JP2016506974A - Acceptor framework for CDR grafting - Google Patents

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Abstract

本発明は、抗体アクセプターフレームワーク、および非ヒト抗体、例えば、ウサギ抗体を、特によく適した抗体アクセプターフレームワークを使用して、グラフトする方法に関する。本発明の方法によって生成された抗体は、種々の診断および治療の用途に有用である。本発明によれば、例えば、配列番号１を含むヒト重鎖アクセプターフレームワークが提供される。本発明のアクセプターフレームワークをコードする単離された核酸もまた提供される。The present invention relates to antibody acceptor frameworks and methods for grafting non-human antibodies, such as rabbit antibodies, using a particularly well-suited antibody acceptor framework. The antibodies produced by the methods of the invention are useful for a variety of diagnostic and therapeutic applications. According to the present invention, for example, a human heavy chain acceptor framework comprising SEQ ID NO: 1 is provided. Also provided is an isolated nucleic acid encoding an acceptor framework of the present invention.

Description

モノクローナル抗体、それらの結合体および誘導体は、治療剤および診断剤として商業的に非常に重要である。非ヒト抗体は、通常、単一の低用量注射後、患者において強い免疫応答を誘発する（Ｓｃｈｒｏｆｆ，１９８５ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ４５：８７９−８５，Ｓｈａｗｌｅｒ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９８５ １３５：１５３０−５； Ｄｉｌｌｍａｎ，Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒ １９９４ ９：１７−２８）。したがって、マウスおよび他の齧歯動物の抗体の免疫原性を低減するためのいくつかの方法、ならびに、完全ヒト抗体を、例えば、トランスジェニックマウスまたはファージディスプレイを用いて生成する技術が開発された。齧歯動物の可変領域をヒト定常領域と共に併せ持つキメラ抗体（例えば、Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ Ｎａｔｕｒｅ １９８４ ３１２：６４３−６）が遺伝子工学的に構築され、免疫原性の問題をかなり低減させた（例えば、ＬｏＢｕｇｌｉｏ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １９８９ ８６：４２２０−４；Ｃｌａｒｋ，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ ２０００ ２１：３９７−４０２）。ヒト化抗体も構築された。ヒト化抗体では、可変領域自体の齧歯動物配列が、少なくとも元のＣＤＲを保存しながら、できるだけヒト配列に近くなるように遺伝子工学的に操作されたか、あるいは齧歯動物抗体のＣＤＲがヒト抗体のフレームワーク中にグラフトされた（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｎａｔｕｒｅ １９８８ ３３２：３２３−７；米国特許第５，６９３，７６１号）。ウサギ（ｒａｂｂｉｔ）ポリクローナル抗体は、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロットなどの生物学的アッセイに広く用いられている。ポリクローナルウサギ抗体は、それらが通常はるかに高い親和性を有するので、ポリクローナル齧歯動物抗体よりもしばしば好まれる。さらに、ウサギは、しばしば、マウスにおいて免疫原性が低く、および／またはファージディスプレイにおいて使用されるときに良好なバインダーを生じさせない抗原への良好な抗体応答を誘発することができる。ウサギ抗体のこれらの周知の利点のため、ウサギ抗体は、治療用抗体の発見および開発での使用に理想的である。これが一般的になされない理由は、主に、モノクローナルウサギ抗体の生成における技術的困難にある。骨髄腫様の腫瘍は、ウサギでは知られておらず、モノクローナル抗体を生成する従来のハイブリドーマ技術は、ウサギ抗体には適用できない。ウサギ抗体発現細胞の融合細胞系パートナーを提供する先駆的研究は、Ｋｎｉｇｈｔおよび同僚によって行われ（Ｓｐｉｅｋｅｒ−Ｐｏｌｅｔ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ １９９５，９２：９３４８−５２）、改善された融合パートナー細胞系が２００５年にＰｙｔｅｌａらによって記載された（例えば、米国特許第７４２９４８７号参照）。しかしながら、対応するノウハウが基本的に単一の研究グループによって制御されているため、この技術は広範に普及していない。ＲＴ−ＰＣＲを介した、選択された抗体発現細胞からの抗体のクローニングを伴うモノクローナル抗体の生成のための代替方法は文献に記載されているが、ウサギ抗体については一度も成功の報告がなされていない。   Monoclonal antibodies, their conjugates and derivatives are of great commercial importance as therapeutic and diagnostic agents. Non-human antibodies usually elicit strong immune responses in patients after a single low dose injection (Schroff, 1985 Cancer Res 45: 879-85, Shawler. J Immunol 1985 135: 1530-5; Dillman, Cancer Biother 1994 9: 17-28). Thus, several methods have been developed to reduce the immunogenicity of murine and other rodent antibodies, as well as techniques for generating fully human antibodies using, for example, transgenic mice or phage display. . Chimeric antibodies (eg, Boulianne Nature 1984 312: 643-6) that combine rodent variable regions with human constant regions have been genetically engineered to significantly reduce immunogenicity problems (eg, LoBuglio, Proc Natl Acad Sci 1989 86: 4220-4; Clark, Immunol Today 2000 21: 397-402). Humanized antibodies have also been constructed. In a humanized antibody, the rodent sequence of the variable region itself has been genetically engineered to be as close to the human sequence as possible while preserving at least the original CDR, or the CDR of the rodent antibody is a human antibody (Eg, Riechmann, Nature 1988 332: 323-7; US Pat. No. 5,693,761). Rabbit polyclonal antibodies are widely used in biological assays such as ELISA or Western blot. Polyclonal rabbit antibodies are often preferred over polyclonal rodent antibodies because they usually have a much higher affinity. Furthermore, rabbits are often less immunogenic in mice and / or can elicit good antibody responses to antigens that do not produce good binders when used in phage display. Because of these well-known advantages of rabbit antibodies, rabbit antibodies are ideal for use in the discovery and development of therapeutic antibodies. The reason this is not generally done is mainly due to technical difficulties in the production of monoclonal rabbit antibodies. Myeloma-like tumors are not known in rabbits and conventional hybridoma technology to generate monoclonal antibodies is not applicable to rabbit antibodies. Pioneering work to provide fusion cell line partners for rabbit antibody-expressing cells was done by Knight and colleagues (Spieker-Polet et al., PNAS 1995, 92: 9348-52), with an improved fusion partner cell line 2005 (See, eg, US Pat. No. 7,429,487). However, this technology is not widely spread because the corresponding know-how is basically controlled by a single research group. Alternative methods for the production of monoclonal antibodies involving cloning of antibodies from selected antibody-expressing cells via RT-PCR have been described in the literature, but rabbit antibodies have never been successful. Absent.

ウサギ抗体は、ヒト治療に用いたならば、マウス抗体と同様に、強い免疫応答を誘発すると予測され、したがって、ウサギ抗体は、それらが臨床的に使用され得る前に、ヒト化される必要がある。しかしながら、それぞれ、ウサギ抗体とマウス抗体との間、およびウサギ抗体とヒト抗体との間の構造差のため、ヒト化齧歯動物抗体を作るのに用いられる方法をウサギ抗体に対して当てはめることは容易にはできない。例えば、軽鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲＬ３）は、以前に知られていたヒトまたはマウス抗体由来のＣＤＲＬ３よりはるかに長いことが多い。   Rabbit antibodies, if used in human therapy, are expected to elicit a strong immune response, similar to mouse antibodies, and thus rabbit antibodies need to be humanized before they can be used clinically. is there. However, due to the structural differences between rabbit and mouse antibodies, and between rabbit and human antibodies, respectively, it is not possible to apply the method used to make humanized rodent antibodies to rabbit antibodies. It's not easy. For example, the light chain CDR3 (CDRL3) is often much longer than the previously known human or mouse antibody derived CDRL3.

従来技術に記載されたウサギ抗体ヒト化アプローチがごくわずかに存在するが、それらは、非ヒトドナーＣＤＲがヒトアクセプター抗体に移植される古典的なグラフトアプローチではない。ＷＯ０４／０１６７４０は、いわゆる「リサーフェーシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）」ストラテジーを記載する。「リサーフェーシング」ストラテジーの目標は、非ヒトフレームワークの溶媒アクセス可能残基を、それらが、よりヒト様（ｍｏｒｅ ｈｕｍａｎ−ｌｉｋｅ）になるように再構築することである。ＷＯ０４／０１６７４０号に記載されている、ウサギ抗体のための類似のヒト化技法が当該技術分野で公知である。ＷＯ０８／１４４７５７およびＷＯ０５／０１６９５０の両方が、ウサギモノクローナル抗体をヒト化する方法を開示しており、これらは、親ウサギ抗体のアミノ酸配列と類似ヒト抗体のアミノ酸配列との比較を含む。続いて、親ウサギ抗体のフレームワーク領域が、類似ヒト抗体の同等なフレームワーク領域に、配列においてより類似するように、親ウサギ抗体のアミノ酸配列が改変される。良好な結合能を得るためには、各イムノバインダーについて個々に、手間のかかる開発努力を行う必要がある。   Although there are only a few rabbit antibody humanization approaches described in the prior art, they are not classical graft approaches in which non-human donor CDRs are grafted onto human acceptor antibodies. WO 04/016740 describes a so-called “resurfacing” strategy. The goal of the “resurfacing” strategy is to reconstruct solvent accessible residues of non-human frameworks so that they are more human-like. Similar humanization techniques for rabbit antibodies described in WO 04/016740 are known in the art. Both WO08 / 144757 and WO05 / 016950 disclose methods for humanizing rabbit monoclonal antibodies, which involve a comparison of the amino acid sequence of the parent rabbit antibody with that of a similar human antibody. Subsequently, the amino acid sequence of the parent rabbit antibody is modified so that the framework region of the parent rabbit antibody is more similar in sequence to the equivalent framework region of a similar human antibody. In order to obtain a good binding capacity, it is necessary to make laborious development efforts for each immunobinder individually.

上述のアプローチの潜在的問題は、ヒトフレームワークが使用されておらず、ウサギフレームワークが、それがよりヒト様に見えるように遺伝子工学的に操作されることである。そのようなアプローチは、タンパク質のコアに埋められているアミノ酸ストレッチがなお免疫原性Ｔ細胞エピトープを含み得るという危険性を有する。   A potential problem with the above approach is that no human framework is used and the rabbit framework is engineered to make it look more human-like. Such an approach has the risk that the amino acid stretch embedded in the core of the protein may still contain immunogenic T cell epitopes.

これまでに、本出願者らは、現況技術のグラフトアプローチを適用することによってヒト化されたウサギ抗体を同定していない。これは、ウサギＣＤＲがヒトまたは齧歯動物ＣＤＲとはかなり異なったものであり得るという事実によって説明され得る。当該技術分野で公知の通り、多くのウサギＶＨ鎖が、マウスおよびヒトの対応物と比較して、追加の対システインを有する。ｃｙｓ２２とｃｙｓ９２との間で形成される保存されたジスルフィド架橋に加えて、ｃｙｓ２１−ｃｙｓ７９架橋もあり、さらに、いくつかのウサギの鎖では、ＣＤＲＨ１の最後の残基とＣＤＲＨ２の最初の残基との間で形成されるＣＤＲ間Ｓ−Ｓ架橋もある。その上、対のシステイン残基がＣＤＲ−Ｌ３でしばしば見出される。さらに、多くのウサギ抗体ＣＤＲは、以前から公知のいかなる標準的構造にも属さない。特に、ＣＤＲ−Ｌ３は、ヒトまたはマウスの対応物であるＣＤＲ−Ｌ３よりもはるかに長いことが多い。
したがって、ヒトフレームワーク中への非ヒトＣＤＲ抗体のグラフトは主要なタンパク質工学的課題である。自然進化したフレームワークから、人工的に選択された異なるヒトフレームワークへの抗原結合ループの移行は、抗原結合のために天然ループコンフォメーションが保持されるように行われなければならない。抗原結合親和性が、ループグラフト後に大きく低減するか、または消失することがよくある。抗原結合ループのグラフトにおいて、慎重に選択されたヒトフレームワークの使用によって、ヒト化分子において結合親和性を保持する確率が最大となる（Ｒｏｇｕｚｋａら、１９９６年）。文献中の利用可能な多くのグラフト実験はＣＤＲグラフトのおおまかな手引きを提供するが、パターンを一般化することは不可能である。典型的な問題は、ＣＤＲループをグラフトした後に、特異性、安定性または産生能を失うことにある。
したがって、治療剤および診断剤として使用するため、ウサギ抗体を確実かつ迅速にヒト化するための改良法について緊急の必要性がある。さらに、ウサギ抗体を確実にヒト化するためのヒトアクセプターフレームワークの必要性があり、このヒトアクセプターフレームワークは、薬物様生物物理特性を有する機能的抗体および／または抗体フラグメントを提供する。 To date, Applicants have not identified a humanized rabbit antibody by applying the state of the art grafting approach. This can be explained by the fact that rabbit CDRs can be quite different from human or rodent CDRs. As is known in the art, many rabbit VH chains have an additional counter cysteine compared to their mouse and human counterparts. In addition to the conserved disulfide bridge formed between cys22 and cys92, there is also a cys21-cys79 bridge, and in some rabbit chains, the last residue of CDRH1 and the first residue of CDRH2 There are also S—S bridges between the CDRs formed between them. Moreover, paired cysteine residues are often found in CDR-L3. Furthermore, many rabbit antibody CDRs do not belong to any previously known standard structure. In particular, CDR-L3 is often much longer than its human or mouse counterpart, CDR-L3.
Therefore, grafting non-human CDR antibodies into the human framework is a major protein engineering challenge. The transition of an antigen binding loop from a naturally evolved framework to a different artificially selected human framework must be performed so that the natural loop conformation is retained for antigen binding. Often antigen binding affinity is greatly reduced or lost after loop grafting. In the grafting of antigen binding loops, the use of a carefully selected human framework maximizes the probability of retaining binding affinity in a humanized molecule (Roguzka et al., 1996). Many of the grafting experiments available in the literature provide general guidance for CDR grafting, but it is impossible to generalize the pattern. A typical problem is losing specificity, stability or productivity after grafting the CDR loops.
Thus, there is an urgent need for improved methods for reliably and rapidly humanizing rabbit antibodies for use as therapeutic and diagnostic agents. Furthermore, there is a need for a human acceptor framework to reliably humanize rabbit antibodies, which provides functional antibodies and / or antibody fragments with drug-like biophysical properties.

米国特許第５，６９３，７６１号明細書US Pat. No. 5,693,761 米国特許第７，４２９，４８７号明細書US Pat. No. 7,429,487 国際公開第０４／０１６７４０号International Publication No. 04/016740 国際公開第０８／１４４７５７号International Publication No. 08/144757 国際公開第０５／０１６９５０号International Publication No. 05/016950

Ｓｃｈｒｏｆｆ，１９８５ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ４５：８７９−８５Schroff, 1985 Cancer Res 45: 879-85 Ｓｈａｗｌｅｒ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９８５ １３５：１５３０−５Shawler. J Immunol 1985 135: 1530-5 Ｄｉｌｌｍａｎ，Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒ １９９４ ９：１７−２８Dillman, Cancer Biother 1994 9: 17-28 Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ Ｎａｔｕｒｅ １９８４ ３１２：６４３−６Boulianne Nature 1984 312: 643-6 ＬｏＢｕｇｌｉｏ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １９８９ ８６：４２２０−４LoBuglio, Proc Natl Acad Sci 1989 86: 4220-4 Ｃｌａｒｋ，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ ２０００ ２１：３９７−４０２Clark, Immunol Today 2000 21: 397-402 Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｎａｔｕｒｅ １９８８ ３３２：３２３−７Riechmann, Nature 1988 332: 323-7 Ｓｐｉｅｋｅｒ−Ｐｏｌｅｔ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ １９９５，９２：９３４８−５２Spieker-Polet et al. , PNAS 1995, 92: 9348-52.

驚くべきことに、品質管理（ＱＣ）アッセイによって同定された（ＷＯ０１４８０１７およびＡｕｆ ｄｅｒ Ｍａｕｒ ｅｔ ａｌ （２００１），ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ５０８，ｐ．４０７−４１２で開示される通りの）高度に可溶性および安定性があるヒト抗体フレームワークは、他の非ヒト動物種からのＣＤＲ、例えば、ウサギＣＤＲに対応するのに特に好適であることが見出された。その結果、第１の態様において、本発明は、ジスルフィド架橋がＣＤＲ中に存在するかどうかとは無関係で、異なる結合特異性の、アクセプターとして、様々な抗体、特にウサギ抗体からのＣＤＲに好適な特定のヒト抗体の重鎖可変領域（いわゆる、「ａ５８」ＶＨフレームワーク配列）を提供する。   Surprisingly, it is highly soluble and stable (as disclosed in WO0148017 and Auf der Maur et al (2001), FEBS Lett508, p. 407-412) identified by a quality control (QC) assay Human antibody frameworks have been found to be particularly suitable for dealing with CDRs from other non-human animal species, such as rabbit CDRs. Consequently, in a first aspect, the present invention is suitable for CDRs from various antibodies, particularly rabbit antibodies, as acceptors, with different binding specificities, regardless of whether disulfide bridges are present in the CDRs. The heavy chain variable region of a particular human antibody (the so-called “a58” VH framework sequence) is provided.

ウサギＣＤＲの、この高度に適合する可変鎖フレームワークへのグラフトによって生成されるヒト化イムノバインダーは、ドナーＣＤＲが由来するウサギ抗体の空間識を一貫して、確実に維持する。したがって、ドナーイムノバインダーの構造的に重要な位置をアクセプターフレームワーク中に導入する必要がない。これらの利点のため、結合能の最適化なしで、またはほとんどなしで、ウサギ抗体のハイスループットな（ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ）ヒト化を実現することができる。   Humanized immunobinders generated by grafting rabbit CDRs onto this highly compatible variable chain framework consistently and reliably maintain the spatial knowledge of the rabbit antibody from which the donor CDRs are derived. Therefore, it is not necessary to introduce structurally important positions of the donor immunobinder into the acceptor framework. Because of these advantages, high-throughput humanization of rabbit antibodies can be achieved with little or no optimization of binding capacity.

したがって、別の態様において、本発明は、本明細書に開示の可溶性および安定性のある軽鎖および／または重鎖ヒト抗体フレームワーク配列中に、ウサギＣＤＲおよび他の非ヒトＣＤＲをグラフトさせ、それによって、優れた生物物理特性を有するヒト化抗体を生成する方法を提供する。特に、本発明の方法によって生成されたイムノバインダーは、溶解性および安定性などの優れた機能特性を示す。   Accordingly, in another aspect, the present invention grafts rabbit and other non-human CDRs into the soluble and stable light and / or heavy chain human antibody framework sequences disclosed herein, Thereby, a method for producing humanized antibodies with superior biophysical properties is provided. In particular, the immunobinder produced by the method of the present invention exhibits excellent functional properties such as solubility and stability.

高度に可溶性および安定性のあるヒト抗体フレームワーク中に、ウサギモノクローナル抗体由来の抗原結合部位をグラフトさせるためにここで使用されるＣＤＲ Ｈ１の定義を示す。The definition of CDR H1 used here to graft antigen binding sites from rabbit monoclonal antibodies into a highly soluble and stable human antibody framework is shown. Ｋａｂａｔデータベースから抽出されたウサギ抗体配列の分析は、ＣＤＲ３の可変重鎖が、典型的には、マウスの対応物より３個のアミノ酸分長いことを確定する。Analysis of rabbit antibody sequences extracted from the Kabat database determines that the CDR3 variable heavy chain is typically three amino acids longer than the mouse counterpart.

定義
本発明がより容易に理解され得ることを目的として、特定の用語を以下の通りに定義する。さらなる定義は、この詳細な説明全体にわたって記載される。 Definitions In order that the present invention may be more readily understood, certain terms are defined as follows. Additional definitions are set forth throughout this detailed description.

「「抗体」という用語は、完全な抗体および任意の抗原結合フラグメントを指す。「抗原結合ポリペプチド」および「イムノバインダー」という用語は、本明細書で同時に使用される。「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互接続されている少なくとも２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖を含み、場合によりグリコシル化されているタンパク質またはその抗原結合部分を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略記される）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、すなわちＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略記される）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、すなわちＣＬを含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域と、超可変領域が散在する、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域とにさらに細区画できる。各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成され、以下の順序、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で、アミノ末端からカルボキシ末端へ配置されている。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有している。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃｌｑ）を含めた、宿主組織または因子へのイムノグロブリンの結合を媒介し得る。 The term “antibody” refers to intact antibodies and any antigen binding fragment. The terms “antigen-binding polypeptide” and “immunobinder” are used simultaneously herein. “Antibody” refers to a protein or antigen-binding portion thereof comprising at least two heavy (H) chains and two light (L) chains interconnected by disulfide bonds, optionally glycosylated. Each heavy chain includes a heavy chain variable region (abbreviated herein as V H ) and a heavy chain constant region. The heavy chain constant region includes three domains, CH1, CH2 and CH3. Each light chain includes a light chain variable region (abbreviated herein as VL ) and a light chain constant region. The light chain constant region includes one domain, CL. The V H and V L regions can be further subdivided into hypervariable regions called complementarity determining regions (CDRs) and more conserved regions called framework regions (FR) interspersed with hypervariable regions. Each V H and V L is composed of 3 CDRs and 4 FRs, arranged from the amino terminus to the carboxy terminus in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. The variable region of the heavy and light chains contains a binding domain that interacts with an antigen. The constant region of the antibody may mediate immunoglobulin binding to host tissues or factors, including various cells of the immune system (eg, effector cells) and the first component of the classical complement system (Clq).

抗体の「抗原結合部分」（または、単純に「抗体部分」）という用語は、抗原（例えば、ＴＮＦ）に特異的に結合する能力を保持する、抗体の１つ以上のフラグメントを指す。抗体の抗原結合機能は完全長抗体のフラグメントによって行われ得ることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合フラグメントの例には、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる１価フラグメントであるＦａｂフラグメント、（ｉｉ）ヒンジ領域のジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む２価フラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント、（ｉｖ）抗体の単腕のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）１つのＶＨドメインからなる、単一ドメインすなわちｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６）、ならびに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、または（ｖｉｉ）合成リンカーによって場合により連結されていてもよい２つ以上の単離されたＣＤＲの組合せが挙げられる。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、すなわちＶＬおよびＶＨは、別々の遺伝子によってコードされるが、それらは、それらを単一タンパク質鎖として作るのを可能にする合成リンカーによる組換え方法を用いて連結でき、この単一タンパク質鎖では、ＶＬおよびＶＨ領域が対をなして一価の分子（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知、例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６、およびＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９−５８８３を参照）を形成する。そのような単一鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含されるものとする。これらの抗体フラグメントは、当業者に公知の従来の技法を用いて得られ、インタクトな抗体と同じ様式において有用性を求めてスクリーニングされる。抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技法によって産生されたものでも、インタクトなイムノグロブリンの酵素的または化学的切断によって産生されたものでもよい。抗体は、異なったアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭ抗体のものであり得る。 The term “antigen-binding portion” (or simply “antibody portion”) of an antibody refers to one or more fragments of an antibody that retain the ability to specifically bind to an antigen (eg, TNF). It has been shown that the antigen-binding function of an antibody can be performed by fragments of a full-length antibody. Examples of binding fragments encompassed by the term “antigen-binding portion” of an antibody include: (i) a Fab fragment that is a monovalent fragment consisting of V L , V H , CL and CH1 domains; (ii) a disulfide in the hinge region F (ab ′) 2 fragment, which is a bivalent fragment comprising two Fab fragments linked by cross-linking, (iii) Fd fragment consisting of V H and CH1 domains, (iv) single arm VL and V H of the antibody Fv fragment consisting of a domain, (v) a single domain or dAb fragment consisting of one VH domain (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), and (vi) isolated complementarity By a decision region (CDR), or (vii) a synthetic linker More combinations of linked 2 may be one or more isolated CDR, and the like. In addition, the two domains of the Fv fragment, namely VL and VH , are encoded by separate genes, but they use a recombinant linker-based recombination method that allows them to be made as a single protein chain. In this single protein chain, the VL and VH regions are paired and known as a monovalent molecule (single chain Fv (scFv), see, for example, Bird et al. (1988) Science 242: 423. 426, and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). Such single chain antibodies are also intended to be encompassed within the term “antigen-binding portion” of an antibody. These antibody fragments are obtained using conventional techniques known to those skilled in the art and are screened for utility in the same manner as intact antibodies. The antigen binding portion may be produced by recombinant DNA techniques or may be produced by enzymatic or chemical cleavage of intact immunoglobulins. The antibody can be of a different isotype, eg, an IgG (eg, IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 subtype), IgA1, IgA2, IgD, IgE or IgM antibody.

「イムノバインダー」という用語は、イムノバインダーは、標的抗原を特異的に認識するように、抗体の抗原結合部位の全部または一部、例えば、重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインの全部または一部を含有する分子を指す。イムノバインダーの非限定的な例として、完全長のイムノグロブリン分子およびｓｃＦｖ、さらに、これらに限定されないが、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、すなわち、ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメインおよびＣＨ１ドメインからなる一価のフラグメント、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、すなわち、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結されている２つのＦａｂフラグメントを含む二価のフラグメント、（ｉｉｉ）本質的には、ヒンジ領域の一部を有するＦａｂであるＦａｂ’フラグメント（ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（Ｐａｕｌ ｅｄ．，３ｒｄ ｅｄ．１９９３）を参照されたい）、（ｉｖ）ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント、（ｖ）抗体の単腕のＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖｉ）ＶＨドメインまたはＶＬドメインからなるＤａｂフラグメント（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６）、ラクダ抗体（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６３：４４６−４４８（１９９３）、およびＤｕｍｏｕｌｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ１１：５００−５１５（２００２）を参照されたい）、またはサメ抗体（例えば、サメＩｇ−ＮＡＲ Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標））等の単一ドメイン抗体、ならびに（ｖｉｉ）単一の可変ドメインを含有する重鎖可変領域および２つの定常ドメインであるナノボディを含めた、抗体フラグメントが挙げられる。 The term “immunobinder” refers to all or part of an antigen binding site of an antibody, such as all or part of a heavy chain variable domain and / or light chain variable domain, such that the immunobinder specifically recognizes the target antigen. Refers to a molecule that contains a portion. Non-limiting examples of immunobinders include, but are not limited to, full-length immunoglobulin molecules and scFv, including (i) Fab fragments: VL domain, VH domain, CL domain and CHI A monovalent fragment consisting of a domain, (ii) an F (ab ′) 2 fragment, ie a divalent fragment comprising two Fab fragments linked by a disulfide bridge in the hinge region, (iii) essentially Fab ′ fragment, which is a Fab with part of the hinge region (see FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul ed., 3 rd ed. 1993)), (iv) Fd fragment consisting of V H domain and C H 1 domain, v) Single arm VL of antibody Fv fragment consisting of main and V H domain, (vi) Dab fragment consisting of V H domain or VL domain (Ward et al., (1989) Nature 341 : 544-546), camel antibody (Hamers-Casterman, et al , Nature 363: 446-448 (1993) and Dumoulin, et al., Protein Science 11: 500-515 (2002)), or shark antibodies (eg, shark Ig-NAR Nanobodies®). Antibody fragments, including single domain antibodies such as (vii) heavy chain variable regions containing a single variable domain and Nanobodies that are two constant domains.

「単鎖抗体」、「単鎖Ｆｖ」、または「ｓｃＦｖ」という用語は、リンカーによって連結されている抗体重鎖可変ドメイン（または領域、ＶＨ）および抗体軽鎖可変ドメイン（または領域、ＶＬ）を含む分子を指す。かかるｓｃＦｖ分子は、一般構造、ＮＨ２−ＶＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＯＯＨまたはＮＨ２−ＶＨ−リンカー−ＶＬ−ＣＯＯＨを有することができる。現況技術における好適なリンカーは、反復ＧＧＧＧＳアミノ酸配列またはその改変体からなる。本発明の好ましい実施形態において、配列番号８に記載のアミノ酸配列の（ＧＧＧＧＳ）４リンカーが使用されるが、１〜３反復の改変体も可能である（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８）。本発明に使用できる他のリンカーは、Ａｌｆｔｈａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８：７２５−７３１、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：９４−１０６、Ｈｕ ｅｔ ａｌ．（１９９６），Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：３０５５−３０６１、Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．（１９９９），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：４１−５６、およびＲｏｏｖｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．によって記載されている。 The terms “single chain antibody”, “single chain Fv”, or “scFv” refer to an antibody heavy chain variable domain (or region, V H ) and an antibody light chain variable domain (or region, V L ) linked by a linker. ). Such scFv molecules, the general structure, NH 2 -V L - linker -V H -COOH or NH 2 -V H - may have a linker -V L -COOH. A suitable linker in the state of the art consists of a repetitive GGGGS amino acid sequence or a variant thereof. In a preferred embodiment of the present invention, a (GGGGGS) 4 linker of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8 is used, although modifications of 1 to 3 repeats are possible (Holliger et al. (1993), Proc. Natl.Acad.Sci.USA 90: 6444-6448). Other linkers that can be used in the present invention are described in Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8: 725-731, Choi et al. (2001), Eur. J. et al. Immunol. 31: 94-106, Hu et al. (1996), Cancer Res. 56: 3055-3061, Kipriyanov et al. (1999), J. et al. Mol. Biol. 293: 41-56, and Rovers et al. (2001), Cancer Immunol. It is described by.

本明細書で使用する場合、「機能特性」という用語は、例えば、ポリペプチドの製造上の特性または治療有効性を改善するために、当業者にとって、（例えば、従来のポリペプチドと比べた）改善が望ましくかつ／または好都合であるポリペプチド（例えば、イムノバインダー）の特性である。１つの実施形態において、機能特性は、安定性（例えば、熱安定性）である。別の実施形態において、機能特性は、（例えば、細胞性条件下における）溶解性である。さらに別の実施形態において、機能特性は、凝集挙動である。さらに別の実施形態において、機能特性は、（例えば、原核生物細胞中における）タンパク質発現である。さらに別の実施形態において、機能特性は、製造プロセスにおける封入体の可溶化後のリフォールディング挙動である。特定の実施形態において、機能特性は抗原結合親和性の改善ではない。別の好ましい実施形態において、１つ以上の機能特性の改善はイムノバインダーの結合親和性に実質的な影響を与えない。   As used herein, the term “functional property” is used by those of ordinary skill in the art, for example, to improve the manufacturing properties or therapeutic effectiveness of a polypeptide (eg, compared to a conventional polypeptide). A property of a polypeptide (eg, immunobinder) for which improvement is desirable and / or advantageous. In one embodiment, the functional property is stability (eg, thermal stability). In another embodiment, the functional property is solubility (eg, under cellular conditions). In yet another embodiment, the functional property is agglomeration behavior. In yet another embodiment, the functional property is protein expression (eg, in prokaryotic cells). In yet another embodiment, the functional property is refolding behavior after solubilization of inclusion bodies in the manufacturing process. In certain embodiments, the functional property is not an improvement in antigen binding affinity. In another preferred embodiment, the improvement of one or more functional properties does not substantially affect the binding affinity of the immunobinder.

「ＣＤＲ」という用語は、抗原の結合に主に寄与する抗体の可変ドメイン内の６つの超可変領域の１つを意味する。６つのＣＤＲに対して最も一般的に用いられる定義の１つは、Ｋａｂａｔ Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ．ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１−３２４２）によって提供されたものである。本明細書で用いられるように、ＣＤＲのＫａｂａｔの定義は、軽鎖可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３（ＣＤＲ Ｌ１、ＣＤＲ Ｌ２、ＣＤＲ Ｌ３、またはＬ１、Ｌ２、Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメインのＣＤＲ２およびＣＤＲ３（ＣＤＲ Ｈ２、ＣＤＲ Ｈ３、またはＨ２、Ｈ３）に対してのみあてはまる。しかし、本明細書で用いられる場合、重鎖可変ドメインのＣＤＲ１（ＣＤＲ Ｈ１またはＨ１）は、位置２６で始まり位置３６の前で終了する残基の位置（Ｋａｂａｔナンバリング）よって定義される。これは、基本的には、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｉａにより異なって定義されるＣＤＲ Ｈ１の融合物である（説明のために図１も参照されたい）。   The term “CDR” refers to one of the six hypervariable regions within the variable domain of an antibody that primarily contribute to antigen binding. One of the most commonly used definitions for the six CDRs is Kabat E.I. A. et al. (1991) Sequences of proteins of immunological interest. NIH Publication 91-3242). As used herein, CDR Kabat definition includes CDR1, CDR2, and CDR3 (CDR L1, CDR L2, CDR L3, or L1, L2, L3) of light chain variable domains and heavy chain variable domains. Only applies to CDR2 and CDR3 (CDR H2, CDR H3, or H2, H3). However, as used herein, the heavy chain variable domain CDR1 (CDR H1 or H1) is defined by the position of the residue beginning at position 26 and ending before position 36 (Kabat numbering). This is basically a fusion of CDR H1 defined differently by Kabat and Chotia (see also FIG. 1 for illustration).

本明細書で用いられる「抗体フレームワーク」という用語は、可変ドメインの抗原結合性ループ（ＣＤＲ）に対する骨格として働く、ＶＬまたはＶＨいずれかの可変ドメインの部分を意味する。本質的に、これはＣＤＲのない可変ドメインである。   As used herein, the term “antibody framework” means the portion of the variable domain of either VL or VH that serves as the backbone for the antigen-binding loop (CDR) of the variable domain. In essence, this is a variable domain without CDRs.

「エピトープ」または「抗原決定基」という用語は、イムノグロブリンまたは抗体が特異的に結合する抗原上の部位を指す（例えば、ＴＮＦ分子上の特定部位）。エピトープは通常、特有の空間的コンフォメーションにある少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個の連続または非連続のアミノ酸を含んでいる。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６，Ｇ．Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅｄ．（１９９６）を参照。   The term “epitope” or “antigenic determinant” refers to a site on an antigen to which an immunoglobulin or antibody specifically binds (eg, a specific site on a TNF molecule). Epitopes usually contain at least 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 or 15 consecutive or non-contiguous amino acids in a unique spatial conformation . For example, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G.M. E. Morris, Ed. (1996).

「特異的な結合」、「選択的結合」、「選択的に結合する」および「特異的に結合する」という用語は、所定の抗原のエピトープへの抗体結合を指す。通常、抗体は、約１０−８Ｍ未満、約１０−９Ｍ未満もしくは約１０−１０Ｍ未満またはさらに低い値などの、約１０−７Ｍ未満の親和性（ＫＤ）で結合する。「ＫＤ」または「Ｋｄ」という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の解離平衡定数を指す。通常、本発明の抗体は、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ装置の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を用いて決定した場合、約１０−８Ｍ未満、約１０−９Ｍ未満もしくは約１０−１０Ｍ未満またはさらに低い値などの、約１０−７Ｍ未満の解離平衡定数（ＫＤ）でＴＮＦに結合する。 The terms “specific binding”, “selective binding”, “selectively bind” and “specifically bind” refer to antibody binding to an epitope of a given antigen. Usually, the antibody binds with an affinity (K D ) of less than about 10 −7 M, such as less than about 10 −8 M, less than about 10 −9 M, or less than about 10 −10 M or even lower values. The term “K D ” or “Kd” refers to the dissociation equilibrium constant of a particular antibody-antigen interaction. Typically, antibodies of the invention are less than about 10 −8 M, less than about 10 −9 M, or less than about 10 −10 M or even lower, as determined using, for example, the surface plasmon resonance (SPR) technique of the BIACORE instrument It binds to TNF with a dissociation equilibrium constant (K D ) of less than about 10 −7 M, such as value.

「核酸分子」という用語は、本明細書で使用される場合、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を指す。核酸分子は、１本鎖でも、２本鎖でもよいが、２本鎖ＤＮＡであることが好ましい。核酸は、それが別の核酸配列と機能的関係に置かれている場合に、「作動可能に連結されている」。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、それがコード配列の転写に影響を与える場合に、その配列に作動可能に連結している。   The term “nucleic acid molecule” as used herein refers to DNA and RNA molecules. The nucleic acid molecule may be single-stranded or double-stranded, but preferably is double-stranded DNA. A nucleic acid is “operably linked” when it is placed into a functional relationship with another nucleic acid sequence. For example, a promoter or enhancer is operably linked to a sequence if it affects the transcription of the coding sequence.

「ベクター」という用語は、連結されている別の核酸を輸送できる核酸分子を指す。一実施形態において、ベクターは「プラスミド」であり、これは、追加のＤＮＡセグメントが結紮され得る環状２本鎖ＤＮＡループを指す。別の実施形態において、ベクターはウイルスベクターであり、この場合、追加のＤＮＡセグメントはウイルスゲノム中に結紮され得る。本明細書で開示されるベクターは、それらが導入される宿主細胞における自律複製が可能であり得るか（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソームの哺乳動物ベクター）、または宿主細胞への導入の際に、宿主細胞のゲノムに組み込まれ得るので、宿主ゲノムと共に複製される（例えば、非エピソームの哺乳動物ベクター）。   The term “vector” refers to a nucleic acid molecule capable of transporting another nucleic acid to which it has been linked. In one embodiment, the vector is a “plasmid”, which refers to a circular double stranded DNA loop into which additional DNA segments can be ligated. In another embodiment, the vector is a viral vector, in which case additional DNA segments can be ligated into the viral genome. The vectors disclosed herein may be capable of autonomous replication in a host cell into which they are introduced (eg, bacterial vectors having a bacterial origin of replication and episomal mammalian vectors) or into host cells. Upon introduction, it can be integrated into the genome of the host cell so that it is replicated with the host genome (eg, a non-episomal mammalian vector).

用語「宿主細胞」は、発現ベクターが導入された細胞を指す。宿主細胞は、細菌、微生物、植物、または動物細胞、好ましくは、大腸菌、枯草菌、出芽酵母、ピキアパストリス、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣系統）、またはＮＳ０細胞を含む。   The term “host cell” refers to a cell into which an expression vector has been introduced. Host cells include bacterial, microbial, plant or animal cells, preferably E. coli, Bacillus subtilis, budding yeast, Pichia pastoris, CHO (Chinese hamster ovary strain), or NS0 cells.

「ウサギ目動物（ｌａｇｏｍｏｒｐｈ）」という用語は、分類学上のウサギ目（Ｌａｇｏｍｏｒｐｈａ）のメンバーを指し、ウサギ科（Ｌｅｐｏｒｉｄａｅ）（例えば、ノウサギ（ｈａｒｅ）およびウサギ（ｒａｂｂｉｔ））およびナキウサギ科（Ｏｃｈｏｔｏｎｉｄａｅ）を含む。最も好ましい実施形態において、ウサギ目動物はウサギである。「ウサギ」という用語は、本明細書で使用される場合、ウサギ科に属する動物を指す。   The term “lagomorph” refers to members of the taxonomic Lagomorpha, such as Leporidae (eg, hare and rabbit) and Ochotonidae. including. In the most preferred embodiment, the order Rabbit is a rabbit. The term “rabbit” as used herein refers to an animal belonging to the family Rabbit.

本明細書で用いられる「同一性」は、２つのポリペプチド間、分子間、または２つの核酸間でマッチする配列を意味する。比較された２つの配列の両方におけるある位置が同じ塩基、または同じアミノ酸モノマーサブユニットによって占められている場合（例えば、各々の２つのポリペプチドにおけるある位置がリジンによって占められている場合）、それぞれの分子はその位置で同一である。２つの配列間の「同一性パーセント」は、それら２つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れた、それらの配列によって共有される同一の位置の数の関数である。一般的に、２つの配列を、最大の同一性をもたらすようにアライメントさせた場合に比較が行われる。かかるアラインメントは、例えば、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、ならびにギャップウェイト１６、１４、１２、１０、８、６、または４およびレングスウェイト１、２、３、４、５、または６を用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージにおいてＧＡＰプログラム中に組み入れられた、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４−４５３（１９７０））のアルゴリズムの方法を用いて提供され得る。   As used herein, “identity” means a sequence that matches between two polypeptides, molecules, or two nucleic acids. If a position in both of the two sequences compared is occupied by the same base or the same amino acid monomer subunit (eg, if a position in each of the two polypeptides is occupied by lysine), respectively Are identical at that position. The “percent identity” between two sequences is shared by those sequences, taking into account the number of gaps that need to be introduced for optimal alignment of the two sequences and the length of each gap It is a function of the number of identical positions. In general, a comparison is made when two sequences are aligned to give the greatest identity. Such an alignment is, for example, using either a Blossum 62 matrix or a PAM 250 matrix, and gap weights 16, 14, 12, 10, 8, 6, or 4 and length weights 1, 2, 3, 4, 5, or 6. Can be provided using the methods of the algorithm of Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970)), incorporated in the GAP program in the GCG software package.

別段に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載の方法および物質に類似または同等の方法および物質を本発明の実施または試行に用いることができるが、好適な方法および物質は下記に記載のものである。相反する場合には、定義を含めた本明細書が優先される。加えて、物質、方法、および実施例は、例示にすぎず、限定することを意図しない。   Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. Although methods and materials similar or equivalent to those described herein can be used in the practice or testing of the present invention, suitable methods and materials are those described below. In case of conflict, the present specification, including definitions, will control. In addition, the materials, methods, and examples are illustrative only and not intended to be limiting.

本発明の様々な態様を、以下のサブセクションにおいてさらに詳しく記載する。様々な実施形態、選択、および範囲を任意に組み合わせることができることが理解される。さらに、特定の実施形態によっては、選択された定義、実施形態、または範囲を適用しなくてもよい。   Various aspects of the invention are described in further detail in the following subsections. It is understood that various embodiments, selections, and ranges can be arbitrarily combined. Further, in certain embodiments, selected definitions, embodiments, or ranges may not apply.

別段の言及がない場合、アミノ酸位置はＡＨｏナンバリングスキームに従って示される。ＡＨｏナンバリングシステムは、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ，Ａ．ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．（２００１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０９：６５７−６７０）にさらに記載されている。代替的には、Ｋａｂａｔら（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２）に、より詳細に記載されたＫａｂａｔナンバリングシステムを使用できる。抗体重鎖および軽鎖可変領域内のアミノ酸残基位置を同定するのに使用される２通りの異なったナンバリングシステムの変換表が、Ａ．Ｈｏｎｅｇｇｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０９（２００１）６５７−６７０に提供されている。 Unless otherwise noted, amino acid positions are indicated according to the AHo numbering scheme. The AHo numbering system is described by Honegger, A .; and Pluckthun, A .; (2001) J. Org. Mol. Biol. 309 : 657-670). Alternatively, Kabat et al. (Kabat, EA, et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human 24. The Kabat numbering system described in more detail can be used. A conversion table of two different numbering systems used to identify amino acid residue positions within antibody heavy and light chain variable regions is shown in A.C. Honegger, J .; Mol. Biol. 309 (2001) 657-670.

第１の態様において、本発明は、ウサギ目動物種、例えば、ウサギからのＣＤＲのグラフトのためのヒトアクセプターフレームワーク配列を提供する。ヒト単一鎖ＶＨフレームワークａ５８（配列番号１）は、驚くべきことに、本質的にウサギ抗体の抗原結合部位に高度に適合することが見出された。したがって、ａ５８ＶＨは、ウサギループのグラフトに由来する安定したヒト化ｓｃＦｖ抗体フラグメントを構築するために好適な骨格を表す。   In a first aspect, the present invention provides a human acceptor framework sequence for grafting CDRs from Rabbit species, such as rabbits. The human single chain VH framework a58 (SEQ ID NO: 1) was surprisingly found to be highly compatible with the antigen binding site of a rabbit antibody in essence. Thus, a58VH represents a suitable scaffold for constructing stable humanized scFv antibody fragments derived from rabbit loop grafts.

したがって、一態様において、本発明は、配列番号１に対して少なくとも７０％の同一性を有するＶＨ配列を含むイムノバインダーアクセプターフレームワークを提供する。   Thus, in one aspect, the invention provides an immunobinder acceptor framework comprising a VH sequence having at least 70% identity to SEQ ID NO: 1.

該配列は、任意の他の好適な可変軽鎖と組み合わされ得る。好ましい可変軽鎖は、配列番号２であり、これはＷＯ０３／０９７６９７にも開示され、ＷＯ０３／０９７６９７で開示される通り、ＫＩ２７、または任意の他のＶＬ配列に指定された。   The sequence can be combined with any other suitable variable light chain. A preferred variable light chain is SEQ ID NO: 2, which is also disclosed in WO 03/097697, designated KI27, or any other VL sequence, as disclosed in WO 03/097697.

好ましい実施形態において、可変重鎖フレームワークは、リンカーを介して可変軽鎖フレームワークに結合される。リンカーは、任意に好適なリンカー、例えば、１〜４反復の配列ＧＧＧＧＳ（配列番号：５）、好ましくは、（ＧＧＧＧＳ）４ペプチド（配列番号：４）を含むリンカー、またはＡｌｆｔｈａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８：７２５−７３１で開示されるようなリンカーであり得る。 In a preferred embodiment, the variable heavy chain framework is linked to the variable light chain framework via a linker. The linker can be any suitable linker, for example, a linker comprising the sequence GGGGS (SEQ ID NO: 5), preferably (GGGGGS) 4 peptide (SEQ ID NO: 4), or Alfthan et al. (1995) Protein Eng. 8: 725-731 can be a linker as disclosed.

その結果、本発明は、
（ｉ）配列番号１に対して少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、より好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する可変重鎖フレームワークと、及び／または
（ｉｉ）配列番号２に対して少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、より好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する可変軽鎖フレームワークと、を含むイムノバインダーアクセプターフレームワークを提供する。 As a result, the present invention
(I) a variable heavy chain framework having at least 70% identity to SEQ ID NO: 1, preferably at least 75%, 80%, 85%, 90%, more preferably at least 95% identity; and (Ii) a variable light chain framework having at least 70% identity to SEQ ID NO: 2, preferably at least 75%, 80%, 85%, 90%, more preferably at least 95% identity An immunobinder acceptor framework is provided.

より好ましい実施形態において、本発明は、配列番号３に対して少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％の同一性を伴う配列を有するイムノバインダーを提供する。   In a more preferred embodiment, the invention relates to a sequence with at least 60%, more preferably at least 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% identity to SEQ ID NO: 3 An immunobinder having the following formula is provided.

フレームワークは、実質的にはいかなるウサギＣＤＲにも適合する。異なるウサギＣＤＲを含むことによって、よく表され、ウサギ野生型単一鎖に反して良好に生じ、元々のドナーウサギ抗体の親和性を依然としてほぼ完全に保持する。   The framework is compatible with virtually any rabbit CDR. By including different rabbit CDRs, it is well expressed and occurs well against the rabbit wild-type single chain, and still retains almost completely the affinity of the original donor rabbit antibody.

本明細書に記載のイムノバインダーアクセプターフレームワークは、重鎖フレームワーク、好ましくは位置１２、１０３、および１４４（ＡＨｏナンバリング）に、溶解性を促進する置換を含み得る。好ましくは、疎水性アミノ酸は、より親水性のアミノ酸によって置換される。親水性アミノ酸とは、例えば、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、セリン（Ｓ）およびスレオニン（Ｔ）である。より好ましくは、重鎖フレームワークは、（ａ）位置１２のセリン（Ｓ）、（ｂ）位置１０３のセリン（Ｓ）もしくはスレオニン（Ｔ）、及び／または（ｃ）位置１４４のセリン（Ｓ）もしくはスレオニン（Ｔ）を含む。   The immunobinder acceptor framework described herein may include substitutions that promote solubility in the heavy chain framework, preferably positions 12, 103, and 144 (AHo numbering). Preferably, the hydrophobic amino acid is replaced by a more hydrophilic amino acid. Examples of hydrophilic amino acids include arginine (R), asparagine (N), aspartic acid (D), glutamine (Q), glycine (G), histidine (H), lysine (K), serine (S) and threonine. (T). More preferably, the heavy chain framework is (a) serine (S) at position 12, (b) serine (S) or threonine (T) at position 103, and / or (c) serine (S) at position 144. Alternatively, it contains threonine (T).

さらに、可変軽鎖フレームワークの位置１、３、４、１０、４７、５７、９１、および１０３（ＡＨｏナンバリング）のうちの１つ以上に安定性増強アミノ酸が存在してもよい。可変軽鎖フレームワークは、位置１のグルタミン酸（Ｅ）、位置３のバリン（Ｖ）、位置４のロイシン（Ｌ）、位置１０のセリン（Ｓ）、位置４７のアルギニン（Ｒ）、位置５７のセリン（Ｓ）、位置９１のフェニルアラニン（Ｆ）及び／または位置１０３のバリン（Ｖ）を含むことが、より好ましい。   In addition, there may be a stability enhancing amino acid at one or more of positions 1, 3, 4, 10, 47, 57, 91, and 103 (AHo numbering) of the variable light chain framework. The variable light chain framework consists of glutamic acid at position 1 (E), valine at position 3 (V), leucine at position 4 (L), serine at position 10 (S), arginine at position 47 (R), position 57 More preferably, it comprises serine (S), phenylalanine (F) at position 91 and / or valine (V) at position 103.

グルタミン（Ｑ）は脱アミノ化（ｄｅｓａｍｉｎａｔｉｏｎ）の傾向があるので、別の好ましい実施形態において、ＶＨが位置１４１にグリシン（Ｇ）を含む。この置換はタンパク質の長期保存を改善し得る。   In another preferred embodiment, VH contains glycine (G) at position 141 because glutamine (Q) is prone to deamination. This substitution can improve long-term storage of the protein.

例えば、本明細書に開示のアクセプターフレームワークは、非ヒトＣＤＲが由来する非ヒト抗体の結合特性を保持するヒトまたはヒト化抗体を生成するのに使用できる。したがって、好ましい実施形態において、本発明は、ドナーイムノバインダー、好ましくは哺乳動物イムノバインダー、より好ましくはウサギ目動物イムノバインダー、最も好ましくはウサギからの重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、及び／または軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３をさらに含む、本明細書に開示のイムノバインダーアクセプターフレームワークを包含する。したがって、一実施形態において、本発明は、
（ｉ）ウサギ目動物の可変軽鎖ＣＤＲと、
（ｉｉ）配列番号１に対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、および最も好ましくは１００％の同一性を有するヒト可変重鎖フレームワークと、を含む、所望の抗原に特異的であるイムノバインダーを提供する。 For example, the acceptor frameworks disclosed herein can be used to generate human or humanized antibodies that retain the binding properties of non-human antibodies from which non-human CDRs are derived. Thus, in a preferred embodiment, the invention relates to a donor immunobinder, preferably a mammalian immunobinder, more preferably a rabbit eye animal binder, most preferably a heavy chain CDR1, CDR2 and CDR3, and / or light chain from a rabbit. The immunobinder acceptor framework disclosed herein further comprises CDR1, CDR2, and CDR3. Thus, in one embodiment, the present invention provides
(I) a variable light chain CDR of a rabbit eye,
(Ii) a human variable heavy chain framework having at least 70%, preferably at least 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, and most preferably 100% identity to SEQ ID NO: 1; An immunobinder that is specific for the desired antigen is provided.

好ましくは、ウサギ目動物はウサギである。より好ましくは、イムノバインダーは、ドナーイムノバインダーからの重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。   Preferably, the rabbit eye animal is a rabbit. More preferably, the immunobinder comprises heavy chain CDR1, CDR2, and CDR3 from the donor immunobinder and light chain CDR1, CDR2, and CDR3.

当該技術分野で公知の通り、多くのウサギＶＨ鎖が、マウスおよびヒトの対応物と比較して、追加の対システインを有する。ｃｙｓ２２とｃｙｓ９２との間で形成される保存されたジスルフィド架橋に加えて、ｃｙｓ２１−ｃｙｓ７９架橋もあり、さらに、いくつかのウサギの鎖では、ＣＤＲＨ１の最後の残基とＣＤＲＨ２の最初の残基との間で形成されるＣＤＲ間Ｓ−Ｓ架橋もある。さらに、ＣＤＲ−Ｌ３において、対システイン残基がしばしば見出される。さらに、多くのウサギ抗体ＣＤＲは、以前から公知のいかなる標準構造にも属さない。特に、ＣＤＲ−Ｌ３は、ヒトまたはマウスの対応物であるＣＤＲ−Ｌ３よりもはるかに長いことが多い。   As is known in the art, many rabbit VH chains have an additional counter cysteine compared to their mouse and human counterparts. In addition to the conserved disulfide bridge formed between cys22 and cys92, there is also a cys21-cys79 bridge, and in some rabbit chains, the last residue of CDRH1 and the first residue of CDRH2 There are also S—S bridges between the CDRs formed between them. Furthermore, cysteine residues are often found in CDR-L3. Furthermore, many rabbit antibody CDRs do not belong to any previously known standard structure. In particular, CDR-L3 is often much longer than its human or mouse counterpart, CDR-L3.

上述の通り、本明細書に開示のフレームワークへの非ヒトＣＤＲのグラフトは、該ＣＤＲが適切なコンフォメーションで現れる分子を産する。必要な場合、イムノバインダーの親和性は、非ヒトドナーイムノバインダーの抗原相互作用フレームワーク残基をグラフトさせることによって改善され得る。これらの位置は、例えば、
（ｉ）それぞれの生殖細胞系前駆体配列を同定すること、または代替的には、高い相同性のフレームワーク配列の場合にはコンセンサス配列を用いることと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の生殖細胞系前駆体配列またはコンセンサス配列とドナー可変ドメイン配列との配列アラインメントを生成することと、
（ｉｉｉ）相違している残基を同定することと、によって同定され得る。 As described above, grafting of non-human CDRs onto the framework disclosed herein yields molecules in which the CDRs appear in the proper conformation. If necessary, the affinity of the immunobinder can be improved by grafting antigen interacting framework residues of the non-human donor immunobinder. These positions are, for example,
(I) identifying each germline precursor sequence, or alternatively using a consensus sequence in the case of highly homologous framework sequences;
(Ii) generating a sequence alignment of the germline precursor sequence or consensus sequence of step (i) with the donor variable domain sequence;
(Iii) identifying the different residues.

分子の表面上の相違している残基は、多くの場合、おそらく抗原への親和性を生成するために、インビボにおける親和性生成プロセス中に変異させられた。   Different residues on the surface of the molecule were often mutated during the in vivo affinity generation process, presumably to generate affinity for the antigen.

別の態様において、本発明は、本明細書に記載のイムノバインダーアクセプターフレームワークを含むイムノバインダーを提供する。例えば、前記イムノバインダーは、ｓｃＦｖ抗体、完全長イムノグロブリン、Ｆａｂフラグメント、Ｄａｂまたはナノボディーであり得る。   In another aspect, the present invention provides an immunobinder comprising an immunobinder acceptor framework as described herein. For example, the immunobinder can be a scFv antibody, full length immunoglobulin, Fab fragment, Dab or nanobody.

好ましい実施形態において、イムノバインダーは、１つ以上の分子、例えば、細胞毒性剤、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子もしくは他のシグナル伝達分子などの治療剤、造影剤、または転写活性化因子もしくはＤＮＡ結合ドメインなどの第２のタンパク質に結合している。   In preferred embodiments, the immunobinder is one or more molecules, for example, therapeutic agents such as cytotoxic agents, cytokines, chemokines, growth factors or other signaling molecules, contrast agents, or transcriptional activators or DNA binding domains. Is bound to a second protein such as

本明細書に開示のイムノバインダーは、例えば、診断適用、治療適用、標的評価または遺伝子療法で使用できる。   The immunobinders disclosed herein can be used, for example, in diagnostic applications, therapeutic applications, target evaluation or gene therapy.

本発明は、本明細書に開示のイムノバインダーアクセプターフレームワークまたは本明細書に開示のイムノバインダー（複数可）をコードする単離された核酸をさらに提供する。   The present invention further provides an isolated nucleic acid encoding the immunobinder acceptor framework disclosed herein or the immunobinder (s) disclosed herein.

別の実施形態において、本明細書に開示の核酸を含むベクターを提供する。   In another embodiment, a vector comprising a nucleic acid disclosed herein is provided.

本明細書に開示の核酸またはベクターは、例えば、遺伝子療法で用いることができる。   The nucleic acids or vectors disclosed herein can be used, for example, in gene therapy.

本発明は、本明細書に開示のベクター及び／または核酸を含む宿主細胞をさらに包含する。   The invention further encompasses host cells comprising the vectors and / or nucleic acids disclosed herein.

さらに、本明細書に開示のイムノバインダーアクセプターフレームワーク、本明細書に開示のイムノバインダー、本明細書に開示の単離された核酸または本明細書に開示のベクターを含む組成物を提供する。   Further provided is a composition comprising an immunobinder acceptor framework disclosed herein, an immunobinder disclosed herein, an isolated nucleic acid disclosed herein, or a vector disclosed herein. .

本明細書に開示の配列は、以下のものである（Ｘ残基はＣＤＲ挿入部位であり、少なくとも３個および最大５０個のアミノ酸を含む）。
配列番号１：可変重鎖フレームワークａ５８
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（Ｘ）ｎ＝３−５０ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳ（Ｘ）ｎ＝３−５０ＲＦＳＶＳＲＤＮＳＫＮＴＶＹＬＱＩＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＭ（Ｘ）ｎ＝３−５０ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号２：可変軽鎖フレームワークＫＩ２７
ＥＩＶＭＴＱＳＰＳＴＬＳＡＳＶＧＤＲＶＩＩＴＣ（Ｘ）ｎ＝３−５０ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（Ｘ）ｎ＝３−５０ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＡＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＴＹＹＣ（Ｘ）ｎ＝３−５０ＦＧＱＧＴＫＬＴＶＬＧ
配列番号３：フレームワーク配列
ＥＩＶＭＴＱＳＰＳＴＬＳＡＳＶＧＤＲＶＩＩＴＣ（Ｘ）ｎ＝３−５０ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（Ｘ）ｎ＝３−５０ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＡＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＴＹＹＣ（Ｘ）ｎ＝３−５０ＦＧＱＧＴＫＬＴＶＬＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（Ｘ）ｎ＝３−５０ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳ（Ｘ）ｎ＝３−５０ＲＦＳＶＳＲＤＮＳＫＮＴＶＹＬＱＩＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＭ（Ｘ）ｎ＝３−５０ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号４：リンカー
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ The sequences disclosed herein are as follows (the X residue is the CDR insertion site and contains at least 3 and up to 50 amino acids):
SEQ ID NO: 1: Variable heavy chain framework a58
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCCAAS (X) n = 3-50 WVRQAPGKGLEWVS (X) n = 3-50 RFSVSRDNSKNTVYLQINSLRRAEDTAVYYCAM (X) n = 3-50 WGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 2: Variable light chain framework KI27
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITC (X) n = 3-50 WYQQKPGKAPKLLIY (X) n = 3-50 GVPSRFSGGSGASFLTTISSLQPDDFATYYC (X) n = 3-50 FGQGTKLTVLG
SEQ ID NO: 3: framework sequences EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITC (X) n = 3-50 WYQQKPGKAPKLLIY (X) n = 3-50 GVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYC (X) n = 3-50 FGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (X) n = 3-50 WVRQAPGKGLEWVS (X) n = 3-50 RFSVSRDNSKNTVYLQINSLRRAEDTAVYYCAM (X) n = 3-50 WGQGTLVTVSS
Sequence number 4: Linker GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS

別の態様において、本発明は、安定的かつ可溶性の抗体フレームワークに非ヒトドナー抗体のＣＤＲをグラフトさせることによって非ヒト抗体をヒト化する方法を提供する。特に好ましい実施形態において、ウサギ抗体からのＣＤＲステムおよびフレームワークは上述のものである。   In another aspect, the invention provides a method of humanizing a non-human antibody by grafting the CDRs of the non-human donor antibody to a stable and soluble antibody framework. In particularly preferred embodiments, the CDR stem and framework from the rabbit antibody are as described above.

米国特許第５２２５５３９号でＷｉｎｔｅｒによって、ＷＯ９００７８６１Ａ１でＱｕｅｅｎらによって、ヒトアクセプターフレームワーク中にＣＤＲをグラフトさせる一般的方法が開示されており、それらの全体において、参照により本明細書に組み込まれる。ウサギモノクローナル抗体からのＣＤＲを、選択されたフレームワークにグラフトさせる一般戦略は、ＷｉｎｔｅｒらおよびＱｕｅｅｎらのものに関連するが、特定の主要な点で異なっている。特に、本発明の方法は、本明細書で開示されるヒト抗体フレームワークが、特にヒトまたは非ヒトドナー抗体のアクセプターとして好適であるという点で当該技術分野において公知の典型的なＷｉｎｔｅｒおよびＱｕｅｅｎ方法論とは異なる。したがって、ＷｉｎｔｅｒおよびＱｕｅｅｎの一般的方法とは異なり、本発明のヒト化方法に使用されるフレームワーク配列は、必ずしも、ドナーＣＤＲが由来する非ヒト（例えば、ウサギ）抗体の配列に最高の配列類似性を示すフレームワーク配列ではない。加えて、ＣＤＲコンフォメーションを支持するためにドナー配列からのフレームワーク残基グラフトは必要とされない。最大で、フレームワーク中に位置する抗原結合アミノ酸または体細胞超変異中に起きた他の変異が導入され得る。   General methods for grafting CDRs into human acceptor frameworks are disclosed by Winter in US Pat. No. 5,225,539 and by Queen et al. In WO 9007861A1, which are incorporated herein by reference in their entirety. The general strategy for grafting CDRs from rabbit monoclonal antibodies to selected frameworks is related to that of Winter et al. And Queen et al., But differs in certain major respects. In particular, the methods of the present invention include typical Winter and Queen methodologies known in the art in that the human antibody frameworks disclosed herein are particularly suitable as acceptors for human or non-human donor antibodies. Is different. Thus, unlike the general methods of Winter and Queen, the framework sequences used in the humanization method of the invention do not necessarily have the highest sequence similarity to the sequence of the non-human (eg, rabbit) antibody from which the donor CDRs are derived. It is not a framework array showing sex. In addition, framework residue grafting from the donor sequence is not required to support the CDR conformation. At most, antigen binding amino acids located in the framework or other mutations that occurred during somatic hypermutation can be introduced.

高い可溶性および安定性を有するヒト化されたウサギ由来抗体を生成するグラフト方法の特定の詳細を以下に記載する。   Specific details of the grafting method to produce humanized rabbit derived antibodies with high solubility and stability are described below.

本発明の方法の例示的実施形態において、ＣＤＲドナー抗体のアミノ酸配列が最初に同定され、該配列は、従来の配列アラインメントツール（例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−ＷｕｎｓｃｈアルゴリズムおよびＢｌｏｓｓｕｍマトリックス）を用いてアラインメントされる。ギャップの導入および残基位置の命名は、従来の抗体ナンバリングシステムを用いて行われ得る。例えば、イムノグロブリン可変ドメインについてＡＨｏナンバリングシステムを使用できる。Ｋａｂａｔナンバリングスキームは、抗体中の残基をナンバリングするのに最も広く採用されている標準法であるので、これも適用できる。Ｋａｂａｔナンバリングは、例えば、ＳＵＢＩＭプログラムを用いて割り当てることができる。このプログラムは、抗体配列の可変領域を分析し、Ｋａｂａｔらによって確立されたシステムに従って配列をナンバリングする（Ｄｅｒｅｔら、１９９５年）。フレームワーク領域およびＣＤＲ領域の定義は、通常、Ｋａｂａｔの定義に従って行われるが、これは配列可変性をベースにしたものであり、最も一般的に使用されている。しかし、ＣＤＲ−Ｈ１については、そのような指定は、好ましくは、Ｋａｂａｔの定義、３Ｄ複合体構造のサブセットの抗体と抗原との間の接触の分析によって生成された平均接触データ（ＭａｃＣａｌｌｕｍら、１９９６年）、および構造的ループ領域の位置に基づくＣｈｏｔｉａの定義の組合せである（図１も参照）。抗体重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸残基位置を同定するのに使用される２つの異なったナンバリングシステムの変換表がＡ．Ｈｏｎｅｇｇｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０９（２００１）６５７−６７０に提供されている。Ｋａｂａｔナンバリングシステムは、Ｋａｂａｔら（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２）に、より詳細に記載されている。ＡＨｏナンバリングシステムは、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ，Ａ．ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．（２００１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０９：６５７−６７０）で、より詳細に記載されている。 In an exemplary embodiment of the method of the invention, the amino acid sequence of the CDR donor antibody is first identified and the sequence is aligned using conventional sequence alignment tools (eg, Needleman-Wunsch algorithm and Blossum matrix). Introduction of gaps and naming of residue positions can be performed using conventional antibody numbering systems. For example, an AHo numbering system can be used for immunoglobulin variable domains. The Kabat numbering scheme is also applicable because it is the most widely adopted standard method for numbering residues in antibodies. Kabat numbering can be assigned using, for example, the SUBIM program. This program analyzes the variable region of antibody sequences and numbers the sequences according to the system established by Kabat et al. (Deret et al., 1995). Framework and CDR regions are usually defined according to the Kabat definition, which is based on sequence variability and is most commonly used. However, for CDR-H1, such designation is preferably defined by the Kabat definition, average contact data generated by analysis of contacts between antibodies and antigens of a subset of the 3D complex structure (MacCallum et al., 1996). Year), and a combination of Chotia definitions based on the location of the structural loop region (see also FIG. 1). A conversion table of two different numbering systems used to identify the amino acid residue positions of the variable regions of antibody heavy and light chains is shown in A.C. Honegger, J .; Mol. Biol. 309 (2001) 657-670. The Kabat numbering system is described in Kabat et al. (Kabat, EA, et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health. Are described in more detail. The AHo numbering system is described by Honegger, A .; and Pluckthun, A .; (2001) J. Org. Mol. Biol. 309 : 657-670).

ウサギモノクローナル抗体の可変ドメインは、例えば、配列分析アルゴリズムのＥＸＣＥＬインプリメンテーション（ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）およびヒト抗体レパートリーの分析に基づいた分類方法を用いて、例えば、対応するヒトサブグループに分類できる（Ｋｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．Ｆｅｂ １１；２９６（１）：５７−８６）。   The variable domains of rabbit monoclonal antibodies can be classified, for example, into the corresponding human subgroups using classification methods based on, for example, the EXCEL implementation of the sequence analysis algorithm and the analysis of the human antibody repertoire (Knappik et al. , 2000, J Mol Biol. Feb 11; 296 (1): 57-86).

ＣＤＲコンフォメーションをドナー抗原結合領域に割り当てることができ、続いて、様々な標準構造を維持するのに必要な残基位置を同定することもできる。ウサギ抗体の６つの抗体超可変領域のうち５つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１、およびＨ２）のＣＤＲの標準構造はＣｈｏｔｈｉａ（１９８９年）の定義を用いて決定される。   CDR conformations can be assigned to donor antigen binding regions and subsequently the residue positions necessary to maintain the various canonical structures can also be identified. The standard structure of the CDRs of 5 (L1, L2, L3, H1, and H2) of the 6 antibody hypervariable regions of the rabbit antibody is determined using the definition of Chothia (1989).

本発明の抗体は、強化された機能特性、例えば、強化された溶解性および／または安定性を示すようにさらに最適化することができる。特定の実施形態において、本発明の抗体は、２００８年３月１２日に出願された、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｂａｓｅｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｈａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」という名称のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００１９５８号に開示されている「機能的なコンセンサス（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）」法に従って最適化され、参照により本明細書に組み込まれる。   The antibodies of the invention can be further optimized to exhibit enhanced functional properties, such as enhanced solubility and / or stability. In a specific embodiment, the antibodies of the invention are disclosed in PCT Application No. PCT / EP2008 / 001958, filed March 12, 2008, entitled “Sequence Based Engineering and Optimization of Single Chain Antibodies”. Which is optimized according to the “functional consensus” method, which is incorporated herein by reference.

置換のための例示的フレームワーク残基位置および例示的フレームワーク置換は、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａｎｄ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｉｔｈ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ」という名称の、２００８年６月２５日出願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＣＨ２００８／０００２８５号、および「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｂａｓｅｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｈａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」という名称の、２００８年６月２５日出願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＣＨ２００８／０００２８４号に記載されている。   Exemplary framework residue positions for substitution and exemplary framework substitution are described in PCT application PCT application filed June 25, 2008, entitled “Methods of Modifying Antibodies, and Modified Antibodies with Improved Functional Properties”. CH2008 / 000285 and PCT application No. PCT / CH2008 / 000284 filed on June 25, 2008, entitled “Sequence Based Engineering and Optimization of Single Chain Antibodies”.

他の実施形態において、本発明のイムノバインダーは、「Ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｎｄｅｒｓ」という名称の、２００８年６月２５日出願の、米国仮出願第６１／０７５，６９２号に記載されている、安定性を増強する変異を１つ以上含んでいる。ある好ましい実施形態において、イムノバインダーは、１２、１０３、および１４４（ＡＨｏナンバリング法）からなる重鎖アミノ酸位置の群から選択されるアミノ酸位置に溶解性を増強する変異を含んでいる。好ましい一実施形態において、イムノバインダーは、（ａ）重鎖アミノ酸位置１２のセリン（Ｓ）、（ｂ）重鎖アミノ酸位置１０３のセリン（Ｓ）またはスレオニン（Ｔ）、及び（ｃ）重鎖アミノ酸位置１４４のセリン（Ｓ）またはスレオニン（Ｔ）からなる群より選択される置換を１つ以上含んでいる。別の実施形態において、イムノバインダーは、以下の置換、（ａ）重鎖アミノ酸位置１２のセリン（Ｓ）、（ｂ）重鎖アミノ酸位置１０３のセリン（Ｓ）またはスレオニン（Ｔ）、及び（ｃ）重鎖アミノ酸位置１４４のセリン（Ｓ）またはスレオニン（Ｔ）を含んでいる。   In other embodiments, the immunobinders of the present invention have stability described in US Provisional Application No. 61 / 075,692, filed June 25, 2008, entitled “Solubility Optimization of Immunobinders”. Contains one or more mutations that enhance In certain preferred embodiments, the immunobinder comprises a mutation that enhances solubility at an amino acid position selected from the group of heavy chain amino acid positions consisting of 12, 103, and 144 (AHo numbering method). In a preferred embodiment, the immunobinder comprises (a) a serine (S) at heavy chain amino acid position 12, (b) a serine (S) or threonine (T) at heavy chain amino acid position 103, and (c) a heavy chain amino acid. One or more substitutions selected from the group consisting of serine (S) or threonine (T) at position 144 are included. In another embodiment, the immunobinder comprises the following substitutions: (a) serine (S) at heavy chain amino acid position 12; (b) serine (S) or threonine (T) at heavy chain amino acid position 103; and (c A) Serine (S) or threonine (T) at heavy chain amino acid position 144.

特定の好ましい実施形態において、イムノバインダーは、ＡＨｏナンバリングシステムによる軽鎖可変領域の位置１、３、４、１０、４７、５７、９１、及び１０３のうちの少なくとも１つに、軽鎖アクセプターフレームワークのフレームワーク残基で安定性増強変異を含む。好ましい実施形態において、軽鎖アクセプターフレームワークは、（ａ）位置１のグルタミン酸（Ｅ）、（ｂ）位置３のバリン（Ｖ）、（ｃ）位置４のロイシン（Ｌ）、（ｄ）位置１０のセリン（Ｓ）、（ｅ）位置４７のアルギニン（Ｒ）、（ｅ）位置５７のセリン（Ｓ）、（ｆ）位置９１のフェニルアラニン（Ｆ）、及び（ｇ）位置１０３のバリン（Ｖ）からなる群より選択される１つ以上の置換を含む。   In certain preferred embodiments, the immunobinder is a light chain acceptor frame at at least one of positions 1, 3, 4, 10, 47, 57, 91, and 103 of the light chain variable region according to the AHo numbering system. Contains stability enhancing mutations at the framework residues of the workpiece. In a preferred embodiment, the light chain acceptor framework comprises (a) glutamic acid at position 1 (E), (b) valine at position 3 (V), (c) leucine at position 4 (L), (d) position. 10 serine (S), (e) arginine (R) at position 47, (e) serine (S) at position 57, (f) phenylalanine (F) at position 91, and (g) valine at position 103 (V One or more substitutions selected from the group consisting of:

上述の変異を含むヒト化抗体を産生する様々な利用可能な方法のいずれを用いることもできる。   Any of a variety of available methods for producing humanized antibodies containing the mutations described above can be used.

したがって、本発明は、本明細書に記載の方法に従ってヒト化されたイムノバインダーを提供する。   Accordingly, the present invention provides immunobinders that are humanized according to the methods described herein.

特定の好ましい実施形態において、該イムノバインダーの標的抗原はＶＥＧＦまたはＴＮＦαである。   In certain preferred embodiments, the immunobinder target antigen is VEGF or TNFα.

例えば、当該技術分野で公知の技法を用いて、本発明に記載のポリペプチドまたは本発明の方法で生成されたポリペプチドを合成できる。代替的には、所望の可変領域をコードする核酸分子を合成すること、および組換え法によってポリペプチドを生成することができる。   For example, the polypeptides described in the present invention or the polypeptides produced by the methods of the present invention can be synthesized using techniques known in the art. Alternatively, the polypeptide can be produced by synthesizing nucleic acid molecules encoding the desired variable regions and by recombinant methods.

例えば、ヒト化可変領域の配列がひとたび決定されると、分子生物学の分野で周知の技法によって、その可変領域またはそれを含むポリペプチドを生成することができる。より具体的には、核酸配列で宿主細胞を形質転換することによって、広範なポリペプチドを産生するのに、組換えＤＮＡ技法を用いることができる（例えば、所望の可変領域をコードするＤＮＡ配列（例えば、改変重鎖または軽鎖、その可変ドメインまたはその他の抗原結合性フラグメント））。   For example, once the sequence of a humanized variable region is determined, the variable region or a polypeptide containing it can be generated by techniques well known in the field of molecular biology. More specifically, recombinant DNA techniques can be used to produce a wide range of polypeptides by transforming host cells with nucleic acid sequences (eg, DNA sequences encoding the desired variable region ( For example, modified heavy or light chains, variable domains or other antigen-binding fragments thereof)).

一実施形態において、少なくともＶＨまたはＶＬをコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結するプロモーターを含む発現ベクターを調製できる。必要または望ましい場合、相補的な可変ドメインをコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結するプロモーターを含有する第２の発現ベクターを調製することができる（すなわち、親発現ベクターがＶＨをコードし、第２の発現ベクターがＶＬをコードする場合逆もまた同様である）。その後、細胞系（例えば、不死化哺乳動物細胞系）を該発現ベクターの一方または両方で形質転換し、キメラ可変ドメインまたはキメラ抗体の発現を可能にする条件下で培養することができる（例えば、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒらの国際特許出願第ＰＣＴ／ＧＢ８５／００３９２号を参照）。 In one embodiment, an expression vector can be prepared that includes a promoter operably linked to a DNA sequence encoding at least VH or VL . If necessary or desirable, a second expression vector can be prepared that contains a promoter operably linked to the DNA sequence encoding the complementary variable domain (ie, the parent expression vector encodes V H , The reverse is also true if the two expression vectors encode VL ). A cell line (eg, an immortalized mammalian cell line) can then be transformed with one or both of the expression vectors and cultured under conditions that allow expression of the chimeric variable domain or chimeric antibody (eg, (See Neuberger et al., International Patent Application No. PCT / GB85 / 00392).

一実施形態において、ドナーＣＤＲおよびアクセプターＦＲのアミノ酸配列を含む可変領域を作り、次いで、ＣＤＲアミノ酸置換をもたらすように核酸分子に変化を導入し得る。   In one embodiment, a variable region comprising the amino acid sequences of the donor CDR and acceptor FR can be created and then introduced into the nucleic acid molecule to result in a CDR amino acid substitution.

ポリペプチドのアミノ酸配列改変体をコードする核酸分子を作るための当該技術分野で認識されている例示的方法には、部位特異的（またはオリゴヌクレオチド媒介）変異誘発、ＰＣＲ変異誘発、および該ポリペプチドをコードする事前調製ＤＮＡのカセット変異誘発による調製が含まれるが、これらに限定されない。   Exemplary methods recognized in the art for making nucleic acid molecules encoding amino acid sequence variants of polypeptides include site-specific (or oligonucleotide-mediated) mutagenesis, PCR mutagenesis, and the polypeptides Including, but not limited to, preparation by cassette mutagenesis of pre-prepared DNA encoding.

部位特異的変異誘発は、置換改変体を調製するのに好ましい方法である。この技法は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：４４３１−４４４３（１９８５）およびＫｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８（１９８７）を参照）。簡潔には、ＤＮＡの部位特異的変異誘発を行う際に、親ＤＮＡの改変を、最初に、上記親ＤＮＡの単一鎖に所望の変異をコードするオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせることによって行う。ハイブリダイゼーションの後に、ハイブダイズしたオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、親ＤＮＡの単一鎖を鋳型として用いて、ＤＮＡポリメラーゼを用いて第２鎖全体を合成する。それによって、所望の変異をコードするオリゴヌクレオチドが、結果として得られる２本鎖ＤＮＡに組み込まれる。   Site-directed mutagenesis is a preferred method for preparing substitutional variants. This technique is well known in the art (see, eg, Carter et al. Nucleic Acids Res. 13: 4431-4443 (1985) and Kunkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488 (1987)). )). Briefly, when performing site-directed mutagenesis of DNA, modification of the parent DNA is performed by first hybridizing an oligonucleotide encoding the desired mutation to a single strand of the parent DNA. Following hybridization, the entire second strand is synthesized using DNA polymerase using the hybridized oligonucleotide as a primer and the single strand of the parent DNA as a template. Thereby, an oligonucleotide encoding the desired mutation is incorporated into the resulting double-stranded DNA.

ＰＣＲ変異誘発もポリペプチドのアミノ酸配列改変体を作るのに適している。Ｈｉｇｕｃｈｉ，ｉｎ ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｐｐ．１７７−１８３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９０）、およびＶａｌｌｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：７２３−７３３（１９８９）を参照。簡潔には、ＰＣＲにおける出発物質として少量の鋳型ＤＮＡが用いられる場合、鋳型ＤＮＡの対応する領域と配列が若干異なるプライマーを使用して、プライマーが鋳型と異なっている位置のみで鋳型配列と異なっている、比較的多量の特異ＤＮＡフラグメントを生成することができる。   PCR mutagenesis is also suitable for making amino acid sequence variants of polypeptides. Higuchi, in PCR Protocols, pp. 177-183 (Academic Press, 1990), and Vallette et al. , Nuc. Acids Res. 17: 723-733 (1989). Briefly, when a small amount of template DNA is used as a starting material in PCR, a primer that is slightly different in sequence from the corresponding region of the template DNA is used and differs from the template sequence only in the position where the primer differs from the template. A relatively large amount of specific DNA fragments can be produced.

改変体を調製するための別の方法であるカセット変異誘発は、Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ３４：３１５−３２３（１９８５）によって記載された技法に基づいている。出発物質は、変異導入されるＤＮＡを含むプラスミド（または他のベクター）である。変異導入される親ＤＮＡ中のコドン（複数可）を同定する。同定された変異部位（複数可）の各側に特異な制限エンドヌクレアーゼ部位がなければならない。そのような制限酵素認識部位が存在していない場合、ポリペプチドをコードするＤＮＡ中の適切な位置に制限酵素認識部位を導入する上述のオリゴヌクレオチド媒介変異誘発方法を用いて、生成させることができる。これらの部位でプラスミドＤＮＡを切断して、それを線状化する。制限酵素認識部位間のＤＮＡの配列をコードするが、所望の変異（複数可）を含有する２本鎖オリゴヌクレオチドは標準的手順を用いて合成され、ここで、オリゴヌクレオチドの２本の鎖は、標準的な技法を用いて別々に合成され、次いで、互いにハイブリダイズされる。この２本鎖オリゴヌクレオチドはカセットと呼ばれる。このカセットは、プラスミドに直接的に結紮されるように、線状化されたプラスミドの末端と適合する５’末端および３’末端を有するように設計される。このプラスミドは、この時点で、変異導入されたＤＮＡ配列を含有する。   Cassette mutagenesis, another method for preparing variants, is described in Wells et al. Gene 34: 315-323 (1985). The starting material is a plasmid (or other vector) containing the DNA to be mutated. Identify the codon (s) in the parent DNA to be mutated. There must be a unique restriction endonuclease site on each side of the identified mutation site (s). If no such restriction enzyme recognition site is present, it can be generated using the above-described oligonucleotide-mediated mutagenesis method that introduces a restriction enzyme recognition site at an appropriate location in the DNA encoding the polypeptide. . The plasmid DNA is cut at these sites to linearize it. Double-stranded oligonucleotides that encode the sequence of DNA between the restriction enzyme recognition sites but contain the desired mutation (s) are synthesized using standard procedures, where the two strands of the oligonucleotide are , Synthesized separately using standard techniques, and then hybridized to each other. This double-stranded oligonucleotide is called a cassette. This cassette is designed to have 5 'and 3' ends that are compatible with the ends of the linearized plasmid, such that it is directly ligated to the plasmid. This plasmid now contains the mutated DNA sequence.

本発明の方法によって生成された可変領域は、リモデリングを行って、抗原結合性がさらに増強するようにさらに改変することができる。したがって、上述のステップは、例えば、親和性成熟を含めた追加ステップに先行することも、それらの後にくることもできる。加えて、さらなる最適化に、経験的な結合データを用いることもできる。   The variable region generated by the method of the present invention can be remodeled and further modified to further enhance antigen binding. Thus, the steps described above can precede or follow additional steps including, for example, affinity maturation. In addition, empirical combined data can be used for further optimization.

アミノ酸置換とは別に、本発明では、例えば、改変されたエフェクター機能を有するＦｃ領域改変体を生成するためのＦｃ領域アミノ酸配列への他の改変も企図されている。例えば、ＦｃＲへの結合を減少または促進するために、Ｆｃ領域の１つ以上のアミノ酸残基を除去することができる。一実施形態において、そのようなＦｃ領域改変体を生成するために、１つ以上のＦｃ領域残基を改変することができる。通常、本発明のこの実施形態によれば、１以下〜約１０のＦｃ領域残基が除去される。１つ以上のアミノ酸欠失を含む本明細書のＦｃ領域は、好ましくは、開始Ｆｃ領域または天然配列ヒトＦｃ領域の少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％を保持する。   Apart from amino acid substitutions, the present invention also contemplates other modifications to the Fc region amino acid sequence, eg, to generate Fc region variants with altered effector functions. For example, one or more amino acid residues of the Fc region can be removed to reduce or facilitate binding to FcR. In one embodiment, one or more Fc region residues can be modified to generate such Fc region variants. Typically, from this embodiment of the invention, no more than 1 to about 10 Fc region residues are removed. An Fc region herein comprising one or more amino acid deletions preferably comprises at least about 80%, preferably at least about 90%, most preferably at least about 95% of the starting Fc region or native sequence human Fc region. Hold.

一実施形態において、本発明に記載されているポリペプチド、または本発明の方法で生成されたポリペプチド、例えば、ヒト化Ｉｇ可変領域および／またはヒト化Ｉｇ可変領域を含むポリペプチドは、組換え法によって産生されたものであり得る。例えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を組換え発現に好適な発現ベクターに挿入できる。ポリペプチドが抗体である場合、定常領域に場合により連結された、追加の軽鎖可変領域および重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドが同じかまたは異なった発現ベクターに挿入され得る。親和性タグ配列（例えば、Ｈｉｓ（６）タグ）を、下流の精製を容易にするためにポリペプチド配列に場合により結合または包含させることができる。イムノグロブリン鎖をコードするＤＮＡセグメントは、イムノグロブリンポリペプチドの発現を確実にする、発現ベクター（複数可）中の制御配列に作動可能に連結されている。発現制御配列としては、プロモーター（例えば、天然付随または異種のプロモーター）、シグナル配列、エンハンサーエレメントおよび転写終結配列が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、発現制御配列は、真核宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトすることができるベクター中の真核細胞プロモーター系である。ひとたびベクターが適切な宿主に組み入れられれば、ヌクレオチド配列の高レベル発現ならびにポリペプチドの収集および精製に好適な条件下で宿主は維持される。   In one embodiment, a polypeptide described in the present invention, or a polypeptide produced by a method of the present invention, such as a humanized Ig variable region and / or a polypeptide comprising a humanized Ig variable region, is recombinant. It may have been produced by the law. For example, a polynucleotide sequence encoding a polypeptide can be inserted into an expression vector suitable for recombinant expression. When the polypeptide is an antibody, additional light chain variable region and polynucleotide encoding heavy chain variable regions, optionally linked to the constant region, can be inserted into the same or different expression vectors. An affinity tag sequence (eg, a His (6) tag) can optionally be linked or included in the polypeptide sequence to facilitate downstream purification. The DNA segment encoding the immunoglobulin chain is operably linked to control sequences in the expression vector (s) that ensure expression of the immunoglobulin polypeptide. Expression control sequences include, but are not limited to, promoters (eg, naturally associated or heterologous promoters), signal sequences, enhancer elements and transcription termination sequences. Preferably, the expression control sequence is a eukaryotic promoter system in a vector capable of transforming or transfecting a eukaryotic host cell. Once the vector is incorporated into a suitable host, the host is maintained under conditions suitable for high level expression of nucleotide sequences and polypeptide collection and purification.

これらの発現ベクターは通常、エピソームとして、または宿主染色体ＤＮＡに組み込まれた部分として宿主生物内で複製可能である。一般的に、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列で形質転換された細胞の検出を可能にするために、選択マーカー（例えば、アンピシリン耐性、ハイグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性またはネオマイシン耐性）を含有している（例えば、米国特許第４，７０４，３６２号参照）。   These expression vectors are usually replicable in the host organism as an episome or as a part integrated into the host chromosomal DNA. In general, expression vectors contain a selectable marker (eg, ampicillin resistance, hygromycin resistance, tetracycline resistance or neomycin resistance) to allow detection of cells transformed with the desired DNA sequence. (See, eg, US Pat. No. 4,704,362).

大腸菌は、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ配列）をクローニングするのに特に有用な原核細胞の宿主の１つである。使用に好適な他の微生物の宿主には、枯草菌（Ｂaｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｕｓ）などの桿菌、ならびにサルモネラ、セラチアおよび様々なシュードモナス種などの他の腸内細菌科が含まれる。   E. coli is one prokaryotic host particularly useful for cloning the polynucleotides (eg, DNA sequences) of the present invention. Other microbial hosts suitable for use include bacilli such as Bacillus subtilus, and other Enterobacteriaceae such as Salmonella, Serratia and various Pseudomonas species.

酵母などの他の微生物も発現に有用である。サッカロミセスおよびピキアは例示的酵母宿主であり、好適なベクターは、所望により、発現制御配列（例えば、プロモーター）、複製開始点、終止配列などを有する。典型的なプロモーターとしては、３−ホスホグリセレートキナーゼおよび他の解糖系酵素が挙げられる。誘導性酵母プロモーターとしては、とりわけ、アルコールデヒドロゲナーゼ、イソシトクロムＣ由来のプロモーター、ならびにメタノール、マルトースおよびガラクトース利用を担っている酵素群由来のプロモーターが挙げられる。   Other microorganisms such as yeast are also useful for expression. Saccharomyces and Pichia are exemplary yeast hosts, and suitable vectors optionally have expression control sequences (eg, promoters), origins of replication, termination sequences, and the like. Typical promoters include 3-phosphoglycerate kinase and other glycolytic enzymes. Inducible yeast promoters include, inter alia, promoters derived from alcohol dehydrogenase and isocytochrome C, and promoters derived from enzymes responsible for the use of methanol, maltose and galactose.

本発明の範囲内では、大腸菌および出芽酵母が好ましい宿主細胞である。   Within the scope of the present invention, E. coli and budding yeast are preferred host cells.

微生物に加えて、哺乳動物組織培養も、本発明のポリペプチドを発現および産生させるのに使用できる（例えば、イムノグロブリンまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド）。Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ、Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ、ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎ．Ｙ．，Ｎ．Ｙ（１９８７）を参照されたい。種タンパク質（例えば、インタクトなイムノグロブリン）を分泌できる多くの好適な宿主細胞系が当該技術分野で開発されているので、真核細胞が事実上好ましく、それらには、ＣＨＯ細胞系、様々なＣｏｓ細胞系、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、骨髄腫細胞系、形質転換Ｂ細胞およびハイブリドーマが挙げられる。これらの細胞のための発現ベクターは、複製開始点、プロモーターおよびエンハンサーなどの発現制御配列（Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８９：４９（１９８６））、ならびにリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライシング部位、ポリアデニル化部位、転写ターミネータ配列などの必要なプロセシング情報部位を含むことができる。好ましい発現制御配列は、イムノグロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、サイトメガロウイルスなどから得られたプロモーターである。Ｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９（１９９２）を参照されたい。   In addition to microorganisms, mammalian tissue culture can also be used to express and produce the polypeptides of the invention (eg, polynucleotides encoding immunoglobulins or fragments thereof). Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.A. Y. , N.M. See Y (1987). Since many suitable host cell systems capable of secreting seed proteins (eg, intact immunoglobulins) have been developed in the art, eukaryotic cells are practically preferred, including CHO cell lines, various Cos cells Cell lines, HeLa cells, 293 cells, myeloma cell lines, transformed B cells and hybridomas. Expression vectors for these cells include origins of replication, expression control sequences such as promoters and enhancers (Queen et al., Immunol. Rev. 89:49 (1986)), as well as ribosome binding sites, RNA splicing sites, polyadenyls. Necessary processing information sites such as a transcription site and a transcription terminator sequence can be included. Preferred expression control sequences are promoters obtained from immunoglobulin genes, SV40, adenovirus, bovine papilloma virus, cytomegalovirus and the like. Co et al. , J .; Immunol. 148: 1149 (1992).

目的のポリヌクレオチド配列（例えば、重鎖および軽鎖をコードする配列ならびに発現制御配列）を含有するベクターを、周知の方法（細胞宿主のタイプに応じて異なる）によって宿主細胞内に導入できる。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションは原核細胞に一般的に利用され、一方、リン酸カルシウム処理、エレクトロポレーション、リポフェクション、バイオリスティクス（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ）またはウイルスベースのトランスフェクションは他の細胞宿主に使用され得る（全般的にＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ ｅｄ．，１９８９を参照）。哺乳動物細胞を形質転換するのに使用される他の方法には、ポリブレンの使用、プロトプラスト融合、リポソーム、エレクトロポレーション、および微量注入が挙げられる（全般的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，上記参照）。トランスジェニック動物の産生には、受精卵母細胞内に導入遺伝子を微量注入すること、または、胚幹細胞のゲノム中に組み入れ、そのような細胞の核を除核卵母細胞内に導入することができる。   Vectors containing the polynucleotide sequences of interest (eg, sequences encoding heavy and light chains and expression control sequences) can be introduced into host cells by well-known methods (depending on the type of cell host). For example, calcium chloride transfection is commonly utilized for prokaryotic cells, while calcium phosphate treatment, electroporation, lipofection, biolistics or virus-based transfection can be used for other cellular hosts (general Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (see Cold Spring Harbor Press, 2nd ed., 1989) Other methods used to transform mammalian cells include polybrene use, protoplasts Fusion, liposomes, electroporation, and microinjection are included (generally, Sambrook et al., See above). For the production of transgenic animals, the transgene can be microinjected into fertilized oocytes, or incorporated into the genome of embryonic stem cells and the nuclei of such cells can be introduced into enucleated oocytes .

トランスジェニック動物のゲノム中に導入して、それに続いて、例えば、トランスジェニック動物の乳中に発現させるために、対象となるポリペプチドを導入遺伝子に組み入れることもできる（例えば、Ｄｅｂｏｅｒらの第５，７４１，９５７号、Ｒｏｓｅｎの第５，３０４，４８９号、およびＭｅａｄｅの第５，８４９，９９２号を参照）。好適な導入遺伝子には、カゼインまたはベータラクトグロブリンなどの乳腺特異的遺伝子由来のプロモーターおよびエンハンサーに作動可能に連結した、軽鎖および／または重鎖のコード配列が挙げられる。   The polypeptide of interest can also be incorporated into the transgene for introduction into the genome of the transgenic animal and subsequent expression, for example, in the milk of the transgenic animal (see, eg, Deboer et al. 741,957; Rosen 5,304,489; and Meade 5,849,992). Suitable transgenes include light and / or heavy chain coding sequences operably linked to promoters and enhancers from mammary gland specific genes such as casein or beta-lactoglobulin.

ポリペプチドは、単一ベクターを用いて発現させることも、２つのベクターを用いて発現することもできる。例えば、抗体重鎖および軽鎖を、別々の発現ベクターにクローニングして、細胞中に共トランスフェクト（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）してもよい。   Polypeptides can be expressed using a single vector or can be expressed using two vectors. For example, antibody heavy and light chains may be cloned into separate expression vectors and co-transfected into cells.

一実施形態において、本発明のポリペプチドの発現を促進するのに、シグナル配列を使用できる。   In one embodiment, a signal sequence can be used to facilitate expression of a polypeptide of the invention.

ひとたび発現されれば、そのポリペプチドを、硫酸アンモニウム沈殿、親和性カラム（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧ）、カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ精製、ゲル電気泳動などを含めた、当該技術分野の標準的手順（全般的に、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．（１９８２））を参照のこと）に従って精製することができる。   Once expressed, the polypeptide can be purified using standard procedures in the art, including ammonium sulfate precipitation, affinity columns (eg, protein A or protein G), column chromatography, HPLC purification, gel electrophoresis, and the like. Generally, it can be purified according to Scopes, Protein Purification (see Springer-Verlag, NY (1982)).

ヒト化Ｉｇ可変領域またはそれらを含むポリペプチドを宿主細胞または培養細胞系によって発現させることができる。それらは、インビボの細胞で発現させることもできる。改変された抗体を産生するように形質転換（例えば、トランスフェクト）される細胞系は、不死化哺乳動物細胞系であり得、例えば、リンパ球系出自のものである（例えば、骨髄腫、ハイブリドーマ、トリオーマ、またはクアドローマ細胞系）。この細胞系としてはまた、ウイルス（例えば、エプスタインーバーウイルス）を用いた形質転換によって不死化された、Ｂ細胞などの正常なリンパ系細胞が挙げられ得る。   Humanized Ig variable regions or polypeptides comprising them can be expressed by host cells or cultured cell lines. They can also be expressed in cells in vivo. The cell line that is transformed (eg, transfected) to produce the modified antibody can be an immortalized mammalian cell line, such as that of a lymphoid origin (eg, myeloma, hybridoma). , Trioma, or quadroma cells). This cell line can also include normal lymphoid cells such as B cells that have been immortalized by transformation with a virus (eg, Epstein-Barr virus).

ポリペプチドを産生するのに使用される細胞系は通常、哺乳動物細胞系であるが、他の供給源からの細胞系（細菌および酵母など）も使用できる。特に、大腸菌由来の細菌株を使用でき、とりわけ、例えば、ファージディスプレイを使用できる。   The cell line used to produce the polypeptide is usually a mammalian cell line, but cell lines from other sources (such as bacteria and yeast) can also be used. In particular, bacterial strains derived from E. coli can be used, in particular, for example, phage display.

骨髄腫細胞株など、一部の不死化リンパ系細胞系は、それらの正常な状態で、単離されたＩｇ軽鎖または重鎖を分泌する。本発明の方法中に調製された改変抗体を発現するベクターでそのような細胞系が形質転換された場合、通常分泌される鎖が、事前に調製されたベクターによってコードされたＩｇ鎖の可変ドメインに相補的な鎖であるという条件では、該方法の残りのステップを実行する必要はない。   Some immortal lymphoid cell lines, such as myeloma cell lines, secrete isolated Ig light or heavy chains in their normal state. When such a cell line is transformed with a vector expressing a modified antibody prepared during the method of the present invention, the normally secreted chain is a variable domain of an Ig chain encoded by a previously prepared vector. As long as the strands are complementary to each other, the remaining steps of the method need not be performed.

不死化細胞系が分泌しない、または相補鎖を分泌しない場合、適切な相補鎖またはそのフラグメントをコードするベクターを細胞内に導入することが必要である。   If the immortalized cell line does not secrete or does not secrete the complementary strand, it is necessary to introduce a vector encoding the appropriate complementary strand or fragment thereof into the cell.

不死化細胞系が相補的な軽鎖または重鎖を分泌する場合、形質転換細胞系は、例えば、好適な細菌細胞をベクターで形質転換し、次いで、その細菌細胞を不死化細胞系と（例えば、スフェロプラスト融合によって）融合させることによって産生され得る。代替的には、エレクトロポレーションによってＤＮＡが不死化細胞系に直接的に導入され得る。   If the immortal cell line secretes a complementary light or heavy chain, the transformed cell line can, for example, transform a suitable bacterial cell with the vector and then transform the bacterial cell with the immortal cell line (eg, , By spheroplast fusion). Alternatively, DNA can be introduced directly into an immortalized cell line by electroporation.

一実施形態において、本発明で記載されるヒト化Ｉｇ可変領域、または本発明の方法によって生成されるヒト化Ｉｇ可変領域は、任意の抗体の抗原結合性フラグメント中に存在し得る。これらのフラグメントは、組換えによって産生され得、ならびにタンパク質分解酵素で抗体を消化することによって操作、合成または産生され得る。例えば、フラグメントは、Ｆａｂフラグメントであり得、パパインによる消化は、２本の重鎖を連結する鎖間（すなわち、ＶＨ−ＶＨ）ジスルフィド結合の前に領域で抗体を切断する。これは、軽鎖ならびに重鎖のＶＨおよびＣＨ１ドメインを含有する２つの同一なフラグメントの形成をもたらす。代替的には、このフラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントであり得る。これらのフラグメントは、ペプシンで抗体を消化することによって生成され得る。ペプシンは、鎖間ジスルフィド結合の後で重鎖を切断し、その結果、両方の抗原結合部位を含有するフラグメントをもたらす。さらに別の代替手段は、「単一鎖」抗体を用いることである。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントは、様々な方法で構築できる。例えば、ＶＨのＣ末端をＶＬのＮ末端に連結できる。通常、リンカー（例えば、（ＧＧＧＧＳ）４、配列番号４）をＶＨとＶＬとの間で配置する。しかし、鎖が連結され得る順序は、逆にすることができ、検出または精製を容易にするタグ（例えば、Ｍｙｃタグ、ＨｉｓタグまたはＦＬＡＧタグ）が含まれ得る（これらなどのタグを本発明の任意の抗体または抗体フラグメントに追加することができる、それらの使用はｓｃＦｖに限定されない）。したがって、以下に述べるように、タグ付きの抗体は本発明の範囲内である。代替的な実施形態において、本明細書に記載の抗体または本明細書に記載の方法によって生成される抗体は、重鎖２量体または軽鎖２量体であり得る。さらに、抗体軽鎖もしくは重鎖またはその部分、例えば単一ドメイン抗体（ＤＡｂ）も使用できる。 In one embodiment, the humanized Ig variable region described in the present invention, or the humanized Ig variable region produced by the method of the present invention, can be present in any antigen-binding fragment of an antibody. These fragments can be produced recombinantly, as well as engineered, synthesized or produced by digesting the antibody with proteolytic enzymes. For example, the fragment can be a Fab fragment, and digestion with papain cleaves the antibody in the region before the interchain (ie, V H -V H ) disulfide bond connecting the two heavy chains. This results in the formation of two identical fragments containing the V H and C H 1 domains of the light chain and the heavy chain. Alternatively, this fragment may be an F (ab ′) 2 fragment. These fragments can be generated by digesting the antibody with pepsin. Pepsin cleaves the heavy chain after an interchain disulfide bond, resulting in a fragment containing both antigen binding sites. Yet another alternative is to use “single chain” antibodies. Single chain Fv (scFv) fragments can be constructed in a variety of ways. For example, connecting the C-terminus of V H to the N-terminus of the V L. Usually, a linker (eg (GGGGS) 4 , SEQ ID NO: 4) is placed between V H and V L. However, the order in which the strands can be ligated can be reversed and can include tags (eg, Myc tag, His tag or FLAG tag) that facilitate detection or purification (such tags as those of the present invention). Can be added to any antibody or antibody fragment, their use is not limited to scFv). Thus, as described below, tagged antibodies are within the scope of the present invention. In alternative embodiments, the antibodies described herein or the antibodies produced by the methods described herein can be heavy chain dimers or light chain dimers. In addition, antibody light or heavy chains or portions thereof, such as single domain antibodies (DAb) can be used.

別の実施形態において、本発明に記載のヒト化Ｉｇ可変領域、または本発明の方法で生成されるヒト化Ｉｇ可変領域は、単一鎖抗体（ＳｃＦｖ）またはミニボディー（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）で存在する（例えば、米国特許第５，８３７，８２１号またはＷＯ９４／０９８１７Ａ１参照）。ミニボディーは、それぞれＳｃＦｖ分子（１つ以上の抗原結合部位を含む単一ポリペプチド、例えば、接続ペプチドを介してＣＨ３ドメインに融合したＶＨドメインに柔軟なリンカーによって連結されたＶＬドメイン）を含む２本のポリペプチド鎖で作られた２量体分子である。ＳｃＦｖ分子は、ＶＨ−リンカー−ＶＬ配向または、ＶＬ−リンカー−ＶＨ配向で構築できる。抗原結合部位を作るＶＬおよびＶＨドメインを連結する柔軟なヒンジは、好ましくは、約１０〜約５０アミノ酸残基を含む。この目的のための例示的接続ペプチドは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３である（Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．．（１９８８）、ＰＮＡＳ，８５：５８７９）。他の接続ペプチドは当該技術分野において公知である。 In another embodiment, the humanized Ig variable region described in the present invention, or the humanized Ig variable region generated by the method of the present invention, is present in a single chain antibody (ScFv) or minibody (minibody) ( For example, see US Pat. No. 5,837,821 or WO94 / 09817A1). Each minibody contains a ScFv molecule (a single polypeptide containing one or more antigen binding sites, eg, a VL domain linked by a flexible linker to a VH domain fused to a CH3 domain via a connecting peptide). A dimeric molecule made up of two polypeptide chains. ScFv molecules can be constructed in a VH -linker- VL orientation or a VL -linker- VH orientation. The flexible hinge that connects the VL and VH domains that make up the antigen binding site preferably comprises from about 10 to about 50 amino acid residues. An exemplary connecting peptide for this purpose is (Gly4Ser) 3 (Huston et al. (1988), PNAS, 85: 5879). Other connecting peptides are known in the art.

単一鎖抗体を生成する方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、Ｈｏ ｅｔ ａｌ．（１９８９），Ｇｅｎｅ，７７：５１、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８８），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３、Ｐａｎｔｏｌｉａｎｏ ｅｔ ａｌ．（１９９１），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：１０１１７、Ｍｉｌｅｎｉｃ ｅｔ ａｌ．（１９９１），Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５１：６３６３、Ｔａｋｋｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ４：８３７。ミニボディーは、当該技術分野で記載されている方法を用いて、ＳｃＦｖ成分および接続ペプチド−ＣＨ３成分を構築することによって生成できる（例えば、米国特許第５，８３７，８２１号またはＷＯ９４／０９８１７Ａ１参照）。これらの成分を、別々のプラスミドから制限フラグメントとして単離し、その後、適切なベクター中に結紮および再クローニングすることができる。適切なアセンブリを制限酵素消化およびＤＮＡ配列分析で確かめることができる。一実施形態において、本発明のミニボディーは接続ペプチドを含む。一実施形態において、接続ペプチドは、Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカー、例えば、ＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧＧ（配列番号６）を含む。 Methods for producing single chain antibodies are well known in the art, see, eg, Ho et al. (1989), Gene, 77:51, Bird et al. (1988), Science 242: 423, Pantoliano et al. (1991), Biochemistry 30: 10117, Milenic et al. (1991), Cancer Research, 51: 6363, Takkinen et al. (1991), Protein Engineering 4: 837. Minibodies can be generated by constructing a ScFv component and a connecting peptide-CH 3 component using methods described in the art (see, eg, US Pat. No. 5,837,821 or WO 94 / 09817A1). ). These components can be isolated as restriction fragments from separate plasmids and then ligated and recloned into an appropriate vector. Appropriate assembly can be verified by restriction enzyme digestion and DNA sequence analysis. In one embodiment, the minibody of the invention comprises a connecting peptide. In one embodiment, the connecting peptide comprises a Gly / Ser linker, eg, GGGSSSGGGSGGG (SEQ ID NO: 6).

別の実施形態において、４価のミニボディーを構築できる。例えば、アミノ酸配列（Ｇ４Ｓ）４Ｇ３ＡＳ（配列番号７）を有する柔軟なリンカーを用いて２個のＳｃＦｖ分子が連結されることを除けばミニボディーと同じ方法で、４価のミニボディーを構築することができる。 In another embodiment, a tetravalent minibody can be constructed. For example, in the same manner as a minibody except that two ScFv molecules are linked using a flexible linker having the amino acid sequence (G 4 S) 4 G 3 AS (SEQ ID NO: 7). You can build a body.

別の実施形態において、本発明で記載するヒト化可変領域、または本発明の方法で生成されるヒト化可変領域はダイアボディーで存在し得る。ダイアボディーはｓｃＦｖ分子に類似しているが、通常、両方の可変ドメインを接続する短い（１０未満、好ましくは１〜５）アミノ酸残基リンカーを有し、それゆえ、同一ポリペプチド鎖上のＶＬドメインとＶＨドメインとは相互作用できない。代替的には、１本のポリペプチド鎖のＶＬおよびＶＨ領域が（それぞれ）第２のポリペプチド鎖上のＶＨおよびＶＬドメインと相互作用する（ＷＯ０２／０２７８１）。 In another embodiment, the humanized variable region described in the present invention, or the humanized variable region produced by the method of the present invention, can be present in a diabody. Diabodies are similar to scFv molecules, but usually have a short (less than 10, preferably 1-5) amino acid residue linker connecting both variable domains, and thus V on the same polypeptide chain. L domain and V H domain cannot interact. Alternatively, the VL and VH regions of one polypeptide chain (respectively) interact with the VH and VL domains on the second polypeptide chain (WO02 / 02781).

別の実施形態において、本発明のヒト化可変領域は、ＦｃＲ結合部分に作動可能に連結した抗体（例えば、ｓｃＦｖ分子、ミニボディー、４価のミニボディー、またはダイアボディー）の免疫反応性フラグメントまたは部分に存在し得る。例示的な一実施形態において、ＦｃＲ結合部分は完全なＦｃ領域である。   In another embodiment, a humanized variable region of the invention comprises an immunoreactive fragment of an antibody (eg, scFv molecule, minibody, tetravalent minibody, or diabody) operably linked to an FcR binding moiety or Can exist in the part. In one exemplary embodiment, the FcR binding portion is a complete Fc region.

好ましくは、本明細書に記載のヒト化法は、ドナー抗体と比較して実質的に抗原の親和性が変化していないＩｇ可変領域をもたらす。   Preferably, the humanization methods described herein result in an Ig variable region that has substantially no change in antigen affinity compared to the donor antibody.

一実施形態において、本発明の可変ドメインを含むポリペプチドは、約１０５Ｍ−１、約１０６Ｍ−１、約１０７Ｍ−１、約１０８Ｍ−１、約１０９Ｍ−１、約１０１０Ｍ−１、約１０１１Ｍ−１または約１０１２Ｍ−１超の（またはそれに等しい）結合定数Ｋａの結合親和性で抗原に結合する（これらの値の中間値の親和性を含む）。 In one embodiment, a polypeptide comprising a variable domain of the invention has about 10 5 M −1 , about 10 6 M −1 , about 10 7 M −1 , about 10 8 M −1 , about 10 9 M −1. Binds to an antigen with a binding affinity Ka of a binding constant Ka greater than (or equal to) about 10 10 M −1 , about 10 11 M −1 or about 10 12 M −1 (intermediate affinity of these values) including).

様々な方法で親和性、結合活性および／または特異性を測定できる。通常、親和性が定義または測定される正確な方法に関わらず、本発明の方法によって、作製元の抗体（または複数の抗体）よりも臨床適用の任意の側面で優れた抗体が生成される場合、該方法は、抗体親和性を改善するものである（例えば、改変された抗体が、作製元の抗体（または複数の抗体）よりも低用量または低頻度または好都合な投与経路で投与できる場合、本発明の方法は有効または好成果であると考えられる）。   Affinity, binding activity and / or specificity can be measured in various ways. Usually, regardless of the exact method by which affinity is defined or measured, the method of the invention produces an antibody that is superior to the original antibody (or antibodies) in any aspect of clinical application. The method improves antibody affinity (eg, if the modified antibody can be administered at a lower dose or less frequently or by a convenient route of administration than the antibody (or antibodies) of origin, The method of the present invention is considered to be effective or successful.

より詳細には、抗体と、それが結合する抗原との間の親和性は、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ、ＢｉａＣｏｒｅアッセイまたはＫｉｎＥｘＡ（商標）３０００アッセイ（Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｂｏｉｓｅ（ＩＤ））から入手可能）を含めた様々なアッセイで測定できる。簡潔には、セファロースビーズを共有結合によって抗原（本発明の方法で使用される抗原は、任意の目的の抗原（例えば、がん抗原、細胞表面タンパク質または分泌タンパク質、病原体の抗原（例えば、細菌またはウイルス抗原（例えば、ＨＩＶ抗原、インフルエンザ抗原または肝炎抗原））、アレルゲンであり得る）でコーティングする。試験される抗体の希釈物を調製し、各希釈物をプレートにおける指定された穴に添加する。次いで、それぞれの穴に検出抗体（例えば、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ結合体）を添加し、続いて色素形成の基質（例えば、ＨＲＰ）を添加する。次いで、プレートをＥＬＩＳＡプレートリーダーで４５０ｎＭにて読み取り、ＥＣ５０値を計算する。（しかしながら、本明細書に記載された方法は概ね適用可能であり、それらは、いかなる特定の抗原または抗原のクラスに結合する抗体の産生にも限定されないと理解される）。   More particularly, the affinity between an antibody and the antigen to which it binds includes, for example, an ELISA assay, BiaCore assay or KinExA ™ 3000 assay (available from Sapidyne Instruments (Boise (ID))). Can be measured by various assays. Briefly, antigens (eg, antigens used in the methods of the invention may be any antigen of interest (eg, cancer antigen, cell surface protein or secreted protein, pathogen antigen (eg, bacteria or Coat with a viral antigen (eg, HIV antigen, influenza antigen or hepatitis antigen), which can be an allergen) Prepare dilutions of the antibody to be tested and add each dilution to a designated hole in the plate. A detection antibody (eg, goat anti-human IgG-HRP conjugate) is then added to each well, followed by a chromogenic substrate (eg, HRP) The plate is then loaded at 450 nM with an ELISA plate reader. Read and calculate EC50 values (however, the methods described herein are generally applicable) There, they are understood not to be limited to the production of antibodies that bind to the class of any particular antigen or antigen).

当業者ならば、親和性の決定が常に単一の数値を見るだけですむほど単純ではないと認識するであろう。抗体は２つの腕を有するので、通常、それらの見かけの親和性は、可変領域と抗原との間の固有の親和性よりはるかに高い（これは結合活性によるものと考えられている）。ｓｃＦｖまたはＦａｂフラグメントを用いて固有の親和性を測定できる。   One skilled in the art will recognize that determining affinity is not as simple as always looking at a single number. Since antibodies have two arms, their apparent affinity is usually much higher than the intrinsic affinity between the variable region and the antigen (this is believed to be due to binding activity). Intrinsic affinity can be measured using scFv or Fab fragments.

別の一態様において、本発明は、細胞毒、薬物（例えば、免疫抑制薬）、または放射性毒などの治療用部分に結合体化している、ヒト化ウサギ抗体、またはそのフラグメントを特色としている。かかる複合体を、本明細書において「イムノコンジュゲート」と呼ぶ。   In another aspect, the invention features a humanized rabbit antibody, or fragment thereof, conjugated to a therapeutic moiety such as a cytotoxin, drug (eg, immunosuppressive drug), or radiotoxin. Such a complex is referred to herein as an “immunoconjugate”.

本発明の抗体結合体を用いて、所与の生物学的応答を調節することができ、薬物部分は古典的な化学療法剤に限定されると解釈してはならない。例えば、薬物部分は、所望の生物活性を有するタンパク質またはポリペプチドであってよい。かかるタンパク質としては、例えば、酵素的に活性な毒素、またはその活性なフラグメント、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナスの体外毒素、もしくはジフテリア毒素γ、腫瘍壊死因子もしくはインターフェロン−γなどのタンパク質、または生物学的応答調節物質、例えば、リンホカイン、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）、もしくは他の成長因子が挙げられ得る。   The antibody conjugates of the invention can be used to modulate a given biological response and the drug moiety should not be construed as limited to classical chemotherapeutic agents. For example, the drug moiety can be a protein or polypeptide having the desired biological activity. Such proteins include, for example, enzymatically active toxins, or active fragments thereof, such as proteins such as abrin, ricin A, Pseudomonas exotoxin, or diphtheria toxin γ, tumor necrosis factor or interferon-γ, or organisms Such as lymphokines, interleukin-1 (“IL-1”), interleukin-2 (“IL-2”), interleukin-6 (“IL-6”), granulocyte macrophage colonies A stimulating factor (“GM-CSF”), granulocyte colony stimulating factor (“G-CSF”), or other growth factors may be mentioned.

かかる治療部分を、抗体に結合体化するための技術は周知であり、例えば、Ａｒｎｏｎ ｅｔ ａｌ．，”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ”，ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．２４３−５６（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，”Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”，ｉｎ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（２ｎｄ Ｅｄ．），Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．６２３−５３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ，”Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ”，ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．４７５−５０６（１９８５）；”Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ Ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ”，ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．３０３−１６（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８５），およびＴｈｏｒｐｅ ｅｔ ａｌ．，”Ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ”，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，６２：１１９−５８（１９８２）を参照。 Techniques for conjugating such therapeutic moieties to antibodies are well known, see, eg, Arnon et al. , “Monoclonal Antibodies for Immunization of Drugs in Cancer Therapeutics”, in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy , Reisfeldt. (Eds.), Pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al. "Antibodies For Drug Delivery", In Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (Eds.), Pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc.1987); Thorpe,. (. Eds) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:: A Review", in Monoclonal Antibodies "84 Biological And Clinical Applications, Pinchera et al, pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer D . (. eds).. tection And Therapy, Baldwin et al, pp.303-16 (Academic Press 1985), and Thorpe et al, "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol.Rev, 62: 119-58 (1982).

１つの態様において、本発明は、疾患の処置のためのヒト化ウサギ抗体を含む薬学的処方物を提供する。用語「薬学的処方物」とは、明白に有効である抗体または抗体誘導体の生物活性を可能にするような形態であり、処方物を投与した被験体に毒性のある追加の成分を含まない調製物をいう。「薬学的に許容される」賦形剤（媒介物、添加剤）とは、被験体である哺乳動物に合理的に投与し、採用する活性成分の有効用量を実現できるものである。   In one aspect, the present invention provides a pharmaceutical formulation comprising a humanized rabbit antibody for the treatment of disease. The term “pharmaceutical formulation” is a form that allows the biological activity of an antibody or antibody derivative that is clearly effective and does not contain additional components that are toxic to the subject to which the formulation is administered. Say things. “Pharmaceutically acceptable” excipients (vehicles, additives) are those that can be reasonably administered to a subject mammal to achieve an effective dosage of the active ingredient employed.

（均等物）
前述の記載を考慮すると、本発明の多くの修正および代替の実施例が、当業者には明らかであろう。したがって、この記載は、単なる例示として解釈すべきであり、本発明を実行するのに最良の様式を当業者に教示するためのものである。構造の詳細は、本発明の精神から逸脱することなく実質的に変えることができ、添付の特許請求の範囲内となるすべての修正の独占的使用権を保有する。本発明は、添付の特許請求の範囲および適用可能な法律の規則によって要求される程度にのみ制限されるものであると意図する。 (Equivalent)
Many modifications and alternative embodiments of the invention will be apparent to those skilled in the art in view of the foregoing description. Accordingly, this description is to be construed as illustrative only and is for the purpose of teaching those skilled in the art the best mode of carrying out the invention. The details of construction may vary substantially without departing from the spirit of the invention and retain exclusive use rights for all modifications that fall within the scope of the appended claims. The present invention is intended to be limited only to the extent required by the appended claims and the rules of applicable law.

特許、特許出願、論説、書籍、論文、論述、ウェブページ、図および／または添付書類を含む、この出願に引用された全文献および類似物は、かかる文献および類似物の書式に関わらず、参照によりそれらの全体が明示的に組み込まれる。組み込まれた文献および類似物の１つ以上が、定義された用語、用語の使用法、記載された技法または同様のものを含むこの明細書と異なるか相反する場合には、本明細書が優先される。   All documents and similar materials cited in this application, including patents, patent applications, editorials, books, papers, articles, web pages, figures and / or attachments, are referenced, regardless of the format of such documents and analogs. Are explicitly incorporated in their entirety. In the event that one or more of the incorporated literature and similar materials differs from or contradicts this specification, including defined terms, term usage, described techniques, or the like, this specification controls. Is done.

Claims (16)

配列番号１を含むヒト重鎖アクセプターフレームワーク。   Human heavy chain acceptor framework comprising SEQ ID NO: 1. 位置１２、１０３、および／または１４４（Ａｈｏナンバリング）にアミノ酸置換を含む、請求項１に記載のヒト重鎖アクセプターフレームワーク。   2. The human heavy chain acceptor framework of claim 1, comprising an amino acid substitution at position 12, 103, and / or 144 (Aho numbering). 前記置換が、
（ａ）位置１２のセリン（Ｓ）、
（ｂ）位置１０３のセリン（Ｓ）またはスレオニン（Ｔ）、及び／または
（ｃ）位置１４４のセリン（Ｓ）またはスレオニン（Ｔ）である、請求項２に記載のヒト重鎖アクセプターフレームワーク。 Said substitution is
(A) serine (S) at position 12,
The human heavy chain acceptor framework of claim 2, wherein (b) serine (S) or threonine (T) at position 103, and / or (c) serine (S) or threonine (T) at position 144. . 請求項１に記載のアクセプターフレームワークをコードする単離された核酸。   An isolated nucleic acid encoding the acceptor framework of claim 1. 請求項４に記載の核酸を含むベクター。   A vector comprising the nucleic acid according to claim 4. 請求項５に記載のベクターを含む宿主細胞。   A host cell comprising the vector of claim 5. 所望の抗原に特異的であるイムノバインダーであって、
（ａ）ウサギ目動物イムノバインダーの可変軽鎖ＣＤＲを含む、軽鎖アクセプターフレームワークと、
（ｂ）ウサギ目動物イムノバインダーの可変重鎖ＣＤＲを含む、請求項１に記載のヒト重鎖アクセプターフレームワークと、を含むイムノバインダー。 An immunobinder specific for the desired antigen,
(A) a light chain acceptor framework comprising a variable light chain CDR of a rabbit eye animal immunobinder;
An immunobinder comprising: (b) the human heavy chain acceptor framework of claim 1 comprising a variable heavy chain CDR of a rabbit eye animal immunobinder. 前記軽鎖アクセプターフレームワークが、配列番号２に対して少なくとも８５％の同一性を有する、請求項７に記載のイムノバインダー。   8. The immunobinder of claim 7, wherein the light chain acceptor framework has at least 85% identity to SEQ ID NO: 2. 前記可変軽鎖フレームワークと前記重鎖アクセプターフレームワークを結合するリンカー配列をさらに含み、前記リンカー配列が配列番号４である、請求項７に記載のイムノバインダー。   The immunobinder according to claim 7, further comprising a linker sequence that connects the variable light chain framework and the heavy chain acceptor framework, wherein the linker sequence is SEQ ID NO: 4. 抗原結合に関与するドナーフレームワーク残基をさらに含む、請求項７に記載のイムノバインダー。   The immunobinder of claim 7, further comprising a donor framework residue involved in antigen binding. 前記イムノバインダーが、ｓｃＦｖ抗体、完全長イムノグロブリン、またはＦａｂフラグメントである、請求項７に記載のイムノバインダー。   The immunobinder according to claim 7, wherein the immunobinder is a scFv antibody, a full-length immunoglobulin, or a Fab fragment. ウサギイムノバインダーをヒト化する方法であって、
（ａ）ドナーウサギイムノバインダーからのＣＤＲ Ｈ１、ＣＤＲ Ｈ２、及びＣＤＲ Ｈ３配列からなる群の少なくとも１つの重鎖ＣＤＲを、請求項１に記載のヒト重鎖アクセプターフレームワークにグラフトすることと、
（ｂ）ドナーウサギイムノバインダーからのＣＤＲ Ｌ１、ＣＤＲ Ｌ２、およびＣＤＲ Ｌ３配列からなる群の少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲを、ヒト軽鎖アクセプターフレームワークにグラフトすることであって、ここで前記軽鎖アクセプターフレームワークが配列番号２に対して少なくとも８５％の同一性を有することと、を含む、前記方法。 A method for humanizing a rabbit immunobinder,
Grafting at least one heavy chain CDR of the group consisting of CDR H1, CDR H2, and CDR H3 sequences from a donor rabbit immunobinder to the human heavy chain acceptor framework of claim 1;
(B) grafting at least one light chain CDR of the group consisting of CDR L1, CDR L2, and CDR L3 sequences from a donor rabbit immunobinder onto a human light chain acceptor framework, wherein The strand acceptor framework has at least 85% identity to SEQ ID NO: 2. 前記ヒト重鎖アクセプターフレームワークおよび前記ヒト軽鎖フレームワークのうちの１つまたは両方の中のフレームワーク残基を、前記ドナーウサギイムノバインダーのフレームワーク残基で置換することをさらに含む、請求項１２に記載の方法。   Further comprising substituting framework residues in one or both of the human heavy chain acceptor framework and the human light chain framework with framework residues of the donor rabbit immunobinder. Item 13. The method according to Item 12. 前記重鎖アクセプターフレームワークが、重鎖アミノ酸位置１２、１０３、および１４４（ＡＨｏナンバリング）のうちの１つ以上に置換を有する、請求項１２に記載の方法。   13. The method of claim 12, wherein the heavy chain acceptor framework has a substitution at one or more of heavy chain amino acid positions 12, 103, and 144 (AHo numbering). 位置１２、１０３、および１４４のうちの１つ以上の前記置換が、
（ａ）位置１２のセリン（Ｓ）、
（ｂ）位置１０３のスレオニン（Ｔ）、及び
（ｃ）位置１４４のスレオニン（Ｔ）、からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。 One or more of the substitutions at positions 12, 103, and 144 is
(A) serine (S) at position 12,
15. The method of claim 14, wherein the method is selected from the group consisting of (b) threonine (T) at position 103, and (c) threonine (T) at position 144. 請求項１２に記載の方法に従ってヒト化されたイムノバインダー。   An immunobinder humanized according to the method of claim 12.
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