JP2016164179A - コンドロイチン硫酸オリゴ糖を含む免疫賦活剤及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】コンドロイチン硫酸の免疫賦活活性効果を維持しつつ、経口吸収されうる低分子量のコンドロイチン硫酸オリゴ糖を安全に低分子化する新規な方法、及びそのような方法により得られうるコンドロイチン硫酸オリゴ糖を含む免疫賦活剤を提供する。
【解決手段】重量平均分子量で５０００〜１００００のコンドロイチン硫酸オリゴ糖を含む免疫賦活剤。
【選択図】図７

Description

本発明は、経口吸収される免疫賦活活性をもつ抗炎症性コンドロイチン硫酸オリゴ糖を含む免疫賦活剤及びそのような免疫賦活活性を有するコンドロイチン硫酸オリゴ糖の製造方法に関する。

コンドロイチン硫酸は、保湿、免疫活性調節等の作用を有し、近年、化粧品、医薬品、健康食品等多岐にわたり用いられている。特に変形性関節炎に対する抗炎症作用や皮膚の老化防止作用が期待され、健康食品として広く用いられている。

ところで、上記コンドロイチン硫酸は、一般に大きな分子量を有する高分子であり、医薬品あるいは健康食品として用いる場合、その薬理活性、生理活性を発現するために水溶性であることが必要であり、より低分子化されたオリゴ糖とすることが重要である。また、腸管からの吸収性を高めるために、低分子化オリゴ糖とすることが重要である。

なお、コンドロイチン硫酸を低分子化する技術としては、例えば下記特許文献１から５、非特許文献１、２に記載がある。

例えば下記特許文献１、２には、酵素コンドロイチナーゼによりコンドロイチン硫酸を低分子化する技術が記載されている。また下記特許文献３、４には２価の金属と過酸化水素によりコンドロイチン硫酸を低分子化する技術が記載されている。また下記特許文献５には、二酸化チタンによりコンドロイチン硫酸を低分子化する技術が記載されている。また下記非特許文献１には、塩基を用いたベータ脱離反応を利用してコンドロイチン硫酸を低分子化する技術が記載されている。そして非特許文献２には、過酸化物を用いたラジカル反応によりコンドロイチン硫酸を低分子化する技術が記載されている。

国際公開ＷＯ ２００６／０１１１７９号公報 国際公開ＷＯ １９９８／０１４４８１号公報 国際公開ＷＯ １９８２／００３６２７号公報 特開平１１−１３０８０１号公報 国際公開ＷＯ ２００８／０５９８６９号公報

Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ（２００６）３４６（３）：９４６−９５７ Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ（２００５）、３４４（２）：１９３−２０３

しかしながら、上記特許文献、非特許文献に記載の技術では、コンドロイチン硫酸を低分子化することはできるが、低分子化されたコンドロイチン硫酸の構造に不飽和結合、あるいはグリコシド結合以外での開裂を発生させてしまい、また、糖鎖の構造変化、硫酸基の脱離なども起こってしまうためコンドロイチン硫酸本来の効果が低下してしまうといった課題がある。さらに、上記特許文献１、２に記載の方法では、放線菌由来の酵素を用いるため医薬品として用いる場合、特に過大なる安全性試験が求められ製品コストを上昇させてしまうといった課題がある。

また低分子化することによるコンドロイチン硫酸の免疫賦活作用は明らかでなく必要量以上、あるいは効果のないコンドロイチン硫酸オリゴ糖を製造してしまうといった課題がある。

そこで、本発明は、上記課題に鑑み、コンドロイチン硫酸の免疫賦活活性効果を維持しつつ、経口吸収されうる低分子量のコンドロイチン硫酸オリゴ糖を安全に低分子化する新規な方法、及びそのような方法により得られうるコンドロイチン硫酸オリゴ糖を含む免疫賦活剤を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、二酸化チタンの存在下でコンドロイチン硫酸に白色蛍光灯光を照射することにより得られるコンドロイチン硫酸オリゴ糖が、重量平均分子量で５０００〜１００００程度の低分子量であるにもかかわらず、哺乳動物細胞を用いたアッセイ系で低分子化前のコンドロイチン硫酸と同等の免疫賦活活性を有することを見出した。この低分子化コンドロイチン硫酸オリゴ糖は、反転腸管を用いた吸収実験で極めて高い腸管吸収性を示すことから、経口投与による免疫賦活剤として有用であり、これらの知見に基づいて本発明を完成した。

すなわち、本発明の要旨は以下のとおりである。
＜１＞重量平均分子量で５０００〜１００００のコンドロイチン硫酸オリゴ糖を含む免疫賦活剤。
＜２＞前記免疫賦活活性が、哺乳動物に経口投与した場合にＴ細胞の活性化を介して得られる＜１＞に記載の免疫賦活剤。
＜３＞前記コンドロイチン硫酸オリゴ糖が、二酸化チタンの存在下でコンドロイチン硫酸に室内照明用蛍光灯の光を照射することにより低分子化して得られる＜１＞又は＜２＞に記載の免疫賦活剤。
＜４＞前記コンドロイチン硫酸が、哺乳動物軟骨由来、軟骨魚類ヒレ、軟骨由来、硬骨魚類軟骨由来、軟体動物軟骨由来、鳥類軟骨由来コンドロイチン硫酸の少なくともいずれかを含む＜１＞から＜３＞の何れかに記載の免疫賦活剤。
＜５＞医薬品又は健康食品の形態にある＜１＞から＜４＞の何れかに記載の免疫賦活剤。
＜６＞二酸化チタンの存在下でコンドロイチン硫酸に室内照明用蛍光灯の光を照射することにより低分子化する工程を含む、重量平均分子量で５０００〜１００００のコンドロイチン硫酸オリゴ糖の製造方法であって、前記コンドロイチン硫酸に照射される室内照明用蛍光灯の光エネルギーが０．０５〜１０ＭＪ，好ましくは０．１〜１ＭＪであるコンドロイチン硫酸オリゴ糖の製造方法。
＜７＞前記二酸化チタンを、前記コンドロイチン硫酸１ｇに対し０．１ｇ以上１０ｇ以下の範囲内で用いる、＜６＞に記載のコンドロイチン硫酸オリゴ糖の製造方法。

本発明のコンドロイチン硫酸オリゴ糖を含む免疫賦活剤は、コンドロイチン硫酸の免疫賦活活性効果・抗炎症作用を維持しつつ経口投与による吸収効率が改善されている。当該コンドロイチン硫酸オリゴ糖の製造方法によれば、簡単な方法により免疫賦活活性効果・抗炎症作用を有するコンドロイチン硫酸オリゴ糖及びそれを含む医薬品又は健康食品を提供することができる。

コンドロイチン硫酸に含まれる様々な硫酸化パターンを持つ二糖単位を示す図である。 分子量の異なるコンドロイチン硫酸に対してマウス反転腸管吸収実験を行った結果を示す図である。 分子量の異なるコンドロイチン硫酸に対して免疫賦活活性の測定を行った結果を示す図である。図３Ａは１型ヘルパーＴ細胞の産生するサイトカイン、インターフェロンガンマ（ＩＮＦ−γ）、図３Ｂは２型ヘルパーＴ細胞の産生するサイトカイン、インターロイキン５（ＩＬ５）をそれぞれ測定したものである。 化合物１から化合物４に対して分子量を測定するためのゲル濾過ＨＰＬＣを行った結果を示す図と分子量標準品コンドロイチン硫酸の保持時間を示したものである。 化合物１、化合物２および低分子化反応を行う前のコンドロイチン硫酸に対して、プロトンNMR測定を行った結果を示す図である。 化合物１から化合物４に対してマウス反転腸管吸収実験を行った結果を示す図である。 化合物１から化合物４の免疫賦活活性を、低分子化していないコンドロイチン硫酸と比較した結果を示す図である。上図は１型ヘルパーＴ細胞の産生するサイトカイン、インターフェロンガンマ（ＩＮＦ−γ）、下図は２型ヘルパーＴ細胞の産生するサイトカイン、インターロイキン５（ＩＬ５）をそれぞれ測定したものである。

以下、本発明を実施するための形態について、詳細に説明する。なお本発明は多くの異なる形態による実施が可能であり、以下に示す実施形態、実施例に限定されないことはいうまでもない。

（コンドロイチン硫酸）
コンドロイチン硫酸（chondroitin sulfate：図中ではＣＳと略す）は、アミノ糖誘導体とヘキソース誘導体の繰り返し構造を有する直鎖状の多糖体であるグリコサミノグリカン（glycosaminoglycan）の１つである。コンドロイチン硫酸は、コアタンパク質に結合したプロテオグリカンとして動物組織に広く分布しており、動物の発生・分化・成長および再生に重要な役割を担っている。コンドロイチン硫酸は、たとえば軟骨中の主要成分として、水和力や弾性に寄与して軟骨組織形成に役立っている。またコンドロイチン硫酸は、多様な生理活性分子との結合性を示し、生理活性分子の貯留や、安定化あるいはマスキングの役割を持ち、細胞膜受容体などと協働して、シグナル伝達機構を制御している。また、コンドロイチン硫酸は神経系においては神経細胞の軸索の伸展促進や阻害効果を示し、免疫系細胞においては顆粒に存在し、免疫物質の蓄積や放出を制御している。マラリヤ原虫やウイルスなどの感染においては、コンドロイチン硫酸は、受容体となるとともに、感染阻害効果を示すことが知られている。多くの場合、以下に述べるＤ構造やＥ構造のようなコンドロイチン硫酸が、特に高い生理活性を示すことが知られている。

コンドロイチン硫酸は、分子量数万（単糖数２０〜４００個）の直鎖多糖体構造を有する。この構造は、グルクロン酸（ＧｌｃＡ）とＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）とがβ１−３およびβ１−４で交互に結合した二糖の繰り返しを基本構造とする。コンドロイチン硫酸は、コンドロイチン（chondroitin：ＣＨ）が、たとえば図１に示すような多様な硫酸基修飾を受けた物質である。

具体的には、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）は、コンドロイチン（chondroitin：ＣＨ）の二糖単位のＧａｌＮＡｃ残基４位が硫酸化（４Ｓ）されたＡ構造（ＣＳＡ）、ＧａｌＮＡｃ残基６位が硫酸化（６Ｓ）されたＣ構造（ＣＳＣ）、ＧｌｃＡ残基２位とＧａｌＮＡｃ残基６位の二糖単位の２カ所が硫酸化（２Ｓ，６Ｓ）されたＤ構造（ＣＳＤ）、ＧａｌＮＡｃ残基の４位と６位の２カ所が硫酸化（４Ｓ，６Ｓ）されたＥ構造（ＣＳＥ）、ＧｌｃＡ残基２位、ＧａｌＮＡｃ残基４位および６位の計３カ所が硫酸化（２Ｓ，４Ｓ，６Ｓ）されたｔｒｉＳ構造（ＣＳｔｒｉＳまたはＣｔｒｉＳ）など、多様な硫酸化修飾二糖単位を含む。コンドロイチン硫酸は、これらの硫酸基修飾構造が組み合わさった、きわめて複雑な多糖体構造を有する。

（低分子化によるコンドロイチン硫酸オリゴ糖の製造方法）
本実施形態に係るコンドロイチン硫酸の低分子化は、二酸化チタンの存在下でコンドロイチン硫酸に一般に流通する白色蛍光灯の光を照射することを特徴の一つとする。

低分子化される前のコンドロイチン硫酸の分子量としては、天然物由来である限り限定されるわけではないが、１５ｋＤａ以上１，０００ｋＤａ以下であることが好ましく、反応を効率的に遂行するためより好ましくは１０ｋＤａ以上２００ｋＤａ以下である。なお、ここでいう重量平均分子量とはコンドロイチン硫酸標準品（生化学工業株式会社製、サメ軟骨由来又はクジラ軟骨由来のコンドロイチン硫酸標準品）を標準物質として用いてＧＰＣ（ゲルパーミエイションクロマトグラフィー）法によって測定したものである。

また、本実施形態におけるコンドロイチン硫酸は、そのまま用いることもできるが、反応効率、回収率の観点から溶媒に溶解されていることも好ましい。溶媒としては、コンドロイチン硫酸を溶解できる限りにおいて限定されることはないが、安全性、溶解性の観点から水、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド等であることが好ましい。また、溶媒に溶解されるコンドロイチン硫酸の濃度としては、分解反応を進行させることができる限りにおいて限定されるわけではないが、例えば０．１ｍｏｌ／ｌ以上１０ｍｏｌ／ｌ以下の範囲にあることが好ましく、より好ましくは０．５ｍｏｌ／ｌ以上５ｍｏｌ／ｌ以下の範囲である。

ここで二酸化チタンは、白色蛍光灯の光を受けて触媒として作用する。酸化チタンの量としては、限定されるわけではないが、例えば低分子化の対象となるコンドロイチン硫酸１ｇに対し、０．１ｇ以上１０ｇ以下の範囲にあることが好ましく、より好ましくは０．５ｇ以上２ｇ以下である。

また、本実施形態において用いられる白色蛍光灯の光としては、コンドロイチン硫酸の分解反応が進行する限りにおいて限定されないが、波長の範囲としては、例えば３５０ｎｍ以上５００ｎｍ以下であることが好ましく、より好ましくは３６０ｎｍ以上４００ｎｍ以下である。また、この光のエネルギー量としても、コンドロイチン硫酸の分解反応が進行する限りにおいて限定されるわけではないが、低分子化による効果を十分得ることができる。一方コンドロイチン硫酸としての免疫賦活活性作用を十分維持する観点、すなわち経口吸収されるコンドロイチン硫酸の分子量の観点から、１０ｋＤａ以下のコンドロイチン硫酸オリゴ糖を調製するためには０．０５〜１０ＭＪの範囲内であることが好ましく、より好ましくは０．１〜１ＭＪの範囲内である。

なお、本実施形態に係る低分子化は、限定されるわけではないが、弱酸性（ｐＨ４〜７）から弱アルカリ性（ｐＨ７〜１０）の雰囲気中で行われることが好ましく、より好ましくはｐＨ７である。

以上、本実施形態に係る方法は、白色蛍光灯の光を照射することで、ガンマ線、紫外線などといった人体に有害な光を使用せず、また、安全性の高い食品添加物として承認され、広く用いられている酸化チタン（ＴｉＯ_２）を光触媒として用いているため、緩和な条件下、例えば室温、中性条件で行うことができるだけでなく、更に、低分子化されたコンドロイチン硫酸の構造に不飽和結合の発生やグリコシド結合以外での開裂を発生させることが極めて少ない。また、糖鎖の構造変化、硫酸基の脱離なども殆ど起こらず、コンドロイチン硫酸本来の効果を高く維持することができる。即ち、従来の方法において生ずる不飽和結合の導入や糖鎖の構造変化による活性低下といった課題を極力抑えることができ、コンドロイチン硫酸の免疫賦活効果・抗炎症効果を維持しつつ安全にコンドロイチン硫酸を低分子化できる方法を提供することができる。

（コンドロイチン硫酸オリゴ糖を含む免疫賦活剤）
こうして得られるコンドロイチン硫酸オリゴ糖は、例えば飲食品、医薬品、化粧品等に用いて、これらに免疫機能調節作用を付与することができる。
本明細書における免疫機能調節作用とは、生体において低下している免疫反応を高める、および／または亢進している免疫反応を抑制する作用のことをいう。従って、その作用には、免疫賦活作用および免疫抑制作用が含まれる。好ましい実施形態では、本発明に係るコンドロイチン硫酸オリゴ糖は、後述する実施例で示されるように、Ｔ細胞、特にヘルパーＴ細胞の活性化を介して免疫賦活活性を示し、免疫賦活剤として用いることができる。

本明細書における免疫機能調節作用は、当該技術分野で知られている方法で測定することができる。それは、例えば、免疫機能調節作用を有するサイトカインを誘導する作用を指標として測定することができる。この目的に用いられるサイトカインには、インターフェロン−γ、インターロイキン−５、１０、１２等が含まれる。また、免疫機能調節作用は、免疫応答に関与する樹状細胞の成熟化や、細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の活性を指標として測定することもできる。

本発明の免疫機能調節剤は健康増進のために用いることができるが、腫瘍、癌の転移、ウイルス性疾患（例えば、カゼ、エイズ、ウイルス性肝炎）、アレルギー性疾患（例えば、花粉症、アレルギー性鼻炎、アトピー、喘息）、自己免疫疾患（例えば、リウマチ様関節炎）、炎症性疾患、糖尿病のような疾患または状態に有効であることも知られている。

（医薬組成物）
本発明の医薬組成物（薬剤）は前記コンドロイチン硫酸オリゴ糖を有効成分として含むもので、免疫、特に全身免疫を賦活又は調節して、免疫異常に伴う疾患の治療、改善、進展防止や他の疾患からの予防等に使用できる薬剤である。例えば、抗腫瘍剤、抗感染症剤、抗ウイルス剤、抗自己免疫疾患剤、抗糖尿病薬、抗アレルギー剤、抗消化器疾患剤（過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、便秘、下痢等の治療剤等）等の疾患やこれら疾患からの予防に使用することができる。

この薬剤を適用される対象は、動物、特にヒトであって免疫、特に全身免疫を賦活又は調節することを求めるヒトである。

本発明の薬剤の特徴の一つに経口投与でも優れた効果を示すこと、天然物に由来するコンドロイチン硫酸オリゴ糖を使用することができ、特に安全性でも優れていることを挙げることができる。従って、投与形態については特に制限は無い。経口投与、非経口投与（皮下、筋肉内投与、経鼻投与、エアゾール投与等）各種の投与形態が採用可能であり、また免疫賦活作用及び／又は免疫調節作用を求める疾患者に広くしかも簡便に適用することができる。安全性や経口投与に適していることからそのような疾患に対する予防、改善のために、後述の健康食品、機能性食品、健康飲料、機能性飲料等の形で使用することも可能である。

本発明においては、他の薬剤成分（医薬活性物質）と共に、例えば混合又は組み合わせて使用することができ、このような場合本発明で目的とする前記有効成分を含有し目的とする前記薬理活性（免疫賦活活性又は免疫調節活性）を示すものであれば本発明の薬剤に含まれる。

その他、薬理学的に許容し得る各種の製剤用物質（補助剤等として）を含むこともできる。製剤用物質は製剤の剤型により適宜選択することができるが、例えば、賦形剤、希釈剤、添加剤、崩壊剤、結合剤、被覆剤、潤滑剤、滑走剤、滑沢剤、風味剤、甘味剤、乳化剤、可溶化剤等を挙げることができる。更に、製剤用物質を具体的に例示すると、炭酸マグネシウム、二酸化チタン、ラクトース、マンニトール及びその他の糖類、タルク、牛乳蛋白、ゼラチン、澱粉、セルロース及びその誘導体、動物及び植物油、ポリエチレングリコール、及び溶剤、例えば滅菌水及び一価又は多価アルコール、例えばグリセロールを挙げることができる。

本発明の薬剤は、前述の如く公知の又は将来開発される様々な医薬製剤の形態、例えば、経口投与、腹腔内投与、経皮的投与、吸入投与等各種の投与形態に調製することができる。本発明の薬剤をこれら様々な医薬製剤の形態に調製するためには公知の又は将来開発される方法を適宜採用することができる。

これら様々な医薬製剤の形態として、例えば適当な固形又は液状の製剤形態、例えば顆粒、粉剤、被覆錠剤、錠剤、（マイクロ）カプセル、坐剤、シロップ、ジュース、懸濁液、乳濁液、滴下剤、注射用溶液、活性物質の放出を延長する製剤等を挙げることができる。

本発明の薬剤の投与量については、疾患の種類、程度、製剤の形態等に応じて適当に選択される。例えば、経口投与で患者１日当たり、有効成分のコンドロイチン硫酸オリゴ糖を、好ましくは１ｍｇ〜５０ｇ程度、より好ましくは１０ｍｇ〜１０ｇ程度、更に好ましくは５０ｍｇ〜５ｇ程度投与することができる。また、重篤な場合には更に増量することもできる。投与の回数、時期については、数日に１回でも、また１日１回でも可能であるが、通常は１日当たり数回、例えば２〜４回に分けて、食前、食間、食後に投与される。好ましくは、食前に投与される。また、静脈投与の場合には上記経口投与に比べて十〜百分の一程度の投与量でもよい。

（飲食品）
特に、本発明のコンドロイチン硫酸オリゴ糖を健康食品や機能性食品として使用する場合にも上記経口投与製剤を参考に健康食品や機能性食品として必要な成分、添加剤を加えて調製することができる。当然のことながら、飲食品として使用される食用或いは栄養成分等を適宜添加して、使用することができる。通常は、本発明の方法で製造されたコンドロイチン硫酸オリゴ糖を、好ましくは０．０１〜８０重量％程度、より好ましくは０．０５〜２０重量％程度含有することができる。

飲食品として使用できる調味剤や甘味剤を使用し、溶液としてドリンクの形態で使用することもできるし、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、ゼリータイプ、アイスクリ−ムタイプ、凍らせた形態等の形態で使用することもできる。

この飲食品は予防用として健常者は勿論、各種の疾患を有する者で、重症患者から軽症の患者まで、特に免疫機能異常に伴う疾患者に限定することなく、全身免疫賦活又は免疫調節を求めて使用することができる。ヒト以外の動物に対しても、飼料、医薬品及び医薬組成物等の形態で適用することができる。

上記説明したコンドロイチン硫酸オリゴ糖の調製方法について、実際に実験を行い、効果を確認した。以下に説明する。

（実施例１：コンドロイチナーゼによる低分子化コンドロイチン硫酸の免疫賦活活性）
特許文献１に示されたコンドロイチナーゼをもちいて低分子化したコンドロイチン硫酸を調製し、マウス反転腸管を用いて経口吸収されるコンドロイチン硫酸の分子量を調べた。コンドロイチン硫酸はグルクロン酸を定量するカルバゾール−硫酸法によった。図２に示すように、重量平均分子量１０ｋＤａ以下の低分子化コンドロイチン硫酸オリゴ糖は、マウス反転腸管を用いた系で吸収が良好であり、更に低分子であればあるほど経口吸収率が良好になることが分る。

コンドロイチン硫酸の有する免疫賦活活性はある程度の分子量が必要であると考えられることから、マウス脾臓細胞を用いて免疫細胞賦活活性を測定した。その結果、図３に示すように重量平均分子量５ｋＤａ以上のコンドロイチン硫酸が、免疫細胞賦活活性を有する点で好ましく、重量平均分子量６〜８ｋＤａのコンドロイチン硫酸であることが特に好ましい。なお、分子量約５ｋＤａのコンドロイチン硫酸は１８糖に相当し、分子量約６ｋＤａのコンドロイチン硫酸は２２糖に相当し、分子量８ｋＤａのコンドロイチン硫酸は２８糖に相当する。本発明では、これらの２８糖〜１８糖のコンドロイチン硫酸オリゴ糖を使用することが好ましく、２８糖〜２２糖のコンドロイチン硫酸オリゴ糖を使用することがさらに好ましい。

（実施例２：コンドロイチン硫酸オリゴ糖の調製）
（化合物１）
まず、平均分子量１５ｋＤａのコンドロイチン硫酸（サケ鼻軟骨由来、日本薬品株式会社製）１ｇを、２０ｍｌの水（溶媒）に溶かし、試料溶液を得た。次に、二酸化チタン（日本薬局方「製造専用」、和光社製）１ｇを添加し、白色蛍光灯（４０Ｗ、東芝製）の光を３６０分間照射した。そして、この照射後の試料溶液に対し、遠心分離による二酸化チタンの除去及び凍結乾燥を行うことで、白色の化合物１を得た。

次に、この得られた化合物１に対し、溶離液として０．１ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウムを含むｐＨ７の緩衝液及びゲル濾過用ＨＰＬＣカラム（アサヒパックＧＦ５１０、内径８ｍｍ、長さ３０ｃｍ）を用いて、検出器には示差屈折計を用い、溶離液の流速０．５ｍｌ／分のもと、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を行った。この結果を図４に示す。なお図４中、横軸の数字は保持時間を示す。この結果、上記の方法を経由していないコンドロイチン硫酸については分子量の変化は当然ない一方で、上記の反応を経由した化合物１は分子量が１１，０００程度減少していることが確認できた。

また、アルドリッチ社製の純度１００％の重水０．７ｍｌに５ｍｇの完全に乾燥した上記化合物１を溶解し、ＮＭＲスペクトルを測定した（日本電子社製ＧＳＸ５００αを使用）。測定条件は共鳴周波数５００ＭＨｚ、観測幅１０，０００Ｈｚ、積算回数３００回、パルス幅１２μｓ、温度４５℃とした。そして得られたスペクトルから、化合物１の構造解析を行った。この結果を図５に示す。また、比較対象として、反応させる前のコンドロイチン硫酸に対して同様に行ったＮＭＲによる構造解析の結果を図５に示す。この結果、図５では反応前のコンドロイチン硫酸のスペクトルと比べて、各シグナルの線幅がシグナル高さに対して小さく、また５．１ppm付近に新たなシグナルが観測される。このシグナルは低分子化によって新たに生じた還元末端に由来するアノメリックプロトンと帰属することができる。以上のことから白色蛍光灯照射による酸化チタンとの反応によって、コンドロイチン硫酸が低分子化されていることが予想された。また図５に観測された化合物１と低分子化する前のコンドロイチン硫酸のシグナルは、低分子化により新たに出現したアノメリックシグナル以外まったく同一であることが確認できた。即ち、反応前と反応後において分子量以外に構造変化がないことを確認した。

更に、上記得られた化合物１に対し反転腸管を用いた腸管吸収実験を行った。腸管吸収は、マウス結腸を用いて反転腸管を調製し、行った。この結果を図６に示す。この結果、コンドロイチン硫酸オリゴ糖化合物１の平均分子量が５ｋＤａであると急激な腸管吸収が確認できた。

（化合物２）
本化合物は化合物１とほぼ同じであるが、蛍光灯光の照射時間が異なる。即ち、化合物１では、４０Ｗ白色蛍光灯（東芝製）の光を３６０分間照射したのに対し、化合物２では２４０分間照射した点のみ異ならせた。この結果、本実施例において白色の化合物２を得ることができた。

次に、この得られた化合物２に対し、化合物１の場合と同様にHPLCによる分子量の測定を行った。この結果を図４に示す。この結果、上記の方法を経由していないコンドロイチン硫酸については分子量の変化は当然ない一方で、上記の反応を経由した化合物２は分子量が８，０００程度減少していることが確認できた。

また、アルドリッチ社製の純度１００％の重水０．７ｍｌに５ｍｇの完全に乾燥した上記化合物２を溶解し、ＮＭＲスペクトルを測定した。測定方法は化合物１の場合と同様である。そして得られたスペクトルから、化合物２の構造解析を行った。この結果を図５に示す。この結果、図５では反応前のコンドロイチン硫酸のスペクトルと比べて、各シグナルの線幅がシグナル高さに対して小さく、また５．１ｐｐｍ付近に新たなシグナルが観測される。このシグナルは低分子化によって新たに生じた還元末端に由来するアノメリックプロトンと帰属することができる。以上のことから白色蛍光灯照射による酸化チタンとの反応によって、コンドロイチン硫酸が低分子化されていることが予想された。また図５に観測された化合物２と低分子化するまえのコンドロイチン硫酸のシグナルは、低分子化により新たに出現したアノメリックシグナル以外まったく同一であることが確認できた。即ち、反応前と反応後において分子量以外に構造変化がないことを確認した。

また、この結果得られた化合物２に対しても化合物１と同じ反転腸管を用いた腸管吸収実験を行った。反転腸管を用いた腸管吸収の結果を図６に示す。
化合物１に比べて吸収量は低いものの低分子化前のコンドロイチン硫酸に比べて高い腸管吸収量が確認された。

（化合物３）
本化合物は化合物１とほぼ同じであるが、白色蛍光灯（４０Ｗ、東芝製）の光の照射時間が異なる。即ち、化合物１では、室内用白色蛍光灯の光を３６０分間照射したのに対し、化合物３では１２０分間照射した点のみ異ならせた。この結果、本実施例において白色の化合物３を得ることができた。

また、この結果得られた化合物３に対しても化合物１と同じ測定を行った。ＨＰＬＣの結果を図４に、反転腸管を用いた腸管吸収の結果を図６にそれぞれ示す。
ＨＰＬＣの結果によると、本実施例の方法を経由していないコンドロイチン硫酸については分子量の変化は当然ない一方で、本実施例の方法を経由した化合物３は、６、０００程度減少していることが確認できた。

図には示していないがＮＭＲによる構造解析の結果は、反応前のコンドロイチン硫酸のスペクトルと比べて、各シグナルの線幅がシグナル高さに対して小さく、白色蛍光灯照射による酸化チタンとの反応によって、コンドロイチン硫酸が低分子化されていることが予想された。

また図６に示した反転腸管を用いた腸管吸収実験では、分子量の低下によってコンドロイチン硫酸オリゴ糖の吸収量は反応前のコンドロイチン硫酸に比べて増加することが確認できた。

（化合物４）
本化合物は化合物１とほぼ同じであるが、白色蛍光灯の光の照射時間が異なる。即ち、化合物１では、室内用蛍光灯（４０Ｗ、東芝製）の光を３６０分間照射したのに対し、化合物４では９０分間照射した点のみ異ならせた。この結果、本実施例において白色の化合物４を得ることができた。

また、この結果得られた化合物４に対しても化合物１と同じ測定を行った。ＨＰＬＣの結果を図４に、反転腸管を用いた腸管吸収の結果を図６にそれぞれ示す。
ＨＰＬＣの結果によると、本実施例の方法を経由していないコンドロイチン硫酸については分子量の変化は当然ない一方で、本実施例の方法を経由した化合物４は、３、０００程度減少していることが確認できた。

なお、図には示していないがＮＭＲによる構造解析の結果は、反応前のコンドロイチン硫酸のスペクトルと比べて、各シグナルの線幅はほとんど変化なく、コンドロイチン硫酸が若干低分子化されていることが予想された。

（実施例３：コンドロイチン硫酸オリゴ糖の免疫賦活活性）
上記得られた化合物１から化合物４のコンドロイチン硫酸が示すマウス胸腺由来Ｔ細胞分化誘導作用の測定を行った。マウス胸腺由来Ｔ細胞分化誘導作用の測定は、１０週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスを用いて、２週間に２度のアジュバンド、オブアルブミンの静脈内注射を行い、脾臓細胞を活性化し、本来のコンドロイチン硫酸、あるいは化合物１から４を脾臓細胞の培地に添加した。１週間培養することによって培地に放出されたサイトカイン類（インターフェロンガンマ、ＩＮＦ−γと表記：インターロイキン５、ＩＬ５と表記）を測定キットにより定量し、１型２型ヘルパーＴ細胞への誘導活性を調査した。この結果を図７に示す。この結果、コンドロイチン硫酸本来のＴ細胞分化誘導作用は、分子量５、０００以上で本来の不活化作用が低減していないことが確認できた。

本発明は、コンドロイチン硫酸の経口吸収を期待して製造された、コンドロイチン硫酸を含む製品、例えば医薬品、化粧品、健康食品、食品添加物として産業上の利用可能性がある。

Claims (5)

1. 重量平均分子量で５０００〜１００００のコンドロイチン硫酸オリゴ糖を含む免疫賦活剤。
2. 前記免疫賦活活性が、哺乳動物に経口投与した場合にＴ細胞の活性化を介して得られる請求項１に記載の免疫賦活剤。
3. 前記コンドロイチン硫酸オリゴ糖が、二酸化チタンの存在下でコンドロイチン硫酸に室内照明用蛍光灯の光を照射することにより低分子化して得られる請求項１又は２に記載の免疫賦活剤。
4. 前記コンドロイチン硫酸が、哺乳動物軟骨由来、軟骨魚類ヒレ、軟骨由来、硬骨魚類軟骨由来、軟体動物軟骨由来、鳥類軟骨由来コンドロイチン硫酸の少なくともいずれかを含む請求項１〜３何れか一項に記載の免疫賦活剤。
5. 医薬品又は健康食品の形態にある請求項１〜４何れか一項に記載の免疫賦活剤。

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