CN117802161A - 精准重组腺相关病毒载体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本文涉及一种精准重组腺相关病毒(pciAAV)载体,及其在基因治疗、基因编辑、基因调控中的用途。
Description
技术领域
本发明一般涉及重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)载体;更具体地,涉及一种精准重组腺相关病毒(precision recombinant adeno-associated virus,pciAAV)载体,及其在基因治疗、基因编辑、基因调控中的用途。
背景技术
基因治疗面向因基因表达谱异常引起的遗传突变的患者,包括治疗或预防由基因缺陷,异常调节或表达引起的遗传疾病,例如表达不足或过表达而导致的疾病、恶性肿瘤等。可以通过向患者提供纠正性遗传物质来治疗,预防或缓解。目前基因递送载体主要包括非病毒载体和病毒基因递送载体。在许多可用的病毒来源的基因载体(例如,重组逆转录病毒,重组慢病毒,重组腺病毒等)中,重组腺相关病毒(rAAV)基因载体越来越受欢迎。
腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)属于细小病毒科(Parvoviridae)。它因具有非致病性、低免疫原性、广谱感染性等优势而已成为目前基因治疗最有前景的基因载体。AAV是一种无囊膜的单链DNA病毒,携带有约4.7kb的线性单链DNA基因组。AAV DNA基因组的两端各有一个145bp的倒置末端重复序列(inverted terminal repeat,ITR),其中靠近末端的125个碱基是一个较长的回文结构,自身能通过碱基互补配对进行折叠,使得ITR呈现出T字型的发卡结构。携带野生型倒置末端重复序列的正链、负链DNA基因组以相同的概率包装进入AAV病毒衣壳,从而产生相同数量的正链,或者负链DNA AAV病毒颗粒。AAV病毒颗粒感染进入细胞,进入细胞核,脱衣壳,且将AAV基因组释放至细胞核。AAV基因组两端的ITR可以折叠形成T型发卡结构,其3'末端会作为DNA合成的引物,合成第二条链,形成双链DNA分子,进而启动AAV基因组中所携带的基因表达。AAV基因组的正链、负链DNA分子也可以通过互补配对形成双链DNA分子,表达基因。此外,分子间的ITR会自发结合,进而形成二聚体和多聚体,这样的分子能够在细胞内长期,甚至是终身持续表达外源基因。
AAV DNA基因组两端的ITR包含有用于AAV DNA复制,包装,整合和拯救的基本信息。传统的rAAV包装***均以AAV的ITR为包装基本元件。具体地,两个ITR置于需要包装进入rAAV衣壳的DNA两端,也即,D-trs-A'-C'-C-B'-B-A置于包装基因DNA链3’末端,A'-B'-B-C'-C-A-trs-D置于包装基因DNA链5’末端,用于把DNA包装进入rAAV衣壳。所述rAAV载体包装体系自起用至今已有数十年,面临技术落后,生产的rAAV载体DNA分子不纯(含有3-6%的质粒骨架杂质DNA),质量不高,基因表达效率低,临床应用毒副作用大等缺陷。同时,这样的包装设计还会产生含有质粒骨架杂质DNA的、3’末端不含有ITR的单极单链rAAV病毒粒子,其在临床应用中可能会产生***突变,甚至造成严重医疗事故,极大地影响rAAV载体的应用。
总之,传统方法包装生产的rAAV载体存在所递送的DNA分子纯度低,基因表达效率低,基因操作性差,有***基因发生突变的风险等问题,其应用受到极大的限制。
发明内容
本文提供一种精准DNA分子重组腺相关病毒(pciAAV)载体。经长期研究,发明人发现,采用本文提供的pciAAV载体能够减低或消除杂质DNA(例如质粒骨架杂质DNA)被包装进AAV衣壳,其将有利于提高rAAV基因包装效率,提高rAAV基因表达效率,提高rAAV基因治疗的有效性、安全性,极大地促进rAAV载体、rAAV基因治疗的发展和应用。
一方面,本文提供一种包装前pciAAV基因组,其按顺序包含:
(a)经改造的ITR,其不具有D元件和trs序列;
(b)感兴趣的基因或保护序列;
(c)完整ITR;
(d)感兴趣的基因或保护序列;和
(e)经改造的ITR,其不具有D元件和trs序列;
其中,区段(b)和(d)中至少一个包含感兴趣的基因。
另一方面,本文还提供一种pciAAV转基因质粒,其包含本文所述的包装前pciAAV基因组。
另一方面,本文提供一种pciAAV载体,其包含:
衣壳蛋白,和
经衣壳蛋白包装的pciAAV基因组;
其中,所述经衣壳蛋白包装的pciAAV基因组源自本文所述的包装前pciAAV基因组。
另一方面,本文还提供一种包装pciAAV载体的方法,其包括:将本文所述的pciAAV转基因质粒与Cap、Rep表达质粒分别转化DH10Bac大肠杆菌感受态细胞;经过至少一轮蓝白斑筛选,挑出白色菌落,扩增并提取重组杆粒;利用重组杆粒转染昆虫细胞,以产生重组杆状病毒;和,提取重组杆状病毒,并用重组杆状病毒感染昆虫细胞,以获得pciAAV载体。
另一方面,本文还提供一种向细胞递送GOI的方法,包括使细胞与一种或多种本文所述的pciAAV载体接触;其中,一种或多种所述pciAAV载体的基因组包含所述GOI的基因表达框和/或任选的其它DNA序列;其中,所述pciAAV载体由本文所述的包装前pciAAV基因组包装得到。
另一方面,本文还提供一种分离的宿主细胞,其包含本文所述的一种或多种pciAAV载体。
另一方面,本文还提供所述一种或多种pciAAV载体在基因表达中的用途。
另一方面,本文还提供所述一种或多种pciAAV载体在基因治疗中的用途。
另一方面,本文还提供所述一种或多种pciAAV载体在基因编辑中的用途。
另一方面,本文还提供所述一种或多种pciAAV载体在基因调控中的用途。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步说明,其中这些显示仅为了图示说明本发明的实施方案,而不是为了局限本发明的范围。
图1显示了AAV2 Flip ITR(显示RBE、trs位点)的DNA序列结构示意图。
图2显示了根据本文的一个示例性实施方式的pciAAV载体构建设计包装示意图。
图3显示了根据本文的一个示例性的实施方式的pciAAV载体衣壳蛋白SDS-PAGE电泳结果。泳道MW:蛋白质分子量标准;泳道1:rAAV-EGFP载体;泳道2:pciAAV-EGFP载体。
图4显示了根据本文的一个示例性的实施方式的pciAAV载体中性琼脂糖电泳结果。泳道MW:DNA分子量标准;泳道1:rAAV-EGFP载体;泳道2:pciAAV-EGFP载体;泳道3:4.7kbPCR DNA片段。
图5显示了根据本文的一个示例性实施方式的pciAAV载体碱性琼脂糖电泳结果。泳道MW:DNA分子量标准;泳道1:pciAAV-EGFP载体泳道;2:rAAV-EGFP载体;泳道3:4.7kbPCR DNA片段。
图6显示了根据本文的一个示例性实施方式的pciAAV载体杂质DNA PCR分析引物设计示意图。
图7显示了根据本文的一个示例性实施方式的pciAAV载体杂质DNA PCR分析电泳结果。图7A:pciAAV载体PCR产物。泳道MW,DNA分子量标准;泳道1,pciAAV-EGFP质粒,F1,R1,引物;泳道2,pciAAV-EGFP质粒,目的DNA模板引物;泳道3,pciAAV-EGFP质粒,F2,R2引物;泳道4,pciAAV-EGFP感粒,F1,R1,引物;泳道5,pciAAV-EGFP感粒,目的DNA模板引物;泳道6,pciAAV-EGFP感粒,F2,R2引物;泳道7,pciAAV-EGFP载体,F1,R1,引物;泳道8,pciAAV-EGFP载体,目的DNA模板引物;泳道9,pciAAV-EGFP载体,F2,R2引物。图7B:rAAV载体PCR产物。泳道MW,DNA分子量标准;泳道1,rAAV-EGFP质粒,F1,R1,引物;泳道2,rAAV-EGFP质粒,目的DNA模板引物;泳道3,rAAV-EGFP质粒,F2,R2引物;泳道4,rAAV-EGFP感粒,F1,R1,引物;泳道5,rAAV-EGFP感粒,目的DNA模板引物;泳道6,rAAV-EGFP感粒,F2,R2引物;泳道7,rAAV-EGFP载体,F1,R1,引物;泳道8,rAAV-EGFP载体,目的DNA模板引物;泳道9,rAAV-EGFP载体,F2,R2引物。
图8显示了根据本文的一个示例性实施方式的pciAAV载体转染HEK293细胞基因表达检测分析结果。A:pciAAV载体转染HEK293细胞绿色荧光图;B:rAAV载体转染HEK293细胞绿色荧光图;C:流式细胞分析转染HEK293细胞效率和基因表达效率。
具体实施方式
本申请中科技术语的含意与本领域技术人员的普遍理解一致,除非另做说明。本申请中,“一”或其与各种量词的组合既包括单数含意也包括复数含意,除非特别说明。本申请中,对于同一参数或变量,当给出多个数值、数值范围、或其组合予以说明时,相当于具体揭示了这些数值、范围端值以及由它们任意组合而成的数值范围。本申请中,任一数值不论是否带有“约”之类的修饰词,一律涵盖本领域技术人员能够理解的约略范围,例如正负10%、5%等。本文中,每一“实施方式”均同等地指代且涵盖了本申请各项方法和各项***的实施方式。本申请中,任意实施方式中一项或多项技术特征可以与任何一个或多个其他实施方式中的一项或多项技术特征自由组合,由此得到的实施方式同样属于本申请公开的内容。
腺相关病毒是细小病毒科的成员。它无包膜,呈二十面体对称结构。目前AAV已有十余种血清型和百余种变异体被发现,其中,AAV2是目前研究最为透彻、应用最为广泛的血清型。
AAV基因组包括长约4.7kb的线性单链DNA,其两端具有长约145个碱基的ITR。ITR中靠近末端的约125个碱基包含回文序列,其自身能通过碱基互补配对而发生折叠,呈现出T字型的发卡结构。ITR包含Rep蛋白结合元件(Rep binding site,RBE)和末端解链位点(terminal resolution site,trs),能够被Rep蛋白识别结合并在trs处产生切口。
AAV基因组在两端的ITR之间包含两个开放阅读框(open reading frame,ORF)。这两个ORF分别编码rep和cap。rep基因编码Rep78、Rep68、Rep52和Rep40四种Rep蛋白,它们对于AAV病毒的复制、整合、拯救和包装起作用。cap基因编码AAV病毒的衣壳蛋白VP1、VP2和VP3,其中VP1为形成感染性AAV所必需,VP3是组成AAV病毒颗粒的主要蛋白,VP1、VP2和VP3在AAV病毒衣壳中的比例约为1:1:10。
在AAV组装形成病毒颗粒时,携带野生型ITR的正链、负链DNA基因组以相同的概率包装进入AAV病毒衣壳,从而产生相同数量的正链或负链AAV病毒颗粒。AAV病毒颗粒感染进入细胞,在细胞中,脱衣壳,且释放AAV基因组,AAV基因组两端的ITR折叠形成T型回文发卡结构后,以3'末端为引物,合成第二条链,形成双链分子,进而启动AAV基因组中所携带的基因的表达。AAV基因组的正链、负链DNA分子也可以通过互补配对形成双链DNA,表达基因。
包装前pciAAV基因组
一方面,本文提供一种包装前pciAAV基因组,其按顺序包含:
(a)经改造的ITR,其不具有D元件和trs序列;
(b)感兴趣的基因或保护序列;
(c)完整ITR;
(d)感兴趣的基因或保护序列;和
(e)经改造的ITR,其不具有D元件和trs序列;
其中,区段(b)和(d)中至少一个包含感兴趣的基因。
本文中,所用术语“重组腺相关病毒”或“rAAV”载体指的是作为基因递送载体且包含包装于病毒衣壳内的重组AAV基因组的非野生型腺相关病毒颗粒。
本文中,所用术语“精准DNA分子重组腺相关病毒”或“pciAAV”载体指的是本文提供的、经设计优化以能够实现精准DNA包装和递送的rAAV载体。在一些情况中,所述“精准DNA包装”意指经包装形成的rAAV载体(例如,pciAAV载体)中具有减低或消除的杂质DNA(例如质粒骨架杂质DNA)水平,由此能够减低或消除杂质DNA的递送,从而有利于提高rAAV基因包装效率,基因表达效率,提高rAAV基因治疗的有效性、安全性。
本文中,所用术语“包装前pciAAV基因组”指的是待包装的(例如,用于克隆进入质粒载体)、供于后续经包装进入衣壳蛋白的重组AAV基因组。
本文中,所用术语“完整ITR”通常指的是传统AAV2基因组所含的具有145个碱基的ITR序列,例如,其通常包含D、A'、C'、C、B'、B、A元件,以及RBE和trs位点。
应理解,存在于AAV基因组的末端的完整ITR序列通常会存在相同或不同的区段取向,例如,Flip/Flop、Flop/Flip、Flip/Flip或Flop/Flop。“Flip”ITR的示例性结构取向如图1所示,其一般包含D元件、A'元件、C'元件、C元件、B'元件、B元件、A元件,具有trs和RBE位点。“Flop”ITR的示例性结构取向如图1所示,不同之处在于:其中B'区段与C'区段的位置对调,且B区段与C区段的位置对调。
本文中,所用术语“经改造的ITR”一般指的是基于完整ITR改造(例如,截短)而得的ITR。在一些实施方式中,所述经改造的ITR在完整ITR的基础上缺乏D元件和trs序列。
本文中,所用术语“发卡结构”又称“发夹结构”,指的是DNA分子自身回折使得折叠区域内部分碱基彼此靠近且互补配对形成的“发卡”状,例如T型发卡状结构,例如如图1所示。
在一些实施方式中,本文所述的包装前pciAAV基因组按5'至3'顺序包含上述区段(a)至区段(e)。
本文中,所用术语“感兴趣的基因(GOI)”、“待递送的基因”、“外源基因”、“外源核酸”或“目的基因”可互换使用,意指来源于所关注或研究的生物体之外或待递送至该生物体的基因。所述GOI可以是希望在pciAAV病毒颗粒所要递送的受体细胞中表达或产生生物学功能的任何基因。
在一些实施方式中,所述GOI包含编码所述GOI的核苷酸序列。在一些实施方式中,编码所述GOI的核苷酸序列为DNA序列。
在一些实施方式中,所述GOI在其一端(例如5'或3'端)或两端(例如5'和3'端)包含填充序列。在一些实施方式中,所述经改造的ITR(例如,区段(a)或(e))与所述完整ITR(例如,区段(c))之间包含填充序列。“填充序列”通常指的是包含在较大核酸分子(例如质粒载体)中的核苷酸序列,通常用于在两个核酸元件之间(例如在启动子和编码序列(如GOI)之间)产生所需间隔,或延伸核酸分子以使其具有期望长度。填充序列不含有蛋白质编码信息,并且可以具有未知/合成来源和/或与较大核酸分子内的其它核酸序列不相关。在其中一些GOI的DNA序列长度小于AAV的包装长度4.7kb的实施方式中,增加填充序列,以辅助DNA形式,用于填充以使待包装进入单个病毒粒的DNA长度达到AAV的包装长度(例如,约4.7kb)。
在一些实施方式中,所述经改造的ITR(例如,区段(a)或(e))与所述完整ITR(例如,区段(c))之间间隔约4.7kb(例如,至少4.0kb、至少4.1kb、至少4.2kb、至少4.3kb、至少4.4kb、至少4.5kb、至少4.6kb、长达4.7kb)的长度。在一些实施方式中,包含填充序列,以使所述经改造的ITR(例如,区段(a)或(e))与所述完整ITR(例如,区段(c))之间间隔约4.7kb(例如,至少4.0kb、至少4.1kb、至少4.2kb、至少4.3kb、至少4.4kb、至少4.5kb、至少4.6kb、长达4.7kb)的长度。
在一些实施方式中,所述包装前pciAAV基因组中包含GOI的正链单链DNA序列,例如,在区段(a)和(c)之间或区段(c)或(e)之间。在一些实施方式中,所述包装前pciAAV基因组包含GOI的负链单链DNA序列,例如,在区段(a)和(c)之间或区段(c)或(e)之间。在一些实施方式中,所述包装前pciAAV基因组包含GOI的正链单链DNA序列和负链单链DNA序列,例如,在区段(a)和(c)之间和/或区段(c)或(e)之间。在一些实施方式中,所述包装前pciAAV基因组在区段(a)和(c)之间包含GOI的正链或负链单链DNA序列且在区段(c)和(e)之间包含GOI的正链或负链单链DNA序列。
在一些实施方式中,用于编码GOI的核苷酸序列包括正向的GOI表达框。在一些示例性实施方式中,所述正向的GOI表达框可以5'-3'方向包含启动子、GOI开放阅读框、多聚A序列。在一些示例性实施方式中,所述正向的GOI表达框还可包含增强子、内含子。在一些示例性实施方式中,所述增强子、内含子位于启动子与GOI开放阅读框之间。在一些示例性实施方式中,所述正向的GOI表达框可以5'-3'方向包含用于基因编辑、基因调控的DNA序列。在一些示例性实施方式中,可以在例如启动子上游和/或多聚A下游包含填充序列。
在一些实施方式中,用于编码GOI的核苷酸序列包括反向的GOI表达框。在一些示例性实施方式中,所述反向的GOI表达框可以5'-3'方向包含多聚A序列反向互补序列、GOI开放阅读框的反向互补序列、启动子反向互补序列。在一些示例性实施方式中,所述反向的GOI表达框还可包含增强子、内含子。在一些示例性实施方式中,所述增强子、内含子位于启动子反向互补序列与GOI开放阅读框的反向互补序列之间。在一些示例性实施方式中,反向的GOI表达框可以5'-3'方向包含用于基因编辑、基因调控的DNA序列的反向互补序列。在一些示例性实施方式中,可以在例如启动子'下游和/或多聚A'上游包含填充序列。
在一些实施方式中,所述启动子可以包括,例如,CMV启动子,CAG启动子,或细胞特异性启动子,如GFAP启动子、hAAT启动子等。
在一些实施方式中,所述包装前pciAAV基因组不具有编码rep基因和/或cap基因的核苷酸序列。
本文中,所用术语“保护序列”或“保护DNA序列”,意指,为了阻止杂质DNA包装进rAAV衣壳,在杂质DNA的位置,构建设置的没有细胞危害的DNA。
在一些实施方式中,所述包装前pciAAV基因组可构建于质粒(如pciAAV转基因质粒)中。本文所述的pciAAV转基因质粒可以选择任何适合于产生本文所述的包装前pciAAV基因组的质粒。合适的pciAAV转基因质粒可以基于,例如但不限于,pFastBacdual、pFastBac1质粒等。
所述包装前pciAAV基因组后续可通过pciAAV载体包装***包装进入衣壳蛋白,形成pciAAV载体。在一些实施方式中,所述pciAAV载体包装***可以包括,例如,昆虫细胞杆状病毒包装***、哺乳动物细胞包装***等。
pciAAV转基因质粒
另一方面,本文还提供一种pciAAV转基因质粒,其包含本文所述的包装前pciAAV基因组。
本文所述的pciAAV转基因质粒可以选择任何适合于产生本文所述的包装前pciAAV基因组的质粒。合适的pciAAV转基因质粒可以基于,例如但不限于,pFastBacdual质粒、pFastBac1质粒等。
在一些示例性实施方式中,所述pciAAV转基因质粒可以设计为编码GOI的正链单链DNA序列,如上所述。在一些示例性实施方式中,所述pciAAV转基因质粒可以设计为编码GOI的负链单链DNA序列,如上所述。
所述pciAAV转基因质粒可与Rep、Cap基因表达质粒一起,经pciAAV载体包装***,包装产生本文所述的pciAAV载体。
pciAAV载体
另一方面,本文提供一种pciAAV载体,其包含:
衣壳蛋白,和经衣壳蛋白包装的pciAAV基因组;其中,所述经衣壳蛋白包装的pciAAV基因组源自本文所述的包装前pciAAV基因组。
在一些实施方式中,所述经衣壳蛋白包装的pciAAV基因组源自本文所述的包装前pciAAV基因组的区段(a)-(c)或区段(c)-(e)。
本文中,“pciAAV载体”也称“pciAAV病毒颗粒”,其通过(例如,利用pciAAV载体包装***)将包装前pciAAV基因组包装进入AAV衣壳蛋白而产生。
在一些实施方式中,所述pciAAV载体包装***的示例可以包括,例如,昆虫细胞杆状病毒包装***、哺乳动物细胞包装***等。
在一些实施方式中,所述经衣壳蛋白包装的pciAAV基因组(也称“经包装的pciAAV基因组”)为单极、单链DNA。本文中,所述“单极”指的是单一DNA极性,也即,要么是载有正链DNA的pciAAV载体,要么是载有负链DNA的pciAAV载体,两者不同时存在于同一pciAAV载体中。
在一些实施方式中,所述经包装的pciAAV基因组两端均形成发卡结构(例如,分别具有完整ITR和经改造的ITR)。
在一些实施方式中,所述经包装的pciAAV基因组不具有编码rep基因和/或cap基因的核苷酸序列。
在一些实施方式中,所述经包装的pciAAV基因组包含GOI的正链单链DNA序列和/或负链单链DNA序列。在一些实施方式中,所述经包装的pciAAV基因组包含GOI的正链单链DNA序列。在一些实施方式中,所述经包装的pciAAV基因组包含GOI的负链单链DNA序列。
在一些实施方式中,用于编码GOI的核苷酸序列包括正向的GOI表达框。
在一些示例性实施方式中,所述正向的GOI表达框可以5'-3'方向包含启动子、GOI开放阅读框、多聚A序列。在一些示例性实施方式中,所述正向的GOI表达框还可包含增强子、内含子。在一些示例性实施方式中,所述增强子、内含子位于启动子与GOI开放阅读框之间。在一些示例性实施方式中,所述正向的GOI表达框可以5'-3'方向包含用于基因编辑、基因调控的DNA序列。
在一些实施方式中,用于编码GOI的核苷酸序列包括反向的GOI表达框。在一些示例性实施方式中,所述反向的GOI表达框可以5'-3'方向包含多聚A序列反向互补序列、GOI开放阅读框的反向互补序列、启动子反向互补序列。在一些示例性实施方式中,所述反向的GOI表达框还可包含增强子、内含子。在一些示例性实施方式中,所述增强子、内含子位于启动子反向互补序列与GOI开放阅读框的反向互补序列之间。在一些示例性实施方式中,反向的GOI表达框可以5'-3'方向包含用于基因编辑、基因调控的DNA序列的反向互补序列。
在一些实施方式中,所述启动子可以包括,例如,CMV启动子,CAG启动子,或细胞特异性启动子,如GFAP启动子、hAAT启动子等。
在一些实施方式中,所述pciAAV载体为包含至少第一pciAAV载体和第二pciAAV载体的pciAAV载体组;其中,第一pciAAV载体和第二pciAAV载体各自在其一端具有完整ITR且在其另一端具有经改造的ITR。在一些实施方式中,第一pciAAV载体的pciAAV基因组源自本文所述的包装前pciAAV基因组的区段(a)-(c)或区段(c)-(e)。在一些实施方式中,第二pciAAV载体的pciAAV基因组源自本文所述的包装前pciAAV基因组的区段(a)-(c)或区段(c)-(e)。
在一些实施方式中,所述GOI在其一端(例如5'或3'端)或两端(例如5'和3'端)包含填充序列。在一些实施方式中,所述经改造的ITR(例如,区段(a)或(e))与所述完整ITR(例如,区段(c))之间包含填充序列。“填充序列”通常指的是包含在较大核酸分子(例如质粒载体)中的核苷酸序列,通常用于在两个核酸元件之间(例如在启动子和编码序列(如GOI)之间)产生所需间隔,或延伸核酸分子以使其具有期望长度。填充序列不含有蛋白质编码信息,并且可以具有未知/合成来源和/或与较大核酸分子内的其它核酸序列不相关。
在一些实施方式中,所述经包装的pciAAV基因组长度为约4.7kb(例如,至少4.0kb、至少4.1kb、至少4.2kb、至少4.3kb、至少4.5kb、至少4.6kb、长达4.7kb)。
在一些实施方式中,所述pciAAV载体包含所述GOI的正链单链DNA序列或包含所述GOI的负链单链DNA序列。
在一些实施方式中,所述衣壳蛋白为AAV衣壳蛋白。在一些实施方式中,所述衣壳蛋白可以为选自AAV1-AAV12(AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12)等各种AAV的衣壳蛋白。
在一些实施方式中,所述衣壳蛋白为AAV衣壳蛋白变异体,如酪氨酸单氨基酸/多氨基酸变异体,酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸变异体,或AAV-DJ等多血清型嵌合体,或多肽嵌入变异体等。
在一些实施方式中,所述衣壳蛋白可通过利用pciAAV载体包装***由表达AAV衣壳蛋白Cap的质粒而产生。
在一些实施方式中,所述pciAAV载体可由pciAAV转基因质粒(产生包装前pciAAV基因组)和表达AAV衣壳蛋白Cap与复制蛋白Rep的质粒(产生Cap和Rep蛋白),利用pciAAV载体包装***而包装产生。在一些实施方式中,AAV Cap编码基因和AAV Rep编码基因可以处于同一质粒或两个不同质粒上。在一些实施方式中,AAV Cap和/或AAV Rep表达质粒可包括Cap和/或Rep基因表达框和所需表达元件,以及用于增强表达的内含子序列等。对用于表达AAV Cap和/或Rep的质粒无特别限制,本领域技术人员可常规应用AAV Cap和/或Rep表达质粒,参见例如,Urabe M,Ding C,Kotin RM.Insect cells as a factory to produceadeno-associated virus type 2vectors.Hum Gene Ther.2002Nov 1;13(16):1935-43.doi:10.1089/10430340260355347.PMID:12427305。
包装pciAAV载体的方法
另一方面,本文还提供一种包装pciAAV载体的方法,其包括:将本文所述的pciAAV转基因质粒与Cap、Rep表达质粒分别转化DH10Bac大肠杆菌感受态细胞;经过至少一轮蓝白斑筛选,挑出白色菌落,扩增并提取重组杆粒;利用重组杆粒转染昆虫细胞,以产生重组杆状病毒;和,提取重组杆状病毒,并用重组杆状病毒感染昆虫细胞,以获得pciAAV载体。
在一些实施方式中,所述大肠杆菌感受态细胞为大肠杆菌DH10Bac感受态细胞。在一些实施方式中,所述pciAAV载体包装***为昆虫细胞杆状病毒包装***。
在一些实施方式中,经过至少一轮蓝白斑筛选,挑出白色菌落,扩增并提取重组杆粒。在一些实施方式中,经过两轮或更多轮蓝白斑筛选,挑出白色菌落,扩增并提取重组杆粒。
在一些实施方式中,将重组杆粒转染进入昆虫细胞(例如昆虫细胞Sf9),以产生重组杆状病毒(例如P3代重组杆状病毒)。
在一些实施方式中,将重组杆状病毒(例如P3代的两种或三种重组杆状病毒)感染(例如共同感染)昆虫细胞(例如Sf9昆虫细胞),包装获得pciAAV载体。
图2中给出了根据本文一个示例性实施方式的pciAAV载体构建包装示意图。待由pciAAV载体包装的包装前pciAAV基因组中,待包装的GOI(正或负链)上游具有完整ITR,下游具有缺失D元件及trs序列的经改造的ITR。在上述区段的上游另添加4.4kb的包含GOI的DNA序列,其上游具有缺失D元件及trs序列的经改造的ITR。这样包装产生的AAV基因载体只包含GOI的DNA分子(正或负链),不含有质粒骨架DNA杂质分子。
采用昆虫细胞杆状病毒包装***包装rAAV载体的方法还可参见,例如,Urabe M,Ding C,Kotin RM.Insect cells as a factory to produce adeno-associated virustype 2vectors.Hum Gene Ther.2002Nov 1;13(16):1935-43.doi:10.1089/10430340260355347.PMID:1242730。
pciAAV的应用方法
另一方面,本文还提供一种向细胞递送GOI的方法,包括使细胞与一种或多种本文所述的pciAAV载体接触;其中,一种或多种所述pciAAV载体的基因组包含所述GOI的基因表达框和/或任选的其它DNA序列;其中,所述pciAAV载体由本文所述的包装前pciAAV基因组包装得到。
在一些实施方式中,所述细胞可以是真核细胞。在一些实施方式中,所述细胞可以是动物细胞。在一些实施方式中,所述细胞可以是脊椎动物细胞。在一些实施方式中,所述细胞可以是哺乳动物细胞,例如人细胞。
在一些实施方式中,所述pciAAV载体的基因组包含所述GOI的正链单链DNA序列或负链单链DNA序列。在一些实施方式中,一种或多种所述pciAAV载体包括:只含有所述GOI的正链单链DNA序列的pciAAV载体和/或只含有所述GOI的负链单链DNA序列的pciAAV载体。
在一些实施方式中,一种或多种所述pciAAV载体包括两种或更多种pciAAV载体,其至少包括具有所述GOI的正链单链DNA序列的第一pciAAV载体和具有所述GOI的负链单链DNA序列的第二pciAAV载体。
在一些实施方式中,使细胞与具有所述GOI的正链单链DNA序列的pciAAV载体接触。在一些实施方式中,使细胞与具有所述GOI的负链单链DNA序列的pciAAV载体接触。在一个优选实施方式中,使细胞与具有所述GOI的正链单链DNA序列的第一pciAAV载体和具有所述GOI的负链单链DNA序列的第二pciAAV载体接触。在一些实施方式中,使细胞同时接触具有所述GOI的正链单链DNA序列的第一pciAAV载体和具有所述GOI的负链单链DNA序列的第二pciAAV载体。在一些实施方式中,使细胞依次(例如,在24小时内先后)接触具有所述GOI的正链单链DNA序列的第一pciAAV载体和具有所述GOI的负链单链DNA序列的第二pciAAV载体,反之亦然。应理解,本文中,“第一pciAAV载体”和“第二pciAAV载体”仅用于区分两者而不意在限制其使用次序。
当使用具有所示GOI的正链单链DNA序列的pciAAV载体,或具有所述GOI的负链单链DNA序列的pciAAV载体感染细胞时,其均可以以3'引物合成第二条互补DNA链,启动基因表达。
通过联合使用具有所述GOI的正链单链DNA序列的pciAAV载体和具有所述GOI的负链单链DNA序列的pciAAV载体,有利于使含正链、负链的pciAAV基因组在宿主细胞的细胞核中快速互补配对以形成双链分子,进而启动基因表达。
另一方面,本文还提供一种分离的宿主细胞,其包含本文所述的一种或多种pciAAV载体。
在一些实施方式中,所述宿主细胞可以是真核细胞。在一些实施方式中,所述宿主细胞可以是动物细胞。在一些实施方式中,所述宿主细胞可以是脊椎动物细胞。在一些实施方式中,所述宿主细胞可以是哺乳动物细胞。在一些实施方式中,所述宿主细胞可以是人细胞。
在一些实施方式中,所述宿主细胞通过使真核细胞(例如动物细胞,例如哺乳动物细胞,例如人细胞)与本文所述的一种或多种pciAAV载体接触来获得。
另一方面,还提供本文所述的一种或多种pciAAV载体,其用于基因表达。还提供本文所述的一种或多种pciAAV载体在制备用于基因表达的产品中的用途。在一些实施方式中,所述基因表达的对象是动物,具体地是脊椎动物,更具体地是哺乳动物,更具体地是人类。
另一方面,还提供本文所述的一种或多种pciAAV载体,其用于基因治疗。还提供本文所述的一种或多种pciAAV载体在制备用于基因治疗的产品中的用途。在一些实施方式中,所述基因治疗的对象是动物,具体地是脊椎动物,更具体地是哺乳动物,更具体地是人类。
另一方面,还提供本文所述的一种或多种pciAAV载体,其用于基因编辑。还提供本文所述的一种或多种pciAAV在制备用于基因编辑的产品中的用途。在一些实施方式中,所述基因编辑的对象是动物,具体地是脊椎动物,更具体地是哺乳动物,更具体地是人类。
另一方面,还提供本文所述的一种或多种pciAAV载体,其用于基因调控。还提供本文所述的一种或多种pciAAV在制备用于基因调控的产品中的用途。在一些实施方式中,所述基因调控的对象是动物,具体地是脊椎动物,更具体地是哺乳动物,更具体地是人类。
实施例
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本领域技术人员可对本发明做出适当的修改、变动,这些修改和变动都在本发明的范围之内。
用于pciAAV载体包装的质粒载体的构建
质粒1.pFBD-ITR-CMV-EGFP-PolyA-1.9kb stuff DNA-ITR,用于包装普通rAAV-CMV-EGFP-PolyA载体。
通过以下方式构建质粒1。
设计并使用引物:
引物1:5’-cacgtgcggaccgagtgcatggtccggatgccca-3’(SEQ ID NO:1,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成);
引物2:5’-gccgctcggtccgagggtacaaggcagggcctgc-3’(SEQ ID NO:2,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)。
PCR扩增1.9kb stuffDNA片段,通过RsrII单酶切,使粘性末端的1.9kb stuffDNA,***RsrII单酶切并用小牛肠碱性磷酸酶(Calf Intestinal Alkaline Phosphatase,CIAP)处理的pFastBacdual-ITR-EGFP质粒载体中。
(pFastBacdual-ITR-EGFP质粒构建参考文献:李泰明等,昆虫细胞制备AAV-ITR基因表达微载体,生物工程学报,2015,31(8),1232页,1.2.1方法中的“构建pFastBacdual-ITR-EGFP质粒”)。
质粒2.pFB1-△DtrsITR-1.9kb stuff DNA-CMV-EGFP-PolyA-ITR-1.9kb stuffDNA-CMV-EGFP-PolyA-△DtrsITR,用于包装pciAAV-CMV-EGFP-PolyA载体。
通过以下方式构建质粒2。
第一步构建pFB1-△DtrsITR-CMV-EGFP-PolyA-ITR-ANN。
设计并使用引物:
引物3:5’-agcaccagtcgcggccgctttagatccgaaccagataag-3’(SEQ ID NO:3,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成);
引物4:5’-ggccaacctaggagggctgctagcaccagtcgcggccgcttt-3’(SEQ ID NO:4;由生工生物工程(上海)股份有限公司合成);
引物5:5’-gggaaagccggcgaacgtggcgagaaaggaagg-3’(SEQ ID NO:5,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)。
通过两轮PCR扩增获得携带AvrII/NheI/NotI酶切位点(ANN)-载体-NgoMIV片段。通过AvrII/NgoMIV双酶切,使粘性末端的AvrII/NheI/NotI(ANN)-载体-NgoMIV片段,***AvrII/NgoMIV双酶切的pFB1-△DtrsITR-CMV-EGFP-PolyA-ITR载体中。在载体中另引入AvrII/NheI/NotI3个酶切位点。
第二步构建pFB1-△DtrsITR-1.9kb stuff DNA-CMV-EGFP-PolyA-ITR-ANN。
设计并使用引物:
引物6:5’-tagtcgacgcgtagtgcatggtccggatgccca-3’(SEQ ID NO:6,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成);
引物7:5’-aactagacgcgtagggtacaaggcagggcctgc-3’(SEQ ID NO:7,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成),PCR扩增1.9kb stuff DNA片段。通过MluI单酶切,使粘性末端的1.9kb stuff DNA,***MluI单酶切并用小牛肠碱性磷酸酶(CIAP)处理的pFB1-△DtrsITR-CMV-EGFP-PolyA-ITR-ANN载体中。
第三步构建pFB1-△DtrsITR-1.9kb stuff DNA-CMV-EGFP-PolyA-ITR-CMV-EGFP-PolyA。
设计并使用引物:
引物8:5’-tttgtagctagcctagttattaatagtaatcaa-3’(SEQ ID NO:8,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成);
引物9:5’-tctaaagcggccgctacaaaatcagaaggacaggga-3’(SEQ ID NO:9,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)。
PCR扩增CMV-EGFP-PolyA片段,通过NheI/NotI双酶切,使粘性末端的CMV-EGFP-PolyA片段,***NheI/NotI双酶切的pFB1-△DtrsITR-1.9kb stuff DNA-CMV-EGFP-PolyA-ITR-ANN载体中。
第四步构建pFB1-△DtrsITR-1.9kb stuff DNA-CMV-EGFP-PolyA-ITR-1.9kbstuff DNA-CMV-EGFP-PolyA。
设计并使用引物:
引物10:5’-agggctgctagcagtgcatggtccggatgccca-3’(SEQ ID NO:10,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成);
引物11:5’-aactaggctagcagggtacaaggcagggcctgc-3’(SEQ ID NO:11,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)。
PCR扩增1.9kb stuff DNA片段,通过NheI单酶切,使带粘性末端的1.9kb stuffDNA片段,***NheI单酶切碱性磷酸酶处理的pFB1-△DtrsITR-1.9kb stuff DNA-CMV-EGFP-PolyA-ITR-CMV-EGFP-PolyA载体中。
第五步构建pFB1-△DtrsITR-1.9kb stuff DNA-CMV-EGFP-PolyA-ITR-1.9kbstuff DNA-CMV-EGFP-PolyA-△DtrsITR。
设计并使用引物:
引物12:5’-tttgtagcggccgcattcttctagagctccatggt-3’(SEQ ID NO:12,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成);
引物13:5’-tctaaagcggccgcccggaatattaatagccgcgg-3’(SEQ ID NO:13,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)。
PCR扩增△DtrsITR片段,通过NotI单酶切,使带粘性末端的△DtrsITR片段,***NotI单酶切并用小牛肠碱性磷酸酶(CIAP)处理的pFB1-△DtrsITR-1.9kb stuff DNA-CMV-EGFP-PolyA-ITR-1.9kb stuff DNA-CMV-EGFP-PolyA载体中。
重组Bacmid制备
将上一步的重组质粒分别制备重组Bacmid,具体方法如下:
1,冰上缓慢融化100μl DH10Bac感受态,1-3min。
2,加入500ng质粒DNA,轻轻混匀。
3,冰上放置30分钟,42℃热击90s,立即转入冰上放置3分钟。
4,加入890μl LB培养基,37℃225rpm摇2-3h。
5,在含终浓度为50μg/ml卡那霉素(kan),77μg/ml庆大霉素(Gen),10μg/ml四环素(Tet)的预制的90mm KTG抗性琼脂糖LB固体培养皿中央滴加40μl2%(20mg/ml)的X-gal和20μl 20%(200mg/ml)IPTG。使用无菌涂布器使之均匀涂布于平板表面,于烘箱孵育直至全部液体消失。
6,用取梯度为100μl和300μl菌液涂KTG抗性固体琼脂糖平板。
7,37℃放置48h,挑取2个白色克隆,划线于新的KTG抗性固体琼脂糖平板上,37℃过夜。
8,挑取两个单克隆菌斑进行PCR鉴定;PCR鉴定Bacmid,所用引物分别为目的基因F/R,PUC M13 F/R。
9,取出鉴定正确的Bacmid菌斑,接种于10ml LB(Kan+,Gen+,Tet+)摇菌16-18h,使用OMEGA试剂盒抽提分离重组的杆粒DNA,实验方法参照试剂盒说明书,测量杆粒浓度后分装后冻于–20℃。
杆状病毒的制备
1,配制转染试剂
1×HBS 200ml配制
Hepes 0.954g
NaCl 1.754g
灭菌ddH2O 150ml
1M NaOH调PH至7.4
定容至200ml,安全柜中无菌抽滤,4℃保存
PEI 20ml配制
PEI 0.043g
无水乙醇 1ml
充分溶解后,用1×HBS定容至20ml,反复冻融三次(-20℃冻,室温融化),-20℃保存
2,细胞铺板
铺板:取一6孔板,吸取悬浮培养细胞计数,使铺板细胞密度为2*106个细胞/ml,每孔2ml,细胞存活率在95%以上。
3,转染(每孔的量)
A液:PEI:加6μl PEI及94μl 1×HBS混匀,静置4分钟。
B液:取3μg杆粒(提前将杆粒65℃灭活30分钟)DNA,用1×HBS补足,使终体积为100μl,轻轻混匀。
将A溶液取100μl加入B溶液,混匀,室温孵育30分钟。加入铺好细胞的孔内,培养96小时。
4,扩增病毒
1),分离P1
证实细胞处于晚期感染阶段后(96h),每孔收集2ml含病毒的培养基到无菌的15ml离心管中,500g离心5分钟去除细胞碎片。
取上清到无菌的EP管中,4℃避光保存。若想长期保存,分装冻于-80℃。
2),扩增病毒获取P2
取MOI为0.1,8ml悬浮培养的细胞,密度为2×106个细胞/ml,计算所需的P1体积为1.6ml。27℃培养72h,收集悬浮培养细胞于无菌的15ml离心管中,500g离心5分钟。将上清分装至无菌的EP管中,该病毒上清为P2,4℃避光保存,若想长期保存,分装冻于-80℃。
3),扩增病毒获取P3
可按上述方法扩增得到P3,取MOI为0.1,密度为2×106个细胞/ml,10ml悬浮培养细胞加入200μl P2储存液,培养72h收集P3。
通常得到的P1病毒滴度在1×106-1×107之间,P2滴度在1×107-1×108之间。
4),病毒包装
取MOI为1,100ml悬浮培养的细胞,密度为5×106个细胞/ml,加入P3代Rep、Cap、目的基因各5ml,培养72h收集细胞。
pciAAV载体包装
本发明中涉及的pciAAV载体包装***,可以为昆虫细胞杆状病毒包装***,也可以是哺乳动物细胞包装***。昆虫细胞为Sf9细胞。首先,将表达AAV复制蛋白Rep、表达AAV衣壳蛋白Cap的一个或两个重组质粒(Rep和Cap基因在一个或分别在两个不同的质粒上),另一个质粒含有pciAAV DNA基因组。分别转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,通过两轮蓝白斑筛选,包含重组杆粒的菌落为白色,未发生重组的菌落为蓝色,挑选白色菌落扩增,提取重组杆粒。
然后,用昆虫细胞转染试剂,分别将上述两种,或三种重组杆粒转染昆虫细胞Sf9,4-5天后,收集细胞上清,获得P1代昆虫细胞重组杆状病毒。将P1代重组杆状病毒经过两次感染Sf9昆虫细胞扩增,获得P3代重组杆状病毒。采用噬菌斑法测定P3代杆状病毒的滴度,病毒滴度(pfu/ml)=1/稀释倍数×噬菌斑数×1/每孔接种体积。
最后,将P3代的两种或三种重组杆状病毒共同感染Sf9昆虫细胞,包装获得pciAAV载体病毒颗粒。具体操作可参考文献:Urabe M,Ding C,Kotin RM.Insect cells as afactory to produce adeno-associated virus type 2vectors.Hum Gene Ther.2002年11月1日;13(16):1935-43.doi:10.1089/10430340260355347.PMID:12427305。
采用昆虫细胞杆状病毒包装***的包装示意图如图2所示。
碘克沙醇密度梯度超速离心法纯化步骤
1,获得细胞裂解液
1),共转染72h后,1000g,5分钟离心收集细胞;
2),弃上清,用10ml Lysis Buffer重悬细胞;
Lysis Buffer(1L): NaCl 8.766g
Tris 6.055g
DH2O 950ml
5M HCl调PH:8.5,定容至1L
安全柜中无菌抽滤,4℃保存
3),液氮冷冻,37℃融化,反复3-4次至清亮;
4),4℃,5000g,30分钟离心收集上清;沉淀用4-5ml PBS重悬,再次离心收集上清;
5),加入DNase(10μl/ml)和RNase(1μl/ml),37℃水浴消化1h,待纯化;
2,碘克沙醇密度梯度超速离心纯化病毒
1),用PBS-MK(1×PBS,1mM MgCl2,2.5mMKCl)将60%碘克沙醇,稀释成15%,25%,40%和58%,15%相加固体NaCl至终浓度1M;2),15%,25%相加入0.5%的酚红溶液至1.5μl/ml,58%相加入0.5%的酚红溶液至0.5μl/ml;
3),用1.27*120mm的平口脊椎穿刺针从39ml快速密封管底部依次加入8ml15%,6ml 25%,8ml 40%和5ml 58%的碘克沙醇稀释液,避免出现气泡;
4),将细胞裂解液小心地覆盖在碘克沙醇密度梯度溶液上,填满管子(与管口线齐平),如有必要用Lysis Buffer补充体积填满管子,配平,69000rpm,18℃离心1.5h(BECKMANCOULTER离心机70Ti转子);
5),从底部刺穿快速密封管,弃最初的4ml(对应58%相),收集管中溶液6ml;
6),超滤管(Amicon Uitra-4 Centrifugai Filters,Ultracel-100k)超滤,3000g,5分钟离心;PBS(1×PBS,索莱宝,补加5M NaCl至终浓度350mM)重复洗涤直至碘克沙醇残留浓度<0.1%,最终每100ml包装体积的病度压缩到200μl左右;
7),加甘油至终浓度5%,无菌过滤,分装存于-80℃;
荧光定量PCR检测pciAAV载体滴度的方法
RT-PCR方法
1,将质粒ITR-CMV-EGFP-PolyA-ITR稀释10倍,然后进行梯度稀释,稀释5个梯度做标准曲线
2,将病毒稀释10倍,然后进行梯度稀释,稀释4个梯度
3,缓冲液配制(避光):
2xSuperpreMix Plus(SYBR Green)10μl
引物14,5’-TCCGCGTTACATAACTTACGG-3’(SEQ ID NO:14;由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)0.3μl
引物15,5’-GGGCGTACTTGGCATATGAT-3’(SEQ ID NO:15;由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)0.3μl
dd H2O 4.4μl
4,加样,20μl体系:5μl模板+15μl Buffer,每个梯度做两个复孔
5,RT-PCR(Roche LightCycler)程序:
SDS-PAGE电泳分析pciAAV载体衣壳蛋白质
1,制胶:
1),分离胶(10%):在分离胶的配置烧杯中按如下量加料(9.093ml):双蒸水3.69ml、30%丙烯酰胺制胶液(丙烯酰胺:甲叉双丙烯酰胺=29:1)2.97ml、2M Tris,pH8.82.25ml、10%过硫酸铵90μl、10%SDS 90μl、TEMED 3μl,混匀后利用滴管将分离胶滴入两块玻璃板之间,至液面达到梳子下缘1cm处。用滴管缓慢加入75%乙醇,静置,待分离胶聚合后,倒去75%乙醇层。
2),浓缩胶(5%):在浓缩胶的配置烧杯中按如下量加料(2.357ml):双蒸水1.83ml、30%丙烯酰胺制胶液(丙烯酰胺:甲叉双丙烯酰胺=29:1)0.39ml、0.5MTris,pH6.80.75ml、10%过硫酸铵30μl、10%SDS 30μl、TEMED 2μl,混匀后即刻用滴管加浓缩胶覆于两块玻璃板之间的分离胶之上至满,轻轻***梳子。静置待其凝结后,即制成凝胶板。
2,样品处理:
病毒样品采用与上文关于pciAAV载体的构建、包装、纯化生产所述的相同操作制备。
病毒样品:5X载样缓冲液=2:1的比例混匀,沸水浴10分钟,浴后瞬时离心,取全部样品进行电泳。
3,电泳
1),将两块玻璃板制成的凝胶板垂直安装在电泳槽里的电源架上,使凝胶板的凹沿面靠向电源架。
2),将凝胶板与电源架按要求固定于电源槽内,按要求加入电泳缓冲液,轻轻地拔去凝胶板内的梳子。
3),取处理后的样品液,用微量进样器吸取15μl样品液缓缓加入凝胶板内的凹口部位(样品点入处)。
4),电泳时,控制电压,浓缩胶为90V,分离胶电压为120V。观察胶中的溴酚蓝的色条带走至近底端1cm时,停止电泳。
4,染色。用刀片或薄板将凝胶板外的两块玻璃板轻轻撬开,用刀片在凝胶上沿分离胶与浓缩胶的交接处,将分离胶切下。然后将分离胶小心移入染色器皿中,加入100ml染色液,加盖,染色1-3小时。
5,脱色。将染色液倒去。染色的凝胶用水漂洗数遍,放入清水中,水刚刚没过凝胶即可,放入微波炉中,高火加热2分钟,取出缓慢摇晃,重复此操作,至能清晰显示出蛋白条带。
图3显示了pciAAV载体衣壳蛋白SDS-PAGE电泳结果。泳道1,pciAAV载体。泳道2,rAAV载体。pciAAV衣壳蛋白质和普通的rAAV衣壳蛋白质组成没有差别,都是由VP1、Vp2、Vp3三种蛋白质组成,且三种蛋白质的组成基本上是1:1:10。
pciAAV载体基因组鉴定
DNA中性琼脂糖凝胶电泳分析
1,在三角烧瓶或玻璃瓶中加入准确量的琼脂糖粉和定量的1X TAE电泳缓冲液制备琼脂糖溶液。
2,在***瓶颈上轻轻地塞上Kimwipes纸。如用玻璃瓶,瓶塞须拧松。在沸水浴或微波炉中将混悬液加热至琼脂糖溶解。
3,使清亮的溶液冷却至40-50℃,加入4S red染色液迅速灌制凝胶。当凝胶完全凝固后,置电泳槽中,加入新配制的1X TAE电泳缓冲液至恰好盖没凝胶。
4,采用如上所述制备的rAAV-CMV-EGFP-PolyA载体和pciAAV-CMV-EGFP-PolyA载体。准备病毒储液10μl,加1.1μl 10X PCR Buffer,放入PCR仪,95℃5分钟,72℃5分钟,55℃5分钟,37℃5分钟,80℃5分钟,72℃5分钟,55℃5分钟,37℃15分钟。
5,变复性后的样品中加0.2倍体积的6X凝胶载样缓冲液。
6,将溶于6X载样缓冲液的样品全部加至加样孔中。以100V的电压开始电泳跑50分钟。
7,成像:将胶置于凝胶成像仪中拍照记录。
图4显示了pciAAV载体中性琼脂糖凝胶电泳结果。泳道1,rAAV载体,其DNA主要为正负链互补配对形成的4.7kb双链DNA分子。泳道2,pciAAV载体分别载有两种目的基因DNA分子:正链单极DNA和负链单极DNA(长度均约为4.7kb)。由于这两种DNA的极性相反,它们具有互补性。在中性琼脂糖凝胶电泳分析时,会显示长度约为4.7kb的双链DNA分子。其中,单极单链DNA分子因其分子量较小,会在中性胶上显示小得多的、通常呈弥散形态的DNA条带。泳道3,4.7kb PCR DNA片段。
DNA碱性琼脂糖凝胶电泳分析
1,碱性琼脂糖凝胶的制备:在三角烧瓶或玻璃瓶中加入0.36g琼脂糖粉和27ml蒸馏水制备琼脂糖溶液。在三角***瓶颈上轻轻地塞上Kimwipes纸。如用玻璃瓶,瓶塞须拧松。在微波炉中将混悬液中火加热至琼脂糖溶解。使清亮的溶液在水浴锅56℃平衡5分钟。加入3ml 10X碱性凝胶电泳缓冲液(56℃水浴锅平衡2分钟)混匀,迅速灌制凝胶。当凝胶完全凝固后,置电泳槽中,加入新配制的1X电泳缓冲液(4℃)至恰好盖没凝胶。
2,样品制备:采用如上所述制备的rAAV-CMV-EGFP-PolyA载体和pciAAV-CMV-EGFP-PolyA载体。取病毒样品30μl,加3μl蛋白酶K(20mg/ml),65℃消化15分钟,12000g离心5分钟,取30μl上清,加入6μl 6X碱性凝胶载样缓冲液。
3,电泳:将DNA样品全部加至加样孔中,以<3.5V/cm的电压开始电泳。(水平电泳槽JY-SPAT 27V电泳3h。)
4,洗脱:将凝胶放在400ml注射用水中,水平摇床56rpm洗脱1h,每隔30分钟换一次水。
5,染色:用含0.5μg/ml EB(溴化乙锭)的1X TAE染色液,染洗脱过的凝胶。
6,成像:将胶置于凝胶成像仪中拍照记录。
图5显示了pciAAV载体碱性琼脂糖凝胶电泳结果。泳道1,pciAAV载体,pciAAV DNA在碱性琼脂糖凝胶电泳分析时,一般呈现一条单一的DNA条带,其单链DNA长度是4.7kb,但由于其在包装时,有可能会出现DNA分子的过早断裂,所以,会呈现不均一的DNA长度。泳道2,rAAV载体,其DNA主要为4.7kb单链DNA分子。泳道3,4.7kb PCR DNA片段
pciAAV载体杂质DNA PCR分析
1.材料准备:
模板:pFBD-ITR-CMV-EGFP-PolyA-1.9kb stuff DNA-ITR,Bac-ITR-CMV-EGFP-PolyA-1.9kb stuff-ITR,rAAV2-ITR-CMV-EGFP-PolyA-1.9kb stuff-ITR。
pFB1-△DtrsITR-1.9kb stuff DNA-CMV-EGFP-PolyA-ITR-1.9kb stuff DNA-CMV-EGFP-PolyA-△DtrsITR,Bac-△DtrsITR-1.9kb stuff DNA-CMV-EGFP-PolyA-ITR-1.9kb stuff DNA-CMV-EGFP-PolyA-△DtrsITR,rAAV6-△DtrsITR-1.9kb stuff DNA-CMV-EGFP-PolyA-ITR-1.9kb stuff DNA-CMV-EGFP-PolyA-△DtrsITR(pciAAV-CMV-EGFP-PolyA载体病毒)。
2XTaq Master Mix(近岸生物)
2.为了验证质粒pFB1-△DtrsITR-1.9kb stuff DNA-CMV-EGFP-PolyA-ITR-1.9kbstuff DNA-CMV-EGFP-PolyA-△DtrsITR包装的rAAV6-△DtrsITR-1.9kb stuff DNA-CMV-EGFP-PolyA-ITR-1.9kb stuff DNA-CMV-EGFP-PolyA-△DtrsITR病毒(pciAAV-CMV-EGFP-PolyA载体病毒),△DtrsITR两侧是否有质粒杂质DNA片段,设计如下引物进行PCR扩增。
引物序列:
引物16:ttaggtggcggtacttgggtc(SEQ ID NO:16,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)
引物17:cgcagcagggcagtcgcccta(SEQ ID NO:17,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)
引物18:tgattttgtagcggccgcatt(SEQ ID NO:18,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)
引物19:agcgtcgtaagctaatacgaa(SEQ ID NO:19,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)
引物20:atggtgagcaagggcgaggag(SEQ ID NO:20,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)
引物21:ttacttgtacagctcgtccat(SEQ ID NO:21,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)
为了验证质粒pFBD-ITR-CMV-EGFP-PolyA-1.9kb stuff DNA-ITR包装的rAAV2-ITR-CMV-EGFP-PolyA-1.9kb stuff-ITR病毒(rAAV-CMV-EGFP-PolyA载体病毒),ITR两侧是否有质粒杂质DNA片段,设计如下引物进行PCR扩增。引物序列:
引物16:ttaggtggcggtacttgggtc,(SEQ ID NO:16,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)
引物17:cgcagcagggcagtcgcccta,(SEQ ID NO:17,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)
引物22:gatcataatcagccatacca,(SEQ ID NO:22,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)
引物19:agcgtcgtaagctaatacgaa,(SEQ ID NO:19,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)
引物20:atggtgagcaagggcgaggag,(SEQ ID NO:20,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)
引物21:ttacttgtacagctcgtccat,(SEQ ID NO:21,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)
3.PCR体系20μl:
PCR反应条件
图6显示示例性的pciAAV载体杂质DNA PCR分析引物设计示意图。共设计了四对引物,第一对,F1,R1,用于检测pciAAV包装质粒左侧端△DtrsITR的上游杂质DNA。第二对,F2,R2,用于检测pciAAV包装质粒右侧端△DtrsITR的下游杂质DNA。第三对,F3,R3,用于检测rAAV包装质粒左侧端ITR的上游杂质DNA。第四对,F4,R4,用于检测rAAV包装质粒右侧端ITR的下游杂质DNA。
图7显示pciAAV载体杂质DNA PCR分析结果。可见,pciAAV载体包装不会将质粒骨架DNA杂质分子包装进AAV衣壳,所以不会有PCR产物。pciAAV除了目的DNA条带(A,8),不包含检测的杂质DNA(A,7,9)。不同的是,传统的rAAV载体包装时,左右质粒骨架DNA杂质分子都会被包装进rAAV衣壳,形成rAAV载体杂质DNA分子,两对PCR引物扩增都有产物,因此,除了目的DNA条带(B,8),还包含检测的杂质DNA(B,7,9)。
pciAAV载体感染HEK293细胞基因表达分析
用24孔板铺HEK293细胞,细胞密度为1.5x105,次日用rAAV6-CMV-EGFP-PolyA(rAAV6-EGFP),pciAAV6-CMV-EGFP-PolyA(pciAAV6-EGFP)分别转染HEK293细胞,MOI,1x103,1x104,转染后,第三天,荧光显微镜观察细胞绿色荧光,并照相。流式细胞仪分析绿色荧光细胞百分比和绿色荧光强度。
图8显示了pciAAV载体感染HEK293细胞基因表达检测结果。pciAAV载体由于没有杂质DNA的干扰,其转染细胞的效率比传统rAAV载体转染细胞效率更高,且绿色荧光强度更强。
Claims (10)
1.一种包装前pciAAV基因组,其按顺序包含:
(a)经改造的ITR,其不具有D元件和trs序列;
(b)感兴趣的基因或保护序列;
(c)完整ITR;
(d)感兴趣的基因或保护序列;和
(e)经改造的ITR,其不具有D元件和trs序列;
其中,区段(b)和(d)中至少一个包含感兴趣的基因。
2.如权利要求1所述的包装前pciAAV基因组,其按5'至3'顺序包含上述区段(a)至区段(e)。
3.如权利要求1所述的包装前pciAAV基因组,其中,所述包装前pciAAV基因组中包含感兴趣的基因的正链单链DNA序列和/或感兴趣的基因的负链单链DNA序列,例如,在区段(a)和(c)之间和/或区段(c)或(e)之间。
4.一种pciAAV转基因质粒,其包含如权利要求1所述的包装前pciAAV基因组。
5.一种pciAAV载体,其包含:
衣壳蛋白,和
经衣壳蛋白包装的pciAAV基因组;
其中,所述经衣壳蛋白包装的pciAAV基因组源自如权利要求1所述的包装前pciAAV基因组。
6.如权利要求5所述的pciAAV载体,其中,所述经衣壳蛋白包装的pciAAV基因组源自如权利要求1所述的包装前pciAAV基因组的区段(a)-(c)或区段(c)-(e)。
7.如权利要求5所述的pciAAV载体,其为包含至少第一pciAAV载体和第二pciAAV载体的pciAAV载体组;其中,第一pciAAV载体和第二pciAAV载体各自在其一端具有完整ITR且在其另一端具有经改造的ITR。
8.一种包装pciAAV载体的方法,其包括:将如权利要求4所述的pciAAV转基因质粒与Cap、Rep表达质粒分别转化DH10Bac大肠杆菌感受态细胞;经过至少一轮蓝白斑筛选,挑出白色菌落,扩增并提取重组杆粒;利用重组杆粒转染昆虫细胞,以产生重组杆状病毒;和,提取重组杆状病毒,并用重组杆状病毒感染昆虫细胞,以获得pciAAV载体。
9.一种分离的宿主细胞,其包含一种或多种如权利要求5所述的pciAAV载体。
10.一种或多种如权利要求5所述的pciAAV载体在基因治疗、基因编辑或基因调控中的用途。
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