JP2016507583A - 毛髪への色素沈着効果の発現に好適な化粧料組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、式（Ｉ）で表されるＲ−Ｎ１−スペルミジン、又は１，４−ブタンジアミン、Ｎ−（３−アミノプロピル）−Ｎ１−Ｒ、（Ｉ） Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）３−Ｎ１（Ｒ）−（ＣＨ２）４−ＮＨ２の、そのままの形態又はそれらの医薬として許容される誘導体の形態での、毛髪におけるメラニン生成を誘導し、色素沈着、特に毛茎への色素沈着を促進するために設計された化粧料組成物の有効成分等としての使用、及び局所投与のための活性成分として、式（Ｉ）で表される化合物を、そのままの形態又は塩等の医薬として許容される誘導体の形態で含んでいる、上述の色素沈着効果を実行するために好適な化粧料組成物に関する。【選択図】図１

Description

本発明は、ヒトの毛髪への色素沈着効果及び当該目的を達成するための活性成分の使用に関する。

ヒトの毛包は、上皮細胞（種々の角質細胞系、内皮細胞等）、間葉系細胞（毛乳頭細胞の線維芽細胞、結合組織鞘細胞の線維芽細胞等）、神経外胚葉性細胞（神経、メラノサイト）及び遷移移動性細胞（免疫細胞、肥満細胞）と相互作用する複雑な組織である。

毛髪繊維の成長及び色素沈着は、毛髪周期、体内分布、人種及び性別の違い、種々のホルモン感受性、遺伝子欠陥並びに加齢に伴う変化等に依存する変化等の種々の固有因子の影響を受ける。毛髪の成長は、気候及び季節、汚染物質、毒素及び化学物質への曝露等の環境要因の影響も受ける。表皮及び毛包において観測される色素沈着の制御の相違は、基本的に、ほ乳類の皮膚の色素沈着系の区画を反映している。

上皮、毛包の毛球及び毛包の外根鞘に存在するメラノサイトは、互いに異なっている。大きな相違は、個々のメラノサイト−角質細胞の機能単位に存在する。毛球のメラニン単位は、免疫的に別個の皮膚の領域である近位成長相の毛包内に存在する。当該ユニットは、毛包中の５個の角質細胞毎に存在する1個のメラノサイトと、毛包マトリックスの基底層内の角質細胞毎に存在する1個のメラノサイトとを含んでいる。一方、個々の表皮メラノサイトは、免疫担当表皮メラニン単位における３６個の生きた角質細胞と関連している。

これらの２種類のメラノサイト集団の間の最も明白な相違は、毛球内のメラノサイトの活動が、サイクルの制御の関するものであり、そのため、対応するメラニン生成は、毛髪の成長サイクルと厳密に関連しており、したがって、不連続である。一方、表皮のメラニン生成は連続的であるようである。

事実、毛髪サイクルは、メラノサイトの成長期（初期成長相）、成熟期（成長相の中期から終期）、及びアポトーシスによるメラノサイトの死滅期（初期退行期）を含んでいる。全ての毛髪周期は、少なくとも最初の１０サイクルの間は生存している色素単位の再構成に関連している（非特許文献１、非特許文献２）。メラニンの生合成及び毛包内におけるメラノサイトから角質細胞へのその後の輸送は、メラニン前駆体の存在及び複雑なシグナル伝達機構に依存している。

濾胞及び表皮メラノサイトは共通の特徴を有しているが、濾胞メラノサイトは、加齢のプロセスに対し、表皮メラノサイトよりも感受性が高いようである。毛髪の色素沈着単位は、環境センサとして重要な役割を果たすと共に、重要な生理機能を果たしている。実際に、色素は、メラニンとの選択的に結合することによる、体内からの重金属及び毒素の迅速な排出に寄与している（非特許文献１）。

銀髪又は白髪の出現は、老化及び遺伝子による制御に関連する個々の毛包の色素系性能の低下を示唆する。メラノサイトの老化は、細胞内における抗酸化機構又はアポトーシスの促進及びアポトーシスの抑制における明らかな変化に加え、活性酸素種により媒介される核及びミトコンドリアＤＮＡへの損傷に伴う老化による変異の発現に関連づけられる。酸化ストレスは、環境因子及び内因性の変化（放射線、炎症、精神的ストレス）等の種々の因子により生成される。文献中の他のデータにおいて、（成長期の）毛髪の成長相の間の連続的なメラニンの合成は、高レベルの酸化ストレスを生成し、メラノサイトは、フリーラジカルにより誘発される老化に特に感受性が高いことが報告されている。

事実、銀髪中の色素単位にはアポトーシスしたメラノサイトが含まれると共に高レベルの酸化ストレスが存在することが立証されている（非特許文献３）。

本出願人による国際公開第２０１１／０１３０８７号（特許文献１）には、スペルミジン系の毛髪への色素沈着活性を有する組成物が記載されている。しかし、局所投与製剤として使用する場合、スペルミジンは、他のポリアミンと同様に、皮膚に吸収され作用を発揮する前に、一定時間空気と接触するため、頭皮への局所投与の際に酸化を受けやすい。吸収される前の上述の時間中に起こる可能性のあるスペルミジンの酸化により、活性を有しない酸化生成物が生成する。更に、本発明の範囲は、毛髪の色素沈着活性を増大させることにある。

国際公開第２０１１／０１３０８７号

Tobin, Int. J. Cosmetic Science, 2008 Tobin and Paus, Exp. Gerontol., 2001 Arck et al., FASEB Journal, 2006

驚くべきことに、上述の課題は、下で定義される一般式（Ｉ）：Ｒ−Ｎ^１−スペルミジンを、そのまま、或いは塩等の医薬として許容される誘導体を使用することによって解決されることが見出され、これが本発明の対象である。

本発明は、式（Ｉ）で表されるＲ−Ｎ^１−スペルミジン、又は１，４−ブタンジアミン、Ｎ−（３−アミノプロピル）−Ｎ^１−Ｒ又はそれらの医薬として許容される誘導体の、毛髪におけるメラニン生成を誘導し、色素沈着、特に毛茎への色素沈着を促進するための使用に関する。

（Ｉ） Ｈ_２Ｎ−（ＣＨ_２）_３−Ｎ^１（Ｒ）−（ＣＨ_２）_４−ＮＨ_２

式（Ｉ）において、Ｒはスペルミジンの二級アミン基に結合した置換基であり、必要に応じて１以上の炭素原子がフッ素置換されていてもよい、１から６の炭素原子からなる飽和又は不飽和の直鎖又は分岐鎖アルキル基、すなわち、メチル基、エチル基、トリフルオロメチル基、トリフルオロエチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、エチレン基、ビニル基、プロピレン基、ブチレン基；フェニル基、ナフチル基、ベンジル基、トリル基等の、必要に応じて１以上の炭素原子がフッ素置換されていてもよいアリール基、又は必要に応じて１以上の炭素原子がフッ素置換されていてもよい、１から６の炭素原子からなる飽和又は不飽和の直鎖又は分岐鎖アルキル基、すなわち、メチル基、エチル基、トリフルオロメチル基、トリフルオロエチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、エチレン基、ビニル基、プロピレン基、ブチレン基を含むアリール−アルキル基；必要に応じて１以上の炭素原子が、必要に応じて１以上の炭素原子がフッ素置換されていてもよい、１から６の炭素原子からなる飽和又は不飽和の直鎖又は分岐鎖アルキル基、すなわち、メチル基、エチル基、トリフルオロメチル基、トリフルオロエチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、エチレン基、ビニル基、プロピレン基、ブチレン基で置換されていてもよい、３から８の炭素原子からなる飽和又は不飽和のシクロアルキル基である。

毛包中の色素沈着の（絶対）強度の測定値を示すと共に、キャリアのみで処理した対照群と、それぞれ、濃度０．５及び１．５μＭのＮ−メチル−スペルミジン（ＭＳ）で処理した群と、濃度０．５μＭのスペルミジン（Ｓｐｄ）で処理した参照群とを比較したグラフである。 キャリアで処理した対照群、それぞれ、濃度０．５及び１．５μＭのＮ−メチル−スペルミジン（ＭＳ）で処理した群についての、マッソン・フォンタナ法によるメラニンの組織化学的実験結果に対応する画像である。 チロシナーゼ活性（％）の絶対値を示すグラフである。 チロシナーゼ活性（％）のそれぞれについて、対照と比較した場合における増加率を示すグラフである。

一般式（Ｉ）で表される化合物は、本発明の範囲内で活性を有し、空気中で安定であるため、酸化の結果、他の不活性な物質に変化することなく、頭皮への有効な局所投与が可能である。

これらの一般式（Ｉ）で表される化合物は、毛髪における顕著なメラニン生成作用を有しているため、毛髪への色素沈着、特に毛茎への色素沈着のための頭皮への局所投与に有効に使用することができる。

本発明において、上述の作用により、式（Ｉ）で表される化合物の、例えば、毛髪染色剤に通常見られる有害な副作用のない天然の色素沈着剤としてのヒトに対する使用が導き出される。

上述の色素沈着効果を実行するために設計された化粧料組成物も本発明の対象であり、したがって、該組成物は、局所投与のための活性成分として、式（Ｉ）で表される化合物を少なくとも１種、そのままの形態又は塩等の医薬として許容される誘導体の形態で含んでいる。

局所への使用に好適な形態としては、例えば、ローション、コンディショナー、シャンプー、マスク又はゲルが挙げられる。

式（Ｉ）で表される上述の化合物が、塩等の医薬として許容される誘導体の形態を取る場合、好ましくは三マレイン酸塩等のマレイン酸塩又は三塩酸塩等の塩酸塩である。

局所投与のための製剤用に医薬として許容される他の有機又は無機塩も全て好適である。

式（Ｉ）で表され、本発明に好ましい化合物は、Ｎ^１−メチル−スペルミジン又は下式で表されるＮ−（３−アミノプロピル）−Ｎ^１−メチル−１，４−ブタンジアミン（ＣＡＳ登録番号 ５１４６０−２３−２）であり、

（ＩＩ） Ｈ_２Ｎ−（ＣＨ_２）_３−Ｎ^１（ＣＨ_３）−（ＣＨ_２）_４−ＮＨ_２

本発明の組成物において、そのままの形態又は三マレイン酸塩又は三塩酸塩（３ＨＣｌ）等の医薬として許容される塩の形態で使用される。

式（Ｉ）で表され、本発明に好ましい他の化合物は、Ｎ^１−シクロヘキシル−スペルミジン、又は下式で表されるＮ−（３−アミノプロピル）−Ｎ^１−シクロヘキシル−１，４−ブタンジアミン（ＣＡＳ登録番号 １８３０７０−２８−２）であり、

（ＩＩＩ） Ｈ_２Ｎ−（ＣＨ_２）_３−Ｎ^１（Ｃ_６Ｈ_１１）−（ＣＨ_２）_４−ＮＨ_２

本発明の組成物において、そのままの形態又は三マレイン酸塩又は三塩酸塩（３ＨＣｌ）等の医薬として許容される塩の形態で使用される。

一般式（Ｉ）で表される他の好ましい化合物は、Ｎ^１−エチル−スペルミジン又は下式で表されるＮ−（３−アミノプロピル）−Ｎ^１−エチル−１，４−ブタンジアミン又は医薬として許容される塩である。

（ＩＶ） Ｈ_２Ｎ−（ＣＨ_２）_３−Ｎ^１（Ｃ_２Ｈ_５）−（ＣＨ_２）_４−ＮＨ_２

式（Ｉ）で表され、本発明に好ましい他の化合物は、Ｎ^１−プロピル−スペルミジン又は下式で表されるＮ−（３−アミノプロピル）−Ｎ^１−プロピル−１，４−ブタンジアミンであり、

（Ｖ） Ｈ_２Ｎ−（ＣＨ_２）_３−Ｎ^１（Ｃ_３Ｈ_７）−（ＣＨ_２）_４−ＮＨ_２

そのままの形態又は医薬として許容される塩の形態で使用される。

式（Ｉ）で表される化合物は、そのままの形態又は塩等の医薬として許容される誘導体の形態のいずれの場合においても、本発明の組成物に、好ましくは、下記の溶液の重量／体積濃度の範囲内の量だけ含まれている。
・０．０１〜０．３０ｇ／１００ｍＬ
・０．００１〜０．３０ｇ／１００ｍＬ
・０．０００１０〜０．１５ｇ／１００ｍＬ
・０．００５〜０．３０ｇ／１００ｍＬ
・０．０５〜０．２１０ｇ／１００ｍＬ

本発明に基づいて調製された頭皮への局所投与のための組成物の例について以下に説明するが、本発明を制限するものではない。

成分の量は、表示された濃度範囲と共に、重量／体積％で表記されている。

実施例１
ヘアージェル
成分（名称を含む）・・・・・・・・・・・・・・・量 ｗ／ｖ（％）
ポリアクリル酸−１４・・・・・・・・・・・・・０．０５〜１．００
ＰＲＧ−４０ 水素化ヒマシ油・・・・・・・・・０．２０〜３．００
香料・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・０．１０〜１．００
ヒドロキシメチルグリシンナトリウム塩・・・・・０．０４〜０．４９
パンテノール・・・・・・・・・・・・・・・・・０．１０〜０．５０
ソルビトール・・・・・・・・・・・・・・・・・０．１０〜１．００
Ｎ１−メチル，Ｎ１−（３−アミノプロピル）
−１，４−ブタンジアミン・・・・・・・・・・・０．０１０〜０．３０
ＥＤＴＡ二ナトリウム塩・・・・・・・・・・・・０．０２５〜０．１０
ヒドロキシプロピルグアー・・・・・・・・・・・０．２０〜１．００
ベンゾフェノン−４・・・・・・・・・・・・・・０．２０〜０．２５
ポリクオタニウム−１１・・・・・・・・・・・・０．０５〜０．５０
水・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・１００ｍＬになるまで適量

実施例２
ヘアコンディショナー
成分（名称を含む）・・・・・・・・・・・・・・・量 ｗ／ｖ（％）
ＥＤＴＡ二ナトリウム塩・・・・・・・・・・・・０．０２５〜０．０５
キシリトール・・・・・・・・・・・・・・・・・０．５０〜１．５０
パンテノール・・・・・・・・・・・・・・・・・０．５０〜１．５０
セリシン・・・・・・・・・・・・・・・・・・・０．０５０〜０．２０
ヒドロキシエチルセルロース・・・・・・・・・・０．１０〜０．９０
塩化セトリモニウム・・・・・・・・・・・・・・０．５０〜５．００
ビス−イソブチルＰＥＧ／ＰＰＧ−２０／３５／
アモジメチコン共重合体・・・・・・・・・・・・０．０５〜０．７５
エチルヘキサン酸セチル・・・・・・・・・・・・０．０５〜０．４０
ポリソルビン酸 ８０・・・・・・・・・・・・・０．０５〜０．４０
ブチレングリコール・・・・・・・・・・・・・・０．０５〜３．００
シクロペンタシロキサン・・・・・・・・・・・・０．１０〜３．００
Ｃ１２〜１３アルキル乳酸エステル・・・・・・・・０．５０〜５．００
ステアリン酸グリセリル・・・・・・・・・・・・１．００〜６．００
ＰＥＧ−１００ ステアリン酸エステル・・・・・０．５０〜４．００
ジメチコン・・・・・・・・・・・・・・・・・・１．００〜６．００
ジメチコノール・・・・・・・・・・・・・・・・０．１０〜１．００
セテアリルアルコール・・・・・・・・・・・・・１．００〜７．００
フィタントリオール・・・・・・・・・・・・・・０．０５０〜１．００
フェノキシエタノール・・・・・・・・・・・・・０．３０〜０．９０
メチルパラベン・・・・・・・・・・・・・・・・０．０２０〜０．２０
エチルパラベン・・・・・・・・・・・・・・・・０．０２０〜０．２０
ゼアキサンチン・・・・・・・・・・・・・・・・０．００００５〜
０．０００３０
ルチン・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・０．０００５〜０．００３
Ｎ１−メチル，Ｎ１−（３−アミノプロピル）
−１，４−ブタンジアミン・・・・・・・・・・・０．０００１０〜０．１５
香料・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・０．１０〜０．３０
水・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・１００ｍＬになるまで適量

実施例３
アフターシャンプー水
成分（名称を含む）・・・・・・・・・・・・・・・量 ｗ／ｖ（％）
安息香酸ナトリウム・・・・・・・・・・・・・・０．０４〜０．１０
ソルビン酸カリウム・・・・・・・・・・・・・・０．０４〜０．１０
パンテノール・・・・・・・・・・・・・・・・・０．１０〜０．５０
Ｎ１−メチル，Ｎ１−（３−アミノプロピル）
−１，４−ブタンジアミン・・・・・・・・・・・０．０１０〜０．３０
ＥＤＴＡ二ナトリウム塩・・・・・・・・・・・・０．０２５〜０．０５
香料・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・０．１０〜０．２０
ＰＰＧ−２６−Ｂｕｔｅｔｈ−２６・・・・・・・０．２０〜０．５０
ＰＥＧ−４０ 水素化ヒマシ油・・・・・・・・・０．２０〜０．５０
乳酸・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ｐＨ５．０になるまで適量
水・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・１００ｍＬになるまで適量

実施例４
男性型脱毛症処置用ローション
成分（名称を含む）・・・・・・・・・・・・・・・量 ｗ／ｖ（％）
ヒドロキシプロピルトリモニウムヒアルロン酸塩・０．００５〜０．５０
ポリウレタン−２６・・・・・・・・・・・・・・０．００４〜４．０
レシチン（ダイズ）・・・・・・・・・・・・・・・０．００５〜５．０
変性アルコール・・・・・・・・・・・・・・・・１５．０〜２０．０
Ｎ１−メチル，Ｎ１−（３−アミノプロピル）
−１，４−ブタンジアミン・・・・・・・・・・・０．００５〜０．３０
ビオチン・・・・・・・・・・・・・・・・・・・０．０１〜０．１０
パントテン酸カルシウム・・・・・・・・・・・・０．１〜３．０
ルチン・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・０．００１〜０．０５
ＰＥＧ−４０ 水素化ヒマシ油・・・・・・・・・０．５〜２．０
ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシ
ケイ皮酸オクタデシル・・・・・・・・・・・・・０．０５
香料・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・０．２０
ゼアキサンチン・・・・・・・・・・・・・・・・０．００２〜０．０１
ヒマワリ種子油・・・・・・・・・・・・・・・・０．００１〜０．０１
乳酸・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ｐＨ５．０になるまで適量
水・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・１００ｍＬになるまで適量

実施例５
男性型脱毛症処置用シャンプー
成分（名称を含む）・・・・・・・・・・・・・・・量 ｗ／ｖ（％）
ラウレススルホコハク酸二ナトリウム塩・・・・・１．００〜５．００
ラウレス硫酸マグネシウム・・・・・・・・・・・５．００〜９．００
ＰＥＧ−７ グリセリルココエート・・・・・・・０．５０〜１．００
コカミドＭＩＰＡ・・・・・・・・・・・・・・・０．５０〜２．００
ＰＥＧ−２００ 水素化パルミチン酸グリセリル・０．５０〜２．００
ポリカテミウム−１０・・・・・・・・・・・・・０．１０〜０．５０
ラウロイルサルコシン酸ナトリウム・・・・・・・１．００〜４．００
ＥＤＴＡ四ナトリウム塩・・・・・・・・・・・・０．０５〜０．２０
Ｎ１−メチル，Ｎ１−（３−アミノプロピル）
−１，４−ブタンジアミン・・・・・・・・・・・０．００１〜０．３０
ビオチン・・・・・・・・・・・・・・・・・・・０．０１〜０．１０
パントテン酸カルシウム・・・・・・・・・・・・０．０１〜３．０
ウンデシレノイル小麦タンパクカリウム塩・・・・０．５０〜１．００
ラウレス−４・・・・・・・・・・・・・・・・・０．０１〜０．８０
香料・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・０．１０〜０．８０
グリコールジステアリン酸・・・・・・・・・・・０．５０〜１．００
ラウレス−７・・・・・・・・・・・・・・・・・０．５０〜０．８０
ココアモホ酢酸ナトリウム・・・・・・・・・・・０．０５〜３．００
コカミドプロピルベタイン・・・・・・・・・・・０．０１〜２．００
ラウレス硫酸ナトリウム・・・・・・・・・・・・０．０１〜３．００
ヒドロキシメチルグリシンナトリウム塩・・・・・０．２０〜０．４５
水酸化ナトリウム・・・・・・・・・・・・・・・適量
クエン酸・・・・・・・・・・・・・・・・・・・適量
水・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・１００ｍＬになるまで適量

実施例６
強力ヘアケア用化粧液
成分（名称を含む）・・・・・・・・・・・・・・・量 ｗ／ｖ（％）
変性アルコールＣ型・・・・・・・・・・・・・・１０．００〜２０．００
パントテン酸カルシウム・・・・・・・・・・・・０．０５〜２．００
Ｎ１−メチル，Ｎ１−（３−アミノプロピル）
−１，４−ブタンジアミン・・・・・・・・・・・０．０５〜０．２１０
オクタトリエン酸カリウム・・・・・・・・・・・０．００１〜０．１８
ビオチン・・・・・・・・・・・・・・・・・・・０．００５〜０．０２０
セイヨウジュウニヒトエ葉抽出物・・・・・・・・０．００１〜０．１０
ダイズ乳酸発酵物・・・・・・・・・・・・・・・０．０１〜０．１５
パンテノール・・・・・・・・・・・・・・・・・０．１０〜１．００
ヒアルロン酸ヒドロキシプロピルトリモニウム・・０．００２〜０．５０
ポリウレタン−２６・・・・・・・・・・・・・・０．００４〜４．０
レシチン（ダイズ）・・・・・・・・・・・・・・・０．００５〜５．０
ＰＥＧ−４０ 水素化ヒマシ油・・・・・・・・・０．５０〜２．００
香料・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・０．１０〜０．３０
ヒドロキシプロピルグアー・・・・・・・・・・・０．１０〜０．４０
エトキシジグリコール・・・・・・・・・・・・・０．１０〜０．７０
乳酸・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・０．０５〜０．５０
水・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・１００ｍＬになるまで適量

以下、本発明に基づく組成物の使用中の活性の実験結果について詳述する。

活性実験
組織サンプル
定期的にフェイスリフト治療を受けている女性から、インフォームドコンセント後に正常ヒト頭皮を採取した。全ての実験は、倫理委員会の承認の下で、ヘルシンキ原則に適合するように実施した。

毛包及び組織培養片の顕微解剖
正常な色素沈着が見られる成長相ＶＩの毛包（ＨＦ）（銀髪及び白髪の毛包は実験に使用していない）を正常ヒト頭皮から顕微解剖し、フィルポットのモデルに基づいて組織培養に供した。

本発明のＮ^１−メチル−スペルミジン又はキャリア自体（対照群）を、培地を交換する度に、すなわち４８時間毎に投与した。投与した対象化合物は、濃度０．５μＭのスペルミジンであった。

毛髪の色素沈着
マッソン・フォンタナ染色液を投与し、凍結切片中のメラニンの組織化学的可視性を確保した。メラニンは褐色顆粒として染色され、定量的マッソン・フォンタナ法により、色素沈着度を評価した(Ito N., Ito T., Kromminga A., Bettermann A., Takigawa M., Kees F., Straub R. H., and Paus R. (2005): Human hair follicles display a functional equivalent of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis and synthesise Cortisol. (FASEB J 19, 1332-4)。

この方法は、メラニン合成の変化について、非常に高感度で信頼性の高い指標であることが、酵素活性のアッセイ及び通常のチロシナーゼの発現によって証明されている(Kauser S., Slominski A., Wei E. T., and Tobin D. J. (2006): Modulation of the human hair follicle pigmentary unit by corticotropin-releasing hormone and urocortin peptides. (FASEB J 20, 882-95)。

毛包の色素沈着単位の所定の参照領域における染色の強さは、ソフトウェアＩｍａｇｅＪ（アメリカ国立衛生研究所）を使用して解析した。

図面の説明
図１及び図２は、実験結果を示す。図３及び図４は、他の実験結果を示す。

結果
図１及び２は、上述の実験結果を示す図である。

同図において、Ｎ^１−メチル−スペルミジンは、頭文字のＭＳで示されている。頭文字Ｓｐｄは、対照化合物として使用したスペルミジンを示している。

図１は、毛包中の色素沈着の（絶対）強度の測定値を示すと共に、キャリアのみで処理した対照群と、それぞれ、濃度０．５及び１．５μＭのＮ^１−メチル−スペルミジン（ＭＳ）で処理した群と、濃度０．５μＭのスペルミジン（Ｓｐｄ）で処理した参照群とを比較したグラフである。

図２は、キャリアで処理した対照群、それぞれ、濃度０．５及び１．５μＭのＮ^１−メチル−スペルミジン（ＭＳ）で処理した群についての、マッソン・フォンタナ法によるメラニンの組織化学的実験結果に対応する画像である。

キャリアの画像に示されるように、色素沈着領域の近位側と遠位側とは区別される。

図１及び２のいずれにおいても、Ｎ^１−メチル−スペルミジンで処理した場合には、テストされた両濃度について、用量依存的にメラニンの産生量の増大、ひいては、本化合物で処理した毛髪において、参照キャリアとの比較においてメラニン色素産生活性がはっきりと示されている。

また、図１のグラフは、濃度０．５μＭのＮ^１−メチル−スペルミジン（ＭＳ）を使用した場合における毛包の絶対色素沈着強度が、濃度０．５μＭのスペルミジン（Ｓｐｄ）で処理した対照群との比較において、増加量が高いことを示している。

チロシナーゼの酵素アッセイ
図３及び図４は、後述の他の実験結果を示す。

下記の式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）及び（Ｖ）で表される化合物を、全て５ｍＭの濃度で、上述のようにテストした。

アッセイの原理
チロシナーゼは、メラニンの合成及び集積が起こるエンドサイトーシス経路中の特殊化した細胞内器官であるメラノソーム中に発現する膜糖タンパクである。チロシンからのメラニンの合成は、色素産生細胞であるメラノサイト中で行われる。メラノソームにおいて産生されたメラニンは、上述の経路を経て角質細胞に輸送される。メラニンは、広い波長スペクトル内の光を吸収する高分子であり、紫外線照射の有害な効果から角質細胞を保護する。アミノ酸を２，３−ジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）に変換する第１段階の反応には、ペルオキシダーゼが関与している。チロシナーゼ酵素は、ドーパキノンを産生する次段階の生合成経路に関与している。メラニンは、前駆体であるチロシン及びDOPAを出発物質とし、加水分解酵素及び酸化酵素の両者の機能を示すチロシナーゼ酵素によって合成される。チロシンがＬ−ＤＯＰＡ（ジヒドロキシフェニルアラニン）に変換され、次いで、赤色のドーパキノンに変換され、褐色のメラニン高分子が得られる。合成経路の第1の分岐において、ドーパキノンは黒色高分子量メラニンに変換され、一方、システインとの反応により、互いに同様の物質であり、赤色高分子量メラニンと呼ばれる一連の高分子が生成する。

使用物質
リン酸一カリウム（Ｓｉｇｍａ Ｐ５３７９−１００Ｇ）
Ｌ−チロシン（Ｓｉｇｍａ Ｔ３７５４−５０Ｇ）
チロシナーゼ（Ｓｉｇｍａ Ｔ３８２４−２５ＫＵ）
水酸化カリウム標準溶液（Ｓｉｇｍａ ３５１１３−１ Ｌ）
水（ＢｉｏＣｈｅｍｉｋａ、分子生物学用、ＤＥＰＣ処理及び滅菌フィルター処理済）（Ｓｉｇｍａ ９５２８４）

装置
キュベット １００−ＱＳ（Ｈｅｌｌｍａ，Ｚ６００１０５）
フィルター付滅菌ノズルチップ
分光光度計（Ｊｅｎｗａｙ ＵＶＡ ＩＳ ＭＯＤ：６７１５，ＢＳ−６７１５Ｂ０）
ｐＨメーター ８２７ｐＨＬａｂ（Ｍｅｔｒｈｏｍ）

手順
試薬Ａ（リン酸カリウムバッファー、５０ｍＭ、ｐＨ６．５、２５°Ｃ）
１Ｍ ＫＯＨを使用して、ｐＨ（約４．５）をｐＨ６．５に調整
使用まで４℃にて保管

試薬Ｂ（Ｌ−チロシン溶液 １ｍＭ）
使用まで４℃にて保管

試薬Ｃ（チロシン溶液）
使用直前
酵素は、ｘｘｘｘ単位／ｍｇ（ボトルに記載されており、違うボトルを使用する毎に異なる）の所定体積を有する固体である。
対応する液体についての計算値＝ｘｘｘｘ単位／ｍＬ 液体体積
＝ｘｘｘｘ単位／ｍＬ 液体体積／ｘｘｘｘ単位／ｍｇ 固体重量
＝ｘｍｇ／ｍＬ
約１ｍＬの溶液を調製し、アルミ箔中、−２０℃で使用まで保管する。
後述のとおり、溶液Ａ＋Ｂを調製する。
脱イオン水 ９ｍＬ
試薬Ａ １０ｍＬ（リン酸カリウムバッファー ５０ｍＭ）
試薬Ｂ １０ｍＬ（Ｌ−チロシン １ｍＭ）
必要ならば、溶液をボルテックスし、１Ｍ ＨＣｌ又はＮａＯＨを用いて、２５℃におけるｐＨを６．５に再調整する。
テストに供する化合物の種々の濃度の溶液を調製し、使用まで４℃で保管する。
チロシナーゼ溶液の霜取りをし、使用まで暗所にて氷中で保管しておく。
リン酸カリウムバッファー（５０ｍＭ、ｐＨ ６．５）、上述の溶液Ａ＋Ｂ及びテストに供する式（Ｉ）で表される化合物を含む溶液を室温で混合する。
校正のために分光光度計を起動する。
下記のパラメータを使用する。
読み取り波長：280nm
測定モード：吸光度
測定時間：７００秒
その他については、通常の手順にしたがう。

まず、Ｌ−チロシンのみが存在する場合におけるチロシナーゼの酵素活性を測定し、実際の１ｍＬあたりの酵素単位を確認し、後でテストに供される化合物が酵素活性に及ぼす効果を評価する際の基準とする。
１ ブランクテストを繰り返す（テストされる濃度毎にブランクテスト１回）
２ テストを繰り返す（テストされる濃度毎にテスト１回）
（キュベットを用いずに）装置のブランクテストの読み取りを行う→校正
個別のキュベットに、後述のように混合物を調製する

式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）及び（Ｖ）で表されるテストに供する化合物のテストを、後述のとおり行う。
１ ブランクテストを繰り返す（テストされる濃度毎にブランクテスト1回）
２ テストを繰り返す（テストされる濃度毎にテスト1回）
個別のキュベットに、後述のように混合物を調製する

酵素活性の阻害又は促進能の計算

ｄｆ＝希釈率（０．１ｍＬ／合計体積３ｍＬ＝３０）
０．００１＝３ｍＬの反応混合物中での、ｐＨ ６．５、２５℃における、Ｌ−チロキシン１単位あたりのＡ_{２８０ｎｍ}／ｍｉｎの変化量
０．１＝使用した酵素の体積（ｍＬ）
単位／固体１ｍｇ＝単位／酵素１ｍＬ：ｍｇ 固体重量／酵素１ｍＬ
単位／タンパク質１ｍｇ＝単位／酵素１ｍＬ：ｍｇ タンパク質重量／酵素１ｍＬ
単位の定義＝Ｌ−チロシン含有反応混合物３ｍＬ中での、ｐＨ ６．５、２５℃におけるＡ_{２８０ｎｍ}／ｍｉｎの増加量が０．００１である酵素量

テストに供した化合物のそれぞれについて、活性化合物が存在しない場合における酵素活性（酵素活性１００％）と比較して、酵素活性の割合を計算した。

その後、酵素活性の増加率（％酵素活性−１００）を計算した。

上の表に示したデータを、図３及び４のグラフにまとめた。図３は、酵素活性（％）の絶対値を示す。

図４は、上述のとおり測定した酵素活性（％）のそれぞれについて、対照と比較した場合における増加率を示す。

テストに供した式（Ｉ）で表される化合物の全てが、チロシナーゼの酵素活性、ひいては特許請求の範囲に関連するメラニン産生活性について、明らかな増加を示している。

Claims (18)

1. 式（Ｉ）で表されるＲ−Ｎ^１−スペルミジン、又は１，４−ブタンジアミン、Ｎ−（３−アミノプロピル）−Ｎ^１−Ｒ又はそれらの医薬として許容される誘導体の、毛髪におけるメラニン生成を誘導し、色素沈着、特に毛茎への色素沈着を促進するための使用。
   （Ｉ） Ｈ_２Ｎ−（ＣＨ_２）_３−Ｎ^１（Ｒ）−（ＣＨ_２）_４−ＮＨ_２
   式（Ｉ）において、Ｒはスペルミジンの二級アミン基に結合した置換基であり、必要に応じて１以上の炭素原子がフッ素置換されていてもよい、１から６の炭素原子からなる飽和又は不飽和の直鎖又は分岐鎖アルキル基、すなわち、メチル基、エチル基、トリフルオロメチル基、トリフルオロエチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、エチレン基、ビニル基、プロピレン基、ブチレン基；フェニル基、ナフチル基、ベンジル基、トリル基等の、必要に応じて１以上の炭素原子がフッ素置換されていてもよいアリール基、又は必要に応じて１以上の炭素原子がフッ素置換されていてもよい、１から６の炭素原子からなる飽和又は不飽和の直鎖又は分岐鎖アルキル基、すなわち、メチル基、エチル基、トリフルオロメチル基、トリフルオロエチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、エチレン基、ビニル基、プロピレン基、ブチレン基を含むアリール−アルキル基；必要に応じて１以上の炭素原子が、必要に応じて１以上の炭素原子がフッ素置換されていてもよい、１から６の炭素原子からなる飽和又は不飽和の直鎖又は分岐鎖アルキル基、すなわち、メチル基、エチル基、トリフルオロメチル基、トリフルオロエチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、エチレン基、ビニル基、プロピレン基、ブチレン基で置換されていてもよい、３から８の炭素原子からなる飽和又は不飽和のシクロアルキル基である。
2. 前記式（Ｉ）で表される化合物が、頭皮に局所的に投与される請求項１に記載の使用。
3. 前記式（Ｉ）で表される化合物が、Ｎ^１−エチル−スペルミジン又は下式で表されるＮ−（３−アミノプロピル）−Ｎ^１−メチル−１，４−ブタンジアミンである請求項１に記載の使用。
   （ＩＩ） Ｈ_２Ｎ−（ＣＨ_２）_３−Ｎ^１（ＣＨ_３）−（ＣＨ_２）_４−ＮＨ_２
4. 前記式（Ｉ）で表される化合物が、Ｎ^１−シクロヘキシル−スペルミジン又は下式で表されるＮ−（３−アミノプロピル）−Ｎ^１−シクロヘキシル−１，４−ブタンジアミンである請求項１に記載の使用。
   （ＩＩＩ） Ｈ_２Ｎ−（ＣＨ_２）_３−Ｎ^１（Ｃ_６Ｈ_１１）−（ＣＨ_２）_４−ＮＨ_２
5. 前記式（Ｉ）で表される化合物が、Ｎ^１−エチル−スペルミジン又は下式で表されるＮ−（３−アミノプロピル）−Ｎ^１−エチル−１，４−ブタンジアミンである請求項１に記載の使用。
   （ＩＶ） Ｈ_２Ｎ−（ＣＨ_２）_３−Ｎ^１（Ｃ_２Ｈ_５）−（ＣＨ_２）_４−ＮＨ_２
6. 前記式（Ｉ）で表される化合物が、Ｎ^１−プロピル−スペルミジン又は下式で表されるＮ−（３−アミノプロピル）−Ｎ^１−プロピル−１，４−ブタンジアミンである請求項１に記載の使用。
   （Ｖ） Ｈ_２Ｎ−（ＣＨ_２）_３−Ｎ^１（Ｃ_３Ｈ_７）−（ＣＨ_２）_４−ＮＨ_２
7. 前記式（Ｉ）で表される化合物の医薬として許容される塩が、三マレイン酸塩等のマレイン酸との塩である請求項１に記載の使用。
8. 前記式（Ｉ）で表される化合物の医薬として許容される塩が、三塩酸塩等の塩酸との塩である請求項１に記載の使用。
9. 式（Ｉ）で表されるＲ−Ｎ^１−スペルミジン、又は１，４−ブタンジアミン、Ｎ−（３−アミノプロピル）−Ｎ^１−Ｒのうち少なくとも１つを含む、毛髪への色素沈着を促進するための化粧料組成物。
   （Ｉ） Ｈ_２Ｎ−（ＣＨ_２）_３−Ｎ^１（Ｒ）−（ＣＨ_２）_４−ＮＨ_２
   式（Ｉ）において、Ｒはスペルミジンの二級アミン基に結合した置換基であり、必要に応じて１以上の炭素原子がフッ素置換されていてもよい、１から６の炭素原子からなる飽和又は不飽和の直鎖又は分岐鎖アルキル基、すなわち、メチル基、エチル基、トリフルオロメチル基、トリフルオロエチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、エチレン基、ビニル基、プロピレン基、ブチレン基；フェニル基、ナフチル基、ベンジル基、トリル基等の、必要に応じて１以上の炭素原子がフッ素置換されていてもよいアリール基、又は必要に応じて１以上の炭素原子がフッ素置換されていてもよい、１から６の炭素原子からなる飽和又は不飽和の直鎖又は分岐鎖アルキル基、すなわち、メチル基、エチル基、トリフルオロメチル基、トリフルオロエチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、エチレン基、ビニル基、プロピレン基、ブチレン基を含むアリール−アルキル基；必要に応じて１以上の炭素原子が、必要に応じて１以上の炭素原子がフッ素置換されていてもよい、１から６の炭素原子からなる飽和又は不飽和の直鎖又は分岐鎖アルキル基、すなわち、メチル基、エチル基、トリフルオロメチル基、トリフルオロエチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、エチレン基、ビニル基、プロピレン基、ブチレン基で置換されていてもよい、３から８の炭素原子からなる飽和又は不飽和のシクロアルキル基である。
10. 前記式（Ｉ）で表される化合物が、Ｎ^１−メチル−スペルミジン又は下式で表されるＮ−（３−アミノプロピル）−Ｎ^１−メチル−１，４−ブタンジアミンである請求項９に記載の化粧料組成物。
    （ＩＩ） Ｈ_２Ｎ−（ＣＨ_２）_３−Ｎ^１（ＣＨ_３）−（ＣＨ_２）_４−ＮＨ_２
11. 前記式（Ｉ）で表される化合物が、Ｎ^１−シクロヘキシル−スペルミジン又は下式で表されるＮ−（３−アミノプロピル）−Ｎ^１−シクロヘキシル−１，４−ブタンジアミンである請求項９に記載の化粧料組成物。
    （ＩＩＩ） Ｈ_２Ｎ−（ＣＨ_２）_３−Ｎ^１（Ｃ_６Ｈ_１１）−（ＣＨ_２）_４−ＮＨ_２
12. 前記式（Ｉ）で表される化合物が、Ｎ^１−エチル−スペルミジン又は下式で表されるＮ−（３−アミノプロピル）−Ｎ^１−エチル−１，４−ブタンジアミンである請求項９に記載の化粧料組成物。
    （ＩＶ） Ｈ_２Ｎ−（ＣＨ_２）_３−Ｎ^１（Ｃ_２Ｈ_５）−（ＣＨ_２）_４−ＮＨ_２
13. 前記式（Ｉ）で表される化合物が、Ｎ^１−プロピル−スペルミジン又は下式で表されるＮ−（３−アミノプロピル）−Ｎ^１−プロピル−１，４−ブタンジアミンである請求項９に記載の化粧料組成物。
    （Ｖ） Ｈ_２Ｎ−（ＣＨ_２）_３−Ｎ^１（Ｃ_３Ｈ_７）−（ＣＨ_２）_４−ＮＨ_２
14. 前記式（Ｉ）で表される化合物が、０．５μＭの濃度で存在する請求項９に記載の化粧料組成物。
15. 前記式（Ｉ）で表される化合物が、１．５μＭの濃度で存在する請求項９に記載の化粧料組成物。
16. 前記式（Ｉ）で表される化合物が、下記の範囲内の、単位体積当たりの重量分率で表される濃度で存在する請求項９に記載の化粧料組成物。
    ・０．０１〜０．３０ｇ／１００ｍＬ
    ・０．００１〜０．３０ｇ／１００ｍＬ
    ・０．０００１０〜０．１５ｇ／１００ｍＬ
    ・０．００５〜０．３０ｇ／１００ｍＬ
    ・０．０５〜０．２１０ｇ／１００ｍＬ
17. 前記式（Ｉ）で表される化合物の医薬として許容される塩が、三マレイン酸塩等のマレイン酸との塩である請求項９に記載の化粧料組成物。
18. 前記式（Ｉ）で表される化合物の医薬として許容される塩が、三塩酸塩等の塩酸との塩である請求項９に記載の化粧料組成物。