JP2016506752A - Acceptor framework for CDR grafting - Google Patents
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Abstract
本発明は、抗体アクセプターフレームワーク、及び良好に適合させた抗体アクセプターフレームワークを使用して非ヒト抗体（例えばウサギ抗体）をグラフトする方法に関する。本発明の方法によって生成された抗体は、多様な診断用適用及び治療用適用に有用である。第１の態様において、本発明は、ジスルフィド架橋がＣＤＲ中に存在するかどうかに非依存的に、異なる結合特異性の多様な抗体からの（特にウサギ抗体からの）ＣＤＲのためのアクセプターとして特に適切な特定のヒト抗体の重鎖可変領域（いわゆる「ａ７２」ＶＨフレームワーク配列）を提供する。【選択図】なしThe present invention relates to antibody acceptor frameworks and methods for grafting non-human antibodies (eg, rabbit antibodies) using well-matched antibody acceptor frameworks. The antibodies produced by the methods of the invention are useful in a variety of diagnostic and therapeutic applications. In a first aspect, the present invention is particularly useful as an acceptor for CDRs from various antibodies (especially from rabbit antibodies) with different binding specificities, independent of whether disulfide bridges are present in the CDRs. Provide the heavy chain variable region of an appropriate specific human antibody (so-called “a72” VH framework sequence). [Selection figure] None
Description
モノクローナル抗体、それらのコンジュゲート及び誘導体は、治療用薬剤及び診断用薬剤として商業上非常に重要である。非ヒト抗体は、通常単一の低用量の注射に続いて、患者において強い免疫反応を誘発する（Ｓｃｈｒｏｆｆ，１９８５ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ４５：８７９−８５，Ｓｈａｗｌｅｒ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９８５ １３５：１５３０−５；Ｄｉｌｌｍａｎ，Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒ １９９４ ９：１７−２８）。したがって、例えば遺伝子導入マウスまたはファージディスプレイを使用して完全ヒト抗体を作製する技術に加えて、マウス及び他のげっ歯類抗体の免疫原性を減少させる複数の方法が開発された。キメラ抗体が操作され、それはヒト定常領域とげっ歯類可変領域を組み合わせたものであり（例えばＢｏｕｌｉａｎｎｅ Ｎａｔｕｒｅ １９８４ ３１２：６４３−６）、免疫原性問題を大幅に減少させる（例えばＬｏＢｕｇｌｉｏ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １９８９ ８６：４２２０−４；Ｃｌａｒｋ，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ ２０００ ２１：３９７−４０２）。ヒト化抗体も操作され、その場合、可変領域それ自体のげっ歯類配列はヒト配列に可能な限り近いが少なくとももとのＣＤＲを維持するように操作されるか、またはげっ歯類抗体からのＣＤＲはヒト抗体のフレームワークの中へグラフトされる（例えばＲｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｎａｔｕｒｅ １９８８ ３３２：３２３−７；ＵＳ５，６９３，７６１）。ウサギポリクローナル抗体は、生物学的アッセイ（ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロット等）のために広く使用される。ポリクローナルウサギ抗体は、通常はるかに高い親和性に起因してポリクローナルげっ歯類抗体よりもしばしば好まれる。さらに、しばしばウサギは、マウスにおいて免疫抗原性の低い抗原及び／またはファージディスプレイにおいて使用された場合に良好な結合物を生じない抗原に対して良好な抗体反応を誘発することができる。ウサギ抗体のこれらの周知の長所に起因して、治療用抗体の探索及び開発において使用されることが理想的だろう。これが一般的には行われない理由は、主にモノクローナルウサギ抗体の生成における技術的な難題のためである。ミエローマ様の腫瘍がウサギにおいて知られていないので、モノクローナル抗体を生成する従来のハイブリドーマ技術はウサギ抗体に適用可能ではない。ウサギ抗体発現細胞のための融合細胞株パートナーの提供に関する先駆的研究は、Ｋｎｉｇｈｔ及び共同研究者（Ｓｐｉｅｋｅｒ−Ｐｏｌｅｔ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ １９９５，９２：９３４８−５２）によって行われ、改善された融合パートナー細胞株は、２００５年にＰｙｔｅｌａ ｅｔ ａｌ．（例えば米国特許第７４２９４８７号を参照）によって記述された。しかしながら、基本的には対応するノウハウが単一の研究グループによって優先されるので、この技術は幅広く広まらない。ＲＴ−ＰＣＲ経由で選択される抗体発現細胞からの抗体のクローニングを含むモノクローナル抗体の生成のための代替方法は、文献中で記載されているが、ウサギ抗体について成功したとは報告されていない。 Monoclonal antibodies, their conjugates and derivatives are of great commercial importance as therapeutic and diagnostic agents. Non-human antibodies elicit a strong immune response in patients, usually following a single low dose injection (Schroff, 1985 Cancer Res 45: 879-85, Shawler. J Immunol 1985 135: 1530-5; Dillman, Cancer Biother 1994 9: 17-28). Thus, in addition to techniques for generating fully human antibodies using, for example, transgenic mice or phage display, multiple methods have been developed to reduce the immunogenicity of mouse and other rodent antibodies. A chimeric antibody has been engineered that combines a human constant region and a rodent variable region (eg, Boulianne Nature 1984 312: 643-6), which greatly reduces immunogenicity problems (eg, LoBuglio, Proc Natl Acad). Sci 1989 86: 4220-4; Clark, Immunol Today 2000 21: 397-402). A humanized antibody is also engineered, in which the variable region itself has a rodent sequence that is as close as possible to the human sequence but is engineered to maintain at least the original CDRs, or from the rodent antibody. CDRs are grafted into the framework of human antibodies (eg Riechmann, Nature 1988 332: 323-7; US 5,693,761). Rabbit polyclonal antibodies are widely used for biological assays (such as ELISA or Western blots). Polyclonal rabbit antibodies are often preferred over polyclonal rodent antibodies, usually due to their much higher affinity. Furthermore, often rabbits can elicit good antibody responses to antigens that are less immunogenic in mice and / or antigens that do not produce good binding when used in phage display. Due to these well-known advantages of rabbit antibodies, it would be ideal to be used in the search and development of therapeutic antibodies. The reason this is not generally done is mainly due to technical challenges in the production of monoclonal rabbit antibodies. Since myeloma-like tumors are not known in rabbits, conventional hybridoma technology to generate monoclonal antibodies is not applicable to rabbit antibodies. Pioneering work on providing fusion cell line partners for rabbit antibody-expressing cells was performed by Knight and co-workers (Spieker-Polet et al., PNAS 1995, 92: 9348-52) and improved fusion partners. The cell line was published in 2005 by Pytela et al. (See, eg, US Pat. No. 7,429,487). However, this technology is not widely spread because basically the corresponding know-how is prioritized by a single research group. Alternative methods for the production of monoclonal antibodies, including the cloning of antibodies from antibody-expressing cells selected via RT-PCR, have been described in the literature but have not been reported as successful for rabbit antibodies.
ウサギ抗体は、マウス抗体と同様に、ヒト治療法のために使用されれば強い免疫応答を誘発すると予想され、したがってウサギ抗体は臨床的に使用する前にヒト化する必要がある。しかしながら、ヒト化げっ歯類抗体の作製に使用される方法は、ウサギ抗体とマウス抗体との間及びそれぞれウサギ抗体とヒト抗体との間の構造的な差異に起因して、ウサギ抗体については容易に推定することができない。例えば、軽鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲＬ３）は、大抵の場合ヒト抗体またはマウス抗体からの従来公知のＣＤＲＬ３よりもはるかに長い。 Rabbit antibodies, like mouse antibodies, are expected to elicit a strong immune response when used for human therapy, and thus rabbit antibodies need to be humanized before clinical use. However, the methods used to make humanized rodent antibodies are easy for rabbit antibodies due to structural differences between rabbit and mouse antibodies and between rabbit and human antibodies, respectively. Cannot be estimated. For example, light chain CDR3 (CDRL3) is often much longer than previously known CDRL3 from human or mouse antibodies.
先行技術中で記載されるウサギ抗体ヒト化アプローチは少数あるが、それは非ヒトドナーのＣＤＲがヒトアクセプター抗体上に移植される古典的なグラフトアプローチではない。ＷＯ０４／０１６７４０はいわゆる「表面再建（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）」戦略を記述する。「表面再建」戦略の目標は、よりヒト様になるように、非ヒトフレームワークの溶媒接近可能な残基をリモデルすることである。ＷＯ０４／０１６７４０中で記載されるように、ウサギ抗体のための類似のヒト化技法は、当技術分野において公知である。ＷＯ０８／１４４７５７及びＷＯ０５／０１６９５０の両方は、ウサギモノクローナル抗体をヒト化する方法を開示し、それは、類似のヒト抗体のアミノ酸配列に対する親のウサギ抗体のアミノ酸配列の比較を含む。続いて、親ウサギ抗体のアミノ酸配列は、そのフレームワーク領域が類似のヒト抗体の同等のフレームワーク領域に配列でより類似するように変更される。良好な結合能力を獲得するために、各々の免疫結合物のためにについて労力を要する開発努力を個別に行なう必要がある。 There are a few rabbit antibody humanization approaches described in the prior art, but it is not a classic grafting approach where non-human donor CDRs are grafted onto a human acceptor antibody. WO 04/016740 describes a so-called “resurfacing” strategy. The goal of the “surface reconstruction” strategy is to remodel non-human framework solvent accessible residues so that they are more human-like. Similar humanization techniques for rabbit antibodies are known in the art, as described in WO 04/016740. Both WO08 / 144757 and WO05 / 016950 disclose methods for humanizing rabbit monoclonal antibodies, which include a comparison of the amino acid sequence of the parent rabbit antibody to that of a similar human antibody. Subsequently, the amino acid sequence of the parent rabbit antibody is altered so that its framework region is more similar in sequence to the equivalent framework region of a similar human antibody. In order to obtain good binding capacity, labor-intensive development efforts need to be made individually for each immunoconjugate.
上述のアプローチの可能性のある問題は、ヒトフレームワークが使用されないが、ウサギフレームワークをよりヒト様になるように操作するということである。かかるアプローチは、タンパク質のコア中に埋没するアミノ酸ストレッチが免疫原性Ｔ細胞エピトープをまだ含み得るというリスクをもたらす。 A possible problem with the above approach is that no human framework is used, but the rabbit framework is manipulated to be more human-like. Such an approach poses the risk that the amino acid stretch embedded in the core of the protein may still contain immunogenic T cell epitopes.
今日まで、本出願人は、最先端技術のグラフトアプローチの適用によってヒト化されたウサギ抗体を同定していない。これは、ウサギＣＤＲがヒトＣＤＲまたはげっ歯類ＣＤＲとはかなり異なり得るという事実によって説明されるだろう。当技術分野において公知であるように、多くのウサギＶＨ鎖はマウス及びヒトのカウンターパートと比較して余剰のペアのシステインを有する。ｃｙｓ２２とｃｙｓ９２との間に形成される保存されたジスルフィド架橋に加えて、ｃｙｓ２１−ｃｙｓ７９架橋、そしていくつかのウサギ鎖においてＣＤＲ Ｈ１の最後の残基とＣＤＲ Ｈ２の第１の残基との間に形成されるＣＤＲ間Ｓ−Ｓ架橋もある。その他に、ペアのシステイン残基は、多くの場合ＣＤＲ−Ｌ３中で見出される。さらに、多くのウサギ抗体ＣＤＲはいかなる従来公知の標準構造にも属さない。特に、ＣＤＲ−Ｌ３は、大抵の場合ヒトまたはマウスのカウンターパートのＣＤＲ−Ｌ３よりもはるかに長い。 To date, the Applicant has not identified a rabbit antibody that has been humanized by application of a state of the art grafting approach. This will be explained by the fact that rabbit CDRs can be quite different from human or rodent CDRs. As is known in the art, many rabbit VH chains have an extra pair of cysteines compared to mouse and human counterparts. In addition to the conserved disulfide bridge formed between cys22 and cys92, the cys21-cys79 bridge, and between the last residue of CDR H1 and the first residue of CDR H2 in some rabbit chains There are also S—S bridges between CDRs formed in In addition, pairs of cysteine residues are often found in CDR-L3. Furthermore, many rabbit antibody CDRs do not belong to any conventionally known standard structure. In particular, CDR-L3 is often much longer than human or mouse counterpart CDR-L3.
したがって、ヒトフレームワークの中への非ヒトＣＤＲ抗体のグラフトは、タンパク質工学の主要な課題である。自然に進化したフレームワークから異なる人為的に選択されたヒトフレームワークへの抗原結合ループの移行は、天然のループのコンフォメーションが抗原結合のために保持されるように、実行されなくてはならない。多くの場合、抗原結合親和性は、ループグラフト後に大幅に減少するかまたは消失する。抗原結合ループのグラフトにおける慎重に選択されたヒトフレームワークの使用は、ヒト化分子における結合親和性を保持する可能性を最大化する（Ｒｏｇｕｚｋａ ｅｔ ａｌ １９９６）。文献で入手可能な多くのグラフト実験はＣＤＲグラフトのための大まかな指針を提供するが、パターンを一般化することは可能ではない。典型的な問題は、ＣＤＲループのグラフト後に特異性、安定性または生産可能性を失うことである。 Therefore, grafting of non-human CDR antibodies into the human framework is a major challenge in protein engineering. Transition of the antigen binding loop from a naturally evolved framework to a different artificially selected human framework must be performed so that the conformation of the natural loop is preserved for antigen binding . In many cases, antigen binding affinity is significantly reduced or lost after loop grafting. The use of carefully selected human frameworks in the grafting of antigen binding loops maximizes the possibility of retaining binding affinity in humanized molecules (Roguzka et al 1996). Although many grafting experiments available in the literature provide rough guidance for CDR grafting, it is not possible to generalize the pattern. A typical problem is loss of specificity, stability or productivity after grafting of CDR loops.
したがって、治療用薬剤及び診断用薬剤としての使用のためのウサギ抗体を確実かつ迅速にヒト化する改善された方法について緊急の必要性がある。さらに、確実にウサギ抗体をヒト化し、薬剤様の生物物理的特性を備えた機能的な抗体及び／または抗体断片を提供する、ヒトアクセプターフレームワークのための必要性がある。 Therefore, there is an urgent need for improved methods for reliably and rapidly humanizing rabbit antibodies for use as therapeutic and diagnostic agents. Furthermore, there is a need for a human acceptor framework that reliably humanizes rabbit antibodies and provides functional antibodies and / or antibody fragments with drug-like biophysical properties.
品質管理（ＱＣ）アッセイ（ＷＯ０１４８０１７及びＡｕｆ ｄｅｒ Ｍａｕｒ ｅｔ ａｌ（２００１），ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ５０８，ｐ．４０７−４１２中で開示されるような）によって同定された高度に可溶性及び安定性のあるヒト抗体フレームワークが、他の非ヒト動物種からのＣＤＲ（例えばウサギＣＤＲ）の順応のために特に好適であることが意外にも見出された。したがって、第１の態様において、本発明は、ジスルフィド架橋がＣＤＲ中に存在するかどうかに非依存的に、異なる結合特異性の多様な抗体からの（特にウサギ抗体からの）ＣＤＲのためのアクセプターとして特に適切な特定のヒト抗体の重鎖可変領域（いわゆる「ａ７２」ＶＨフレームワーク配列）を提供する。 Highly soluble and stable human antibody frames identified by quality control (QC) assays (as disclosed in WO0148017 and Auf der Maur et al (2001), FEBS Lett 508, p. 407-412) It has been surprisingly found that the work is particularly suitable for the adaptation of CDRs (eg rabbit CDRs) from other non-human animal species. Thus, in a first aspect, the invention provides an acceptor for CDRs from various antibodies (especially from rabbit antibodies) with different binding specificities, independent of whether disulfide bridges are present in the CDRs. As a particularly suitable human antibody heavy chain variable region (so-called “a72” VH framework sequence).
この高度に適合性のある可変的な鎖フレームワークの中へのウサギＣＤＲのグラフトによって一貫かつ確実に生成されるヒト化免疫結合物は、ドナーＣＤＲが由来するウサギ抗体の空間的方向性を保持する。したがって、ドナー免疫結合物の構造的に関連する位置をアクセプターフレームワークの中へ導入する必要はない。これらの長所に起因して、結合能力の至適化がほとんどないかまたはないウサギ抗体のハイスループットヒト化を達成することができる。 A humanized immunoconjugate produced consistently and reliably by grafting rabbit CDRs into this highly compatible variable chain framework retains the spatial orientation of the rabbit antibody from which the donor CDRs are derived. To do. Thus, there is no need to introduce structurally related positions of the donor immune conjugate into the acceptor framework. Due to these advantages, high-throughput humanization of rabbit antibodies with little or no optimization of binding ability can be achieved.
したがって、別の態様において、本発明は、ウサギ及び他の非ヒトＣＤＲを本明細書において開示されるヒト抗体フレームワーク配列の可溶性及び安定性のある軽鎖及び／または重鎖の中へグラフトし、それによって優れた生物物理的特性を備えたヒト化抗体を生成する方法を提供する。特に、本発明の方法によって生成された免疫結合物は優れた機能的特性（可溶性及び安定性等）を示す。 Accordingly, in another aspect, the present invention grafts rabbits and other non-human CDRs into the soluble and stable light and / or heavy chains of the human antibody framework sequences disclosed herein. , Thereby providing a method for producing humanized antibodies with superior biophysical properties. In particular, the immunoconjugate produced by the method of the present invention exhibits excellent functional properties (such as solubility and stability).
定義
本発明をより容易に理解するために、特定の用語を以下の通り定義する。追加の定義は「発明の概要」を通して説明される。
Definitions For easier understanding of the present invention, certain terms are defined as follows. Additional definitions are set forth through the Summary of the Invention.
「抗体」という用語は抗体全体及び任意の抗原結合断片を指す。「抗原結合ポリペプチド」及び「免疫結合物」という用語は本明細書において同時に使用される。「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む、任意で糖鎖付加されるタンパク質またはその抗原結合部分を指す。各々の重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨと本明細書において省略される）及び重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）からなる。各々の軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬと本明細書において省略される）及び軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は１つのドメイン（ＣＬ）からなる。ＶＨ及びＶＬの領域は、より保存された領域（フレームワーク領域（ＦＲ）と称される）が散在する超可変性の領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される）へとさらに細分することができる。各々のＶＨ及びＶＬは、以下の順序、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４でアミノ末端からカルボキシ末端までアレンジされる３つのＣＤＲ及び４つのＦＲからなる。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えばエフェクター細胞）及び古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む、宿主組織または因子に対する免疫グロブリンの結合を媒介することができる。 The term “antibody” refers to whole antibodies and any antigen-binding fragment. The terms “antigen-binding polypeptide” and “immunoconjugate” are used simultaneously herein. “Antibody” refers to an optionally glycosylated protein or antigen-binding portion thereof comprising at least two heavy (H) chains and two light (L) chains interconnected by disulfide bonds. Each heavy chain is comprised of a heavy chain variable region (abbreviated herein as V H ) and a heavy chain constant region. The heavy chain constant region is comprised of three domains (CH1, CH2 and CH3). Each light chain is comprised of a light chain variable region (abbreviated herein as VL ) and a light chain constant region. The light chain constant region is comprised of one domain (CL). V H and V L regions are further converted into hypervariable regions (called complementarity determining regions (CDRs)) interspersed with more conserved regions (called framework regions (FR)) Can be subdivided. Each VH and VL consists of three CDRs and four FRs arranged in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 from the amino terminus to the carboxy terminus. The variable region of the heavy and light chains contains a binding domain that interacts with an antigen. The constant region of the antibody can mediate immunoglobulin binding to host tissues or factors, including various cells of the immune system (eg, effector cells) and the first component of the classical complement system (C1q).
抗体の「抗原結合部分」（または単純に「抗体部分」）という用語は、抗原（例えばＴＮＦ）に特異的に結合する能力を保持する、１つまたは複数の抗体の断片を指す。全長抗体の断片によって抗体の抗原結合機能を実行することができることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語内に包含される結合断片の例には、（ｉ）Ｆａｂ断片（ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインから成る一価断片）；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片（ヒンジ領域でのジスルフィド架橋によって連結される２つのＦａｂ断片を含む二価断片）；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１のドメインから成るＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単腕のＶＬ及びＶＨのドメインから成るＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインから成る、単一ドメインまたはｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６）；及び（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）または（ｖｉｉ）合成リンカーによって任意で連結することができる２つ以上の単離されたＣＤＲの組み合わせが含まれる。さらに、Ｆｖ断片（ＶＬ及びＶＨ）の２つのドメインは分離した遺伝子によってコードされるが、ＶＬ及びＶＨの領域がペアになって一価分子を形成する単一タンパク質鎖（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知；例えばＢｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６；及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３）を参照）として作製されることを可能にする合成リンカーによって、組換え法を使用して、連結することができる。かかる単一の鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」という用語内に包含されることが意図される。これらの抗体断片は当業者に公知の従来の技法を使用して得られ、断片はインタクトな抗体と同じ様式で有用性についてスクリーニングされる。抗原結合部分は、組み換えＤＮＡ技法またはインタクトな免疫グロブリンの酵素切断もしくは化学切断によって生産することができる。抗体は、異なるアイソタイプ、例えばＩｇＧ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ抗体であり得る。 The term “antigen-binding portion” (or simply “antibody portion”) of an antibody refers to a fragment of one or more antibodies that retain the ability to specifically bind to an antigen (eg, TNF). It has been shown that the antigen-binding function of an antibody can be performed by fragments of a full-length antibody. Examples of binding fragments encompassed within the term “antigen-binding portion” of an antibody include (i) Fab fragments (monovalent fragments consisting of V L , V H , CL and CH1 domains); (ii) F (ab ') Two fragments (a divalent fragment comprising two Fab fragments linked by a disulfide bridge at the hinge region); (iii) an Fd fragment consisting of V H and CH1 domains; (iv) a single arm VL of the antibody And an Fv fragment consisting of the domain of VH , (v) a single domain or dAb fragment consisting of the VH domain (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546); and (vi) isolated Included are combinations of two or more isolated CDRs that can optionally be linked by a complementarity determining region (CDR) or (vii) synthetic linker. In addition, the two domains of the Fv fragment (V L and V H ) are encoded by separate genes, but the V L and V H regions pair to form a single protein chain (single chain). Known as chain Fv (scFv); see, for example, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). Recombinant methods can be used to link by synthetic linkers that allow them to be made. Such single chain antibodies are also intended to be encompassed within the term “antigen-binding portion” of an antibody. These antibody fragments are obtained using conventional techniques known to those skilled in the art, and the fragments are screened for utility in the same manner as intact antibodies. Antigen binding moieties can be produced by recombinant DNA techniques or by enzymatic or chemical cleavage of intact immunoglobulins. The antibody can be a different isotype, eg, an IgG (eg, IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 subtype), IgA1, IgA2, IgD, IgE, or IgM antibody.
「免疫結合物」という用語は、免疫結合物が標的の抗原を特異的に認識するように、抗体の抗原結合部位のすべてまたは一部（例えば重鎖及び／または軽鎖の可変ドメインのすべてまたは一部）を含有する分子を指す。免疫結合物の非限定的例には、全長免疫グロブリン分子及びｓｃＦｖに加えて、（ｉ）Ｆａｂ断片（ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインから成る一価断片）；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片（ヒンジ領域でのジスルフィド架橋によって連結される２つのＦａｂ断片を含む二価断片）；（ｉｉｉ）Ｆａｂ’断片（本質的にはヒンジ領域の一部を備えたＦａｂ）（ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（Ｐａｕｌ ｅｄ．，３．ｓｕｐ．ｒｄ ｅｄ．１９９３））を参照）；（ｉｖ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインから成るＦｄ断片；（ｖ）抗体の単腕のＶＬ及びＶＨのドメインから成るＦｖ断片、（ｖｉ）単一ドメイン抗体（ＶＨまたはＶＬドメインから成るＤａｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６）、ラクダ科からの抗体（Ｃａｍｅｌｉｄ）（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６３：４４６−４４８（１９９３）及びＤｕｍｏｕｌｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ １１：５００−５１５（２００２）を参照）、またはサメ抗体（例えばサメＩｇ−ＮＡＲナノボディ（登録商標））等）；及び（ｖｉｉ）ナノボディ（単一の可変ドメインを含有する重鎖可変領域及び２つの定常ドメイン）を含むが、これらに限定されない抗体断片が含まれる。 The term “immunoconjugate” refers to all or part of an antigen binding site of an antibody (eg, all or all of the variable domains of heavy and / or light chains) such that the immunoconjugate specifically recognizes the target antigen. Refers to a molecule containing (part). Non-limiting examples of immunoconjugates include, in addition to full length immunoglobulin molecules and scFv, (i) Fab fragments (monovalent fragments consisting of V L , V H , C L and C H 1 domains); (ii) F (ab ′) 2 fragment (a divalent fragment comprising two Fab fragments linked by a disulfide bridge at the hinge region); (iii) Fab ′ fragment (Fab essentially with part of the hinge region) (See FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul ed., 3. sup.rd ed. 1993))); (iv) Fd fragment consisting of V H and C H 1 domains; (v) Single arm VL and V H of antibody Fv fragment consisting of the domain, (vi) Dab fragment consisting of a single domain antibody (V H or V L domains (Ward et al, (1989) Nature 341:. 5 4-546), antibodies from camelids (Camelid) (Hamers-Casterman, et al., Nature 363: 446-448 (1993) and Dumoulin, et al., Protein Science 11: 500-515 (2002)). ), Or shark antibodies (such as shark Ig-NAR Nanobodies®); and (vii) nanobodies (heavy chain variable region containing a single variable domain and two constant domains), Non-limiting antibody fragments are included.
「単一鎖抗体」、「単一鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」という用語は、リンカーによって接続された抗体重鎖可変ドメイン（または領域；ＶＨ）及び抗体軽鎖可変ドメイン（または領域；ＶＬ）を含む分子を指す。かかるｓｃＦｖ分子は、以下の一般構造、ＮＨ２−ＶＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＯＯＨまたはＮＨ２−ＶＨ−リンカー−ＶＬ−ＣＯＯＨを有することができる。適切な最先端技術のリンカーは反復ＧＧＧＧＳアミノ酸配列またはそのバリアントから成る。本発明の好ましい実施形態において、配列番号：８中で記載されるアミノ酸配列の（ＧＧＧＧＳ）４リンカーが使用されるが、１〜３の反復のバリアントも可能である（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８）。本発明のために使用することができる他のリンカーは、Ａｌｆｔｈａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８：７２５−７３１、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：９４−１０６、Ｈｕ ｅｔ ａｌ．（１９９６），Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：３０５５−３０６１、Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．（１９９９），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：４１−５６及びＲｏｏｖｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌによって記述される。 The terms “single chain antibody”, “single chain Fv” or “scFv” refer to an antibody heavy chain variable domain (or region; V H ) and an antibody light chain variable domain (or region; V L ) connected by a linker. ). Such scFv molecules can have the following general structure: NH 2 -V L -linker-V H -COOH or NH 2 -V H -linker -V L -COOH. Suitable state-of-the-art linkers consist of repetitive GGGGS amino acid sequences or variants thereof. In a preferred embodiment of the present invention, a (GGGGS) 4 linker of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8 is used, although variants with 1 to 3 repeats are possible (Holliger et al. (1993). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448). Other linkers that can be used for the present invention are described in Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8: 725-731, Choi et al. (2001), Eur. J. et al. Immunol. 31: 94-106, Hu et al. (1996), Cancer Res. 56: 3055-3061, Kipriyanov et al. (1999), J. et al. Mol. Biol. 293: 41-56 and Roovers et al. (2001), Cancer Immunol.
本明細書において使用されるとき、「機能的特性」という用語は、例えば、ポリペプチドの製造特性または治療有効性を改善するために、改善（例えば従来のポリペプチドと比較して）が、当業者に所望される及び／または有利であるポリペプチド（例えば免疫結合物）の特性である。一実施形態において、機能的特性は安定性（例えば熱安定性）である。別の実施形態において、機能的特性は可溶性（例えば細胞条件下で）である。さらに別の実施形態において、機能的特性は凝集挙動である。さらになお別の実施形態において、機能的特性はタンパク質発現（例えば原核生物細胞中の）である。さらに別の実施形態において、機能的特性は製造プロセスにおける封入体可溶化に続く再折畳み挙動である。特定の実施形態において、機能的特性は抗原結合親和性における改善ではない。別の好ましい実施形態において、１つまたは複数の機能的特性の改善は免疫結合物の結合親和性に対する実質的効果を有していない。 As used herein, the term “functional property” refers to an improvement (eg, compared to a conventional polypeptide), eg, to improve the manufacturing properties or therapeutic efficacy of a polypeptide. A property of a polypeptide (eg, an immunoconjugate) that is desirable and / or advantageous to a vendor. In one embodiment, the functional property is stability (eg, thermal stability). In another embodiment, the functional property is soluble (eg, under cellular conditions). In yet another embodiment, the functional property is agglomeration behavior. In still yet another embodiment, the functional property is protein expression (eg, in prokaryotic cells). In yet another embodiment, the functional property is refolding behavior following inclusion body solubilization in the manufacturing process. In certain embodiments, the functional property is not an improvement in antigen binding affinity. In another preferred embodiment, the improvement in one or more functional properties has no substantial effect on the binding affinity of the immunoconjugate.
「ＣＤＲ」という用語は、主に抗原結合に寄与する抗体の可変ドメイン内の６つの超可変領域のうちの１つを指す。６つのＣＤＲについての最も一般的には使用される定義の１つは、Ｋａｂａｔ Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ．ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１−３２４２によって提供された。本明細書において使用される時、ＫａｂａｔのＣＤＲの定義は、軽鎖可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３（ＣＤＲ Ｌ１、ＣＤＲ Ｌ２、ＣＤＲ Ｌ３またはＬ１、Ｌ２、Ｌ３）に加えて、重鎖可変ドメインのＣＤＲ２及びＣＤＲ３（ＣＤＲ Ｈ２、ＣＤＲ Ｈ３またはＨ２、Ｈ３）についてだけ適用される。しかしながら本明細書において使用される時、重鎖可変ドメインのＣＤＲ１（ＣＤＲ Ｈ１またはＨ１）は、位置２６で開始し位置３６の前に終了する残基位置（Ｋａｂａｔのナンバリング）によって定義される。この定義は、基本的にＫａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａによって異なって定義されるようなＣＤＲ Ｈ１の融合である（図示については図１も参照）。 The term “CDR” refers to one of six hypervariable regions within the variable domain of an antibody that primarily contribute to antigen binding. One of the most commonly used definitions for the six CDRs is Kabat E.I. A. et al. (1991) Sequences of proteins of immunological interest. Provided by NIH Publication 91-3242. As used herein, the Kabat CDR definition includes the CDR1, CDR2 and CDR3 (CDR L1, CDR L2, CDR L3 or L1, L2, L3) light chain variable domains as well as the heavy chain variable domains. Only applicable for CDR2 and CDR3 (CDR H2, CDR H3 or H2, H3). However, as used herein, the heavy chain variable domain CDR1 (CDR H1 or H1) is defined by the residue position (Kabat numbering) starting at position 26 and ending before position 36. This definition is basically a fusion of CDR H1 as defined differently by Kabat and Chothia (see also FIG. 1 for illustration).
本明細書において使用される時、「抗体フレームワーク」という用語は、この可変ドメインの抗原結合ループ（ＣＤＲ）のためにスキャフォールドとして役立つ可変ドメイン（ＶＬまたはＶＨのいずれか）の一部を指す。基本的には、それはＣＤＲなしの可変ドメインである。 As used herein, the term “antibody framework” refers to the part of a variable domain (either VL or VH) that serves as a scaffold for the antigen binding loop (CDR) of this variable domain. . Basically it is a variable domain without CDRs.
「エピトープ」または「抗原決定基」という用語は、免疫グロブリンまたは抗体が特異的に結合する抗原上の部位（例えばＴＮＦ分子上の特異的部位）を指す。エピトープは典型的には独特の空間的なコンフォメーションで少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５の連続または非連続のアミノ酸を含む。例えばＥｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６，Ｇ．Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅｄ．（１９９６）を参照されたい。 The term “epitope” or “antigenic determinant” refers to a site on an antigen to which an immunoglobulin or antibody specifically binds (eg, a specific site on a TNF molecule). An epitope typically includes at least 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 or 15 consecutive or non-contiguous amino acids in a unique spatial conformation. For example, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G.M. E. Morris, Ed. (1996).
「特異的結合」、「選択的結合」、「選択的に結合する」及び「特異的に結合する」という用語は、既定の抗原上のエピトープへの抗体の結合を指す。典型的には、抗体は、およそ１０−７Ｍ未満（およそ１０−８Ｍ、１０−９Ｍもしくは１０−１０Ｍ未満またはさらに低い等）の親和性（ＫＤ）で結合する。 The terms “specific binding”, “selective binding”, “selectively bind” and “specifically bind” refer to the binding of an antibody to an epitope on a given antigen. Typically, the antibody binds with an affinity (K D ) of less than about 10 −7 M (such as about 10 −8 M, 10 −9 M or less than 10 −10 M or even lower).
「ＫＤ」または「Ｋｄ」という用語は特定の抗体−抗原相互作用の持続的な解離平衡を指す。典型的には、本発明の抗体は、例えばＢＩＡＣＯＲＥ装置において表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を使用して決定されるように、およそ１０−７Ｍ未満（およそ１０−８Ｍ、１０−９Ｍもしくは１０−１０Ｍ未満またはさらに低い等）の解離平衡定数（ＫＤ）でＴＮＦに結合する。 The term “K D ” or “Kd” refers to the persistent dissociation equilibrium of a particular antibody-antigen interaction. Typically, an antibody of the invention is less than about 10 −7 M (approximately 10 −8 M, 10 −9 M or about 10 μM , as determined using, for example, surface plasmon resonance (SPR) technology in a BIACORE instrument. It binds to TNF with a dissociation equilibrium constant (K D ) of less than 10 −10 M or even lower.
本明細書において使用されるとき、「核酸分子」という用語はＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子を指す。核酸分子は一本鎖または二本鎖であり得るが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。別の核酸配列と機能的関係へと配置される場合、核酸は「作動可能に連結される」。例えば、プロモーターまたはエンハンサーが配列の転写に影響するならば、コード配列に作動可能に連結される。 As used herein, the term “nucleic acid molecule” refers to DNA and RNA molecules. The nucleic acid molecule can be single-stranded or double-stranded, but preferably is double-stranded DNA. Nucleic acids are “operably linked” when placed into a functional relationship with another nucleic acid sequence. For example, a promoter or enhancer is operably linked to a coding sequence if it affects the transcription of the sequence.
「ベクター」という用語は、それが連結された別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。一実施形態において、ベクターは「プラスミド」であり、追加のＤＮＡセグメントをライゲーションできる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の実施形態において、ベクターはウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントをウイルスゲノムの中へライゲーションできる。本明細書において開示されるベクターは、それらが導入される宿主細胞中で自律複製が可能であり得るか（例えば細菌複製起点を有する細菌ベクター、及びエピソーム哺乳類ベクター）、または宿主細胞の中への導入に際して宿主細胞のゲノムの中へ組み込むことができ、それによって宿主ゲノムと共に複製される（例えば非エピソーム哺乳類ベクター）。 The term “vector” refers to a nucleic acid molecule capable of transporting another nucleic acid to which it has been linked. In one embodiment, the vector is a “plasmid” and refers to a circular double stranded DNA loop into which additional DNA segments can be ligated. In another embodiment, the vector is a viral vector and additional DNA segments can be ligated into the viral genome. The vectors disclosed herein may be capable of autonomous replication in a host cell into which they are introduced (eg, bacterial vectors having a bacterial origin of replication and episomal mammalian vectors) or into a host cell. Upon introduction, it can be integrated into the genome of the host cell, thereby replicating with the host genome (eg, a non-episomal mammalian vector).
「宿主細胞」という用語は、発現ベクターが導入される細胞を指す。宿主細胞には、細菌細胞、微生物細胞、植物細胞または動物細胞、好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣株）細胞またはＮＳ0細胞が含まれる。 The term “host cell” refers to a cell into which an expression vector has been introduced. Host cells include bacterial cells, microbial cells, plant cells or animal cells, preferably Escherichia coli, Bacillus subtilis; Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, CHO (Chinese hamster ovary strain) cells or NS0 cells.
「ウサギ目の動物」という用語は、科Ｌｅｐｏｒｉｄａｅ（例えば野ウサギ及びウサギ）及びＯｃｈｏｔｏｎｉｄａｅ（ナキウサギ）を含む分類学上の目Ｌａｇｏｍｏｒｐｈａのメンバーを指す。最も好ましい実施形態において、ウサギ目の動物はウサギである。本明細書において使用される時、「ウサギ」という用語はＬｅｐｏｒｉｄａｅ科に属する動物を指す。 The term “Rabbit's animal” refers to members of the taxonomic eye Lagomorpha, including the families Leporidae (eg, hares and rabbits) and Ochotonidae (pears). In the most preferred embodiment, the animal of the order Rabbit is a rabbit. As used herein, the term “rabbit” refers to an animal belonging to the family Leporidae.
本明細書において使用されるとき、「同一性」は、２つのポリペプチド、分子または核酸の間の配列マッチングを指す。２つの比較される配列の両方中の位置が同じ塩基またはアミノ酸モノマーサブユニットによって占められる場合（例えば各々の２つのポリペプチド中の位置がリジンによって占められるならば）、その時それぞれの分子はその位置で同一である。２つの配列の間の「パーセンテージ同一性」は、２つの配列の最適なアライメントのために導入される必要のあるギャップの数及び各々のギャップの長さを考慮に入れて、配列が共有する同一の位置の数の関数である。一般的に、２つの配列がアライメントされる場合に最大の同一性を与えるように比較される。かかるアライメントは、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、ならびに１６、１４、１２、１０、８、６または４のギャップウェイト及び１、２、３、４、５または６の長さウェイトを使用して、例えばＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰのプログラムの中へ組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４−４５３（１９７０））アルゴリズムの方法を使用して提供することができる。 As used herein, “identity” refers to sequence matching between two polypeptides, molecules or nucleic acids. If a position in both of the two compared sequences is occupied by the same base or amino acid monomer subunit (eg, if a position in each of the two polypeptides is occupied by lysine) then each molecule is at that position Are the same. “Percent identity” between two sequences is the identity shared by the sequences, taking into account the number of gaps that need to be introduced for optimal alignment of the two sequences and the length of each gap. Is a function of the number of positions. In general, two sequences are compared to give the greatest identity when aligned. Such an alignment uses either a Blossum 62 matrix or a PAM250 matrix and a gap weight of 16, 14, 12, 10, 8, 6 or 4 and a length weight of 1, 2, 3, 4, 5 or 6. For example, using the method of the Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970)) algorithm incorporated into the GAP program in the GCG software package. .
特別に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される同じ意味を有する。本発明の実践または試験において、本明細書において記述されたものに類似または同等の方法及び材料を使用することができるが、適切な方法及び材料が下記に述べられる。矛盾する事例において、定義を含む本明細書が優先されるだろう。加えて、材料、方法、及び例は、単に説明的なものであり、限定を意図したものではない。 Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. Although methods and materials similar or equivalent to those described herein can be used in the practice or testing of the present invention, suitable methods and materials are described below. In case of conflict, the present specification, including definitions, will control. In addition, the materials, methods, and examples are illustrative only and not intended to be limiting.
本発明の様々な態様を以下のサブセクション中でさらに詳細に記載する。様々な実施形態、優先性及び範囲が随意に組み合わせられることが理解される。さらに、特異的実施形態に応じて、選択された定義、実施形態または範囲を適用しなくてもよい。 Various aspects of the invention are described in further detail in the following subsections. It is understood that the various embodiments, preferences and ranges can be combined arbitrarily. Further, depending on the specific embodiment, selected definitions, embodiments or ranges may not apply.
特別に明示されないならば、アミノ酸位置はＡＨｏナンバリングスキームに従って示される。ＡＨｏナンバリングシステムは、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ，Ａ．ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．（２００１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０９：６５７−６７０中でさらに記載されている。あるいは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２）中でさらに記載されるようなＫａｂａｔナンバリングシステムを使用することができる。抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域中のアミノ酸残基位置の同定に使用される、２つの異なるナンバリングシステムについての換算表は、Ａ．Ｈｏｎｅｇｇｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０９（２００１）６５７−６７０中で提供される。 Unless specified otherwise, amino acid positions are indicated according to the AHo numbering scheme. The AHo numbering system is described by Honegger, A .; and Pluckthun, A .; (2001) J. Org. Mol. Biol. 309: 657-670. Alternatively, Kabat et al. (As described in Kabat, EA, et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, NIH Public. A unique Kabat numbering system can be used. A conversion table for the two different numbering systems used to identify amino acid residue positions in the heavy and light chain variable regions of antibodies is given in A.C. Honegger, J .; Mol. Biol. 309 (2001) 657-670.
第１の態様において、本発明は、ウサギ目の動物種（例えばウサギ）からのＣＤＲのグラフトのためのヒトアクセプターフレームワーク配列を提供する。ヒト一本鎖ＶＨフレームワークａ７２（配列番号：１）は、意外にもウサギ抗体の抗原結合部位と基本的には非常に適合性のあることが見出された。したがって、ａ７２ ＶＨは、ウサギループのグラフトに由来した安定性のあるヒト化ｓｃＦｖ抗体断片の構築に適切なスキャフォールドを表わす。 In a first aspect, the present invention provides a human acceptor framework sequence for grafting of CDRs from a Rabbit species (eg, rabbit). The human single chain VH framework a72 (SEQ ID NO: 1) was surprisingly found to be basically very compatible with the antigen binding site of the rabbit antibody. Thus, a72 VH represents a suitable scaffold for the construction of stable humanized scFv antibody fragments derived from rabbit loop grafts.
したがって、一態様において、本発明は、配列番号：１と少なくとも７０％の同一性を有するＶＨ配列を含む免疫結合物アクセプターフレームワークを提供する。 Accordingly, in one aspect, the invention provides an immunoconjugate acceptor framework comprising a VH sequence having at least 70% identity with SEQ ID NO: 1.
前記配列は他の適切な可変軽鎖と組み合わせることができる。好ましい可変軽鎖は、ＷＯ０３／０９７６９７中で開示されＫＩ２７と表記される配列番号：２、またはＷＯ０３／０９７６９７中で開示されるような他のＶＬ配列である。 Said sequence can be combined with other suitable variable light chains. A preferred variable light chain is SEQ ID NO: 2, disclosed in WO 03/097697 and designated KI27, or other VL sequences as disclosed in WO 03/097697.
好ましい実施形態において、可変重鎖フレームワークはリンカー経由で可変軽鎖フレームワークに連結される。リンカーは、任意の適切なリンカー、例えば配列ＧＧＧＧＳ（配列番号：５）の１〜４の反復を含むリンカー、好ましくは（ＧＧＧＧＳ）４ペプチド（配列番号：４）、またはＡｌｆｔｈａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８：７２５−７３１中で開示されるようなリンカーであり得る。 In a preferred embodiment, the variable heavy chain framework is linked to the variable light chain framework via a linker. The linker can be any suitable linker, for example a linker comprising 1 to 4 repeats of the sequence GGGGS (SEQ ID NO: 5), preferably (GGGGGS) 4 peptide (SEQ ID NO: 4), or Alfthan et al. (1995) Protein Eng. 8: 725-731 can be a linker as disclosed.
したがって、本発明は、
（ｉ）配列番号：１と少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、より好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する可変重鎖フレームワーク；及び／または
（ｉｉ）配列番号：２と少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、より好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する可変軽鎖フレームワーク
を含む、免疫結合物アクセプターフレームワークを提供する。
Therefore, the present invention
(I) a variable heavy chain framework having at least 70% identity to SEQ ID NO: 1, preferably at least 75%, 80%, 85%, 90%, more preferably at least 95% identity; and / or (Ii) an immunity comprising a variable light chain framework having at least 70% identity, preferably at least 75%, 80%, 85%, 90%, more preferably at least 95% identity with SEQ ID NO: 2. Provide a binder acceptor framework.
より好ましい実施形態において、本発明は、配列番号：３と少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％の同一性を備えた配列を有する免疫結合物を提供する。 In a more preferred embodiment, the invention provides a sequence with at least 60%, more preferably at least 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% identity with SEQ ID NO: 3. An immunoconjugate having is provided.
フレームワークは実質的には任意のウサギＣＤＲと適合性がある。異なるウサギＣＤＲを含有しても、ウサギ野生型一本鎖とは異なって良好に発現され良好に生産され、もとのドナーウサギ抗体の親和性をほとんど完全に保持する。 The framework is compatible with virtually any rabbit CDR. Even if it contains different rabbit CDRs, it is well expressed and well produced, unlike rabbit wild type single chains, and retains the affinity of the original donor rabbit antibody almost completely.
本明細書において記載されるような免疫結合物アクセプターフレームワークは、重鎖フレームワーク中の好ましくは位置１２、１０３及び１４４（ＡＨｏナンバリング）で、可溶性を促進する置換を含むことができる。好ましくは、疎水性アミノ酸はより親水性のアミノ酸によって置換される。親水性アミノ酸は、例えばアルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、セリン（Ｓ）及びスレオニン（Ｔ）である。より好ましくは、重鎖フレームワークは、（ａ）位置１２でのセリン（Ｓ）；（ｂ）位置１０３でのセリン（Ｓ）もしくはスレオニン（Ｔ）及び／または（ｃ）位置１４４でのセリン（Ｓ）もしくはスレオニン（Ｔ）を含む。 The immunoconjugate acceptor framework as described herein can include substitutions that promote solubility, preferably at positions 12, 103 and 144 (AHo numbering) in the heavy chain framework. Preferably, the hydrophobic amino acid is replaced by a more hydrophilic amino acid. Examples of hydrophilic amino acids include arginine (R), asparagine (N), aspartic acid (D), glutamine (Q), glycine (G), histidine (H), lysine (K), serine (S) and threonine (T ). More preferably, the heavy chain framework comprises (a) serine (S) at position 12; (b) serine (S) or threonine (T) at position 103 and / or (c) serine at position 144 ( S) or threonine (T).
さらに、安定性を促進するアミノ酸は、可変軽鎖フレームワークの１つまたは複数の位置１、３、４、１０、４７、５７、９１及び１０３（ＡＨｏナンバリング）で存在し得る。より好ましくは、可変軽鎖フレームワークは、位置１でのグルタミン酸（Ｅ）、位置３でのバリン（Ｖ）、位置４でのロイシン（Ｌ）、位置１０でのセリン（Ｓ）；位置４７でのアルギニン（Ｒ）、位置５７でのセリン（Ｓ）、位置９１でのフェニルアラニン（Ｆ）及び／または位置１０３でのバリン（Ｖ）を含む。 In addition, amino acids that promote stability may be present at one or more positions 1, 3, 4, 10, 47, 57, 91 and 103 (AHo numbering) of the variable light chain framework. More preferably, the variable light chain framework is glutamic acid at position 1 (E), valine at position 3 (V), leucine at position 4 (L), serine at position 10 (S); Arginine (R), serine (S) at position 57, phenylalanine (F) at position 91 and / or valine (V) at position 103.
グルタミン（Ｑ）は脱アミノ化（ｄｅｓａｍｉｎａｔｉｏｎ）の傾向があるので、別の好ましい実施形態において、ＶＨは位置１４１でのグリシン（Ｇ）を含む。この置換は、タンパク質の長期保存を改善し得る。 In another preferred embodiment, VH comprises glycine (G) at position 141 because glutamine (Q) is prone to deamination. This substitution can improve the long-term storage of the protein.
例えば、本明細書において開示されるアクセプターフレームワークを使用して、非ヒトＣＤＲが由来する非ヒト抗体の結合特性を保持するヒト抗体またはヒト化抗体を生成することができる。したがって、好ましい実施形態において、本発明は、ドナー免疫結合物、好ましくは哺乳類免疫結合物、より好ましくはウサギ目の動物免疫結合物、及び最も好ましくはウサギからの重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ならびに／または軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３をさらに含む、本明細書において開示されるような免疫結合物アクセプターフレームワークを包含する。したがって、一実施形態において、本発明は、
（ｉ）ウサギ目の動物の可変軽鎖ＣＤＲ；及び
（ｉｉ）配列番号：１と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％及び最も好ましくは１００％の同一性を有するヒト可変重鎖フレームワーク
を含む、所望される抗原に特異的な免疫結合物を提供する。
For example, the acceptor frameworks disclosed herein can be used to generate human or humanized antibodies that retain the binding properties of non-human antibodies from which non-human CDRs are derived. Thus, in a preferred embodiment, the present invention provides a donor immunoconjugate, preferably a mammalian immunoconjugate, more preferably a rabbit eye animal immunoconjugate, and most preferably a heavy chain CDR1, CDR2 and CDR3 from rabbit and / or Or an immunoconjugate acceptor framework as disclosed herein further comprising light chain CDR1, CDR2 and CDR3. Thus, in one embodiment, the present invention provides
(I) a variable light chain CDR of a rabbit eye; and (ii) at least 70%, preferably at least 75%, 80%, 85%, 90%, 95% and most preferably 100% with SEQ ID NO: 1. Immunoconjugates specific for the desired antigen are provided, including human variable heavy chain frameworks with identity.
好ましくは、ウサギ目の動物はウサギである。より好ましくは、免疫結合物は、ドナー免疫結合物からの重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む。 Preferably, the animal of the order Rabbit is a rabbit. More preferably, the immunoconjugate comprises heavy chain CDR1, CDR2 and CDR3 and light chain CDR1, CDR2 and CDR3 from a donor immunoconjugate.
当技術分野において公知であるように、多くのウサギＶＨ鎖はマウス及びヒトのカウンターパートと比較して余剰のペアのシステインを有する。ｃｙｓ２２とｃｙｓ９２との間に形成される保存されたジスルフィド架橋に加えて、ｃｙｓ２１−ｃｙｓ７９架橋、そしていくつかのウサギ鎖においてＣＤＲ Ｈ１の最後の残基とＣＤＲ Ｈ２の第１の残基との間に形成されるＣＤＲ間Ｓ−Ｓ架橋もある。その他に、ＣＤＲ−Ｌ３中のペアのシステイン残基は多くの場合見出される。その他に、多くのウサギ抗体ＣＤＲは任意の従来公知の標準構造に属さない。特にＣＤＲ−Ｌ３は、大抵の場合ヒトまたはマウスのカウンターパートのＣＤＲ−Ｌ３よりもはるかに長い。 As is known in the art, many rabbit VH chains have an extra pair of cysteines compared to mouse and human counterparts. In addition to the conserved disulfide bridge formed between cys22 and cys92, the cys21-cys79 bridge, and between the last residue of CDR H1 and the first residue of CDR H2 in some rabbit chains There are also S—S bridges between CDRs formed in In addition, pairs of cysteine residues in CDR-L3 are often found. In addition, many rabbit antibody CDRs do not belong to any conventionally known standard structure. In particular, CDR-L3 is often much longer than human or mouse counterpart CDR-L3.
先に述べたように、本明細書において開示されるフレームワーク上への非ヒトＣＤＲのグラフトは、ＣＤＲが適切なコンフォメーションで提示される分子をもたらす。必要ならば、免疫結合物の親和性は、非ヒトドナー免疫結合物の抗原と相互作用するフレームワーク残基のグラフトによって改善することができる。これらの位置は、例えば、
（ｉ）それぞれの生殖系列先祖配列を同定すること、または代わりに、高度に相同なフレームワーク配列の事例においてコンセンサス配列を使用すること；
（ｉｉ）生殖系列先祖配列または工程（ｉ）のコンセンサス配列とドナー可変ドメイン配列の配列アラインメントを生成すること；及び
（ｉｉｉ）異なる残基を同定すること
によって同定することができる。
As previously mentioned, grafting of non-human CDRs onto the framework disclosed herein results in molecules in which the CDRs are presented in the proper conformation. If necessary, the affinity of the immunoconjugate can be improved by grafting framework residues that interact with the antigen of the non-human donor immunoconjugate. These positions are, for example,
(I) identifying each germline ancestral sequence, or alternatively using consensus sequences in the case of highly homologous framework sequences;
(Ii) generating a sequence alignment of the germline ancestral sequence or the consensus sequence of step (i) and the donor variable domain sequence; and (iii) identifying the different residues.
分子の表面上の異なる残基は、多くの事例において、インビボの親和性生成プロセスの間に変異して、おそらく抗原に対する親和性を生成する。 Different residues on the surface of the molecule are often mutated during the in vivo affinity generation process, possibly producing affinity for the antigen.
別の態様において、本発明は、本明細書において記述される免疫結合物アクセプターフレームワークを含む免疫結合物を提供する。前記免疫結合物は、例えばｓｃＦｖ抗体、全長免疫グロブリン、Ｆａｂ断片、Ｄａｂまたはナノボディであり得る。 In another aspect, the invention provides an immunoconjugate comprising an immunoconjugate acceptor framework described herein. The immunoconjugate can be, for example, an scFv antibody, full-length immunoglobulin, Fab fragment, Dab or Nanobody.
好ましい実施形態において、免疫結合物は、１つまたは複数の分子、例えば治療用薬剤（細胞毒性剤、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子または他のシグナリング分子等）、イメージング剤、または第２のタンパク質（転写活性化因子またはＤＮＡ結合性のドメイン等）に付加される。 In preferred embodiments, the immunoconjugate comprises one or more molecules, such as a therapeutic agent (such as a cytotoxic agent, cytokine, chemokine, growth factor or other signaling molecule), imaging agent, or second protein (transcription). Activator or DNA binding domain).
本明細書において開示されるような免疫結合物は、例えば診断用適用、治療用適用、標的の検証または遺伝子療法において使用することができる。 Immunoconjugates as disclosed herein can be used, for example, in diagnostic applications, therapeutic applications, target validation or gene therapy.
本発明は、本明細書において開示される免疫結合物アクセプターフレームワークまたは本明細書において開示されるような免疫結合物（複数可）をコードする単離核酸をさらに提供する。 The invention further provides an isolated nucleic acid encoding an immunoconjugate acceptor framework as disclosed herein or an immunoconjugate (s) as disclosed herein.
別の実施形態において、本明細書において開示される核酸を含むベクターが提供される。 In another embodiment, a vector comprising a nucleic acid disclosed herein is provided.
本明細書において開示されるような核酸またはベクターは例えば遺伝子療法において使用することができる。 Nucleic acids or vectors as disclosed herein can be used, for example, in gene therapy.
本発明は、本明細書において開示されるベクター及び／または核酸を含む宿主細胞をさらに包含する。 The invention further encompasses host cells comprising the vectors and / or nucleic acids disclosed herein.
さらに、組成物は、本明細書において開示されるような免疫結合物アクセプターフレームワーク、本明細書において開示されるような免疫結合物、本明細書において開示されるような単離核酸、または本明細書において開示されるようなベクターを含んで提供される。 Further, the composition can comprise an immunoconjugate acceptor framework as disclosed herein, an immunoconjugate as disclosed herein, an isolated nucleic acid as disclosed herein, or Provided are including vectors as disclosed herein.
本明細書において開示される配列は以下の通りである（Ｘ残基はＣＤＲ挿入部位であり、少なくとも３〜５０までのアミノ酸を含有する）。 The sequences disclosed herein are as follows (X residue is the CDR insertion site and contains at least 3-50 amino acids):
配列番号：１：可変重鎖フレームワークａ７２
ＥＶＱＬＶＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＧＶＳ（Ｘ）ｎ＝３−５０ＷＩＲＱＨＰＶＫＧＬＥＷＩＧ（Ｘ）ｎ＝３−５０ ＲＬＴＩＳＶＤＴＳＫＴＱＶＳＬＮＬＲＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（Ｘ）ｎ＝３−５０ ＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
SEQ ID NO: 1: Variable heavy chain framework a72
EVQLVESGPGLVKPSQTLSLTCGVS (X) n = 3-50 WIRQHPVKGLEWIG (X) n = 3-50 RLTISVDTSKQVSLNLRSVTAADTAVYYCAR (X) n = 3-50 WGQGTTVTVSS
配列番号：２：可変軽鎖フレームワークＫＩ２７
ＥＩＶＭＴＱＳＰＳＴＬＳＡＳＶＧＤＲＶＩＩＴＣ（Ｘ）ｎ＝３−５０ ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（Ｘ）ｎ＝３−５０ ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＡＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＴＹＹＣ（Ｘ）ｎ＝３−５０ ＦＧＱＧＴＫＬＴＶＬＧ
SEQ ID NO: 2: Variable light chain framework KI27
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITC (X) n = 3-50 WYQQKPGKAPKLLIY (X) n = 3-50 GVPSRFSGGSGASFLTTISSLQPDDFATYYC (X) n = 3-50 FGQGTKLTVLG
配列番号：３：フレームワーク配列
ＥＩＶＭＴＱＳＰＳＴＬＳＡＳＶＧＤＲＶＩＩＴＣ（Ｘ）ｎ＝３−５０ ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（Ｘ）ｎ＝３−５０ ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＡＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＴＹＹＣ（Ｘ）ｎ＝３−５０ＦＧＱＧＴＫＬＴＶＬＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＶＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＧＶＳ（Ｘ）ｎ＝３−５０ＷＩＲＱＨＰＶＫＧＬＥＷＩＧ（Ｘ）ｎ＝３−５０ ＲＬＴＩＳＶＤＴＳＫＴＱＶＳＬＮＬＲＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（Ｘ）ｎ＝３−５０ ＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
SEQ ID NO: 3: framework sequences EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITC (X) n = 3-50 WYQQKPGKAPKLLIY (X) n = 3-50 GVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYC (X) n = 3-50 FGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGPGLVKPSQTLSLTCGVS (X) n = 3-50 WIRQHPVKGLEWIG (X) n = 3-50 RLTISVDTSKTQVSLNLRSVTAADTAVYYCAR (X) n = 3-50 WGQGTTVTVSS
配列番号：４：リンカー
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
SEQ ID NO: 4: Linker GGGGSGGGGGGGGGSGGGGS
別の態様において、本発明は、安定性及び可溶性のある抗体フレームワークの上へ非ヒトドナー抗体のＣＤＲをグラフトすることによって、非ヒト抗体のヒト化のための方法を提供する。特に好ましい実施形態において、ＣＤＲはウサギ抗体から生じ、フレームワークは上記のものである。 In another aspect, the invention provides a method for humanization of non-human antibodies by grafting the CDRs of the non-human donor antibody onto a stable and soluble antibody framework. In particularly preferred embodiments, the CDRs originate from rabbit antibodies and the framework is as described above.
米国特許第５，２２５，５３９号中でＷｉｎｔｅｒ及びＷＯ９００７８６１Ａ１中でＱｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（それらの全体は参照として本明細書に援用される）によって、ヒトアクセプターフレームワークの中へＣＤＲをグラフトする一般的な方法が開示されている。ウサギモノクローナル抗体からのＣＤＲを選択されたフレームワークの上へグラフトするための一般的な戦略はＷｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．及びＱｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．の戦略に関連するが、特定の鍵となる点で異なる。特に、本発明の方法は、本明細書において開示されるようなヒト抗体フレームワークがヒトまたは非ヒトのドナー抗体のためのアクセプターとして特に適切であるという点で、当技術分野において公知の典型的なＷｉｎｔｅｒ及びＱｕｅｅｎ方法論とは異なる。したがって、Ｗｉｎｔｅｒ及びＱｕｅｅｎの一般的な方法とは異なり、本発明のヒト化方法のために使用されたフレームワーク配列は、必ずしもドナーＣＤＲが由来する非ヒト（例えばウサギ）抗体の配列に最大の配列類似性を示すフレームワーク配列ではない。加えて、ＣＤＲコンフォメーションを支持するためにドナー配列からフレームワーク残基をグラフトすることは要求されない。多くとも、フレームワーク中に位置する抗原結合アミノ酸または体細胞超変異の間に起こった他の変異を導入することができる。 In US Pat. No. 5,225,539, Winter et al. And WO 9007861 A1, Queen et al. (Generally incorporated herein by reference) discloses a general method for grafting CDRs into the human acceptor framework. A general strategy for grafting CDRs from rabbit monoclonal antibodies onto selected frameworks is described by Winter et al. And Queen et al. Related to the strategy, but different in certain key points. In particular, the methods of the invention are typically known in the art in that a human antibody framework as disclosed herein is particularly suitable as an acceptor for human or non-human donor antibodies. Unlike the Winter and Queen methodologies. Thus, unlike the general method of Winter and Queen, the framework sequence used for the humanization method of the present invention is not necessarily the largest sequence in the sequence of the non-human (eg, rabbit) antibody from which the donor CDR is derived. It is not a framework sequence showing similarity. In addition, it is not required to graft framework residues from the donor sequence to support the CDR conformation. At most, antigen-binding amino acids located in the framework or other mutations that occurred during somatic hypermutation can be introduced.
高い可溶性及び安定性を備えたヒト化したウサギ由来抗体を生成するグラフト方法の特定の詳細について下記に述べる。 Specific details of the grafting method to produce humanized rabbit derived antibodies with high solubility and stability are described below.
本発明の方法の例示的な実施形態において、ＣＤＲドナー抗体のアミノ酸配列を最初に同定し、配列を従来の配列アラインメントツール（例えばＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム及びＢｌｏｓｓｕｍマトリックス）を使用してアライメントさせる。ギャップの導入及び残基位置の命名は従来の抗体ナンバリングシステムを使用して行うことができる。例えば、免疫グロブリン可変ドメインのためのＡＨｏナンバリングシステムを使用することができる。抗体中の残基のナンバリングのために最も広く採用される基準であるので、Ｋａｂａｔのナンバリングスキームも適用することができる。Ｋａｂａｔのナンバリングは、例えばＳＵＢＩＭプログラムを使用して割り当てることができる。このプログラムは、Ｋａｂａｔ及び共同研究者（Ｄｅｒｅｔ ｅｔ ａｌ １９９５）によって確立されたシステムに従って抗体配列の可変領域を分析し配列をナンバリングする。フレームワーク及びＣＤＲの領域の定義は、配列可変性に基づき最も一般的に使用されるＫａｂａｔの定義に従って、一般的には行われる。しかしながら、ＣＤＲ−Ｈ１については、表記は、好ましくはＫａｂａｔの定義、抗体と抗原との間の接触の３次元の複合体構造のサブセットの分析によって生成された平均接触データ（ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，１９９６）、及び構造的ループ領域の位置に基づくＣｈｏｔｉａの定義の組み合わせである（図１も参照）。抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域中のアミノ酸残基位置の同定に使用される、２つの異なるナンバリングシステムについての換算表は、Ａ．Ｈｏｎｅｇｇｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０９（２００１）６５７−６７０中で提供される。Ｋａｂａｔのナンバリングシステムは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２）中にさらに記載されている。ＡＨｏナンバリングシステムは、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ，Ａ．ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．（２００１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０９：６５７−６７０中でさらに記載されている。 In an exemplary embodiment of the method of the invention, the amino acid sequence of the CDR donor antibody is first identified and the sequence is aligned using conventional sequence alignment tools (eg, Needleman-Wunsch algorithm and Blossum matrix). Introduction of gaps and naming of residue positions can be performed using conventional antibody numbering systems. For example, an AHo numbering system for immunoglobulin variable domains can be used. Since it is the most widely adopted criterion for numbering residues in antibodies, the Kabat numbering scheme can also be applied. Kabat numbering can be assigned using, for example, the SUBIM program. This program analyzes the variable regions of antibody sequences and numbers the sequences according to a system established by Kabat and collaborators (Delet et al 1995). The definition of framework and CDR regions is generally done according to the most commonly used Kabat definition based on sequence variability. However, for CDR-H1, the notation is preferably the definition of Kabat, average contact data generated by analysis of a subset of the three-dimensional complex structure of contact between antibody and antigen (MacCallum et al., 1996). ), And a Chotia definition based on the location of the structural loop region (see also FIG. 1). A conversion table for the two different numbering systems used to identify amino acid residue positions in the heavy and light chain variable regions of antibodies is given in A.C. Honegger, J .; Mol. Biol. 309 (2001) 657-670. The Kabat numbering system is described in Kabat et al. (Described in Kabat, EA, et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, 3H No. 91). . The AHo numbering system is described by Honegger, A .; and Pluckthun, A .; (2001) J. Org. Mol. Biol. 309: 657-670.
ウサギモノクローナル抗体の可変ドメインは、例えばヒト抗体レパートリーの分析に基づいた配列分析アルゴリズム及び分類方法のＥＸＣＥＬ実装を使用して、例えば対応するヒトサブグループへと分類することができる（Ｋｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．Ｆｅｂ １１；２９６（１）：５７−８６）。 The variable domains of rabbit monoclonal antibodies can be classified, for example, into the corresponding human subgroups using, for example, an EXCEL implementation of a sequence analysis algorithm and classification method based on the analysis of the human antibody repertoire (Knappik et al., 2000, J Mol Biol. Feb 11; 296 (1): 57-86).
ＣＤＲコンフォメーションをドナー抗原結合領域に割り当てることができ、続いて異なる正準構造の維持に要求される残基位置も同定することができる。ウサギ抗体の６つの抗体超可変領域のうちの５つについてのＣＤＲ正準構造（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１及びＨ２）はＣｈｏｔｈｉａ（１９８９）の定義を使用して決定される。 CDR conformations can be assigned to donor antigen binding regions and subsequently the residue positions required to maintain different canonical structures can also be identified. CDR canonical structures (L1, L2, L3, H1 and H2) for 5 of the 6 antibody hypervariable regions of rabbit antibodies are determined using the definition of Chothia (1989).
本発明の抗体をさらに至適化して、促進された機能的特性（例えば促進された可溶性及び／または安定性）を示すことができる。特定の実施形態において、本発明の抗体は、２００８年３月１２日に出願されたＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００１９５８号、発明の名称「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｂａｓｅｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｈａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」（参照として本明細書に援用される）中で開示された「機能的なコンセンサス」方法論に従って至適化される。 The antibodies of the invention can be further optimized to exhibit enhanced functional properties (eg, enhanced solubility and / or stability). In a specific embodiment, the antibodies of the present invention are identified in PCT patent application No. PCT / EP2008 / 001958, filed March 12, 2008, entitled “Sequence Based Engineering and Optimization of Single Chain Antibodies” (as a reference). Optimized according to the “functional consensus” methodology disclosed in (incorporated herein).
置換のための例示的なフレームワーク残基位置及び例示的なフレームワーク置換は、２００８年６月２５日に出願されたＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＣＨ２００８／０００２８５号、発明の名称「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａｎｄ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｉｔｈ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ」、及び２００８年６月２５日に出願されたＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＣＨ２００８／０００２８４号、発明の名称「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｂａｓｅｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｈａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」中で記載される。 Exemplary framework residue positions for substitution and exemplary framework substitution are described in PCT Patent Application No. PCT / CH2008 / 000285 filed June 25, 2008, entitled “Methods of Modifying Antibodies”. , And Modified Antibodies with Improved Functional Properties ”and PCT Patent Application No. PCT / CH2008 / 000284 filed on June 25, 2008, the title of which is“ Sequence Based Engineering in Opinion in the United States ”. The
他の実施形態において、本発明の免疫結合物は、２００８年６月２５日に出願された米国仮出願第６１／０７５，６９２号、発明の名称「Ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｎｄｅｒｓ」中で記載される、安定性促進変異のうちの１つまたは複数を含む。特定の好ましい実施形態において、免疫結合物は、１２、１０３及び１４４（従来のＡＨｏナンバリング）からなる重鎖アミノ酸位置の群から選択されるアミノ酸位置での可溶性促進変異を含む。１つの好ましい実施形態において、免疫結合物は、（ａ）重鎖アミノ酸位置１２でのセリン（Ｓ）；（ｂ）重鎖アミノ酸位置１０３でのセリン（Ｓ）またはスレオニン（Ｔ）；及び（ｃ）重鎖アミノ酸位置１４４でのセリン（Ｓ）またはスレオニン（Ｔ）からなる群から選択される１つまたは複数の置換を含む。別の実施形態において、免疫結合物は、以下の置換、（ａ）重鎖アミノ酸位置１２でのセリン（Ｓ）；（ｂ）重鎖アミノ酸位置１０３でのセリン（Ｓ）またはスレオニン（Ｔ）；及び（ｃ）重鎖アミノ酸位置１４４でのセリン（Ｓ）またはスレオニン（Ｔ）を含む。 In other embodiments, the immunoconjugates of the present invention are described in US Provisional Application No. 61 / 075,692, filed on June 25, 2008, entitled “Solubility Optimization of Immunobinders”, Contains one or more of the stability promoting mutations. In certain preferred embodiments, the immunoconjugate comprises a solubility promoting mutation at an amino acid position selected from the group of heavy chain amino acid positions consisting of 12, 103 and 144 (conventional AHo numbering). In one preferred embodiment, the immunoconjugate comprises (a) a serine (S) at heavy chain amino acid position 12; (b) a serine (S) or threonine (T) at heavy chain amino acid position 103; and (c ) Comprising one or more substitutions selected from the group consisting of serine (S) or threonine (T) at heavy chain amino acid position 144; In another embodiment, the immunoconjugate comprises the following substitutions: (a) serine (S) at heavy chain amino acid position 12; (b) serine (S) or threonine (T) at heavy chain amino acid position 103; And (c) a serine (S) or threonine (T) at heavy chain amino acid position 144.
特定の好ましい実施形態において、免疫結合物は、ＡＨｏナンバリングシステムに従う軽鎖可変領域の位置１、３、４、１０、４７、５７、９１及び１０３のうちの少なくとも１つ中の軽鎖アクセプターフレームワークのフレームワーク残基で、安定性促進変異を含む。好ましい実施形態において、軽鎖アクセプターフレームワークは、（ａ）位置１でのグルタミン酸（Ｅ）、（ｂ）位置３でのバリン（Ｖ）、（ｃ）位置４でのロイシン（Ｌ）；（ｄ）位置１０でのセリン（Ｓ）；（ｅ）位置４７でのアルギニン（Ｒ）；（ｅ）位置５７でのセリン（Ｓ）；（ｆ）位置９１でのフェニルアラニン（Ｆ）；及び（ｇ）位置１０３でのバリン（Ｖ）からなる群から選択される１つまたは複数の置換を含む。 In certain preferred embodiments, the immunoconjugate is a light chain acceptor frame in at least one of positions 1, 3, 4, 10, 47, 57, 91 and 103 of the light chain variable region according to the AHo numbering system. A framework residue in the workpiece that contains a stability-promoting mutation. In a preferred embodiment, the light chain acceptor framework comprises (a) glutamic acid (E) at position 1, (b) valine (V) at position 3, (c) leucine (L) at position 4; d) serine (S) at position 10; (e) arginine (R) at position 47; (e) serine (S) at position 57; (f) phenylalanine (F) at position 91; and (g ) Comprising one or more substitutions selected from the group consisting of valine (V) at position 103;
上述のような変異を含むヒト化抗体を生産する多様な利用可能な方法のうちのいずれかを使用することができる。 Any of a variety of available methods for producing humanized antibodies containing mutations as described above can be used.
したがって、本発明は、本明細書において記述された方法に従ってヒト化された免疫結合物を提供する。 Accordingly, the present invention provides immunoconjugates that are humanized according to the methods described herein.
特定の好ましい実施形態において、前記免疫結合物の標的抗原はＶＥＧＦまたはＴＮＦαである。 In certain preferred embodiments, the target antigen of the immunoconjugate is VEGF or TNFα.
本発明中で記載されるポリペプチドまたは本発明の方法によって生成されるポリペプチドは、例えば当技術分野において公知の技法を使用して合成することができる。あるいは、所望される可変領域をコードする核酸分子は合成することができ、ポリペプチドは組換え法によって生産される。 The polypeptides described in the present invention or produced by the methods of the present invention can be synthesized using, for example, techniques known in the art. Alternatively, a nucleic acid molecule encoding the desired variable region can be synthesized and the polypeptide produced by recombinant methods.
例えば、一旦ヒト化可変領域の配列が決められたならば、その可変領域またはそれを含むポリペプチドは分子生物学の技術分野における周知の技法によって作製することができる。より具体的には、組み換えＤＮＡ技法を使用して、核酸配列（例えば所望される可変領域（例えば修飾された重鎖または軽鎖；その可変ドメイン、またはその他の抗原結合断片）をコードするＤＮＡ配列）による宿主細胞の形質転換によって、広範囲のポリペプチドを生産することができる。 For example, once a humanized variable region has been sequenced, the variable region or a polypeptide comprising it can be made by well-known techniques in the field of molecular biology. More specifically, using recombinant DNA techniques, a DNA sequence that encodes a nucleic acid sequence (eg, a desired variable region (eg, a modified heavy or light chain; a variable domain thereof, or other antigen-binding fragment)). A wide range of polypeptides can be produced by transformation of host cells with
一実施形態において、少なくともＶＨまたはＶＬをコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結されるプロモーターを含む発現ベクターを調製することができる。必要であるかまたは所望されるならば、相補的な可変ドメインをコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結されるプロモーターを含む第２の発現ベクターを調製することができる（すなわち、親発現ベクターがＶＨをコードする場合、第２の発現ベクターはＶＬをコードし、その逆も成立する）。次いで細胞株（例えば不死化哺乳類細胞株）を、１つまたは両方の発現ベクターで形質転換し、キメラ可変ドメインまたはキメラ抗体の発現を可能にする条件下で培養することができる（例えばＮｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ．ａｌ．に帰属する国際特許出願第ＰＣＴ／ＧＢ８５／００３９２号を参照されたい）。 In one embodiment, an expression vector can be prepared that includes a promoter operably linked to a DNA sequence encoding at least VH or VL . If necessary or desired, a second expression vector can be prepared that includes a promoter operably linked to a DNA sequence encoding a complementary variable domain (ie, the parent expression vector is V When encoding H , the second expression vector encodes VL and vice versa). Cell lines (eg, immortalized mammalian cell lines) can then be transformed with one or both expression vectors and cultured under conditions that allow expression of the chimeric variable domain or chimeric antibody (see, eg, Neuberger et. (see International Patent Application No. PCT / GB85 / 00392), which belongs to al.
一実施形態において、ドナーＣＤＲ及びアクセプターＦＲのアミノ酸配列を含む可変領域を作製することができ、次いで変化を核酸分子の中へ導入してＣＤＲアミノ酸置換を達成する。 In one embodiment, a variable region comprising the amino acid sequences of the donor CDR and acceptor FR can be created, and then changes are introduced into the nucleic acid molecule to achieve CDR amino acid substitutions.
ポリペプチドのアミノ酸配列バリアントをコードする核酸分子の作製のための例示的な当技術分野で認められている方法には、部位特異的（またはオリゴヌクレオチド媒介性）変異誘発、ＰＣＲ変異誘発、及びポリペプチドをコードする先に調製されたＤＮＡのカセット式変異誘発による調製が含まれるが、これらに限定されない。 Exemplary art-recognized methods for the production of nucleic acid molecules encoding amino acid sequence variants of polypeptides include site-specific (or oligonucleotide-mediated) mutagenesis, PCR mutagenesis, and poly This includes, but is not limited to, preparation by cassette mutagenesis of previously prepared DNA encoding the peptide.
部位特異的変異誘発は置換バリアントを調製する好ましい方法である。この技法は当技術分野において周知である（例えばＣａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：４４３１−４４４３（１９８５）、Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８（１９８７）を参照されたい）。簡潔には、ＤＮＡの部位特異的変異誘発の実行において、親ＤＮＡは、所望される変異をコードするオリゴヌクレオチドをかかる親ＤＮＡの単一ストランドへ最初にハイブリダイズすることによって変更される。ハイブリダイゼーション後に、ＤＮＡポリメラーゼを使用し、プライマーとしてハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドを使用し、テンプレートとして親ＤＮＡの単一ストランドを使用して、第２のストランド全体を合成する。したがって、所望される変異をコードするオリゴヌクレオチドが、生じた二本鎖ＤＮＡ中に取り込まれる。 Site-directed mutagenesis is a preferred method of preparing substitution variants. This technique is well known in the art (see, eg, Carter et al. Nucleic Acids Res. 13: 4431-4443 (1985), Kunkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488 (1987)). See). Briefly, in performing a site-directed mutagenesis of DNA, the parent DNA is altered by first hybridizing an oligonucleotide encoding the desired mutation to a single strand of such parent DNA. After hybridization, the entire second strand is synthesized using a DNA polymerase, using the hybridized oligonucleotide as a primer, and using a single strand of the parent DNA as a template. Thus, an oligonucleotide encoding the desired mutation is incorporated into the resulting double stranded DNA.
ＰＣＲ変異誘発もポリペプチドのアミノ酸配列バリアントの作製に好適である。ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｐｐ．１７７−１８３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９０）；ａｎｄ Ｖａｌｌｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：７２３−７３３（１９８９）中のＨｉｇｕｃｈｉを参照されたい。簡潔には、少量のテンプレートＤＮＡがＰＣＲにおける出発材料として使用される場合、テンプレートＤＮＡ中の対応する領域とわずかに配列で異なるプライマーを使用して、プライマーがテンプレートとは異なる位置でのみテンプレート配列と異なる比較的大量の特異的ＤＮＡ断片を生成することができる。 PCR mutagenesis is also suitable for generating amino acid sequence variants of polypeptides. PCR Protocols, pp. 177-183 (Academic Press, 1990); and Vallette et al. , Nuc. Acids Res. 17: 723-733 (1989). Briefly, if a small amount of template DNA is used as the starting material in PCR, a primer that differs slightly in sequence from the corresponding region in the template DNA is used, and the template sequence is only located where the primer differs from the template. Different relatively large amounts of specific DNA fragments can be generated.
バリアントを調製する別の方法（カセット式変異誘発）はＷｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ３４：３１５−３２３（１９８５）によって記述された技法に基づく。出発材料は変異させるＤＮＡを含むプラスミド（または他のベクター）である。変異させる親ＤＮＡ中のコドン（複数可）を同定する。同定された変異部位（複数可）の各サイド上にユニークな制限酵素部位がなくてはならない。かかる制限部位が存在しないならば、ポリペプチドをコードするＤＮＡ中の適切な位置でそれらを導入する上述のオリゴヌクレオチド媒介性変異誘発方法を使用して、それらを生成することができる。プラスミドＤＮＡをこれらの部位で切断して直線化する。制限部位の間のＤＮＡの配列をコードするが所望される変異（複数可）を含有する二本鎖オリゴヌクレオチドを、標準的な手順（オリゴヌクレオチドの２つのストランドを別々に合成し、次いで標準的な技法を使用してともにハイブリダイズする）を使用して合成する。この二本鎖オリゴヌクレオチドはカセットと称される。このカセットは線状化プラスミドの末端と適合性のある５’末端及び３’末端を有するようにデザインされ、その結果プラスミドへ直接ライゲーションすることができる。このプラスミドはここで変異させたＤＮＡ配列を含有する。 Another method for preparing variants (cassette mutagenesis) is described in Wells et al. Gene 34: 315-323 (1985). The starting material is a plasmid (or other vector) containing the DNA to be mutated. Identify the codon (s) in the parent DNA to be mutated. There must be a unique restriction enzyme site on each side of the identified mutation site (s). If such restriction sites are not present, they can be generated using the above-described oligonucleotide-mediated mutagenesis methods that introduce them at the appropriate location in the DNA encoding the polypeptide. Plasmid DNA is cut and linearized at these sites. Double-stranded oligonucleotides that encode the sequence of DNA between the restriction sites but contain the desired mutation (s) are synthesized using standard procedures (synthesize the two strands of the oligonucleotide separately and then standard Are hybridized together using a simple technique. This double stranded oligonucleotide is referred to as a cassette. This cassette is designed to have 5 'and 3' ends that are compatible with the ends of the linearized plasmid so that it can be directly ligated to the plasmid. This plasmid contains the DNA sequence mutated here.
本発明の方法によって生成された可変領域をリモデルしさらに変更して、さらに抗原結合を増加させることができる。したがって、追加の工程（例えば親和性成熟が含まれる）は上記の工程に先行または後続し得る。加えて、経験的な結合データはさらなる至適化のために使用することができる。 The variable region generated by the method of the present invention can be remodeled and further modified to further increase antigen binding. Thus, additional steps (eg, including affinity maturation) may precede or follow the above steps. In addition, empirical binding data can be used for further optimization.
アミノ酸置換の他に、本発明は、変更されたエフェクター機能を備えたＦｃ領域バリアントを生成するために、例えばＦｃ領域アミノ酸配列への他の修飾を企図する。例えば、ＦｃＲに結合を減少または促進するために、Ｆｃ領域の１つまたは複数のアミノ酸残基を削除することができる。一実施形態において、Ｆｃ領域残基のうちの１つまたは複数はかかるＦｃ領域バリアントを生成するために修飾することができる。一般的に、１〜約１０のＦｃ領域残基は本発明のこの実施形態に従って削除されるだろう。１つまたは複数アミノ酸欠失を含む本明細書におけるＦｃ領域は、好ましくは出発のＦｃ領域またはヒトＦｃ領域の天然の配列の少なくとも約８０％及び好ましくは少なくとも約９０％及び最も好ましくは少なくとも約９５％を保持するだろう。 In addition to amino acid substitutions, the present invention contemplates other modifications to, for example, the Fc region amino acid sequence to generate Fc region variants with altered effector functions. For example, one or more amino acid residues in the Fc region can be deleted to reduce or facilitate binding to FcR. In one embodiment, one or more of the Fc region residues can be modified to generate such an Fc region variant. Generally, 1 to about 10 Fc region residues will be deleted according to this embodiment of the invention. An Fc region herein containing one or more amino acid deletions is preferably at least about 80% and preferably at least about 90% and most preferably at least about 95% of the native sequence of the starting Fc region or human Fc region. Would hold%.
一実施形態において、本発明中で記載されるポリペプチドまたは本発明の方法によって生成されるポリペプチド（例えばヒト化Ｉｇ可変領域及び／またはヒト化Ｉｇ可変領域を含むポリペプチド）は、組換え法によって生産することができる。例えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、組換え発現のために好適な発現ベクター中に挿入することができる。ポリペプチドが抗体である場合、追加の軽鎖及び重鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチド（任意で定常領域に連結される）は、同じまたは異なる発現ベクターの中へ挿入することができる。親和性タグ配列（例えばＨｉｓ（６）タグ）を、後続の精製を促進するためにポリペプチド配列内に任意で付加または含み得る。免疫グロブリン鎖をコードするＤＮＡセグメントは、免疫グロブリンポリペプチドの発現を保証する発現ベクター中の制御配列へ作動可能に連結される。発現制御配列には、プロモーター（例えば天然に結び付いたプロモーターまたは異種プロモーター）、シグナル配列、エンハンサーエレメント及び転写終結配列が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、発現制御配列は、真核生物宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションすることができるベクターにおける真核生物プロモーターシステムである。一旦、ベクターが適切な宿主の中へ取り込まれたならば、宿主はヌクレオチド配列の高レベル発現ならびにポリペプチドの収集及び精製のために好適な条件下で維持される。 In one embodiment, a polypeptide described in the present invention or a polypeptide produced by a method of the present invention (eg, a polypeptide comprising a humanized Ig variable region and / or a humanized Ig variable region) is a recombinant method. Can be produced by. For example, a polynucleotide sequence encoding a polypeptide can be inserted into an expression vector suitable for recombinant expression. Where the polypeptide is an antibody, polynucleotides encoding additional light and heavy chain variable regions (optionally linked to constant regions) can be inserted into the same or different expression vectors. An affinity tag sequence (eg, a His (6) tag) can optionally be added or included within the polypeptide sequence to facilitate subsequent purification. A DNA segment encoding an immunoglobulin chain is operably linked to control sequences in an expression vector that ensures expression of the immunoglobulin polypeptide. Expression control sequences include, but are not limited to, promoters (eg, naturally associated promoters or heterologous promoters), signal sequences, enhancer elements, and transcription termination sequences. Preferably, the expression control sequence is a eukaryotic promoter system in a vector capable of transforming or transfecting a eukaryotic host cell. Once the vector is incorporated into a suitable host, the host is maintained under conditions suitable for high level expression of the nucleotide sequence and collection and purification of the polypeptide.
これらの発現ベクターは、典型的には、エピソームとしてまたは宿主染色体ＤＮＡの組込み部分として宿主生物中で複製可能である。一般的には、発現ベクターは選択マーカー（例えばアンピシリン抵抗性、ハイグロマイシン抵抗性、テトラサイクリン耐性またはネオマイシン抵抗性）を含有して、所望されるＤＮＡ配列で形質転換された細胞の検出を可能にする（例えば米国特許第４，７０４，３６２号を参照）。 These expression vectors are typically replicable in the host organism as episomes or as an integral part of the host chromosomal DNA. In general, the expression vector contains a selectable marker (eg ampicillin resistance, hygromycin resistance, tetracycline resistance or neomycin resistance) to allow detection of cells transformed with the desired DNA sequence. (See, eg, US Pat. No. 4,704,362).
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、本発明のポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ配列）のクローン化のために特に有用な１つの原核生物宿主である。使用のために好適な他の微生物宿主には桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｕｓ等）及び他の腸内細菌科（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ種、Ｓｅｒｒａｔｉａ種及び様々なＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種等）が含まれる。 E. coli is one prokaryotic host particularly useful for cloning the polynucleotides (eg, DNA sequences) of the present invention. Other microbial hosts suitable for use include Neisseria gonorrhoeae (such as Bacillus subtilus) and other Enterobacteriaceae (such as Salmonella species, Serratia species and various Pseudomonas species).
他の微生物（酵母等）も発現のために有用である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ及びＰｉｃｈｉａは、所望に応じて発現制御配列（例えばプロモーター）、複製起点、終止配列及び同種のものを有する適切なベクターがある、例示的な酵母宿主である。典型的なプロモーターには３−ホスホグリセレートキナーゼ及び他の解糖系酵素のものが含まれる。誘導可能な酵母プロモーターには、とりわけ、アルコール脱水素酵素、イソシトクロムＣ、ならびにメタノール、マルトース及びガラクトース利用に関与する酵素からのプロモーターが含まれる。 Other microorganisms (such as yeast) are also useful for expression. Saccharomyces and Pichia are exemplary yeast hosts with suitable vectors having expression control sequences (eg, promoters), origins of replication, termination sequences and the like as desired. Typical promoters include those of 3-phosphoglycerate kinase and other glycolytic enzymes. Inducible yeast promoters include, among others, promoters from alcohol dehydrogenase, isocytochrome C, and enzymes involved in methanol, maltose and galactose utilization.
本発明の範囲内で大腸菌及び出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は好ましい宿主細胞である。 E. coli and S. cerevisiae are preferred host cells within the scope of the present invention.
微生物に加えて、哺乳類組織培養も使用して本発明のポリペプチド（例えば免疫グロブリンまたはその断片をコードするポリヌクレオチド）を発現及び生産することができる。Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎ．Ｙ．，Ｎ．Ｙ．（１９８７）を参照されたい。異種タンパク質（例えばインタクトな免疫グロブリン）を分泌することができる多数の適切な宿主細胞株が当技術分野において開発されているので、真核細胞は実際に好ましく、ＣＨＯ細胞株、様々なＣｏｓ細胞株、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、ミエローマ細胞株、形質転換されたＢ細胞及びハイブリドーマが含まれる。これらの細胞のための発現ベクターは、発現制御配列（複製起点、プロモーター及びエンハンサー等）（Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８９：４９（１９８６））及び必要なプロセッシング情報部位（リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位及び転写ターミネーター配列等）を含み得る。好ましい発現制御配列は、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、サイトメガロウイルス及び同種のものに由来するプロモーターである。Ｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９（１９９２）を参照されたい。 In addition to microorganisms, mammalian tissue culture can also be used to express and produce a polypeptide of the invention (eg, a polynucleotide encoding an immunoglobulin or fragment thereof). Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N .; Y. , N.M. Y. (1987). Since a number of suitable host cell lines capable of secreting heterologous proteins (eg intact immunoglobulins) have been developed in the art, eukaryotic cells are indeed preferred, CHO cell lines, various Cos cell lines , HeLa cells, 293 cells, myeloma cell lines, transformed B cells and hybridomas. Expression vectors for these cells include expression control sequences (such as origins of replication, promoters and enhancers) (Queen et al., Immunol. Rev. 89:49 (1986)) and the necessary processing information sites (ribosome binding sites, RNA splice sites, polyadenylation sites and transcription terminator sequences, etc.). Preferred expression control sequences are promoters derived from immunoglobulin genes, SV40, adenovirus, bovine papilloma virus, cytomegalovirus and the like. Co et al. , J .; Immunol. 148: 1149 (1992).
対象となるポリヌクレオチド配列（例えば重鎖及び軽鎖のコード配列ならびに発現制御配列）を含有するベクターは、周知の方法（それは細胞宿主のタイプに依存して変動する）によって宿主細胞の中へ移行させることができる。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションは原核生物細胞のために一般的には利用されるが、リン酸カルシウム処理、電気穿孔、リポフェクション、微粒子銃またはウイルスベースのトランスフェクションを他の細胞宿主のために使用することができる（一般的にはＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ ｅｄ．，１９８９を参照されたい）。哺乳類細胞を形質転換するために使用される他の方法は、ポリブレン、原形質融合、リポソーム、電気穿孔及び顕微注入の使用を含む（一般的には、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．前出、を参照されたい）。遺伝子導入動物の生産のために、導入遺伝子を受精卵母細胞の中へ顕微注射することができるか、または胚性幹細胞のゲノムの中へ取り込み、かかる細胞の核を除核卵母細胞の中へ移行させることができる。 A vector containing the polynucleotide sequence of interest (eg, heavy and light chain coding sequences and expression control sequences) is transferred into the host cell by well-known methods, which vary depending on the type of cell host. Can be made. For example, calcium chloride transfection is commonly utilized for prokaryotic cells, but calcium phosphate treatment, electroporation, lipofection, particle gun or virus-based transfection may be used for other cellular hosts. (See in general Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (see Cold Spring Harbor Press, 2nd ed., 1989). Other methods used to transform mammalian cells include: Including the use of polybrene, protoplast fusion, liposomes, electroporation and microinjection (see generally, Sambrook et al., Supra). It can be microinjected into sperm oocytes or taken up into the genome of embryonic stem cells and the nuclei of such cells can be transferred into enucleated oocytes.
被験体ポリペプチドも、遺伝子導入動物のゲノムの中への導入及び後続する発現（例えば遺伝子導入動物の乳汁中の）のために導入遺伝子中に取り込むことができる（例えばＤｅｂｏｅｒ ｅｔ ａｌ．５，７４１，９５７；Ｒｏｓｅｎ ５，３０４，４８９；及びＭｅａｄｅ ５，８４９，９９２を参照されたい）。適切な導入遺伝子には、乳腺腺特異的遺伝子（カゼインまたはβラクトグロブリン等）からのプロモーター及びエンハンサーとの作動可能な連結における軽鎖及び／または重鎖のためのコード配列が含まれる。 A subject polypeptide can also be incorporated into a transgene (eg, Deboer et al. 5,741) for introduction into the genome of the transgenic animal and subsequent expression (eg, in the milk of the transgenic animal). , 957; Rosen 5,304,489; and Meade 5,849,992). Suitable transgenes include coding sequences for light and / or heavy chains in operable linkage with promoters and enhancers from mammary gland specific genes (such as casein or β-lactoglobulin).
ポリペプチドは単一ベクターまたは２つのベクターを使用して発現することができる。例えば、抗体の重鎖及び軽鎖は分離した発現ベクター上にクローン化され、細胞の中へ共トランスフェクションすることができる。 Polypeptides can be expressed using a single vector or two vectors. For example, antibody heavy and light chains can be cloned onto separate expression vectors and co-transfected into cells.
一実施形態において、シグナル配列を使用して本発明のポリペプチドの発現を促進することができる。 In one embodiment, a signal sequence can be used to facilitate expression of a polypeptide of the invention.
一旦発現されたならば、ポリペプチドは、硫安分画、アフィニティーカラム（例えばプロテインＡまたはプロテインＧ）、カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ精製、ゲル電気泳動及び同種のものが含まれる、当該技術分野の標準的な手順に従って精製することができる（一般的にはＳｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．，（１９８２）を参照されたい）。 Once expressed, the polypeptide can be any standard in the art, including ammonium sulfate fractions, affinity columns (eg, Protein A or Protein G), column chromatography, HPLC purification, gel electrophoresis and the like. (See generally, Scopes, Protein Purification (see Springer-Verlag, NY, (1982)).
ヒト化Ｉｇ可変領域またはそれらを含むポリペプチドのいずれかは、培養中の宿主細胞または細胞株によって発現することができる。それらは細胞中でインビボでも発現させることができる。変更された抗体を生産するように形質転換（例えばトランスフェクション）された細胞株は、不死化哺乳類細胞株（リンパ系起源のもの（例えばミエローマ、ハイブリドーマ、トリオーマまたはクアドローマ細胞株）等）であり得る。細胞株には、ウイルス（例えばエプスタインバーウイルス）による形質転換によって不死化された正常リンパ球様細胞（Ｂ細胞等）も含まれ得る。 Either the humanized Ig variable regions or polypeptides comprising them can be expressed by the host cell or cell line in culture. They can also be expressed in vivo in cells. Cell lines transformed (eg, transfected) to produce altered antibodies can be immortalized mammalian cell lines (such as those of lymphoid origin (eg, myeloma, hybridoma, trioma or quadroma cell lines)). . Cell lines can also include normal lymphoid cells (such as B cells) that have been immortalized by transformation with a virus (eg, Epstein-Barr virus).
典型的にはポリペプチドの生産に使用される細胞株は哺乳類細胞株であるが、他の源（細菌及び酵母等）からの細胞株も使用することができる。特に、大腸菌由来細菌株を使用することができる（特に例えばファージディスプレイ）。 Typically, the cell line used to produce the polypeptide is a mammalian cell line, but cell lines from other sources (such as bacteria and yeast) can also be used. In particular, E. coli derived bacterial strains can be used (especially eg phage display).
いくつかの不死化リンパ球様細胞株（ミエローマ細胞株等）は正常状態において単離されたＩｇの軽鎖または重鎖を分泌する。かかる細胞株が本発明のプロセスの間に調製された変更された抗体を発現するベクターにより形質転換されて、正常に分泌された鎖が以前に調製されたベクターによってコードされたＩｇ鎖の可変ドメインに対して相補的ならば、プロセスの残りの工程を実行することは必要ではないだろう。 Some immortalized lymphoid cell lines (such as myeloma cell lines) secrete Ig light or heavy chains isolated in the normal state. The variable domain of an Ig chain in which such a cell line is transformed with a vector expressing the altered antibody prepared during the process of the invention and the normally secreted chain is encoded by a previously prepared vector It would not be necessary to perform the remaining steps of the process.
不死化細胞株が分泌しないかまたは相補的な鎖を分泌しなければ、細胞の中へ適切な相補的な鎖またはその断片をコードするベクターを導入することが必要だろう。 If the immortalized cell line does not secrete or does not secrete the complementary strand, it may be necessary to introduce a vector encoding the appropriate complementary strand or fragment thereof into the cell.
不死化細胞株が相補的な軽鎖または重鎖を分泌する事例において、例えばベクターにより適切な細菌細胞を形質転換し、次いで不死化細胞株と細菌細胞を縮合することによって（例えばスフェロプラスト融合によって）、形質転換された細胞株を生産することができる。あるいは、ＤＮＡは電気穿孔によって不死化細胞株の中へ直接導入することができる。 In cases where the immortal cell line secretes a complementary light or heavy chain, for example by transforming appropriate bacterial cells with a vector and then condensing the immortal cell line with the bacterial cells (eg, spheroplast fusion) To produce transformed cell lines. Alternatively, DNA can be introduced directly into an immortalized cell line by electroporation.
一実施形態において、本発明において記載されるようなヒト化Ｉｇ可変領域または本発明の方法によって生成されるヒト化Ｉｇ可変領域は、任意の抗体の抗原結合断片中に存在し得る。断片は組換えにより生産し操作することができるか、合成することができるか、またはタンパク質分解酵素による抗体の消化によって生産することができる。例えば、断片はＦａｂ断片であり得、パパインによる消化は、鎖間（すなわちＶＨ−ＶＨ）ジスルフィド結合（それは２つの重鎖をつなぐ）の前の領域で抗体を分解する。これは、軽鎖ならびに重鎖のＶＨ及びＣＨ１のドメインを含有する２つの同一の断片の形成を生じる。あるいは、断片はＦ（ａｂ’）２断片であり得る。これらの断片はペプシン（それは鎖間ジスルフィド結合の後の重鎖を切断する）による抗体の消化によって生成することができ、両方の抗原結合部位を含有する断片を生じる。さらに別の代替案は「単一鎖」抗体を使用することである。一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片は多様な手法で構築することができる。例えば、ＶＨのＣ末はＶＬのＮ−末に連結することができる。典型的には、リンカー（例えば（ＧＧＧＧＳ）４；配列番号：４）はＶＨとＶＬとの間に設置される。しかしながら、鎖が連結され得る順序は逆にすることができ、検出または精製を促進するタグ（例えば、Ｍｙｃ−タグ、Ｈｉｓ−タグまたはＦＬＡＧ−タグ）を含むことができる（これらのようなタグは任意の抗体または本発明の抗体断片へ添付することができ、それらの使用はｓｃＦｖに限定されない）。したがって、及び以下で指摘されるように、タグ付加抗体は本発明の範囲内である。代替の実施形態において、本明細書において記述される抗体または本明細書において記述される方法によって生成される抗体は、重鎖二量体または軽鎖二量体であり得る。なおさらに、抗体の軽鎖もしくは重鎖またはその部分（例えば単一ドメイン抗体（ＤＡｂ））を使用することができる。 In one embodiment, a humanized Ig variable region as described in the present invention or a humanized Ig variable region produced by a method of the present invention may be present in an antigen-binding fragment of any antibody. Fragments can be produced and manipulated recombinantly, synthesized, or produced by digestion of antibodies with proteolytic enzymes. For example, the fragment can be a Fab fragment, and digestion with papain degrades the antibody in the region before the interchain (ie, V H -V H ) disulfide bond (which connects the two heavy chains). This results in the formation of two identical fragments containing the V H and C H 1 domains of the light chain and the heavy chain. Alternatively, the fragment can be an F (ab ′) 2 fragment. These fragments can be generated by digestion of the antibody with pepsin, which cleaves the heavy chain after the interchain disulfide bond, resulting in a fragment containing both antigen binding sites. Yet another alternative is to use “single chain” antibodies. Single chain Fv (scFv) fragments can be constructed by a variety of techniques. For example, C-terminal of the V H can be linked to N- youngest V L. Typically, a linker (eg (GGGGS) 4 ; SEQ ID NO: 4) is placed between V H and V L. However, the order in which the strands can be linked can be reversed and can include tags that facilitate detection or purification (eg, Myc-tag, His-tag or FLAG-tag) (such tags are Any antibody or antibody fragment of the invention can be attached and their use is not limited to scFv). Thus, and as pointed out below, tagged antibodies are within the scope of the present invention. In alternative embodiments, the antibodies described herein or the antibodies produced by the methods described herein can be heavy chain dimers or light chain dimers. Still further, an antibody light or heavy chain or portion thereof (eg, a single domain antibody (DAb)) can be used.
別の実施形態において、本発明において記載されるようなヒト化Ｉｇ可変領域または本発明の方法によって生成されるヒト化Ｉｇ可変領域は、単一鎖抗体（ＳｃＦｖ）またはミニボディ中に存在する（例えば米国特許第５，８３７，８２１号またはＷＯ９４／０９８１７Ａ１を参照されたい）。ミニボディは、各々がＳｃＦｖ分子を含む２つのポリペプチド鎖から構成された二量体の分子である（１つまたは複数の抗原結合部位を含む単一ポリペプチド、例えば接続ペプチド経由でＣＨ３ドメインへ融合したＶＨドメインへ柔軟なリンカーによって連結されたＶＬドメイン）。ＳｃＦｖ分子は、ＶＨ−リンカー−ＶＬの方向性またはＶＬ−リンカー−ＶＨの方向性で構築することができる。抗原結合部位を作り上げるＶＬドメイン及びＶＨドメインを連結する柔軟なヒンジは、好ましくは約１０〜約５０アミノ酸残基を含む。この目的のための例示的な接続ペプチドは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３である（Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）．ＰＮＡＳ，８５：５８７９）。他の接続ペプチドは当技術分野において公知である。 In another embodiment, a humanized Ig variable region as described in the present invention or a humanized Ig variable region produced by a method of the present invention is present in a single chain antibody (ScFv) or minibody ( See, for example, US Pat. No. 5,837,821 or WO 94 / 09817A1). A minibody is a dimeric molecule composed of two polypeptide chains each containing a ScFv molecule (a single polypeptide containing one or more antigen binding sites, for example via a connecting peptide to the CH3 domain. V L domains linked by a flexible linker to the fused V H domains). ScFv molecules can be constructed with a V H -linker-V L orientation or a V L -linker-V H orientation. The flexible hinge that connects the VL and VH domains that make up the antigen binding site preferably comprises from about 10 to about 50 amino acid residues. An exemplary connecting peptide for this purpose is (Gly4Ser) 3 (Huston et al., (1988). PNAS, 85: 5879). Other connecting peptides are known in the art.
単一鎖抗体を作製する方法は当技術分野において周知である（例えばＨｏ ｅｔ ａｌ．（１９８９），Ｇｅｎｅ，７７：５１；Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８８）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３；Ｐａｎｔｏｌｉａｎｏ ｅｔ ａｌ．（１９９１），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：１０１１７；Ｍｉｌｅｎｉｃ ｅｔ ａｌ．（１９９１）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５１：６３６３；Ｔａｋｋｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ４：８３７）。ミニボディは、当技術分野において記述された方法を使用して、ＳｃＦｖ成分及び接続ペプチド−ＣＨ３成分を構築することによって作製することができる（例えば米国特許５，８３７，８２１またはＷＯ ９４／０９８１７Ａ１を参照されたい）。これらの成分を制限断片として分離したプラスミドから単離し、次いで適切なベクターの中へライゲーションし、再クローン化することができる。適切なアセンブリーは制限消化及びＤＮＡ配列分析によって検証することができる。一実施形態において、本発明のミニボディは接続ペプチドを含む。一実施形態において、接続ペプチドはＧｌｙ／Ｓｅｒリンカー、例えばＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧＧ（配列番号：６）を含む。 Methods for making single chain antibodies are well known in the art (eg, Ho et al. (1989), Gene, 77:51; Bird et al. (1988), Science 242: 423; Pantoliano et al. 1991), Biochemistry 30: 10117; Milenic et al. (1991), Cancer Research, 51: 6363; Takkinen et al. (1991), Protein Engineering 4: 837). Minibodies can be made by building ScFv components and connecting peptide-CH 3 components using methods described in the art (eg, US Pat. No. 5,837,821 or WO 94 / 09817A1). See). These components can be isolated from the plasmid isolated as a restriction fragment and then ligated into an appropriate vector and recloned. Appropriate assembly can be verified by restriction digestion and DNA sequence analysis. In one embodiment, the minibody of the invention comprises a connecting peptide. In one embodiment, the connecting peptide comprises a Gly / Ser linker, such as GGGSSSGGGSGGG (SEQ ID NO: 6).
別の実施形態において、四価ミニボディを構築することができる。２つのＳｃＦｖ分子が例えばアミノ酸配列（Ｇ４Ｓ）４Ｇ３ＡＳ（配列番号：７）を有する柔軟なリンカーを使用して連結されること以外は、四価ミニボディはミニボディと同じ様式で構築することができる。 In another embodiment, a tetravalent minibody can be constructed. The tetravalent minibody is the same as the minibody except that the two ScFv molecules are linked using, for example, a flexible linker having the amino acid sequence (G 4 S) 4 G 3 AS (SEQ ID NO: 7). Can be built.
別の実施形態において、本発明において記載されるようなヒト化可変領域または本発明の方法によって生成されるヒト化可変領域は、ダイアボディ中に存在し得る。ダイアボディはｓｃＦｖ分子に類似するが、同じポリペプチド鎖上のＶＬドメインとＶＨドメインが相互作用することができないように、通常両方の可変ドメインを接続する短い（１０未満及び好ましくは１〜５）アミノ酸残基リンカーを有する。その代りに、１つポリペプチド鎖のＶＬドメイン及びＶＨドメインは、第２のポリペプチド鎖上のＶＨ及びＶＬドメインと（それぞれ）相互作用する（ＷＯ０２／０２７８１）。 In another embodiment, a humanized variable region as described in the present invention or a humanized variable region produced by a method of the present invention may be present in a diabody. A diabody is similar to a scFv molecule but usually has a short (less than 10 and preferably 1 to 2) connecting both variable domains so that the VL and VH domains on the same polypeptide chain cannot interact. 5) It has an amino acid residue linker. Instead, the VL and VH domains of one polypeptide chain interact (respectively) with the VH and VL domains on the second polypeptide chain (WO02 / 02781).
別の実施形態において、本発明のヒト化可変領域は、ＦｃＲ結合部分へ作動可能に連結された抗体の免疫反応性断片または部分（例えばｓｃＦｖ分子、ミニボディ、四価ミニボディまたはダイアボディ）中に存在し得る。例示的な実施形態において、ＦｃＲ結合部分は完全なＦｃ領域である。 In another embodiment, the humanized variable region of the invention is in an immunoreactive fragment or portion of an antibody operably linked to an FcR binding portion (eg, scFv molecule, minibody, tetravalent minibody or diabody). Can exist. In an exemplary embodiment, the FcR binding portion is a complete Fc region.
好ましくは、本明細書において記述されるヒト化方法は、抗原についての親和性がドナー抗体に比較して実質的に変化しないＩｇ可変領域を生じる。 Preferably, the humanization methods described herein produce Ig variable regions in which the affinity for the antigen is not substantially altered compared to the donor antibody.
一実施形態において、本発明の可変ドメインを含むポリペプチドは、約１０５Ｍ−１、１０６Ｍ−１、１０７Ｍ−１、１０８Ｍ−１、１０９Ｍ−１、１０１０Ｍ−１、１０１１Ｍ−１または１０１２Ｍ−１（これらの値の親和性中間値が含まれる）の会合定数Ｋａを超える（またはそれに等しい）結合親和性で抗原へ結合する。 In one embodiment, the polypeptide comprising a variable domain of the invention has about 10 5 M −1 , 10 6 M −1 , 10 7 M −1 , 10 8 M −1 , 10 9 M −1 , 10 10 M It binds to the antigen with a binding affinity that exceeds (or is equal to) an association constant Ka of −1 , 10 11 M −1 or 10 12 M −1 (including intermediate values of these values).
親和性、結合活性、及び／または特異性は多様な手法で測定することができる。一般的に、及び親和性が定義または測定される正確な様式にかかわらず、本発明の方法が作製された抗体（複数可）に対する臨床適用の任意の態様において上回る抗体を生成する場合、本発明の方法は抗体親和性を改善する（例えば、それが作製された抗体（複数可）よりも低用量で、低頻度で、またはより便利な投与経路によって、修飾された抗体を投与することができる場合、本発明の方法は効果的または成功したと判断される）。 Affinity, binding activity, and / or specificity can be measured in a variety of ways. In general, and regardless of the precise manner in which affinity is defined or measured, the present invention provides for the production of antibodies that outperform any aspect of clinical application to the antibody (s) for which the method of the invention was made. This method improves antibody affinity (eg, the modified antibody can be administered at a lower dose, less frequently, or by a more convenient route of administration than the antibody (s) from which it was made) The method of the present invention is deemed effective or successful.
より具体的には、抗体とそれが結合する抗原との間の親和性は、様々なアッセイ（例えばＥＬＩＳＡアッセイ、ＢｉａＣｏｒｅアッセイまたはＫｉｎＥｘＡ（商標）３０００アッセイ（Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｂｏｉｓｅ、ＩＤ）から入手可能）が含まれる）によって測定することができる。簡潔には、セファロースビーズは、抗原（本発明の方法において使用される抗原は、対象となる任意の抗原（例えば癌抗原；細胞表面タンパク質または分泌タンパク質；病原体の抗原（例えば細菌性抗原またはウイルス性抗原（例えばＨＩＶ抗原、インフルエンザ抗原または肝炎抗原））またはアレルゲン）であり得る）により、共有結的な付加によってコーティングされる。試験される抗体の希釈を調製し、各々の希釈をプレート上の指定のウェルへ添加する。次いで検出抗体（例えばヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰコンジュゲート）、続いて色素形成性基質（例えばＨＲＰ）を各々のウェルに添加する。次いでプレートを４５０ｎＭでＥＬＩＳＡプレートリーダーで読み取り、ＥＣ５０値を計算する（ここで記述された方法が一般的には適用可能であることは理解されるが、それらは任意の特定の抗原または抗原のクラスを結合する抗体の生産に限定されない）。 More specifically, the affinity between an antibody and the antigen to which it binds can be determined by various assays (eg, ELISA assay, BiaCore assay, or KinExA ™ 3000 assay (available from Sapidyne Instruments (Boise, ID)). Is included). Briefly, sepharose beads are antigens (antigens used in the methods of the invention can be any antigen of interest (eg, cancer antigen; cell surface protein or secreted protein); pathogen antigen (eg, bacterial antigen or viral). It can be coated by a covalent addition with an antigen (e.g. HIV antigen, influenza antigen or hepatitis antigen)) or allergen). Prepare dilutions of the antibody to be tested and add each dilution to the designated well on the plate. A detection antibody (eg, goat anti-human IgG-HRP conjugate) is then added to each well, followed by a chromogenic substrate (eg, HRP). The plate is then read at 450 nM in an ELISA plate reader and EC50 values are calculated (it will be understood that the methods described herein are generally applicable, but they can be applied to any particular antigen or class of antigens). Is not limited to the production of antibodies that bind
当業者は、必ずしも親和性の決定がただ一つの図から判断するように単純だとは限らないということを認識するだろう。抗体に２つの腕があるので、それらの見かけ上の親和性は可変領域と抗原との間の内因的な親和性（これは結合活性に起因すると考えられる）よりも通常はるかに高い。内因的な親和性はｓｃＦｖまたはＦａｂ断片を使用して測定することができる。 One skilled in the art will recognize that determining affinity is not always as simple as judging from a single figure. Because antibodies have two arms, their apparent affinity is usually much higher than the intrinsic affinity between the variable region and the antigen, which is believed to be due to binding activity. Endogenous affinity can be measured using scFv or Fab fragments.
別の態様において、本発明は、治療用部分（細胞毒素、薬剤（例えば免疫抑制剤）または放射性毒素等）へコンジュゲートされたヒト化ウサギ抗体またはその断片を特色とする。かかるコンジュゲートは「免疫コンジュゲート」と本明細書において称される。 In another aspect, the invention features a humanized rabbit antibody or fragment thereof conjugated to a therapeutic moiety (such as a cytotoxin, drug (eg, immunosuppressive agent) or radiotoxin). Such conjugates are referred to herein as “immunoconjugates”.
本発明の抗体コンジュゲートを使用して与えられた生物学的応答を修飾することができ、薬剤部分は古典的な化学療法剤に限定されると解釈されるべきでない。例えば、薬剤部分は所望される生物学的活性を保持するタンパク質またはポリペプチドであり得る。かかるタンパク質には、例えば酵素的に活性な毒素またはその活性断片（アブリン、リシンＡ、緑膿菌外毒素またはジフテリア毒素等）；タンパク質（腫瘍壊死因子またはインターフェロン−γ等）；または生物応答修飾因子（例えばリンホカイン、インターロイキン１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン６（「ＩＬ−６」）、顆粒細胞マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）または他の増殖因子等）が含まれ得る。 An antibody conjugate of the invention can be used to modify a given biological response and the drug moiety should not be construed as limited to classical chemotherapeutic agents. For example, the drug moiety can be a protein or polypeptide that retains the desired biological activity. Such proteins include, for example, enzymatically active toxins or active fragments thereof (such as abrin, ricin A, Pseudomonas exotoxin or diphtheria toxin); proteins (such as tumor necrosis factor or interferon-γ); or biological response modifiers (Eg, lymphokines, interleukin 1 (“IL-1”), interleukin 2 (“IL-2”), interleukin 6 (“IL-6”), granule cell macrophage colony stimulating factor (“GM-CSF”)) , Granulocyte colony stimulating factor ("G-CSF") or other growth factors).
かかる治療用部分を抗体へコンジュゲートするための技法は周知であり、例えばＡｒｎｏｎ ｅｔ ａｌ．，”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ”，ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．２４３−５６（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，”Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”，ｉｎ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（２ｎｄ Ｅｄ．），Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．６２３−５３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ，”Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ”，ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．４７５−５０６（１９８５）；”Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ Ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ”，ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．３０３−１６（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８５）、及びＴｈｏｒｐｅ ｅｔ ａｌ．，”Ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ”，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，６２：１１９−５８（１９８２）を参照されたい。 Techniques for conjugating such therapeutic moieties to antibodies are well known and are described, for example, in Arnon et al. , "Monoclonal Antibodies For Immunization Of Drugs In Cancer Therapies", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (Eds.), Pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al. "Antibodies For Drug Delivery", In Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (Eds.), Pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, “Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapeutics: A Review”, in Monoclonal Antibiology. (Eds.), Pp. 475-506 (1985); “Analysis, Results, And Future Prospective of The Therapeutic Use of Radiolabeled Anti-Candocal Therapeutics”, in Monocology. (Eds.), Pp. 303-16 (Academic Press 1985), and Thorpe et al. "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev. 62: 119-58 (1982).
一態様において、本発明は疾患の治療のためのヒト化ウサギ抗体を含む薬学的製剤を提供する。「薬学的製剤」という用語は、抗体または抗体誘導体の生物学的活性が明白に効果的であり、それは製剤が投与される被験体に対して毒性のある追加成分を含有しないことを可能にするような形態である調製物を指す。「薬学的に許容される」賦形剤（賦形剤、添加剤）は、用いられた活性成分の効果的な用量を提供するように被験体哺乳類へ正当に投与することができるものである。 In one aspect, the invention provides a pharmaceutical formulation comprising a humanized rabbit antibody for the treatment of disease. The term “pharmaceutical formulation” allows the biological activity of the antibody or antibody derivative to be clearly effective, which allows the formulation to contain no additional components that are toxic to the subject being administered. Refers to a preparation that is in such a form. "Pharmaceutically acceptable" excipients (excipients, additives) are those that can be legitimately administered to a subject mammal so as to provide an effective dosage of the active ingredient used. .
均等物
本発明の多数の修飾及び代替の実施形態は、前述の記述を考慮して当業者に明らかであろう。したがって、この記述は例示のみと解釈されるべきであり、当業者に本発明の実行のための最良の形態を教示する目的のためである。構造の詳細は本発明の趣旨から逸脱せずに実質的に変動することができ、添付の請求項の範囲内で生じてくるすべての修飾物の独占使用が保有される。本発明は、添付の請求項及び法律が適用可能なルールによって必要とされる程度のみに限定されることが意図される。
Equivalents Numerous modifications and alternative embodiments of the invention will be apparent to those skilled in the art in view of the foregoing description. Accordingly, this description is to be construed as illustrative only and is for the purpose of teaching those skilled in the art the best mode of carrying out the invention. The details of the construction may vary substantially without departing from the spirit of the invention, and the exclusive use of all modifications that come within the scope of the appended claims is retained. It is intended that the present invention be limited only to the extent required by the applicable claims and the applicable rules.
本出願中で引用されるすべての文献及び類似の材料（特許、特許出願、物品、本、論文、学位論文、ウェブページ、図及び／または付属書類が、かかる文献及び類似の材料のフォーマットにかかわらず含まれる）は、それらの全体が参照として明示的に援用される。援用された文献及び類似の材料のうちの１つまたは複数が、本出願（定義された用語、用語使用、記述された技法または同種のものが含まれる）とは異なるかまたは矛盾する場合、本出願が優先する。 All references and similar materials cited in this application (patents, patent applications, articles, books, papers, dissertations, web pages, figures and / or appendices, regardless of the format of such references and similar materials) All of which are expressly incorporated by reference in their entirety. If one or more of the incorporated literature and similar materials is different or inconsistent with this application (including defined terms, terminology usage, described techniques or the like), The application takes precedence.
Claims (16)
（ａ）位置１２でのセリン（Ｓ）；
（ｂ）位置１０３でのセリン（Ｓ）もしくはスレオニン（Ｔ）；及び／または
（ｃ）位置１４４でのセリン（Ｓ）もしくはスレオニン（Ｔ）
である、請求項２に記載のヒト重鎖アクセプターフレームワーク。 Said substitution is
(A) serine (S) at position 12;
(B) serine (S) or threonine (T) at position 103; and / or (c) serine (S) or threonine (T) at position 144
The human heavy chain acceptor framework of claim 2, wherein
（ａ）ウサギ目の動物免疫結合物の可変軽鎖ＣＤＲを含む軽鎖アクセプターフレームワーク；及び
（ｂ）ウサギ目の動物免疫結合物の可変重鎖ＣＤＲを含む請求項１に記載のヒト重鎖アクセプターフレームワーク
を含む、免疫結合物。 Specific for the desired antigen,
2. The human heavy of claim 1 comprising (a) a light chain acceptor framework comprising a variable light chain CDR of a rabbit eye animal immune conjugate; and (b) a variable heavy chain CDR of a rabbit eye animal immune conjugate. An immunoconjugate comprising a chain acceptor framework.
（ａ）ドナーウサギ免疫結合物からのＣＤＲ Ｈ１、ＣＤＲ Ｈ２及びＣＤＲ Ｈ３配列からなる群のうちの少なくとも１つの重鎖ＣＤＲを請求項１に記載のヒト重鎖アクセプターフレームワークの中へグラフトすることと；
（ｂ）ドナーウサギ免疫結合物からのＣＤＲ Ｌ１、ＣＤＲ Ｌ２及びＣＤＲ Ｌ３配列からなる群のうちの少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲを配列番号：２と少なくとも８５％の同一性を有するヒト軽鎖アクセプターフレームワークの中へグラフトすることと
を含む、方法。 A method for humanizing a rabbit immunoconjugate comprising:
(A) grafting at least one heavy chain CDR of the group consisting of CDR H1, CDR H2, and CDR H3 sequences from a donor rabbit immunoconjugate into the human heavy chain acceptor framework of claim 1 And that;
(B) a human light chain acceptor having at least one 85% identity with SEQ ID NO: 2 of at least one light chain CDR of the group consisting of CDR L1, CDR L2 and CDR L3 sequences from a donor rabbit immunoconjugate Grafting into the framework.
（ａ）位置１２でのセリン（Ｓ）；
（ｂ）位置１０３でのスレオニン（Ｔ）；及び
（ｃ）位置１４４でのスレオニン（Ｔ）
からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。 Said substitution at one or more of positions 12 and 103 and 144 is
(A) serine (S) at position 12;
(B) Threonine (T) at position 103; and (c) Threonine (T) at position 144.
The method of claim 14, wherein the method is selected from the group consisting of:
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