JP2016523829A - C5arアンタゴニストの使用 - Google Patents
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Abstract
Description
配列番号1:ヒトC5aR
2番目のループは、AA171〜206の下線によって示される。
2番目のループは、AA167〜203の下線によって示される。
リガンド受容体相互作用によって通常惹起される生物学的応答を阻害又は低下させる化合物又は薬物は、受容体アンタゴニストと呼ばれる。このような受容体アンタゴニストは受容体に結合するものの相互作用の効力は発揮しない。したがって、アンタゴニストが存在すると受容体のリガンド(又は複数のリガンド)の生物学的効果は阻害され又は低下する。アンタゴニストの作用は、受容体の活性部位に結合することによって媒介され、それによってリガンド相互作用をブロックするか、又は中断することができる。或いは、アンタゴニストは受容体の異なる部位に結合して、リガンド結合又は受容体シグナル伝達も効果的に妨害することができる。
本発明の態様は、治療有効量のC5aRアンタゴニストを、必要とする個体に投与する工程を含む、骨損傷の治療又は予防のための方法に関する。本発明の範囲内で、この方法はC5aRアンタゴニストの使用に関連した前述の態様及び実施形態と同等の変種及び実施形態を含むことができる。それらの例は、個体に治療有効量のC5aRアンタゴニストを投与する工程を含む、骨損傷の進行の遅延、停止及び/又は阻害が前記個体に有益である疾患又は障害の治療のための実施形態である。一実施形態では、骨損傷の治療方法は治療有効量のC5aRアンタゴニストを必要とする個体に投与することを含み、前記C5aRアンタゴニストは経口的に投与する。さらなる実施形態では、C5aRアンタゴニストは静脈内に投与する。さらなる実施形態では、C5aRアンタゴニストは皮下に投与する。さらなる実施形態では、C5aRアンタゴニストは1日1回投与する。さらなる実施形態では、C5aRアンタゴニストは週2回投与する。さらなる実施形態では、C5aRアンタゴニストは週1回投与する。さらなる実施形態では、C5aRアンタゴニストは2週間毎に投与する。さらなる実施形態では、C5aRアンタゴニストは20日〜25日毎、又は例えば1ヵ月に1回の頻度で投与する。さらなる実施形態では、C5aRアンタゴニストは本明細書で以下に記載したように医薬組成物に含まれる。
補体因子5のA断片であるC5aは、その受容体C5aRに結合し、炎症応答を刺激する。C5a応答をC5aRアンタゴニストで阻害すると、その他の補体成分に影響を及ぼすことなくC5aによって媒介される急性炎症応答が低下する。環状ペプチドなどのペプチド分子及び抗C5a受容体抗体を含む様々な種類のC5aRアンタゴニストが既に記載されている(背景の項を参照のこと)。
本発明は更に、薬学的に許容される担体及び本発明によるC5aRアンタゴニストを含む医薬組成物及び/又は製剤を含む。
1.骨損傷の治療又は予防において使用するためのC5aRアンタゴニスト。
a.CD11b上方制御アッセイにおいて測定されるIC50が、3.5μg/ml未満、例えば、2.5μg/ml未満、例えば、1.5μg/ml未満又は更に1.0μg/m未満であるか、或いは
b.CD62L下方制御アッセイにおいて測定されるIC50が、1.8μg/ml未満、例えば、1.5μg/ml未満、例えば、1.2μg/ml未満、又は更に1.0μg/ml未満である、前記実施形態のいずれかに記載のC5aRアンタゴニスト。
20/70(マウス抗mC5aR)及び7F3(マウス抗hC5aR)の結合領域
7F3及びmAb20/70のヒト及びマウスC5aRへの結合領域はそれぞれ決定され、記載されている(Lee等、(2006) Nat Biotech 24 (10) 1279〜1284)。簡単に説明すると、キメラヒト/マウスC5a受容体は、重複伸長PCRを使用して構築した。合成オリゴヌクレオチドプライマーは、ヒト又はマウスC5aR遺伝子の領域を増幅するために使用した。必要なヒト及びマウス遺伝子セグメントを結合して、C5aRの完全なコーディング配列及びウシロドプシンの10個のアミノ酸のC末端タグを形成した。各DNA配列を哺乳類細胞発現ベクターpcDNA3.1(+)(Invitrogen社)の構成的CMVプロモーターの下流に挿入した。リポフェクタミン2000(Invitrogen社)を使用し、製造者の指示に従って、発現ベクターをマウスL1.2細胞にトランスフェクトした。約1.6μgスーパーコイルプラスミドDNAを8×105個の細胞に添加した。トランスフェクトしたL1.2細胞は、10%ウシ血清(Hyclone社)を補給したRPMI1640(Gibco社)中において増殖させた。
C5aRアンタゴニストのインビトロ試験
CD11b受容体上方制御
抗C5aR mAb(m20/70)がC5aに応答したCD11b発現の上方制御を阻害する能力。
以下の設定は、CD11b発現における変化を測定することによってC5aRアンタゴニストがC5a誘導性好中球成熟を中和する能力を判定するために考案した。
血液は、顎下神経叢を穿刺することによって未処理のC57BL/6マウス(Taconic社、Denmark)からEDTAをコーティングしたチューブに採取した。採取後、血液をプールし、様々な濃度(表参照)の抗C5aR mAb(m20/70、Shushakova等、2002、Hycult biotech社)10μlを小分けした11個のプール血液90μlに添加し、20分間室温(RT)でインキュベートした。インキュベーション後、0.1% BSA(Miltenyi Biotech社、130-091-376)を含むPBSに溶かした組換えマウスC5a(Hycult Biotech社、HC1101)10μg/ml 9μlを試験管1以外の各試験管に添加し、20分間RTでインキュベートした。その後、各試料をフローサイトメトリーのためにCellwash(BD Biosciences社、349524)及び0.2% BSA(Miltenyi Biotech社、130-091-376)を含有する染色緩衝液中に飽和濃度の抗Ly6G-PE(BD Biosciences社、55161)及び抗CD11b-AF700(eBiosciences社、56-0112-82)を含有するマスターミックス50μlを使用して染色した。死細胞を染色するために、Fixable Near IR死細胞染色キット(Invitrogen社、L10119)を製造者の指示に従って染色カクテルに添加した。4℃で20分間インキュベーション後、FACS溶解溶液(BD Biosciences社、349202)を添加して、暗所でRTで15分間インキュベートすることによって赤血球を溶解した。細胞を染色緩衝液で2回洗浄し、その後LSRIIフローサイトメーター(BD Biosciences社)でFACS Divaソフトウェアを使用して分析した。
好中球におけるC5a誘導性CD11b発現(生Ly6G+細胞として定義した)は、C5aを添加しない血液から得られた値から差し引いた所与の抗C5aR mAb濃度のAF700の平均蛍光強度(FI)として定量した(図2)。抗C5aR mAbのIC50値は、GraphPad Prismソフトウェア(v. 5.03)において非線形カーブフィッティングを使用して0.6μg/mlと算出された。
アッセイ設定
以下の設定は、CD62L発現における変化を測定することによってC5aRアンタゴニストがC5a誘導性好中球活性化を中和する能力を判定するために考案した。
FACSCaliburフローサイトメーター(BD Biosciences社)は、チャンネルFL-4用にコンペンセーションパラメータを定めて設定する。試料は、死細胞及び残骸を排除するようにゲーティングする。好中球は、高いFSC及びSSCを有するものとして同定し、ゲーティングする。FL-4(CD62L-APC)チャンネルにおいてゲーティングした好中球の平均蛍光強度(MFI)を算出する。
%Max試料=(MFI試料-MFIMin)/(MFIMax-MFIMin)×100
であった。
C5aRアンタゴニストがC5aRに結合するC5aと置換する効力を測定するために、シンチレーション近接アッセイ(SPA)を適用することができる。SPAの詳細な説明は、米国特許第4568649号に記載されており、手順は製造者によって提供されている(Amersham Biosciences社)。簡単に説明すると、RBL-hC5aR細胞から精製した受容体を有する膜断片をコムギ胚芽凝集素(WGA)でコーティングしたシンチレーティング微小粒子に結合させる。放射標識hC5a(125I)トレーサーを添加した後、受容体に結合すると、粒子から光の放射が生じる。SPAの原理に特異的であるが、互いに非常に近接した放射性同位元素と粒子のみが光を放射し、すなわち、受容体に結合した放射標識hC5aのみがWGA粒子に十分近接して光を発生する。したがって、放射した光の量は、受容体結合125I-hC5aの量を表す。アッセイは競合アッセイで、抗hC5aR/非標識hC5aは受容体の結合に際してトレーサーと競合する。このアッセイでは、固定量の125I標識C5aをWGA粒子及びC5aR受容体に添加し、1分当たりのカウント(cpm)で測定されるある特定量の光の放出を引き起こす。非標識C5a又は抗C5aRを添加した場合、受容体へのそれらの結合は125I C5aの置換によってcpmの低下の原因となる。%置換は以下の通り算出する。
Smax:非特異的結合。特異的に結合した125I-hC5aに取って代わるために十分な量の非標識hC5aを添加することによって測定。
S0:最大結合。非標識hC5aは添加しない。
C5aRアンタゴニストがhC5a(又はmC5a)依存性好中球遊走を阻害する効力は、ボイデンチャンバーにおいて分析することができる。ヒト又は動物血液から単離した好中球をカルセインで染色し、ボイデンチャンバーの上部区画に添加し、抗体と混合する。hC5a又はmC5aはボイデンチャンバーの下部区画に入れると好中球に対して化学誘引物質として作用する。好中球が下部チャンバーに遊走する能力は、3又は5μmのfluoroblok膜を通過するカルセイン染色好中球の数をカウントすることによって測定する。
アッセイによって、インビトロ設定においてC5aRアンタゴニストがC5a媒介作用を中和する能力を測定する。
血液は、PBS+2% FBSで1:1に希釈し、Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare社#17-1440-03)にFicoll 3部及び血液4部の割合で積層し(50mlチューブ中Ficoll 15ml及び血液20ml)、その後、RTで400×gで30分間遠心分離することによって層別化する。吸引することによって中間のPBMCバンドを丁寧に除去する。濃縮赤血球上に層別化した顆粒球をプラスティック製のパスツールピペットで吸引する。顆粒球及び赤血球を新たな50mlチューブに移し、ペレットにする。ペレットは、1×PBS 40mlで希釈し、4% DEXTRAN 500(sigma社、31392)のPBS溶液10mlを添加し(1:5の割合)、反転によって丁寧に混合する。20〜30分後、得られた顆粒球に富んだ上清を新たなチューブに移し、RTで250×gで5分間回転させる。混入する赤血球は、細胞ペレットを0.2% NaCl 7.5mlに再懸濁し、55〜60秒間丁寧に混合することによって浸透圧溶解で除去する。その後、1.2% NaCl 17.5mlを添加し、次にPBSで50mlに希釈し、250×gで5分間回転させる。この工程を1回繰り返す。細胞ペレットをその後反応混合物(dPBS/RPMI)1mlに再懸濁する。生存能及び細胞数は、NucleoCounter(登録商標)を使用してモニターする。
ヒト好中球を精製し、洗浄し、結合緩衝液(50mM HEPES、pH7.5、CaCl2 1mM、MgCl2 5mM及び0.5%ウシ血清アルブミン(画分V IgGを含まない))中に約5×106個/mlで再懸濁する。各試料について細胞懸濁液40μl(1×105個/ウェル)を96ウェルV型プレート(Greiner社、カタログ番号651101)に接種する。競合試験は、最高濃度として1μMから開始したハーフログ希釈の12濃度の競合非標識リガンドを使用して実施する。最終アッセイ体積120μlを考慮してC5aRアンタゴニスト40μlを添加する。放射性リガンド[125I]-hC5a(Perkin Elmer社、カタログ番号NEX250)40μlをバックグラウンド対照以外の全試料に添加する。アッセイにおける放射性リガンドの最終濃度は1nMで、最終体積は120μLである。全試料は3連で実施し、4℃で4時間インキュベートする。次に細胞を4℃で1200rpmで2分間遠心分離して採取し、洗浄緩衝液(50mM HEPES、pH7.5、CaCl2 1mM、MgCl2 5mM、NaCl 150mM及び0.5%ウシ血清アルブミン(画分V IgGを含まない))100μlで3回洗浄する。最後に、細胞を洗浄緩衝液30μlに再懸濁し、OptiPlate(Perkin Elmer社、カタログ番号6005290)に移し、MicroScint 20(Perkin Elmer社、カタログ番号6013621)150μlを各ウェルに添加する。プレートを覆い、よく混合して、1時間後に調整された実験台でカウントする。アッセイに添加した放射性リガンドの全量は、それぞれのプレートで測定する。各試料中のカウントの数は、[125I]-hC5a 1nMを添加し、冷却C5aRアンタゴニストを添加しない際のカウントの最大レベルを100%とし、冷却C5a 1μMの存在下で測定した非特異的結合を0%とした場合の正規化したパーセントの値として表す。データは、非線形回帰によってPRISM(GraphPad社)を使用して分析する。
ヒト好中球のFluo-4 AM細胞色素による染色
好中球を遠心分離し、PBSで洗浄し、次いで細胞色素中に1×107個/mlで再懸濁し、暗所で室温で40分間インキュベートする。細胞を遠心分離し洗浄して(過剰な色素を除去するため)、再度遠心分離し、細胞緩衝液中に2×106個/mlで再懸濁する。細胞(0.5ml)を滅菌していないFACSガラスチューブに分注し、各試料につきチューブ1本で、室温で保存し、2時間以内に使用する。各試料に1×106個の好中球を使用した。
カルシウムフラックスアッセイは以下の通りに実施する。簡単に説明すると、細胞緩衝液0.5ml中でFluo-4 AMを添加した1×106個の好中球をFACSCaliburフローサイトメーター(BD Biosciences社)で、x軸FSC対y軸SSCを使用して好中球にゲーティングして分析する。FL-1(FITC)チャンネルを使用して様々な試薬(例えば、C5aRアンタゴニスト、C5a、イオノマイシン-I-MGB又はC-MGBではなく細胞緩衝液に最終濃度の10倍で溶解)をチューブに添加した後の好中球蛍光を測定する。試料蛍光は1秒毎に獲得した平均蛍光強度(MFI)値によって連続的に測定する。このデータをCellQuest(BD Biosciences社)ファイルに保存し、更に処理し分析するためにExcel(Microsoft社)及びPrism(v4.0c、GraphPad Software Inc.社)に移す。好中球に試薬を添加する順番及びインキュベート時間は、実施するアッセイの種類によって変化し得る。
C5aRアンタゴニストの10×3倍系列希釈を1000μg/mlから1.37μg/mlまでの濃度範囲で調製する。Fluo-4 AMを添加した好中球(細胞緩衝液0.5ml中に1×106個)を10×C5aRアンタゴニスト溶液(チューブ内の最終C5aRアンタゴニスト濃度:100〜0.137μg/ml)50μlと共に室温で10分間インキュベートする。ベースライン蛍光を確立するために細胞及びC5aRアンタゴニストをFACSによって約60秒間分析する。次に、C5a 10nM 50μlを添加して最終濃度を約1nMとし、蛍光測定は更に約60秒間継続する。C5aRアンタゴニストがC5a誘導性Ca2+放出をブロックするならば、蛍光のスパイクはない。C5aRアンタゴニストがC5aを中和しないならば、蛍光にスパイクがある。最後に、イオノマイシン1μg/ml 50μlを添加して最終濃度を0.1μg/mlとし、細胞がまだ応答性であることを確かめるために蛍光測定は更に約60秒間継続する。
コラーゲン誘導性関節炎(CIA)モデルにおける抗C5aRの効果
マウス
雄DBA/1マウス(10〜11週齢)をTaconic(Denmark)から入手し、実験を開始する前に1週間休養させた。マウスは標準的条件下で収容し(10匹/ケージ)、標準的食餌及び水を与えた。
マウスは0日目に尾の基部に完全フロイントアジュバント(2mg/ml、Arthrogen-CIA(登録商標)アジュバント、Chondrex社、USA)で1:1エマルジョンにしたウシII型コラーゲン(bCII、2mg/ml、Chondrex社、USA)100μlを皮内(i.d.)免疫した。21日目にマウスの尾の基部に不完全フロイントアジュバント(Chondrex社、USA)で1:1エマルジョンにしたbCII(1mg/ml、Chondrex社、USA)100μlをi.d.で追加免疫した。マウスはイソフルラン/O2/N2Oを使用して麻酔下で免疫した。
マウスは、実験の21日目から最後まで1週間当たり5回(週末以外は毎日)以下のスコアリング方法に従ってスコア付けした:目に見える臨床症状がない場合は0ポイント、1ポイント/足指の腫脹(1つ又は2つの関節を含むかどうかにかかわらず)(-前足の指I)、指関節、中足骨/中手骨の併発1ポイント、手首、足根/手根の併発1ポイント。最大スコア6は、前足で得られることがあり、最大スコア7は後足で得られることがあった。実験終了前に10を上回る臨床スコアを得たマウスは、デンマーク当局によるヒトのエンドポイントの定義に従って屠殺した。
HC及びLCの可変領域は、ラット抗マウスC5aR mAb20/70から得られた(Shushakova等、2002、Hycult biotech社)。LCの定常領域は、マウスカッパで、HCの定常領域は、FC領域に6つの変異を設計したマウスIgG2aで、mIgG2a.1を生じた。操作された変異L234A、L235E、G237A(ADCC不活性化)、D327Q、A330S及びP331S(CDC不活性化)は、ADCC又はCDCエフェクター機構を低下させるように形成された。マウスFc-ガンマ受容体I〜IVへの結合の欠如は、表面プラズモン共鳴分析によって測定した(データは示さず)。
マウスの個々の治療的療法は、マウスのスコアが2〜7(治療開始時ほとんどのマウスのスコアは2〜4であった)になった際に開始した。治療を開始することが適格になった最初のマウスには化合物1を与え、治療を開始することが適格になった2番目のマウスには化合物2を与えるなどとするように、治療に従ってマウスを無作為化した。この手順を使用すると全ケージに全化合物が表示され、早期及び後期に関節炎を発症したマウスの両方が全投与群において表示された。マウスはどれも2週間に亘って6回の投与を受けた(週末の間は治療を行わなかったので、治療の間隔は1〜2日である)。マウスは以下の化合物の1つで腹腔内(i.p.)治療を受けた。
20/70抗C5aR(マウスIgG2a.1)エンドトキシンレベル<0.10EU/mg、0.5mg/マウス
抗TNP(マウスIgG2a.1)抗体、エンドトキシンレベル0.001EU/mg、0.5mg/マウス
Etanercept(登録商標)10mg/kg
抗TNP(hzIgG1)抗体、エンドトキシンレベル<0.10EU/mg、10mg/kg
マウスは、治療開始及び終了時にイソフルラン/O2/N2Oによって麻酔し目から採血した(約150μl、推定全血量の最大7.5%)。血液は、凝血促進化物質(BD Microtainer社)を含む0.5ml血清管に採取し、4℃で15000Gで2分間遠心分離(20分以内)するまで室温で維持した。血清を1.4ml micronicチューブに移し、標準的ELISAアッセイ(R&D Systems社)を使用してマトリクスメタロプロテイナーゼ-3(MMP3)レベルを更に分析するまで-80℃で保存した。血清試料は、R&D systems社製造のマトリクスメタロプロテイナーゼ-3(MMP-3)ELISAによって記載されたアッセイ手順を使用して分析した。血清試料は、標準希釈液で1:20に希釈する必要があった。さらなる炎症マーカーは58-バイオマーカーマルチアナライトプロファイル(RodentMAP(登録商標)、Myriad, RBM社、Austin、USA)を使用して評価した。
屠殺時、足を切断し、最適に固定し、カルシウム除去するために第3指と第4指の間から踵骨に向かって矢状に分割した。足を4%パラホルムアルデヒドによって室温で48時間固定し、70%エタノール中に入れた。足をImmunocal中で7日間カルシウム除去し、ASP300組織処理装置でパラフィン包埋用に処理し、切断面を下にして包埋した。パラフィン切片は3μmで切断し、組織病理学的評価用に標準的HE染色で染色した。
後足の遠位指節間関節(DIP)、近位指節間関節(PIP)、中足骨及び足根関節における関節炎変化は、スコアリングシステム(Sumariwalla等、2004の変法)を使用して評価し、0=正常な関節構造、1=軽度の変化、2、3の離散した軟骨限局性のびらんの前の滑膜炎及びパンヌス、2=中等度の変化、付随する軟骨細胞核破壊、軟骨の広い領域の消失、いくつかの骨侵食の前のパンヌスの侵食並びに単核細胞及び多形核細胞が浸潤した滑膜過形成、並びに3=重度の骨侵食及び関節構造の破壊である。組織学スコア係数は、マウス当たりスコア付けされた関節領域の全数(マウス当たり6つから8つの関節領域)によって除したマウス当たりの全合計スコアとして計算した。
臨床スコアリングによる試験化合物の統計学的に有意な効果は、マンホイットニー両側検定を使用して試験化合物群と対照群を比較することによって計算した。計算は、個々のマウスについてGraphPad Prismソフトウェアを使用して臨床スコアの全実験時間に亘って曲線下面積(AUC)を評価して実施した。実験終了前に(6回治療投与後)屠殺したマウスは、最後に観察したスコアと共に計算に含めた。
治療的抗C5aR療法は、CIAモデルにおいて疾患の進行を停止することができた。臨床スコアにおける有意な(p<0.0001)差は、抗C5aR治療とアイソタイプ対照治療を比較した際に観察された。更に、全身骨破壊マーカーMMP-3のレベルの有意な(p=0.0002)低下は臨床的治療の効果を裏付けた。エタネルセプト治療後に臨床スコア及びMMP3レベルの同程度の阻害が見いだされた。
マウスの片足の関節炎モデルにおける抗C5aR治療の効果
C57BL/6マウスにおけるDTH関節炎の誘導
DTH-関節炎は、片足にメチル化ウシ血清アルブミン(mBSA)で古典的DTH反応を惹起し、II型コラーゲンモノクローナル抗体のカクテルを免疫と曝露工程の間に投与するという変更を加えて誘導した(Atkinson SA等、(2012) Arthritis Res Ther 14(3):R134)。簡単に説明すると、7日目に雌C57BL/6マウス(8〜10週齢)の尾の基部の皮内に完全フロイントアジュバント(CFA)(Difco社、Detroit、MI)でエマルジョンにしたmBSA(Sigma社、St. Louis、MO)で免疫した。4日後、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)200μlに溶かしたクローンA2-10(IgG2a)、F10-21(IgG2a)、D8-6(IgG2a)、D1-2G(IgG2b)及びD2-112(IgG2b)を含有するII型コラーゲン(CII)マウス抗体5-クローンカクテル(Chondrex社、Redmond、WA)1000μg(約50mg/kg)を静脈内に投与した。0日目に、マウスの右足蹠の皮下にPBS 20μlに溶かしたmBSA 200μgで曝露した。左足蹠にはPBS 20μlのみを投与して対照とした。足蹠曝露後、マウスはmBSAを曝露した右足蹠に関節炎を発症した。
関節炎スコアに対する抗C5aR治療の効果を調べるために、マウス(n=10/群)にブロッキング抗C5aR抗体(前述のように6つのFc変異を含むm20/70 mIgG2a.1)又はアイソタイプ対照抗体(抗TNP-IgG2a.1)のいずれか500μgをi.p.で週2回、関節炎誘導の日(すなわち、0日目)から全部で4回投与して治療した。
主要な効力としてΔ足の腫脹の読出曲線下面積(AUC)を関節炎誘導後0〜11日目から計算し、足の腫脹の変化(Δ)は関節炎誘導後の右足の厚さマイナス関節炎誘導前の右足の厚さとして計算した。
関節炎を誘導して11日後の屠殺時、後足を切断し、最適に固定し、カルシウム除去するために第3指と第4指の間から踵骨に向かって矢状に分割した。足を4%パラホルムアルデヒドで室温で48時間固定し、70%エタノール中に入れた。足をImmunocal中で7日間カルシウム除去し、ASP300組織処理装置でパラフィン包埋用に処理し、切断面を下にして包埋した。パラフィン切片は3μmで切断した。
足における組織病理学的変化は、従来のヘマトキシリン及びエオジン(HE)全体染色、骨侵食を評価するための破骨細胞酵素、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ(TRAP)染色並びに軟骨プロテオグリカン損失を示すためのサフラニンOそれぞれで染色した各足の3つの部分で評価した。炎症細胞の関節外浸潤(0〜3の尺度で評価した)及び関節炎変化は、別々に評価した。関節炎変化は、中足骨及び足根関節で評価し、滑膜炎(炎症細胞の浸潤及び滑膜の過形成)、軟骨分解及び骨侵食は別々に0〜3の尺度でスコア付けした。関節炎変化の3つのパラメータのそれぞれについて、2つの関節領域の間の平均を計算した。組織学的評価は、n=10の抗C5aR治療マウス及びn=10の対照抗体治療マウスで実施した。
組織学的スコアの統計解析のために、ウェルチによって修正された対応のないスチューデントt検定を使用した。群間の差は、p≦0.05の場合有意と見なし、有意のレベルに*:p≦0.05、**:p≦0.01及び***:p≦0.001を割り当てた。
関節炎誘導の日から抗C5aR抗体治療するとアイソタイプ対照抗体と比較して足の腫脹の有意な軽減が示された(P<0.01、対応のない両側スチューデントt検定、データは示さず)。組織病理学的評価によって、関節炎変化(滑膜炎、軟骨分解及び骨侵食)及び関節外浸潤に対する抗C5aR治療の極めて大きな効果が示された(図5)。これらの発見と共に、抗C5aR治療が関節における関節炎変化を予防することができることを示し、関節リウマチ(RA)を治療するため、更に骨侵食及び骨密度の低下を含む骨損傷を治療するための治療薬としての抗C5aRの適合性を示唆している。
コラーゲン誘導性関節炎(CIA)モデルにおける抗C5aRの単回投与治療
抗C5aR治療の迅速な作用発現効果の有望性を研究するために、単回投与による治療的療法を評価した。マウスを前述のように(実施例3)治療し分析した。簡単に説明すると、関節炎誘導のためにマウス(n=22〜26/群A〜C)又は(n=15〜16/群D)を0日目に免疫し、21日目に追加免疫した。マウスがスコア1日目に対応する臨床スコア2〜7に達した際に、抗C5aR又は抗TNP(IgG2a.1)による単回投与治療(0.5mg/マウス)をそれぞれ開始した。マウスは治療して48時間後に殺処分した。炎症マーカーは58-バイオマーカーマルチアナライトプロファイル(RodentMAP(登録商標)、Myriad, RBM社、Austin、USA)を使用して足のホモジェネートで評価した。足のホモジェネートは、全マウスの後足を脚の毛皮のすぐ下から切断することによって調製した。次に、足は常時冷却を維持し、0.9%生理食塩水(最高50ml)中にコンプリート(Roche社)1錠、Triton X-100(Sigma社)5μl及びFUT-175(Calbiochem社)500μlを含有する緩衝液中でホモジェナイズした。ホモジェネートを4℃で10,000Gで15分間2回遠心分離し、上清を分析するまで-80℃で保存した。
抗C5aRで単回投与治療すると24時間後にもう疾患の進行の停止が示され、48時間後には更により明白となった(図6A)。臨床スコアのAUCは、抗C5aR単回投与治療を受けたマウスでは有意に低下した(p=0.0003)(図6B)。
炎症に関与する一群の可溶性分析物を、抗C5aRを投与して48時間後の単回投与治療マウスから得られた足のホモジェネート及び血清試料で調べた。多くの炎症マーカーが、アイソタイプ(抗TNP-IgG2a.1)治療マウスと比較して抗C5aR治療を受けたマウスで有意に低下していることが見いだされた(Table 1(表2))。
遅延型過敏関節炎(DTHA)モデルにおける抗C5aRの単回投与治療
C5aRアンタゴニストの迅速な作用発現の有望性を更に研究するために、単回投与研究において前述のDTHAモデル(実施例4)で更に効果を評価した。
関節炎を誘導した時点で抗C5aRを単回投与すると、60時間後に測定時の足及び足首の腫脹の軽減が導かれた(図7A)。組織病理学的評価によって、滑膜炎、軟骨破壊及び骨侵食は減衰するが、炎症細胞の関節外浸潤は影響を受けないことが明らかになった(図7B)。関節炎表現型と関係する個々の評価パラメータ全部の合計として定義した全体的な組織病理学スコアも、関節炎スコアのように低下した(図7C)。
Claims (15)
- 関節炎の1つ又は複数の症状を有する対象の骨損傷の治療又は予防において使用するためのC5aRアンタゴニストであって、抗体であるC5aRアンタゴニスト。
- 骨損傷が、骨侵食及び骨密度の低下の1つ又は複数を含む、請求項1に記載のC5aRアンタゴニスト。
- 骨損傷及び軟骨分解の治療又は予防において使用するための、請求項1又は請求項2に記載のC5aRアンタゴニスト。
- 治療が骨損傷の速度及び/又は軟骨分解の速度を低下させるためである、請求項2又は請求項3に記載のC5aRアンタゴニスト。
- 治療が骨侵食の進行を阻害又は停止させるため、又は骨密度を増加させるためである、請求項2から4のいずれか一項に記載のC5aRアンタゴニスト。
- 対象が骨侵食又は骨密度の減少に罹患している、請求項1から5のいずれか一項に記載のC5aRアンタゴニスト。
- 対象が関節炎、例えば、骨関節炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎又は敗血症性関節炎を有する、請求項1から6のいずれか一項に記載のC5aRアンタゴニスト。
- 対象がヒトなどの哺乳類である、請求項1から7のいずれか一項に記載のC5aRアンタゴニスト。
- 治療が迅速な応答を得るためである、請求項1から8のいずれか一項に記載のC5aRアンタゴニスト。
- C5aがC5aRに結合するのを阻害又は低下させる、請求項1から9のいずれか一項に記載のC5aRアンタゴニスト。
- C5aRアンタゴニストが、
a. C5a誘導性好中球活性化、
b. C5a誘導性細胞遊走、及び/又は
c. C5a誘導性好中球成熟
などの、C5aのC5aRによって媒介される生物学的効果を阻害又は低下させる、請求項1から10のいずれか一項に記載のC5aRアンタゴニスト。 - C5aRの2番目のループに結合する抗体である、請求項1から11のいずれか一項に記載のC5aRアンタゴニスト。
- 請求項1から12のいずれか一項に記載のC5aRアンタゴニストを含む医薬組成物。
- 治療有効量のC5aRアンタゴニストを、必要とする個体に投与する工程を含む、骨損傷の治療又は予防のための方法。
- 請求項1〜11のいずれか一項に記載されている、請求項14に記載の方法。
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