JP2016533769A - 抗体発現用バイシストロニック発現ベクター及びそれを用いた抗体の生産方法 - Google Patents
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Abstract
Description
ヒトサイトメガロウイルス(human cytomegalovirus)strain AD169のcomplete genome(GenBank:X17403.1)の塩基配列によりUTR部分とイントロン(intron)部分を含むCMVプロモーター(promoter)のDNA配列を確保した。目的タンパク質の発現のためには、少なくともプロモーター、クローニングサイト、poly A 要素が必要なので、前記サイトメガロウイルスのゲノムから確認された塩基配列を利用し、CMVプロモーター部分とUTR部分、イントロン、cloning site、SV40 poly AのDNAをGenotech(韓国)に依頼して合成した。
前記実施例1で作製したGln−LC遺伝子セットを鋳型とし、下記表1にまとめたBamH I Gln−Fプライマー(配列番号7)とNhe I Gln−Rプライマー(配列番号8)を用いてPCR反応を行った。
増幅用遺伝子としてGS(Glutamin synthetase)遺伝子を含む発現ベクターを作製するために、当社が開発したIRES−GSベクターを使用した。IRESとGS遺伝子、poly Aを含むIRES−GSベクターを、制限酵素Mlu IとXho Iで37℃、4時間処理してIRES−GS遺伝子− f1 origin−カナマイシン/ネオマイシン耐性遺伝子− Poly A−pUC originが含まれたDNAベクター切片を回収した。
前記実施例2で作製したT−easyベクターに挿入されている軽鎖発現用遺伝子セットであるGln−HC DNAを得するために、作製したベクターに制限酵素BamH IとXho Iを37℃で4時間処理して切断した。制限酵素を処理したDNAは、1%のアガロースゲル電気泳動によりGln−HCの大きさに対応するDNAを回収した。
前記実施例4で作製したpCYBIGベクターのGS増幅遺伝子をDHFR(dehydrofolate reductase)遺伝子に代替したpCYBIDベクターを製作しようとした。
6−1.ベバシズマブ軽鎖遺伝子の挿入
前記実施例4及び5で作製したpCYBIGベクター及びpCYBIDベクターにベバシズマブ軽鎖遺伝子を挿入し、ベバシズマブ軽鎖発現プラスミドを作製した。
前記実施例6−1で製作された軽鎖発現用ベクターpCYBIG−ベバシズマブ軽鎖遺伝子ベクターと、pCYBID−ベバシズマブ軽鎖遺伝子ベクターをNhe IとXho Iに切断した。ベバシズマブの重鎖アミノ酸配列(配列番号14)からDNA塩基配列で置換した(配列番号12)。その後、実施例6のように開始コドンであるATGの前にコザック配列(GCCACC)を入れてデザインし、両末端に制限酵素NheIとXhoI認識部位を入れて遺伝子を合成した後、NheIとXhoIを処理して切断した。それぞれの切断したDNAは、1%のアガロースゲル電気泳動によりDNAを回収した後、二つのDNAを連結し、それぞれのpCYBベクターにベバシズマブ軽鎖及び重鎖の遺伝子が挿入されたベクターを作製した(図5、図6)。
7−1.形質転換
抗体タンパク質を安定的に発現する細胞株を開発するために、まずGS欠乏CHO−K1細胞を形質転換実験の前日に6ウェルプレートにウェル当り4×10 5細胞の濃度で分譲した後、37℃、二酸化炭素培養器で培養した。細胞の生存能力が98%以上であることを確認した後、通常であるが、リポフェクタミン(Lipofectamine、Invitrogen社)を用いてpCYB204IGベクターを細胞内に形質転換させた。この時、形質転換は、Opti−MEM−1(Invitrgen社)に、前記発現ベクターDNA 20μgとリポフェクタミン10μlを添加した培地を用いて行った。これから、pCYB204IGが形質転換されたCHO−K1細胞を選抜した。
前記実施例7−1によいてpCYB204IGが形質転換されたCHO−K1細胞株にMSX(Methionine sulfoximine)の初期濃度で25μMを処理した後、細胞の生長が正常に回復するまで生長の推移を観察した。MSX25μMを処理した後、7日以降の継代では、MSXの濃度を250μMに増加させ、同様の方法でMSXによる外部からの圧力に対して生長が回復される継代の時点でMSXの濃度を増加させ、最終的に500μMまで増加させた。500μMのMSXの濃度で作製された細胞株のプール(pool1及びpool2)の発現量を測定した。発現量の測定は、Anti−Fcを用いたELISA方法により確認した(図7a)。
8−1:形質転換
前記pCUB204IGベクターの増幅遺伝子GSの代わりに増幅遺伝子DHFRを含むpCYB204ID発現ベクターが形質転換された細胞株の発現量を比較するために、前記実施例7−1と同様の方法でCHO−DG44細胞(Gibco、12609− 012)にpCYB204IDを細胞内に形質転換させた後、形質転換されたCHO−DG44細胞を選抜した。
実施例8−1においてpCYB204IDが形質転換されたCHO−DG44細胞株にMTX(methotrexate)を処理して遺伝子増幅を行った。実施例7−2と同様に、細胞の生長が正常に回復したときにMTXの濃度を増加させる方法により発現量を測定した。MTX処理濃度は50nM/200nM/800nMの濃度で行った。発現量の測定は、Anti−Fcを用いたELISA方法により確認した(図7b)。
9−1.トシリズマブ軽鎖遺伝子の挿入
前記実施例5で作製したpCYBIDベクターにトシリズマブ軽鎖遺伝子を挿入し、トシリズマブ軽鎖発現プラスミドを作製した。
前記実施例9−1で製作された軽鎖発現用ベクターpCYBID−トシリズマブ軽鎖遺伝子ベクターをNhe IとXho Iに切断した。トシリズマブの重鎖アミノ酸配列(配列番号18)からDNA塩基配列で置換した(配列番号16)。その後、実施例9−1のように開始コドンであるATGの前にコザック配列(GCCACC)を入れてデザインし、両末端に制限酵素Nhe IとXho I認識部位を入れて遺伝子を合成した後、Nhe IとXho Iを処理して切断した。それぞれの切断したDNAは、1%のアガロースゲル電気泳動によりDNAを回収した後、二つのDNAを連結し、pCYBベクターにトシリズマブ軽鎖及び重鎖の遺伝子が挿入されたベクターを作製した(図8)。
10−1.形質転換
抗体タンパク質を安定的に発現する細胞株を開発するために、まず、DHFR欠乏CHO−DG44細胞(Dr.Chasin、Univ.Columbia.USA)を形質転換実験の前日に6ウェルプレートにウェル当り8×105細胞の濃度で分譲した後、37℃、二酸化炭素培養器で培養した。細胞がプレートに70〜80%程度成長したことを確認した後、リポフェクタミンLTXとPLUS(Lipofectamine LTX and PLUS reagent、Invitrogen社)を用いて軽鎖/重鎖発現ベクターpCYBBSS001を細胞内に形質転換した。この時、形質転換には、Opti−MEM−1(Invitrogen社)に、前記発現ベクターDNA各2.5μgとリポフェクタミンLTX 10μlを添加した培地を使用した。これから、軽鎖/重鎖発現ベクターpCYBBSS001が形質転換されたCHO−DG44細胞を選別した。
前記実施例10−1においてpCYBBSS001が形質転換されたCHO−DG44細胞株にMTX(methotrexate)を処理して遺伝子増幅を行った。細胞の生長が正常に回復したときにMTXの濃度を増加させる方法により発現量を測定した。MTX処理濃度は、50 nM/200 nM/800 nMの濃度で行った。その結果、pCYBBSS001ベクターを形質転換させた細胞株の場合、800 nMのMTX濃度で最高の発現量を示した。発現量の測定は、Octet titer assayを用い、Protein A Dip and Read biosensors(forteBIO、cat.no.18−5010、lot no.120716)を1 X PBSで10分以上平衡化した後、培養液に反応させた。Biosensorの再生/中和は、各試料を分析した後、3 サイクル実行し、培養液は、スタンダード範囲内で分析されるように、1 X PBSを使用して希釈し分析した。800 nMのMTX濃度で発現量は、2つのプールでそれぞれ50.8μg/mlと51.7μg/mlで確認され、そのような結果は、本発明のイントロンが挿入された発現ベクターを形質転換した場合、遺伝子が継続的に高発現できることを意味する。
11−1.デノスマブ軽鎖遺伝子の挿入
前記実施例5において作製したpCYBIDベクターにデノスマブ軽鎖遺伝子を挿入し、デノスマブ軽鎖発現プラスミドを作製した。
前記実施例11−1で製作された軽鎖発現用ベクターpCYBID−デノスマブ軽鎖遺伝子ベクターをNhe IとXho Iに切断した。デノスマブの重鎖アミノ酸配列(配列番号22)をDNA塩基配列で置換した(配列番号20)。その後、実施例11−1のように開始コドンであるATGの前にコザック配列(GCCACC)を入れてデザインし、両末端に制限酵素Nhe IとXho I認識部位を入れて遺伝子を合成した後、Nhe IとXho Iを処理して切断した。それぞれの切断したDNAは、1%のアガロースゲル電気泳動によりDNAを回収した後、二つのDNAを連結し、pCYBベクターにデノスマブ軽鎖及び重鎖の遺伝子が挿入されたベクターを作製した(図9)。
12−1.形質転換
抗体タンパク質を安定的に発現する細胞株を開発するために、まず、DHFR欠乏CHO−DG44細胞(Dr.Chasin、Univ.Columbia.USA)を形質転換実験の前日に6ウェルプレートにウェル当り8×105細胞の濃度で分譲した後、37℃、二酸化炭素培養器で培養した。細胞がプレートで70〜80%程度成長したことを確認した後、リポフェクタミンLTX と PLUS(Lipofectamine LTX and PLUS reagent、Invitrogen社)を用いて軽鎖/重鎖発現ベクターpCYBBSS002を細胞内に形質転換した。この時、形質転換には、Opti−MEM−1(Invitrogen社)に、前記発現ベクターDNA各2.5μgとリポフェクタミンLTX 10μlを添加した培地を使用した。これから、軽鎖/重鎖発現ベクターpCYBBSS002が形質転換されたCHO−DG44細胞を選別した。
前記実施例12−1においてpCYBBSS002が形質転換されたCHO−DG44細胞株にMTX(methotrexate)を処理して遺伝子増幅を行った。細胞の生長が正常に回復したときにMTXの濃度を増加させる方法により発現量を測定した。MTX処理濃度は、50 nM/200 nM/800 nMの濃度で行った。その結果、pCYBBSS002ベクターを形質転換させた細胞株の場合、800 nMのMTX濃度で最高の発現量を示した。発現量の測定は、Octet titer assayを用い、Protein A Dip and Read biosensors(forteBIO、cat.no.18−5010、lot no.120716)を1 X PBSで10分以上平衡化した後、培養液に反応させた。Biosensorの再生/中和は、各試料を分析した後、3 サイクルで実行し、培養液は、スタンダードの範囲内で分析されるように、1 X PBSを使用して希釈し分析した。800 nMのMTX濃度で発現量は81.4μg/mlで確認され、そのような結果は、本発明のイントロンが挿入された発現ベクターを形質転換した場合、遺伝子を継続的に高発現することを意味する。
13−1.ベリムマブ軽鎖遺伝子の挿入
前記実施例5で作製したpCYBIDベクターにベリムマブ軽鎖遺伝子を挿入し、ベリムマブ軽鎖発現プラスミドを作製した。
前記実施例13−1で製作された軽鎖発現用ベクターpCYBID−ベリムマブ軽鎖遺伝子ベクターをNhe IとXho Iに切断した。ベリムマブの重鎖アミノ酸配列(配列番号26)をDNA塩基配列で置換した(配列番号24)。その後、実施例13−1のように開始コドンであるATGの前にコザック配列(GCCACC)を入れてデザインし、両末端に制限酵素Nhe IとXho I認識部位を入れて遺伝子を合成した後、Nhe IとXho Iを処理して切断した。それぞれの切断したDNAは、1%のアガロースゲル電気泳動によりDNAを回収した後、二つのDNAを連結し、それぞれのpCYBベクターにベリムマブ軽鎖及び重鎖の遺伝子が挿入されたベクターを作製した(図10)。
14−1.形質転換
前記実施例14−1においてpCYBBSS003ベクターが形質転換されたCHO−DG44細胞株のベリムマブの発現量を測定した。発現量の測定は、Anti−Fcを用いたELISA方法により、PCD(Picograms/cell/day)を計算し、細胞当りの発現量を求めた。その結果、pCYBBSS003ベクターを形質転換させた細胞株の場合、4μg/mlの発現量を示すことが確認し、そのような結果は、本発明のイントロンが挿入された発現ベクターを形質転換した場合、遺伝子を継続的に高発現することができることを意味する。
15−1.ゴリムマブ軽鎖遺伝子の挿入
前記実施例5で作製したpCYBIDベクターにゴリムマブ軽鎖遺伝子を挿入し、ゴリムマブ軽鎖発現プラスミドを作製した。
前記実施例15−1で製作された軽鎖発現用ベクターpCYBID−ゴリムマブ軽鎖遺伝子ベクターをNhe IとXho Iに切断した。ゴリムマブの重鎖アミノ酸配列(配列番号30)をDNA塩基配列で置換した(配列番号28)。その後、実施例15−1のように開始コドンであるATGの前にコザック配列(GCCACC)を入れてデザインし、両末端に制限酵素Nhe IとXho I認識部位を入れて遺伝子を合成した後、Nhe IとXho Iを処理して切断した。それぞれの切断したDNAは、1%のアガロースゲル電気泳動によりDNAを回収した後、二つのDNAを連結し、pCYBベクターにゴリムマブ軽鎖及び重鎖の遺伝子が挿入されたベクターを作製した(図11)。
16−1.形質転換
前記実施例16−1においてpCYBBSS004が形質転換されたCHO−DG44細胞株にMTX(methotrexate)を処理して遺伝子増幅を行った。細胞の生長が正常に回復したときにMTXの濃度を増加させる方法により発現量を測定した。MTX処理濃度は、50 nM/200 nM/500 nM/800 nMの濃度で行った。その結果、pCYBBSS004ベクターを形質転換させた細胞株の場合、800 nMのMTX濃度で最高の発現量を示した。発現量の測定は、Octet titer assayを用い、Protein A Dip and Read biosensors(forteBIO、cat.no.18−5010、lot no.120716)を1 X PBSで10分以上平衡化した後、培養液に反応させた。Biosensorの再生/中和は、各試料を分析した後、3 サイクルで実行し、培養液は、スタンダードの範囲内で分析されるように、1 X PBSを使用して希釈し分析した。500 nMのMTX濃度で発現量は120.3μg/mlで確認され、そのような結果は、本発明のゴリムマブ発現ベクターを形質転換した場合、遺伝子を継続的に高発現することができることを意味する。
17−1.ウステキヌマブ軽鎖遺伝子の挿入
前記実施例17−1で製作された軽鎖発現用ベクターpCYBID−ウステキヌマブ軽鎖遺伝子ベクターをNhe IとXho Iに切断した。ウステキヌマブの重鎖アミノ酸配列(配列番号34)をDNA塩基配列で置換した(配列番号32)。その後、実施例17−1のように開始コドンであるATGの前にコザック配列(GCCACC)を入れてデザインし、両末端に制限酵素Nhe IとXho I認識部位を入れて遺伝子を合成した後、Nhe IとXho Iを処理して切断した。それぞれの切断したDNAは、1%のアガロースゲル電気泳動によりDNAを回収した後、二つのDNAを連結し、それぞれのpCYBベクターにウステキヌマブ軽鎖及び重鎖の遺伝子が挿入されたベクターを作製した(図12) 。
18−1.形質転換
抗体タンパク質を安定的に発現する細胞株を開発するために、まず、DHFR欠乏CHO−DG44細胞(Dr.Chasin、Univ.Columbia.USA)を形質転換実験の前日に6ウェルプレートにウェル当り8×105細胞の濃度で分譲した後、37℃、二酸化炭素培養器で培養した。細胞がプレートで70〜80%程度成長したことを確認した後、リポフェクタミンLTX と PLUS(Lipofectamine LTX and PLUS reagent、Invitrogen社)を用いて軽鎖/重鎖発現ベクターpCYBBSS005を細胞内に形質転換した。この時、形質転換には、Opti−MEM−1(Invitrogen社)に、前記発現ベクターDNAの各2.5μgとリポフェクタミンLTX 10μlを添加した培地を使用した。これから、軽鎖/重鎖発現ベクターpCYBBSS005が形質転換されたCHO−DG44細胞を選別した。
前記実施例18−1においてpCYBBSS005ベクターが形質転換されたCHO−DG44細胞株のウステキヌマブの発現量を測定した。発現量の測定は、Anti−Fcを使用したELISA方法を使用し、PCD(Picograms/cell/day)を計算し、細胞当りの発現量を求めた。その結果、pCYBBSS005ベクターを形質転換させた細胞株の場合、2.5μg/ mlの発現量を示すことが確認され、そのような結果は、本発明のイントロンが挿入された発現ベクターを形質転換した場合、遺伝子を継続的に高発現することができることを意味する。
19−1.イピリムマブ軽鎖遺伝子の挿入
前記実施例5で作製したpCYBIDベクターにイピリムマブ軽鎖遺伝子を挿入し、イピリムマブ軽鎖発現プラスミドを作製した。
前記実施例19−1で製作された軽鎖発現用ベクターpCYBID−イピリムマブ軽鎖遺伝子ベクターをNhe IとXho Iに切断した。イピリムマブの重鎖アミノ酸配列(配列番号38)をDNA塩基配列で置換した(配列番号36)。その後、実施例19−1のように開始コドンであるATGの前にコザック配列(GCCACC)を入れてデザインし、両末端に制限酵素Nhe IとXho I認識部位を入れて遺伝子を合成した後、Nhe IとXho Iを処理して切断した。それぞれの切断したDNAは、1%のアガロースゲル電気泳動によりDNAを回収した後、二つのDNAを連結し、それぞれのpCYBベクターにイピリムマブ軽鎖及び重鎖の遺伝子が挿入されたベクターを作製した(図13)。
20−1.形質転換
抗体タンパク質を安定的に発現する細胞株を開発するために、まず、DHFR欠乏CHO−DG44細胞(Dr.Chasin、Univ.Columbia.USA)を形質転換実験の前日に6ウェルプレートにウェル当り8×10 5細胞の濃度で分譲した後、37℃、二酸化炭素培養器で培養した。細胞がプレートで70〜80%程度成長したことを確認した後、リポフェクタミンLTX と PLUS(Lipofectamine LTX and PLUS reagent、Invitrogen社)を用いて軽鎖/重鎖発現ベクターpCYBBSS006を細胞内に形質転換した。この時、形質転換には、Opti−MEM−1(Invitrogen社)に、前記発現ベクターDNAの各2.5μgとリポフェクタミンLTX 10μlを添加した培地を使用した。これから、軽鎖/重鎖発現ベクターpCYBBSS006が形質転換されたCHO−DG44細胞を選別した。
前記実施例20−1においてpCYBBSS006が形質転換されたCHO−DG44細胞株にMTX(Methotrexate)を処理して遺伝子増幅を行った。細胞の生長が正常に回復したときにMTXの濃度を増加させる方法により発現量を測定した。MTX処理濃度は、50 nM/200 nM/500 nM/800 nMの濃度で行った。その結果、pCYBBSS006ベクターを形質転換させた細胞株の場合、500 nMのMTX濃度で最高の発現量を示した。発現量の測定は、Octet titer assayを用いており、Protein A Dip and Read biosensors(forteBIO、cat.no.18−5010、lot no.120716)を1 X PBSで10分以上平衡化した後、培養液に反応させた。Biosensorの再生/中和は、各試料を分析した後、3 サイクルで実行し、培養液は、スタンダードの範囲内で分析されるように、1 X PBSを使用して希釈し分析した。500 nMのMTX濃度で発現量は8μg/mlで確認されており、そのような結果は、本発明のイントロンが挿入された発現ベクターを形質転換した場合、遺伝子を継続的に高発現することを意味する。
Claims (20)
- (i)「プロモーター−UTR(untranslation region)−イントロン−抗体軽鎖遺伝子−polyA」を含む第1の発現カセット;及び
(ii)「プロモーター−UTR−イントロン−抗体重鎖遺伝子−IRES(internal ribosome entry site)−増幅遺伝子−polyA」を含む第2の発現カセットを含む、
抗体発現用バイシストロニック発現ベクター。 - 前記プロモーターは、SV40(simian virus 40)初期プロモーター、CMV(Cytomegalovirus)プロモーター及びhEF1−α(human elongation factor1−α)プロモーターからなる群から選択された、請求項1に記載の発現ベクター。
- 前記UTRは、CMV由来である、請求項1に記載の発現ベクター。
- 前記イントロンは、CMV由来である、請求項1に記載の発現ベクター。
- 前記プロモーターがSV40初期プロモーターであり、前記UTR及び前記イントロンはSV40由来である、請求項1に記載の発現ベクター。
- 前記プロモーターがCMVプロモーターであり、前記UTR及び前記イントロンは、CMV由来である、請求項1に記載の発現ベクター。
- 前記プロモーターがhEF1−αプロモーターであり、前記UTR及び前記イントロンがhEF1−α由来である、請求項1に記載の発現ベクター。
- 前記プロモーターは、配列番号1の塩基配列で構成されたCMVプロモーターである、請求項2に記載の発現ベクター。
- 前記UTRは、配列番号2の塩基配列で構成されたCMV由来UTRである、請求項3に記載の発現ベクター。
- 前記イントロンは、配列番号3の塩基配列で構成された、請求項5に記載の発現ベクター。
- 前記増幅遺伝子は、GS(glutamine synthetase)またはDHFR(dehydrofolate reductase)である、請求項1に記載の発現ベクター。
- 前記抗体は、ベバシズマブ(bevacizumab)、トシリズマブ(Tocilizumab)、デノスマブ(denosumab)、ベリムマブ(belimumab)、ゴリムマブ(golimumab)、ウステキヌマブ(ustekinumab)またはイピリムマブ(Ipilimumab)である、請求項1に記載の発現ベクター。
- 前記発現ベクターは、図5に記載されたpCYB204IGの開裂地図、図6に記載されたpCYB204IDの開裂地図、図8に記載されたpCYBBSS001の開裂地図、図9に記載されたpCYBBSS002の開裂地図、図10に記載されたpCYBBSS003の開裂地図、図11に記載されたpCYBBSS004の開裂地図、図12に記載されたpCYBBSS005の開裂地図及び図13に記載されたpCYBBSS006の開裂地図からなる群から選択された開裂地図を有する、請求項1に記載の発現ベクター。
- 前記抗体軽鎖遺伝子は、配列番号11、配列番号15、配列番号19、配列番号23、配列番号27、配列番号31、及び配列番号35からなる群から選択された塩基配列で構成される、請求項1に記載の発現ベクター。
- 前記抗体重鎖遺伝子は、配列番号12、配列番号16、配列番号20、配列番号24、配列番号28、配列番号32及び配列番号36からなる群から選択された塩基配列で構成される、請求項1に記載の発現ベクター。
- 請求項1〜15のいずれか1項の発現ベクターが形質転換された動物細胞。
- 前記動物細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)である、請求項16に記載の動物細胞。
- 請求項16に記載の動物細胞を培養する段階を含む抗体の生産方法。
- 前記動物細胞を培養した培養物から抗体を精製する段階をさらに含む、請求項18に記載の抗体の生産方法。
- 前記抗体は、ベバシズマブ、トシリズマブ、デノスマブ、ベリムマブ、ゴリムマブ、ウステキヌマブまたはイピリムマブである、請求項18又は19に記載の方法。
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