JP2016527247A - 高力価パンクレアチン医薬組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、高活性パンクレアチン酵素を含む高力価医薬組成物を提供する。また本発明は、ＨＡ−パンクレアチン酵素、およびこの組成物または剤形を生成する工程、ならびにこれらの使用方法を目的とする。【選択図】なし

Description

相互関連出願
本願は、２０１３年７月２２日に出願した米国特許仮出願第６１／８５６，９５２号の恩典を、米国特許法１１９条（ｅ）の下主張するものであり、この開示全体が、すべての目的のため本明細書中に参照として援用される。

技術分野
本発明は、高活性パンクレアチン（ＨＡ−パンクレアチン）酵素を含む高力価医薬組成物を目的とする。また本発明は、ＨＡ−パンクレアチン酵素およびその組成物または剤形を生成する工程、ならびにそれらの使用方法を目的とする。

膵外分泌不全（ＥＰＩ）は、２００，０００人超のアメリカ人が罹患しているとＦＤＡが推定しており、個体が自身の膵臓により作製される消化酵素を欠いていることにより食品を適切に消化することができない生理学的障害を含むものである。この消化酵素の喪失は、栄養素の消化不良および吸収不全などの障害をもたらし、これに関連する栄養障害および他の結果として起こる望ましくない生理学的な病態をもたらす。これらの障害は、嚢胞性線維症（ＣＦ）、ならびに膵臓癌、膵切除、および膵炎などの膵臓の外分泌機能を損なう他の病態に罹患する患者に共通している。この栄養障害は、処置しないまま、特に乳児およびＣＦ患者で処置しないままである場合、生命が危険となる可能性がある。この障害は、成長不全、免疫応答障害、および短い平均余命を引き起こす可能性がある。

パンクレリパーゼ酵素などの消化酵素および他の膵酵素生成物（ＰＥＰ）を投与して、ＥＰＩを少なくとも部分的に治療することができる。投与した消化酵素により、患者は食物をより効率的に消化できるようになる。

ＥＰＩを処置するために使用するパンクレリパーゼ酵素は、主に、３つの酵素分類であるリパーゼ、アミラーゼ、およびプロテアーゼの組み合わせであり、これと共にとりわけエラスターゼ、ホスホリパーゼ、およびコレステラーゼを含む他の酵素、ならびに他の様々な補因子および補酵素と共に様々な補因子および補酵素を含み、酵素生成物中のレベルまたは効力は記載されている。

これらの酵素は、膵臓で天然に産生されており、脂肪、タンパク質、および炭水化物の消化に重要である。この酵素は、脂肪のグリセロールおよび脂肪酸への、デンプンのデキストリンおよび糖への、かつタンパク質のアミノ酸およびアミノ酸由来物質への加水分解を触媒する。しかしながら、消化は、正しい消化機能に貢献する他の多くの酵素および基質を含み、最大範囲の消化産物の生成に関係する複合的な工程である。

パンクレリパーゼ酵素は、典型的に、ブタの膵腺から調製される。他のパンクレリパーゼの供給源として、ウシの膵腺または膵液が挙げられる。これら酵素の天然の哺乳類の供給源から、ヒトの膵臓により分泌されるものと類似する酵素組成を含む生成物がもたらされる。他の非哺乳類の供給源もまた使用でき、たとえばこれらは、米国特許第６，０５１，２２０号、米国特許第２００４／００５７９４４号、米国特許公開公報第２００１／００４６４９３号、および国際特許公開公報第２００６０４４５２９号に記載されている。

パンクレリパーゼ含有生成物は有効な治療を提供することができるが、これにはいくつか問題がある。各食事に伴い複数（４〜９）の相対的に大きなカプセル（多くの服用錠数）が必要であり、これは投与に対する患者のアドヒアランスを下げるものである。服用錠数が多い結果として起こり得る微生物およびウイルスの混入もまた、望ましくないものとされる。これら問題のすべては、酵素抽出物の純度が低いことと関連している。純度の問題は、何年も行われている酵素抽出手法の結果であり、これは粗水性混合物またはスラリーの形成、アルコールによる沈殿、遠心分離、および濾過を含む。このような抽出工程により生じる最終生成物は、わずか２５％のタンパク質からなり得る。リパーゼは、これらパンクレリパーゼ抽出物の効能の観点から重要な酵素であり、１００ＩＵ ＵＳＰ／ｍｇの範囲の活性を有する。これは、約２５，０００ＩＵ／ｍｇの活性を有する（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能な純粋なブタリパーゼなどの）純粋なブタのリパーゼ活性とは対照的である。この近似を計算の根拠として使用すると、生成物は、０．５％未満の活性リパーゼを含むと推定できる。さらに、過度の不活性材料が存在することにより、必然的に何らかの感染性の混入が、このバルクの一部で起こり得て、結果として、混合物の望ましい活性成分と共に摂取され得る。過度の不活性材料はまた、たとえばメンブレンフィルターまたは濾過カラムの閉塞を介して、生体の負荷を低減する目的の技術をも妨害し、潜在的な感染上の負荷を減少させるために有益な電離放射線から抽出物を遮蔽する。

多くの純粋な単一酵素および３つの単一酵素の混合物は、１例では、ＥＰＩの処置のための臨床開発段階に入っている。これらは、組み換え型胆汁酸刺激リパーゼ（ＢＳＳＬ）（Ｅｘｉｎａｌｄａ（商標）／Ｋｉｏｂｒｉｎａ（登録商標））（母乳に含まれている組み換え型ヒトリパーゼ）；Ｍｅｒｉｓｐａｓｅ（登録商標）（組み換え型イヌ胃リパーゼ）；ＭＳＩ ８１９（組み換え型リパーゼ）；およびリプロタマーゼ（ｌｉｐｒｏｔａｍａｓｅ）（微生物供給源から抽出し、化学的に架橋した、組み換え型細菌リパーゼ、プロテアーゼ、およびアミラーゼからなる混合物）である。これら実験上の治療は全て、これまでのところ、Ｚｅｎｐｅｐ（登録商標）またはＵｌｔｒｅｓａ（登録商標）などのブタの膵臓由来の市販の酵素抽出物に匹敵するレベルの処置効能を証明できていない。同様に、２０１１年１月１２日のＦＤＡの顧問会議では、パンクレリパーゼ抽出生成物で従来得られたものと比較して、脂肪の吸収係数（ＣＦＡ）の増加に関するその低い効能により、リプロタマーゼの承認が反対された。

より良好、簡便、かつ潜在的に安全な生成物を生成するために、現存するパンクレリパーゼ含有生成物と比較してより濃縮かつ精製されており、さらにはＥＰＩの処置のための効能を維持する生成物が必要であることが明らかである。プロテアーゼ、リパーゼ、またはアミラーゼの単離のための出発物質としてパンクレリパーゼの使用を記載する文献は多く存在するが、治療的に使用するために改善された生成物を作製する目的で精製したＰＥＰもしくは類似生成物で見出される種類のパンクレリパーゼの報告は存在しない。それぞれの場合において、本明細書中に記載される本発明に先立つ目的は、他よりも特定の酵素または酵素の画分を精製すること、または酵素活性全体を実質的に増大させることなく特定の成分を除去することであった。すべての場合で、治療剤として使用するためのＨＡ−パンクレアチン生成物を生成する方向性もなかった。

タンパク質の精製を記載する従来技術は、パンクレリパーゼにより例示されるようにタンパク質を多く含む単純な画分を抽出かつ単離すること、または、たとえばリパーゼもしくはプロテアーゼといった、単一のタンパク質または単一のクラスのタンパク質を分離することを目的とする。

たとえば、Ｈｗａｎｇ（Ｉｎｄ． Ｅｎｇ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ． ２００７， ４６， ４２８９）は、膵酵素の溶解度と溶媒の極性との関係、ならびに膵タンパク質からのリパーゼ、プロテアーゼ、およびアミラーゼの選択的な沈殿についての報告を開示している。Ｈｗａｎｇは、極性の低い溶媒を使用する場合、パンクレアチンの沈殿が増大し、溶媒が２８（ＭＰａ）^０．５未満のヒルデブラント溶解パラメータを有する場合に最大となること；溶媒極性が３４（ＭＰａ）^０．５未満に低下すると、アミラーゼおよびプロテアーゼの選択的な沈殿が増大するが、対照的にリパーゼの選択的な沈殿は、溶液の極性とは無関係であり、混合物に存在するリパーゼの６５％以下が回収されることを示している。これらの結果から、ＨＡ−パンクレアチンを得るために幅広い範囲の膵酵素を精製する誘因はなく、当業者が精製の最中に酵素クラスの混合物を保存する誘因はない。６０年をはるかに超えるあいだ治療生成物において使用してきたパンクレリパーゼを精製する試みがなかったという事実は、これを行うことによる利益が予想または予測されていなかったことを強く示している。パンクレリパーゼ生成物を改善するためのすべての試みは、非膵臓起源由来の単一酵素に焦点を当てており、さらに、改善した生成物を製造するための、より純粋かつ／またはより濃縮された酵素の供給源としてパンクレリパーゼを使用することが、これまで認識されていなかったことをさらに強調している。

実質的に類似した定性的および定量的な酵素活性プロファイルを有する生成物を生成する目的で、医薬品および洗浄の用途で現在使用されているパンクレリパーゼを数倍精製する誘因または理由はない。実際に、現在の生成物は、これらの役割を適切に果たしており、当該生成物は、６０年を超えるあいだ実質的に変化しないままであり、本明細書に記載される著しく改善した生成物または関連する調製工程に関する記載はないように思われる。ＥＰＩの処置のための純粋な酵素を含む生成物は全て、単一酵素に基づくものであるか、または１例では、組み換え技術または微生物供給源からの３つの純粋かつ化学修飾された単一酵素の混合物に基づくものである。ＥＰＩの処置、洗浄、および組織の消化に使用される膵腺の粗製抽出物から、プロテアーゼ、リパーゼ、およびアミラーゼを含む混合物を精製する試みはなされていない。同様に、単離した酵素または酵素クラスを得る目的とは反対の手法などの、個々に精製した後に組み換えを行った膵臓供給源由来の酵素に関する誘因または報告もない。

本発明は、ＨＡ−パンクレアチン酵素およびそれらの高力価医薬組成物または剤形を目的とする。また本発明は、ＨＡ−パンクレアチンを生成する高収率工程、および当該生成物を使用するための方法を目的とする。

発明の詳細な説明
本発明は、有効かつ有意に高い治療活性を有する、より具体的には、不必要な生物学的成分および／または望ましくない潜在的に感染性の成分のバイオバーデンを減少させた本質的な酵素クラスを含む生成物（ＨＡ（高活性）‐パンクレアチン）を目的とする。また本発明は、ＨＡ−パンクレアチン、より具体的には非常に高い収率のＨＡ−パンクレアチンを生成する工程を目的とする。また、ＨＡ−パンクレアチンは、より小さく、より簡便な剤形の製剤、特に、単一のピル、懸濁用の小粒子の剤形、および単一の単位服用量で他の治療成分または有益な成分と組み合わせることのできる剤形として送達され得る製剤の形成を可能にする。この革新は、嚢胞性線維症の患者などの、ＰＥＩを罹患している患者に対して特に価値がある。また本発明は、患者の年齢または病態により、たとえば懸濁物、粒子といった、カプセル以外の代替的な投与形態を必要とし得る製剤に製剤化するために有益である。より濃縮され、よってより小さくなる剤形、単位または粒子は、この患者グループにとって非常に価値がある。また本発明は、上述した理由のため微生物などの不必要または望ましくない生物学的構成成分および関連するいずれかの毒素を低減または除去するように設計した技術の使用を可能にする。

本発明は、ＨＡ−パンクレアチン酵素（ＨＡ−パンクレアチン）およびその高力価医薬組成物を目的とする。特定の実施形態では、ＨＡ−パンクレアチンは、ブタ由来である。ＨＡ−パンクレアチンは、リパーゼ、プロテアーゼ、アミラーゼを含み、かつ、少なくとも約１２０ＵＳＰ ＩＵ／ｍｇ、または少なくとも約１５０ＵＳＰ ＩＵ／ｍｇ、または少なくとも約２００ＵＳＰ ＩＵ／ｍｇ、または少なくとも約４００ＵＳＰ ＩＵ／ｍｇ、または少なくとも約５００ＵＳＰ ＩＵ／ｍｇのリパーゼ比活性を有する。

本明細書中に使用される用語「消化酵素」は、生物が食物を摂取または吸収できるように食物の成分を分解する消化管中の酵素を指す。消化酵素の非限定的な例として、パンクレリパーゼ酵素（パンクレリパーゼまたはパンクレアチンとも呼ばれる）、リパーゼ、コリパーゼ、トリプシン、キモトリプシン、キモトリプシンＢ、パンクレアトペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＢ、グリセロールエステルヒドロラーゼ、ホスホリパーゼ、ステロールエステルヒドロラーゼ、エラスターゼ、キニノゲナーゼ、リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、α−アミラーゼ、パパイン、キモパパイン、グルテナーゼ、ブロメライン、フィシン、β−アミラーゼ、セルラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ラクターゼ、スクラーゼ、イソマルターゼ、およびそれらの混合物が挙げられる。

本明細書中の用語「膵酵素」は、アミラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、またはそれらの混合物などの膵臓の分泌物、またはパンクレアチンなどの酵素活性を有する膵臓由来の任意の抽出物に存在する種類の酵素のいずれか１つを指す。

用語「パンクレリパーゼ酵素」または「パンクレリパーゼ」、または「パンクレアチン」は、アミラーゼ、リパーゼ、およびプロテアーゼの酵素を含む数種類の酵素の混合物を指す。パンクレリパーゼ酵素は、たとえばＮｏｒｄｍａｒｋ Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌ ＧｍｂＨ， ｏｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＬＬＣから販売されている。

用語「ＡＰＩ」は、「消化酵素」または「パンクレリパーゼ酵素」または「パンクレアチン」を指すように本明細書中で使用される。

用語「リパーゼ」は、脂質のグリセロールおよび単純な脂肪酸への加水分解を触媒する酵素を指す。本発明に適したリパーゼの例として、限定するものではないが、動物のリパーゼ（たとえばブタのリパーゼ）、細菌のリパーゼ（たとえばシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）のリパーゼ、および／またはバークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）のリパーゼ）、真菌のリパーゼ、植物のリパーゼ、組み換え型リパーゼ（たとえば培養物中の細菌、酵母、真菌、植物、昆虫、もしくは哺乳類の宿主細胞のいずれか１つから選択される適切な宿主細胞による組み換えＤＮＡ技術を介して生成されるか、または、天然に存在する配列と相同または実質的に同一であるアミノ酸配列を含む組み換え型リパーゼ天然に存在するリパーゼをコードする核酸と相同または実質的に同一である核酸によりコードされるリパーゼなどを含む）、合成リパーゼ、化学修飾されたリパーゼ、ならびにそれらの混合物が挙げられる。用語「脂質」は、脂肪、ワックス、ステロール、脂溶性ビタミン（ビタミンＡ、Ｄ、Ｅ，およびＫなど）、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、リン脂質などを含む天然に存在する分子を広く含む。

用語「アミラーゼ」は、たとえば、αアミラーゼ、βアミラーゼ、γアミラーゼ、酸α‐グルコシダーゼ、プチアリンなどの唾液性アミラーゼなどといった、でんぷんを分解するグリコシドヒドロラーゼ酵素を指す。本発明での使用に適したアミラーゼとして、限定するものではないが、動物のアミラーゼ、細菌のアミラーゼ、真菌のアミラーゼ（たとえばアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）のアミラーゼ、たとえばコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）のアミラーゼ）、植物のアミラーゼ、組み換え型アミラーゼ（たとえば、培養物中の細菌、酵母、真菌、植物、昆虫、または哺乳類の宿主細胞のいずれか１つから選択した、適切な宿主細胞により組み換えＤＮＡ技術を介して生成されるアミラーゼ、または、天然に存在する配列と相同または実質的に同一であるアミノ酸配列を含む組み換えアミラーゼ、天然に存在するアミラーゼをコードする核酸と相同または実質的に同一である核酸によりコードされるアミラーゼなど）、化学修飾されたアミラーゼ、ならびにそれらの混合物が挙げられる。

用語「プロテアーゼ」は、一般的に、タンパク質のアミノ酸の間のペプチド結合を切断する酵素（たとえばプロテナーゼ、ペプチダーゼ、またはタンパク質分解酵素）を指す。概して、プロテアーゼは、たとえば、アスパラギン酸ペプチダーゼ、システイン（チオール）ペプチダーゼ、メタロペプチダーゼ、セリンペプチダーゼ、スレオニンペプチダーゼ、触媒機構未知のアルカリもしくはセミアルカリプロテアーゼ、および中性ペプチダーゼといった、それら酵素の触媒の種類により同定される。本発明の使用に適したプロテアーゼの非限定的な例として、セリンプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ（たとえばプラスメプシン）メタロプロテアーゼ、およびグルタミン酸プロテアーゼが挙げられる。さらに、本発明の使用に適したプロテアーゼとして、限定するものではないが、動物のプロテアーゼ、細菌のプロテアーゼ、真菌のプロテアーゼ（たとえばアスペルギルス メレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｍｅｌｌｅｕｓ）プロテアーゼ）、植物のプロテアーゼ、組み換えプロテアーゼ（たとえば、培養物中の細菌、酵母、真菌、植物、昆虫、または哺乳類の宿主細胞のうちのいずれか１つから選択した適切な宿主細胞により組み換えＤＮＡ技術を介して生成されるプロテアーゼ、または天然に存在する配列と相同または実質的に同一であるアミノ酸配列を含む組み換えプロテアーゼ、天然に存在するプロテアーゼをコードする核酸と相同または実質的に同一である核酸によりコードされるプロテアーゼなど）、化学修飾されたプロテアーゼ、ならびにそれらの混合物が挙げられる。

本発明の組成物のパンクレリパーゼ酵素は、１つまたは複数のリパーゼ（すなわち１つのリパーゼ、または２つ以上のリパーゼ）、１つまたは複数のアミラーゼ（すなわち１つのアミラーゼ、または２つ以上のアミラーゼ）、１つまたは複数のプロテアーゼ（すなわち１つのプロテアーゼ、または２つ以上のプロテアーゼ）を含み、かつ、異なる組み合わせおよび比率でのこれら酵素の混合物である。

本発明に有益な組成物のリパーゼの活性は、約６５０〜約１００，０００ＩＵ（ＵＳＰ法）とすることができる。これは、約６７５〜約８２５ＩＵ、約２，５００〜約２８，０００ＩＵ、約２，７００〜約３，３００ＩＵ、約４，５００〜約５，５００ＩＵ、約８，０００〜約１１，０００ＩＵ、約１３，５００〜約１６，５００ＩＵ、および約１８，０００〜約２２，０００ＩＵ、約２２，５００〜約２７，５００ＩＵ、約３６，０００〜約４４，０００ＩＵ、ならびにこの間のすべての範囲および部分範囲とすることができる。

本発明の組成物は、好ましくは、少なくとも約６５０ＩＵ（ＵＳＰ法）、少なくとも約９，０００ＩＵ、さらにより好ましくは、単位服用量あたり約２０，０００ＵＳＰ単位、約４０，０００ＵＳＰ単位、約６０，０００ＵＳＰ単位、約８０，０００ＵＳＰ単位、または約１００，０００ＵＳＰ単位のリパーゼを含む。

本発明に係るＨＡ−パンクレアチン組成物は、粉剤の形態であってもよく、またはたとえば錠剤といった圧縮形態であってもよく、または複数のコーティングしたおよび／もしくはコーティングしていない粒子を含んでもよい。この粒子は、少なくとも１つの腸溶コーティングでコーティングしたコアであって、上記コーティングが腸溶性ポリマーを含む、コアを含み得る。また、コーティングした粒子のほかに上述の組成物は、コーティングしていないパンクレリパーゼの粒子を含み得る。特に、この粒子は、ミニタブレット、マイクロタブレット、マイクロ粒子、マイクロスフェア、マイクロカプセル、マイクロペレットである。この粒子は、最大約５ｍｍの直径を有することができる。この粒子は、任意の適切な粒子の大きさまたは形状を有することができる。たとえば、粒子は、約２５〜５，０００μｍの範囲の大きさを有することができ、たとえば、約２〜５ｍｍの範囲の公称粒径を有する「ミニタブレット」の形態とすることができ、または約２ｍｍ未満、たとえば約１〜２ｍｍの公称粒径を有する「マイクロタブレット」とすることができる。この粒子は、約８００μｍ未満、好ましくは５００μｍ未満、より好ましくは２００μｍ未満の平均粒径を有することができる。この粒子は、４００μｍ以上の体積径（ｄ（ｖ，０．１）（体積分布の１０％がこの値未満であり、９０％超がこの値を超える径として定義）、および８００μｍ以下の体積径（ｄ（ｖ，０．９）（体積分布の９０％がこの値未満であり、１０％がこの値を超える径として定義）を有しうる。

パンクレリパーゼのコアが腸溶コーティングにより囲まれている実施形態で、このコーティングは、胃の酸性環境から薬物を保護し、かつ小腸に達する前での薬物の放出を実質的に防止する障壁として作用する。他のコーティング組成物を伴う腸溶コーティング組成物の適切な組み合わせを使用して、薬剤の放出または治療効果に関して望ましい種類の制御を提供できる。腸溶コーティングは、少なくとも１つの腸溶性ポリマーおよびさらなる賦形剤を含む。文言「腸溶性ポリマー」は、たとえば、酸性のｐＨで安定であるが、高いｐＨでは迅速に崩壊することができるポリマー、または、残りの消化管とは対照的に、胃の中に存在するあいだ、消化酵素と胃の内容物の接触が相対的に軽微あることを確保するために水和もしくは浸食の速度が十分に遅いポリマーといった、胃の内容物から消化酵素を保護するポリマーを意味する。

腸溶性ポリマーの非限定的な例として、酢酸フタル酸セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート、ポリビニルアセテートフタレート、メタクリル酸のコポリマー、メチルメタクリル酸のエステル、メチルメタクリル酸のコポリマー、およびメタクリル酸／メチルメタクリル酸コポリマー、メタクリル酸‐アクリル酸エチルのコポリマー（１：１）、シェラック、ならびにエチルセルロースがある。これらのポリマーは、セラフェート（酢酸フタル酸セルロース）、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｌ１ＯＯ、Ｓ１ＯＯ、Ｌ３０Ｄ、ＦＳ３０Ｄ、Ｌ１００−５５、Ｌ３０Ｄ５５（メタクリル酸のコポリマー）、Ａｑｕａｔｅｒｉｃ（登録商標）（酢酸フタル酸セルロース）、Ａｑｏａｔ（登録商標）（ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート）、およびＨＰ５５（登録商標）（ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート）などの異なる商標名で市販されている。腸溶コーティングは、タルクなどの他の賦形剤をさらに含んでもよい。好ましくは、腸溶コーティング剤は、少なくとも１つの腸溶性ポリマーを１０〜２０重量％含み、上記重量％は、それぞれコーティングした粒子の総重量に基づくものである。このコーティングは、脂肪族カルボン酸およびアルコールから選択したＣ６〜Ｃ３０親油性低分子量分子、好ましくはステアリン酸、ミリスチン酸、ミリスチンアルコール、またはステアリルアルコールなどのＣ１４〜Ｃ１８カルボン酸もしくはアルコールなどの親油性の薬剤をさらに含んでもよい。コーティングの他の任意の成分は、可塑剤、固化防止剤（タルク、ステアリン酸マグネシウム、コロイド状二酸化ケイ素、およびそれらの組み合わせ；さらに任意に低粘度のエチルセルロース）である。適切な可塑剤の非限定的な例として、トリアセチン、クエン酸トリブチル、クエン酸トリエチル、アセチルトリ−ｎ−ブチルシトラート、フタル酸ジエチル、セバシン酸ジブチル、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ひまし油、アセチル化モノおよびジグリセリド、セチルアルコール、ならびにこれらの混合物が挙げられる。好ましい可塑剤は、非フタル酸の可塑剤またはその混合物である。

ＨＡ−パンクレアチンのコーティングまたは非コーティング粒子は、既知の工程によって調製され得る。たとえばマイクロペレットのコアを、ＨＡ−パンクレアチンに適切な結合剤を添加し、次いで適切な溶媒の存在下での押し出しおよびその後の球形化（ｓｐｈｅｒｏｎｉｚａｔｉｏｎ）を行うことにより調製してもよい。制御された球形化を応用して、小さな大きさのＨＡ−パンクレアチン粒子を作製してもよい。噴霧コーティング、粉末レイヤリング、および流動床の技術を、不活性なコアのコーティングを介してビーズを調製するために使用してもよい。また、コアセルベーションの工程は、コーティングしたパンクレリパーゼの粒子を調製するために有益であり得る。

直接的な圧縮を使用して、賦形剤を含まない圧縮された粒子を調製してもよい。特定の例では、錠剤は、胃液と接触すると疎水性コーティング層がその場で形成されることにより、胃抵抗性を示し得る。

ＨＡ−パンクレアチンを含む組成物は、消化酵素を含む治療薬の投与に適した任意の形態であってよく、たとえば、この形態は、粉剤、ペレット、マイクロスフィア、カプセル、分包包装、錠剤、液体懸濁物、および液体溶液などであってよい。

本発明の一実施形態では、ＨＡ−パンクレアチンを含む剤形、特に、ＨＡ−パンクレアチンを含むより小さなかつ／または単一の剤形を調製できる。ＨＡ−パンクレアチンの利用率により、２５０〜２７５ｍｇのＡＰＩが充填されている、２０，０００単位力価、カプセルサイズ０のＺｅｎｐｅｐ（登録商標）の典型的な製剤組成物と比較して、カプセルの大きさを低減でき、かつ／またはさらには食事あたりのカプセルの数を減少させて用量を送達することが可能となる。成人の患者は、食事あたり当該カプセルを４〜１０個摂取し得る。全体の一日用量２００，０００ＵＳＰのリパーゼでは、現在、患者は１０個のカプセルを摂取しており、薬剤の摂取量は、約２，５００〜２，７５０ｍｇである。少なくとも２倍の純度にすることが意味のある改善であり、より純度を高くすることも求められている。実際、ＨＡ−パンクレアチンの製剤上の剤形は、約１００〜１１０ｍｇのＡＰＩ（対２５０〜２７５ｍｇ）の含有量を有し得る経口投与カプセルの形態を取っており、よって、全体の一日投与量２００，０００ＵＳＰ Ｕのリパーゼでは、患者の薬剤摂取量は、約１，０００〜１，１００ｍｇ（対２，５００〜２，７５０ｍｇ）である。さらに、サイズ２（対サイズ０）のＨＡ−パンクレアチンのカプセルを用いて、投与されるカプセルの総数をも顕著に減少させてもよく、または代替としてサイズ０のカプセルを維持し、その含量を適切に調節し、これにより毎日の摂取量を顕著に低下させてもよい。ＥＰＩの処置は、しばしば乳児期に始まる長期的な処置である。より少量の単位服用量に含めることができ、かつ／または食事あたりの単位剤形の数を減らすことができるようにパンクレリパーゼを製剤化できることは、患者にとって重要な利点となる。

本発明の新規の剤形はまた、小さな粒子の剤形を含んでもよい。単位体積あたりの効力が増大したパンクレリパーゼ生成物は、ビーズの寸法の減少に関する重要な問題を克服するであろう。市販のパンクレリパーゼの剤形の大部分は、パンクレリパーゼのビーズで充填したカプセルであり、腸溶性ポリマーでコーティングされている。このコーティングは、膵臓のリパーゼが酸性媒体中で非可逆的に不活化されることから使用されている。カプセルを開けて、ビーズを特定の食物にばらまいてもよく、この方法は、若年の患者、または嚥下困難患者もしくは服薬錠数の多さに対処するのが難しい患者にとって重要な選択肢となる。ビーズは最大２ｍｍであり得る相当の直径を有することから、この選択肢は、すべての患者の必要性に対処していない。このことは、乳児または経管栄養を必要とする患者のための液体に、このビーズを簡単に懸濁できないことを意味する。ビーズの寸法を減らす試みは、総表面積を大きく増大させることとなり、結果として粒子の増大した表面積を有効的に被覆するために、より多くの腸陽性ポリマーが必要となる。これにより、剤形のバルクが服用錠数を更に増大させ、コーティングする賦形剤のレベルが、その１日摂取量で設定される確立した上限を超える可能性がある点まで、剤形のバルクおよび摂取されるポリマー量が著しく増大することとなる。

バルクをかなり減少させたＨＡ−パンクレアチンを利用できることは、全用量を単一の単位剤形に含めることができるだけでなく、または単位剤形の数を減らすことができるだけでなく、他の化合物とパンクレリパーゼの併用を可能にする。たとえば、炭酸水素ナトリウムなどの制酸緩衝剤およびＨＡ−パンクレアチンを、単一の単位剤形に組み合わせてもよいが、このような組み合わせは、追加的なカプセル／錠剤が必要であり、かつ／または過剰な大きさのカプセル／錠剤の大きさが必要であるため、すでに非常に多くの服薬錠数を顕著に増大させることから、膵酵素と、現在のパンクレリパーゼを使用して胃のｐＨを増加させる薬剤とのそのような併用を企図することは可能ではない。

また、ＨＡ−パンクレアチンは、緩衝液が、パンクレアチンのリパーゼ成分の酸不活性化を防止することから、腸溶コーティングを用いなくとも分散可能な剤形を提供する選択肢を提供する。さらにまた、炭酸水素塩の分泌が、概してＥＰＩ患者で低減しているため、炭酸水素塩の補充もまた治療上の利益を提供し得る。この新規の剤形は、即時放出または遅延放出用に製剤化することができ、かつ液体の媒体に分散できる。この後者の特性は、この組成が、液体食または別の簡便な媒体に容易に分散可能であるため、液体食を必要とする患者にとって重要な利点を提供する。これらの併用は、様々な従来の剤形、たとえばカプセル、錠剤、分包包装、ビーズ、および液体などで送達することができる。上述するように、腸溶性ポリマーでパンクレリパーゼの剤形をコーティングする必要性は、酸性媒体中でリパーゼ酵素が不安定であるためであるが、しかしながら、プロトンポンプ阻害剤の使用を介して胃のｐＨを上げると、リパーゼを不活化するために十分低いｐＨのレベルにおそらく曝露されないため、リパーゼは活性のままであることが証明されている。この手法は、服薬錠数を増加させ、かつ別の欠点を克服するために追加的の長期的な投薬を使用することから、簡便ではなく、また必ずしも医学的に望ましいとは言えない。胃のｐＨは、炭酸水素ナトリウムなどの単純な制酸剤で一時的に中和することができ、炭酸水素ナトリウムは、薬剤Ｚｅｇｅｒｉｄ（登録商標）の成分であり、ＰＰＩオメプラゾールなどの酸不安定性の薬剤の保護に有益であることが示されている。この薬剤中の炭酸水素ナトリウムのレベルは、１．１ｇであり、オメプラゾールのレベルは、２０ｍｇまたは４０ｍｇのいずれかであり、これらの成分は、硬いシェルカプセルに含まれている。

ＨＡ−パンクレアチンおよびＨ_２アンタゴニストであるプロトンポンプ阻害剤または胆汁酸塩などの少なくとも１つの他の活性化合物の組み合わせを含む単一剤形もまた、本発明に開示されている。

本発明を用いることにより生成物が改善されている。実際に、ＨＡ−パンクレアチンの調製により、このバイオバーデンを有する材料の量を低下させる結果として、単純にバイオバーデンの低減をもたらす。しかしながら、さらに、この調製工程のために使用する方法もまた、バイオバーデンを低減させることができ、結果として妨害が著しく少ない生成物が生成される。さらに、生成物から大量の不活性材料を除去することにより、たとえば、濾過、紫外線（ＵＶ）光の曝露といった、適用される注射可能な生体物質に使用する滅菌技術の使用を可能にする。繰り返しになるが、これは、生成物の特徴において重要かつ予測し得なかった改善を表すものである。

本発明の組成物または経口剤形に存在するＨＡ−パンクレアチンは、以下の工程にしたがって調製される。

出発材料はパンクレアチンである。本発明では、この用語を、用語「ＡＰＩ」または「出発パンクレアチン」、または「出発膵酵素」、または「天然のパンクレアチン」、「出発パンクレリパーゼ」、または「天然のパンクレリパーゼ」を使用して言及することもありうる。

簡便な出発材料は、たとえばＮｏｒｄｍａｒｋ Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌ ＧｍｂＨまたはＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＬＬＣか販売されているブタ由来のパンクレリパーゼである。ウシまたは他の哺乳類の供給源由来の類似の抽出物を使用してもよい。好ましい出発材料はブタ由来のパンクレリパーゼである。粗製抽出物を生成するために使用する抽出の手順を、以下のステップを含むものとしてまとめることができる：ブタ膵腺を湿潤状態ですりつぶす；パンクレリパーゼの「アクチベータ」の添加；タンパク質を沈殿かつ脂質を除去するための冷却かつ加熱したイソプロパノールによる「粗製酵素スラリー」の処置；線維状物質を除去し、圧縮かつ濃縮するための遠心分離および濾過ステップ；「ウェットケーキ」の真空乾燥；バルク密度および粒子の大きさのための「ウェットケーキ」の粉砕および製粉。この乾燥生成物が、現在の製品として使用されるパンクレアチンである。

本発明のＨＡ−パンクレアチンは、出発パンクレアチンをさらに処置することにより調製される。この処置は、膵酵素を基とする生成物の効能にとって鍵となる要素を保存し、本質的ではない要素を除去するものである。

本発明の工程からもたらされる物質はＨＡ−パンクレアチンである。

少なくとも約１２０ＵＳＰ ＩＵ／ｍｇのリパーゼ比活性を有するＨＡ−パンクレアチンは、溶媒でパンクレアチンを処理することを含む工程を使用して調製され、上記溶媒は、２８〜４５（ＭＰａ）^０．５から構成されるヒルデブラント溶解パラメータ（ＳＰ）を有し、上記溶媒は、１つの有機溶媒、または有機溶媒の混合物、または少なくとも１つの有機溶媒と水性溶媒との混合物であり、この工程は、低温、好ましくは室温を下回る温度で実行される。

１つの実施形態では、少なくとも約１２０ＵＳＰ ＩＵ／ｍｇのリパーゼ比活性を有するＨＡ−パンクレアチンは、溶媒でパンクレアチンを処理する工程を使用して調製され、上記溶媒は、２８〜３８（ＭＰａ）^０．５から構成されるヒルデブラント溶解パラメータ（ＳＰ）を有し、上記溶媒は、１つの有機溶媒、または有機溶媒の混合物、または少なくとも１つの有機溶媒と水性溶媒との混合物であり、工程が、低温、好ましくは室温を下回る温度で実行されている。

１つの特定の実施形態では、少なくとも約１２０ＵＳＰ ＩＵ／ｍｇのリパーゼ比活性を有するＨＡ−パンクレアチンは、溶媒でパンクレアチンを処理することを含む工程を使用して調製され、上記溶媒が、２８〜３４（ＭＰａ）^０．５から構成されるヒルデブラント溶解パラメータ（ＳＰ）を有し、上記溶媒は、１つの有機溶媒、または有機溶媒の混合物、または少なくとも１つの有機溶媒と水性溶媒との混合物であり、この工程は、低温、好ましくは室温を下回る温度で実行される。

別の特定の実施形態では、少なくとも約１２０ＵＳＰ ＩＵ／ｍｇのリパーゼ比活性を有するＨＡ−パンクレアチンは、溶媒でパンクレアチンを処理することを含む工程を使用して調製され、上記溶媒が、３４〜３８（ＭＰａ）^０．５から構成されるヒルデブラント溶解パラメータ（ＳＰ）を有し、上記溶媒は、１つの有機溶媒、または有機溶媒の混合物、または少なくとも１つの有機溶媒と水性溶媒との混合物であり、この工程は、低温、好ましくは室温を下回る温度で実行される。

別の実施形態では、少なくとも約１２０ＵＳＰ ＩＵ／ｍｇのリパーゼ比活性を有するＨＡ−パンクレアチンは、溶媒でパンクレアチンを処理することを含む工程を使用して調製され、上記溶媒が、３４〜４５（ＭＰａ）^０．５から構成されるヒルデブラント溶解パラメータ（ＳＰ）を有し、上記溶媒は、１つの有機溶媒、または有機溶媒の混合物、または少なくとも１つの有機溶媒と水性溶媒との混合物であり、この工程は、低温、好ましくは室温を下回る温度で実行される。

１つの特定の実施形態では、少なくとも約１２０ＵＳＰ ＩＵ／ｍｇのリパーゼ比活性を有するＨＡ−パンクレアチンは、溶媒でパンクレアチンを処理することを含む工程を使用して調製され、上記溶媒が、３８〜４５（ＭＰａ）^０．５から構成されるヒルデブラント溶解パラメータ（ＳＰ）を有し、上記溶媒は、１つの有機溶媒、または有機溶媒の混合物、または少なくとも１つの有機溶媒と水性溶媒との混合物であり、この工程は、低温、好ましくは室温を下回る温度で実行される。

ＨＡ−パンクレアチンは、少なくとも約１２０ＵＳＰ ＩＵ／ｍｇ、または少なくとも約１５０ＵＳＰ ＩＵ／ｍｇ、または少なくとも約２００ＵＳＰ ＩＵ／ｍｇ、または少なくとも約４００ＵＳＰ ＩＵ／ｍｇ、または少なくとも約５００ＵＳＰ ＩＵ／ｍｇのリパーゼ比活性を有し得る。

ヒルデブラント溶解パラメータは、特定の溶媒の相対的な溶解力を示す数値である。これは、溶媒の凝集エネルギー密度に由来し、言い換えると気化熱に由来する。ヒルデブラントの値は、Ｂａｒｔｏｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， １９８３などの文献から利用可能である。この工程の溶媒は、１つの有機溶媒、または複数の有機溶媒の混合物、または少なくとも１つの有機溶媒と水性溶媒との混合物であり、有機溶媒と水性溶媒との混合物は、１つまたは複数の有機溶媒と、１つまたは複数の水性溶媒とを含み得る。この溶媒は、以下の溶解度の値：４５、４２、４０、３８、３６、３５、３４、および２８を有しうる。

有機溶媒は、ｎ−ペンタン、ｎ−ヘキサン、ｎ−へプタン、ジエチルエーテル、シクロヘキサン、四塩化炭素、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、クロロホルム、トリクロロエチレン、アセトン、ジメチルホルムアミド、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、エタノール、ジメチルスルホキシドブチルアルコール、メタノール、アセトニトリル、ジオキサン、および塩化メチレン（ｍｅｔｈｙｌｅｎｃｈｌｏｒｉｄｅ）を含む溶媒の群から選択され得る。好ましい有機溶媒は、アセトン、イソプロパノール、およびエタノールである。

水性溶媒は、水または緩衝溶液からなる群から選択され得る。好ましい緩衝液は、ｐＨ＝７またはｐＨ＝４であり、これらはそれぞれ、ｐＨ＝７、１０ｍＭのリン酸塩緩衝液、およびｐＨ＝４．０、１０ｍＭの酢酸塩の緩衝液であり得る。

本発明の一実施形態では、溶媒は、１つまたは複数の有機溶媒および１つの水性溶媒を含む混合物であって、上記混合物が、２８〜４５（ＭＰａ）^０．５の範囲のヒルデブラント溶解パラメータを有する。本発明の実施形態では、溶媒は、１つまたは複数の有機溶媒および１つの水性溶媒を含む混合物であって、上記混合物が、２８〜３８（ＭＰａ）^０．５の範囲のヒルデブラント溶解パラメータを有する。１つの特定の実施形態では、溶媒は、１つまたは複数の有機溶媒および１つの水性溶媒を含む混合物であって、上記混合物は、２８〜３４（ＭＰａ）^０．５の範囲のヒルデブラント溶解パラメータを有する。１つの特定の実施形態では、溶媒は、１つまたは複数の有機溶媒および１つの水性溶媒を含む混合物であって、上記混合物は、３４〜３８（ＭＰａ）^０．５の範囲のヒルデブラント溶解パラメータを有する。別の実施形態では、溶媒は、１つまたは複数の有機溶媒および１つの水性溶媒を含む混合物であって、上記混合物は、３４〜４５（ＭＰａ）^０．５の範囲のヒルデブラント溶解パラメータを有する。１つの特定の実施形態では、溶媒は、１つまたは複数の有機溶媒および１つの水性溶媒を含む混合物であって、上記混合物は、３８〜４５（ＭＰａ）^０．５の範囲のヒルデブラント溶解パラメータを有する。溶媒混合物のＳＰは、ヒルデブラント溶解パラメータを使用して計算する。

１つの実施形態では、溶媒は、３８（ＭＰａ）^０．５のＳＰを有し、水性溶媒と有機溶媒の混合物である。ＳＰ＝３８を有するこのような２成分溶媒のいくつかの例として、
アセトン‐緩衝液：ｐＨ＝７の緩衝液に対するアセトンの体積比率は、３５：６５である；ｐＨ＝４．０の緩衝液に対するアセトンの体積比率は、３５：６５である；ＳＰ（アセトン）＝２０．２、ＳＰ（緩衝液）＝４７．９
エタノール−緩衝液：ＰＨ＝７の緩衝液に対するエタノールの体積比率は、４５：５５である；ｐＨ＝４．０の緩衝液に対するエタノールの体積比率は４５：５５である；ＳＰ（エタノール）＝２６．０、ＳＰ（緩衝液）＝４７．９
がある。

別の実施形態では、ＳＰ＝３４（ＭＰａ）^０．５の２成分溶媒は、アセトン‐緩衝液である：ｐＨ＝７の緩衝液に対するアセトンの体積比率は５０：５０である；ＳＰ（アセトン）＝２０．２、ＳＰ（緩衝液）＝４７．９。

さらなる別の実施形態では、ＳＰ＝３５（ＭＰａ）^０．５の２成分溶媒は、アセトン‐緩衝液である：ｐＨ＝７の緩衝液に対するアセトンの体積比率は４５：５５である；ＳＰ（アセトン）＝２０．２、ＳＰ（緩衝液）＝４７．９。

本発明の一実施形態（単一のステップ工程）では、２８〜４５（ＭＰａ）^０．５のＳＰを有する溶媒でパンクレアチンを処理することは、以下の：ａ１）撹拌しながら溶媒にパンクレアチンを懸濁するステップと、ａ２）ステップａ２）の混合物の可溶部分（上清）から不溶部分（ペレット）で分離するステップと、ａ３）ａ１で得た不溶部分を乾燥させるステップとを含み、上記ステップａ１〜ａ３は、室温より低い温度で実行される。この工程の実行に適した温度は４℃である。

本発明の一実施形態（単一のステップ工程）では、３４〜３８（ＭＰａ）^０．５のＳＰを有する溶媒でパンクレアチンを処理することは、以下の：ａ１）撹拌しながら溶媒にパンクレアチンを懸濁するステップと、ａ２）ステップａ２の混合物の可溶部分（上清）から不溶部分（ペレット）で分離するステップと、ａ３）ステップａ１で得た不溶部分を乾燥させるステップとを含み、ステップａ１〜ａ３は、室温より低い温度で実行される。この工程の実行に適した温度は４℃である。

ステップ１ａは、好ましくは約６０分間実行される。好ましい温度は４℃である。分離ステップ（ステップａ２）は、遠心分離、沈降、または濾過などの異なる方法により実行され得る。乾燥ステップ（ａ３）は、たとえば、効率の高い乾燥器、真空ポンプ、凍結乾燥器で行うことができ、他の方法もまた使用できる。ステップａ１の溶媒中のパンクレアチンの濃度は、好ましくは、０．０５０〜０．３ｍｇ／ｍＬから構成される量、好ましくは０．０６５〜０．１ｍｇ／ｍＬの量であり、好ましくは０．０６５ｍｇ／ｍＬまたは０．１ｍｇ／ｍＬである。

単一のステップ工程である１つの特定の実施形態では、溶媒は、３８（ＭＰａ）^０．５のＳＰを有し、アセトンおよびｐＨ７の緩衝液（１０ｍＭのリン酸塩）の混合物であり、ステップａ１のパンクレアチンは１０ｇ／ｍＬの濃度である。

本発明の別の実施形態（２つのステップの工程）では、溶媒は、有機溶媒と水性溶媒との混合物であり、まずパンクレアチンを水性溶媒に分散して、次いで有機溶媒をその上に添加する。この実施形態では、ステップａ１は、以下の、ａ１．１（懸濁）撹拌しながら水性溶媒にパンクレアチンを懸濁するステップと、ａ１．２（沈殿）有機溶媒またはその混合物をステップａ１．１の懸濁物に添加するステップとを含む。ステップａ１．１の混合物は静的条件下で保存される。ステップａ１．１の持続時間は、スケールおよび器具に応じて約１０〜約３０分である。ステップａ１．２の持続時間は約３０分である。

水性溶媒中のパンクレアチンは、０．０５０〜０．３ｍｇ／ｍＬから構成される量、好ましくは０．１〜０．３ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０または０．３ｍｇ／ｍＬの量であり、有機溶媒は、好ましくはエタノールまたはアセトンのいずれかであり、水性溶媒は、好ましくはｐＨ＝４．０の緩衝液（１０ｍＭの酢酸塩緩衝液など）またはｐＨ７の緩衝液（１０ｍＭのリン酸塩など）である。

単一のステップ工程の１つの特定の実施形態では、溶媒は、３８（ＭＰａ）^０．５のＳＰを有し、アセトンおよびｐＨ７の緩衝液（２０ｍＭのリン酸塩など）の混合物であり、ステップａ１のパンクレアチンは、０．１ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。

単一ステップ工程の別の特定の実施形態では、溶媒は、３８（ＭＰａ）^０．５のＳＰを有し、アセトンおよびｐＨ４の緩衝液（１０ｍＭの酢酸塩緩衝液など）の混合物であり、ステップａ１のパンクレアチンは、０．１ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。

本発明のさらなる別の実施形態（複数のステップ工程）では、溶媒が有機溶媒と水性溶媒との混合物である際、まずパンクレリパーゼを水性溶媒に分散し、次いで有機溶媒を、この水性分散物の可溶部分に添加する。この実施形態では、工程ステップａ１は、以下の、ａ１．１）（懸濁）撹拌しながら水性溶媒にパンクレアチンを懸濁するステップと、ａ１．２）（分離）不溶部分（ペレット）からステップａ１．１の可溶部分（上清）を分離するステップと、ａ１．３）（沈殿）、有機溶媒またはその混合物を、ステップａ１．２の可溶部分に添加するステップとを含む。

ステップａ１．１は、好ましくは約３０分実行される。ステップａ１．３の混合物は、約１５分間静的条件下で保存される。これらのステップに好ましい温度は４℃である。

水性溶媒中のパンクレアチンは、好ましくは、０．０５〜０．３ｍｇ／ｍＬから構成される量、好ましくは０．１〜０．３ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．１または０．３ｍｇ／ｍＬの量で存在する。使用する溶媒のＳＰは、好ましくは３８である。有機溶媒は、好ましくはエタノールまたはアセトンのいずれかであり、水性溶媒は、好ましくはｐＨ＝４．０の緩衝液（１０ｍＭの酢酸塩緩衝液など）またはｐＨ７の緩衝液（１０ｍＭのリン酸塩など）である。

複数のステップの工程の１つの特定の実施形態では、溶媒は、３８（ＭＰａ）^０．５のＳＰを有し、アセトンおよびｐＨ４．０の緩衝液（１０ｍＭの酢酸塩緩衝液など）の混合物であり、ステップａ１のパンクレアチンは、０．３ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。

複数のステップの工程のさらなる別の実施形態では、溶媒は、３８（ＭＰａ）^０．５のＳＰを有し、エタノールおよびｐＨ４．０の緩衝液（１０ｍＭの酢酸塩緩衝液など）の混合物であり、ステップａ１のパンクレアチンは、０．３ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。

複数のステップの工程のさらなる別の実施形態では、溶媒は、３８（ＭＰａ）^０．５のＳＰを有し、エタノールおよびｐＨ４．０の緩衝液（１０ｍＭの酢酸塩緩衝液など）の混合物であり、ステップａ１のパンクレアチンは、０．１ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。

複数のステップの工程のさらなる別の実施形態では、溶媒は、３８（ＭＰａ）^０．５のＳＰを有し、アセトンおよびｐＨ７の緩衝液（１０ｍＭのリン酸塩緩衝液など）の混合物であり、ステップａ１のパンクレアチンは、０．３ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。

分離ステップ（ステップａ２およびａ１．２）は、遠心分離または濾過などの異なる方法により実行され得る。ＨＡ−パンクレアチンの調製工程のうちすべての工程ステップは、温度制御下で実行されており、この温度は常に室温を下回り、好ましくは約４℃であり、湿度もまた制御され得る。

本発明の工程は、ＨＡ−パンクレアチンの滅菌、およびウイルスの不活性化またはウイルス負荷の低下を含み得るが、これは濾過、加熱、照射（紫外線照射、Ｘ線照射、β線照射、およびガンマ線照射）、高圧処理および／またはβプロピオラクトン（ｐｒｏｐｒｉｏｌａｃｔｏｎｅ）（ＢＰＬ）を使用するなどの核酸のアルキル化により、実行され得る。約１８時間超、好ましくは１８〜４８時間、さらにより好ましくは１８〜３０時間といった適切な時間、８５℃超、好ましくは８５℃〜１００℃などの温度での加熱は、ウイルス混入物の低減にも有効である。０．５重量％以下の残留水分を有する固体のＨＡ−パンクレアチンに、低温での加熱（８４℃、好ましくは８０℃）を行ってもよい。

本発明に開示される手法には多くの利点があることが上記から明らかである。本発明の手法は、消化液に存在し、出発材料の消化を維持する消化酵素の天然のスペクトルおよび天然の供給源を保持するものである。本発明の手法は、粗製物抽出工程の結果として残っている消化に必要とされていない材料を除去するものであり、よって、ＡＰＩのバルクが減少する。本発明の手法により、細菌またはウイルス混入物の低減または除去が可能となる。本発明の手法により、混合した酵素クラスの互いに対する比率の制御が可能となる。さらにＡＰＩを、高力価の多数の剤形に製剤化できる。

本明細書中に記載の本発明は、上述の理由により、現存する生成物よりもすぐれており、かつ治療に顕著な進歩を提示する生成物をもたらすものである。

実験
材料
パンクレアリパーゼ（ＡＰＩ、出発パンクレリパーゼまたはパンクレアチン、天然のパンクレリパーゼまたはパンクレアチン）は、Ｎｏｒｄｍａｒｋにより提供される。これは、ブタ膵臓から抽出され、典型的にタンパク質を約３０％含み（ブラッドフォード法で定量化）、９４．４ＩＵ／ｍｇのリパーゼ活性、２５３．２ＩＵ／ｍｇのプロテアーゼ活性、４２０．３ＩＵ／ｍｇのアミラーゼ活性を有し、Ｐ／Ｌ比は２．７、Ａ／Ｌ比は４．５であり、水の含量は０．３である。この材料を、１次元および２次元の電気泳動、次いでＭＡＬＤＩ ＴＯＦによる特徴付けにより解析して、パンクレリパーゼの構成成分を同定する（Ｍａｒｉｏ Ｎｅｇｒｉ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｍｉｌａｎ， Ｉｔａｌｙ）。この抽出物の２次元の電気泳動から、水に明らかに容易に可溶である画分の中に少なくとも５０のタンパク質／ペプチドスポット、および水に明らかに容易に可溶ではない画分の中に３０のタンパク質／ペプチドスポットが存在することが示される。溶解度の決定は、活性酵素が上に吸着し得る、またはパンクレリパーゼの水不溶性成分により捕捉され得るという事実により混同される。また溶解度は、ｐＨの関数でもある。混合物中の個々のタンパク質に対応するスポット、および可溶性の高いまたは可溶性の低い画分を使用して調製したゲルの画像を、主なスポットを切断してウシのトリプシンで消化させ、かつマトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）および酵素電気泳動を使用して解析した後に解析する。ペプチド質量フィンガープリントを、ライブラリーの参照物質のフィンガープリントと比較し、アミラーゼ、リパーゼ、コリパーゼ、カルボキシペプチダーゼＡ１およびＢ、エラスターゼ２Ａおよび１、キモトリプシン、トリプシン、およびホスホリパーゼＡ２を同定する。この抽出物は、明らかに、比較的粗製であり、多くの活性酵素種に加えて多くの外来性タンパク質を含む。

腸溶製剤：Ｐｅｐｔａｍｅｎ（登録商標） Ｊｕｎｉｏｒ １．０ Ｃａｌ（Ｎｅｓｔｌｅ、２５０ｍＬ包装）：脂肪含有量：３．８ｇ／１００ｍＬ、タンパク質含有量：３ｇ／１００ｍＬ、脂肪および炭水化物含有量：２０．４ｇ／Ｍｌ。

方法
脂肪分解活性：パンクレリパーゼ酵素ＵＳＰのモノグラフに記載のリパーゼアッセイの標準的な手順に基づく方法を用いて測定を実行し、これは、使用する基質（オリーブ油）中のエステル型脂肪酸の加水分解から形成される遊離脂肪酸の、ｐＨスタット法による滴定に基づく。これは、以下の原理に基づく：リパーゼは、トリグリセリドの加水分解を触媒し、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）の形成をもたらす。形成したＦＦＡを経時的に滴定すると、リパーゼの酵素活性が決定され、これを、単位で表記することができる：１Ｕ＝１分間に形成されたＦＦＡ１μモル。ｐＨの値が、固定値と比較して変化する場合（ＰＨスタット法）、ＮＡＯＨ（滴定剤）の添加を提供する実験系を介して安定したｐＨ値を維持することにより反応が起こる。添加した滴定剤の経時的な量は、トリグリセリドに対するリパーゼの作用により形成されたＦＦＡの量に対応する。曲線の勾配（添加した滴定剤＝ｆ（体積（ｍＬ）／時間（分））は、リパーゼの酵素活性を与える。

以下に報告するリパーゼ活性（ＬＡ）は、常にＩＵ ＵＳＰとして表される。

以下に報告するリパーゼの比活性（ＬＳＡ）は、常に、ＩＵ ＵＳＰ／ ｍｇとして表される。

タンパク質分解活性およびアミロース分解活性：パンクレリパーゼ酵素のＵＳＰモノグラフに記載の標準的な手法に従って測定を行う。以下で報告する酵素の比活性（ＳＡ）を、常にＩＵ ＵＤＰ／ｍｇとして表す。

水分含有量を、８０℃で４時間（試料１８、１９、および２０）でのＴＧＡ、またはカールフィッシャー法（試料２６、２７、および２８）により測定する。

内部標準物質としてパルミチン酸コレステリルを使用して、ヘキサン：イソプロパノール（３：２）でトリグリセリドを抽出し、ＨＰＬＣにより解析する。全ての保持時間を標準物質のトリオレイン溶液と比較することにより、ピークを同定する。

タンパク質解析：総タンパク質含有量をブラッドフォードアッセイで定量化する。
炭水化物の解析：１）短鎖の糖を、内部標準物質としてキシリトールを使用したＨＰＬＣにより解析する。全ての保持時間を、糖の標準物質、すなわちマルトースと比較することにより、ピークを同定する。２）マルトデキストリンを、Ｃａｒｒｅｚ ＩおよびＣａｒｒｅｚＩＩの存在下で抽出し、ＨＰＬＣにより解析し、全ての保持時間を、マルトデキストリンの標準物質、すなわちマルトース一水和物、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、およびマルトヘプタオースと比較することにより、ピークを同定する。

実施例
実施例１
ＨＡ−パンクレアチンの調製；０．１ｇ／ｍＬ；マルチステップ：懸濁、分離、沈殿（ＳＰ＝３８：アセトン：水性溶媒＝３５：６５；エタノール：溶媒水性溶媒＝４５：５５）

ステップａ１．１‐懸濁：出発パンクレリパーゼを、０．１ｇ／ｍＬの濃度、４℃で水性溶媒に分散し、３０分間撹拌し続ける。この実験を、６５０ｍｇ（有機溶媒がアセトンの場合）または５５０ｍｇ（有機溶媒がエタノールの場合）の出発パンクレリパーゼのいずれかを使用して実験室規模で実行する。４つの異なる水性溶媒：１）ｐＨ＝４．０の緩衝液（１０ｍＭの酢酸塩緩衝液）；２）ｐＨ＝７．０の緩衝液（１０ｍＭのリン酸塩）；３）脱イオン水（ＤＷ）；４）ＮａＣｌ（０．５Ｍ）を含むｐＨ＝４．０の緩衝液（１０ｍＭの酢酸塩）を、パンクレリパーゼの懸濁に関して試験する。

ステップａ１．２‐分離：ステップａ．１．１からの懸濁物を遠心分離（１０分、４℃、約１１，０００ｇ）し、上清（ＳＮ）をペレットから分離する。

ステップａ１．３‐沈殿：有機溶媒を、ステップａ．１．２の上清に添加し、混合物を静的条件で１５分間、４℃で保存する。有機溶媒はアセトンまたはエタノールのいずれかである。アセトンは、水性溶媒それぞれ６５部（体積）あたり３５部（体積）の量で添加する。エタノールは、水性溶媒それぞれ５５部（体積）あたり４５部（体積）の量で添加する。

ステップａ２‐分離：混合物を遠心分離（１０分、４℃、約１１，０００ｇ）して、パンクレリパーゼ酵素を含むペレットから上清を分離する。このペレットをステップａ１．１で使用した水性溶媒に再度懸濁する（再懸濁後のペレットのＬＡ、沈殿物）。

異なるステップの材料を解析する。リパーゼ活性（ＬＡ）として表すパンクレリパーゼの量を、
ステップａ１の懸濁物（懸濁物のＬＡ；ＬＡ−Ｓａ．１．１）
ステップａ２で得られた上清（ＳＮのＬＡ、沈殿物、ＬＡ−ＳＮ）
ステップａ２で得、次いで出発媒体に再度懸濁したペレット（ペレットのＬＡ、沈殿物、ＬＡ−Ｐ）
で測定する。

結果を表１、２、３、および４に記録する。

表１は、パンクレリパーゼの沈殿物（ステップａ１．３）が、沈殿部分（ペレット）においてリパーゼ活性の約６７〜約７７％の範囲の良好な回収を可能にすることを示す。収率は、最初の懸濁したパンクレリパーゼのリパーゼ活性に関するステップａ２（ペレットおよび上清）の総リパーゼ活性の％であり、ステップａ１．１（Ｓａ１．１）の懸濁物のリパーゼ活性：（ＬＡ−ＳＮ＋ＬＡ−Ｐ）／（ＬＡ−Ｓａ．１．１）として表す。

この工程の収率は、約３７〜約５６％の範囲である。収率％は、ステップａ１．ａで使用したパンクレリパーゼの理論上のリパーゼ活性に関する、ステップａ２のペレットおよび上清の総リパーゼ活性であり、無処置の原材料の比活性（すなわち、標準的なＵＳＰ法に従って決定した９４．４ＩＵ ＵＳＰ／ｍｇ）およびその初期重量を因数分解することにより計算される。

濃縮係数（ｐＨ非依存的）は、ステップａ２のペレットのリパーゼ活性と、出発パンクレアチン（９４．４ＩＵ／ｍｇである）のリパーゼ活性のとの比率を計算することにより決定する。この工程により最大２．５の濃縮係数が得られる。またこの濃縮は、ＨＰＬＣプロファイル解析によっても確認される。

他の消化酵素に関して、最終ペレット（ステップａ２の沈殿物）のアミラーゼ含有量は、出発パンクレリパーゼのアミラーゼ含有量よりも少ない。

実施例２．ＨＡ−パンクレアチンの沈殿；０．３ｇ／ｍＬ；マルチステップ：懸濁、分離、沈殿（ＳＰ＝３８：アセトン：水性溶媒＝３５：６５；エタノール：水性溶媒＝４５：５５）
ステップａ．１．１‐懸濁：パンクレリパーゼ（ＡＰＩ）を、０．３ｇ／ｍＬの濃度、４℃で水性溶媒に分散し、３０分間撹拌する。この実験を、６５０ｍｇ（有機溶媒がアセトンの場合）または５５０ｍｇ（有機溶媒がエタノールの場合）の出発パンクレリパーゼのいずれかを使用して、実験室規模で行う。２つの実験を、異なる水性溶媒：１）ｐＨ＝４．０の緩衝液（１０ｍＭの酢酸塩緩衝液）；２）ｐＨ＝７．０の緩衝液（１０ｍＭのリン酸塩）のそれぞれにおいて行う。
ステップａ１．２−分離：ステップａ１からの懸濁物を遠心分離（１０分、４℃、約１１，０００ｇ）し、上清（ＳＮ）を、ペレットから分離する。
ステップａ１．３−沈殿：有機溶媒を、ステップａ１．２の上清に添加し、混合物を、静的条件で１５分間、４℃で保存する。有機溶媒はアセトンまたはエタノールのいずれかである。アセトンは、水性溶媒それぞれ６５部（体積）あたり３５部（体積）の量で添加する。エタノールは、水性溶媒それぞれ５５部（体積）あたり４５部（体積）の量で添加する。

ステップａ２−分離：この混合物を遠心分離（１０分、４℃、約１１，０００ｇ）して、パンクレリパーゼ酵素を含むペレットから上清を分離する。ペレットを、出発水性溶媒に再度懸濁する（再懸濁後のペレットのＬＡ、沈殿物）。
ステップａ３‐乾燥：ステップａ２のペレットを乾燥させる。

異なるステップの材料を解析する。パンクレリパーゼの量を、リパーゼ活性（ＬＡ）として表し、
ステップａ１の懸濁物（懸濁物のＬＡ；ＬＡ−Ｓａ１．１）；
ステップａ２で得られた上清（ＳＮのＬＡ、沈殿物、ＬＡ−ＳＮ）；
ステップａ２で得られ、次いで出発水性媒体で再度懸濁したペレット（ペレットのＬＡ、沈殿物、ＬＡ−Ｐ）
で測定する。

結果を、表４、５、および６に記録する。

表４は、沈殿後の回収率が非常に良好（７３〜９２％）であることを示す。

０．３ｇ／ｍＬのパンクレリパーゼの濃度で実行したマルチステップの工程の総収率は、約５６〜約６４の範囲にある。

濃縮係数を、ステップａ２のペレットのリパーゼ活性と、ステップａ１．１の出発パンクレリパーゼのリパーゼ活性（９４．４Ｕ／ｍｇ）との比率を計算することにより計算する。濃縮係数は、１．９〜３．０の範囲にある。

実施例３ ＨＡ−パンクレアチンの調製；０．１ｇ／ｍＬ：２ステップ：懸濁、沈殿（ＳＰ＝３８：アセトン：水性溶媒＝３５：６５；エタノール：水性溶媒＝４５：５５、ＳＰ（アセトン）＝２０．２、ＳＰ（エタノール）＝２６．０、ＳＰ（緩衝液）＝４７．９）
ステップａ１．１−懸濁：パンクレリパーゼを、０．１ｇ／ｍＬの濃度、４℃で水性溶媒に分散し、３０分間撹拌し続ける。この実験を、６５０ｍｇ（有機溶媒がアセトンの場合）または５５０ｍｇ（有機溶媒がエタノールの場合）の出発パンクレリパーゼを使用して実験室規模で実行する。２つの実験を、異なる水性溶媒：１）ｐＨ＝４．０、１０ｍＭの酢酸塩緩衝液；２）ｐＨ＝７．０、１０ｍＭのリン酸塩緩衝液でそれぞれ行う。
ステップａ１．２‐沈殿：有機溶媒を、ステップａ１．１の懸濁物に添加し、この混合物を、４℃で１５分間保存する。この有機溶媒はアセトンまたはエタノールのいずれかである。アセトンは、水性溶媒それぞれ６５部（体積）あたり３５部（体積）の量で添加する。エタノールは、水性溶媒それぞれ５５部（体積）あたり４５部（体積）の量で添加する。
ステップａ．２−分離：混合物を遠心分離（１０分、４℃、約１１，０００ｇ）して、膵酵素を含むペレットから上清を分離する。ペレットを、出発水性溶媒に再度懸濁する（再懸濁後のペレットのＬＡ、分離物）。
異なるステップの材料を解析する。パンクレリパーゼの量をリパーゼ活性として表し、全行程に沿って、
ステップａ１．１の懸濁物（懸濁物のＬＳＡ；ＬＡ−Ｓａ１．１）
ステップａ２で得られた上清（ＳＮのＬＡ，分離物、ＬＡ−ＳＮ）；
ステップａ２で得られ、次いで出発媒体に再度懸濁したペレット（ペレットのＬＡ、沈殿物、ＬＡ−Ｐ）
で測定する。

結果を表７、８、および９に記録する。

沈殿後の回収率は高く、ほぼ完全な回収が、２ステップ工程で達成される。

全工程の収率は７３．１〜８４．５の範囲にあり、複数のステップの工程を用いて得た収率よりも高い。収率％は、ステップａ１．１で使用したパンクレアチンの理論上のリパーゼ活性に関する、ステップａ２のペレットおよび上清の総リパーゼ活性であり、これは、出発材料（すなわち標準的なＵＳＰ法により決定した９４．４ＩＵ ＵＳＰ／ｍｇ）の比活性およびその初期重量を因数分解することにより計算する。

この結果から、２ステップ工程におけるｐＨ＝７の水性緩衝液およびアセトンの使用が、興味深い収率（総工程の収率が約７６％）、ならびに２．１〜４．２の範囲の濃縮係数が提供することが示される。

実施例４ ＨＡ−パンクレアチンの調製；０．１ｇ／ｍＬ；２ステップ；懸濁、沈殿、スケールアップ（ＳＰ＝３８：アセトン：水性溶媒＝３５：６５）
ステップａ１．１−懸濁：６．５ｇの出発パンクレリパーゼ（６１，４００ＩＵ リパーゼ）を、ｐＨ＝７．０の緩衝液（１０ｍＭのリン酸塩緩衝液）４５ｍｌに４℃で分散し、各サイクル１分間で、撹拌（Ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘ、３サイクル）する。この攪拌機を１０ｍｌの冷却緩衝液１０ｍｌで２回洗浄し、残りのパンクレリパーゼを回収する。
ステップａ１．２‐沈殿：３５ｍＬのアセトンを、ステップａ１．１の懸濁物に添加し、混合物を静的条件下で、３０分間４℃で保存する。
ステップａ２−分離：混合物を遠心分離（１５分、４℃、約２，７００ｇ）して、
膵酵素を含むペレットから上清を分離する。
ステップａ３−乾燥：ペレットを、２つの異なるプロトコルに従って乾燥させる。ペレットの平均乾燥重量は１．５５ｇであり、リパーゼ活性（ＬＡ）は３６５，０００ＩＵリパーゼであり、比活性（ＬＳＡ）は２３５ＩＵ ＵＳＰ／ｍｇである。

表１０は、２つのプロトコルで得た各材料に関して測定したリパーゼ（Ｐ）、プロテアーゼ（Ｐ）、およびアミラーゼ（Ａ）の比活性を報告する。ペレットのリパーゼ活性（１ｍＬの緩衝液中の懸濁後に測定）は、乾燥処理の前にも測定する。これは、２３３．７ＩＵ ＵＳＰ／ｍｇに達する。

この解析から、乾燥工程自体は、ＬＳＡに影響を与えず、プロトコルが異なっても同一の酵素活性を有する材料をもたらすことが示される。前の実施例で計算された濃縮係数も常に２を超え、異なるプロトコルの間で一定である。これは、２．５（試料１８）、２．７（試料１９）、２．３（試料１０）であり、平均値は２．５である。乾燥処理の前に測定したペレットのリパーゼ活性は、合計２３３．７ＩＵ ＵＳＰ／ｍｇ（試料１８）に達する。

異なるプロトコルを用いて得た試料のＨＰＬＣプロファイルを、重ねることができる（ｓｕｐｅｒ−ｉｍｐｏｓａｂｌｅ）。出発材料のＨＰＬＣプロファイルとの関連する定性的な差は観察されなかった。

実施例５ ＨＡ−パンクレアチンの調製；０．１ｇ／ｍＬ；２ステップ；懸濁、調製；スケールアップ（ＳＰ＝３８：エタノール：水性溶媒（ｐＨ＝７）＝４５：５５、試料２１）；（ＳＰ＝３４：アセトン：水性溶媒（ｐＨ＝７）＝５０：５０ 試料２２）；（ＳＰ＝３５：アセトン：水性溶媒（ｐＨ＝７）＝４５：５５、試料２３）。実施例４の調製工程を、ここで異なる量の出発パンクレリパーゼ、異なる量の緩衝溶液、および異なる量のアセトン（ＨＳ＝３４または３５）またはエタノールの量（ＨＳ＝３８）に適用する。乾燥プロトコルは、２４時間、６〜８℃、０．２ｍｂａｒであり、他の全てのパラメータおよび条件は、実施例４と同一である。

結果を表１３および１４に報告する。

このデータから、乾燥工程自体はＬＡに影響を与えるものではなく、プロトコルが異なっても、同一の酵素活性を有する材料をもたらすことが示される。上述の実施例のように計算した濃縮係数は、１．６（試料２１）、１．３（試料２２）、１．７（試料２３）である。

表１４は、ここで適用したスケールアップ工程で得た最終的な精製材料の酵素活性および酵素の収率を示す。

異なる凍結乾燥プロトコルで得た試料のＨＰＬＣプロファイルは、重ねることができる。出発材料のＨＰＬＣプロファイルとの関連する定性的な差は観察されていない。

異なるプロトコルで得た試料２５および２６から、プロトコル（ＨＳ＝３８）で示された試料２４よりも低い比ＬＡおよび高いＰＡおよびＡＡが示される。

実施例６ ＨＡ−パンクレアチンの調製；０．０６５および０．１ｇ／ｍＬ；単ステップ：実験室規模（ＳＰ＝３８−アセトン：水性溶媒＝３５：６５）
ステップａ１−懸濁‐沈殿：６５０ｍｇ（試料２４）または１０００ｍｇ（試料２５）の天然のパンクレリパーゼを、４℃で３０分間撹拌しながら、緩衝液（ｐＨ＝７、１０ｍＭのリン酸塩）およびアセトンの６５：３５の混合物（６５容量の緩衝液および３５容量のアセトン）１０ｍＬに分散する。
ステップａ２−分離：ステップａ１の混合物を遠心分離（１０分、１０，０００ｇ、４℃）して、膵酵素を含むペレットから上清を分離する。
ステップａ３）−乾燥：ペレットを、高効率ポンプを用いて０．２ｍｂａｒで乾燥する。

この材料を解析する。リパーゼ活性として表すパンクレリパーゼの量を、全行程に沿って、
ステップａ２で得た上清（ＳＮのＬＡ、分離物、ＬＡ−ＳＮ）；
ステップａ２で得て、出発媒体で再度懸濁したペレット（ペレットのＬＡ、沈殿物、ＬＡ−Ｐ）；
で測定する。
懸濁物のＬＡ−ステップａ１の沈殿物（懸濁物のＬＡ；ＬＡ−ＳＮ）は、理論値として表す。

結果を、表１５および１６に記録する。

単ステップ工程は、良好な収率、および２ステップ工程よりも高い反応係数を提供する。これは実施が簡単であり、直接的であることから、工業化にとって興味深いことである。

実施例７ ＨＡ−パンクレアチンの調製；０．１ｇ／ｍＬ；単ステップ；パイロットスケール（ＳＰ＝３８−アセトン：水性溶媒：３５：６５）
ステップａ１‐懸濁‐沈殿：１０ｇの天然のパンクレリパーゼを、６０分間、４℃で撹拌しながら、緩衝液（ｐＨ＝７、１０ｍＭのリン酸塩）およびアセトンの溶媒混合物（６５容量の緩衝液および３５容量のアセトン）１００ｍＬに分散する。
ステップａ２−分離：ステップａ１の混合物を遠心分離（１０分、２，７００ｇ、４℃）して、膵酵素を含むペレットから上清を分離する。
ステップａ３）−乾燥、試料２６のペレットを、ペトリ皿に注ぎ、試料２８および２９のペレットは、遠心管に保存したままにし、高効率ポンプを使用して０．２ｍｂａｒで直接乾燥させる。

材料を解析する。リパーゼ活性として表されるパンクレリパーゼの量は、全工程に沿って、
ステップａ２で得た上清（ＳＮのＬＡ、分離物、ＬＡ−ＳＮ）；
ステップａ２で得、次いで、出発媒体で再度懸濁したペレット（ペレットのＬＡ、分離物、ＬＡ−Ｐ）
で測定する。
懸濁‐沈殿ステップａ１のＬＡ（懸濁物のＬＡ；ＬＡ−ＳＮ）は、理論値として表される。

結果を、表１７および１８に報告する。

リパーゼ、プロテアーゼ、およびアミラーゼ活性に関して良好な再現性が得られる。

非常に高いリパーゼの収率が得られ、同様に濃縮係数も高い（２超）。これは、２.（試料２６）、２．４（試料２７）、２．３（試料２８）である。

単ステップ工程は、良好な収率を提供する。４．２ｇｒのＨＡ−パンクレアチンが得られ（出発パンクレリパーゼの４２％）、リパーゼの総活性単位は、９４０，０００ＩＵ ＵＳＰ（初期のＬＡの９９〜１００％）である。入手したＨＡ−パンクレアチンは、２２１ＩＵ ＵＳＰ／ｍｇの比活性を有する。

実施例８ ＨＡ−パンクレアチンの調製；０．１ｇ／ｍＬ；マルチステップ；懸濁、沈殿、分離；比較例（ＳＰ＝３８−アセトン：水＝３５：６５）
ステップａ１．１−懸濁：パンクレリパーゼを、約３０分間撹拌しながら、４℃、０．０４５ｍｇ／Ｌの濃度で水性溶媒（蒸留水）に分散する（試料２９）。
ステップａ１．２‐沈殿：８０ｍＬの溶媒混合物（アセトン：水＝３５：４５）を、ステップａ１．１の懸濁物２０ｍＬに添加する（ことにより最終溶媒混合物中でＳＰ＝３８（ＭＰａ）^０．５を得る）。この混合物を、静的条件下で、６０分間２５℃で保存する。
ステップａ２−分離：この混合物を遠心分離（１０分、３，０００ｇ、２５℃）して、膵酵素を含むペレットから上清を分離する。

異なるステップの材料を解析する。リパーゼ活性として表されるパンクレリパーゼの量を、全工程に沿って、
ステップａ１．１の懸濁物（懸濁物のＬＡ；ＬＡ−Ｓａ１．１）
ステップａ２で得た上清（ＳＮのＬＡ、沈殿物、ＬＡ−ＳＮ）、
ステップａ２で得、次いで出発蒸留水で再度懸濁したペレット（ペレットのＬＡ、沈殿物、ＬＡ−Ｐ）
で測定する。

結果を、表１９〜２０に報告する。上述の実施例の２つのステップおよび１つのステップの方法で得た結果を、直接比較する目的のため同様にここで報告する。

この従来技術の工程は不十分な収率を提供し、酵素の不活化が顕著であり、結果としてリパーゼの濃縮は観察されていない。

実施例９ 精製したＨＡ−パンクレアチン（試料２０）の特徴付け
ＨＡ材料を、消化能力に関して試験し、出発パンクレリパーゼと比較した。２０ｍｇのＨＡ−パンクレアチンおよび５０ｍｇの出発パンクレリパーゼ（２３００ＩＵ ＵＳＰリパーゼに対応）を、それぞれ１ｍＬの脱イオン水に懸濁し、５０ｍＬの腸溶製剤Ｐｅｐｔａｍｅｎ Ｊｕｎｉｏｒ １．０に３７℃で添加し、１００ｒｐｍで、６０分、１２０分、および２４０分間撹拌する。消化試験を、１時間後、２時間後、および４時間後に行う。この試験を、各パンクレリパーゼの試料で６回繰り返した。

脂質栄養素を、トリオレインの消化（トリオレインのピークの減少）を測定することによりモニタリングする。総タンパク質消化を、ブラッドフォード法によりモニタリングする。アミロース分解工程を、短鎖糖の形成を測定することによりモニタリングする。消化の度合いの差異を、４時間の消化の後の天然およびＨＡ材料の消化成績を比較することにより得る。

活性の差を、式（天然のパンクレアチンの活性−ＨＡ−パンクレアチンの活性）／天然のパンクレリパーゼの活性で計算する。消化の差を、以下の式（天然のパンクレアチンの消化（％）−ＨＡ−パンクレアチンの消化（％））により計算する。

このインビトロ試験により、ＨＡ−パンクレアチンのリパーゼ、タンパク質、および炭水化物の消化を解析することが可能である。リパーゼの消化は、反応容器に存在する酵素活性の差に対する感受性がきわめて高く、よって、活性の１０％の差異が消化量の差異の１０％に対応する。消化の動態は同様の傾向を示す。これらの結果から、天然およびＨＡのパンクレアチンは、類似の脂質消化パターンを有することが示唆される。

タンパク質消化プロファイルはほぼ重ねることができることから、ＨＡ−パンクレアチンのプロテアーゼ活性は、同レベルの天然のパンクレリパーゼで消化を維持することが示唆される。プロテアーゼ活性の約６０％の差は、タンパク質消化の度合いに関して全く効果をもたらすものではない。

炭水化物消化プロファイルは、マルトースの産生がＨＡ−パンクレアチンでは少ないため、異なっている。アミラーゼ活性の差および消化産物の量の比較から、ＨＡ−パンクレアチンにおいても、アミロース分解が起こることが示される。

Claims (42)

1. 高活性パンクレアチン（ＨＡ−パンクレアチン）であって、前記パンクレリパーゼが、少なくとも約１２０ＵＳＰ ＩＵ／ｍｇのリパーゼ比活性を有する、高活性パンクレアチン。
2. 少なくとも約１５０ＵＳＰ ＩＵ／ｍｇのリパーゼ比活性を有する、請求項１に記載のパンクレアチン。
3. 少なくとも約２００ＵＳＰ ＩＵ／ｍｇのリパーゼ比活性を有する、請求項１に記載のパンクレアチン。
4. 少なくとも約５００ＵＳＰ ＩＵ／ｍｇのリパーゼ比活性を有する、請求項１に記載のパンクレアチン。
5. 請求項１、２、３、または４に記載のＨＡ−パンクレアチンを含む高力価医薬組成物。
6. 前記パンクレアチンがブタ由来である、請求項１、２、３、４、または５に記載の組成物。
7. 単位服用量あたり少なくとも約９，０００ＵＳＰ ＩＵ、約２０，０００ＵＳＰ ＩＵ、約４０，０００ＵＳＰ ＩＵ、約６０，０００ＵＳＰ ＩＵ、約８０，０００ＵＳＰ ＩＵ、または約１００，０００ＵＳＰ ＩＵのリパーゼを含む、請求項５または６に記載の組成物。
8. 複数のコーティングされたＨＡ−パンクレアチン粒子を含み、前記粒子が少なくとも１つの腸溶性ポリマーでコーティングしたコアを含む、請求項７に記載の組成物。
9. 粉剤、ペレット、マイクロスフェア、カプセル、分包包装、錠剤、液体懸濁物、または液体溶液の形態である、請求項５、６、７、または８に記載の組成物。
10. 少なくとも約１２０ＵＳＰ ＩＵ／ｍｇのリパーゼ比活性を有するＨＡ−パンクレアチンの調製のための工程であって、２８〜４５（ＭＰａ）^０．５で構成されたヒルデブランド溶解パラメータを有する溶媒でパンクレアチンを処理することを含み、前記溶媒が、１つの有機溶媒、または有機溶媒の混合物、または少なくとも１つの有機溶媒と水性溶媒との混合物であり、前記工程の温度が室温を下回る、工程。
11. 前記溶媒が、２８〜３８（ＭＰａ）^０．５で構成されたヒルデブランド溶解パラメータを有する、請求項１０に記載の工程。
12. 前記溶媒が、２８〜３４（ＭＰａ）^０．５で構成されたヒルデブランド溶解パラメータを有する、請求項１０に記載の工程。
13. 前記溶媒が、３４〜３８（ＭＰａ）^０．５で構成されたヒルデブランド溶解パラメータを有する、請求項１０に記載の工程。
14. 前記溶媒が、３４〜４５（ＭＰａ）^０．５で構成されたヒルデブランド溶解パラメータを有する、請求項１０に記載の工程。
15. 前記溶媒が、３８〜４５（ＭＰａ）^０．５で構成されたヒルデブランド溶解パラメータを有する、請求項１０に記載の工程。
16. 少なくとも約１５０ＵＳＰ ＩＵ／ｍｇのリパーゼ比活性を有するパンクレアチンの調製のための、請求項１０、１１、１２、１３、１４、または１５に記載の工程。
17. 少なくとも約２００ＵＳＰ ＩＵ／ｍｇのリパーゼ比活性を有するパンクレアチンの調製のための、請求項１０、１１、１２、１３、１４、または１５に記載の工程。
18. 少なくとも約２５０ＵＳＰ ＩＵ／ｍｇのリパーゼ比活性を有するパンクレアチンの調製のための、請求項１０、１１、１２、１３、１４、または１５に記載の工程。
19. ａ１）３４〜４５（ＭＰａ）^０．５で構成されたヒルデブランド溶解パラメータを有する溶媒にパンクレアチンを懸濁するステップであって、前記溶媒が、１つの有機溶媒、または有機溶媒の混合物、または少なくとも１つの有機溶媒と水性溶媒との混合物である、ステップと、
    ａ２）前記ステップａ１）の混合物の可溶部分から不溶部分を分離するステップと、
    ａ３）前記ステップａ２）で得られた不溶部分を乾燥させるステップと
    を含み、
    前記工程で、温度が室温を下回る、
    請求項１０に記載の工程。
20. ステップ１ａ）が、約３０分間実行され、工程の温度が４℃である、請求項１９に記載の工程。
21. 前記溶媒が、少なくとも１つの有機溶媒と水性溶媒との混合物であり、ステップａ１が、以下の、
    ａ１．１）撹拌しながら水性溶媒にパンクレアチンを懸濁するステップと、
    ａ１．２）前記ステップ１ａ）の懸濁物に前記１つの有機溶媒またはその混合物を添加するステップと
    を含み、
    前記工程の温度が室温を下回る、
    請求項１０、１９、または２０に記載の工程。
22. 前記溶媒が、少なくとも１つの有機溶媒と水性溶媒との混合物であって、ステップａ１）が、
    ａ１．１）撹拌しながら前記水性溶媒にパンクレアチンを懸濁するステップと、
    ａ１．２）前記ステップａ１．１の可溶部分を不溶部分から分離するステップと、
    ａ１．３）前記ステップａ１．２）の可溶部分に前記１つの有機溶媒またはその混合物を添加するステップと
    を含み、
    前記工程の温度が室温を下回る、
    請求項２１に記載の工程。
23. ステップａ１．３）が、約３０分間実行され、工程の温度が４℃である、請求項２２に記載の工程。
24. 前記ステップａ１．１のパンクレアチンが、０．０５〜０．３ｍｇ／ｍＬから構成された量で存在する、請求項２１、２２、または２３に記載の工程。
25. 前記溶媒が、３８（ＭＰａ）^０．５のヒルデブラント溶解パラメータを有する、請求項１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４に記載の工程。
26. 前記有機溶媒が、ｎ−ペンタン、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、ジエチルエーテル、シクロヘキサン、四塩化炭素、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、クロロホルム、トリクロロエチレン、アセトン、ジメチルホルムアミド、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、エタノール、ジメチルスルホキシドブチルアルコール、メタノール、アセトニトリル、ジオキサン、および塩化メチレン（ｍｅｔｈｙｌｅｎｃｈｌｏｒｉｄｅ）の群から選択される、請求項１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５に記載の工程。
27. 前記有機溶媒が、アセトン、イソプロパノール（ｉｓｏｐｒａｐａｎｏｌ）、およびエタノールの群から選択される、請求項２６に記載の工程。
28. 前記水性溶媒が、緩衝溶液である、請求項１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６に記載の工程。
29. 前記緩衝溶液が、ｐＨ＝７またはｐＨ＝４を有する、請求項１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２８に記載の工程。
30. 前記有機溶媒がアセトンであり、前記水性溶媒が、ｐＨ＝７の緩衝溶液である、請求項１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２８に記載の工程。
31. 前記有機溶媒がエタノールであり、前記水性溶媒が、ｐＨ＝７の緩衝溶液である、請求項１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、または２８に記載の工程。
32. 前記有機溶媒がアセトンであり、前記水性溶媒が、ｐＨ＝４の緩衝溶液である、請求項１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、または２８に記載の工程。
33. 前記有機溶媒がエタノールであり、前記水性溶媒が、ｐＨ＝４の緩衝溶液である、請求項１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２８、または２４に記載の工程。
34. 前記溶媒が、３８（ＭＰａ）^０．５のヒルデブラント溶解パラメータを有し、前記溶媒がアセトンとｐＨ＝７の緩衝溶液との混合物であり、前記ステップ１ａ）のパンクレアチンが、０．１ｍｇ／ｍＬの濃度である、請求項１９または２１に記載の工程。
35. 前記溶媒が、３８（ＭＰａ）^０．５のヒルデブラント溶解を有し、前記溶媒が、アセトンとｐＨ＝４の緩衝溶液との混合物であり、前記ステップａ１のパンクレアチンが、０．１ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項２２に記載の工程。
36. 前記溶媒が、３８（ＭＰａ）^０．５のヒルデブラント溶解を有し、前記溶媒が、エタノールとｐＨ＝４の緩衝溶液との混合物であり、前記ステップａ１のパンクレアチンが、０．１ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項２２に記載の工程。
37. 前記溶媒が、３８（ＭＰａ）^０．５のヒルデブラント溶解を有し、前記溶媒が、アセトンとｐＨ＝７の緩衝溶液との混合物であり、前記ステップａ１のパンクレアチンが、０．３ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項２２に記載の工程。
38. 前記溶媒が、３８（ＭＰａ）^０．５のヒルデブラント溶解を有し、前記溶媒が、アセトンとｐＨ＝４の緩衝溶液との混合物であり、前記ステップａ１のパンクレアチンが、０．３ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項２３に記載の工程。
39. 前記溶媒が、３８（ＭＰａ）^０．５のヒルデブラント溶解を有し、前記溶媒が、エタノールとｐＨ＝４の緩衝溶液との混合物であり、前記ステップａ１のパンクレアチンが、０．３ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項２３に記載の工程。
40. 微生物および／またはウイルスの負荷を低減するステップを含む、請求項１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、または３９に記載の工程。
41. 前記細菌および／またはウイルスの負荷の低減を、濾過、加熱、電離放射線、高圧、またはアルキル化により実行する、請求項４０に記載の工程。
42. 膵酵素不全に関連する生理学的な病態にある患者を処置する方法であって、薬学的に許容可能な量の請求項５、６、７、８、または９に記載の組成物を前記患者に投与することを含む、方法。