JP2016525347A - Aavベクター、及び抗aav(アデノ関連ウイルス)中和抗体についてのアッセイ - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2013年7月12日に提出された“AAV VECTOR AND ASSAY FOR ANTI−AAV(ADENO−ASSOCIATED VIRUS)NEUTRALIZING ANTIBODIES“と題する米国仮特許出願第61/845,841号明細書に対する優先権を主張するものであり、この出願は、その全体を参照により本明細書に組み込むものとする。
この実施例は、抗AAV中和抗体(NAb)アッセイの性能を評価する様々な試験を概説する。このようなアッセイを用いて、AAVベクター媒介性遺伝子移入試験への登録前に被験者を選択すると共に、AAVベクター媒介性遺伝子移入療法の過程で、及びAAVベクター媒介性遺伝子移入療法後の抗AAV中和抗体の存在又は量をモニターすることができる。
この実施例は、本明細書に記載する試験で用いられる特定の材料及び装置についての説明を含む。
この実施例は、抗AAV抗体を検出及び/又は定量する例示的方法の説明を含む。
1.対照血漿(プールしたヒト血漿、FACT)が、AAV8ベクターについては1:100〜1:316、及びAAV2ベクターについては1:1000〜1:3160の読取り値をもたらす。
2.細胞を含むが、ベクター及び血清は含まないウェルが、許容される程度の低い読取り値をもたらす。
3.細胞及びベクターを含むが、血清は含まないウェルが、許容される読取り値をもたらす。
ルシフェラーゼ発現率(%)=[(試験サンプルルシフェラーゼ読取り値−ブランク)/(V−FBSルシフェラーゼ読取り値−ブランク)]×100。
ルシフェラーゼ阻害率(%)=100−ルシフェラーゼ発現率(%)
この実施例は、抗AAV抗体を検出及び/又は定量するためのアッセイ結果の説明を含む。
・16/18回で、FACT血漿は、1:100〜1:316の力価を示した;
・1/18回(プレート2、4日目)で、測定された力価は、1/2log低く、1:31〜1:100であり、これによってこのアッセイランは排除された;
・1/18回(プレート3、6日目)で、測定された力価は、1/2log高く、1:316〜1:1000であり、これによってこのアッセイランは排除された。
・13/15回で、FACT血漿は、1:100〜1:316の力価を示した;
・1/15回(プレート3、3日目)で、測定された力価は、1/2log高く、1:316〜1:1000であり、これによってこのアッセイランは排除された;
・1/15回(プレート3、5日目)で、測定された力価は、1/2log低く、1:31.6〜1:100であり、これによってこのアッセイランは排除された。
この実施例は、AAV抗体アッセイに基づく結論の説明を含む。
Claims (70)
- ベクター配列がリポータトランスジーンを含む組換えAAVベクター配列において、前記リポータトランスジーンが、(a)一本鎖又は自己相補的ゲノムを含み、(b)1つ又は複数の発現調節エレメントに作動可能に連結され、かつ(c)1つ又は複数のフランキングエレメントによってフランキングされている、組換えAAVベクター配列。
- ベクターがリポータトランスジーンを含む組換えAAVベクターにおいて、前記リポータトランスジーンが、(a)一本鎖又は自己相補的ゲノムを含み、(b)1つ又は複数の発現調節エレメントに作動可能に連結され、かつ(c)1つ又は複数のフランキングエレメントによってフランキングされており、ここで、前記組換えAAVベクターは、感染性組換えAAV粒子を含む、組換えAAVベクター。
- AAVに結合する抗体を、分析又は検出若しくは測定するための方法において、以下:
(a)組換えベクターを包膜する感染性組換えAAV粒子を用意するステップであって、(i)前記ベクターが、リポータトランスジーンを含み、(ii)前記リポータトランスジーンが、一本鎖若しくは自己相補的ゲノムを含むと共に、(iii)前記リポータトランスジーンが、1つ又は複数の発現調節エレメントに作動可能に連結され、かつ1つ又は複数のフランキングエレメントによってフランキングされている、ステップ;
(b)AAVに結合する抗体を分析又は検出するために、被験者からの生体サンプルを用意するステップ;
(c)前記感染性組換えAAV粒子に感染し得る細胞を用意するステップ;
(d)(a)の感染性組換えAAV粒子を(b)の生体サンプルと接触させるか、又はインキュベートし、これによって得られる混合物(M)を生成するステップ;
(e)得られた混合物(M)と(c)の細胞を、(a)の前記感染性組換えAAV粒子が、前記細胞中の前記リポータトランスジーンに感染して、これを発現させることを可能にする条件下で、接触させるステップ;
(f)前記リポータトランスジーンの発現を測定するステップ;並びに
(g)(f)の前記リポータトランスジーン発現を対照のリポータトランスジーンと比較するステップであって、前記対照が、(i)AAVに結合する抗体が欠失した陰性(−)対照であるか、又は(ii)AAVに結合する既定量の抗体を有する陰性(−)対照であるかのいずれかであり、これによって、AAVに結合する抗体の存在を分析、又は検出若しくは測定するステップ
を含む方法。 - 前記細胞が、哺乳動物細胞を含む、請求項3に記載の方法。
- 前記細胞が、AAV複製及び/又はゲノム組込みのためのヘルパー機能をコード化する核酸配列をもたらす、請求項3に記載の方法。
- 前記細胞が、AAV血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh74、若しくはRh10、又はこれらAAV血清型のいずれかのハイブリッド若しくはキメラのVP1、VP2若しくはVP3配列と90%以上同一のVP1、VP2若しくはVP3配列を含むAAV粒子に感染し得る、請求項3に記載の方法。
- 前記細胞が、AAV血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh74、若しくはRh10、又は前記AAV血清型のいずれかのハイブリッド若しくはキメラに感染し得る、請求項3に記載の方法。
- 前記細胞が、哺乳動物細胞を含む、請求項3に記載の方法。
- 前記細胞が、HEK−293、CHO、BHK、MDCK、10T1/2、WEHI細胞、COS、BSC 1、BSC 40、BMT 10、VERO、WI38、MRC5、A549、HT1080、293、B−50、3T3、NIH3T3、HepG2、Saos−2、Huh7、HER、HEK、HEL、又はHeLa細胞を含む、請求項3に記載の方法。
- 前記細胞が、AAV E4遺伝子を発現する、請求項3に記載の方法。
- 前記細胞が、2V6.11細胞を含む、請求項3に記載の方法。
- 前記リポータトランスジーンが、酵素、比色、蛍光、発光、化学発光、又は電気化学シグナルを賦与するタンパク質をコード化する、請求項1若しくは2に記載のAAVベクター、又は請求項2に記載の方法。
- 前記リポータトランスジーンが、ルシフェラーゼ遺伝子を含む、請求項1若しくは2に記載のAAVベクター、又は請求項2に記載の方法。
- 前記ルシフェラーゼ遺伝子が、ウミシイタケ(renilla)ルシフェラーゼ又はホタル(firefly)ルシフェラーゼ遺伝子を含む、請求項13に記載の方法。
- 前記リポータトランスジーンが、βガラクトシダーゼ遺伝子、βグルコロニダーゼ遺伝子、又はクロラムフェニコールトランスフェラーゼ遺伝子を含む、請求項1若しくは2に記載のAAVベクター、又は請求項2に記載の方法。
- 前記リポータトランスジーンが、緑色蛍光タンパク質(GFP)、赤色蛍光タンパク質(RFP)又はアルカリホスファターゼをコード化する、請求項1若しくは2に記載のAAVベクター、又は請求項2に記載の方法。
- 前記組換えベクターが、AAVベクターを含む、請求項1若しくは2に記載のAAVベクター、又は請求項2に記載の方法。
- 前記AAVベクターが、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh74、若しくはRh10ベクター、又はこれらAAVベクターのいずれかのハイブリッド若しくはキメラを含む、請求項17に記載のAAVベクター。
- 前記発現調節エレメントが、哺乳動物細胞において作動可能なプロモータ及び/又はエンハンサー核酸配列を含む、請求項1若しくは2に記載のAAVベクター、又は請求項2に記載の方法。
- 前記発現調節エレメントが、サイトメガロウイルス(CMV)最初期プロモータ/エンハンサー、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモータ/エンハンサー、SV40プロモータ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)プロモータ、ニワトリβアクチン(CBA)プロモータ、ホスホグリセロールキナーゼ(PGK)プロモータ、又は伸長因子−1α(EF1−α)プロモータを含む、請求項1若しくは2に記載のAAVベクター、又は請求項2に記載の方法。
- 前記リポータトランスジーンが、一本鎖ゲノムである、請求項1若しくは2に記載のAAVベクター、又は請求項2に記載の方法。
- 前記リポータトランスジーンが、自己相補的ゲノムである、請求項1若しくは2に記載のAAVベクター、又は請求項2に記載の方法。
- 前記フランキングエレメントが、1つ又は複数のAAV逆方向末端反復配列(ITR)を含む、請求項1若しくは2に記載のAAVベクター、又は請求項2に記載の方法。
- 前記リポータトランスジーンが、1つ又は複数の5’及び/又は3’AAV ITRの間に位置する、請求項23に記載の方法。
- 前記自己相補的リポータトランスジーンゲノムが、二本鎖逆方向反復配列構造を含む、請求項1若しくは2に記載のAAVベクター、又は請求項2に記載の方法。
- 前記フランキングエレメントが、AAV Repタンパク質によりプロセシングされていない突然変異又は変異型AAV ITRを含む、請求項1若しくは2に記載のAAVベクター、又は請求項2に記載の方法。
- 前記フランキングエレメントが、感染性組換えAAV粒子において、自己相補的リポータトランスジーンゲノムの二本鎖逆方向配列構造への形成を可能にするか、又はそれを促進する突然変異若しくは変異型AAV ITRを含む、請求項1に記載のAAVベクター、又は請求項2に記載の方法。
- 前記突然変異、改変若しくは変異型AAV ITRが、欠失D配列、及び/又は突然変異、改変若しくは変異型末端分離(resolution)部位(TRS)配列を有する、請求項27又は28に記載のAAVベクター又は方法。
- 前記突然変異、改変若しくは変異型末端分離(resolution)部位(TRS)配列が、CGGTTGを含む、請求項28に記載のAAVベクター又は方法。
- 前記突然変異又は変異型AAV ITRが、前記リポータトランスジーンの自己相補的配列同士の間に位置する、請求項27又は28に記載のAAVベクター又は方法。
- 前記突然変異又は変異型AAV ITRが、AAV2ゲノム配列のヌクレオチド122〜144に対応するヌクレオチドが欠失したAAV2 ITRを含む、請求項27又は28に記載のAAVベクター又は方法。
- 前記組換えベクターが、AAVの第1の逆方向末端反復配列(ITR);哺乳動物細胞において作動可能なプロモータ;リポータトランスジーン;ポリアデニル化シグナル;及び任意選択でAAVの第2のITRを含む、請求項1若しくは2に記載のAAVベクター、又は請求項2に記載の方法。
- 前記組換えベクターが、哺乳動物細胞において、作動可能なプロモータの下流にリポータトランスジーンの挿入を可能にする制限部位を、また、該制限部位の下流に転写後調節エレメントを含み、ここで、前記プロモータ、前記制限部位及び前記転写後調節エレメントは、5’AAV ITRの下流に、また任意選択の3’AAV ITRの上流に位置する、請求項1若しくは2に記載のAAVベクター、又は請求項2に記載の方法。
- 前記感染性組換えAAV粒子が、霊長類に感染するAAV血清型を含む、請求項1若しくは2に記載のAAVベクター、又は請求項2に記載の方法。
- 前記感染性組換えAAV粒子が、ヒト又はアカゲザル(rhesus macaque)に感染するAAV血清型を含む、請求項1若しくは2に記載のAAVベクター、又は請求項2に記載の方法。
- 前記感染性組換えAAV粒子が、AAV血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh74、若しくはRh10、又はこれらAAV血清型のいずれかのハイブリッド若しくはキメラのVP1、VP2又はVP3配列と90%以上同一であるVP1、VP2又はVP3配列を含む、請求項1若しくは2に記載のAAVベクター、又は請求項2に記載の方法。
- 前記感染性組換えAAV粒子が、AAV血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh74、若しくはRh10、又は前記AAV血清型のいずれかのハイブリッド若しくはキメラを含む、請求項1若しくは2に記載のAAVベクター、又は請求項2に記載の方法。
- 前記生体サンプルが、霊長類サンプルを含む、請求項2又は3に記載の方法。
- 前記生体サンプルが、血清を含む、請求項2又は3に記載の方法。
- 前記生体サンプルが、血漿を含む、請求項2又は3に記載の方法。
- 前記生体サンプルが、ヒト血清又はヒト血漿を含む、請求項2又は3に記載の方法。
- 前記被験者が、哺乳動物である、請求項2又は3に記載の方法。
- 前記被験者が、ヒトである、請求項2又は3に記載の方法。
- 前記被験者が、タンパク質の不十分な発現又は活性に起因する障害に罹患している、請求項2又は3に記載の方法。
- 前記被験者が、異常、欠陥若しくは望ましくないタンパク質の発現又は活性に起因する障害に罹患している、請求項2又は3に記載の方法。
- 前記被験者が、遺伝性疾患に罹患している、請求項2又は3に記載の方法。
- 前記被験者が、遺伝子置換又は補充療法の候補である、請求項2又は3に記載の方法。
- 前記被験者が、遺伝子ノックダウン又はノックアウト療法の候補である、請求項2又は3に記載の方法。
- 前記被験者が、以下:肺疾患(例えば、嚢胞性線維症)、出血性疾患(例えば、抑制因子を伴う、若しくは伴わないA型血友病又はB型血友病)、サラセミア、血液疾患(例えば、貧血)、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、てんかん、リソソーム蓄積症、銅若しくは鉄蓄積障害(例えば、ウィルソン若しくはメンケス病)、リソソーム酸性リパーゼ欠損症、神経若しくは神経変性疾患、癌、1型若しくは2型糖尿病、ゴーシェ病、ハーラー病、アデノシンデアミナーゼ欠損症、代謝異常(例えば、グリコーゲン蓄積症)、網膜変性疾患(例えば、RPE65欠損症、コロイデレミア、及びその他の眼病)、固形臓器(例えば、脳、肝臓、腎臓、心臓)の疾患、又は感染性ウイルス性(例えば、B型及びC型肝炎、HIVなど)、細菌性若しくは真菌性疾患に罹患している、請求項2又は3に記載の方法。
- 陰性(−)対照と比較した(f)の前記リポータトランスジーン発現に基づいて、前記生体サンプル中のAAVに結合する抗体の量を計算するステップをさらに含む、請求項2又は3に記載の方法。
- 前記生体サンプル中のAAVに結合する抗体の前記量を、前記被験者に関連する報告書に入力又は算入するステップをさらに含む、請求項2又は3に記載の方法。
- 前記生体サンプル中のAAVに結合する抗体の前記量をデータベースに入力し、これによって、データベースエントリー、すなわち前記被験者に関連するデータベースエントリーを作成するステップをさらに含む、請求項2又は2に記載の方法。
- 分析又は検出される前記抗体が、AAVキャプシドタンパク質に結合する、請求項2又は3に記載の方法。
- 分析又は検出される前記抗体が、AAV血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh74、若しくはRh10、又は前記AAV血清型のいずれかのハイブリッド若しくはキメラに結合する、請求項2又は3に記載の方法。
- 前記既定量の抗体が、AAV血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh74、若しくはRh10、又は前記AAV血清型のいずれかのハイブリッド若しくはキメラに結合する、請求項2又は3に記載の方法。
- 前記生体サンプルを、(a)の感染性組換えAAV粒子との接触又はインキュベートの前に希釈する、請求項2又は3に記載の方法。
- 前記生体サンプルの複数の希釈物を分析する、請求項2又は3に記載の方法。
- 複数の異なる希釈率の前記生体サンプルを分析する、請求項2又は3に記載の方法。
- 前記生体サンプルを、(a)の感染性組換えAAV粒子との接触又はインキュベートの前に、1:1〜1:500に希釈する、請求項2又は3に記載の方法。
- 前記生体サンプルを、(a)の感染性組換えAAV粒子との接触又はインキュベートの前に、1:500〜1:5000に希釈する、請求項2又は3に記載の方法。
- 少なくとも2つ、3つ、4つ、5つ若しくは6つの異なる希釈率の生体サンプルを分析する、請求項2又は3に記載の方法。
- 前記細胞を、前記得られた混合物(d)と6〜48時間接触させる、請求項2又は3に記載の方法。
- 前記細胞を、前記得られた混合物(d)と12〜36時間接触させる、請求項2又は3に記載の方法。
- 前記細胞を、前記得られた混合物(d)と20〜30時間接触させる、請求項2又は3に記載の方法。
- 前記細胞を、前記得られた混合物(d)と約24時間接触させる、請求項2又は3に記載の方法。
- 前記リポータトランスジーンの発現を測定する前に、前記細胞を溶解させる、請求項2又は3に記載の方法。
- 前記生体サンプルが、熱失活させてある、請求項2又は3に記載の方法。
- 前記生体サンプルが、約50〜70℃で約15分〜1時間熱失活させてある、請求項2又は3に記載の方法。
- 前記生体サンプルが、約56℃で約30分間熱失活させてある、請求項2又は3に記載の方法。
- 前記方法がin vitroで実施される、請求項2又は3に記載の方法。
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