ES2368963A1 - Procedimiento de identificación de agentes terapéuticos contra el melanoma y uso de agente identificado. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de identificación de agentes terapéuticos contra el melanoma y uso de agente identificado. La invención se refiere a un procedimiento para la identificación de compuestos candidatos a ser utilizados como agentes terapéuticos para el tratamiento del melanoma entre aquellos que sean capaces de activar la proteína MDA-5 o de aumentar los niveles de la proteína NOXA, y de desencadenar autofagia. Se basa en que la activación del sensor de dsRNA MDA-5 es capaz de desencadenar la destrucción de células de melanoma por activación tanto de autofagia como de apoptosis, de manera autónoma y selectiva de las células tumorales, sin provocar la estabilización del antagonista natural de NOXA, MCL-1. La invención se refiere también al uso de RNAs de doble cadena o análogos del mismo tales como el ácido poliinosin-policitidílico (pIC), acomplejados con portadores policatiónicos tales como la polietilenimina (PEI), para la fabricación de medicamentos para el tratamiento del melanoma.
Description
Procedimiento de identificación de agentes
terapéuticos contra el melanoma y uso de agente identificado.
La invención se refiere al campo del tratamiento
del cáncer y a la identificación de compuestos válidos para ello.
Más concretamente, la invención se refiere a un procedimiento para
la identificación de compuestos candidatos a ser utilizados en el
tratamiento del melanoma, así como al uso de una combinación de
compuestos identificada por dicho procedimiento como combinación
adecuada para tratar el melanoma.
El melanoma representa un prototipo de los
cánceres sólidos con una creciente incidencia y un pronóstico
extremadamente grave en los estadios avanzados (Jemal et al.,
2008). Al mismo tiempo, el melanoma metastásico continúa siendo un
paradigma de los tumores quimio e inmunoresistentes, a pesar de los
considerables esfuerzos que se han hecho para identificar las causas
que determinan su quimio e inmunorresistencia a nivel molecular. Los
únicos agentes aprobados por la Agencia de Fármacos y Alimentos de
los EE.UU. (FDA: Food and Drugs Administration) para el tratamiento
del melanoma metastásico son el agente alquilante dacarbazina (DTIC)
y el inmunomodulador IL-2 (Tawbi and Kirkwood,
2007). Sin embargo, rara vez más del 5% de los pacientes se
benefician de respuestas completas y duraderas en el caso de los
melanomas metastásicos, y las toxicidades secundarias pueden ser
graves. En consecuencia, la supervivencia media actual de los
pacientes con melanoma metastásico es de 6 a 10 meses y, por ello,
el desarrollo de terapias mejoradas es una prioridad en esta
enfermedad (Jemal et al. 2007).
Inicialmente, el análogo sintético de dsRNA
viral conocido como pIC (ácido
poliinosin-policitidílico), un compuesto que se ha
utilizado durante más de cuatro décadas para estimular el sistema
inmune de manera dependiente de IFN (Field et al. 1967),
pareció dar resultados prometedores como candidato a agente
terapéutico contra el melanoma. Desgraciadamente, los estudios
clínicos con pIC desnudo demostraron poca estabilidad del pIC y poca
inducción del IFN, junto con ausencia de efecto antitumoral
detectable en melanoma (Robinson et al., 1976). Así, se
considera que el pIC desnudo es un pobre agente antimelanoma.
Los análisis histogenéticos de alta eficacia y
los estudios sistemáticos funcionales han supuesto avances
significativos en nuestra comprensión del inicio y progresión del
melanoma, así como en el descubrimiento de los complejos mecanismos
asociados con el fracaso de los tratamientos (Fecher et al.,
2007; Gray-Schopfer et al., 2007). Se están
identificando defectos consistentes y alteraciones en las cascadas
de señalización de BRAF/MAPK, PI3K/AKT,
NF-\kappaB o NOTCH, proporcionando una plataforma excitante para el diseño racional de fármacos (Gray-Schopfer et al., 2007). Los programas de muerte celular en los que están implicados las mitocondrias, el retículo endoplásmico están siendo también objeto de estudio, aunque demuestran ser invariablemente ineficaces in vivo (Hersey and Zhang, 2008). Sin embargo, la terapia dirigida no ha demostrado ser eficaz en los estudios clínicos sobre melanoma (Flaherty, 2006): o bien los fármacos anticancerígenos no interaccionan con sus dianas de manera efectiva, o tienen que ser administrados siguiendo regímenes de dosificación que dan lugar a niveles de toxicidad inaceptables en los compartimentos celulares normales (Tawbi and Kirkwood, 2007). Es importante mencionar que durante el tratamiento pueden incluso activarse mecanismos compensatorios, que seleccionan poblaciones de células con una quimiorresistencia superior a la inicial (Lev et al., 2004; Shatton et al., 2008; Wolter et al., 2007). De hecho, se considera en general que el melanoma presenta una capacidad notoria para eludir la estimulación de la apoptosis por distintas rutas, capacidad que le resulta muy ventajosa para su progresión y la formación de metástasis, así como para desarrollar una notoria capacidad de resistencia a distintas terapias (revisado por Ivanov et al., 2003).
NF-\kappaB o NOTCH, proporcionando una plataforma excitante para el diseño racional de fármacos (Gray-Schopfer et al., 2007). Los programas de muerte celular en los que están implicados las mitocondrias, el retículo endoplásmico están siendo también objeto de estudio, aunque demuestran ser invariablemente ineficaces in vivo (Hersey and Zhang, 2008). Sin embargo, la terapia dirigida no ha demostrado ser eficaz en los estudios clínicos sobre melanoma (Flaherty, 2006): o bien los fármacos anticancerígenos no interaccionan con sus dianas de manera efectiva, o tienen que ser administrados siguiendo regímenes de dosificación que dan lugar a niveles de toxicidad inaceptables en los compartimentos celulares normales (Tawbi and Kirkwood, 2007). Es importante mencionar que durante el tratamiento pueden incluso activarse mecanismos compensatorios, que seleccionan poblaciones de células con una quimiorresistencia superior a la inicial (Lev et al., 2004; Shatton et al., 2008; Wolter et al., 2007). De hecho, se considera en general que el melanoma presenta una capacidad notoria para eludir la estimulación de la apoptosis por distintas rutas, capacidad que le resulta muy ventajosa para su progresión y la formación de metástasis, así como para desarrollar una notoria capacidad de resistencia a distintas terapias (revisado por Ivanov et al., 2003).
A diferencia de la quimioterapia estándar, cuyo
objetivo es matar células tumorales principalmente "desde
dentro" (es decir, activando programas intrínsecos de muerte
celular), la inmunoterapia, tradicionalmente, ha implicado una
cascada indirecta de interacciones célula-célula. En
el melanoma, la mayor parte de los esfuerzos se han enfocado a
incrementar los niveles o la eficacia funcional de dos
compartimentos: las células presentadoras de antígenos y las
células T citotóxicas (Wilcox and Markovic, 2007). También se están
haciendo ensayos con vacunas, así como anticuerpos dirigidos contra
inmunomoduladores inhibidores (p. ej. CTL4), aunque con resultados
frustrantes en los ensayos clínicos en fase IV (Kirkwood et
al., 2008). Más recientemente, se está persiguiendo la
estimulación del sistema inmune innato por medio de la activación de
los receptores similares a Toll (TLR)-3, - 4, -7 y
-9, para apoyar la destrucción citotóxica de las células de melanoma
mediante citocidas naturales (NK: natural killers), células
dendríticas (DC: dendritic cells) y células T (para
revisiones recientes, véanse Kirkwood et al., 2008, o Tormo
et al. 2007). Sin embargo, múltiples estudios, incluidos
estudios de los autores de la invención, han demostrado una
capacidad inherente de las células para eludir las terapias
inmunológicas regulando a la baja (editando) marcadores
inmunorreactivos de superficie. Los melanomas también pueden ejercer
efectos supresores sobre el hospedador (p. ej., inhibición de la
maduración de las células presentadoras de antígenos o bloqueo de la
activación completa de células T) (Tormo et al., 2006;
Iikovitch and López, 2008; Verma et al., 2008). Así, puede
decirse que los melanomas presentan también una capacidad inherente
para eludir la actividad antitumoral de los inmunomoduladores.
En el marco de la inmunoterapia, una de las
moléculas cuyo aumento de expresión ha sido estudiado como posible
factor positivo en la terapia contra el melanoma es
MDA-5 (gen 5 asociado a la diferenciación de
melanoma), el producto de uno de los genes inicialmente descritos
como asociados a la diferenciación del melanoma (Kang et al.,
2002). MDA-5 es una helicasa con un dominio de unión
al RNA de doble cadena (dsRNA), sustrato sobre el cual ejerce la
actividad helicasa (Yoneyama et al., 2005), lo que le permite
actuar como primera línea de defensa frente al dsRNA viral (Akira
et al., 2006). Además, MDA-5 contiene un
dominio de reclutamiento de caspasas (CARD), que se requiere para
activar vías de señalización que conllevan la activación de
NF-\kappaB y otros factores de transcripción
implicados en la regulación de citoquinas (Kawai et al.,
2005). Los receptores de la familia de helicasas a la que pertenece
MDA-5 comparten las mismas cascadas de señalización
entre ellos y con el adaptador IPS-1. Otros miembros
de la misma familia de helicasas son RIG-I
(retinoic acid inducible protein 1, también abreviado como
Ddx58) y LGP2 (también abreviado como Ddx58).
Se conoce que tanto IFN-\beta
como el dsRNA provocan la inducción de la transcripción del gen
Mda-5, por lo que se ha propuesto un papel potencial
del aumento de la expresión de Mda-5 en la
supresión del crecimiento inducido por IFN. Pero se ha visto (Kang
et al., 2002) que la inducción del MDA-5
endógeno mediante IFN-\beta es primariamente
citostática (es decir, induce la parada del ciclo celular). Así,
para desencadenar muerte celular tumoral, MDA-5 tuvo
que expresarse ectópicamente a niveles elevados (Kovacsovics et
al., 2002). Aún así, esta actividad
pro-apoptótica de la expresión ectópica de
MDA-5 resultó ineficaz en células tumorales con una
ruta RAS/MEK/EK hiperactiva (Lin et al., 2006), como es el
caso de los melanomas (Chin et al., 2006).
La solicitud de patente norteamericana US
2007/0259372 propone la identificación de agonistas o antagonistas
del IFN-\beta, IFN-\alpha o el
IFN-\gamma entre los compuestos capaces de
incrementar la expresión de MDA-5 y sugiere también
que los inductores de la expresión del gen Mda-5
pueden considerarse candidatos a compuestos inductores de la
diferenciación terminal de células tumorales, en particular células
de melanoma, por exhibir el promotor del gen de
Mda-5 una expresión específica de tejido en los
melanocitos. También sugiere un posible papel de
MDA-5 en la generación de señales apoptóticas a
través de su dominio CARD. Sin embargo, hasta el momento, no se
conocía cuáles eran las dianas de MDA-5 capaces de
desencadenar la apoptosis, y cómo activarlas de manera trazable y
selectiva para las células tumorales. La acusada capacidad del
melanoma para eludir los mecanismos que provocan la muerte celular
programada tampoco hacía suponer que la activación de señales
apópticas mediadas por MDA-5 pudiera suponer un
mecanismo válido para la terapia contra el melanoma, por lo que la
activación de MDA-5 no se había considerado como
procedimiento para identificar candidatos a agentes terapéuticos
contra el melanoma.
La autofagia, por su parte, está emergiendo como
una estrategia alternativa para provocar el funcionamiento de la
maquinaria endógena de las células cancerígenas relacionada con la
muerte celular. Este proceso implica una intrincada cascada de
acontecimientos que conduce, en último lugar, al secuestro de
componentes citosólicos para la posterior degradación por los
lisosomas (Xie and Klionsky, 2007). Dependiendo del mecanismo de
englobamiento o de la naturaleza de la carga que les llega a los
autolisosomas, se han descrito múltiples mecanismos de autofagia de
los cuales la macroautofagia, o degradación de fragmentos grandes de
orgánulos celulares y agregados proteicos, está despertando un
creciente interés por su potencial para comprometer la viabilidad
celular de las células cancerígenas, privándola de orgánulos clave
(p. ej., retículo endoplásmico o mitocondrias)
(Hoyer-Hansen, 2008). Sin embargo, se desconoce cómo
está regulada la autofagia y su potencial terapéutico no es claro y
sencillo (Hippert et al., 2006). Por una parte, la
macroautofagia (a la que se hará referencia simplemente como
"autofagia" de aquí en adelante) ha demostrado un importante
potencial para proteger células frente a una amplia variedad de
señales agresivas intracelulares y extracelulares, incluidos los
fármacos anticancerígenos, y para favorecer el desarrollo de tumores
(Mizushima et al., 2008; Kroemer and Levine, 2008).
Paradójicamente, la autofagia ha sido asociada también con muerte
celular (Kromer et al. 2009). Así, por una parte, la
autofagia excesiva o persistente puede promover la muerte celular
por depleción de orgánulos clave (tales como el retículo
endoplásmico o las mitocondrias); por otra, los inductores de la
pro-autofagia también pueden redirigir señales de
supervivencia, desregular enzimas lisosomales y, en última
instancia, activar muerte celular dependiente o independiente de
caspasas (Xie and Klionsky, 2007). En consecuencia, no está claro si
la autofagia puede exacerbar la quimio e inmunorresistencia del
melanoma, en lugar de mejorar la respuesta al tratamiento, por lo
que la viabilidad de la autofagia como estrategia terapéutica en el
melanoma no es obvia. Además, ninguno de los más de 20 genes de
autofagia descritos hasta la fecha en células de mamífero ha sido
caracterizado con detalle en el melanoma. Por ello, se desconoce si
la autofagia está regulada en el melanoma de una manera diferente a
la de las células normales, que proporcione una ventana para la
intervención terapéutica.
En esta situación, sigue pendiente la
identificación de agentes terapéuticos para el tratamiento del
melanoma, alternativos a los ya autorizados y, especialmente, que
sean válidos para el tratamiento de pacientes inmunocomprometidos.
También sigue siendo necesaria la identificación de posibles dianas
terapéuticas útiles para el desarrollo de procedimientos de
identificación de candidatos a agentes terapéuticos para el
tratamiento del melanoma entre los compuestos capaces de actuar
sobre dichas dianas.
La presente invención proporciona solución a
ambos problemas.
La presente invención se basa en el sorprendente
hallazgo de que el RNA de doble cadena (dsRNA) viral y los análogos
del mismo, tales como el bien conocido ácido
poliinosin-policitidílico (al que se alude
habitualmente de forma abreviada como pIC), cuando se administran
formando complejos con portadores catiónicos, resultan ser potentes
inductores de la muerte de células de melanoma, gracias a que son
capaces tanto de desencadenar autofagia como de activar la apoptosis
selectiva de células tumorales de melanoma vía NOXA, sin requerir
p53 o desencadenar mecanismos compensatorios a la inducción de NOXA.
El efecto observado es claramente superior al efecto obtenido cuando
se administra pIC desnudo, en ausencia de portador catiónico, lo que
está en consonancia con los pobres resultados que se obtuvieron en
la fases clínicas en los estudios de comprobación de la capacidad
del pIC como agente terapéutico para el tratamiento del
melanoma.
Tal como se demuestra más adelante en los
Ejemplos de la presente memoria, a diferencia de las respuestas
clásica a RNA viral mediadas por células T citotóxicas o asesinas
naturales, el pIC (ácido poliinosin-policitidílico)
acomplejado con PEI (polietilenimina) fue suficiente para promover
el suicido de las células de melanoma y el bloqueo de metástasis
mediada por melanomas in vivo, incluso en ratones
inmunocomprometidos. Los análisis genéticos, funcionales y
ultraestructurales descritos más adelante en la presente solicitud
demuestra que la inducción de la autofagia por pIC no se desencadena
para la protección celular, sino para una destrucción selectiva de
células tumorales. Los análisis sobre los mecanismos de muerte
dirigidos por pIC mostraron una dependencia estricta de portadores
catiónicos para poder llegar al citosol y ejercer su acción.
Aunque el pIC estaba considerado como un
inductor de la inmunidad controlada por el IFN, el efecto observado
es independiente de la activación de la vía de producción y
secreción de IFN-\alpha. En consonancia con esa
observación, la activación de la vía autofágica hallada se produce
incluso en animales inmunocomprometidos.
La administración a células de melanoma del
complejo [pIC]^{PEI} es capaz de promover toda una cascada
de señalización que conlleva la activación de la expresión y/o la
actividad de distintas proteínas, que resulta en una activación
tanto de la autofagia como de la apoptosis y que da lugar a la
muerte de las células de melanoma, sin afectar a la viabilidad de
los melanocitos sanos, es decir, de forma específica de las células
tumorales. Esta cascada de señalización proporciona nuevos puntos de
actuación para la explotación clínica de programas intrínsecos de
reconocimiento de patógenos, autofagia y muerte de células
tumorales.
Entre las moléculas implicadas en la activación
de la autofagia y la apoptosis, los estudios con RNAs de
interferencia revelaron que la helicasa MDA-5, cuya
expresión y actividad enzimática se activan mediante dsRNA, es un
operador clave en la citotoxicidad del pIC acomplejado. En presencia
del complejo [pIC]^{PEI}, se produce la activación de esta
proteína, que se manifiesta por una separación de los dominios
helicasa y caspasa como resultado de una ruptura proteolítica. Esta
activación es mucho menor (y, en algunas líneas celulares de
melanoma, nula), cuando se administra pIC desnudo, sin PEI.
MDA-5 parece actuar como un
enlace entre la vía autofágica y la vía apoptótica, cuya activación
se puede explotar clínicamente para la terapia del melanoma. Por una
parte, contrariamente a las estrategias que se habían seguido
previamente, en las que se intentaba provocar un aumento de la
expresión de MDA-5 para conseguir la muerte de
células tumorales, los resultados que se muestran más adelante en la
presente solicitud demuestran que los niveles endógenos de
MDA-5 en células de melanoma son suficientes para
desencadenar muerte celular, siempre y cuando se aporte al citosol
suficiente dsRNA (o un análogo del mismo) de forma apropiada.
MDA-5 parece estar implicado en la inducción de
programas apoptóticos intrínsecos vía NOXA, provocando un aumento de
los niveles de dicha proteína; esta inducción de la apoptosis vía
NOXA es independiente del estatus de p53 y no presenta efectos
compensatorios sobre MCL-1, un antagonista natural
de NOXA que se estabiliza al activar esta última proteína con
inhibidores de proteasomas. Esta activación de NOXA, sin activación
de MCL-1, representa un punto de acción de
MDA-5 sobre la maquinaria apoptótica desconocido
hasta ahora, diferente de las vías apoptóticas activadas por
inductores de la apoptosis tales como bortezomib, molécula que no
tiene ningún efecto en los niveles de MDA-5 o en su
proce-
samiento.
samiento.
Además, los Ejemplos mostrados más adelante en
la presente memoria descriptiva muestran que el complejo del análogo
del dsRNA pIC con el portador policatiónico PEI activa la autofagia
y desencadena la maquinaria apoptótica en los tumores siguiendo una
estrategia inesperada: el tratamiento con este complejo no conduce
simplemente a la fusión de autofagosomas individuales con lisosomas
discretos, sino que induce marcados cambios estructurales en el
compartimento endocítico de las células tratatas, observándose una
secuencia ordenada de eventos de fusión que implican el
reclutamiento progresivo de marcadores de endosomas, autofagosomas y
lisosomas (Rab7, LC3 y Lysotracker, respectivamente). Esta serie
Rab7>LC3>Lysotracker sucede en múltiples ciclos sostenidos,
hasta que las células tumorales finalmente colapsan, habiéndose
observado un intervalo de tiempo considerable desde que se detectan
las primeras fusiones endocíticas Rab7/LC3 (dentro de la primera
hoja de tratamiento) hasta que sucede el colapso celular final
(24-48 h). Además, para que el proceso de la muerte
de las células de melanoma se produzca de forma eficiente, es
necesaria la actividad de las caspasas, por lo que la activación del
factor proapoptótico NOXA provocada por MDA-5
resulta ser una segunda fuerza paralela necesaria para que el
efecto citotóxico sea efectivo. Así la helicasa
MDA-5, un sensor innato del dsRNA, se revela como un
sensor clave de la citotoxicidad específica de células tumorales
observada en los tratamientos con el complejo [pIC]^{PEI},
al haber demostrado tener capacidad para activar tanto la autofagia
como los programas apoptóticos dependientes de NOXA.
Todo esto tiene como resultado que los
activadores de MDA-5, incluido el complejo
[pIC]^{PEI}, suministrados de forma adecuada para favorecer
su llegada al citosol y el desencadenamiento de la vía autofágica,
parecen ser útiles para el tratamiento del melanoma, un tipo de
cáncer para el cual, como se ha comentado previamente, apenas hay
tratamientos. La destrucción de las células de melanoma así
desencadenada no parece afectar a las células sanas. Debido al
mecanismo de activación, independiente de IFN y del estatus de p53,
el efecto anticancerígeno debería observarse igualmente en
individuos inmunocomprometidos.
Así, MDA-5 se presenta como una
diana terapéutica adecuada para la búsqueda de agentes para el
tratamiento del melanoma entre los activadores de dicha proteína,
pues dichos activadores son útiles para desencadenar la
autodestrucción de células tumorales mediante una activación
coordinada de lisosomas intrínsecos y proteasas apoptóticas, lo cual
supone una nueva estrategia para superar la quimiorresistencia y la
inmunorresistencia del melanoma. Esta estrategia presenta ventajas
sobre los agentes terapéuticos estándar porque activa tanto la
autofagia como la apoptosis en células tumorales, de manera autónoma
y selectiva.
Dada la similitud estructura de
MDA-5 con las otras helicasas de su misma familia y
teniendo en cuenta el hecho de que los receptores de esa familia
comparten cascadas de señalización similares entre ellos, es de
esperar que otros miembros de la misma familia, tales como
RIG-I y LGP2, presenten un comportamiento similar y
puedan ser utilizados también como dianas terapéuticas.
Igualmente, la combinación que ha posibilitado
el descubrimiento de esta vía por ser capaz de activarla, el
complejo [pIC]^{PEI}, o cualquier otra combinación de un
análogo de dsRNA y un portador catiónico, se presenta como un buen
candidato para ser utilizado para la fabricación de medicamentos
para el tratamiento del melanoma.
Por todo ello, un aspecto de la invención se
refiere a un procedimiento para la identificación de compuestos
candidatos a ser utilizados como agentes terapéuticos para el
tratamiento del melanoma que comprende las etapas de:
- a)
- poner en contacto el compuesto candidato con un cultivo de células de melanoma o de una línea celular derivada de células de melanoma;
- b)
- determinar al menos uno de los siguientes parámetros:
- a.
- el nivel de activación de MDA-5;
- b.
- el nivel de expresión de NOXA;
- \quad
- o combinaciones de los anteriores;
- c)
- comparar los datos obtenidos con los observados en un control de las mismas células tratadas de igual manera, aunque en ausencia del compuesto candidato;
- d)
- considerar compuestos candidatos a ser utilizados como agentes terapéuticos para el tratamiento del melanoma aquellos que hayan dado lugar a un aumento significativo respecto al control en el parámetro o parámetros determinados en la etapa b).
La diferencia entre los datos obtenidos del
cultivo celular tratado con el compuesto candidato y el cultivo
control sin tratamiento se considerará significativa cuando el
análisis estadístico dé como resultado valores de p<0,05.
En una posible realización del procedimiento de
la invención, el parámetro cuya modificación se determina es el
nivel de activación de MDA-5. Este parámetro puede
determinarse comprobando la existencia de la ruptura proteolítica de
dicha proteína que da lugar a la separación de los dominios helicasa
y caspasa: el compuesto candidato a agente terapéutico para el
tratamiento del melanoma, como se ha comentado previamente, debería
dar lugar a dicha ruptura proteolítica, lo cual es una indicación de
que es capaz de dar lugar a la activación de los mecanismos de
autofagia y apoptosis previamente mencionados que darían lugar a la
muerte de las células de melanoma. Una posible metodología para
realizar esta comprobación son las transferencias tipo Western de
extractos proteicos de los cultivos celulares y la comprobación de
la señal de las bandas correspondientes a la proteína completa y a
los fragmentos correspondientes a los dominios helicasa y caspasa.
Concretamente, como se muestra en el Ejemplo 3, la aparición de una
banda de 30 kD es indicativo de la existencia de ruptura
proteolítica.
Alternativamente, podría determinarse también la
activación de otras helicasas de la familia de
MDA-5, tales como RIG-I o LGP2.
Otra posible realización del procedimiento de la
invención es la determinación del nivel de expresión de NOXA, pues,
como se ha comprobado previamente, se observa un aumento de los
niveles de expresión de los genes correspondientes cuando se
produce la activación de los mecanismos de autofagia y apoptosis que
se desea que desencadene el compuesto candidato a agente
terapéutico. La determinación de los niveles de expresión de
cualquiera de estas proteínas puede realizarse, por ejemplo,
determinando la concentración del RNA mensajero correspondiente (lo
cual puede llevarse a cabo, por ejemplo, por transferencia tipo
Northern o por RT-PCR) o la concentración de la
propia proteína en un extracto proteico del correspondiente cultivo
celular (por ejemplo, mediante una transferencia tipo Western). Se
prefiere particularmente que, si se determina el nivel de expresión
de NOXA, se determine también la existencia de activación de
MDA-5, como corroboración de que se están activando
los mecanismos de autofagia y apoptosis deseados, por considerarse
MDA-5 un punto de enlace entre ambos.
Se prefiere particularmente que el procedimiento
de la invención incluya adicionalmente una etapa de determinación de
la inducción de autofagia por parte del compuesto candidato a agente
terapéutico contra el melanoma. La inducción de la autofagia puede
comprobarse por distintas técnicas, entre las que destaca la
determinación del nivel de expresión y la localización intracelular
de proteínas de autofagia (tales como la que se utiliza en los
Ejemplos de la presente memoria, LC3) o la determinación por
microscopía de la presencia de estructuras características del
proceso de autofagia. Entre estas técnicas, son casos
específicos:
- El seguimiento de las modificaciones
postraduccionales de la proteína expresada por el gen de autofagia 8
(al que se alude de forma abreviada como ATG8 o, LC3) la proteína
LC3: LC3 se procesa y lipida cuando se inserta en autofagosomas, las
estructuras membranosas en las que se secuestran componentes
celulares durante la autofagia. La lipidación cambia la conformación
y la movilidad electroforética de esta proteína, por lo que una de
las posibles técnicas de comprobar la inducción de autofagia es
recurrir a técnicas de immunoblot con anticuerpos dirigidos contra
esta proteína, lo que permite comprobar bien que la localización de
la banda correspondiente a la proteína tras someterla a
electroforesis es diferente en las muestras control con respecto a
las muestras en las que se supone que el compuesto candidato ha
inducido autofagia o bien, si el anticuerpo reconoce específicamente
la forma propia de los autofagosomas, la unión del anticuerpo
\hbox{confirmaría la inducción de autofagia en la muestra
tratada con el compuesto candidato.}
- El seguimiento de los cambios en la
distribución intracelular de la proteína LC3, pues otro rasgo
distintivo de la autofagia es la relocalización de LC3, desde el
citosol a autofagosomas de reciente formación (Xie and Klionsky,
2007). Así, pues la formación de focos de concentración de dicha
proteína puede considerarse un indicativo de la formación de
autofagosomas, especialmente en fases tempranas, por lo que la
determinación de la localización celular de una proteína de fusión
de LC3 con, por ejemplo una proteína fluorescente, son ampliamente
utilizados como una indicación de estadios tempranos de autofagia.
Es habitual el uso como proteína fluorescente de GFP (green
fluorescent protein: proteína verde fluorescente) o RFP (red
fluorescent protein: proteína roja fluorescente), que permiten
realizar el seguimiento de la autofagia mediante microscopía de
fluorescencia: los cambios en la distribución celular de la
fluorescencia, de un patrón difuso a una tinción focal son
indicativos de la inducción de autofagia. En el caso del
procedimiento de la presente invención, la utilización de esta
metodología implicaría el uso de células que o bien hubieran sido
transfectadas con un vector que permitiera la expresión transitoria
de la proteína de fusión, tal como un plásmido o un virus
recombinante no integrativo, o con células que en las que el
fragmento de DNA capaz de expresión la proteína de fusión formada
por la proteína de fusión y LC3 estuviera integrado en el genoma y
en las que la expresión de la proteína de fusión pudiera producirse
de forma estable. Un ejemplo de tal estrategia se muestra en el
Ejemplo 1 de la presente memoria, donde las células fueron
transfectadas previamente con un retrovirus recombinante que dio
lugar a la inserción en el genoma celular del fragmento de DNA que
contenía las partes codificantes de las proteínas GFP y LC3 unidas
de tal manera que dieran lugar a una proteína de fusión, llevándose
a cabo posteriormente los ensayos de cambios en la distribución
intracelular de la fluorescencia con las células transfectadas de
forma estable.
- Utilización de microscopía electrónica de
transmisión para detectar los autofagosomas ya formados en fases más
avanzadas del posible proceso de autofagia, como pueden ser
transcurridas 5 horas desde la adición del compuesto a ensayar. La
acumulación de estructuras densas frente a los electrones, unidas a
la membrana, se considerará un rasgo indicativo de formación de
autofagosomas. El transcurso del proceso de autofagia puede
confirmarse en fases más tardías del proceso (por ejemplo, a las 24
ó 30 horas del tratamiento con el compuesto a ensayar), momento en
el cual la microscopía electrónica debería
\hbox{mostrar la
formación de grandes vacuolas fagocíticas, indicativas de colapso
celular.}
Como se ha comentado, el reclutamiento de
endosomas es unos de los eventos tempranos del proceso citotóxico en
el que se basa la presente invención. Por ello, otra alternativa
para complementar el procedimiento de la invención es la detección
de la distribución citoplasmática de proteínas de la familia Rab.
Concretamente, se prefiere detectar la presencia de endosomas de
Rab5 o, más preferiblemente, Rab7.
En cuanto a las líneas celulares válidas, puede
utilizarse cualquier línea celular procedente de melanoma,
preferiblemente procedente de un ser humano. Ejemplos de líneas
celulares válidas, que se utilizan en los ejemplos de la invención,
son las líneas de células humanas
SK-Mel-19,
SK-Mel-28,
SK-Mel-103 y
SK-Mel-147, así como las células de
ratón B16.
Los ensayos que se describen más adelante en los
ejemplos de la presente memoria son muestra de una realización del
procedimiento de la invención en la que se llevó a cabo una
combinación de determinación de la activación de
MDA-5, análisis de expresión de genes (observándose
incremento en la expresión de NOXA) y confirmación de la activación
de la autofagia por las tres posibles metodologías mencionadas
(seguimiento de las modificaciones postraduccionales de la proteína
LC3 mediante immunoblot,; seguimiento de los cambios en la
distribución celular de LC3 mediante la detección de la
fluorescencia debida a la proteína fluorescente GFP, con la que LC3
formaba una proteína de fusión GFP-LC3 que se
expresaba en células previamente transfectadas con un retrovirus
recombinante que contenía una construcción capaz de expresar dicha
proteína de fusión; confirmación de la formación de autofagosomas
por microscopía electrónica de transmisión a las 5 horas del
tratamiento con el compuesto candidato y confirmación de formación
de vacuolas fagocíticas a las 30 horas del tratamiento).
La aplicación de dicha realización del
procedimiento de la invención permitió observar que,
inesperadamente, uno de los compuestos que dio lugar a resultados
positivos fue un compuesto hasta ahora considerado como un pobre
agente terapéutico para el tratamiento del melanoma, el análogo del
dsRNA viral abreviado como pIC (ácido
poliinosin-policitidílico). A diferencia de los
ensayos previos, en este caso el pIC se puso en contacto con las
células formando un complejo con un portador catiónico polimérico,
la polietilenimina (PEI); de esta manera, el complejo
[pIC]^{PEI}, como se ha comentado previamente, es capaz de
activar, en las células de melanoma, tanto la vía autofágica como la
vía apoptótica, provocando la muerte de las células de melanoma de
forma selectiva, sin afectar a los melanocitos normales presentes en
el mismo cultivo, sin requerir que las células expresen p53 ni que
se activen en las células de melanoma vías relacionadas con la
inmunidad controlada por IFN, que eran las vías que tradicionalmente
se habían considerado activadas por el dsRNA viral y sus análogos.
Consecuentemente con esta observación, la activación de la vía
autofágica hallada se produce incluso en animales
inmunocomprometidos. Así, los resultados obtenidos indican que la
inhibición del crecimiento del melanoma por [pIC]^{PEI} se
puede favorecer no sólo en presencia de un sistema inmune activo,
sino que también es altamente eficaz en animales sin linfocitos T, B
o "asesinas naturales" (NK: "natural killers").
Estos resultados, los primeros en informar de la muerte de células
cancerosas provocada por autofagia desencadenada por análogos de
dsRNA viral, proporcionan la prueba del principio de un nuevo
tratamiento que explota programa innatos acoplados al dsRNA, pero
sin una dependencia estricta de efectores inmunes de la destrucción
de células tumorales.
Por todo ello, un segundo aspecto de la presente
invención lo constituye el uso de un fragmento de RNA de doble
cadena (dsRNA) o un análogo del mismo, en combinación con un
portador policatiónico, para la fabricación de un medicamento para
el tratamiento del melanoma.
En una realización particularmente preferida del
uso de la invención, el medicamento va destinado al tratamiento de
un paciente inmunocomprometido.
En una realización de la invención, el fragmento
de RNA de doble cadena o análogo del mismo es un fragmento largo. En
una realización preferida de la invención, el análogo de RNA largo
de doble cadena es el ácido
poliinosin-policitidílico (pIC). En otra realización
preferida, el portador policatiónico es la polietilenimina (PEI). En
una realización particularmente preferida de la invención, el
análogo de RNA largo de doble cadena es el ácido
poliinosin-policitílico y el portador policatiónico
es la polietilenimina.
Tal como se utiliza en la invención, el término
"fragmento largo de RNA de doble cadena" se utiliza como
contraposición a los fragmentos de RNA conocidos como RNAs cortos.
Por tanto, se considerará que un RNA de doble cadena (bicatenario)
es "largo" si el fragmento de RNA bicatenario comprende al
menos 25 nucleótidos por cadena. Se prefiere que el fragmento
utilizado sea análogo en longitud a los RNAs intermediarios de doble
cadena que aparecen en las células durante el ciclo celular de las
mayor parte de los virus RNA y que parecen ser el sustrato natural
de las helicasas de la familia de MDA-5, por lo que
el RNA de doble cadena de la invención se considerará "largo"
especialmente si comprende al menos 100 nucleótidos por cadena y,
más especialmente, si comprende al menos 1000 nucleótidos por
cadena.
Fragmentos de RNA de doble cadena que se
presentan en la naturaleza y que podrían ser útiles para el uso de
la invención podrían ser los RNA intermediarios de doble cadena que
aparecen durante el ciclo celular de Paramyxovirus (tales como el
virus de la enfermedad de Newcastle, NDV; el virus Sendai (SDV)),
Rhabdovirus (virus de la estomatitis vesicular (VSV)); flavovirus
(virus de la hepatitus C (HCV)), ortomyxovirus (virus Influenza) y
picornavirus (virus de la encéfalo-miocarditis
(EMCV)).
En cuanto a los análogos de RNA de doble cadena,
además del ácido poliinosin-policitidílico (pIC),
pueden ser útiles para el uso de la invención los RNAs cortos de
interferencia (siRNA) o los RNAs que tienen trifosfatos libres en 5'
(en contraposición al RNA que se encuentra normalmente en los
mamíferos, que tiene cubierto el extremo 5' o tiene modificaciones
en la base correspondiente para poder discriminar entre el RNA
propio y el ajeno). Entre los análogos no presentes en la naturaleza
pueden citarse también: a) aquellos cuyo esqueleto está formado por
un compuesto análogo a la ribosa, tales como los basados en LNA
(locked nucleic acid: ácido nucleico "bloqueado", por su
resistencia a la hidrólisis), morfolino y PNA (peptide nucleic
acid: ácido nucleico peptídico); b) aquéllos en los que al menos
una de las bases nitrogenadas típicas de los nucleótidos del RNA han
sido sustituidas por análogos, que pueden dar lugar incluso a
apareamientos distintos de los naturales, tales como diaminopurina
(que se aparea con el uracilo mediante tres puentes de hidrógeno),
el par xantina/diaminopirimidina (donde la forma ceto/ceto de la
purina, la xantina, forma tres puentes de hidrógeno con la
amina/amina pirimidina), o el par isoguanina/isocitosina (donde al
forma amina/ceto de la purina, la isoguanina, forma tres puentes de
hidrógeno con la
pirimidin-ceto-amina, la
isocitosina).
En cuanto al portador policatiónico, son
adecuados para los propósitos del uso de la invención todos aquéllos
capaces de alterar la permeabilidad de la membrana plasmática y/o
inducir endocitosis, favoreciendo la entrada en la célula del RNA de
doble cadena o de su análogo y, con ello, favoreciendo la activación
de los sensores citosólicos de RNA de dobles cadena, tales como la
helicasa MDA-5. Además de la polietilenimina (PEI) y
lipofectamina, quedan englobados dentro de esta definición
poli-L-lisina, polisilazano,
polidihidroimidazolenium, polialilaminem y polietilenimina etoxilada
(ePEI).
La invención se ilustra ahora con más detalle
mediante los Ejemplos y Figuras que aparecen a continuación.
Fig. 1. La inducción de macroautofagia
mediante [pIC]^{PEI} da como resultado la muerte celular
del melanoma.
- El panel A muestra imágenes de
epifluorescencia de la tinción de focos de eGFP-LC3
similares a los autofagosomas en células de melanoma
SK-Mel-103 tratadas durante 12 h con
1 mg/ml de PEI-acomplejado con pIC
([pIC]^{PEI}) (fotografía derecha) o de células tratadas
con PEI como agente único (fotografía izquierda, marcada como
"Control").
- El panel B muestra un gráfico en el que se
representa la acumulación, en función del tiempo, de células
SK-Mel-103 que muestran emisión de
fluorescencia punteada de eGFP-LC3, en tres
condiciones, según se indica sobre la curva correspondiente: tras el
tratamiento con [pIC]^{PEI}, con el placebo (control), o
con rapamicina (ésta última se utilizó como inductor clásico de
autofagia).
- El panel C muestra fotografías tomadas de
inmunotransferencias de extractos celulares totales aislados de
células SK-Mel-103, obtenidas
recogiendo las células en los tiempos postratamiento indicados, en
horas, sobre cada grupo de tratamientos. Los tratamientos se indican
sobre cada carril: control (ningún tratamiento: poblaciones de
células control incubadas sólo en presencia del tampón disolvente),
pIC o complejo [pIC]^{PEI}. A la izquierda de las
fotografías se indican las proteínas analizadas: ATG5 sin modificar
(LC3 I), ATG5 tras lipidación (LC3 II) o el control de carga
(\beta-actina); a la derecha se indica el peso
molecular, en kDa, de las proteínas teñidas según la altura de
aparición de las bandas.
- El panel D muestra microfotografías de
microscopía electrónica de células
SK-Mel-103 tratadas con
[pIC]^{PEI} (columna derecha) o control con PEI (columna
izquierda). Las flechas apuntan a los autofagosomas y autolisosomas
unidos a la membrana.
- El panel E muestra microfotografías a bajo
(fotografías superiores) y bajo (fotografías inferiores) número de
aumentos de células SK-Mel-103 5
horas después de la incubación con tampón control (columna izquierda
de fotografías) o [pIC]^{PEI} (columna derecha).
- El panel F muestra microfotografías
representativas de microscopía de campo claro (paneles izquierdo e
intermedio) y de microscopía electrónica (panel derecho) de las
poblaciones celulares tratadas según se indica sobre las
fotografías, 30 horas después del tratamiento.
Fig. 2: Microscopía en intervalos de tiempo
de la inducción de la autofagia en células de melanoma mediante
[pIC]^{PEI}.
Se muestran microfotografías de fluorescencia
tomada a los tiempos indicados después del tratamiento con PEI
(control) o [pIC]^{PEI} de células
SK-Mel-103 que expresaban
eGFP-LC3. Los agregados focales son indicativos de
la formación de autofagosomas. Las flechas apuntan a las células que
colapsan y se sueltan (mueren) durante el tratamiento.
Fig. 3: La llegada al citosol de pIC gracias
a la presencia de PEI desencadena de forma selectiva la muerte de
las células de melanoma.
- El panel A muestra gráficos que representan el
porcentaje de muerte celular, estimada mediante exclusión de azul de
tripano 24 y 48 h después de los tratamientos indicados en las
leyendas (NT (barras sin relleno): ningún tratamiento; PEI (barras
con relleno gris oscuro, 100 ): polietilenimina; pIC
(barras con relleno gris claro, 101 ): ácido
poliinosin-policitidílico; [pIC]^{PEI}
(barras con relleno negro, 100 ): ácido
poliinosin-policitidílico acomplejado con
polietilenimina), representado como media \pm SEM de tres
experimentos independientes realizados con células del tipo que se
indica sobre los gráficos. Se observa que sólo las poblaciones de
células de melanoma tratadas con [pIC]^{PEI} mueren
eficientemente.
- El panel B muestra imágenes de microscopía
electrónica de células de melanoma
SK-Mel-28 y
SK-Mel-103 tratadas con el tampón
control (Ctr), PEI, pIC o [pIC]^{PEI}, visualizadas 12 h
después del tratamiento. Para cada una de las líneas celulares se
muestran fotografías tomadas a dos aumentos. Las flechas apuntan a
los autolisosomas, que se observan sólo en las células tratadas con
[pIC]^{PEI}.
Fig. 4: Selectividad por las células
tumorales de la actividad citotóxica de
[pIC]^{PEI}.
- El panel A muestra imágenes representativas de
campo claro de melanocitos de prepucio humano (fila superior),
células de melanoma humano
SK-Mel-103 (fila intermedia) y
melanoma murino B16 (fila inferior) después del tratamiento con el
tampón control, PEI, pIC o [pIC]^{PEI}, según se indica
sobre cada columna de imágenes.
- El panel B muestran las curvas de
dosis-respuesta de PEI y pIC, como agentes
individuales o en combinación (grupo de barras situado más a la
derecha en cada gráfico) observado en células FM (foreskin
melanocytes: melanocitos de prepucio humano) y
SK-Mel-103. La respuesta se expresa
como el porcentaje de células muertas medido 24 horas después del
tratamiento.
- El panel C muestra un gráfico que representan
el porcentaje de muerte celular, estimada mediante exclusión de azul
de tripano 24 h después de los tratamientos indicados en las
leyendas (Ctrl: ningún tratamiento; PEI: polietilenimina; pIC: ácido
poliinosin-policitidílico; [pIC]^{PEI}:
ácido poliinosin-policitidílico acomplejado con
polietilenimina, representado como media \pm SEM de tres
experimentos independientes realizados con células del tipo que se
indica sobre los gráficos
(SK-Mel-103 o fibroblastos de
prepucio). Como en el panel A, se observa que sólo las poblaciones
de células de melanoma tratadas con [pIC]^{PEI} mueren
eficientemente.
Fig. 5. MDA-5 es un sensor y
un controlador de la citotoxicidad de [pIC]^{PEI} en
células de melanoma.
- El panel A muestra los resultados de la
inmunotransferencia de extractos de células
SK-Mel-28 (foto superior) y
SK-Mel-147 (foto inferior del panel)
no tratadas (NT) o tratadas con PEI, pIC, [pIC]^{PEI} o
bortezomib (Bor) según se indica sobre los carriles. Los asteriscos
corresponden a una banda de fondo. Las flechas indican la posición
donde debería observarse la banda de 30 kD indicativa de la escisión
de MDA-5.
- El panel B muestra inmunotransferencias donde
se muestra el procesamiento de MDA-5 en células
SK-Mel-147 sin infectar o infectadas
con lentivirus que codifican el shRNA control (carriles encabezados
por "sh Control") o el shRNA dirigido contra
MDA-5 (carriles encabezados por "sh
MDA-5"), visualizado mediante inmunotinción
después del tratamiento de las células con pIC, [pIC]^{PEI}
o con el tampón control (carriles "NT": no tratadas), según se
indica sobre los carriles. Como en el panel A, los asteriscos
corresponden a una banda de fondo y las flechas indican la posición
donde debería observarse la banda de 30 kD indicativa de la escisión
de MDA-5.
- El panel C corresponde al efecto inhibitorio
del shRNA dirigido contra MDA-5 sobre la toxicidad
dirigida por [pIC]^{PEI} evaluado mediante el porcentaje de
muerte celular, determinado mediante exclusión de azul de tripano,
observado 24 horas después del tratamiento con pIC desnudo (barras
con relleno gris, 102 ), con el complejo
[pIC]^{PEI} (barras con relleno negro,
100 ) o en células no tratadas (barras sin relleno).
Se muestran también los resultados obtenidos en células tratadas con
el shRNA control ("sh Control"). Los datos se muestran como
medias \pm SEM de tres experimentos independientes.
Fig. 6: Efecto de los inhibidores
farmacológicos de la autofagia sobre la actividad citotóxica de
[pIC]^{PEI}. Colocalizción de autofagosomas y lisosomas
después del tratamiento con [pIC]^{PEI}.
- El panel A muestra el efecto de
3-metiladenina (3-MA) y cloroquina
(Chlor) sobre la relocalización de eGFP-LC3 en los
autofagosomas, evaluado a partir del porcentaje de células
SK-Mel-103 que presentaban focos de
fluorescencia debida a GFP-LC3 12 h después del
tratamiento con [pIC]^{PEI} (barras con relleno negro) o
con el tampón control (barras sin relleno).
- El panel B muestra el efecto inhibitorio de
Cloroquina (Chlor), pepstatina A (PEP) o E64d sobre la muerte
celular estimada mediante exclusión de azul de tripano 20 horas
después del tratamiento con vehículo (barras blancas) o
[pIC]^{PEI} (barras negras) Los datos se muestran como
medias \pm SEM de tres experimentos independientes.
- El panel C muestra imágenes de fluorescencia
de células SK-Mel-103 transducidas
con Cherry-GFP-LC3, para detectar la
formación de autofagosomas (focos rojos y verdes) y autolisosomas
(focos únicamente rojos), tras el tratamiento con
[pIC]^{PEI}, rapamicina 25 nM o el disolvente control
(Control), según se indica sobre cada columna de fotografías.
- El panel D muestra el efecto inhibitorio de
bafilomicina 100 \muM (Bafil), Cloroquina 20 \muM (Chlor) o
pepstatina A 10 \mug/ml (PEP) sobre la muerte celular estimada
mediante exclusión de azul de tripano 20 horas después del
tratamiento con vehículo (barras blancas) o [pIC]PEI (barras
negras) Los datos se muestran como medias \pm SEM de tres
experimentos independientes.
- El panel E muestra imágenes de fluorescencia
confocal de células SK-Mel-103
tratadas con [pIC]PEI (fila superior de fotografías) o con
[pIC]PEI en presencia de cloroquina (fila inferior de
fotografías) y transfectadas de forma estable con
eGFP-Rab5 de tipo salvaje (Rab5 wt (wild type) en la
figura, columna de fotografías de la izquierda) o bien incubadas
con [pIC]PEI marcado con Fluor Red (FluoR en la figura,
columna de fotografías intermedia). Puede observarse la
internalización de [pIC]PEI por las células de melanoma en
ausencia o en presencia de cloroquina.
- El panel F muestra imágenes de fluorescencia
confocal que permiten visualizar la proteolisis dependiente de
lisosomas por la existencia de escisión y liberación del resto
fluorescente de la DQ-BSA (que da lugar a
fluorescencia verde, tanto en las células
SK-Mel-103 tratadas con el vehículo
(Control) como en las tratadas con [pIC]PEI. En presencia de
cloroquina (Chlor: fila intermedia de fotografías), no se observa
señal de fluorescencia en la columna de DQ-BSA
(columna intermedia). Se obtuvieron también imágenes simultáneas de
las células en presencia de Lysotracker-Red
(LTR-Red: columna izquierda de fotografías) para
visualizar el comapartimento lisosomal, que dio origen a señal en
las tres filas de fotografías.
- El panel G muestra un gráfico de barras en el
que se representa la colocalización de las señales correspondientes
a DQ-BSA y Lysotracker-Red en las
células del ensayo del panel F (Ctrl.: control, barras con relleno
negro, 100 ; Chl: cloroquina, barras sin relleno;
[pIC]^{PEI}, barras con relleno gris, 102 ).
La colocalización se estimó en un mínimo de 150 células en dos
experimentos independientes, y se expresó con respecto al valor
obtenido en las células control (u.a.: unidades arbitrarias de
fluorescencia).
- El panel H muestra imágenes de
inmunofluorescencia confocal de focos de fluorescencia debida a
GFP-LC3 (señal verde en el original, indicativa de
localización de autofagosomas), y Lysotracker (señal roja en el
original, indicativa de la presencia lisosomas) en
SK-mel-103 después del tratamiento
con [pIC]PEI o tampón control, según se indica junto a las
imágenes. Los núcleos se contratiñeron con Hoescht (fotografías
superiores, con señal azul en el original). En la fila inferior se
muestra la superposición de las tres imágenes anteriores, en las que
se aprecia una señal de color amarillento o anaranjado en las zonas
que presentaban señal verde y roja en las imágenes correspondiente a
GFP-LC3 y Lysotracker respectivamente, lo que indica
que las señales correspondiente a GFP-LC3 y a
Lysotracker se localizan en las mismas zonas.
- El panel I muestra imágenes de microscopía
confocal en tiempo real tomadas en células
SK-Mel-103 que expresaban
eGFP-LC3 (señal verde en el original) tratadas o
bien con el tampón control con pIC ("Control") o bien con
[pIC]^{PEI} e incubadas en presencia de Lysotracker (señal
roja en el original) o Hoescht (señal azul en el original) según se
indica sobre las imágenes. La superposición de las tres imágenes
tomadas (fotografía inferior derecha de cada tratamiento, Control o
[pIC]^{PEI}], reveló una fuerte colocalización (señal
amarilla) entre GFP-LC3 y lisosomas (tal como era de
esperar por la formación de autolisosomas) tras el tratamiento con
[pIC]^{PEI} pero no tras el tratamiento con el pIC desnudo
de control. En la tercera fila del panel, bajo las imágenes
resultado de la superposición, se muestran las gráficas obtenidas al
cuantificar en un plano dado de células la intensidad total de
fluorescencia en los canales verde (gráfica marcada como "GFP",
correspondiente a eGFP-LC3) y rojo (gráfica marcada
como "Lyso", correspondiente al Lysotracker). En el caso de las
gráficas obtenidas de las células tratadas con [pIC]^{PEI},
la distribución similar tanto de las señales de
eGFP-LC3 como de Lysotracker es indicativa de
colocalización y, por tanto, de la fusión de autofagosomas y
lisosomas.
- El panel J muestra una representación del
análisis basado en la población de células
SK-Mel-103 tratadas con pIC
(Control) o con [pIC], donde se representa la intensidad de la señal
de eGFP-LC3 (fluorescencia verde, eje X) y
Lysotracker (señal roja, eje Y). Los cuadrados incluyen células con
alta tinción dual para ambos marcadores.
Fig. 7: Tráfico de endosomas y generación y
resolución de anfísomas por el tratamiento con
[pIC]^{PEI}.
- El panel A muestra imágenes secuenciales de
células de melanoma SK-Mel-103 que
expresaban eGFP-Rab7, capturadas por microscopía de
fluorescencia en tiempo real, en los tiempos indicados tras el
tratamiento con [pIC]^{PEI} o el vehículo control. Se
observa que [pIC]PEI dio lugar a la generación de un gran
número de vesículas. Los asteriscos marcan las fusiones
endosoma-endosoma (a efectos de claridad, se indican
sólo algunos ejemplos).
- El panel B muestra fotografías de microscopía
confocal obtenidas de células
SK-Mel-103 transfectadas de forma
estable con retrovirus que daban lugar a fluorescencia verde por
expresión de la fusión eGFP-Rab7 wt (Rab7 tipo
salvaje) (primera y tercera columna de fotografías contando desde la
izquierda, en el segundo caso obtenida en presencia adicional de
Lysotracker-Red, según se indica sobre la columna) o
la fusión eGFP-Rab7 T22N incubada en presencia de
Lysotracker-Red (columna derecha de fotografías).
Las células se trataron adicionalmente con [pIC]^{PEI} 10
(fila inferior del panel) o con el vehículo control (fila superior
del panel). Las imágenes se capturaron 10 horas después del
tratamiento con [pIC]^{PEI} Las dos columnas de fotografías
situadas más a la derecha contienen valores superpuestos que
corresponden al área media contenida en vesículas decoradas con
Rab7.
- El panel C muestra una secuencia de
microfotografías confocales tomadas en los intervalos de tiempo
indicados (en segundos) sobre las fotografías, que ilustran la
fusión e incorporación de lisosomas a vesículas positivas para Rab7,
tras el tratamiento con [pIC]^{PEI}.
- El panel D muestra imágenes de microscopía de
fluorescencia obtenidas a tiempo real, de células
SK-Mel-103 tratadas con
[pIC]^{PEI} y transfectadas de forma estable con retrovirus
que daban lugar a fluorescencia verde o roja, según expresaran las
fusiones GFP-Rab7 wt (abreviado simplemente
GFP-Rab7 junto a la fila correspondiente de
fotografías), Cherry-LC3 (abreviado
Ch-LC3 junto a la fila de fotografías
correspondiente), o que daban lugar fluorescencia azul por haber
sido tratadas con Lysotracker-Blue
(LTR-Blue en la Figura). Las imágenes se tomaron en
los intervalos de tiempo indicados (en minutos) 1 hora después del
inicio del tratamiento. Las flechas marcan la primera secuencia en
la que se pudo visualizar cada uno de los marcadores indicados.
- El panel E muestra la incorporación de LC3 en
la superficie de las vesículas endosómicas con Rab7 previamente a su
internalización y posterior degradación. Estas estructuras híbridas
endosoma/LC3 (anfisomas) se visualizaron mediante microscopía de
fluorescencia en tiempo real de células
SK-Mel-103 que expresaban
eGFP-Rab7 o Cherry-LC3 (abreviado
Ch-LC3 junto a la fila de fotografías
correspondiente).
Fig. 8: La citotoxicidad de
[pIC]^{PEI} es dependiente de la activación de caspasas
efectoras y reguladoras.
- El panel A muestra el porcentaje de muerte
celular provocado por el tratamiento de células
SK-Mel-147 con tampón control con
PEI (Ctr, representado por barras sin relleno), pIC (barras con
relleno gris) o el complejo [pIC]^{PEI} (barras con relleno
negro), en presencia de los compuestos indicados bajo cada uno de
los gráficos: el vehículo (tampón control sin PEI) (gráfico
izquierdo), la vitamina E (+VitE, gráfico intermedio) o el inhibidor
de caspasas ZVAD-fmk (+ZVAD, gráfico derecho),
porcentaje que se cuantificó en todos los casos a partir de la
exclusión de azul de tripano.
- El panel B muestra los resultados de las
inmunotransferencias de extractos de las líneas celulares de
melanoma metastásico indicadas en el lado izquierdo, obtenidas
recogiendo las células en los tiempos postratamiento indicados, en
horas, sobre cada carril. Los tratamientos se indican sobre los
tiempos: NT (ningún tratamiento: poblaciones de células control
incubadas sólo en presencia del tampón disolvente), PEI, pIC,
complejo [pIC]^{PEI} o Bor (bortezomib 25 mM). Junto a cada
fotografía se indica la proteína analizada: casp-9
(caspasa 9), casp-8 (caspasa 8) o tubulina (control
de carga). Los números situados en el lado derecho indican la masa
relativa, en kDa, correspondiente a las proteínas que presentan
bandas a esa altura.
- El panel C muestra los resultados de las
inmunotransferencias de extractos de la línea celular
SK-Mel-103, obtenidas recogiendo las
células en los tiempos postratamiento indicados, en horas, sobre
cada grupo de carriles (24 y 48 horas). Los tratamientos se indican
sobre los carriles, bajo los tiempos: NT (ningún tratamiento:
poblaciones de células control incubadas sólo en presencia del
tampón disolvente), PEI, pIC y complejo [pIC]^{PEI}. Junto
a cada fotografía se indica la proteína analizada:
casp-9 (caspasa 9), casp-8 (caspasa
8), casp-7 (caspasa 7), casp-3
(caspasa 3) o tubulina (control de carga).
Fig. 9: [pIC]^{PEI} desencadena la
apoptosis vía NOXA independientemente del status de p53 y sin
inducir la activación compensatoria de
MCL-1.
- El panel A muestra fotografías de las
inmunotransferencias obtenidas de células
SK-Mel-28 (grupo superior de
fotografías) o SK-Mel-147 (grupo
inferior de fotografías del panel) obtenidas recogiendo las células
en los tiempos postratamiento indicados, en horas, sobre cada
carril. Los tratamientos se indican sobre los tiempos: NT (ningún
tratamiento: poblaciones de células control incubadas sólo en
presencia del tampón disolvente), PEI, pIC, complejo
[pIC]^{PEI} o Bor (bortezomib 25 mM). Junto a cada
fotografía se indica la proteína cuyo nivel se analizó: NOXA,
Mcl-1 o tubulina (control de carga).
- El panel B muestra sendos gráficos donde se
representan los niveles relativos de Mcl-1 (gráfico
superior) y NOXA (gráfico inferior) calculados por densitometría a
partir de las inmunotransferencias obtenidas de células
SK-Mel-28 en función del tiempo
transcurrido desde el tratamiento que se indica en abscisas,
representados como el porcentaje referido al valor correspondiente
obtenido en las células control sin tratar. Junto a cada curva se
indica el tratamiento al que corresponde.
- El panel C muestra fotografías tomadas de
inmunotransferencias de extractos celulares totales aislados de
células SK-Mel-103, obtenidas
recogiendo las células en los tiempos postratamiento indicados, en
horas, sobre cada grupo de tratamientos. Los tratamientos se indican
sobre cada carril: NT (ningún tratamiento: poblaciones de células
control incubadas sólo en presencia del tampón disolvente), PEI,
pIC, complejo [pIC]^{PEI} o Bor (bortezomib 25 mM). Junto a
cada fotografía se indica la proteína cuyo nivel se analizó: NOXA,
Bcl-xL, Bcl-2 o tubulina (control de
carga). En la parte inferior del panel se indica, bajo cada carril,
el porcentaje de muerte celular observado según el tiempo
postratamiento y el tratamiento.
- El panel D muestra fotografías de
inmunotransferencias dirigidas a evaluar la expresión de la proteína
NOXA, obtenidas de células de melanoma
SK-Mel-103 tratadas durante 24 h con
pIC o [pIC]^{PEI} dos días después de la infección con un
vector lentiviral que expresaba
\hbox{un shRNA inactivo shRNA
(sh Ctrl) o un shRNA dirigido contra NOXA. }
- El panel E muestra un gráfico donde se
representan las tasas de muerte de células de melanoma
SK-Mel-103 (expresada como
porcentaje de células muertas), transducidas bien con un shRNA
control (barras con relleno gris claro, 101 ) o con
un shRNA dirigido contra NOXA (barras con relleno negro,
100 ) e incubadas con pIC o [pIC]^{PEI}
durante 24 h (NT: ningún tratamiento, células incubadas sólo con el
vehículo de administración).
- El panel F corresponde al efecto inhibitorio
de la regulación a la baja de MDA-5 sobre la
inducción de NOXA por [pIC]^{PEI}, representado por los
niveles de NOXA (expresados en unidades arbitrarias, u.a.)
determinados en células SK-Mel-103
transducidas con shRNAs control o un shRNA dirigido contra
MDA-5. Los niveles de NOXA se cuantifícaron por
densitometría de la correspondiente inmunotransferencia y se
representaron con respecto a los controles sin tratar (N Inf:
ninguna interferencia, niveles a los que les dio el valor 1 en el
caso del tratamiento con pIC desnudo y de 100 en el caso del
tratamiento con [pIC]^{PEI}).
Fig. 10: Actividad
anti-melanoma de [pIC]^{PEI} en ratones
immunocompetentes.
- El panel A se refiere a la generación de
xenoinjertos subcutáneos de células de melanoma B16 en ratones
singénicos C57BL/6. En la parte superior se esquematiza la
estrategia experimental, con los tiempos de tratamiento en los que
se produjeron las inyecciones peritumorales de 2 ng/kg de pIC
desnudo o acomplejado con PEI (grupo [pIC]^{PEI}), sólo PEI
o 100 \mul de glucosa al 5% (grupo NT: ningún tratamiento);
inmediatamente debajo se representa el crecimiento de tumores
observado en cada caso, expresado como el volumen de tumor, en
milímetros cúbicos, medido en los días indicados con un calibre.
- El panel B se refiere a la implantación
intravenosa de células de melanoma B16-eGFP en
ratones C57BL/6. En la parte superior del panel se esquematiza la
estrategia experimental, con los tiempos de tratamiento intravenoso
posterior a la implantación con 1 ng/kg de pIC o el complejo
[pIC]^{PEI}, PEI en glucosa al 5% o glucosa al 5% sin
ningún otro compuesto (grupo NT: ningún tratamiento), en los
momentos indicados. Inmediatamente debajo se muestran imágenes de
fluorescencia obtenidas de pulmones de pulmones de ratones sometidos
a cada uno de los tratamientos indicados.
- El panel C muestra un gráfico de barras en el
que se representa el número de metástasis de pulmón observado en
cada uno de los grupos de tratamiento del ensayo del panel B,
obtenido por recuento de metástasis externas, (P* <0,01
entre NT/PEI y [pIC]^{PEI}; n=5; ensayo generalizado
de Mann-Whitney).
Fig. 11: IFN-\alpha es
inducido por [pIC]^{PEI} pero no es suficiente para
provocar la muerte de las células de melanoma.
- El panel A muestra sendos gráficos en los que
se representan los niveles relativos de mRNA de
IFIT-1, estimados mediante PCR cuantitativa,
expresados con respecto al mRNA detectado en las células control sin
tratar (NT), determinados en células de melanoma B16 (gráfico
izquierdo) o macrófagos BMD (derivados de médula ósea) (gráfico de
la derecha), tras el tratamiento con pIC o [pIC]^{PEI}.
- El panel B corresponde a la tasa de muerte
celular observada al tratar células de melanoma
SK-Mel-103 con las concentraciones
indicadas en abscisas de IFN-\alpha humano
recombinante, determinada a las 24 horas del tratamiento. Como
controles, las células se trataron en paralelo con pIC desnudo y
[pIC]^{PEI} (pareja de barras situadas más a la derecha).
Nótese que los niveles elevados de IFN-\alpha no
son citotóxicos para las células de melanoma, y no pueden reproducir
la eficacia de la mortalidad provocada por [pIC]^{PEI}.
- El panel C muestra los valores de los
logaritmos en base 2 de las relaciones de los genes inducidos por
IFN alterados por el tratamiento con pIC o [pIC]PEI estimados
con respecto a células control tratadas con PEI, en los tiempos
indicados.
Fig. 12: Inhibición de la diseminación de
metástasis mediante [pIC]^{PEI} en ratones
inmunocomprometidos.
- El panel A muestra fotografías tomadas bajo
luz visible (fila superior) o fluorescente (fila inferior) de
pulmones representativos de ratones Beige con SCID
(inmunodeficiencia combinada severa) inoculados i.v. con células de
melanoma B16, y. tratados con PEI, pIC o [pIC]^{PEI} según
se indica sobre las fotografías. Las imágenes se capturaron 14 días
después de la inyección de células.
- El panel B muestra un gráfico de barras en el
que se representa el número medio de metástasis inducidas por B16
en cada uno de los grupos de ratones Beige con SCID del panel A
(P*<0,01 entre los grupos de tratamiento con PEI o pIC y
[pIC]^{PEI}; n=5; ensayo generalizado de
Mann-Whitney).
- El panel C corresponde al análisis histológico
de metástasis de pulmón desencadenadas por melanoma B16 en los
grupos de tratamiento de los paneles A y B. Se muestran tinciones
representativas con hematoxilina y eosina de muestras de pulmón
tomadas de ratones correspondientes a los tratamientos indicados
sobre las imágenes, que se visualizan a dos aumentos diferentes
(10x y 40x).
- El panel D muestra fotografías de muestras
representativas de pulmones de ratones Beige con SCID inoculados
i.v. con células de melanoma
SK-Mel-103 y tratados con PEI, pIC o
[pIC]^{PEI} según se indica sobre las fotografías. Las
imágenes se tomaron bajo luz fluorescente (fila superior) o con luz
visible tras tinción de la muestra con hematoxilina y eosina (H
& E) (fila inferior).
- El panel E muestra un gráfico de barras en el
que se representa el número medio de metástasis de pulmón inducidas
por las células SK-Mel-103
cuantificadas en cada uno de los grupos de ratones Beige con SCID
del panel D. (P*<0,01 entre los grupos de tratamiento con
PEI o pIC y [pIC]^{PEI}; n=5, ensayo generalizado de
Mann-
Whitney).
Whitney).
Fig. 13: Inhibición de la diseminación de
metástasis mediante [pIC]^{PEI} en ratones
Tyr::NRAS^{Q61K} x INK4a/ARF^{-/-}.
- El panel A muestra un gráfico de
Kaplan-Meier correspondiente a la supervivencia
libre de progresión de metástasis de ratones Tyr::Ras^{Q16K} x
INK4a/ARF^{-/-} tratados con DMBA para provocar lesiones
pigmentadas y tratados entonces con PEI en glucosa al 5% (Control:
Ctrl.), pIC o [pIC]^{PEI}].
- El panel B muestra gráficos de barras
acumulativas correspondientes al número medio de neoplasmas
melanocíticos cutáneos desarrollados por cada uno de los grupos de
ensayo del panel A. El recuento se realizó cada 5 días y los tumores
se agruparon por intervalos de tamaño según se indica sobre los
gráficos.
- El panel C presenta imágenes representativas
de secciones transversas (columna de la izquierda) o coronales
(columna de la derecha) obtenidas mediante PET/CT encaminada a
ensayar la actividad metabólica (incorporación de
^{18}F-FDG), de ejemplos representativos de
ratones tratados con PEI en glucosa al 5% (control), pIC desnudo o
[pIC]^{PEI}. Los tumores aparecen rodeados por líneas
blancas discontinuas. Los asteriscos indican la posición de los
corazones de los animales.
- El panel D muestra tinciones de hematoxilina -
eosina de muestras de lesiones melanocíticas extraídas de cada uno
de los grupos de tratamiento descritos en el panel A.
- El panel E muestra tinciones de hematoxilina -
eosina de muestras de tejido tomadas de piel, corazón, hígado o
pulmón (según se indica a la izquierda de las fotografías) de
ratones tratados con el vehículo glucosa al 5% (Control) o con
[pIC]^{PEI} que demuestran la ausencia de toxicidad
asociada al tratamiento con [pIC]^{PEI} en los
compartimentos de células normales.
Los ensayos que forman parte de los Ejemplos que
se describen a continuación se llevaron a cabo con los siguientes
materiales y técnicas experimentales:
Las líneas celulares de melanoma metastásico
humano SK-Mel-19,
SK-Mel-28,
SK-Mel-103 y
SK-Mel-147 y las células de ratón
B16 ya han sido descritas (Soengas et al. 2001). Estas
células se cultivaron en medio DMEM (medio de Eagle modificado por
Dulbecco) (Life Technologies, Rockville, MD, USA) suplementado por
suero bovino fetal al 10% (Nova-Tech Inc., Grand
Island, NY, USA).
Los melanocitos humanos, se aislaron de
prepucios de recién nacidos humanos tal como se ha descrito
(Fernández et al., 2005) y se mantuvieron en Medio 254
suplementado con factores de crecimiento de melanocitos
(HMG-1) que contenían 10 ng/ml de
12-miristato-13-acetato
de forbol (Cascade Biologics, Portland, OR, USA).
Los fibroblastos humanos se aislaron de
prepucios de recién nacidos humanos y se mantuvieron en medio DMEM
con suero bovino fetal al 10%.
El análogo sintético del dsRNA, pIC, se adquirió
a InvivoGen (San Diego, CA). Los reactivos jetPEI™,
jetPEI-Fluor™ y la formulación
invivo-jetPEI™ se adquirieron... a
Polyplus-transfection (Ikirch, Francia) Estos
últimos reactivos, que contienen un derivado lineal de la
polietilenimina, se utilizaron para acomplejar pIC en una relación
N/P (residuos de nitrógeno de JetPEI por fosfato de RNA) de 1 a 5
in vitro e in vivo, siguiendo las instrucciones del
fabricante.
A menos que se indique de otra manera, las
concentraciones de pIC utilizados en los cultivos de células fueron
de 1 \mug/ml, y de 1-2 ng/kg en ratones.
El bortezomib (Velcade, anteriormente
PS-341) se obtuvo de Millenium Pharmaceuticals Inc
(Cambridge, MA); la adriamicina (doxorrubicina) de Sigma Chemical
(St. Louis, MO), y el etopósido de Bristol-Myers
Squibb (Nueva York, NY). El antioxidante Tiron y la
Vit-E se adquirieron a Sigma (St. Louis, MO), y el
inhibidor general de caspasas ZVAD a R&D System (Minneapolis,
MN). La 3-metiladenina (3-MA) se
obtuvo de Sigma Chemical (St.Louis, MO). La cloroquina se obtuvo de
Sigma Chemical (St Louis, MO, USA).
Los ensayos de viabilidad celular en respuesta a
los tratamientos con fármacos se realizaron tras sembrar melanocitos
y células de melanoma al menos 12 horas antes del tratamiento con
fármacos. El porcentaje de muerte celular en los tiempos y
concentraciones de tratamiento indicados se estimó mediante ensayos
estándar de exclusión de azul de tripano tal como se ha descrito
previamente (Wolter et al., 2007; Fernández et al.,
2005).
Para determinar cambios a nivel de las
proteínas, se trataron 2x10^{6} células tal como se ha indicado y
se recogieron a diferentes tiempos tras el tratamiento. Los Usados
totales de células se sometieron a electroforesis en geles de
poliacrilamida con SDS al 10%, 12% o en gradientes del
4-15% en condiciones reductoras, y seguidamente se
transfirieron a membranas de Immobilon-P (Millipore,
Bedford, MA, USA). Las bandas de proteínas se detectaron mediante el
sistema ECL (GE Healthcare, Buckighamshire, UK).
Los anticuerpos primarios incluían:
casp-9 y casp-3 de Novus Biological
(Littleton, CO, USA); casp-8 (Ab-3)
de Oncogene Research Products (San Diego, CA, USA);
casp-7 de Cell Signaling Technology (Beverly, MA,
USA); casp-7 de Cell Signaling Technology (Beverly,
MA, USA); Bcl-xL de BD Transduction Laboratories
(Franklin Lakes, NJ, USA); Blc-2 de Dako Diagnostics
(Glostrup, Dinamarca); NOXA de Calbiochem (San Diego, CA, USA); LC3
de Cell Signaling (Danvers, MA, USA); p53 de Novocastra Laboratories
(Newcastle, UK); y \alpha-tubulina (clon
AC-74) de Sigma Chemical (St Louis, MO, USA). El
anticuerpo anti-MDA-5 se ha descrito
anteriormente (Barral et al., 2007; Kang et al.,
2004).
Los anticuerpos secundarios fueron anticuerpos
anti-ratón o anti-conejo de GE
Healthcare. Para cuantificar los cambios en los niveles de proteínas
inducidos mediante los diferentes tratamientos se utilizó Image J,
considerando los controles sin tratar como referencia para la
expresión basal.
El vector lentiviral con RNA utilizado para
regular NOXA a la baja se ha descrito previamente (Fernández et
al., 2005). El vector lentiviral pLKO-shRNA,
utilizado para regular a la baja MDA-5 (secuencia
diana, SEQ ID NO:l: CGCAAGGAGTTCCAACCATTT) se adquirieron a
OpenBiosystems (Huntsville, AL). También se diseñaron
oligonucleótidos mezclados para generar el shRNA control. Los virus
se generaron a partir de los vectores lentivirales mencionados en
células 293FT, tal como ha sido descrito, y se utilizaron en
condiciones que daban lugar a una eficacia de infección > 80%
(Denoyelle et al., 2006). La regulación a la baja de
MDA-5 se confirmó mediante inmunotransferencia y
RT-PCR (cebador directo SEQ ID NO:2, 5' GGC ACC ATG
GGA AGT GAT T 3'; cebador inverso, SEQ ID NO:3: 5' ATT TGG TAA GGC
CTG AGC TG 3'. Cuando se indica así, el tratamiento con pIC o
[pIC]^{PEI} se inició a los 3 días después de la infección
con los correspondientes virus que expresaban el
shRNA.
shRNA.
Se aisló el RNA total de al menos dos
experimentos independientes y se purificó con el kit Rneasy
(Quiagen). Se marcaron con Cy5-dUTP 2,5 \mug de
muestras tratadas 5 con PEI y se utilizaron como referencia en las
reacciones de hibridación con 2,5 \mug del RNA marcado con
Cy3-dUTP resultante de la incubación con pIC o PEI.
El RNA marcado se híbrido con el Microarray de oligos de dos colores
del genoma humano completo (4x44K) de Agilent (Santa Clara, CA, USA)
siguiendo las instrucciones del fabricante. Después de lavar, los
portaobjetos se escanearon utilizando un Scanarray 5000 XL (GSI
Lumonics Kanata, Ontario, Canadá) y las imágenes se analizaron con
el programa GenePix 4.0 (Axon Instruments Inc., Union City, CA),
esencialmente tal como se ha descrito previamente (Alonso et
al., 2007). Las medidas de la intensidad de fluorescencia se
sometieron a la sustración automática del fondo. Las relaciones
Cy3:Cy5 se normalizaron al valor de la mediana de la relación de
todos los puntos del array. Después de la normalización, se
descartaron los puntos con intensidades para ambos canales (suma de
medianas) menores que el fondo local. Las relaciones de los
restantes puntos fueron objeto de transformación logarítmica (base
2), y los puntos duplicados en los arrays se ajustaron a la mediana.
El agrupamiento de pares no ponderado (UPGMA: unweighted
pair-group) de los genes expresados de forma
diferencial entre las muestras control y de ensayo se llevó a cabo
con el Gene Expresión Pattern Análisis Suite (GEPAS).
Los ratones C57BL/6 hembra se adquirieron al NIH
(Bethesda. MA). Los ratones Beige hembra con SCID (severe
combined immunodeficiency: inmunodeficiencia combinada severa),
que tienen afectada la función de los linfocitos NK, T y B, eran de
Charles Rivers (Wilmington, MA). Todos los animales eran de
6-12 semanas de edad al comienzo de los
experimentos. El cuidado de los animales se prodigó de acuerdo con
los procedimientos institucionales del Centro del Cáncer de la
Universidad de Michigan.
Los injertos en la piel se generaron mediante
inyección intracutánea de 10^{5} células de melanona B16. 2 ng/kg
de pIC, solo o acomplejado con invivoJetPEI™ se administraron
mediante inyecciones peritumorales en los días 7, 11, 15 y 21
posteriores a la implantación del tumor. Los grupos adicionales de
tratamiento incluyeron JetPEI como agente único y controles con
placebo. El volumen de los tumores se estimó mediante medidas con un
calibrador y se calcularon como V= L x W2/2, donde L y
W indican la longitud y la anchura del tumor,
respectivamente. Se analizaron 10 tumores por grupo experimental. De
forma rutinaria, los ratones se sacrificaron cuando el volumen del
tumor excedió de 1000 mm^{3}.
Los modelos sustitutorios de metástasis pulmonar
se generaron mediante inyección intravenosa (i.v.) de 4x10^{5}
células de melanoma B16-eGFP o 5x10^{5} células de
melanoma
SK-Mel-103-eGFP
(SK-Mel-103 infectadas con el vector
pLVO-eGFP-LC3 tal como se describe
más adelante). El tratamiento se llevó a cabo los días 3, 6, y 9
mediante inyección i.v. de 1 ng/kg de pIC solo o acomplejado con
invivoJetPEI. Los grupos de control sin PEI recibieron PEI en
5% de glucosa, mientras que el grupo sin tratamiento (NT) recibió 5%
de glucosa sin PEI. 14 días después de la inoculación de las
células, se sacrificaron los ratones, y se procesaron sus pulmones
para obtener imágenes de fluorescencia; las metástasis externas se
contaron manualmente y se les asignó un valor según su número y
tamaño. Alternativamente, se utilizó un sistema Illumatool TLS
LT-9500 de luz de fluorescencia (Lightools Research,
Encinitas, CA, USA) y la fluorescencia emitida por las células
tumorales se capturó con una cámara Hamamatsu Orea 100 CCD. La
implicación de metástasis se siguió de forma independiente mediante
análisis de la tinción con hematoxilina-eosina de
secciones de parafina. Los experimentos se llevaron a cabo en grupos
de cinco ratones y se repitieron de dos a cuatro veces. Los ratones
se sometieron a eutanasia cuando las poblaciones control mostraron
signos de malestar o defectos respiratorios.
Los melanomas autóctonos se generaron cruzando
los ratones Tyr::N-Ras^{Q61K}/º con ratones
knockout en Ink4a/Arf en un contexto C57BL/6 (Ackermann et
al., 2005). Para la inducción del melanoma en la piel, los
ratones se pintaron una vez, a la edad de 8-10
semanas, con 220 \mug de
7,12-dimetilben[a]antraceno (DMBA).
Tras el desarrollo de los primeros neoplasmas melanocíticos
(lesiones de al menos 1 mm de diámetro), los ratones se trataron 2
veces por semanas con inyecciones intraperitoneales de 1 ng/kg de
pIC como agente individual o acomplejado con invivoJetPEI. Se
contaron los melanomas y los lunares (neví) y se midió su tamaño en
dos diámetros biseccionantes utilizando un calibre, expresándolo
como tamaño medio tumoral, en mm^{3}.
El tamaño de los tumores de evaluó también
mediante PET-CT (Positron Emission
Tomography-Computed Tomography: Tomografía de
Emisión de Positrones - Tomografía Computada). La exploración y
adquisición de imágenes de PET-CT se llevó a cabo
con el sistema de PET-CT para animales pequeños
Explore Vista de General Electrics (Fairfield, CT, USA). Se
inyectaron 15 MBq de ^{18}F-FDG
(2-fluoro-2-desoxi-D-glucosa)
para la adquisición de imágenes de PET y se reconstruyeron las
imágenes mediante el algoritmo 3DOSEM. Las imágenes de CT se
adquirieron con 16 disparos con una energía de 35 KeV y 200 \muA,
y las imágenes se reconstruyeron utilizando el algoritmo FDK. Los
melanomas, las metástasis y otros órganos se monitorizaron
independientemente mediante el análisis de secciones de parafina
teñidas con hematoxilina-eosina.
Para la microscopía electrónica de transmisión
(TEM), las poblaciones de células indicadas se lavaron con tampón de
Sorensen 0,1, pH 7,5 y se fijaron en glutaraldehído al 2,5% durante
1,5 h, y a continuación se deshidrataron y se embebieron en resina
de Spurr. Luego, el bloque se seccionó en secciones ultrafinas de
60-100 nm, que se picaron sobre rejillas de cobre.
Para realizar el análisis rutinario, las secciones ultrafinas se
tiñeron con acetato de uranilo al 2% y citrato de plomo. Las
micrografías electrónicas se tomaron con un microscopio de
transmisión Philips CM-100 (FEI, Hillsbrough, OR) y
una cámara digital Kodak 1.6 Megaplus.
La fusión eGFP-LC3 clonada en el
vector de expresión pCNA fue un donativo de Gabriel Núñez (Centro
del Cáncer de la Universidad de Michigan). Dicha fusión
eGFP-LC3, así como los fragmentos de secuencia
correspondientes a las fusiones eGFP-Rab7wt,
eGFP-Rab7 T22N, eGFP-Rab5wt,
eGFP-Cherry-LC3 y
Cherry-LC3 se clonaron en sendos vectores
lentivirales pLVO-puro para conseguir una
transferencia estable de genes mediada por lentivirus. Las células
derivadas de melanoma (SK-Mel-103,
por ejemplo) se infectaron con el vector resultante
(pLVO-GFP-LC3, por ejemplo) y se
seleccionaron con puromicina. La emisión de fluorescencia asociada a
GFP-LC3 se visualizó utilizando un microscopio de
fluoresencia Leica AF6000 y las imágenes se analizaron mediante LAS
AF V1.9 (Leica, Solms, Alemania). Para realizar la microscopía
confocal en tiempo real, se utilizó un microscopio ultraespectral
Leica
TCS-SP2-AOBS-UV
acoplado a CO2 y una cámara de incubación a temperatura controlada.
Las imágenes se analizaron mediante LCS (Leica, Solms, Alemania).
Para los experimentos de colocalización se añadió el Lysotracker™
Red (Invitrogen, Carlsbad, CA), o Lysotracker™ Blue (Invitrogen,
Carlsbad, CA), a concentraciones finales, respectivamente, de 50 nM
o 200 nM, añadidos 1 hora antes de la obtención de imágenes, así
como Hoescht 33342 (Invitrogen, Carlsbad, CA), añadido a una
concentración final de 5 \mug/ml, 10 minutos antes de la obtención
de imágenes. Las imágenes de colocalización se analizaron con LAS AF
V1.9 (Leica, Solms, Alemania).
El interferón alfa humano se midió en
sobrenadantes de cultivo mediante ensayo inmunoabsorbente de enzimas
ligadas (ELISA). El kit de ELISA de IFN-\alpha
humano y el hIFN-\alpha recombinante se
adquirieron a PBL Interferón Source (Piscataway, NY) y se utilizaron
de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El nivel de
expresión del IFN- \alpha/\beta se midió en macrófagos derivados
de médula ósea (BMDMs) y células de melanoma B16 mediante PCR a
tiempo real. Los BMDMs se prepararon, plaquearon y trataron tal
como ha sido previamente descrito (Celada et al., 1984). El
análisis mediante PCR cuantitativa a tiempo real de los transcritos
de RNA de IFIT-1 (proteína 1 inducida por interferón
con repeticiones del tetratricopéptido) se llevaron a cabo
utilizando cebadores y sondas TaqMan obtenidas de Applied Biosystems
en un detector de secuencias 770 de Applied Biosystems tras la
normalización con \beta-actina.
Los datos de viabilidad se expresaron como
medias +/- s.e.m, y el análisis estadístico de las diferencias se
determinó mediante el ensayo de la t de Student para dos muestras.
Se consideró significativo P < 0,05. Para la evaluación
estadística del crecimiento de los tumores y las metástasis in
vivo, se utilizó el ensayo generalizado de
Mann-Whitney Wilcoxon para comparar los valores de
variables continuas entre dos grupos. Se consideraron
significativos los valores de P <0,05.
- Ejemplo
1
Tal como se ha comentado previamente, un rasgo
distintivo de la autofagia (tanto para inducción de la muerte
celular como de la supervivencia), es la relocalización de la
proteína del gen de autofagia 8 (ATG8)/LC3 desde el citosol a
autofagosomas de reciente formación. Basándose en esta observación,
los cambios en la distribución celular de una proteína de fusión
GFP-LC3 (p. ej. de un patrón difuso a la tinción
focal) son ampliamente utilizados como un sustituto de estadios
tempranos de autofagia. La presencia de autofagosomas puede
confirmarse también mediante microscopía electrónica o microscopía
de campo claro.
Para comenzar a abordar el papel de la autofagia
en la respuesta del melanoma a los fármacos, se llevó a cabo un
análisis discriminatorio basado en GFP-LC3 con
fármacos quimioterapéuticos e inmunomoduladores comercialmente
disponibles. Las células de melanoma se transdujeron de forma
estable con vectores lentivirales capaces de expresar derivados del
marcador de autofagosomas LC3 marcados con GFP, tales como el vector
pLVO-eGFP-LC3. La línea celular
humana SK-Mel-103 se seleccionó como
el sistema modelo de células de melanoma para el estudio
discriminatorio inicial, basándose en su fenotipo altamente
metastásico y quimiorresistente (Soengas et al., 2001). Se
llevaron a cabo estudios de
\hbox{validación posteriores en un
panel de líneas celulares de diverso fondo genético (véase más
adelante).}
Se encontró que diversos fármacos
anticancerígenos inducían la emisión focal de fluorescencia asociada
a GFP-LC3 sin afectar de forma significativa a la
viabilidad celular. Sin embargo, entre los inductores de muerte
celular, se encontró que un complejo de PEI y el compuesto análogo
de dsRNA ácido poliinosin-policitidílico,
[pIC]^{PEI}, era particularmente eficaz, dando lugar a una
fuerte acumulación de focos GFP-LC3. Aproximadamente
50% de las células mostraron una tinción de GFP-LC3
en forma de puntos continuos perceptibles dentro de las
4-6 h de incubación con dosis bajas
(0,5-1 \mug/ml) de [pIC]^{PEI} (véanse
los micrográficos representativos y la cuantificación en la Fig. 1A
y B, respectivamente). De hecho, los análisis cinéticos indicaron
una generación más rápida de focos de GFP-LC3 por
[pIC]^{PEI} que por rapamicina (Fig. 1B), un control
positivo clásico de la inducción de autofagia (Klionsky et
al., 2008). Es interesante que en los momentos más tardíos del
tratamiento con [pIC]^{PEI} se obtuvo como resultado
muerte celular, incluso en las líneas celulares que son
intrínsecamente resistentes a agentes normales lesivos para el DNA
tales como doxorrubicina o etopósido, como es el caso de la línea
SK-Mel-103). El análisis de la
proteína LC3 endógena mostró cambio en su movilidad electroforética
(Fig. 1C), característicos de la lipidación de esta proteína durante
autofagia, y un requerimiento estricto de ATG5 para la formación de
focos GFP-LC3.
Los autores, de la invención no tenían
conocimiento de ningún informe previo que hubiera ligado el pIC a la
autofagia en células cancerígenas. Por ello, centraron los
siguientes ensayos en este compuesto, puesto que podría revelar
nuevos elementos para aumentar la comprensión del potencial de los
sensores intracelulares de dsRNA para inducir autofagia y muerte de
células tumorales.
La tinción focal de GFP-LC3 de
células tratadas con [pIC]^{PEI} descrita en el apartado
anterior es consistente con la formación de autofagosomas. Sin
embargo, para descartar posibles agregaciones inespecíficas e
independientes de autofagia de esta proteína de fusión (Klionsky
et al., 2008), la respuesta de las células de melanoma a
[pIC]^{PEI} se analizó independientemente mediante
microscopía electrónica (Fig. 1D).
Las respuestas tempranas (5 h) a
[pIC]^{PEI} implicaban una marcada acumulación de
estructuras densas frente a los electrones, unidas a la membrana, en
las que habían quedado secuestrados restos celulares (Fig. ID), un
rasgo distintivo de autofagosomas. El tamaño y número de estas
estructuras era visible como gránulos intracelulares incluso
mediante microscopía óptica (Fig. 1E).
En los momentos tardíos, el tratamiento con
[pIC]^{PEI} condujo al colapso celular (Fig. 1F, panel
intermedio), el cual se encontró mediante microscopía electrónica
que estaba asociado con la formación de grandes vacuolas
fagocíticas, de más de 500 nm de diámetro (Fig 1F, panel derecho):
la inducción de estructuras multivesiculares grandes resultó ser
una característica estructural definitoria de la acción de
[pIC]^{PEI} sobre las células de melanoma. La muerte de
células de melanoma finalmente producida fue en todos los casos el
resultado de activación previa de vesículas autofagocíticas
clásicas. La Fig. 2 muestra un resumen de la evolución en el tiempo
de la inducción de la autofagia, mediante microfotografías de
fluorescencia seleccionadas tomadas en distintos tiempos,
microfotografías en donde puede observarse la redistribución de
eGFP a lo largo del tiempo: de una tinción difusa a agregados
focales, indicativos de la formación de autofagosomas, proceso que
culmina con un colapso celular generalizado; las células control
mostraron una tinción difusa durante todo el tiempo de ensayo,
indicativo de niveles basales de acumulación de LC3.
Es interesante que la integridad de las
membranas plasmática y nuclear se mantuvo, y que las células
tratadas con [pIC]^{PEI} mostraban la condensación de la
cromatina característica de los programas de apoptosis. La inducción
de autofagia era dependiente de pIC, pues PEI (Control) tuvo un
impacto mínimo en el número o el tamaño de los autofagosomas (Fig.
1D-F). En conjunto, estos resultados apoyan un
efecto citotóxico de [pIC]^{PEI} que implica la formación
de autofagosomas, seguido de deceso celular con rasgos similares a
los apoptóticos.
- Ejemplo
2
Para determinar si la actividad
pro-autofágica de [pIC]^{PEI} hallada en el
estudio discriminatorio inicial realizado con células
SK-Mel-103 era un reflejo de una
actividad anti-melanoma más amplia, se realizaron
ensayos sobre un juego adicional de líneas celulares. Se
seleccionaron casos que representan defectos genéticos o
epigenéticos asociados con el melanoma en oncogenes (BRAF,
NRAS), supresores de tumores (p16, p19, PTEN) y factores
pro y antiapoptóticos (familia de Bcl-2), que se
sabe que contribuyen a la progresión del melanoma y a su
quimiorresistencia.
Las mutaciones en p53 son raras en
melanoma (Soengas and Lowe, 2003). Sin embargo, puesto que p53 puede
jugar un papel clave en la activación de programas apoptóticos y
autofágicos, también se realizaron ensayos con
SK-Mel-28, una línea celular que
expresa una p53 mutante, para determinar si este supresor de
tumores se requiere estrictamente para la actividad antimelanoma de
[pIC]^{PEI}. Además, también se incluyó en el análisis una
variante metastásica de la línea celular de melanoma de ratón B16,
como ejemplo de modelo ampliamente utilizado en la inmunoterapia del
melanoma (Wenzel et al., 2008), para evaluar diferencias en
la respuesta al tratamiento supuestamente asociadas a las
diferencias entre especies. En paralelo, se analizaron también
melanocitos aislados de prepucio humano.
El contexto genético de las líneas de melanoma
metastásico humano utilizadas se muestra en la Tabla 1:
La presencia de mutaciones (mut.) en p53 se
determinó por secuenciación directa de los exones
2-10 por RT-PCR. Las muestras con el
polimorfismos P72R se indican como ^{R}. La inducibilidad de p53
(Induc. p53) se determinó mediante inmunotransferencia de extractos
tratados con doxorrubicina (0,5 \mug/ml, 12 h). Las líneas con
altos niveles endógenos de p53 se indican con un asterisco. Los
niveles de PTEN, Apaf-1, Casp-8,
Bcl-2, Bcl-xL y
Mcl-1 se determinaron por inmunotransferencia y se
normalizaron con respecto a los melanocitos control. La presencia de
mutaciones en BRAF y NRAS se determinó por secuenciación directa de
fragmentos genómicos amplificados por PCR de los exones 15 y 3,
resepctivamente. Las respuestas a doxorrubicina (DOX; 0,5 \mug/ml,
30 h) se catalogaron como ++, +, -/+, -, según los porcentajes de
muerte celular fueran de 100-70,
70-50, 50-30 y <30%,
respectivamente.
respectivamente.
Con estas líneas, se llevaron a cabo ensayos
similares a los descritos en el Ejemplo 1 para la línea celular
SK-Mel-103, ara comprobar la
sensibilidad de cada una de estas células a PEI y pIC como agentes
independientes o utilizados en combinación. Los resultados se
resumen en la Fig. 3.
Las cinco líneas celulares de melanoma ensayadas
(SK-Mel-19, -28, -103, -147, y B16)
murieron con una cinética y sensibilidad similares después del
tratamiento con [pIC]^{PEI} (Fig. 3A). Es significativo que
en todas las líneas de melanoma en las que se realizó el ensayo, la
activación temprana de la autofagia por parte de
[pIC]^{PEI} fue invariablemente seguida por muerte
celular.
La microscopía electrónica mostró autofagosomas
claros, también en el caso de la línea mutante en p53,
SK-Mel-28 (Fig. 3B). Como puede
apreciarse en la Fig. 3A y en las curvas de
dosis-respuesta representadas en la Fig. 4B (que
muestra los datos representativos de las líneas correspondientes a
cuatro aislados independientes), es importante señalar que, en
condiciones que provocaron la muerte del 70% de las células de
melanoma SK-Mel-103 24 horas después
del tratamiento, los melanocitos normales siguieron siendo viables y
no mostraron marcadores de autofagia.
Es más, como puede apreciarse en la Fig. 4A, no
se observaron cambios significativos en la morfología, la
granulación citosólica o la distribución de GFP-LC3
en los melanocitos a lo largo de un amplio rango de concentraciones
de [pIC]^{PEI}. La Fig. 4C es indicativa también de que los
fibroblastos normales de piel humana también resultaron ser más
resistentes a [pIC]^{PEI} que las células de melanoma.
Los arrays de cDNA mostraron que los melanocitos
experimentaban cambios mínimos en la expresión de genes en momentos
tempranos (4 horas) o tardíos (10 horas) después del tratamiento,
independientemente de si eran tratados con pIC desnudo o con el
complejo [pIC]^{PEI}; por el contrario, las células de
melanoma respondieron con alteraciones sustanciales en su
transcriptoma. Es interesante señalar que la respuesta al pIC
desnudo fue bastante transitoria, mientras que el efecto de
[pIC]^{PEI} fue sostenido.
Es interesante haber encontrado que PEI es
crítico en su selectividad por las células tumorales. Así, la
actividad antimelanoma de pIC se redujo en un 70-80%
cuando no se incluía PEI en el tratamiento (Fig. 3A). Sin PEI, el
pIC desnudo fue casi tan ineficaz en las células de melanoma como en
los melanocitos, y mostraba una actividad mínima como inductor de
proautofagia (Fig. 3B).
PEI es un vehículo clásico en terapia génica por
su capacidad para favorecer la captación por endocitosis de
moléculas de DNA y RNA (revisado en Payne, 2007). Las estructuras
multilamelares encontradas en las células de melanoma tratadas con
[pIC]^{PEI} (véanse las fotografías inferiores de la Fig
2B), son de hecho consistentes con múltiples eventos de fusión que
implican la llegada de híbridos endosoma-lisosoma
(anfisomas) a los autofagosomas (Maiuri et al., 2007).
- Ejemplo
3
Además de favorecer la endocitosis de las
moléculas de DNA o RNA, PEI puede promover el hinchamiento de los
endosomas y permitir una entrega eficiente del material genético al
citosol (revisado en Payne, 2007). Por ello, se pensó que PEI podría
favorece el acceso de pIC a sus sensores intracitosólicos. El gen 5
asociado a la diferenciación de melanoma (MDA-5) es
uno de estos sensores (Akira, 2006), y por ello, los autores de la
invención realizaron ensayos para comprobar si esta proteína era la
que desencadenaba la muerte de células de melanoma mediada por
[pIC]^{PEI}.
La activación de MDA-5 se
analizó realizando un seguimiento de la ruptura proteolítica que
separa su dominio helicasa y su dominio de reclutamiento para la
activación de caspasas (CARD) durante la muerte celular, tal como ha
sido descrito (Kovasovics et al. 2002; Barral et al.,
2007). Dicho análisis se llevó a cabo mediante inmunotransferencia
de extractos de células SK-Mel-28 y
SK-Mel-147 tratadas con PEI, pIC o
[pIC]^{PEI}, tras someter dichos extractos a
electroforesis. Como control positivo de inducción eficaz de muerte
celular se utilizó bortozomib. Los resultados se muestran en la Fig.
5.
Es interesante que la inmunotransferencia de
proteínas reveló una capacidad fuerte y sostenida del complejo de
PEI y pIC, [pIC]^{PEI}, para inducir el procesamiento de
MDA-5 (Fig. 5A). El pIC desnudo fue capaz de inducir
este procesamiento, aunque a niveles significativamente menores, y
no en todas las células ensayadas (ninguno de los carriles
correspondientes a células SK-Mel-28
muestran la banda de 30 kD, característica de la existencia de
escisión proteolítica, que debería aparecer a la altura marcada por
la flecha en los paneles A y B de la Fig. 5) ni de manera sostenida
(véase la Fig. 5A, donde la intensidad de la banda de 30 kD
disminuye con el tiempo de tratamiento con pIC en el caso de las
células SK-Mel-147).
Para definir la contribución de
MDA-5 a la actividad citotóxica de
[pIC]^{PEI}, se transdujeron células de melanoma, por medio
de vectores lentivirales, con RNAs cortos en horquilla (shRNA)
complementarios a MDA-5 para provocar la
inactivación estable de MDA-5 (véanse las
inmunotransferencias de proteínas en la Fig. 3B). El shRNA dirigido
contra MDA-5 redujo significativamente la muerte de
células de melanoma provocada por [pIC]^{PEI} sin efectos
inespecíficos detectables sobre las células control (Fig 3C,
p<0,05).
Es importante que la inducción y el
procesamiento de MDA-5 no fue simplemente una
consecuencia de la activación de la maquinaria de muerte celular en
las células de melanoma. El tratamiento con bortezomib, un inhibidor
de proteasomas capaz de activar en melanoma tanto la ruta apoptótica
intrínseca como la ligada a receptores relacionados con la muerte
celular, no tuvo ningún efecto en los niveles de
MDA-5 o en su procesamiento (Fig. 5A). Estos
resultados ilustran la existencia de diferencias importantes en el
mecanismo de ejecución de los programas de muerte celular por parte
de [pIC]^{PEI} y otros inductores proapoptóticos.
- Ejemplo
4
A continuación, los ensayos se centraron en los
mecanismos implicados en la ejecución de la muerte celular inducida
por [pIC]^{PEI}. La 3-metiladenina
(3-MA) y la cloroquina (Chlor) se utilizan
frecuentemente para la validación independiente de los mecanismos de
autofagia, por su capacidad para interferir con la formación de
autofagosomas o la actividad autolisosomal, respectivamente (Maiuri
et al., 2007; Klionsky et al., 2008).
Para comprobar si esta interferencia sucedía en
células de melanoma tratadas con [pIC]^{PEI}, se sometieron
al tratamiento con 3-metiladenina o cloroquina
células de melanoma SK-Mel-103 12
horas después del tratamiento con
[pIC]^{PEI} o con el tampón control (vehículo). Los resultados se muestran en la Fig. 6.
[pIC]^{PEI} o con el tampón control (vehículo). Los resultados se muestran en la Fig. 6.
Tal como se demostró mediante microscopía de
fluorescencia, mediante la cual se cuantificaron los focos
GFP-LC3 formados (Fig. 6A), 3-MA
bloqueó la formación de focos de GFP-LC3 mediada por
[pIC]^{PEI}. En presencia de cloroquina, en cambio, se
acumularon autofagosomas, pero resulta interesante que esta
inducción no resultó productiva como inductora de muerte celular
(Fig. 6C, donde se observa que el porcentaje de células muertas
observado en presencia de cloroquina es inferior al observado con
pepstatina A, E64d o la combinación de ambos). Por ello, estos
resultados apoyan la existencia de un escenario en el que la
actividad citotóxica de [pIC]^{PEI} no es un subproducto
pasivo de la formación de autofagosomas: la actividad lítica del
lisosoma es un mediador esencial en el desencadenamiento de la
muerte de células de melanoma por [pIC]^{PEI}.
- Ejemplo
5
Si el autolisosoma es una pieza clave en la
actividad de [pIC]^{PEI}, el bloqueo de las hidrolasas
lisosomales debería proteger a las células de melanoma durante el
tratamiento con [pIC]^{PEI}. No es factible bloquear toda
la actividad dependiente de lisosomas, puesto que en este orgánulo
se pueden localizar múltiples enzimas con dianas solapantes
(Fehrenbacher and Jaattella, 2005). Aún así, los inhibidores de
proteasas de amplio espectro E64d y pepstatina A pueden aportar
información útil sobre la actividad lisosomal, pues estos compuestos
bloquean de forma eficiente diversas catepsinas (B, D, y L) de los
autolisosomas (Klionsky et al., 2008). Por ello, se realizó
un ensayo en el que se comparó el efecto de cloroquina, pepstatina A
o E64d sobre la muerte celular 20 horas después del tratamiento con
el tampón control o con [pIC]^{PEI}. Los resultados se
muestran en la Fig. 6C, a la que se ha aludido previamente. Es
notable que la pepstatina A y el E64d redujeron en un 50% el grado
de muerte celular provocada por [pIC]^{PEI}.
Para confirmar que las vesículas previamente
identificadas correspondían a eventos de multifusión en los que
estaban implicados endosomas grandes, que su vez reclutan múltiples
autofagosomas (para generar las estructuras híbridas conocidas como
anfisomas) y que no eran el producto de autofagosomas parados en su
evolución, en los que los lisosomas no eran funcionales o no habían
sido reclutados, creciendo los autofogasomas como consecuencia de
acumulación de material degradado de forma inadecuada, las células
de melanoma se transdujeron con fusiones de
Cherry-GFP y LC3.
Cherry-GFP-LC3 da lugar a señales de
fluorescencia rojas y verdes en los autofagosomas, debidas a las dos
proteínas fluorescentes presentes (Cherry y GFP), pero pierden la
señal debida a GFP (verde) en el ambiente ácido de los
autolisosomas. Utilizando esta estrategia se encontró que, de hecho,
[pIC]^{PEI}, de forma similar a la rapamicina, puede
inducir la formación de autolisosomas en células de melanoma, como
indican la presencia de focos LC3, únicamente de color rojo, en la
Fig. 6C. La cloroquina, en consonancia con los ensayos previos,
bloqueó la muerte de células de melanoma desencadenada por
[pIC]^{PEI} (Fig. 6D), sin afectar a la incorporación de
endosomas (tal como se determinó visualizando complejos
[pIC]^{PEI} marcados con FluoRed, que aparecían
colocalizados con las fusiones de GFP con la proteína temprana de
los endosomas Rab5 (Fig. 6E). Un efecto inhibitorio similar se
encontró con la bafilomicina, un bloqueante de las ATPasas de las
vacuolas (Fig. 6D), apoyando de nuevo un modo de acción de
[pIC]^{PEI} dependiente de lisosomas.
Para determinar de forma independiente la
actividad lisosomas durante el tratamiento con [pIC]^{PEI},
se ensayó la capacidad de las células para procesar
DQ-BSA (un derivado de la albúmina de suero bovino,
BSA, cuya fluorescencia verde se extingue a menos que la molécula
sea escindida mediante enzimas proteolíticas. Tal como se muestra en
la Fig. 6F, DQ-BSA resultó escindida de forma
eficiente en presencia de [pIC]^{PEI}, donde es
significativo notar que la emisión de DQ-BSA se
detectó en los lisosomas, como indica la colocalización con
Lysotracker-Red (LTR-Red en la
Figura, un colorante cuya permeabilidad celular es dependiente del
pH y que emite fluorescencia roja cuando se incorpora en lisosomas
funcionales ácidos). El resultado contrasta con la emisión mínima de
fluorescencia debida a DQ-BSA observada en las
células SK-Mel-103 tratadas con
[pIC]^{PEI} cuando la actividad lisosomal se bloqueó con
cloroquina (Fig. 6F y Fig. 6G).
Para caracterizar más detalladamente la
capacidad de [pIC]^{PEI} de provocar la iniciación y
desarrollo completo de procesos de autofagia, se realizaron ensayos
adicionales de visualización de la fusión de autofagosomas y
lisosomas mediante microscopía confocal. Con este objetivo, se
trataron con [pIC]^{PEI} o los correspondientes tampones
como control, células SK-Mel-103 que
expresaban de forma estable GFP-LC3, y se incubaron
en presencia de Lysotracker-Red. El análisis de la
emisión dual de fluorescencia verde y roja (correspondientes a la
fusión GFP-LC3 y Lysotracker-Red,
respectivamente), basado en las células individuales y en la
población de células, mostró una colocalización clara de
autofagosomas y lisosomas (véanse las microfotografías
representativas de la fluorescencia en las Fig. 6H y 6I y las
correspondientes cuantificaciones en la Fig. 6J). Es importante que
esta colocalización fue un evento temprano en las respuestas
desencadenas por [pIC]^{PEI} (es decir, que ya era
detectable dentro de las 4 - 8h tras el tratamiento), y precedió a
un colapso celular organizado.
Una vez determinado que los autofagosomas se
fusionan con lisosomas activos en respuesta [pIC]^{PEI}, se
comprobó si estos orgánulos interaccionaban con los endosomas o eran
"reclutados" por ellos. En primer lugar, se comprobó la
dinámica de los endosomas transduciendo células de melanoma con un
derivado del marcador tardío de endosomas Rab7 (Luzio et al.,
2007), unido a GFP. En las células de melanoma sin tratar (columna
izquierda del panel A de la Fig. 7), la generación basal de
endosomas y su resolución (es decir, la reducción progresiva de su
tamaño); sin embargo, [pIC]^{PEI} exacerbó de forma
llamativa la actividad de los endosomas, induciendo una generación
sostenida, en varias olas, de endosomas (columnas intermedia y
derecha del panel A de la Fig. 7). La detección de imágenes dobles
de señal verde y roja debidas, respectivamente, a
GFP-Rab7 y Lysotracker-Red mostró
que estos endosomas estaban llenos de lisosomas (Fig. 7B). Es más,
la microscopía de imágenes tomadas a intervalos de tiempo permitió
la visualización de una rápida cinética de múltiples reclutamientos
de lisosomas a los endosomas decorados con GFP-Rab7,
como puede comprobarse también en las series secuenciales de eventos
de fusión mostradas en la Fig. 7C. Es importante señalar que, tal
como se muestra en la Fig. 7B (parte derecha), la fusión de
endosomas y lisosomas resultó inhibida de forma significativa si las
células sobreexpresaban Rab7-T22N, un conocido
mutante negativo dominante de esta proteína. Así, estos resultados
revelan un movilización genéticamente programada de los
compartimentos endo/lisosomales en células tumorales mediada por
[pIC]^{PEI}.
Para determinar si los autofagosomas eran
reclutados a formar parte de los endosomas, y en qué momento
sucedía esto, se obtuvieron imágenes simultáneas de la fluorescencia
debida a GFP-Rab7, Cherry-LC3 y
Lysotracker-Blue en diferentes momentos tras la
adición de [pIC]^{PEI}. Tal como se muestra en la Fig. 7D,
Rab7 se incorporó en la membrana de vesículas "vacías"
(endosomas tempranos) preexistentes, que posteriormente reclutaron
la presencia de LC3. Es interesante que LC3 parece ser internalizado
tras decorar las vesículas positivas para Rab7 completas (comenzando
habitualmente con un evento inicial de nucleación: véase la Fig.
7D). La incorporación de LTR-Blue en estos híbridos
endosoma-autofagosoma (anfisomas) fue la última en
suceder. En este punto, la vesícula correspondiente disminuyó
progresivamente de tamaño hasta volverse indetectable, lo que es
indicativo de un proceso degradativo genuino (Fig. 7D: obsérvense
las flechas que indican la secuencia de aparición de
Rab7>LC3>Lysotracker-Blue). En ausencia de
Lysotracker-Blue se encontró un proceso similar de.
reclutamiento progresivo e internalización de LC3 dentro de los
endosomas Rab7 (Fig. 7E), lo que descarta
\hbox{posibles
efectos de este agente lisosomotrópico sobre la dinámica de los
lisosomas.}
En conjunto, estos resultados son consistentes
con una autofagia genuina activamente implicada en la ejecución de
un programa de muerte controlada.
- Ejemplo
6
Las proteasas lisosomales pueden tener un
impacto sobre los programas de muerte celular a múltiples niveles
(Maiuri et al., 2007; Hoyer-Hansen and
Jaatella, 2008). En el caso de las mitocondrias, pueden desregular
la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y/o provocar
el concurso de caspasas apoptóticas clásicas (la caspasa reguladora
casp-9 y las caspasas efectoras
casp-3 y casp-7). También pueden
responder a la activación lisosomal rutas extrínsecas dependientes
de la casp-8 (Fehrenbacher and Jaattella, 2005).
Para abordar la cuestión de la implicación de
ROS en el modo de acción de [pIC]^{PEI}, el tratamiento con
este complejo se llevó a cabo en presencia de vitamina E, Trolox o
Tirón, agentes químicos neutralizantes con diferente actividad
antioxidante, así como con el inhibidor pancaspásico
z-VAD-fmk. Los resultados al
analizar el resultado sobre la muerte celular en cada uno de estos
casos se muestran en la Fig. 8A, en la que se han representado los
datos obtenidos con la vitamina E como caso representativo de los
resultados obtenidos con los agentes químicos antioxidantes
mencionados a las dosis de estos reactivos que bloquean en melanoma
la apoptosis controlada por ROS (Fernández, 2006). Como puede
observarse en dicha figura, la presencia de agentes antioxidantes no
dio lugar a efectos significativos sobre la muerte celular provocada
por [pIC]^{PEI}. En cambio, el inhibidor general de
caspazas z-VAD-fmk inhibió la muerte
inducida por [pIC]^{PEI} en un 70%. En conjunto, estos
resultados apoyan un mecanismo dependiente de caspasas activado en
una etapa posterior de un programa de autofagia.
De hecho, el procesamiento de caspasas fue
promovido de forma eficaz por [pIC]^{PEI} según se
determinó mediante inmunotransferencia de extractos de células
recogidas transcurridos distintos tiempos tras ser sometidas a
ningún tratamiento (NT) salvo el tampón control sin PEI o a
tratamiento con PEI, pIC, el complejo [pIC]^{PEI} o el
conocido inductor de la escisión de caspazas bortezomib (Fig. 8B y
Fig. 8C). La Fig. 8B permite comparar la capacidad de PEI, pIC y
[pIC]^{PEI} para inducir el procesamiento de las caspasas
apoptóticas 8 y 9 en diferentes líneas de melanoma metastásico: una
activación efectiva de las caspasas 9 y 8 era claramente evidente
20h después del tratamiento con [pIC]^{PEI} en todas las
líneas celulares de melanoma humano ensayadas, de forma análoga a lo
que se observó con bortezomib. Es más, la cinética y el grado de
procesamiento de las caspasas provocado por [pIC]^{PEI}
eran altamente consistentes (Fig. 8B), independientemente de la
posible presencia de mutaciones en BRAF (p.ej.
SK-Mel-19), NRAS
(SK-Mel-103,
SK-Mel-147), o p53
(SK-Mel-28).
En la Fig. 8C se muestran los resultados de un
ensayo análogo, realizado con la línea
SK-Mel-103, donde se realizó un
análisis más completo incluyendo, además de las caspasas apoptóticas
9 y 8, las caspasas efectoras 7 y 3; también se realizó el mismo
ensayo con la línea SK-Mel-147, que
dio lugar a resultados similares. El procesamiento eficaz de las
caspasas 9, 3 y 7 en SK-Mel-103 y
SK-Mel-147 fue particularmente
relevante. Estas líneas tienen bajos niveles de
Apaf-1 y son muy ineficaces reclutando el concurso
del apoptosoma casp-9/Apaf-1
(Fernández et al., 2005; Soengas et al., 2006) en
respuesta a agentes anticancerígenos clásicos tales como
doxorrubicina, etopósido o cisplatino (véase el gráfico de la Fig.
1C). Así, estos resultados demuestran una capacidad superior de
[pIC]^{PEI} para activar programas apoptóticos y eludir
mecanismos de resistencia a fármacos quimioterapéuticos
normales.
- Ejemplo
7
Para analizar con más detalle el modo de acción
de [pIC]^{PEI}, y para identificar eventos que pueden ser
activados únicamente por este agente, se comparó la respuesta al
fármaco con los efectos de bortezomib. De manera análoga a como se
hizo en el Ejemplo anterior, este agente se seleccionó porque es
también un potente activador de la maquinaria apoptótica de las
células de melanoma (Wolter et al., 2007; Fernández et
al., 2006).
Sin embargo, se esperaba que el bortezomib y
[pIC]^{PEI} fueran distinguibles desde el punto de vista
del mecanismo. El bortezomib tiene como diana el proteasoma y no el
lisosoma (Qin et al., 2005). Es más, como se muestra en la
Fig. 5A, el bortezomib mata las células de melanoma sin inducir o
procesar MDA-5. El bortezomib también es interesante
porque puede promover una acumulación masiva del proapoptótico NOXA,
pero también inducir una regulación al alza, rápida y drástica, de
su factor antagonista antiapoptótico MCL-1 (37, 49),
un miembro de la familia de Bcl-2. Es importante que
MCL-1 actúa como un mecanismo interno de
compensación a la inhibición del proteasoma y bloquea el efecto
antitumorigénico de Bortezomib in vitro e in vivo
(Wolter et al., 2007; Qin et al., 2006).
Para evaluar las similitudes y diferencias entre
bortezomib y pIC (desnudo o acomplejado con PEI), las células de
melanoma se incubaron con cada uno de estos compuestos y se
recogieron extractos en diferentes momentos después del tratamiento
para evaluar los niveles de NOXA, MCL-1, y otros
miembros de la familia de Bcl-2
(Bcl-xL y el propio Bcl-2). Los
resultados se muestran en la Fig. 9.
Tal como puede verse en los paneles A y B de la
Fig. 9, el pIC desnudo no fue capaz de inducir NOXA de manera
consistente o sostenida en células de melanoma
SK-Mel-28 o
SK-Mel-147 (células que expresan,
respectivamente, p53 con la mutación L145R o p53 tipo silvestre).
Por otra parte, [pIC]^{PEI} indujo NOXA 35, 10 y 5 veces
respecto a los niveles basales en
SK-Mel-28,
SK-Mel-147 y
SK-Mel-103, respectivamente (véanse
las inmunotransferencias de los paneles A y C de la Fig. 9, y las
cuantificaciones representativas de la Fig. 9B, correspondientes a
los datos obtenidos en células
SK-Mel-28), enfatizando de nuevo la
actividad diferencial entre el pIC desnudo y el pIC acomplejado con
PEI.
Con respecto a los reguladores inhibitorios de
NOXA, los niveles de MCL-1 resultaron mínimamente
inducidos por [pIC]^{PEI} (Fig. 9A y primer gráfico de la
Fig. 9B). Esto contrasta con el bortezomib, que activa NOXA de forma
potente, pero induce una acumulación simultánea de
MCL-1, tal como se ha descrito previamente
(Fernández et al., 2005). Otros miembros de la familia de
anti-apoptóticos Bcl-2 tales como
Bcl-2 y Bcl-xL tampoco se vieron
afectados por [pIC]^{PEI} (véanse las inmunotransferencias
de SK-Mel-103 en la Fig. 9C).
En ausencia de mecanismos compensatorios, los
niveles relativamente más bajos de NOXA inducidos por
[pIC]^{PEI} podrían ser suficientes para promover la muerte celular. Para comprobar esta hipótesis, se infectaron células de melanoma SK-Mel-103 con un vector lentiviral que expresaba un shRNA que previamente se había demostrado que inhibía específicamente el mRNA y la proteína de NOXA (Fernández et al., 2005), realizando paralelamente un ensayo control en el que las células se infectaron con un vector lentiviral que expresaba un shRNA control inactivo. Como se muestra en la Fig. 9D, una reducción del 50% en la expresión de la proteína NOXA por el shRNA dirigido contra ella inhibió la regulación al alza de NOXA por parte de [pIC]^{PEI} también aproximadamente en un 50%, e inhibió la toxicidad de [pIC]^{PEI}, reduciendo el porcentaje de muerte celular observada (Fig. 9E).
[pIC]^{PEI} podrían ser suficientes para promover la muerte celular. Para comprobar esta hipótesis, se infectaron células de melanoma SK-Mel-103 con un vector lentiviral que expresaba un shRNA que previamente se había demostrado que inhibía específicamente el mRNA y la proteína de NOXA (Fernández et al., 2005), realizando paralelamente un ensayo control en el que las células se infectaron con un vector lentiviral que expresaba un shRNA control inactivo. Como se muestra en la Fig. 9D, una reducción del 50% en la expresión de la proteína NOXA por el shRNA dirigido contra ella inhibió la regulación al alza de NOXA por parte de [pIC]^{PEI} también aproximadamente en un 50%, e inhibió la toxicidad de [pIC]^{PEI}, reduciendo el porcentaje de muerte celular observada (Fig. 9E).
A continuación, se utilizó un shRNA dirigidos
contra MDA-5 para definir los requerimientos de esta
proteína para la regulación de NOXA mediante [pIC]^{PEI} y
se realizó un ensayo análogo al realizado con el shRNA dirigido
contra NOXA, aunque el parámetro evaluado en esta ocasión fueron los
niveles de NOXA. Los resultados se representan el gráfico de la Fig.
9F. Es interesante que el shRNA de MDA-5 inhibió los
niveles en la proteína NOXA en un 70% (Fig. 9F), sin efectos
secundarios sobre otros miembros de la familia de
Bcl-2.
En conjunto, estos resultados desvelan un nuevo
punto de acción de MDA- 5 en la maquinaria apoptótica controlada por
la inducción de NOXA.
- Ejemplo
8
A continuación, se evaluó la actividad
anti-melanoma de pIC y [pIC]^{PEI} in
vivo. En modelos de melanoma, el pIC desnudo tiene que ser
administrado o a dosis elevadas o en combinación con otros agentes
(p.ej. inhibidores de la síntesis de proteínas) para conseguir una
activación eficaz de los programas de inmunidad innatos. Los datos
obtenidos en los ensayos de los Ejemplos anteriores indicaban que
pIC sería significativamente más potente en presencia de PEI.
La respuesta al tratamiento se analizó en primer
lugar en un contexto inmunocompetente. Las células de melanoma de
ratón B16, bien sin transducir o transducidas con GFP (para
facilitar la detección mediante obtención de imágenes de
fluorescencia), se implantaron en ratones normales singénicos
C57BL/6. Se utilizaron dos estrategias: inyección de células
tumorales (i) por vía subcutánea (s.c.) o (ii) intravenosa (i.v.),
para evaluar la progresión del tumor en lugares localizados o como
metástasis distantes, respectivamente. Los ratones se trataron con
PEI, pIC, [pIC]^{PEI} o 100 \mul de glucosa al 5% (grupo
NT: ningún tratamiento).
El esquema de las Fig. 10A resume la estrategia
experimental seguida, para la generación de xenoinjertos subcutáneos
de células B16, junto con los tiempos de tratamiento en inyecciones
peritumorales de 2 ng/kg de pIC desnudo o acomplejado con PEI. El
experimento se repitió dos veces con resultados similares.
Es notable que, en todos los casos estudiados,
se encontró que [pIC]^{PEI} era superior a pIC. Así, los
ratones con melanomas B16 creciendo subcutáneamente que recibieron
el vehículo, PEI o pIC solo, tuvieron que ser sacrificados a los
15-25 días después del implante, debido a un
crecimiento excesivo de los tumores (Fig. 10A). En las mismas
condiciones, los melanomas subcutáneos del grupo de tratamiento con
[pIC]^{PEI} eran indetectables o significativamente más
pequeños (Fig. 10A).
La Fig. 10B resume la estrategia experimental
seguida para la implantación intravenosa de células de melanoma
B16-eGFP y el tratamiento posterior al implante con
pIC, PEI, el complejo [pIC]^{PEI} o simplemente con glucosa
al 5% (grupo NT: ningún tratamiento). En la misma se muestran las
imágenes de fluorescencia obtenidas de los pulmones tras el
sacrificio de los animales, mientras que los resultados del recuento
de metástasis externas se representa en la Fig. 10C. En este ensayo,
también se encontró que [pIC]^{PEI} era 5 veces más potente
que el pIC desnudo es modelos sustitutorios de metástasis de
melanoma en pulmón, tal como se determinó mediante obtención de
imágenes de fluorescencia.
- Ejemplo
9
pIC es un inductor clásico de la inmunidad
celular controlada por el IFN (Wenzel et al., 2008)). Los
datos expuestos en los Ejemplos anteriores sugerían, sin embargo,
que pIC, cuando está acomplejado con PEI, también podría actuar de
manera autónoma en la célula, lo que puede ser distinguible de las
respuestas mediadas por el IFN en las células inmunes
"profesionales". Para evaluar esta posibilidad, se ensayó en
células de melanoma B16 y macrófagos su capacidad para secretar y
responder al IFN-\alpha. La RT-PCR
indicó que ambos tipos celulares activaron dianas clásicas del
IFN-\alpha tales como IFIT-1
(proteína con repeticiones de tetratricopeptidos inducida por IFN)
tras el tratamiento con [pIC]^{PEI} (Fig. 11A). El PEI
resultó ser dispensable para la inducción de dianas del IFN mediada
por pIC en macrófagos (Fig. 11A). Esto era esperable, pues estas
células pueden detectar de forma eficiente el dsRNA viral. Las
células de melanoma, sin embargo, fueron incapaces de inducir
IFIT-1 solamente con pIC desnudo (Fig.
11A).
11A).
Para realizar una evaluación directa de la
producción de IFN-\alpha por las células de
melanoma, se llevó a cabo un ensayo de Elispot, utilizando
IFN-\alpha humano recombinante como control de
referencia. Los niveles de IFN-\alpha secretados
por las células de melanoma después del tratamiento con
[pIC]^{PEI} fueron menores de 10 pg/ml. Para determinar si
el IFN-\alpha se puede sustituir por
[pIC]^{PEI} (es decir, si la secreción de
IFN-\alpha es el inductor principal de la muerte
celular en melanomas), se añadieron a células de melanoma cantidades
crecientes de esta citoquina. Es interesante que las dosis elevadas
de IFN-\alpha (10 veces superiores a los niveles
secretados después del tratamiento con [pIC]^{PEI}) fueron
incapaces de afectar a la viabilidad de las células de melanoma (Fig
11B).
Es interesante señalar también que los ensayos
con microarrays mostraron que a respuesta al pIC, además de ser
bastante transitoria, implicaba genes esperables de respuesta a
interferón, tal como se muestra en la Fig. 11C). En cambio, el
efecto del [pIC]^{PEI}, además de ser sostenido, se
extendía a transcritos adicionales.
Por ello, estos resultados ilustran diferencias
intrínsecas en el reconocimiento y detección de agentes miméticos de
dsRNA en macrófagos y células de melanoma.
- Ejemplo
10
Puesto que las células de melanona son
frecuentemente inmunorresistentes, se ensayó si la toxicidad directa
de [pIC]^{PEI} dirigida a las células de melanoma seguía
siendo eficiente en un contexto altamente inmunodeficiente. El
mecanismo efector más frecuentemente asociado con la
inmunotolerancia del melanoma son los defectos en la señalización
de células NK, T y B (Kirkwood et al., 2008), por lo que se
decidió realizar ensayos de muerte celular tumoral en un contexto
severamente inmunocomprometido similar al de los melanomas. Por
ello, se ensayó la eficacia de pIC (como agente único o acomplejado
con PEI) para bloquear el crecimiento del melanoma en ratones Beige
con inmunodeficiencia severa combinada (SCID), que carecen de
linfocitos NK, T y B funcionales.
Para realizar un seguimiento de la eficacia del
tratamiento el control de las metástasis pulmonares, las células de
melanoma se marcaron con GFP y se inyectaron por vía intravenosa,
siguiendo un esquema de tratamiento análogo al descrito en el
Ejemplo 8 para la implantación de células de melanoma B16 en ratones
inmunocompetentes. Como ejemplos representativos de melanomas de
ratón y de seres humanos, se utilizaron, respectivamente, células
de melanoma B16 (Fig. 12, paneles A, B y C) y
SK-Mel-103 (Fig. 12, paneles D y
E).
En ambos modelos celulares, [pIC]^{PEI}
fue capaz de inhibir el crecimiento de melanomas en el pulmón. La
Fig 12A muestra la llamativa diferencia en el número de metástasis
B16 visibles en la superficie del pulmón después del tratamiento con
[pIC]^{PEI} (véase la cuantificación en la Fig. 10B). Los
análisis histológicos confirmaron también la reducción en el número
y el tamaño de los nódulos pulmonares controlados por B16 en el
grupo de [pIC]^{PEI} (Fig. 12C).
Análisis similares mostraron un claro efecto
antitumoral de [pIC]^{PEI} (pero no del pIC no acomplejado)
en el control del crecimiento diseminado de
SK-Mel-103 (Fig. 12, paneles D y
E).
Así, incluso en los ratones beige con SCID, que
representan un modelo altamente inmunosuprimido (Croy and Chapeau,
1990), [pIC]^{PEI} fue capaz de controlar la colonización
de los pulmones por células B16 o
SK-Mel-103, sin que pIC mostrara
virtualmente ningún efecto.
- Ejemplo
11
Las diferencias entre pIC y [pIC]^{PEI}
se compararon en un tercer sistema, el de los ratones
Tyr::NRAS^{Q61K} x INK4a/ARF^{-/-}, que desarrollan melanomas
con características similares a las de la enfermedad humana
(Ackermann et al., 2005). Para ello, los ratones se trataron
tópicamente con una única dosis de DMBA
(7,12-dimetilbenz[a]antraceno,
adquirido a Sigma) y, al aparecer las lesiones pigmentadas, se
trataron con pIC, [pIC]^{PEI} o PEI en glucosa al 5% (grupo
control). De nuevo, se observó que la actividad antitumoral de
[pIC]^{PEI} era significativamente mayor que la de pIC
desnudo, tal como lo indican las medidas directas del tamaño de los
tumores (Fig. 13A y 13B), la visualización de la actividad
metabólica de los tumores mediante PET-CT (Fig. 13C)
y los análisis histológicos (Fig. 13D). Es significativo que
[pIC]^{PEI} duplicó el intervalo de tiempo sin lesiones en
progresión (Fig. 13A) en los regímenes de dosificación utilizados,
sin que se apreciaran signos de toxicidad secundaria (véase el
análisis de la Fig.
13 D).
13 D).
Estos resultados apoyan la viabilidad de los
tratamientos basados en la administración de análogos de dsRNA para
contrarrestar el comportamiento agresivo de las células de
melanoma.
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<160> 3
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<170> PatentIn version 3.3
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<210> 1
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<211> 21
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
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<221> misc_feature
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<222> (1)..(21)
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<223> Secuencia diana del shRNA utilizado
para regular a la baja la expresión de MDA-5
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<400> 1
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\hskip-.1em\dddseqskipcgcaaggagt tccaaccatt t
\hfill21
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<210> 2
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<211> 19
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador directo de
RT-PCR para detectar la expresión de
MDA-5
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<400> 2
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\hskip-.1em\dddseqskipggcaccatgg gaagtgatt
\hfill19
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<210> 3
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador inverso de
RT-PCR para detectar la expresión de
MDA-5
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<400> 3
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\hskip-.1em\dddseqskipatttggtaag gcctgagctg
\hfill20
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Claims (5)
1. Compuesto que comprende una combinación de un
fragmento de RNA de doble cadena (dsRNA), o un análogo del mismo, y
un portador policatiónico.
2. Compuesto, según la reivindicación 1, que
comprende una combinación de ácido
poliinosin-policitidílico (pIC) y polietilenimina
(PEI).
3. Uso del compuesto de las reivindicaciones 1 ó
2 para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento
del melanoma.
4. Uso, según la reivindicación 3, en el que el
tratamiento va destinado al tratamiento de un paciente
inmunocomprometido.
5. Medicamento destinado al tratamiento del
melanoma que comprende el compuesto de las reivindicaciones 1 ó
2.
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