JP2016175895A - プラズマ化タンパク質水性溶液、及び、これを用いて生産される細胞・組織生着性に優れるタンパク質定着表面とその応用 - Google Patents
プラズマ化タンパク質水性溶液、及び、これを用いて生産される細胞・組織生着性に優れるタンパク質定着表面とその応用 Download PDFInfo
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Landscapes
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Abstract
Description
本発明の水性溶液は、低温プラズマ放電によりプラズマ化がなされているタンパク質水性溶液である。
本発明の生産方法のうち、ミスト型の水性溶液の生産方法は、プラズマ化がなされる前のタンパク質水性溶液を、特定の送り速度で沿面放電による低温プラズマに接触させることにより、当該タンパク質、又は、当該タンパク質と他の機能性物質の分子を荷電化することによって、当該分子同士を反発させるプラズマミスト化を、下記(a)〜(c)に従い行うことを特徴とする、プラズマミスト化されたタンパク質水性溶液の生産方法である。
(a) 上記の沿面放電を行うための交流電圧の周波数は5〜30kHz、印加電圧は2〜8Vである。
(b) 上記のプラズマ化がなされる前のタンパク質水性溶液のタンパク質濃度は、25μg/ml〜5mg/mlである。
(c) 上記のプラズマ化がなされる前のタンパク質水性溶液の特定の送り速度は、3.0〜36mm/分である。
本発明の生産方法のうち、液滴型の水性溶液の生産方法は、プラズマ化がなされる前のタンパク質水性溶液を、特定の送り速度で沿面放電による低温プラズマに接触させることにより、当該タンパク質、又は、当該タンパク質と他の機能性物質の分子の荷電化を、下記(a)〜(c)に従い行うことを特徴とする、プラズマ化されたタンパク質水性溶液の生産方法である。
(a) 上記の沿面放電を行うための交流電圧の周波数は5〜30kHz、印加電圧は7.5〜18kVである。
(b) 上記のプラズマ化がなされる前のタンパク質水性溶液のタンパク質濃度は、25μg/ml〜255mg/mlである。
(c) 上記のプラズマ化がなされる前のタンパク質水性溶液の特定の送り速度は、36〜180mm/分である。
前述の本発明の装置は、タンパク質水性溶液の導入場が設けられ、当該導入場においてタンパク質水性溶液に沿面放電体から発生する低温プラズマ放電を作用させることにより、プラズマ化したタンパク質を生産するための沿面放電装置であって、当該沿面放電体は、面状の誘電体の表裏の一方において印加電極が、他方において接地電極がそれぞれ当該誘電体と接触状態で設けられており、当該誘電体の面上の当該印加電極の端部と当該接地電極の端部の一部又は全部が揃っているか、あるいは、当該接地電極の端部が当該印加電極の端部の一部又は全部からはみ出すように設けられている沿面放電体であって、当該沿面放電体の1個又は2個以上が、タンパク質水性溶液の導入場の雰囲気に対する接触面を印加電極面として設けられていることを特徴とする、沿面放電装置である。なお、「沿面放電体から発生する低温プラズマ放電」は、性質的には「誘電体バリア放電」と同様の低温プラズマ放電(大気圧で電子温度のみが高い非平衡プラズマ(後述))である。
本発明は、上記の水性溶液(ミスト型であっても液滴型であってもよい)を、対象物の表面に接触させて付着させた後、当該対象物表面の乾燥を行い、当該接触及び乾燥の過程を1回又は2回以上行うことにより、水性溶液中のタンパク質、又は、当該タンパク質と他の機能性物質を対象物表面に定着させることを特徴とする定着方法(以下、本発明の定着方法ともいう)、及び、当該対象物表面(以下、本発明の表面ともいう)を提供する発明である。本発明の定着方法の対象物の表面は特に限定されないが、代表的には、金属性表面、ポリマー表面、セラミック表面、炭素繊維表面が例示される。当該ポリマーは疎水性ポリマーであってもよい。また、当該対象物の表面は、未処理であっても、エッジング処理等の処理がなされていてもよいが、未処理の表面であっても所望の定着が妨げられないことが本発明の定着方法の特徴の一つである。また、本発明の表面における、タンパク質、又は、当該タンパク質と他の機能性物質の定着層を積層化することも可能であり、多くの場合、積層化は好適な態様である。
上記した先行特許文献について簡単に説明する。
本発明の水性溶液は、タンパク質水性溶液が低温プラズマ放電によりプラズマ化がなされたプラズマ化水性溶液である。
既に言及している「低温プラズマ」とは、電子温度(Te)が気体温度(Tg)よりも明らかに大きく(Te/Tg>100)、TeとTgとが平衡に達していないプラズマであり、別名で非平衡プラズマとして知られている。低温プラズマ放電とは、この低温プラズマを得るための放電であり、グロー放電、コロナ放電、誘電体バリア放電、沿面放電等が該当する。これらの中でも、沿面放電又は誘電体バリア放電を用いることが好ましい。
沿面放電においては、交流電源から適切な周波数の交流電圧を、印加電極に印加することにより、印加電極において交流周期に同期して強い電界が形成され、当該電界から放出された電子が誘電体の表面に付与される現象と、それらが再び印加電極に戻る現象が繰り返し起こることによりグロー状の低温プラズマ放電を得ることができる。
誘電体バリア放電は、無声放電、オゾナイザ放電、バリア放電、誘電体バリア交流放電等とも呼ばれる放電形態である。誘電体バリア放電は、電極間に誘電体を介在させ、交流電圧を印加したときのギャップで生じる放電である。放電が生じても誘電体の存在により電極に電荷が流れ込むことができず、誘電体上に電荷が蓄積するために逆電界が発生して、放電はグロー放電の形態で停止し、放電の最終段階であるアーク放電には移行しない。よって誘電体バリア放電では、グロー放電のような安定で持続的な放電を維持させることが可能である。特に誘電体バリア放電は、誘電体の存在により大気圧以上でも拡散したグロー状の放電を安定して得ることができる。
上記のようにして発生する低温プラズマに水性溶液を接触させて、当該溶液分子を荷電させることにより、本発明の水性溶液を生産することができる。
上述したように、本発明の水性溶液には、(1)ミスト型、及び、(2)液滴型、の2通りの態様が存在し、これらの態様は、印加電圧等の印加条件、さらに水性溶液のタンパク質濃度と送り速度をコントロールすることにより峻別して生産することができる。以下、沿面放電を行う本発明の装置の一実施態様を、図面を用いて開示を行い、当該装置を用いる本発明の生産方法について、これらの2種類の態様毎に説明する。
図3は、沿面放電を行う本発明の装置1における、縦断面を主体としたミスト型の水性溶液を生産する場合の解説図であり、図4(1)は、その本体部分10である。図4(2)は、(1)の実線A−A’での横断面図である。さらに、図5は本発明の装置1の沿面放電がなされる、本体部分10の導出口108近傍の壁断面の拡大解説図である。
液滴型の水性溶液の生産方法について繰り返せば、当該方法は、上述したプラズマ化がなされる前のタンパク質水性溶液を、特定の条件で低温プラズマに接触させることにより、当該タンパク質、又は、当該タンパク質と他の機能性物質の分子の荷電化をする、タンパク質水性溶液の生産方法である。
本発明の定着方法は、上記の本発明の水性溶液(ミスト型であっても液滴型であってもよい)を対象物の表面に定着させる方法である。ここで「定着」とは、確りと着いて容易には離れないことを意味するものである。そして、特に本発明においては、当該水性溶液の溶質、すなわち、水性溶液中のタンパク質、又は、当該タンパク質と他の機能性物質、を対象物表面へ定着させることを発明の内容としている。
低温プラズマ発生装置を図3、4に基づいて作製した。
ミスト型に関しては、上記の低温プラズマ発生装置の下部開口部近傍に、本発明の定着方法を施すための表面素材を載置して、本発明の表面の作製を行った。
本発明の表面の生体親和性を、細胞接着性を指標にして評価試験を行った。具体的には、継代数5〜9代目のヒト頸動脈内皮細胞(Cell Application社)を、表面上で培養することにより、その接着性を評価した。培養液は、20%のウシ胎児血清(Gibco社)、1%のペニシリン−ストレプトマイシン(Gibco社)、10μg/lのヒト塩基性線維芽細胞増殖因子(AUSTRAL Biologicals社)を含む、Medium 199(Gibco社)を用いた。上記の要領で本発明の定着方法を施したPDMS膜とNiTi合金平板(対照品を含む)を、それぞれφ35mmディッシュ(Iwaki社)に入れ、PDMS膜については4×105細胞、NiTi合金平板については、1×105細胞を播種した。なお、細胞播種の直前に、37℃のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で各播種を行う表面の洗浄を行った。
シリコーンコートカバーガラス(松浪硝子工業株式会社;C2240)を用いて、タンパク質水性溶液としてコラーゲン水溶液を用いた細胞接着の評価試験を行った。このカバーガラスは疎水性のため、そのままでは、細胞は殆ど接着しないことが知られている。
2: 原理図における誘電体
3: 原理図における印加電極
4: 原理図における接地電極
5: 原理図における交流電源
6: 原理図におけるアース線
7: 原理図における低温プラズマ放電
10: 本発明の装置の本体部分
101: 誘電体管
102: 印加電極
1021:印加電極の導出口側の端部
1022:印加電極の非導出口側の端部
103: 接地電極
1031:接地電極の導出口側の端部
1032:接地電極の非導出口側の端部
104: 絶縁体
105: アース線
106: 低温プラズマ放電
106’: 接地電極側の低温プラズマ放電
107: タンパク質水性溶液の導入場
108: 導出口
11: シリンジポンプ
110: 注射器
111: 外筒
1111: 液体導出部
1112: つば部
112: 内部棒
1121: 摺動体
1122: 押圧部
113、113’: プラズマ化がなされる前の水性溶液
114: 導管
115: 支持台
1151: 台座
1152: 案内棒
1153、1153’: 案内棒の固定部set
1154: 押し込み部
1155: 外筒の載置部
12: エアポンプ
13: ファンクションジェネレーター
14: 増幅器
15: オシロスコープ
13’、14’、15’: 導電線
16: T字型導管
161、162: T字型導管の腕
17: 封止栓
18: プラズマ化がなされたミスト状の水性溶液
Claims (23)
- 低温プラズマ放電によりプラズマ化がなされている、タンパク質水性溶液。
- 前記タンパク質水性溶液に含有されるタンパク質は、細胞外マトリックスタンパク質を含むことを特徴とする、請求項1に記載のタンパク質水性溶液。
- さらに他の機能性物質が含有されていることを特徴とする、請求項2に記載のタンパク質水性溶液。
- 他の機能性物質は、増殖因子、抗血栓因子、抗がん剤、免疫抑制剤、抗体、糖鎖、又は、抗生物質であることを特徴とする、請求項3に記載のタンパク質水性溶液。
- 前記タンパク質水性溶液がミスト化されていることを特徴とする、請求項1〜4のいずれかに記載のタンパク質水性溶液。
- 前記タンパク質水性溶液が液滴であることを特徴とする、請求項1〜4のいずれかに記載のタンパク質水性溶液。
- タンパク質水性溶液の導入場が設けられ、当該導入場においてタンパク質水性溶液に沿面放電体から発生する低温プラズマ放電を作用させることにより、プラズマ化したタンパク質を生産するための沿面放電装置であって、当該沿面放電体は、面状の誘電体の表裏の一方において印加電極が、他方において接地電極がそれぞれ当該誘電体と接触状態で設けられており、当該誘電体の面上の当該印加電極の端部と当該接地電極の端部の一部又は全部が揃っているか、あるいは、当該接地電極の端部が当該印加電極の端部の一部又は全部からはみ出すように設けられている沿面放電体であって、当該沿面放電体の1個又は2個以上が、タンパク質水性溶液の導入場の雰囲気に対する接触面を印加電極面として設けられていることを特徴とする、沿面放電装置。
- タンパク質水性溶液の導入場において、プラズマ化がなされる前のタンパク質水性溶液を導入するための導入口、及び、プラズマ化したタンパク質の導出口が設けられていることを特徴とする、請求項7に記載の沿面放電装置。
- タンパク質水性溶液の導入場が筒状体の内部となっており、沿面放電体の1個又は2個以上が当該筒状体の全部又は一部を構成することを特徴とする、請求項7又は8に記載の沿面放電装置。
- 筒状体の全部又は一部を構成する沿面放電体の数は1個であることを特徴とする、請求項9に記載の沿面放電装置。
- 上記の沿面放電装置のタンパク質水性溶液の導入場に向けての送液機構が設けられていることを特徴とする、請求項7〜10のいずれかに記載の沿面放電装置。
- 請求項5に記載のミスト化されたタンパク質水性溶液の生産方法であって、プラズマ化がなされる前のタンパク質水性溶液を、特定の送り速度で沿面放電による低温プラズマに接触させることにより、当該タンパク質、又は、当該タンパク質と他の機能性物質の分子を荷電化することによって、当該分子同士を反発させるプラズマミスト化を、下記(1)〜(3)に従い行うことを特徴とする、プラズマミスト化されたタンパク質水性溶液の生産方法。
(1) 上記の沿面放電を行うための交流電圧の周波数は5〜30kHz、印加電圧は2〜8kVである。
(2) 上記のプラズマ化がなされる前のタンパク質水性溶液のタンパク質濃度は、25μg/ml〜5mg/mlである。
(3) 上記のプラズマ化がなされる前のタンパク質水性溶液の特定の送り速度は、3.0〜36mm/分である。 - 請求項6に記載の液滴のタンパク質水性溶液の生産方法であって、プラズマ化がなされる前のタンパク質水性溶液を、特定の送り速度で沿面放電による低温プラズマに接触させることにより、当該タンパク質、又は、当該タンパク質と他の機能性物質の分子の荷電化を、下記(1)〜(3)に従い行うことを特徴とする、プラズマ化されたタンパク質水性溶液の生産方法。
(1) 上記の沿面放電を行うための交流電圧の周波数は5〜30kHz、印加電圧は7.5〜18kVである。
(2) 上記のプラズマ化がなされる前のタンパク質水性溶液のタンパク質濃度は、25μg/ml〜255mg/mlである。
(3) 上記のプラズマ化がなされる前のタンパク質水性溶液の特定の送り速度は、36〜180mm/分である。 - 前記のプラズマ化されたタンパク質水性溶液の生産方法において、請求項7〜11のいずれかに記載された沿面放電装置、を沿面放電手段として用い、かつ、当該沿面放電装置のタンパク質水性溶液の導入場に向けて、プラズマ化がなされる前のタンパク質水性溶液を特定の送り速度で送液して、筒状構造の内部に発生させた沿面放電による低温プラズマと接触させることを特徴とする、請求項12又は13に記載の生産方法。
- 請求項1〜6のいずれかに記載のタンパク質水性溶液を、対象物の表面に接触させて付着させた後、当該対象物表面の乾燥を行い、当該接触及び乾燥の過程を1回又は2回以上行うことにより、水性溶液中のタンパク質、又は、当該タンパク質と他の機能性物質を対象物表面に定着させることを特徴とする、定着方法。
- 対象物表面が金属性表面であることを特徴とする、請求項15に記載の定着方法。
- 対象物表面がポリマー表面であることを特徴とする、請求項15に記載の定着方法。
- ポリマーは疎水性ポリマーであることを特徴とする、請求項15に記載の定着方法。
- 請求項15〜18のいずれかに記載の定着方法に従い、タンパク質、又は、当該タンパク質と他の機能性物質を定着させたことを特徴とする、対象物表面。
- 前記対象物表面における、タンパク質、又は、当該タンパク質と他の機能性物質の定着層が積層されていることを特徴とする、請求項19に記載の対象物表面。
- 請求項19又は20に記載の対象物表面に細胞又は生体組織を接触させて、当該表面にこれらを生着させることを特徴とする、細胞又は生体組織の生着方法。
- 請求項19又は20に記載の対象物表面を伴う対象物。
- 生体内インプラントであることを特徴とする、請求項22に記載の対象物。
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