各々におけるセントロメアの位置、および染色体アームの長さに関する情報を、双子葉ゲノムデータベース、例えば、Soybean Genome Database(www.soybase.org)から抽出した。各OGLについて、OGL配列からそれが位置する染色体のセントロメアまでのゲノム距離が(bpで)測定される。染色体内のOGLの相対的位置は、それが存在する特定の染色体アームの長さに対する、セントロメアまでのそのゲノム距離の比率として示される。
a.各OGLについて、OGL位置の周囲の1Mbゲノムウインドウが規定され、そのゲノム位置がこのウインドウとオーバーラップする、双子葉1Kb OGLデータセット中のOGLの数が、集計される。
a)この非遺伝子配列は、配列内に1%よりも多いDNAメチル化を含まない;
b)この非遺伝子配列は、ダイズ染色体セントロメアから0.211〜0.976のゲノム距離の比率の相対的位置値を有する;
c)この非遺伝子配列は、25.62〜43.76%のグアニン/シトシンパーセント含量範囲を有する;および
d)この非遺伝子配列は、約1Kb長〜約4.4Kb長である。
一実施形態によれば、ポリヌクレオチドドナー配列を挿入するための高度に望ましい位置として、ダイズ植物などの双子葉植物のゲノム遺伝子座を同定した後で、1または複数の目的の核酸が、同定されたゲノム遺伝子座中に挿入され得る。一実施形態では、この目的の核酸は、外因性遺伝子配列または他の望ましいポリヌクレオチドドナー配列を含む。別の一実施形態では、ポリヌクレオチドドナー配列を挿入するための高度に望ましい位置として、ダイズ植物などの双子葉植物のゲノム遺伝子座を同定した後で、1または複数の目的の核酸または最適な非遺伝子ダイズゲノム遺伝子座が、任意選択で、同定されたゲノム遺伝子座中への目的のDNAの引き続く組込みと共に、欠失、切除または除去され得る。一実施形態では、最適な非遺伝子ダイズゲノム遺伝子座中への目的の核酸の挿入は、外因性遺伝子配列または他の望ましいポリヌクレオチドドナー配列の除去、欠失または切除を含む。
宿主細胞中にDNA構築物としてポリヌクレオチドドナー配列およびヌクレアーゼ配列を導入するための周知の手順のいずれかが、本開示に従って使用され得る。これらには、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、PEG、エレクトロポレーション、超音波的方法(例えば、ソノポレーション)、リポソーム、マイクロインジェクション、ネイキッドDNA、プラスミドベクター、ウイルスベクター、エピソームおよび組込みの両方、ならびにクローニングされたゲノムDNA、cDNA、合成DNAまたは他の外来遺伝子材料を宿主細胞中に導入するための他の周知の方法のいずれかの使用が含まれる(例えば、Sambrook et al.、上記を参照のこと)。使用される特定の核酸挿入手順は、選択されたタンパク質を発現することが可能な宿主細胞中に少なくとも1つの遺伝子を首尾よく導入することが可能であることだけが必要である。
a.目的の核酸の挿入のための標的として、最適な非遺伝子ダイズ遺伝子座を選択するステップ;
b.部位特異的ヌクレアーゼをダイズ植物細胞などの双子葉植物細胞中に導入するステップであって、この部位特異的ヌクレアーゼは、非遺伝子配列を切断する、ステップ;
c.目的のDNAをこの植物細胞中に導入するステップ;および
d.前記非遺伝子配列に標的化された目的のDNAを含むトランスジェニック植物細胞を選択するステップ。
a.目的の核酸の挿入のための標的として、最適な非遺伝子ダイズ遺伝子座を選択するステップ;
b.部位特異的ヌクレアーゼをダイズプロトプラスト細胞などの双子葉プロトプラスト細胞中に導入するステップであって、この部位特異的ヌクレアーゼは、非遺伝子配列を切断する、ステップ;
c.目的のDNAをダイズプロトプラスト細胞などの双子葉プロトプラスト細胞中に導入するステップ;および
d.前記非遺伝子配列に標的化された目的のDNAを含むダイズプロトプラスト細胞などのトランスジェニック双子葉プロトプラスト細胞を選択するステップ。
a.この非遺伝子配列は、少なくとも1Kb長であり、配列内に1%よりも多いDNAメチル化を含まない;
b.この非遺伝子配列は、ダイズゲノムなどの双子葉ゲノム内で、0.01574〜83.52cM/Mbの比率の組換えを示す;
c.この非遺伝子配列は、ダイズゲノムなどの双子葉ゲノムの、0〜0.494レベルのヌクレオソーム占有率を示す;
d.この非遺伝子配列は、ダイズゲノムなどの双子葉ゲノム中に含まれる任意の他の配列と、40%未満の配列同一性を共有する;
e.この非遺伝子配列は、ダイズなどの双子葉染色体セントロメアから0〜0.99682のゲノム距離の比率の相対的位置値を有する;
f.非遺伝子配列は、14.4〜45.9%のグアニン/シトシンパーセント含量範囲を有する;
g.この非遺伝子配列は、遺伝子配列の近位に位置する;および
h.前記非遺伝子配列を含む、ダイズゲノム配列などの双子葉ゲノム配列の1Mb領域は、1または複数のさらなる非遺伝子配列を含む。一実施形態では、この最適な非遺伝子ダイズ遺伝子座は、クラスター1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、2、3、4、5、6、7、8、9、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31または32の遺伝子座から選択される。
本明細書に開示されるドナー分子は、標的化された相同性非依存的方法および/または相同性依存的方法を介して、細胞のゲノム中に組み込まれる。かかる標的化された組込みのために、このゲノムは、ヌクレアーゼ、例えば、DNA結合ドメイン(例えば、ジンクフィンガー結合ドメイン、CRISPRまたはTALエフェクタードメインが、所定の切断部位またはその近傍において標的部位を結合するように操作される)とヌクレアーゼドメイン(例えば、切断ドメインまたは切断ハーフドメイン)との間での融合物を使用して、所望の位置(単数または複数)において切断される。特定の実施形態では、各々がDNA結合ドメインおよび切断ハーフドメインを含む2つの融合タンパク質が、細胞中で発現され、機能的切断ドメインが再構成されDNAが標的部位の近傍で切断されるような方法で、並置された標的部位に結合する。一実施形態では、切断は、2つのDNA結合ドメインの標的部位間で生じる。これらのDNA結合ドメインの一方または両方が、操作され得る。米国特許第7,888,121号;米国特許出願公開第20050064474号ならびに国際特許公開WO05/084190、WO05/014791およびWO03/080809もまた参照のこと。
ダイズ植物などの双子葉植物のゲノム遺伝子座中への標的化された挿入のためのポリヌクレオチドドナー配列は、典型的には、長さが約10〜約5,000ヌクレオチドの範囲である。しかし、約5、6、7、8、9、10、11および12Kb長の配列を含む、最大で20,000ヌクレオチドの実質的により長いヌクレオチドが、使用され得る。さらに、ドナー配列は、置き換えられた領域と相同ではない配列を含むベクター分子を含み得る。一実施形態では、この目的の核酸は、標的化されたゲノム遺伝子座と相同性を共有する1または複数の領域を含む。一般に、目的の核酸配列の相同な領域は、組換えが望まれるゲノム配列と少なくとも50%の配列同一性を有する。特定の実施形態では、目的の核酸の相同な領域は、標的化されたゲノム遺伝子座中に位置する配列と、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%または99.9%の配列同一性を共有する。しかし、1%と100%との間の任意の値の配列同一性が、目的の核酸の長さに依存して存在し得る。
1.有害生物または疾患に対する抵抗性を付与する遺伝子またはコード配列(例えば、iRNA)
(A)植物疾患抵抗性遺伝子。植物防御は、植物における疾患抵抗性遺伝子(R)の産物と病原体における対応する非病原性(Avr)遺伝子の産物との間の特異的相互作用によって活性化される場合が多い。植物変種は、特定の病原体株に対して抵抗性である植物を操作するために、クローニングされた抵抗性遺伝子で形質転換され得る。かかる遺伝子の例には、クラドスポリウム・フルブム(Cladosporium fulvum)に対する抵抗性に関するトマトCf−9遺伝子(Jones et al., 1994 Science 266:789)、シュードモナス・シリンガエ(Pseudomonas syringae)pv.tomatoに対する抵抗性に関するタンパク質キナーゼをコードするトマトPto遺伝子(Martin et al., 1993 Science 262:1432)、およびシュードモナス・シリンガエ(Pseudomonas syringae)に対する抵抗性に関するシロイヌナズナ属(Arabidopsis)RSSP2遺伝子(Mindrinos et al., 1994 Cell 78:1089)が含まれる。
(A)成長点(growing point)または成長点(meristem)を阻害する除草剤、例えば、イミダザリノン(imidazalinone)、スルホンアニリド(sulfonanilide)またはスルホニルウレア除草剤に対する抵抗性または耐性をコードする遺伝子。このカテゴリー中の例示的な遺伝子は、アセトヒドロキシ酸シンターゼ(AHAS)酵素(Miki et al., 1990 Theor. Appl. Genet. 80:449)としても公知の、変異体アセト乳酸シンターゼ(ALS)(Lee et al., 1988 EMBOJ. 7:1241)をコードする。
(A)例えば、植物のステアリン酸含量を増加させるためにアンチセンス遺伝子またはステアロイル−ACPデサチュラーゼでダイズまたはアブラナ属(Brassica)を形質転換することによって改変された脂肪酸代謝(Knultzon et al., 1992) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89:2624。
(1)フィターゼコード遺伝子、例えば、クロコウジカビ(Aspergillus niger)フィターゼ遺伝子(Van Hartingsveldt et al., 1993 Gene 127:87)の導入は、フィテート(phytate)の分解を増強し、形質転換された植物により多くの遊離ホスフェート(phosphate)を追加する。
本明細書に開示するように、本開示は、少なくとも1Kbの最適な非遺伝子ダイズゲノム配列および目的のDNAを含む組換えゲノム配列を提供し、ここで、この挿入された目的のDNAは、前記非遺伝子配列中に挿入されている。一実施形態では、目的のDNAは、分析ドメイン、有害生物または疾患に対する抵抗性を付与する遺伝子もしくはコード配列(例えば、iRNA)、除草剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、または付加価値形質を付与するもしくはそれに寄与する遺伝子であり、この最適な非遺伝子ダイズゲノム配列は、以下の特徴を含む:
a.この非遺伝子配列は、約1Kb長〜約5.7Kb長であり、メチル化されたポリヌクレオチドを含まない;
b.この非遺伝子配列は、ダイズ植物などの双子葉植物のゲノム内で、0.01574〜83.52cM/Mbの比率の組換えを示す;
c.この非遺伝子配列は、ダイズゲノムなどの双子葉ゲノムの、0〜0.494レベルのヌクレオソーム占有率を示す;
d.この非遺伝子配列は、ダイズゲノムなどの双子葉ゲノム中に含まれる任意の他の配列と、40%未満の配列同一性を共有する;
e.この非遺伝子配列は、ダイズ染色体中心などの双子葉染色体セントロメアから0〜0.99682のゲノム距離の比率の相対的位置値を有する;
f.この非遺伝子配列は、14.4〜45.9%のグアニン/シトシンパーセント含量範囲を有する;
g.この非遺伝子配列は、ネイティブ非遺伝子配列を含む連続するゲノムDNAの40Kb以内で、ダイズコード配列などの既知または予測された双子葉コード配列を含む遺伝子配列の近位に位置する;および
h.この非遺伝子配列は、第2の非遺伝子配列を少なくとも含むゲノム配列などの双子葉ゲノム配列の1Mb領域中に位置する。
組換えの最適な非遺伝子ダイズ遺伝子座を含むトランスジェニック植物もまた、本開示の一実施形態に従って提供される。かかるトランスジェニック植物は、当業者に公知の技術を使用して調製され得る。
[実施例]
ダイズゲノムを、具体的基準を使用するバイオインフォマティクスアプローチを用いてスクリーニングして、ポリヌクレオチドドナーを標的化するための最適なゲノム遺伝子座を選択した。ゲノム遺伝子座を選択するために使用した具体的基準は、植物ゲノム内の導入遺伝子の最適な発現についての検討、部位特異的DNA結合タンパク質によるゲノムDNAの最適な結合についての検討、およびトランスジェニック植物製品の開発要求を使用して開発した。ゲノム遺伝子座を同定および選択するために、ダイズゲノムのゲノムおよびエピゲノムデータセットを、バイオインフォマティクスアプローチを使用してスキャンした。ゲノムおよびエピゲノムデータセットのスクリーニングは、以下の基準を満たした選択された遺伝子座を生じた:1)低メチル化され、1Kb長よりも大きい;2)ポリヌクレオチドドナーの部位特異的ヌクレアーゼ媒介性組込みを介して標的化可能;3)農学的に中立または非遺伝子;4)組み込まれた導入遺伝子がそこから発現され得る領域;および5)遺伝子座内/遺伝子座の周囲の組換えを有する領域。したがって、合計7,018のゲノム遺伝子座(配列番号1〜配列番号7,018)を、これらの具体的基準を使用して同定した。これらの具体的基準はさらに、以下に詳細に記載されている。
ダイズゲノムをスキャンして、DNAが低メチル化された1Kbよりも大きい最適なゲノム遺伝子座を選択した。ダイズ(Glycine max)cultivar Williams82から単離した根組織および苗条組織のDNAメチル化プロファイルを、ハイスループット全ゲノム配列決定アプローチを使用して構築した。抽出したDNAを、メチル化されていないシトシンをウラシルに変換するが、メチル化されたシトシンには影響を与えないバイサルファイト処理に供し、次いで、Illumina HiSeqテクノロジーを使用して配列決定した(Krueger, F. et al. DNA methylome analysis using short bisulfite sequencing data. Nature Methods 9, 145-151 (2012))。生配列決定読み取りを、Krueger F, Andrews SR (2011) Bismark: a flexible aligner and methylation caller for Bisulfite-Seq applications. Bioinformatics 27: 1571-1572)に記載されるBismark(商標)マッピングソフトウェアを使用して収集し、ダイズc.v.Williams82参照ゲノムに対してマッピングした。
ダイズc.v.WILLIAMS82において同定された低メチル化された部位をさらに分析して、どの部位がポリヌクレオチドドナーの部位特異的ヌクレアーゼ媒介性組込みを介して標的化可能であるかを決定した。ダイズ(Glycine max)は、そのゲノムの歴史においてゲノム重複を受けた古倍数体(paleopolyploid)作物であることが公知である(Jackson et al Genome sequence of the palaeopolyploid soybean, Nature 463, 178-183 (2010))。ダイズゲノムは、メチル化され、高いレベルの配列重複を有する高度に反復性のDNAの長いストレッチを含むことが、当該分野で公知である。ダイズゲノム中の既知の反復性領域の注釈付け情報を、Soybean Genome Database(www.soybase.org、Shoemaker, R.C. et al. SoyBase, the USDA-ARS soybean genetics and genomics database. Nucleic Acids Res. 2010 Jan;38(Database issue):D843-6.)から収集した。
ダイズc.v.William82において同定された低メチル化された部位をさらに分析して、どの部位が農学的に中立または非遺伝子であったかを決定した。このように、上記低メチル化された部位をスクリーニングして、任意の既知または予測された内因性ダイズc.v.William82コード配列とオーバーラップしたまたは含んだ任意の部位を除去した。この目的のために、既知の遺伝子の注釈付けデータおよび発現配列タグ(EST)データのマッピング情報を、Soybean Genomic Database(www.soybase.org−バージョン1.1遺伝子モデルを使用した、Jackson et al Genome sequence of the palaeopolyploid soybean Nature 463, 178-183 (2010))から収集した。オープンリーディングフレームに対してすぐ2Kb上流および1Kb下流の任意のゲノム領域もまた検討した。これらの上流領域および下流領域は、遺伝子機能に重要な既知または未知の保存された調節エレメントを含み得る。上に以前に記載した低メチル化された部位を、既知の遺伝子(2Kb上流および1Kb下流の領域を含む)およびESTの存在について分析した。既知の遺伝子(2Kb上流および1Kb下流の領域を含む)またはESTとアラインしたまたはオーバーラップした任意の低メチル化された部位を、下流の分析から除去した。
ダイズc.v.Williams82において同定された低メチル化された部位をさらに分析して、どの部位が発現されたダイズ遺伝子の近位内に存在したかを決定した。ダイズ遺伝子の転写物レベルでの発現を、Mortazavi et al., Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat Methods. 2008;5(7):621-628およびShoemaker RC et al., RNA-Seq Atlas of Glycine max: a guide to the soybean Transcriptome. BMC Plant Biol. 2010 Aug 5;10:160に記載されるように、RNAseq(商標)テクノロジーを使用して、ダイズc.v.Williams82の根組織および苗条組織から生成したトランスクリプトームプロファイリングデータを分析することによって測定した。各低メチル化された部位について、分析を完了して、低メチル化された部位の近位にある40Kb領域内に存在する任意の注釈付きの遺伝子、および低メチル化された部位の近位に位置する注釈付きの遺伝子の平均発現レベルを同定した。ゼロでない平均発現レベルを有する注釈付きの遺伝子から40Kbよりも遠くに位置した低メチル化された部位は、発現されたダイズ遺伝子の近位でないことが決定され、さらなる分析から除去した。
ダイズc.v.Williams82において同定された低メチル化された部位をさらに分析して、どの部位が組換えの証拠を有し、従来の育種を介した他の系統のダイズ中への最適なゲノム遺伝子座の浸透***雑を促進できたかを決定した。多様なダイズ遺伝子型は、農学的に目的の形質を含む新たな改善されたダイズ系統を開発するために、従来の育種の間に慣用的に交配される。このように、導入遺伝子の植物媒介性の形質転換を介してダイズ系統内の最適なゲノム遺伝子座中に浸透***雑される農学的形質は、従来の植物育種の間の減数***組換えを介して、他のダイズ系統、特に精鋭の系統中にさらに浸透***雑されることが可能であるはずである。上記低メチル化された部位をスクリーニングして、あるレベルの減数***組換えを有した部位を同定および選択した。組換え「コールドスポット」として特徴付けられた染色体領域内に存在する任意の低メチル化された部位を、同定および除去した。ダイズでは、これらのコールドスポットを、組換え近交系マッピング集団(Williams 82×PI479752)から生成されたマーカーデータセットを使用して規定した。このデータセットは、ダイズ(Glycine max)参照ゲノム配列に物理的にマッピングされ得る約16,600のSNPマーカーからなった。
上記選択基準の適用は、ダイズゲノムからの、合計90,325の最適なゲノム遺伝子座の同定を生じた。表2は、同定された最適なゲノム遺伝子座の長さをまとめる。これらの最適なゲノム遺伝子座は、以下の特徴を有する:1)1Kb長よりも大きい低メチル化されたゲノム遺伝子座;2)ポリヌクレオチドドナーの部位特異的ヌクレアーゼ媒介性組込みを介して標的化可能なゲノム遺伝子座;3)農学的に中立または非遺伝子のゲノム遺伝子座;4)導入遺伝子がそこから発現され得るゲノム遺伝子座;および5)ゲノム遺伝子座内の組換えの証拠。表2に記載される全ての最適なゲノム遺伝子座のうち、1Kbよりも大きい最適なゲノム遺伝子座だけをさらに分析し、ドナーポリヌクレオチド配列の標的化のために利用した。これらの最適なゲノム遺伝子座の配列は、配列番号1〜配列番号7,018として開示される。集合的に、これらの最適なゲノム遺伝子座は、本明細書の以下にさらに実証されるように、ドナーポリヌクレオチド配列で標的化され得るダイズゲノム内の位置である。
7,018の同定された最適なゲノム遺伝子座(配列番号1〜配列番号7,018)を、F分布および主成分分析統計方法を使用してさらに分析して、最適なゲノム遺伝子座のグループ分けのための代表的な集団およびクラスターを規定した。
同定された7,018の最適なゲノム遺伝子座を、連続確率分布統計分析を使用して統計的に分析した。連続確率分布統計分析の一実施形態として、F分布検定を完了して、代表的な数の最適なゲノム遺伝子座を決定した。F分布検定分析を、当業者に公知の方程式および方法を使用して完了した。さらなるガイダンスについて、参照によって本明細書に組み込まれるK.M Remund, D. Dixon, DL. Wright and LR. Holden. Statistical considerations in seed purity testing for transgenic traits. Seed Science Research (2001) 11, 101-119に記載されるF分布検定分析は、F分布検定の非限定的な一例である。このF分布検定は、最適なゲノム遺伝子座のランダムサンプリングを仮定し、その結果、任意の非妥当遺伝子座は、7,018の最適なゲノム遺伝子座にわたって均等に分布し、サンプリングされた最適なゲノム遺伝子座の数は、7,018の最適なゲノム遺伝子座の総集団の10%以下である。
次に、主成分分析(PCA)統計方法を完了して、7,018の同定された最適なゲノム遺伝子座を含むデータセットの類似性および差異をさらに評価および可視化して、標的化検証のための多様な遺伝子座のサンプリングを可能にした。PCAには、より大きな数の相関変数を主成分と呼ばれるより少ない数の無相関な変数へと変形する数学的アルゴリズムが関与する。
a.このデータセット中の最適なゲノム遺伝子座の長さは、最小1,000Bp〜最大5,713Bpの範囲であった。
a.ダイズでは、染色***置についての組換え頻度を、複数のマッピング集団から生成された内部高解像度マーカーデータセットを使用して規定した。
b.染色体にわたるマーカーの任意の対の間での組換え頻度を、マーカー間の遺伝的距離(センチモルガン(cM))の、マーカー間の物理的距離(Mb)に対する比率に基づいて計算した。例えば、マーカーの対の間の遺伝的距離が1cMであり、マーカーの同じ対の間の物理的距離が2Mbである場合、計算された組換え頻度は、0.5cM/Mbである。各最適なゲノム遺伝子座について、少なくとも1Mb離れたマーカーの対を選択し、この様式で組換え頻度を計算した。これらの組換え値は、最小0.01574cM/Mb〜最大83.52cM/Mbの範囲であった。
a.各最適なゲノム遺伝子座について、最適なゲノム遺伝子座のヌクレオチド配列を、デフォルトパラメーター設定を使用するNCBI BLAST(商標)+ソフトウェア(バージョン2.2.25)実行を使用するBLAST(商標)ベースの相同性検索を使用して、ダイズc.v.Williams82ゲノムに対してスキャンした(Stephen F. Altschul et al (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402)。これらの最適なゲノム遺伝子座配列は、ダイズc.v.Williams82ゲノムから同定されるので、この検索を介して同定された第1のBLAST(商標)ヒットは、ダイズc.v.Williams82配列自体を示す。各最適なゲノム遺伝子座配列についての第2のBLAST(商標)ヒットを同定し、このヒットのアラインメントカバー度(BLAST(商標)ヒットによってカバーされる最適なゲノム遺伝子座のパーセントとして示される)を、ダイズゲノム内の最適なゲノム遺伝子座配列の独自性の尺度として使用した。第2のBLAST(商標)ヒットについてのこれらのアラインメントカバー度値は、最小0%〜最大39.97%の配列同一性の範囲であった。より高いレベルの配列同一性においてアラインしたいずれの配列も、考慮しなかった。
a.ダイズゲノム中の既知の遺伝子の遺伝子注釈付け情報および位置を、Soybean Genome Database(www.soybase.orgにおいて入手可能−バージョン1.1遺伝子モデルを使用した、Jackson et al Genome sequence of the palaeopolyploid soybean, Nature 463, 178-183 (2010))から抽出した。各最適なゲノム遺伝子座について、上流位置および下流位置の両方を考慮して最も近い注釈付きの遺伝子を同定し、最適なゲノム遺伝子座配列とこの遺伝子との間の距離を測定した(Bp)。例えば、最適なゲノム遺伝子座が染色体Gm01中の2,500位から3,500位までに位置し、この最適なゲノム遺伝子座に対して最も近い遺伝子が染色体Gm01中の5,000位から6,000位までに位置する場合、最適なゲノム遺伝子座からこの最も近い遺伝子までの距離は、1500Bpであると計算される。7,018全ての最適なゲノム遺伝子座データセットについてのこれらの値は、最小1,001Bp〜最大39,482Bpの範囲であった。
a.各最適なゲノム遺伝子座について、ヌクレオチド配列を分析して、存在するグアニン塩基およびシトシン塩基の数を推定した。この計数は、各最適なゲノム遺伝子座の配列長さの百分率として示され、GC%についての尺度を提供する。ダイズの最適なゲノム遺伝子座データセットについてのこれらのGC%値は、14.4%〜45.9%の範囲である。
a.ダイズc.v.Williams82ゲノム中の既知の遺伝子の遺伝子注釈付け情報および位置を、Soybean Genome Databaseから抽出した。7,018の最適なゲノム遺伝子座配列の各々について、最適なゲノム遺伝子座配列の周囲の40Kbウインドウを規定し、このウインドウとオーバーラップする位置を有する注釈付きの遺伝子の数を計数した。これらの値は、40Kb近隣内に最小1遺伝子〜最大18遺伝子の範囲であった。
a.ダイズ遺伝子の転写物レベルでの発現を、RNAseq(商標)テクノロジーを使用して、ダイズc.v.Williams82の根組織および苗条組織から生成した利用可能なトランスクリプトームプロファイリングデータを分析することによって測定した。ダイズc.v.Williams82ゲノム中の既知の遺伝子の遺伝子注釈付け情報および位置を、Soybean Genome Databaseから抽出した。各最適なゲノム遺伝子座について、最適なゲノム遺伝子座の周囲の40Kb近隣に存在したダイズc.v.Williams82ゲノム内の注釈付きの遺伝子を同定した。遺伝子の各々についての発現レベルを、上述の引用に記載されたトランスクリプトームプロファイルから抽出し、平均遺伝子発現レベルを計算した。ダイズのゲノム内の全ての遺伝子の発現値は大きく変動する。7,018の最適なゲノム遺伝子座データセットの全てについての平均発現値は、最小0.000415〜最大872.7198の範囲であった。
a.特定のヌクレオチド配列についてのヌクレオソーム占有率のレベルを理解することで、染色体機能および配列のゲノム情況についての情報が提供される。NuPoP(商標)統計パッケージを使用して、任意のサイズのゲノム配列について、ヌクレオソーム占有率および最も確からしいヌクレオソームポジショニングマップを予測した(Xi, L., Fondufe-Mittendor, Y., Xia, L., Flatow, J., Widom, J. and Wang, J.-P., Predicting nucleosome positioning using a duration Hidden Markov Model, BMC Bioinformatics, 2010, doi:10.1186/1471-2105-11-346.)。7,018の最適なゲノム遺伝子座の各々について、ヌクレオチド配列を、NuPoP(商標)ソフトウェアを用いた分析に供し、ヌクレオソーム占有率スコアを計算した。ダイズの最適なゲノム遺伝子座データセットについてのこれらのヌクレオソーム占有率スコアは、最小0〜最大0.494の範囲であった。
a.セントロメアは、2つの姉妹染色分体を接続する、染色体上の領域である。セントロメアのいずれかの側の染色体の部分は、染色体アームとして公知である。20全てのダイズ染色体上のセントロメアのゲノム位置を、公開されたダイズc.v.Williams82参照配列において同定した(Jackson et al Genome sequence of the palaeopolyploid soybean Nature 463, 178-183 (2010))。ダイズ染色体の各々におけるセントロメアの位置および染色体アームの長さに関する情報を、Soybean Genome Databaseから抽出した。各最適なゲノム遺伝子座について、最適なゲノム遺伝子座配列からそれが位置する染色体のセントロメアまでのゲノム距離が測定される(Bp)。染色体内の最適なゲノム遺伝子座の相対的位置は、それが存在する特定の染色体アームの長さに対する、セントロメアまでのそのゲノム距離の比率として示される。ダイズの最適なゲノム遺伝子座データセットについてのこれらの相対的位置値は、最小0〜最大0.99682のゲノム距離の比率の範囲であった。
a.各最適なゲノム遺伝子座について、最適なゲノム遺伝子座位置の周囲の1Mbゲノムウインドウを規定し、考慮した最適なゲノム遺伝子座を含む、この領域内に存在するまたはこの領域とオーバーラップする他のさらなる最適なゲノム遺伝子座の数を計算した。1Mb中の最適なゲノム遺伝子座の数は、最小1〜最大49の範囲であった。
合計32のゲノム遺伝子座を、32の別個のクラスター内にクラスター化された7,018のゲノム遺伝子座から、ドナーポリヌクレオチド配列による標的化のために同定および選択した。32のクラスターの各々について、代表的ゲノム遺伝子座(表4中に上記したようにクラスターの重心に最も近い)または標的化系統との相同性を有するさらなる遺伝子座を選択した。これらのさらなる最適なゲノム遺伝子座を、ダイズ(Glycine max)c.v.Maverick(形質転換および標的化スクリーニング系統)およびダイズ(Glycine max)c.v.Williams82(参照系統)の両方についてのゲノムDNA配列データからなる全ゲノムデータベースに対して、7,018全ての選択された最適なゲノム配列を最初にスクリーニングすることによって選択して、両方の系統由来のゲノムにおけるカバー度(どのくらいの最適なゲノム遺伝子座が両方のゲノム中に存在したか)および配列同一性の百分率を決定した。Williams82ゲノムデータベース中の100%カバー度(両方のゲノム間でアラインされた最適な遺伝子座の配列全体長さ)および100%同一性を有する最適なゲノム遺伝子座を、標的化検証のために選択した。他の基準、例えば、最適なゲノム遺伝子座のゲノム遺伝子座サイズ、独自性の程度、GC%含量および染色体分布もまた、さらなる最適なゲノム遺伝子座を選択する際に考慮に入れた。32の選択された最適なゲノム遺伝子座の染色***置および各ダイズの最適なゲノム遺伝子座の特定のゲノム立体配置は、それぞれ図3および表5に示される。
代表的ゲノム遺伝子座の同定されたDNA配列に対するジンクフィンガータンパク質を、以前に記載されたように設計した。例えば、Urnov et al., (2005) Nature 435:646-551を参照のこと。例示的な標的配列および認識らせんは、表7(認識らせん領域設計)および表8(標的部位)に示される。表8では、ZFP認識らせんによって接触される標的部位中のヌクレオチドは、大文字で示され、非接触ヌクレオチドは小文字で示される。ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)標的部位を、以前に記載した32の選択された最適なゲノム遺伝子座の全てについて設計した。多数のZFP設計を開発し、試験して、上記のようにダイズにおいて同定および選択された32の異なる代表的ゲノム遺伝子座標的部位と、最も高いレベルの効率で結合したフィンガーを同定した。最も高いレベルの効率でジンクフィンガー認識配列と結合した特異的ZFP認識らせん(表7)を、ダイズゲノム内のドナー配列の標的化および組込みに使用した。
ZFN遺伝子発現構築物を含むプラスミドベクターを、当該分野で一般に公知の技能および技術を使用して、設計および完了した(例えば、AusubelまたはManiatisを参照のこと)。各ZFNコード配列を、ジンクフィンガーヌクレアーゼの上流に位置付けたopaque−2核局在化シグナルをコードする配列(Maddaloni et al., (1989) Nuc. Acids Res. 17:7532)に融合させた。非正準ジンクフィンガーコード配列を、IIS型制限酵素FokIのヌクレアーゼドメイン(Wah et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:10564-10569の配列のアミノ酸384〜579)に融合させた。この融合タンパク質の発現を、キャッサバ葉脈モザイクウイルス由来の強い構成的プロモーターによって駆動した。発現カセットは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)ORF23由来の3’UTRもまた含む。トセア・アシグナ(Thosea asigna)ウイルス由来のヌクレオチド配列をコードする自己加水分解性2A(Szymczak et al., (2004) Nat Biotechnol. 22:760-760)を、構築物中にクローニングされた2つのジンクフィンガーヌクレアーゼ融合タンパク質間に付加した。
ジンクフィンガーヌクレアーゼベクターのサブセットを、自動化DNA構築パイプラインを介してクローニングした。全体として、自動化パイプラインは、以前に記載したのと同一のZFN構造を有するベクター構築を生じた。ZFNのDNA結合特異性を付与する各ジンクフィンガーモノマーを、KPFアミノ酸モチーフにおいて2〜3の独自の配列へと分割した。ZFN断片の5’末端および3’末端の両方を、BsaI認識部位(GGTCTCN)および誘導されたオーバーハングを含めることで改変した。オーバーハングを、6〜8部のアセンブリのみが所望の全長発現クローンを生じるように、分布させた。改変されたDNA断片を、de novo合成した(Synthetic Genomics Incorporated、La Jolla、CA)。単一の双子葉骨格pDAB118796を、ダイズZFN構築の全てにおいて使用した。これは、キャッサバモザイクウイルスプロモーターおよびOpaque2 NLSならびにFokIドメインおよびアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)由来のOrf23 3’UTRを含んだ。枯草菌(Bacillus subtilis)由来のBsaI隣接SacB遺伝子を、Opaque2 NLSとFokIドメインとの間にクローニングした。推定ライゲーション事象を、スクロース含有培地上にプレートした場合、このSacBカセットは、ベクター骨格の夾雑を低減または排除する陰性選択因子として作用する。全ての構築において反復して利用した第2の部分は、pDAB117443であった。このベクターは、全てBsaI部位が隣接した、第1のモノマーFok1ドメイン、T2Aスタッター配列および第2のモノマーOpaque2 NLSを含む。
大きい数の遺伝子座の迅速な試験を支持するために、新規のフレキシブルな普遍的ドナー系配列を設計し、構築した。この普遍的ドナーポリヌクレオチド配列は、ハイスループットベクター構築方法論および分析と適合性であった。この普遍的ドナー系は、少なくとも3つのモジュラードメイン:可変ZFN結合ドメイン、非可変分析およびユーザーが規定した特徴ドメイン、ならびにベクタースケールアップのための単純なプラスミド骨格から構成された。この非可変普遍的ドナーポリヌクレオチド配列は、全てのドナーに共通し、全てのダイズ標的部位にわたって使用され得るアッセイの有限のセットの設計を可能にし、したがって、標的化の評価における均一性を提供し、分析サイクル回数を低減させた。これらのドメインのモジュラー的性質は、ハイスループットなドナーアセンブリを可能にした。さらに、この普遍的ドナーポリヌクレオチド配列は、下流の分析を単純化し、結果の解釈を向上させることを目的とした他の独自の特徴を有する。これは、診断的に予測されたサイズへのPCR産物の消化を可能にする非対称制限部位配列を含んだ。PCR増幅において問題となることが予測される二次構造を含む配列を除去した。この普遍的ドナーポリヌクレオチド配列は、サイズが小さかった(3.0Kb未満)。最後に、この普遍的ドナーポリヌクレオチド配列を、時宜を得た様式で大量の試験DNAの嵩を増やす高コピーpUC19骨格上に構築した。
ダイズ(Glycine max)c.v.Maverickプロトプラストへの送達の前に、各ZFN構築物のためのプラスミドDNAを、供給業者の指示に従ってPURE YIELD PLASMID MAXIPREP SYSTEM(登録商標)(Promega Corporation、Madison、WI)またはPLASMID MAXI KIT(登録商標)(Qiagen、Valencia、CA)を使用して、大腸菌(E. coli)の培養物から調製した。
プロトプラストを、葉外植片から生成したカルスから誘導されたMaverick懸濁培養物から単離した。懸濁物を、3%(w/v)スクロース、0.5mg/Lの2,4−Dおよび7gのバクトアガー(bactoagar)、pH5.7を含む新鮮なLS培地(Linsmaier and Skoog 1965)中で7日毎に継代した。単離のために、継代の7日後の30ミリリットルのMaverick懸濁培養物を、50mlコニカルチューブに移し、200gで3分間遠心分離して、1チューブ当たり約10mlの定着細胞体積(SCV)を得た。上清を除去し、20ミリリットルの酵素溶液(MMG溶液(4mM MES、0.6Mマンニトール、15mM MgCl2、pH6.0)中0.3%ペクトリアーゼ(320952;MP Biomedicals)、3%セルラーゼ(「Onozuka」R10(商標);Yakult Pharmaceuticals、Japan))を、4SCVの懸濁細胞毎に添加し、チューブをParafilm(商標)で包んだ。これらのチューブを、プラットホームロッカー上に一晩(約16〜18時間)置き、消化された細胞のアリコートを、顕微鏡的に評価して、細胞壁の消化が十分であったことを確実にした。
継代の7日後の30ミリリットルのダイズc.v.Maverick懸濁培養物を、50mlコニカル遠心分離チューブに移し、200gで3分間遠心分離して、1チューブ当たり約10mlの定着細胞体積(SCV)を得た。細胞ペレットを破壊することなく上清を除去した。20ミリリットルの酵素溶液(MMG溶液(4mM MES、0.6Mマンニトール、15mM MgCl2、pH6.0)中の0.3%ペクトリアーゼ(320952;MP Biomedicals)、3%セルラーゼ(「Onozuka」R10(商標);Yakult Pharmaceuticals、Japan))を、4SCVの懸濁細胞毎に添加し、チューブをParafilm(商標)で包んだ。これらのチューブを、プラットホームロッカー上に一晩(約16〜18時間)置いた。次の朝、消化された細胞のアリコートを、顕微鏡的に評価して、細胞壁の消化が十分であったことを確実にした。
細胞/酵素溶液を、100μM細胞ストレーナーを介して緩徐に濾過した。この細胞ストレーナーを、10mlのW5+培地(1.82mM MES、192mM NaCl、154mM CaCl2、4.7mM KCl、pH6.0)で濯いだ。濾過ステップを、70μMのスクリーンを使用して反復した。最終体積を、10mlのW5+培地を添加することによって40mlにした。これらの細胞を、チューブを反転させることによって混合した。これらのプロトプラストを、細胞を含む50mlコニカル遠心分離チューブの底にクッション溶液を添加することによって、8mlのスクロースクッション溶液(500mMスクロース、1mM CaCl2、5mM MES−KOH、pH6.0)上に緩徐に層状化した。これらのチューブを、スイングバケットローター中で350×gで15分間遠心分離した。5mlのピペットチップを使用して、プロトプラストバンド(約7〜8ml)を緩徐に取り出した。次いで、これらのプロトプラストを、50mlコニカルチューブに移し、25mlのW5+洗浄を添加した。これらのチューブを緩徐に反転させ、200gで10分間遠心分離した。上清を除去し、10mlのMMG溶液を添加し、チューブを緩徐に反転させて、プロトプラストを再懸濁した。プロトプラスト密度を、血球計算器またはフローサイトメーターを使用して決定した。典型的には、4PCVの細胞懸濁物は、約200万のプロトプラストを生じる。
プロトプラスト濃度を、MMGで160万/mlに調整した。300μlのプロトプラストアリコート(約500,000のプロトプラスト)を、2ml無菌チューブ中に移した。このプロトプラスト懸濁物を、チューブ中にプロトプラストを移す間に、定期的に混合した。プラスミドDNAを、実験設計に従ってプロトプラストアリコートに添加した。プロトプラストのチューブを含むラックを、各々1分間3回緩徐に反転させて、DNAおよびプロトプラストを混合した。これらのプロトプラストを、室温で5分間インキュベートした。300マイクロリットルのポリエチレングリコール(PEG 4000)溶液(40%エチレングリコール(81240−Sigma Aldrich)、0.3Mマンニトール、0.4M CaCl2)を、これらのプロトプラストに添加し、チューブのラックを、1分間混合し、インキュベーションの間に穏やかに2回反転させて、5分間インキュベートした。1ミリリットルのW5+を、チューブに緩徐に添加し、チューブのラックを、15〜20回反転させた。次いで、これらのチューブを、350gで5分間遠心分離し、ペレットを破壊することなく上清を除去した。1ミリリットルのWI培地(4mM MES 0.6Mマンニトール、20mM KCl、pH6.0)を、各チューブに添加し、ラックを穏やかに反転させてペレットを再懸濁させた。ラックを、アルミホイルで覆い、横倒しにして、23℃で一晩インキュベートした。
プロトプラストおよび形質転換効率の定量化を、Quanta Flow Cytometer(商標)(Beckman−Coulter Inc)を使用して測定した。形質転換のおよそ16〜18時間後、各再現からの100μlをサンプリングし、96ウェルプレート中に置き、WI溶液で1:1希釈した。これらの再現を、3回再懸濁し、100μlを、フローサイトメトリーを使用して定量化した。サンプルを分析に供する前に、これらのサンプルを、200gで5分間遠心分離し、上清を除去し、サンプルを、液体窒素中で急速冷凍した。次いで、これらのサンプルを、分子分析のための処理まで、−80℃の冷凍庫中に置いた。
表5の選択されたゲノム遺伝子座の各々について、ダイズプロトプラストを、緑色蛍光タンパク質(gfp)遺伝子発現対照、ZFN単独、ドナー単独、ならびに1:10の比率(重量で)でのZFNおよびドナーDNAの混合物を含む構築物でトランスフェクトした。50万のプロトプラストのトランスフェクションのためのDNAの総量は、80μgであった。全ての処理を、3つの再現で実施した。使用したgfp遺伝子発現対照は、キャッサバ静脈モザイクウイルスプロモーター−緑色蛍光タンパク質コード配列−アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)ORF24 3’UTR遺伝子発現カセットを含むpDAB7221(図14、配列番号7569)であった。トランスフェクション当たり一貫した量の総DNAを提供するために、サケ***、またはgfp遺伝子含有プラスミドのいずれかを、必要に応じてフィラーとして使用した。典型的な標的化実験では、4μgのZFNを、単独でまたは36μgのドナープラスミドと共にトランスフェクトし、適切な量のサケ***またはpUC19プラスミドDNAを添加して、DNAの全体量を80μgの最終量にした。フィラーとしてgfp遺伝子発現プラスミドを含めると、複数の遺伝子座および再現処理にわたるトランスフェクション品質の評価が可能になる。
選択されたゲノム遺伝子座における標的化を、プロトプラストベースの迅速標的化系(RTA)を使用する、ZFN誘導性のDNA切断およびドナー挿入によって実証した。各ダイズの選択された遺伝子座について、最大6つのZFN設計を生成し、単独でまたは普遍的ドナーポリヌクレオチドと共にのいずれかでプロトプラスト中に形質転換し、ZFN媒介性の切断および挿入を、それぞれ次世代配列決定(NGS)またはジャンクショナル(junctional)(イン−アウト(in-out))PCRを使用して測定した。
非相同末端結合(NHEJ)媒介性のドナー挿入を介した、ダイズの選択されたゲノム遺伝子座標的内の普遍的ドナーポリヌクレオチド配列の標的化の検証を、セミスループット(semi-throughput)プロトプラストベースの迅速試験分析方法を使用して実施した。各ダイズの選択されたゲノム遺伝子座標的について、およそ3〜6のZFN設計を試験し、標的化を、次世代配列決定方法によってZFN媒介性の切断を測定し、ジャンクショナルイン−アウトPCRによってドナー挿入を測定することによって、評価した(図6)。両方のアッセイにおいて陽性であったダイズの選択されたゲノム遺伝子座を、標的化可能な遺伝子座として同定した。
ダイズの選択されたゲノム遺伝子座標的がドナー挿入のために標的化され得るか否かを決定するために、ZFN構築物および普遍的ドナーポリヌクレオチド構築物を、ゲノムDNAを分析のために抽出する前に24時間にわたってインキュベートしたダイズプロトプラストに共送達した。発現されたZFNが、ダイズの選択されたゲノム遺伝子座標的においておよびドナー中での両方で、標的結合部位を切断することができた場合、線状化したドナーを、非相同末端結合(NHEJ)経路を介して、ダイズゲノム中の切断された標的部位中に挿入する。ダイズの選択されたゲノム遺伝子座標的における標的化された組込みの確認を、「イン−アウト」PCR戦略に基づいて完了し、この戦略では、「イン」プライマーは、ネイティブの最適なゲノム遺伝子座における配列を認識し、「アウト」プライマーは、ドナーDNA内の配列に結合する。これらのプライマーは、ドナーDNAがダイズの選択されたゲノム遺伝子座標的において挿入された場合にだけ、PCRアッセイが予測されたサイズを有する増幅産物を産生するように、設計した。このイン−アウトPCRアッセイを、挿入接合部の5’末端および3’末端の両方において実施した。組み込まれたポリヌクレオチドドナー配列の分析に使用したプライマーを、表9に提供する。
全てのPCR増幅を、TAKARA EX TAQ HS(商標)キット(Clonetech、Mountain View、CA)を使用して実施した。第1のイン−アウトPCRを、1×TAKARA EX TAQ HS(商標)緩衝液、0.2mMのdNTPs、0.2μMの「アウト」プライマー、0.05μMの「イン」プライマー(上記普遍的ドナーカセットから設計した)、0.75単位のTAKARA EX TAQ HS(商標)ポリメラーゼおよび6ngの抽出されたダイズプロトプラストDNAを含む25μLの最終反応体積において実施した。次いで、この反応を、94℃で3分間、98℃で12秒間、60℃で30秒間および72℃で1分間の14サイクル、その後72℃で10分間からなるPCRプログラムを使用して完了し、4℃で維持した。最終PCR産物を、可視化のために、1KB PLUS DNA LADDER(商標)(Life Technologies、Grand Island、NY)と共に、アガロースゲル上で泳動した。
このドナープラスミド、およびダイズの選択されたゲノム遺伝子座標的を特異的に切断するように設計された1つのZFNを、ダイズプロトプラスト中にトランスフェクトし、細胞を24時間後に収集した。イン−アウトジャンクショナルPCRによる、対照、ZFN処理されたおよびドナーと共にZFN処理されたプロトプラストから単離されたゲノムDNAの分析は、ZFNによるゲノムDNA切断の結果として、普遍的ドナーポリヌクレオチドの標的化された挿入を示した(表12)。これらの研究は、この普遍的ドナーポリヌクレオチド系が、内因性部位における標的化を評価するため、および候補ZFNをスクリーニングするために使用され得ることを示している。最後に、プロトプラストベースの迅速標的化分析および新規の普遍的ドナーポリヌクレオチド配列系は、ゲノム標的をスクリーニングするための迅速な手段および植物における正確なゲノム操作の試みのためのZFNを提供する。これらの方法は、DNAの二本鎖破断または一本鎖破断を導入する任意のヌクレアーゼを使用して任意の目的の系においてゲノム標的における部位特異的切断およびドナー挿入を評価するために拡張され得る。
一そろいの最適な非遺伝子ダイズゲノム遺伝子座を、7,018の最適な非遺伝子ダイズゲノム遺伝子座から同定して、部位特異的標的化および遺伝子発現カセットの組込みのための複数の遺伝子座を選択し、単一の染色体内の遺伝子発現カセットのスタックを生成した。3つの最適な非遺伝子ダイズゲノム遺伝子座の得られたセットは、本明細書で「メガ遺伝子座」と呼ばれる。以下の基準を使用して、最適な非遺伝子ダイズゲノム遺伝子座のプールをフィルターにかけ、一そろいの最適な非遺伝子ダイズゲノム遺伝子座を選択した:
1)互いに近位(中心の最適な非遺伝子ダイズゲノム遺伝子座の500Kb以内)の、同じ染色体上の少なくとも3つの最適な非遺伝子ダイズゲノム遺伝子座の位置;
2)2Kb長よりも大きく、互いに50Kb以内の、最適な非遺伝子ダイズゲノム遺伝子座;および
3)中心/中央の最適な非遺伝子ダイズゲノム遺伝子座は、4Kb長よりも大きい。
1)3Kb長よりも大きい最適な非遺伝子ダイズゲノム遺伝子座を同定する;
2)根組織および苗条組織における40Kb領域内の近隣の遺伝子の平均発現が、7.46よりも大きく、これは、全ての最適な非遺伝子ダイズゲノム遺伝子座47.7%パーセンタイルである;
3)最適な非遺伝子ダイズゲノム遺伝子座の全てについての平均/中央値を下回る、0.5〜4の組換え頻度;
4)25%よりも高いGC含量。
Claims (50)
- 少なくとも1Kbであり、
soy_OGL_1423(配列番号639)、
soy_OGL_1434(配列番号137)、
soy_OGL_4625(配列番号76)、
soy_OGL_6362(配列番号440)、
soy_OGL_308(配列番号43)、
soy_OGL_307(配列番号566)、
soy_OGL_310(配列番号4236)、
soy_OGL_684(配列番号47)、
soy_OGL_682(配列番号2101)、
soy_OGL_685(配列番号48)
からなる群から選択される非遺伝子配列と少なくとも90%の配列同一性を有する核酸配列、および
前記組換え配列を産生するために前記非遺伝子配列中に挿入されている、目的のDNA
を含む、組換え配列。 - 前記目的のDNAが、ジンクフィンガー標的部位の近位に挿入されている、請求項1に記載の組換え配列。
- 前記目的のDNAが、ジンクフィンガー標的部位の対の間に挿入されている、請求項1に記載の組換え配列。
- 前記目的のDNAが、分析ドメインを含む、請求項1に記載の組換え配列。
- 前記目的のDNAが、ペプチドをコードしない、請求項1に記載の組換え配列。
- 前記目的のDNAが、ペプチドをコードする、請求項1に記載の組換え配列。
- 前記目的のDNAが、殺虫剤抵抗性遺伝子、除草剤耐性遺伝子、窒素使用効率遺伝子、水利用効率遺伝子、栄養品質遺伝子、DNA結合遺伝子および選択可能なマーカー遺伝子を含む遺伝子発現カセットを含む、請求項1に記載の組換え配列。
- 前記目的のDNAが、2以上の遺伝子発現カセットを含む、請求項1に記載の組換え配列。
- 前記非遺伝子配列の2以上が、各々、2以上の組換え配列を産生するために、挿入された目的のDNAを含み、前記2以上の組換え配列が、同じ染色体上に位置する、請求項1に記載の組換え配列。
- 前記目的のDNAおよび/または前記非遺伝子配列が、前記非遺伝子配列中への前記目的のDNAの挿入の間に改変される、請求項1に記載の組換え配列。
- 前記非遺伝子ダイズゲノム遺伝子座が、
soy_OGL_1423(配列番号639)、
soy_OGL_1434(配列番号137)、
soy_OGL_4625(配列番号76)、
soy_OGL_6362(配列番号440)、
soy_OGL_308(配列番号43)、
soy_OGL_307(配列番号566)および
soy_OGL_310(配列番号4236)
からなる群から選択される配列と少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項1から10のいずれか一項に記載の組換え配列。 - 前記非遺伝子ダイズゲノム遺伝子座が、
soy_OGL_308(配列番号43)、
soy_OGL_307(配列番号566)および
soy_OGL_310(配列番号4236)
からなる群から選択される配列と少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項1から10のいずれか一項に記載の組換え配列。 - 請求項1から10のいずれか一項に記載の組換え配列を含む、ダイズ植物、ダイズ植物部分またはダイズ植物細胞。
- 目的のDNAを含むトランスジェニック植物細胞を作製する方法であって、
a.soy_OGL_1423(配列番号639)、
soy_OGL_1434(配列番号137)、
soy_OGL_4625(配列番号76)、
soy_OGL_6362(配列番号440)、
soy_OGL_308(配列番号43)、
soy_OGL_307(配列番号566)、
soy_OGL_310(配列番号4236)、
soy_OGL_684(配列番号47)、
soy_OGL_682(配列番号2101)および
soy_OGL_685(配列番号48)
からなる群から、少なくとも90%の配列同一性を有する標的非遺伝子ダイズゲノム遺伝子座を選択するステップ;
b.前記標的非遺伝子ダイズゲノム遺伝子座を特異的に結合および切断する部位特異的ヌクレアーゼを選択するステップ;
c.前記部位特異的ヌクレアーゼをダイズ植物細胞中に導入するステップ;
d.前記目的のDNAを前記植物細胞中に導入するステップ;
e.前記目的のDNAを前記標的非遺伝子ダイズゲノム遺伝子座中に挿入するステップ;ならびに
f.前記非遺伝子遺伝子座に標的化された前記目的のDNAを含むトランスジェニック植物細胞を選択するステップ
を含む、方法。 - 前記目的のDNAが、分析ドメインを含む、請求項14に記載のトランスジェニック植物細胞を作製する方法。
- 前記目的のDNAが、ペプチドをコードしない、請求項14に記載のトランスジェニック植物細胞を作製する方法。
- 前記目的のDNAが、ペプチドをコードする、請求項14に記載のトランスジェニック植物細胞を作製する方法。
- 前記目的のDNAが、導入遺伝子を含む遺伝子発現カセットを含む、請求項14に記載のトランスジェニック植物細胞を作製する方法。
- 前記目的のDNAが、2以上の遺伝子発現カセットを含む、請求項14に記載のトランスジェニック植物細胞を作製する方法。
- 前記部位特異的ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、CRISPRヌクレアーゼ、TALEN、ホーミングエンドヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項14に記載のトランスジェニック植物細胞を作製する方法。
- 前記目的のDNAが、相同組換え修復組込み方法を介して、前記非遺伝子遺伝子座内に組み込まれる、請求項14に記載のトランスジェニック植物細胞を作製する方法。
- 前記目的のDNAが、非相同末端結合組込み方法を介して、前記非遺伝子遺伝子座内に組み込まれる、請求項14に記載のトランスジェニック植物細胞を作製する方法。
- 前記目的のDNAの2以上が、前記標的非遺伝子ダイズゲノム遺伝子座の2以上中に挿入される、請求項14に記載のトランスジェニック植物細胞を作製する方法。
- 前記標的非遺伝子ダイズゲノム遺伝子座の2以上が、同じ染色体上に位置する、請求項23に記載のトランスジェニック植物細胞を作製する方法。
- 前記目的のDNAおよび/または前記標的非遺伝子ダイズゲノム遺伝子座が、前記標的非遺伝子ダイズゲノム遺伝子座中への前記目的のDNAの挿入の間に改変される、請求項14に記載のトランスジェニック植物細胞を作製する方法。
- 前記非遺伝子ダイズゲノム遺伝子座が、
soy_OGL_1423(配列番号639)、
soy_OGL_1434(配列番号137)、
soy_OGL_4625(配列番号76)、
soy_OGL_6362(配列番号440)、
soy_OGL_308(配列番号43)、
soy_OGL_307(配列番号566)および
soy_OGL_310(配列番号4236)
からなる群から選択される配列と少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項14から25のいずれか一項に記載のトランスジェニック植物細胞を作製する方法。 - 前記非遺伝子ダイズゲノム遺伝子座が、
soy_OGL_308(配列番号43)、
soy_OGL_307(配列番号566)および
soy_OGL_310(配列番号4236)
からなる群から選択される配列と少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項14から25のいずれか一項に記載のトランスジェニック植物細胞を作製する方法。 - 少なくとも1Kbであり、
soy_OGL_1423(配列番号639)、
soy_OGL_1434(配列番号137)、
soy_OGL_4625(配列番号76)、
soy_OGL_6362(配列番号440)、
soy_OGL_308(配列番号43)、
soy_OGL_307(配列番号566)、
soy_OGL_310(配列番号4236)、
soy_OGL_684(配列番号47)、
soy_OGL_682(配列番号2101)および
soy_OGL_685(配列番号48)
からなる群から選択される非遺伝子配列と少なくとも90%の配列同一性を有する、精製された非遺伝子ダイズゲノム遺伝子座。 - 目的のDNAを含み、前記目的のDNAが、前記非遺伝子配列中に挿入されている、請求項28に記載の精製された非遺伝子ダイズゲノム遺伝子座。
- 前記目的のDNAが、ジンクフィンガー標的部位の近位に挿入されている、請求項29に記載の精製された非遺伝子ダイズゲノム遺伝子座。
- 前記目的のDNAが、ジンクフィンガー標的部位の対の間に挿入されている、請求項29に記載の精製された非遺伝子ダイズゲノム遺伝子座。
- 前記目的のDNAが、分析ドメインを含む、請求項29に記載の精製された非遺伝子ダイズゲノム遺伝子座。
- 前記目的のDNAが、ペプチドをコードしない、請求項29に記載の精製された非遺伝子ダイズゲノム遺伝子座。
- 前記目的のDNAが、ペプチドをコードする、請求項29に記載の精製された非遺伝子ダイズゲノム遺伝子座。
- 前記目的のDNAが、殺虫剤抵抗性遺伝子、除草剤耐性遺伝子、窒素使用効率遺伝子、水利用効率遺伝子、栄養品質遺伝子、DNA結合遺伝子および選択可能なマーカー遺伝子を含む遺伝子発現カセットを含む、請求項29に記載の精製された非遺伝子ダイズゲノム遺伝子座。
- 前記目的のDNAが、2以上の遺伝子発現カセットを含む、請求項29に記載の精製された非遺伝子ダイズゲノム遺伝子座。
- 前記非遺伝子配列の2以上が、各々、2以上の組換え配列を産生するために、挿入された目的のDNAを含み、前記2以上の組換え配列が、同じ染色体上に位置する、請求項29に記載の精製された非遺伝子ダイズゲノム遺伝子座。
- 前記目的のDNAおよび/または前記非遺伝子配列が、前記非遺伝子配列中への前記目的のDNAの挿入の間に改変される、請求項29に記載の精製された非遺伝子ダイズゲノム遺伝子座。
- 前記目的のDNAが、相同組換え修復機構または非相同末端結合修復機構を介して挿入される、請求項29に記載の精製された非遺伝子トウモロコシゲノム遺伝子座。
- 組換え配列を含む植物であって、前記組換え配列は、
非遺伝子配列と少なくとも90%の配列同一性を有する核酸配列、および
前記非遺伝子配列中に挿入されている、目的のDNA
を含む、植物。 - 前記非遺伝子配列が、
soy_OGL_1423(配列番号639)、
soy_OGL_1434(配列番号137)、
soy_OGL_4625(配列番号76)、
soy_OGL_6362(配列番号440)、
soy_OGL_308(配列番号43)、
soy_OGL_307(配列番号566)、
soy_OGL_310(配列番号4236)、
soy_OGL_684(配列番号47)、
soy_OGL_682(配列番号2101)および
soy_OGL_685(配列番号48)
からなる群から選択される、請求項40に記載の植物。 - 前記組換え配列の2以上を含む、請求項40に記載の植物。
- 前記組換え配列が、同じ染色体上に位置する、請求項42に記載の植物。
- 前記目的のDNAが、ジンクフィンガー標的部位の近位に挿入されている、請求項40に記載の植物。
- 前記目的のDNAが、ジンクフィンガー標的部位の対の間に挿入されている、請求項40に記載の植物。
- 前記目的のDNAが、分析ドメインを含む、請求項40に記載の植物。
- 前記目的のDNAが、ペプチドをコードしない、請求項40に記載の植物。
- 前記目的のDNAが、ペプチドをコードする、請求項40に記載の植物。
- 前記目的のDNAが、殺虫剤抵抗性遺伝子、除草剤耐性遺伝子、窒素使用効率遺伝子、水利用効率遺伝子、栄養品質遺伝子、DNA結合遺伝子および選択可能なマーカー遺伝子を含む遺伝子発現カセットを含む、請求項40に記載の植物。
- 前記目的のDNAおよび/または前記非遺伝子配列が、前記非遺伝子配列中への前記目的のDNAの挿入の間に改変される、請求項40に記載の植物。
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