JP2016217854A - ラック色素中のタンパク質の分析方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ラック色素中のタンパク質の分析方法であって、
(1)(i)タンパク質を含有する可能性があるラック色素試料を、9〜10の範囲内のpHを有する水系溶媒に溶解させてラック色素水溶液を調製する段階、
(ii)前記段階(i)で調製したラック色素水溶液のpHを7.5〜9未満の範囲内に調整する段階、及び
(iii)前記段階(ii)でpHを調整したラック色素水溶液を、固定相としてデキストラン及びその誘導体、並びにアガロース及びその誘導体から選択される1種以上の多糖類の架橋物を用い、かつ移動相として5mM以上の塩濃度及び1.5〜9の範囲内のpHを有する水性溶液を用いるゲル濾過に付し、タンパク質を含有する可能性がある溶離液を回収する段階
を含むラック色素試料の前処理段階、及び
(2)前記前処理段階(1)を経た前記ラック色素試料を分析する段階
を含む分析方法。
【選択図】なし
Description
近代、合成色素の発達により天然色素の使用は減少する傾向にあったが、近年では、自然志向の高まりと共に、再び、天然色素が好まれるようになっている。
しかし、天然色素は、動植物等の天然物から抽出及び精製を行って得られるものであるので、天然物に含まれるタンパク質等の残存が問題になることがある。
しかし、従来、ラック色素が含有するタンパク質の量を測定する方法は知られておらず、食品添加物公定書第8版においても、ラック色素中のタンパク質の量は規定されていない。
例えば、非特許文献1では、種々の天然着色料の分析が行われ、ラック色素製剤の分析も行われているが、その夾雑タンパク質の分析は行われていない。
しかし、近年のアレルゲンに対する意識の高まりから、ラック色素が含有するタンパク質の精密な分析方法(本明細書中、用語「分析」は、検出、及び定量を包含する。)を確保することは、有意義である。
例えば、慣用のタンパク質分析方法であるセミミクロケルダール法は、タンパク質そのものの量ではなく窒素の量の測定に基づく方法であり、構成原子として窒素原子を有さないコチニール色素等の夾雑タンパク質の分析に利用できる。
しかし、ラック色素の色素成分であるラッカイン酸は、その構成原子として窒素原子を有するので、セミミクロケルダール法をラック色素が含有するタンパク質の分析に適用することはできない。
また、一般に、タンパク質の精密な分析法においては、高精度の定量法であるブラッドフォード法(Bradford法)、及びタンパク質を分子量によって分離できるSDS−Page法が利用されている。
しかし、ラック色素の主要な色素成分であるラッカイン酸は、当該ブラッドフォード法及びSDS−Page法に原理的に干渉するので、従来、ラック色素中に含有されるアレルゲンタンパク質の分析に当該方法を利用することはできない。なお、このことから理解されるように、この問題は、色価が高いラック色素において顕著である。
また、タンニン酸濁度法は色素中の夾雑タンパク質の量を正確に測定できる方法でない。
しかし、本発明者らは、鋭意検討の結果、所定の可溶化処理をしたラック色素試料を所定のゲル濾過処理に付すことによって、ラック色素中に含有されるタンパク質をラック色素の色素成分から分離できることを見出し、及びこのことにより、ラック色素試料から、当該タンパク質の分析に干渉する色素成分を、当該タンパク質の精密な分析が可能になる程度まで除去できること、言い方を換えれば、分析の対象であるタンパク質を選択的に集められることを見出した。
ここで、本発明者らの検討により、ラック色素の色価が高い場合は、前記所定の可溶化処理、及び所定のゲル濾過処理のみでは当該分離が不充分である問題が明らかになったが、本発明者らは、更に、このように特に色価が高いラック色素試料の場合でも、ゲル濾過処理の前に更に、所定の限外濾過処理を実施することによって、前記分離が可能になることを見出した。
本発明者らは、かかる知見に基づき、更なる研究の結果本発明を完成するに至った。
(1)(i)タンパク質を含有する可能性があるラック色素試料を、9〜10の範囲内のpHを有する水系溶媒に溶解させてラック色素水溶液を調製する段階、
(ii)前記段階(i)で調製したラック色素水溶液のpHを7.5〜9未満の範囲内に調整する段階、及び
(iii)前記段階(ii)でpHを調整したラック色素水溶液を、固定相としてデキストラン及びその誘導体、並びにアガロース及びその誘導体から選択される1種以上の多糖類の架橋物を用い、かつ移動相として5mM以上の塩濃度及び1.5〜9の範囲内のpHを有する水性溶液を用いるゲル濾過に付し、タンパク質を含有する可能性がある溶離液を回収する段階
を含むラック色素試料の前処理段階、及び
(2)前記前処理段階(1)を経た前記ラック色素試料を分析する段階
を含む分析方法。
項2. 前記水性溶液のpHが7〜9の範囲内である項1に記載の分析方法。
項3. 前記水性溶液のpHが7.5〜8.5の範囲内である項2に記載の分析方法。
項4. 前記水性溶液の塩濃度が5〜55mMの範囲内である項1〜3のいずれか1項に記載の分析方法。
項5. 前記水性溶液の塩濃度が10〜50mMの範囲内である項4に記載の分析方法。
項6. 前記水性溶液がリン酸緩衝液である項1〜5のいずれか1項に記載の分析方法。
項7. 前記段階(iii)の前に、更に、
(iv)前記段階(ii)でpHを調整したラック色素水溶液を分画分子量3kD以上の限外濾過に付して、色素成分の少なくとも一部を除去する段階を含む
項1〜6のいずれか1項に記載の分析方法。
項8. 前記ラック色素試料が高い色価を有する場合に段階(iv)を実施する
項7に記載の分析方法。
項9. タンパク質分析用のラック色素試料の調製方法であって、
(i)タンパク質を含有する可能性があるラック色素試料を、9〜10の範囲内のpHを有する水系溶媒に溶解させてラック色素水溶液を調製する段階、
(ii)前記段階(i)で調製したラック色素水溶液のpHを7.5〜9未満の範囲内に調整する段階、及び
(iii)前記段階(ii)でpHを調整したラック色素水溶液を、固定相としてデキストラン及びその誘導体、並びにアガロース及びその誘導体から選択される1種以上の多糖類の架橋物を用い、かつ移動相として5mM以上の塩濃度及び1.5〜9の範囲内のpHを有する水性溶液を用いるゲル濾過に付し、タンパク質を含有する可能性がある溶離液を回収する段階
を含む調製方法。
項10. 前記水性溶液のpHが7〜9の範囲内である項9に記載の調製方法。
項11. 前記水性溶液のpHが7.5〜8.5の範囲内である項10に記載の調製方法。
項12. 前記水性溶液の塩濃度が5〜55mMの範囲内である項9〜11のいずれか1項に記載の調製方法。
項13. 前記水性溶液の塩濃度が10〜50mMの範囲内である項12に記載の調製方法。
項14. 前記水性溶液がリン酸緩衝液である項9〜13のいずれか1項に記載の調製方法。
項15. 前記ゲル濾過段階の前に、更に、前記ラック色素試料を分画分子量3kD以上の限外濾過に付して、ラック色素を除去する限外濾過段階を含む
項9〜14のいずれか1項に記載の調製方法。
項16. 前記ラック色素試料が高い色価を有する場合に前記限外濾過段階を実施する
項15に記載の調製方法。
項17. 項9〜16のいずれか1項に記載の調製方法で得られたタンパク質分析用のラック色素試料を分析することを含む
ラック色素試料中のタンパク質の調製方法。
項18. ラック色素中のタンパク質の分析のためのラック色素試料の前処理方法であって、
(i)タンパク質を含有する可能性があるラック色素試料を、9〜10の範囲内のpHを有する水系溶媒に溶解させてラック色素水溶液を調製する段階、
(ii)前記段階(i)で調製したラック色素水溶液のpHを7.5〜9未満の範囲内に調整する段階、及び
(iii)前記段階(ii)でpHを調整したラック色素水溶液を、固定相としてデキストラン及びその誘導体、並びにアガロース及びその誘導体から選択される1種以上の多糖類の架橋物を用い、かつ移動相として5mM以上の塩濃度及び1.5〜9の範囲内のpHを有する水性溶液を用いるゲル濾過に付し、タンパク質を含有する可能性がある溶離液を回収するゲル濾過段階
を含む前処理方法。
項19. 前記水性溶液のpHが7〜9の範囲内である項18に記載の前処理方法。
項20. 前記水性溶液のpHが7.5〜8.5の範囲内である項19に記載の前処理方法。
項21. 前記水性溶液の塩濃度が5〜55mMの範囲内である項18〜20のいずれか1項に記載の前処理方法。
項22. 前記水性溶液の塩濃度が10〜50mMの範囲内である項21に記載の前処理方法。
項23. 前記水性溶液がリン酸緩衝液である項18〜22のいずれか1項に記載の前処理方法。
項24. 前記ゲル濾過段階の前に、更に、前記ラック色素試料を分画分子量3kD以上の限外濾過に付して、ラック色素を除去する限外濾過段階を含む
項18〜23のいずれか1項に記載の前処理方法。
項25. 前記ラック色素試料が高い色価を有する場合に前記限外濾過段階を実施する
項24に記載の前処理方法。
項26. 項19〜25のいずれか1項に記載の調製方法で得られたタンパク質分析用のラック色素試料を分析することを含む
ラック色素試料中のタンパク質の前処理方法。
ラック色素の主要な色素成分はラッカイン酸である。
本明細書中、「ラック色素試料」とは、本発明の分析方法に供される当該色素の試料の他に、本発明の分析方法における各段階を経た試料を意味する場合がある。これらの意味は、その前後の文脈によって理解される。
本発明のラック色素試料中のタンパク質の分析方法は、
(1)(i)タンパク質を含有する可能性があるラック色素試料を、7.5〜11の範囲内のpHを有する水系溶媒に溶解させてラック色素水溶液を調製する段階、
(ii)前記段階(i)で調製したラック色素水溶液のpHを7〜14の範囲内に調整する段階、及び
(iii)前記段階(ii)でpHを調整したラック色素水溶液を、固定相としてデキストラン及びその誘導体、並びにアガロース及びその誘導体から選択される1種以上の多糖類の架橋物を用い、かつ移動相として5mM以上の塩濃度及び1.5〜9の範囲内のpHを有する水性溶液を用いるゲル濾過に付し、タンパク質を含有する可能性がある溶離液を回収する段階
を含むラック色素試料の前処理段階(本明細書中、前処理段階(1)と称する場合がある。)、及び
(2)前記前処理段階(1)を経た前記ラック色素試料を分析する段階(本明細書中、分析段階(2)と称する場合がある。)
を含む。
本発明の分析方法の分析対象は、ラック色素試料中のタンパク質である。
当該分析対象であるタンパク質は、好ましくは、前記ラック色素に共有結合していないタンパク質である。
当該タンパク質は、通常、ラックカイガラムシ(Laccifer Lacca Kerr)由来のタンパク質である。
本発明の分析方法に供される試料は、通常、タンパク質を含有するラック色素試料であるが、本発明の分析方法は、ラック色素試料がタンパク質を含有しないこと(又は、タンパク質の含有量が検出限界以下であること)を確認する目的でも利用できる。
従って、本発明の分析方法は、タンパク質を含有する可能性がある、あらゆるラック色素試料に適用できる。
通常、ラック色素は、粉末、塊、液体又はペースト状である。その試料は、当該前処理段階(1)において、以下に詳細に説明する段階(i)、及び段階(ii)を経て、後記で詳細に説明する段階(iii)のゲル濾過に付される。
段階(i)では、ラック色素試料を水系溶媒に溶解させる。
段階(i)においては、ラック色素試料の少なくとも一部が水系溶媒に溶解されればよいが、大部分のラック色素試料が溶解されることが好ましく、全てのラック色素試料が溶解されることがより好ましい。
当該水系溶媒のpHは、9〜10の範囲内であり、好ましくは、9.2〜9.8の範囲内であり、より好ましくは、9.4〜9.6の範囲内であり、特に好ましくは、9.5である。
当該水系溶媒は、好適に、リン酸水素二ナトリウム水溶液であることができる。
当該リン酸水素二ナトリウム水溶液の濃度は、好ましくは、1〜1000mMの範囲内であり、より好ましくは、5〜100mMの範囲内であり、及び特に好ましくは、50mMである。
段階(i)で用いられる当該水系溶媒の量は、例えば、ラック色素試料の色価80に対し、1〜10重量部の範囲内であることができる。
当該ラック色素試料は液状であってもよい。すなわち、ラック色素試料の「溶解」は、ラック色素試料の希釈であってもよい。
液状のラック色素試料として、具体的には、例えば、カイガラムシ科ラックカイガラムシ(Laccifer Lacca Kerr)の樹脂状分泌物質の乾燥粉末10gに対し、水100mLを加え、室温下で60分間攪拌抽出し、ろ紙(ADVANTEC 5A(110mm)、東洋濾紙株式会社)で濾過した抽出液が例示される。
段階(ii)では、前記段階(i)で調製したラック色素水溶液のpHを7.5〜9未満の範囲内、好ましくは、7.6〜8.5の範囲内、より好ましくは、7.8〜8.2の範囲内、特に好ましくは、8に調整する。
当該pHの調整は、pH調整剤を使用して、行えばよい。
当該pH調整剤自体のpHは、1〜7の範囲内であり、好ましくは、3〜6の範囲内であり、より好ましくは、4〜5の範囲内であり、特に好ましくは、4.5である。
当該pH調整剤は、好適に、リン酸二水素ナトリウム水溶液であることができる。
当該リン酸二水素ナトリウム水溶液の濃度は、好ましくは、1〜1000mMの範囲内であり、より好ましくは、5〜100mMの範囲内であり、及び特に好ましくは、50mMである。
段階(iii)では、前記段階(ii)でpHを調整したラック色素水溶液を、固定相としてデキストラン及びその誘導体、並びにアガロース及びその誘導体から選択される1種以上の多糖類の架橋物を用い、かつ移動相として5mM以上の塩濃度及び1.5〜9の範囲内のpHを有する水性溶液を用いるゲル濾過に付し、タンパク質を含有する可能性がある溶離液を回収する。
当該架橋物の好ましい例は、1−クロロ−2,3−エポキシ−プロパン架橋デキストランゲルを包含する。
当該移動相としての水性溶液のpHは、好ましくは7〜9の範囲内であり、より好ましくは7.5〜8.5の範囲内である。
当該pHがこのような範囲内であることにより、段階(iii)のゲル濾過において、ラック色素試料中の色素成分とタンパク質とが充分に分離される。
pHの調整は、酸性物質、塩基性物質、及び緩衝剤(例、リン酸緩衝剤)等の添加のような慣用の用法により行えばよい。これらの物質は、1種単独で、又は2種以上の組み合わせで用いることができる。
当該移動相としての水性溶液の塩濃度は、好ましくは5〜55mMの範囲内であり、より好ましくは10〜50mMの範囲内である。
当該塩濃度がこのような範囲内であることにより、段階(iii)のゲル濾過において、ラック色素試料中の色素成分とタンパク質とが充分に分離される。
塩濃度の調整は、塩の添加のような慣用の用法により行えばよい。当該塩の例は、NaCl、及び緩衝剤(例、リン酸緩衝剤)を含む。これらの物質は、1種単独で、又は2種以上の組み合わせで用いることができる。
具体的には、ラック色素試料を固定相であるゲルに負荷し、当該ゲルに移動相を通して、溶出液を回収する。
前記固定相は、好ましくは、ラック色素の負荷の前に、前記移動相に用いられる水性溶液と同じ組成の水性溶液を用いて平衡化される。
この傾向に基づき、タンパク質を含有する画分(又はタンパク質を含有する可能性がある画分)を選択して集めることにより、ラック色素試料から、当該タンパク質の分析に干渉する色素成分を、当該タンパク質の精密な分析が可能になる程度まで除去できる。
すなわち、前処理段階(1)を経たラック色素試料は、元のラック色素試料に比べて、タンパク質含有量に対する色素成分含有量が減少している。
ラック色素試料の色価が高い場合、段階(i)、(ii)、及び(iii)のみでは、ラック色素試料から、ラック色素中のタンパク質の分析に干渉する色素成分を、当該タンパク質の精密な分析が可能になる程度まで除去できない場合がある。
ここで、「ラック色素試料の色価が高い場合」とは、例えば、色価が20以上の場合、又は色価が40以上の場合であることができる。
この場合、前記段階(iii)の前(前記可溶化処理の後)に、更に、前記段階(ii)でpHを調整したラック色素水溶液を分画分子量3kD以上の限外濾過に付して、ラック色素試料中の色素成分の少なくとも一部(言い換えると、一部又は全部)を除去すること(段階(iv))を好適に実施できる。当該段階(iv)を経たラック色素試料は、元のラック色素試料に比べて、タンパク質含有量に対する色素成分含有量が減少している。これにより、その後の段階(iii)で、ラック色素中のタンパク質の分析に干渉する色素成分を、当該タンパク質の精密な分析が可能になる程度まで除去できるようになる。なお、段階(iv)においてラック色素の色素成分の全部が除去された場合、段階(iii)を行う必要は無いが、その場合でも、段階(iii)を行う場合は、本発明の範囲内である。
当該限外濾過は、限外濾過膜を用いて実施できる。
当該限外濾過においては、遠心等により、ラック色素を含有する液の限外濾過膜の通過を促進させられる。当該遠心の条件は、技術常識により適当に設定できるが、例えば、4000×g、40分間程度である。
ラック色素が含有するタンパク質は、限外濾過膜を通過せずに、当該限外濾過膜の上のラック色素試料中に残る。
好ましくは、ラック色素試料にリン酸緩衝液を加えて限外濾過を繰り返すことにより、ラック色素試料を洗浄すること、言い換えれば、色素成分を更に除去することができる。当該洗浄は、例えば、色価が高くなくなるまで(すなわち、例えば、色価が40未満になるまで、又は色価が20未満になるまで)繰り返すことが好ましく、具体的には、例えば、4〜5回繰り返される。
当該限外濾過は、例えば、限外濾過膜を備え、限外濾過に使用できる市販の遠心式濾過ユニット(例、Amicon−15(商品名、ミリポア社))を用いて、その説明書の記載に従って実施できる。
なお、本明細書中、色価とは、着色料溶液の可視部での極大吸収波長における吸光度を測定し、10w/v%溶液の吸光度に換算した数値であり、色価は、好適には、第8版食品添加物公定書に記載の方法に従って、測定される。
必要に応じて、所望により、タンパク質の分析段階の前の適当な段階、好ましくは、前処理段階(1)(すなわち、前処理段階(1)における段階(iii)の後に、タンパク質を含有する可能性があるラック色素試料を濃縮してもよい。当該濃縮は、限外濾過等の慣用の方法により実施すればよい。当該限外濾過は、例えば、限外濾過に使用できる市販の遠心式濾過ユニット(例、Amicon−4(商品名、ミリポア社))を用いて、その説明書の記載に従って実施できる。
本発明は、別の側面では、タンパク質分析用のラック色素試料の調製方法、又はラック色素中のタンパク質の分析のためのラック色素試料の前処理方法であることができる。これらの方法は、前記分析方法において説明した前処理方法と同様に実施できる。
カイガラムシ科ラックカイガラムシ(Laccifer Lacca Kerr)の樹脂状分泌物質の乾燥粉末10gに対し、水100mLを加え、室温下で60分間攪拌抽出し、ろ紙(ADVANTEC 5A(110mm)、東洋濾紙株式会社)で濾過した抽出液をラック色素抽出液とした。本抽出液の主色素成分はアントラキノン系ラッカイン酸である。
ラック色素抽出液を0.5%無水炭酸ナトリウムに溶解させた後、0.1N塩酸水で適度に希釈し、可視部での最大吸収波長(410nm)における吸光度を測定した。当該吸光度を10w/v%溶液の吸光度に換算した値を色価とした。
段階(i)、及び(ii)(可溶化処理)
タンパク質分析用のラック色素試料は、ラック色素抽出液を50mMリン酸水素ナトリウム水溶液(pH9.5)に溶解させた後、50mMリン酸二水素ナトリウム水溶液(pH4.5)を加え、pHを8に調整した。
ゲル濾過カラムとして、1−クロロ−2,3−エポキシ−プロパン架橋デキストランゲル8.3mLをカラム1.45×5.0cmに充填した市販のゲル濾過クロマトグラフィーカラム(PD−10カラム/GEヘルスケア社、商品名)を用いた。
同カラムを予め50mMリン酸緩衝液(pH8.0)で平衡化し、ラック色素抽出液1mLを負荷した。
次いで、50mMリン酸緩衝液(pH8.0)を当該カラムに注入し、溶出液を1mLずつ13画分、分取した。
各タンパク溶出画分を、それぞれ、分子量3kDでの分画性能をもつ再生セルロースメンブレン限外濾過ユニット(Amicon Ultra/Merck社、商品名を用いて1mLに濃縮した。
当該濃縮溶液の一部をBradford法によるタンパク質定量に供し、各画分におけるタンパク質の有無を評価した。その結果、タンパク質溶出画分はNo.4〜8の画分であった。一方、タンパク質定量を妨害する色素成分の溶出は、No.9以降の画分であった。色素成分の溶出は、吸光度(620nm)(有効数字2桁)によって検出した(吸光度測定のブランクとしては、50mMリン酸緩衝液(pH8.0)を用いた)。
表1中、色価について、表中の記号は、以下のことを示す。
− :吸光度が0.00
± :吸光度が0.01以上0.10未満
+ :吸光度が0.10以上0.40未満
++:吸光度が0.40以上
ここで、画分の吸光度が0.01以上0.10未満の場合、当該画分はラック色素を含有するが、この程度の小量であれば、タンパク質の分析へのラック色素の干渉は無視できる。
すなわち、表1から理解されるように、ラック色素抽出液の色価の上限が10〜40の場合、当該前処理により、ラック色素抽出液中のタンパク質を、その分析に干渉する色素成分から分離できること、及び、このことにより、当該タンパク質の分析に干渉する色素成分を、当該タンパク質の精密な分析が可能になる程度まで除去できること、が確認された。
このことは、逆に言えば、当該処理でラック色素成分からタンパク質を分離可能なラック色素抽出液の色価の上限は40であったことを意味する。
3)段階(iv)[限外濾過]
分画分子量3kDの限外濾過ユニット(商品名:Amicon−15、ミリポア社)を用いて、色価が40を超えるラック色素抽出液を、色価が40以下となるように限外濾過(4,000×g、40分間を4〜5回)した。
段階(iv)を含まない前記前処理段階(1)を経た試料、及び段階(iv)を含む前処理段階(1)を経た試料を、それぞれ、50mMリン酸緩衝液(pH8.0)で適度に希釈し、Bradford法(Anal. Biochem., 72, 248 (1976).)に従い、タンパク質の定量を行った。検量線作成には、標準タンパクに牛血清アルブミン水溶液を用いた。
その結果、ラック色素抽出液中のタンパク質の量は、350μg/mLであった。
段階(iv)を含む前処理段階(1)を経た試料、及びラック色素抽出液(前処理段階(1)を経ていない試料)について、次のようにSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を実施した。
試料100μlに、Laemmliサンプルバッファー(BioRad社、商品名)95μl、及び2−メルカプトエタノール5μlを加え、及び5分間煮沸して、SDS−ポリアクリルアミドゲルに負荷する試料を得た。電気泳動の条件はLaemmli法(Nature,227,680(1970))に従った(当該条件を後記した。)。電気泳動後のゲルの染色は、慣用の方法であるCBB染色法によって実施した。
ラック色素の泳動ゲルのCBB染色結果を図1に示す(図1左:前処理段階(1)を行わなかった試料。図1右:段階(iv)を含む前処理段階(1)を行った試料)。前処理段階(1)を行わなかった試料の場合、バンドがスメアになり、各タンパク質の検出が行えなかったが、段階(iv)を含む前処理段階(1)を行った試料の場合、タンパク質のバンドが明瞭に観察された。
<電気泳動条件>
・ゲル:10〜20%ポリアクリルアミドゲル(TEFCO社、商品名)
・泳動条件:200V定圧、約40分
・電気泳動用緩衝液:10×Tris/Glycine/SDSプレミックスバッファー(BioRad社、商品名)を超純水で10倍希釈した。
・分子量マーカー:Precision Plus Protein Standards(BioRad社、商品名)
・試料負荷量: 3μg protein/10μl/well
Claims (8)
- ラック色素中のタンパク質の分析方法であって、
(1)(i)タンパク質を含有する可能性があるラック色素試料を、9〜10の範囲内のpHを有する水系溶媒に溶解させてラック色素水溶液を調製する段階、
(ii)前記段階(i)で調製したラック色素水溶液のpHを7.5〜9未満の範囲内に調整する段階、及び
(iii)前記段階(ii)でpHを調整したラック色素水溶液を、固定相としてデキストラン及びその誘導体、並びにアガロース及びその誘導体から選択される1種以上の多糖類の架橋物を用い、かつ移動相として5mM以上の塩濃度及び1.5〜9の範囲内のpHを有する水性溶液を用いるゲル濾過に付し、タンパク質を含有する可能性がある溶離液を回収する段階
を含むラック色素試料の前処理段階、及び
(2)前記前処理段階(1)を経た前記ラック色素試料を分析する段階
を含む分析方法。 - 前記水性溶液のpHが7〜9の範囲内である請求項1に記載の分析方法。
- 前記水性溶液のpHが7.5〜8.5の範囲内である請求項2に記載の分析方法。
- 前記水性溶液の塩濃度が5〜55mMの範囲内である請求項1〜3のいずれか1項に記載の分析方法。
- 前記水性溶液の塩濃度が10〜50mMの範囲内である請求項4に記載の分析方法。
- 前記水性溶液がリン酸緩衝液である請求項1〜5のいずれか1項に記載の分析方法。
- 前記段階(iii)の前に、更に、
(iv)前記段階(ii)でpHを調整したラック色素水溶液を分画分子量3kD以上の限外濾過に付して、色素成分の少なくとも一部を除去する段階を含む
請求項1〜6のいずれか1項に記載の分析方法。 - 前記ラック色素試料が高い色価を有する場合に前処理段階(iv)を実施する
請求項7に記載の分析方法。
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