JP2016104744A - 医薬組成物及びその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
しかしながら、本発明者ら自身の研究を含む複数の研究から、免疫反応性表面マーカーを下方調節する(編集する)ことによって免疫学的療法を回避する細胞の先天的な能力が証明された。メラノーマもまた、宿主に対する抑制的効果(例えば、抗原提示細胞の成熟の阻害または完全なT細胞活性化の阻止)を発揮することができる(Tormoら、2006(非特許文献15);Ilkovitch及びLopez、2008(非特許文献16);Vermaら、2008(非特許文献17))。したがって、メラノーマは、免疫調節物質の抗腫瘍活性を回避する遺伝的能力を示す。
しかしながら、これまでのところ、どれがアポトーシスを誘発することができるMDA−5の標的であるのかということ、及び腫瘍細胞について追跡可能でかつ選択的な方法で、いかにしてそれを活性化するのかということが知られていなかった。さらに、メラノーマ細胞は、(MDA−5を阻害する)活発なRAS/MEK/ERK活性経路、及びアポトーシスによる細胞死を回避する際立った能力を有するので、MDA−5によって仲介されるアポトーシスシグナルが、メラノーマに対する治療のための有効な機構であることが明らかでなかった。そのため、MDA−5の調節と機能に関するこれまでの情報から、このタンパク質は、メラノーマに対する治療剤の候補を同定する手順のための強力な標的として現われなかった。
・オートファジー遺伝子8(これは、ATG8またはLC3と称される)によって発現されるタンパク質の翻訳後修飾をモニタリングすること。LC3タンパク質は、オートファゴソームに挿入されたときに、プロセシングされ、脂質化される。オートファゴソームは、オートファジーの間、細胞構成要素が運ばれる膜構造である。このタンパク質の立体構造と電気泳動移動度が脂質化によって変化するので、オートファジーの誘導を検証するための考えられる手法の1つは、このタンパク質に対する抗体を用いるイムノブロット法の使用である。この手法によって、電気泳動を実施した後の、タンパク質に対応するバンドが、化合物によってオートファジーが誘導されたと考えられる試料と比較して、対照試料で異なることを検証することができる。あるいは、抗体がオートファゴソームの形を特異的に認識する場合、抗体の結合は、候補化合物で処理した試料におけるオートファジーの誘導を裏付ける。
・LC3タンパク質の細胞内分布の変化をモニタリングすること。その理由は、オートファジーの別の顕著な特徴が、細胞質から新たに形成されたオートファゴソームへのLC3の再配置であることである(Xie及びKlionsky、2007(非特許文献25))。したがって、タンパク質フォーカスの形成は、特に初期段階での、オートファゴソームの形成を示すものと考えることができる。これは、固定細胞または固定組織に対する免疫蛍光または免疫組織化学によって内在性LC3をモニタリングすることにより検出することができる。あるいは、オートファジーは、LC3の蛍光誘導体の細胞内局在を明らかにすることによって、生きた細胞で可視化することができる。蛍光顕微鏡観察によるオートファジーの追跡を可能にする蛍光タンパク質GFP(緑色蛍光タンパク質)またはRFP(赤色蛍光タンパク質)として用いることは一般的であり、拡散したパターンから局所的な染色への細胞蛍光分布の変化は、オートファジーの誘導を示すものである。本発明では、この手法は、融合タンパク質の一過性発現を可能にするベクター(例えば、プラスミドもしくは組換えウイルス)をトランスフェクトしておいた細胞、またはレポータータンパク質とLC3によって形成される融合タンパク質を発現することができるDNAセグメントが安定な形でゲノムに組み込まれた細胞のいずれかの使用を含む。この戦略の一例は、下記の実施例1に示されており、その場合には、細胞に予め組換えレトロウイルスをトランスフェクトした。これによって、融合タンパク質を細胞ゲノムDNA中に導くように、タンパク質GFPとLC3のコード部分をともに含むDNA断片の、細胞ゲノムへの挿入が起こった。このように、安定にトランスフェクトされた細胞を用いる細胞内分布変化の検討を実施することができる。
・細胞内への候補化合物の侵入を検出するための透過電子顕微鏡法の使用。この状況は、より進行した段階のオートファジーの過程におけるオートファゴソーム形成を導く。高密度構造の蓄積(膜結合型)の可視化は、オートファゴソーム形成の指標となる特徴と考えられる。オートファジーの過程は、この過程のより後の段階で(すなわち、試験しようとする化合物で処理してから24または30時間後に)確認することができ、その時点では、電子顕微鏡によって、細胞崩壊を示す巨大な食空胞の形成が示されるはずである。
a)候補化合物を癌細胞培養物、または癌細胞に由来する癌細胞株と接触させる工程と、
b)以下のパラメータ:
i.ファミリーヘリカーゼMDA−5の活性化のレベル、
ii.NOXA発現のレベル、
iii.またはこれらの組合せ
のうちの少なくとも1つを決定する工程と、
c)工程b)で得られたデータを、同様にではあるが、候補化合物の非存在下で処理された同じ細胞の対照で観察されるデータと比較する工程と、
d)対照と比較して、工程b)で決定されたパラメータ(単数または複数)の顕著な増大を生じさせた化合物を選択する工程と、を含むプロセスを指す。
a)候補化合物をメラノーマ細胞培養物、またはメラノーマ細胞に由来する細胞株と接触させる工程:
b)以下のパラメータ:
i.ファミリーヘリカーゼMDA−5の活性化のレベル、
ii.NOXA発現のレベル、
iii.またはこれらの組合せ
のうちの少なくとも1つを決定する工程:
c)工程b)で得られたデータを、同様にではあるが、候補化合物の非存在下で処理された同じ細胞の対照で観察されるデータと比較する工程:
d)前記対照と比較して、工程b)で決定されたパラメータ(単数または複数)の顕著な増大を生じさせた化合物を選択する工程を含む。
この場合、本発明のプロセスは、以下の工程:
a)候補化合物を上で言及した種類の癌のうちの少なくとも1つに由来する癌細胞培養物、または上で言及した種類の癌のうちの少なくとも1つに由来する細胞株と接触させる工程、
b)以下のパラメータ:
i.ファミリーヘリカーゼMDA−5の活性化のレベル、
ii.NOXA発現のレベル、
iii.またはこれらの組合せ
のうちの少なくとも1つを決定する工程、
c)工程b)で得られたデータを、同様にではあるが、候補化合物の非存在下で処理された同じ細胞の対照で観察されるデータと比較する工程、
d)対照と比較して工程b)で決定されたパラメータ(単数または複数)の顕著な増加を生じさせる化合物を選択する工程を含む。
ヒト転移性メラノーマ細胞株SK−Mel−19、SK−Mel−28、SK−Mel−103及びSK−Mel−147ならびにマウスB16細胞は以前に記載されている(Soengasら、2001)。これらの細胞は、10%胎仔ウシ血清(Nova−Tech Inc.,Grand Island,NY,USA)を補充したダルベッコの改変イーグル培地(Life Technologies,Rockville,MD,USA)中で培養した。
dsRNAの合成類似体であるpICは、InvivoGen(San Diego,CA)から購入した。反応性のjetPEI(商標)、jetPEI−Fluor(商標)及びinvivo−jetPEI(商標)は、Polyplus−transfection(Ikirch,Francia)から取得した。ポリエチレンイミンの線形誘導体を含む、これらの製品を用いて、製造元のプロトコルに従って、インビトロ及びインビボで、1〜5のN/P比(RNAリン酸エステル1つ当たりのJetPEIの窒素残基)でpICを複合体化した。
ボルテゾミブ(ベルケード、かつてはPS−341)は、Millenium Pharmaceuticals Inc(Cambridge,MA)から、アドリアマイシン(ドキソルビシン)は、Sigma Chemical(St.Louis,MO)から、エトポシドは、Bristol−Myers Squibb(New York,NY)から入手した。抗酸化剤のタイロン(Tiron)とビタミンEは、Sigma(St.Louis,MO)から、汎カスパーゼ阻害剤ZVADは、R&D System(Minneapolis,MN)から購入した。3−メチルアデニン(3−MA)は、Sigma Chemical(St.Louis,MO)から入手した。クロロキンは、Sigma Chemical(St Louis,MO,USA)から入手した。
タンパク質レベルの変化を明らかにするために、2×106個の細胞を、表示したように処理し、処理後の様々な時間で採取した。全細胞ライセートを還元条件下にて10%、12%または4−15%勾配SDSゲルでの電気泳動にかけ、その後、Immobilon−Pメンブレン(Millipore,Bedford,MA,USA)に転写した。タンパク質バンドは、ECLシステム(GE Healthcare,Buckighamshire,UK)で検出した。
NOXAを下方調節するために使用したshRNAレンチウイルスベクターは、以前に報告されている(Fernandezら、2005(非特許文献31))。MDA−5(標的配列、配列番号:1)を下方調節するために使用したplkoレンチウイルスベクターは、OpenBiosystems(Huntsville、AL)から購入した。スクランブルオリゴヌクレオチドを設計して、対照shRNAも作製した。ウイルスを記載されている通りに293FT細胞から生成させ、>80%の感染効力を与える条件下で使用した(Denoyelleら、2006(非特許文献32))。MDA−5の下方調節は、イムノブロッティングとRT−PCR(配列番号:2のフォワードプライマー及び配列番号:3のリバースプライマー)で確認した。表示されている場合、pICまたはBO−110による処理は、対応するshRNA発現ウイルスの感染3日後に開始された。
トータルRNAを少なくとも2回の独立した実験から単離し、RNeasyキット(Quiagen)を用いて精製した。BO−110で処理した試料は、2.5mgのCy5−UTPで標識し、PICまたはPELとのインキュベーションから得られるCy3−dUTPで標識した2.5gのRNAとのハイブリダイゼーション反応における参照として用いた。マークしたRNAを、製造元の指示に従って、Agilent(Santa Clara,CA,USA)の2色オリゴ完全ヒトゲノムマイクロアレイ(4×44K)とハイブリダイズさせた。洗浄後、スライドをスキャンアレイ10 5000 XL(GSI Lumonics Kanata,Ontario,Canada)を用いてスキャンし、画像を以前に記載されているように(Alonsoら、2007(非特許文献33))、GenePix 4.0プログラム(Axon Instruments Inc.,Union City,CA)で解析した。蛍光の強度測定値を自動バックグラウンド減算に供した。Cy3:Cy5の関係性を全ての点の中央比の値に対して標準化した。標準化の後、両方のチャンネルの強度(中央値の合計)が局所的なバックグラウンドよりも低い点を捨てた。残りの点の関係を対数変換(底2)にかけ、2つ組の点のアレイを中央値に合わせて調整した。対照と被験試料の間で示差的に発現された遺伝子の加重しない対のグループ化(UPGMA:非加重結合法)は、Gene Expression Pattern Analysis Suite(GEPAS)を用いて実施した。
雌C57BL/6マウスは、NIH(Bethesda.MA)から購入した。NK細胞、T細胞及びB細胞リンパ球機能に障害のある雌SCIベージュマウスは、Charles Rivers(Wilmington,MA)から得たものであった。全ての動物は、実験の開始時点で6〜12週齢であった。動物の世話は、ミシガン大学がんセンター(University of Michigan Cancer Center)の施設手続きに準じて行なわれた。
透過電子顕微鏡法(TEM)については、表示した細胞集団を0.1ソーレンセン緩衝液(pH7.5)ですすぎ、2.5%グルタルアルデヒド中で1.5時間固定し、その後、脱水し、スパー樹脂に包埋した。次に、このブロックを60〜100nm超薄切片で薄切し、銅グリッド上に拾い上げた。ルーチン解析のために、超薄切片を2%酢酸ウラニル及びクエン酸鉛で染色した。Philips CM−100透過電子顕微鏡(FEI,Hillsbrough,OR)及びKodak 1.6 Megaplusデジタルカメラで電子顕微鏡写真を取得した。
pCNA発現ベクターにクローニングされたeGFP−LC3融合体は、Gabriel Nunez(ミシガン大学がんセンター(University of Michigan Cancer Center))から贈与されたものであった。eGFP−LC3ならびに断片のeGFP−Rab7wt、eGFP−Rab7 T22N、eGFP−Rab5wt、eGFP−Cherry−LC3及びCherry−LC3を、安定な遺伝子導入用のpLVO−puroレンチウイルスベクターにクローニングした。メラノーマ由来細胞(すなわち、SK−Mel−103)にpLVO−eGFP−LC3を感染させ、ピューロマイシンで選択した。Leica AF6000蛍光顕微鏡を用いてGFP−LC3と関連する蛍光放出をイメージングし、LAS AF Vl.9(Leica,Solms,Germany)で画像を解析した。共焦点リアルタイム顕微鏡観察のために、本発明者らは、CO2及び温度制御インキュベーションチャンバーに接続されたLeica TCS−SP2−AOBS−UV超スペクトル顕微鏡を用いた。LCS(Leica,Solms,Germany)で画像を解析した。共局在実験のために、50nMまたは200nMの濃度のリソトラッカー(商標)レッドまたはブルー(Invitrogen,Carlsbrad,CA)及びHoescht 33342(Invitrogen,Carlsbrad,CA)を、イメージングの10分前に5μg/mlの濃度で添加した。共局在画像は、LAS AF Vl.9(Leica,Solms,Germany)を用いて解析した。
ヒトインターフェロンαを酵素連結免疫吸着アッセイ(ELISA)によって培養上清中で測定した。ヒトIFN−α ELISAキット及び組換えhIFN−αをPBL Interferon Source(Piscataway,NY)から購入し、製造元のプロトコルに従って用いた。IFN−α発現レベルを骨髄由来マクロファージ(BMDM)及びB16メラノーマ細胞からリアルタイムPCRで測定した。BMDMは、以前に記載されているように調製し、プレーティングし、処理した(Celadaら、1984(非特許文献35))。β−アクチンで標準化した後、TaqManプライマー及びApplied Biosystemsから入手したプローブを用いて、Applied Biosystems 7700配列検出器で、IFIT−1 RNA転写物のリアルタイム定量PCR解析を行なった。
生存データは、平均+/−s.e.mとして表す。差の統計解析は、両側スチューデントt検定により求めた。P<0.05を有意とみなした。インビボでの腫瘍増殖及び転移の統計評価については、一般化したマン−ホイットニーウィルコクソン検定を用いて、2群間の連続変数の値を比較した。<0.05のP値を有意とみなした。
先に論じたように、(細胞死の誘導と生存の両方に関する)オートファジーの顕著な特徴は、細胞質から新たに生成したオートファゴソームへのオートファジータンパク質遺伝子8(ATG8)/LC3の再配置である。この観察に基づいて、GFP−LC3融合タンパク質の細胞分布の変化(すなわち、拡散パターンから局所的染色への変化)が、初期段階のオートファジーのマーカーとして用いられる。オートファゴソームの存在は、電子顕微鏡観察または光学顕微鏡観察によっても確認することができる。
薬物に対するメラノーマの応答におけるオートファジーの役割を検討するために、GFP−LC3に基づく識別解析を用いて、市販の化学療法剤及び免疫調節物質をスクリーニングした。GFPが付いたオートファゴソームLC3マーカーの誘導体を発現するレンチウイルスベクター(例えば、pLVO−eGFP−LC3)をメラノーマ細胞に安定にトランスフェクトした。
先のパラグラフで記載したBO−110で処理した細胞におけるGFP−LC3の局所的染色は、オートファゴソームの形成と一致している。しかしながら、異所性に発現したGFP−LC3の非特異的凝集(Klionskyら、2008(非特許文献37))の可能性を排除するために、電子顕微鏡法によって応答を独立に解析した(図1D)。
SK−Mel−103細胞を用いて実施した初期の研究で見出されたオートファジー促進性のBO−110の活性が、より広範な抗メラノーマ活性の現われであったか否かを明らかにするために、さらなる細胞株のセットを試験した。
ヒト転移性メラノーマ細胞株の遺伝的バックグラウンドを、表1に示す。
DNAまたはRNA分子の好都合なエンドサイトーシスに加えて、PEIは、エンドソーム膨張を促進し、細胞質への遺伝材料の効率的な送達を可能にすることができる(Payne、2007に概説されている)。そのため、PEIは、pICが細胞質内センサーに接近するのに有利に働くことができる。メラノーマ分化関連遺伝子−5(MDA−5)は、これらのセンサーの1つであり(Akira、2006)、そのため、著者らは、このタンパク質がBO−110を介してメラノーマ細胞を死滅させるドライバーであるか否かを検討した。
次に、アッセイは、BO−110誘導性細胞死の実行に関与する機構に焦点を当てた。3−メチルアデニン(3−MA)及びクロロキンは、それぞれ、オートファゴソーム形成またはオートリソソーム活性を妨害するその能力によるオートファジー機構の独立した検証によく用いられる(Maiuriら、2007(非特許文献41);Klionskyら、2008(非特許文献37))。
オートリソソームがBO−110の重要なドライバーであるならば、BO−110処理の間、リソソームヒドロラーゼの妨害によって、メラノーマ細胞が保護されるはずである。このオルガネラには、重複する標的を有する複数の酵素が局在することができるので、リソソーム依存的活性を全て妨害するのは実現可能ではない(Fehrenbacher及びJaattella、2005(非特許文献42))。それでも、リソソーム活性に関する有用な情報は、広域スペクトルのプロテアーゼ阻害剤であるE64d及びペプスタチンAによって提供することができる。というのは、これらの化合物は、オートリソソーム中の様々なカテプシン(B、D、及びL)を効率的に妨害するからである(Klionskyら、2008(非特許文献37))。
そのため、緩衝液対照またはBO−110による処理の20時間後、細胞死に対するクロロキン、ペプスタチンAまたはE64dの効果を比較するために、試験を実施した。結果を図6C(これは先に言及されている)に示す。注目すべきことに、ペプスタチンA及びE64dは、BO−110による細胞死の程度を50%低下させた。
まず、後期エンドソームマーカーRab7(Luzioら、2007(非特許文献43))に融合したGFPを発現するメラノーマ細胞において、エンドソーム動態を評価した。基礎のエンドソーム生成及び分割(すなわち、漸進的なサイズの減少)は未処理のメラノーマ細胞で検出された(図7Aの左のパネル)。しかしながら、BO−110処理は、エンドソーム活性を著しく増強させ、エンドソームの持続的かつ多重的な生成を誘導した(図7Aの中央及び右のパネル)。これらのエンドソームは、GFP−Rab7及びリソトラッカーレッドの二重イメージングによって明らかになるように、リソソームで満たされていることが分かった(図7B)。さらに、経時的顕微鏡観察によって、図7Cの連続的な一連の融合事象にも示されているような、GFP−Rab7で装飾されたエンドソームへのリソソームの多重動員の高速動態が明らかになった。重要なのは、図7B(右のパネル)に示すように、細胞がこのタンパク質の既知のドミナントネガティブ突然変異体であるRab7−T22Nを過剰発現した場合、エンドソーム−リソソーム融合が顕著に阻害されたことである。全体として、これらの結果から、BO−110で処理した腫瘍細胞におけるエンド/リソソームコンパートメントの動的動員が明らかになった。
リソソームプロテアーゼは、複数のレベルで死プログラムに影響を及ぼすことができる(Maiuriら、2007(非特許文献41);Hoyer−Hansen及びJaatella、2008(非特許文献26))。ミトコンドリアの場合、それらは、活性酸素種(ROS)の産生を脱調節し、かつ/または標準的なアポトーシスカスパーゼ(調節性casp−9ならびにエフェクターcasp−3及び7)を働かせることができる。casp−8に依存的な外因経路も、リソソーム活性化に応答することができる(Fehrenbacher及びJaattella、2005(非特許文献42))。
BO−110の作用様式におけるROSの影響に取り組むために、ビタミンE、トロロクス(Trolox)またはタイロン、異なる抗酸化活性を有するスカベンジャー及び汎カスパーゼ阻害剤z−VAD−fmkの存在下で処理を行なった。これらの場合の各々における細胞死に関する結果を解析したときの結果を図8Aに示す。ビタミンEで得られたデータは、ROSによって制御されたメラノーマにおけるアポトーシスを阻止するこれらの試薬の用量の言及された化学的抗酸化剤で得られた結果の代表例として示されている(Fernandezら、2006(非特許文献44))。図に示すように、これらの抗酸化剤の存在下では、BO−110による細胞死に対する顕著な効果は観察されなかった。その代わり、汎カスパーゼ阻害剤z−VAD−fmkは、BO−110による死滅を70%阻害した。まとめると、これらの結果は、カスパーゼ依存的機構がオートファジープログラムの下流を活性化したことを裏付けている。
BO−110の作用様式をより詳細に解析するために、及びこの薬剤によって特有に活性化され得る事象を同定するために、薬物応答をボルテゾミブの効果と比較した。これもまた、メラノーマ細胞におけるアポトーシス機構の強力な活性化因子であるので、この薬剤を選択した(Wolterら、2007(非特許文献11);Fernandezら、2006(非特許文献44))。
次に、pIC及びBO−110の抗メラノーマ活性をインビボで評価した。メラノーマモデルでは、自然免疫プログラムの効果的な活性化のために、裸のpICは、高用量でかまたは他の薬剤(例えば、タンパク質合成阻害剤)と組み合わせてかのいずれかで投与されなければならない。先の実施例で得られたデータは、pICがPELの存在下で顕著により強力であることを示唆した。
pICは、IFNによって誘起される細胞免疫の標準的な誘導物質である(Wenzelら、2008)。しかしながら、これまでの実施例で明らかにされたデータによって、pICが、PEIと複合体化されたときに、「プロフェッショナルな」免疫細胞におけるIFN媒介性応答とな異なり得る、細胞自律的な様式で作用することもできることが示唆された。この可能性を評価するために、B16メラノーマ細胞及びマクロファージを、IFN−αを分泌し、それに応答するその能力について試験した。RT−PCRによって、両方の細胞型が、BO−110による処理の後に、IFIT−1(テトラトリコペプチド反復を有するIFN誘導性タンパク質)などの標準的なIFN−α標的を活性化することが示された(図11A)。PEIは、マクロファージにおけるIFN標的のpIC媒介性誘導にとって不可欠ではなかった(図11A)。これらの細胞は、ウイルスdsRNAを効率的に感知することができるので、これは予想される。しかしながら、メラノーマ細胞は、裸のpICだけではIFIT−1を誘導することができなかった(図11A)。
メラノーマ細胞は免疫耐性であることが多いので、メラノーマ細胞に対するBO−110の直接的な毒性が高度免疫不全バックグラウンドでも有効であるか否かを試験した。メラノーマ免疫寛容と関連する最もよく見られるエフェクター機構は、NK、T及びB細胞シグナル伝達の欠損である(Kirkwoodら、2008(非特許文献14))。そのため、メラノーマ増殖を阻止する(単剤としてのまたはPEIと複合体化した)pICの効力を、NK、T及びB細胞リンパ球機能に障害があるマウス(SCIDベージュマウス)で試験した。
pICとBO−110の間の違いを比較するために、より関連性のある設定を用いた。Tyr::NRASQ61K×INK4a/ARF−/−マウスは、ヒト疾患と同様の特徴を有するメラノーマを発症する(Ackermannら、2005(非特許文献34))。マウスをDMBA(Sigmaから入手した7,12−ジメチルベンズ[a]アントラセン)の単回局所処置を用いて処置した。色素性病変が1mmの直径に達したら、インビボ送達用に処方された対照PEI、裸のpICまたはPEIにコンジュゲートしたpICを腹腔内注射(i.p)によって週に2回投与した。
メラノーマ中に存在し、dsRNAセンシング及びオートファジーに影響を及ぼす遺伝的及び後成的変化は、異なる癌タイプ間で保存されていない場合があるので、BO−110が他の新生物性悪性腫瘍で治療的に有効であることができるか否かは明白ではなかった。特に、膵臓、大腸、膀胱、脳、***、前立腺、肺及び卵巣の腫瘍は侵襲性が高く、また、1つには、死プログラムの活性化に多面性があるという理由で、種々の処理に耐性がある。
BO−110に対する感受性は、事前に(すなわち、腫瘍細胞タイプをもとに)予測することができないので、BO−110に対する応答を仲介するシグナル伝達カスケードを明確にする必要があった。メラノーマ細胞における(cDNAアレイに基づく)ハイスループットな遺伝子解析により、BO−110は、dsRNAセンサーのMDA−5、及びアポトーシス促進性因子のNOXAの強い上方調節を促進することができることが示された。興味深いことに、イムノブロッティングアッセイを用いて、本発明者らは、実際、(例えば、HCT116株またはMiaPaCa2株における)BO−110に対する感受性及び耐性は、MDA−5及びNOXAを誘導する細胞の能力と相関することを証明した(図15)。上で示したBO−110のアポトーシス促進性の役割と一致して、感受性のある細胞株は、電気泳動移動度の変化として可視化することができるカスパーゼ−9の明らかなプロセッシングを示した(図15)。
Claims (10)
- ポリイノシン−ポリシチジル酸(pIC)と線状ポリエチレンイミン(PEI)の組合せを含む複合体を含有し、
(a)メラノーマ細胞またはメラノーマ細胞に由来する細胞株において、オートファジーを誘導し、
(b)正常なメラノサイトには影響を及ぼさず、
(c)メラノーマ細胞またはメラノーマ細胞に由来する細胞株において、オートファジー及びアポトーシスの二重誘導を促進し、
(d)ポリイノシン−ポリシチジル酸と線状ポリエチレンイミンの組合せを1〜5のN/P比で含む
ことを特徴とする医薬組成物。 - 前記メラノーマ細胞に由来する細胞株が、ヒト細胞株:SK−Mel−19、SK−Mel−28、SK−Mel−103及びSK−Mel−147、ならびにB16マウス細胞の群から選択される
請求項1に記載の医薬組成物。 - 以下の腫瘍型:膵癌、大腸癌、膀胱癌、神経膠腫、乳癌、前立腺癌、肺癌及び卵巣癌のうちの少なくとも1つに関する細胞におけるオートファジー及びアポトーシスの二重誘導を促進する
請求項1または2に記載の医薬組成物。 - 前記由来する細胞株が、以下の群:
a)膵癌細胞株IMIMPC2、MiaPaCa2、AspcI、A6L、SKPCI及びPanc−1;
b)大腸癌細胞株CACO、SW480及びSW1222;
c)膀胱癌細胞株RTI 12、MGHU4、639V、253J、MGHu3及びSWI 170;
d)神経膠腫細胞株U87MG、U251及びT98G;
e)乳癌細胞株MDA231、MCF7及びT47D;
f)前立腺癌細胞LNCaP、PC3及びDU145;
g)肺癌細胞株H1299及びNCI H460;または
h)卵巣癌細胞株:NCI H23、CHQKI及びSK−OV−3
から選択される
請求項3に記載の医薬組成物。 - 鎖当たり少なくとも1000ヌクレオチド長であるポリイノシン−ポリシチジル酸とポリエチレンイミンの組合せからなる
請求項1ないし4のいずれかに記載の医薬組成物。 - 癌の治療に使用される医薬組成物の製造における
請求項1ないし5のいずれかに記載の医薬組成物の使用。 - 転移性癌の治療に使用される医薬組成物の製造における
請求項6に記載の医薬組成物の使用。 - メラノーマの治療に使用される医薬組成物の製造における
請求項7に記載の医薬組成物の使用。 - 以下の種類の癌:膵癌、大腸癌、膀胱癌、神経膠腫、乳癌、前立腺癌、肺癌及び卵巣癌のうちの少なくとも1つの治療に使用される医薬組成物の製造における
請求項6に記載の医薬組成物の使用。 - 免疫不全患者の治療に使用される医薬組成物の製造におおける
請求項6ないし9のいずれかに記載の医薬組成物の使用。
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