JP2016070896A - Pretreatment method for detecting antigen - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、抗原検出のための前処理方法に関し、例えば被検者の咽頭から採取した咽頭ぬぐい液中にＡ群β溶血連鎖球菌（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）抗原が存在するか否かを検査する際に適用して好適なものである。 The present invention relates to a pretreatment method for detecting an antigen. For example, when examining whether or not a group A β streptococcus pyogenes antigen is present in a pharyngeal swab collected from the pharynx of a subject. It is suitable for application.
従来、Ａ群β溶血連鎖球菌抗原の存在の有無を検査する検出キットとしては、使用直前に２種の薬液を混合して用いるＡ群β溶血連鎖球菌抗原キットが知られている（例えば、非特許文献１参照）。実際上、このＡ群β溶血連鎖球菌抗原キットは、例えば、２［ｍｏｌ／Ｌ］亜硝酸ナトリウムを成分とする薬液Ａが入った第１ボトルと、０．２［ｍｏｌ／Ｌ］酢酸を成分とする薬液Ｂが入った第２ボトルと、試験管形状の抽出用チューブと、被検者の炎症部分である咽頭から検体を採取する綿棒と、陽性又は陰性を判定するテストストリップとから構成されている。 Conventionally, as a detection kit for examining the presence or absence of a group A β-hemolytic streptococcal antigen, a group A β-hemolytic streptococcal antigen kit used by mixing two kinds of chemicals immediately before use is known (for example, non- Patent Document 1). In practice, this group A β-hemolytic streptococcal antigen kit includes, for example, a first bottle containing a chemical solution A containing 2 [mol / L] sodium nitrite as a component and 0.2 [mol / L] acetic acid as a component. A second bottle containing the chemical solution B, a test tube-shaped extraction tube, a cotton swab for collecting a specimen from the pharynx, which is an inflamed part of the subject, and a test strip for determining positive or negative ing.
このＡ群β溶血連鎖球菌抗原キットでは、多糖抗原たるＡ群β溶血連鎖球菌抗原を菌体から遊離させて抽出するために、亜硝酸を用いており、使用直前に亜硝酸を含んだ混合薬液を生成する。このＡ群β溶血連鎖球菌抗原キットでは、使用する直前に、第１ボトル内の薬液Ａと、第２ボトル内の薬液Ｂとをそれぞれ数滴、抽出用チューブに滴下し、検体抽出液として亜硝酸を成分とした混合薬液を生成する。 In this group A β-hemolytic streptococcal antigen kit, nitrite is used in order to release and extract the group A β-hemolytic streptococcal antigen, which is a polysaccharide antigen, from the cells, and a mixed drug solution containing nitrite immediately before use Is generated. In this group A β-hemolytic streptococcal antigen kit, just before use, several drops of the drug solution A in the first bottle and the drug solution B in the second bottle are dropped on the extraction tube, and the sub-sample is used as a sample extract. A mixed chemical solution containing nitric acid as a component is produced.
使用者は、被検者の咽頭等の炎症部分を、綿棒等でぬぐって検体を採取し、この綿棒を用いて先に混合した亜硝酸を成分とする混合薬液をかき回した後、約１〜２分程度室温で放置する。 The user wipes the inflamed part of the subject's pharynx with a cotton swab, etc., collects the specimen, and uses this swab to stir the mixed medicinal solution containing nitrous acid as a component before about 1 to Leave at room temperature for about 2 minutes.
次いで、使用者は、親指及び人差し指の腹にて抽出用チューブを潰し、抽出用チューブ内の先端綿球部を、当該抽出用チューブの側壁を介して強く摘み、先端綿球部に染み込んだ検体や混合薬液を絞り出しながら、綿棒を抽出用チューブから取り出す。このようにして、抽出用チューブ内には、先端綿球部にて採取した検体が混合薬液中に放出された試液が生成され得る。 Next, the user crushes the extraction tube with the abdomen of the thumb and index finger, strongly picks the tip cotton ball part in the extraction tube through the side wall of the extraction tube, and soaks into the tip cotton ball part. Remove the swab from the extraction tube while squeezing out the mixed chemical solution. In this manner, a test solution in which the sample collected at the tip cotton ball part is released into the mixed drug solution can be generated in the extraction tube.
最後に、抽出用チューブ内の試液に、テストストリップの判定部を浸した後、所定時間経過後に、判定部における抗原抗体反応によるライン出現の有無を目視にて確認し、当該ライン出現の有無を基に、試液内にＡ群β溶血連鎖球菌抗原が存在するか否かを判定し得るようになされている。 Finally, after immersing the determination part of the test strip in the test solution in the extraction tube, after a predetermined time has passed, the presence or absence of the line appearance due to the antigen-antibody reaction in the determination part is visually checked to determine whether or not the line appears. Based on this, it is possible to determine whether or not the group A β-hemolytic streptococcal antigen is present in the test solution.
しかしながら、かかる構成でなるＡ群β溶血連鎖球菌抗原キットにおいて、抽出用チューブ内に生成された混合薬液は、不安定な亜硝酸を含んでいるため、事前に混合して抽出用チューブに保管しておくと変質してしまい、検査に用いることができなくなることから、医療現場にて使用直前にその都度混合せざるを得ず、用時調製する必要があった。そのため、使用者によっては、薬液Ａと薬液Ｂの混合割合を誤ってしまう虞もある。その場合には、陰性にも関わらず偽陽性となってしまったり、また、陽性にも関わらず偽陰性となってしまうこともあるため、正しい診断結果が得られない場合もあるという問題があった。（たとえば、特許文献１を参照。） However, in the group A β-hemolytic streptococcal antigen kit having such a configuration, the mixed drug solution generated in the extraction tube contains unstable nitrous acid, so it is mixed in advance and stored in the extraction tube. If this is done, it will be altered and cannot be used for testing. Therefore, it must be mixed each time immediately before use in the medical field, and it must be prepared at the time of use. Therefore, depending on the user, the mixing ratio of the chemical liquid A and the chemical liquid B may be wrong. In that case, there is a problem that a false diagnosis may not be obtained because a false positive may be obtained despite a negative, or a false negative may be obtained despite a positive. It was. (For example, see Patent Document 1.)
その一方、このような誤った用時調製の問題点を解決するため、従来のＡ群β溶血連鎖球菌抗原キットとして、例えば所定量の薬液Ｂが予め入った外側ボトル中に、所定量の薬液Ａが予め入ったアンプルを収納したアンプル収納型ボトルを用いたものも知られている。この種のＡ群β溶血連鎖球菌抗原キットでは、不使用時、薬液Ａと薬液Ｂとが外側ボトル内にてアンプルにより隔離された状態にあるものの、使用直前に、柔軟性のある軟質材料からなる外側ボトルを指で強く摘んでアンプルを潰すことにより、中のアンプルを破壊し、アンプル内の所定量の薬液Ａを、外側ボトル内の薬液Ｂと混合させることで、薬液Ａと薬液Ｂとが最適な混合比率で混合された混合薬液を生成し得る。 On the other hand, as a conventional group A β-hemolytic streptococcal antigen kit, for example, a predetermined amount of chemical solution is placed in an outer bottle preliminarily filled with a predetermined amount of chemical solution B in order to solve the problem of such erroneous preparation at the time of use. There is also known an ampoule storage type bottle in which an ampule containing A is stored in advance. In this type of group A β-hemolytic streptococcal antigen kit, when not in use, the drug solution A and the drug solution B are separated by an ampule in the outer bottle, but immediately before use, from a flexible soft material The ampule is crushed by strongly picking the outer bottle with a finger to destroy the ampule, and a predetermined amount of the medicinal solution A in the ampule is mixed with the medicinal solution B in the outer bottle. Can produce a mixed chemical mixed at an optimal mixing ratio.
しかしながら、この種のＡ群β溶血連鎖球菌抗原キットでも、薬液Ａと薬液Ｂとを最適な混合比率で混合させた混合薬液を生成できるものの、使用直前に混合薬液を用時調製する必要があることに変わりなく、その分、使用者にとって手間がかかるという問題があった。また、使用者が誤って外側ボトル内のアンプルを破壊してしまい薬液Ａと薬液Ｂとを混合させてしまったり、或いは、Ａ群β溶血連鎖球菌抗原キットを搬送中に、何らかの原因でアンプル収納型ボトルに衝撃が加えられ、外側ボトル内のアンプルが破壊されてしまうと、使用者が意図しないタイミングで薬液Ａと薬液Ｂとが混合されてしまう。 However, this type of group A β-hemolytic streptococcal antigen kit can produce a mixed drug solution in which the drug solution A and the drug solution B are mixed at an optimum mixing ratio, but it is necessary to prepare a mixed drug solution immediately before use. In fact, there was a problem that it took time and effort for the user. In addition, the ampoule in the outer bottle may be accidentally destroyed by the user and mixed with drug solution A and drug solution B, or the ampoule is stored for some reason while transporting the group A β-hemolytic streptococcal antigen kit. When an impact is applied to the mold bottle and the ampule in the outer bottle is destroyed, the chemical liquid A and the chemical liquid B are mixed at a timing not intended by the user.
このように、薬液Ａと薬液Ｂとが意図しないタイミングで混合されてしまった場合には、外側ボトル内にて生成された混合薬液が時間経過とともに変質してしまい、その後、検査に用いることができないことから、このような誤った調製が行われないことが望まれている。（たとえば、特許文献１を参照。） As described above, when the chemical liquid A and the chemical liquid B are mixed at an unintended timing, the mixed chemical liquid generated in the outer bottle is deteriorated with the passage of time, and then used for the inspection. It is hoped that such an incorrect preparation will not occur because it is not possible. (For example, see Patent Document 1.)
また、これまでのかかる前処理は亜硝酸を含む混合液にて室温で１分から２分程静置し処理が行われており、その後のイムノクロマト法を原理とするキットでの検出時間は５分から１５分を要するため、操作時間（約１分程度）も含めるとＡ群連鎖球菌の検出としては合計で７分から１８分を要していた。 In addition, the pretreatment so far has been carried out by allowing the mixture to stand at room temperature for 1 to 2 minutes in a mixed solution containing nitrous acid, and the detection time with a kit based on the immunochromatography method thereafter is from 5 minutes. Since it takes 15 minutes, including the operation time (about 1 minute), it took 7 to 18 minutes in total for detection of group A streptococci.
そこで、本発明は以上の点を考慮してなされたもので、前処理工程を自動化することで前処理試薬の用時調製を不要とし、さらに、前処理中に加温を行うことで効率よく抗原を抽出できる方法を提案することである。 Therefore, the present invention has been made in consideration of the above points, and by automating the pretreatment process, it is not necessary to prepare the pretreatment reagent at the time of use, and furthermore, heating is efficiently performed during the pretreatment. It is to propose a method that can extract the antigen.
本発明者らは、Ａ群連鎖球菌を含む可能性のある検体を亜硝酸溶液と酢酸溶液またはクエン酸溶液を混合し処理する工程を自動化することで前処理試薬の用時調製を不要とし試薬の誤調製を防止した。さらに、前処理を３０℃〜５０℃で１０秒〜２分間加温することで、効率よく抗原を抽出できることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち本発明は以下のような構成からなる。
The present inventors automate the process of mixing a nitrous acid solution with an acetic acid solution or a citric acid solution for a sample that may contain group A streptococci, thereby eliminating the need for pretreatment reagent preparation at the time of use. Was prevented from being mis-prepared. Furthermore, the inventors have found that the antigen can be efficiently extracted by heating the pretreatment at 30 ° C. to 50 ° C. for 10 seconds to 2 minutes.
That is, the present invention has the following configuration.
［項１］
免疫学的測定のための検体の前処理方法であって、以下の［１］から［３］までの工程を含む方法。
［１］亜硝酸を含有する試薬溶液、および、クエン酸または酢酸を含有する試薬溶液を、３以上のウェルを有するカートリッジのうち２つのウェルに、それぞれ別々に保持する工程。
［２］前記カートリッジのうち、前記２種類の試薬溶液が保持されていないウェルにて、自動で前記２種類の試薬溶液および検体を混合する工程。
［３］前記２種類の試薬溶液と検体との混合溶液を一定時間保持する工程。
［項２］
前記工程［３］において検体を３０℃から５０℃の間で保持する、項１に記載の方法
［項３］
前記工程［３］において保持時間が１０秒から２分である、項１または２に記載の方法。
［項４］
検体がＡ群β溶血連鎖球菌を含む検体である、項１〜３のいずれかに記載の方法。
［項５］
項１〜４のいずれかに記載の前処理方法で処理された検体中の測定対象物質を、免疫学的方法で測定する方法。
［項６］
項１〜５のいずれかに記載の方法に用いるためのカートリッジであって、３以上のウェルを有し、そのうち２つのウェルに、亜硝酸を含有する試薬溶液、および、クエン酸または酢酸を含有する試薬溶液が、それぞれ別々に保持されているカートリッジ。
［項７］
項１〜４のいずれかに記載の方法に用いるための検査キットであって、以下の［１］から［２］の構成を含むキット。
［１］３以上のウェルを有するカートリッジであって、そのうち２つのウェルに、亜硝酸を含有する試薬溶液、および、クエン酸または酢酸を含有する試薬溶液が、それぞれ別々に保持されているカートリッジ。
［２］検体中の測定対象物質検出用の抗体を含む試薬。
［項８］
測定対象物質がＡ群β溶血連鎖球菌である、項７に記載の検査キット。
[Claim 1]
A method for pretreatment of a specimen for immunological measurement, comprising the following steps [1] to [3].
[1] A step of separately holding a reagent solution containing nitrous acid and a reagent solution containing citric acid or acetic acid in two wells of a cartridge having three or more wells.
[2] A step of automatically mixing the two types of reagent solution and the specimen in a well of the cartridge in which the two types of reagent solution are not held.
[3] A step of holding a mixed solution of the two types of reagent solutions and the specimen for a predetermined time.
[Section 2]
Item [3] The method according to Item [1], wherein the specimen is held at 30 ° C. to 50 ° C. in Step [3].
Item 3. The method according to Item 1 or 2, wherein the holding time in the step [3] is 10 seconds to 2 minutes.
[Claim 4]
Item 4. The method according to any one of Items 1 to 3, wherein the sample is a sample containing group A β-hemolytic streptococci.
[Section 5]
Item 5. A method for measuring a substance to be measured in a sample treated by the pretreatment method according to any one of Items 1 to 4 by an immunological method.
[Claim 6]
A cartridge for use in the method according to any one of Items 1 to 5, having three or more wells, two of which contain a reagent solution containing nitrous acid, and citric acid or acetic acid A cartridge in which each reagent solution is held separately.
[Claim 7]
Item 5. A test kit for use in the method according to any one of Items 1 to 4, comprising the following configurations [1] to [2].
[1] A cartridge having three or more wells, in which a reagent solution containing nitrous acid and a reagent solution containing citric acid or acetic acid are separately held in two wells, respectively.
[2] A reagent containing an antibody for detecting a substance to be measured in a specimen.
[Section 8]
Item 8. The test kit according to Item 7, wherein the substance to be measured is group A β-hemolytic streptococci.
本発明により、亜硝酸を含有する試薬および酢酸またはクエン酸を含有する試薬を別々のウェルに保持したカートリッジにて自動で上記２液および検体を混合し、検体を処理することにより、医療現場での用時調製を不要にできるとともに、誤った調製をも防止できる。また検体の前処理を加温して行うことでより効率良く抗原を抽出できることから検査時間を短縮することができ、かつ検査精度が向上する。 According to the present invention, the two liquids and the sample are automatically mixed in a cartridge in which a reagent containing nitrous acid and a reagent containing acetic acid or citric acid are held in separate wells, and the sample is processed. It is possible to eliminate the need for preparation at the time of use, and to prevent erroneous preparation. Moreover, since the antigen can be extracted more efficiently by heating the sample pre-treatment, the test time can be shortened and the test accuracy is improved.
本発明の実施形態の一つは、免疫学的測定のための検体の前処理方法であって、以下の［１］から［３］までの工程を含む方法である。
［１］亜硝酸を含有する試薬溶液、および、クエン酸または酢酸を含有する試薬溶液を、３以上のウェルを有するカートリッジのうち２つのウェルに、それぞれ別々に保持する工程。
［２］前記カートリッジのうち、前記２種類の試薬溶液が保持されていないウェルにて、自動で前記２種類の試薬溶液および検体を混合する工程。
［３］前記２種類の試薬溶液と検体との混合溶液を一定時間保持する工程。
One embodiment of the present invention is a sample pretreatment method for immunological measurement, and includes the following steps [1] to [3].
[1] A step of separately holding a reagent solution containing nitrous acid and a reagent solution containing citric acid or acetic acid in two wells of a cartridge having three or more wells.
[2] A step of automatically mixing the two types of reagent solution and the specimen in a well of the cartridge in which the two types of reagent solution are not held.
[3] A step of holding a mixed solution of the two types of reagent solutions and the specimen for a predetermined time.
測定対象物質を成分として含有する検体としては、血清、血漿、血液、髄液等の各種体液や尿等の***物、便等の希釈物から固形分を除去したもの、鼻腔ぬぐい液、鼻腔吸引液、咽頭ぬぐい液、唾液、鼻汁などから採取した各種組織の抽出液等が挙げられ、特に限定されない。これらに希釈や前処理等の操作を行って得たものも、検体となりうる。なお、検体には必ずしも測定対象物質が成分として含有されている必要はなく、測定対象物質を成分として含有する可能性があることを前提とした検体であってもよい。 Samples containing the substance to be measured as a component include various body fluids such as serum, plasma, blood, and cerebrospinal fluid, excreta such as urine, diluted stool, nasal wipes, and nasal aspiration Examples include extracts of various tissues collected from liquids, throat swabs, saliva, nasal discharge, etc., and are not particularly limited. Those obtained by subjecting these to operations such as dilution and pretreatment can also serve as specimens. Note that the specimen does not necessarily contain the measurement target substance as a component, and may be a specimen premised on the possibility of containing the measurement target substance as a component.
本発明の方法が適用される免疫学的測定の対象は特に限定されない。例えば、被測定物質としては、タンパク質、脂質、糖類があり、それには例えば、各種抗原、抗体、レセプター、酵素などが含まれる。 The subject of the immunological measurement to which the method of the present invention is applied is not particularly limited. For example, the substances to be measured include proteins, lipids, and saccharides, and examples thereof include various antigens, antibodies, receptors, enzymes, and the like.
なかでも、本発明の方法が好適に用いられるのは、前記測定対象が微生物等の細胞壁の内部に存在し、測定のためには前記微生物等から測定対象を溶出させる必要がある場合である。このような測定対象としては、グラム陰性菌、グラム陽性菌が挙げられ、中でもグラム陽性菌に属するＡ群β溶血連鎖球菌中の抗原を溶出させる際に好適である。 In particular, the method of the present invention is preferably used when the measurement object exists inside a cell wall of a microorganism or the like and the measurement object needs to be eluted from the microorganism or the like for measurement. Examples of such measurement targets include gram-negative bacteria and gram-positive bacteria, and are particularly suitable for eluting antigens in group A β-hemolytic streptococci belonging to gram-positive bacteria.
本発明の方法では３以上のウェルを有するカートリッジを用いる。前記ウェルは、免疫学的測定において、目的に応じて種々の役割を有する。例えば、本発明の方法に必要な試薬を保持および／または保存する容器としての役割や、試薬や検体等を混合させる混合槽および／または反応槽としての役割を有する。さらに別の目的に使用させてもよい。 In the method of the present invention, a cartridge having three or more wells is used. The well has various roles in immunological measurement depending on the purpose. For example, it has a role as a container for holding and / or storing a reagent necessary for the method of the present invention, and a role as a mixing tank and / or a reaction tank for mixing reagents and specimens. Further, it may be used for another purpose.
本発明の前処理方法によれば、亜硝酸を含有する試薬溶液、および、酢酸またはクエン酸を含有する試薬溶液を、３以上のウェルを有するカートリッジのうち２つの別々のウェルに保持させ、前記カートリッジのうち、前記２種類の試薬溶液が保持されていない別のウェルにて、自動で前記２種類の試薬溶液および検体を混合し一定時間保持する。これらの工程によって、亜硝酸と酢酸またはクエン酸の反応により発生する窒素ガスにて、測定対象を含んでいる微生物等の細胞壁を破壊し、測定対象物質を溶出させる。 According to the pretreatment method of the present invention, a reagent solution containing nitrous acid and a reagent solution containing acetic acid or citric acid are held in two separate wells of a cartridge having three or more wells, The two types of reagent solutions and the sample are automatically mixed in another well of the cartridge in which the two types of reagent solutions are not held and held for a certain period of time. Through these steps, the cell wall of a microorganism or the like containing the measurement target is destroyed with nitrogen gas generated by the reaction of nitrous acid and acetic acid or citric acid, and the measurement target substance is eluted.
自動で試薬や検体を混合する方法は、種々の方法が知られており特に限定されない。例えば、モーター等により２次元または３次元方向の制御が可能な分注用のポンプやピペット等と、チップとの組み合わせによって、試料や試薬を分注・混合すればよい。前記モーターは、従来公知の駆動手段を好適に利用可能であり、例えば、サーボモーター、ステッピングモーターやリニアモーターなど機械的に駆動するものを挙げることができる。前記分注用ポンプには、例えば、ペンシルポンプなどを挙げることができる。また、前記チップは、前記分注用のポンプやピペットに合ったものを適宜用いればよい。また、これらは、市販の自動分注装置を用いてもよい。 Various methods for automatically mixing reagents and specimens are known and are not particularly limited. For example, the sample and the reagent may be dispensed and mixed by combining a tip with a dispensing pump or pipette that can be controlled in two or three dimensions by a motor or the like. Conventionally known driving means can be suitably used for the motor, and examples thereof include mechanically driven motors such as a servo motor, a stepping motor, and a linear motor. Examples of the dispensing pump include a pencil pump. Moreover, what is necessary is just to use suitably the said chip | tip suitable for the said pumps and pipettes for dispensing. Moreover, you may use a commercially available automatic dispensing apparatus for these.
自動で亜硝酸を含有する試薬溶液および酢酸またはクエン酸を含有する試薬溶液を混合することにより、医療現場での用時調製を不要にできるとともに、誤った調製をも防止できる。また検体の前処理を加温して行うことでより効率良く抗原を抽出できることから検査時間を短縮することができ、かつ検査精度が向上する。 By automatically mixing a reagent solution containing nitrous acid and a reagent solution containing acetic acid or citric acid, preparation at the time of use in the medical field can be made unnecessary and erroneous preparation can be prevented. Moreover, since the antigen can be extracted more efficiently by heating the sample pre-treatment, the test time can be shortened and the test accuracy is improved.
本発明の方法で用いられる亜硝酸を含有する試薬溶液中の亜硝酸濃度は特に限定されないが、好ましい下限は１ｍｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは２ｍｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは４ｍｍｏｌ／Ｌである。一方、好ましい上限は１５ｍｍｏ／Ｌ、さらに好ましくは１０ｍｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは８ｍｍｏｌ／Ｌである。 The concentration of nitrous acid in the reagent solution containing nitrous acid used in the method of the present invention is not particularly limited, but the preferred lower limit is 1 mmol / L, more preferably 2 mmol / L, and even more preferably 4 mmol / L. On the other hand, a preferable upper limit is 15 mmol / L, more preferably 10 mmol / L, and still more preferably 8 mmol / L.
本発明の方法で用いられるクエン酸を含有する試薬溶液中のクエン酸濃度は特に限定されないが、好ましい下限は０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは０．０２ｍｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは０．０２ｍｍｏｌ／Ｌである。一方、好ましい上限は１．０ｍｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは０．５ｍｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは０．１ｍｍｏｌ／Ｌである。 The concentration of citric acid in the reagent solution containing citric acid used in the method of the present invention is not particularly limited, but the preferred lower limit is 0.01 mmol / L, more preferably 0.02 mmol / L, more preferably 0.02 mmol / L. On the other hand, a preferable upper limit is 1.0 mmol / L, more preferably 0.5 mmol / L, and further preferably 0.1 mmol / L.
本発明の方法で用いられる酢酸を含有する試薬溶液中の酢酸濃度は特に限定されないが、好ましい下限は０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは０．１ｍｍｏｌ／Ｌである。一方、好ましい上限は５．０ｍｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは１．０ｍｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは０．８ｍｍｏｌ／Ｌである。 The concentration of acetic acid in the reagent solution containing acetic acid used in the method of the present invention is not particularly limited, but a preferable lower limit is 0.01 mmol / L, more preferably 0.05 mmol / L, and further preferably 0.1 mmol / L. is there. On the other hand, the preferable upper limit is 5.0 mmol / L, more preferably 1.0 mmol / L, and still more preferably 0.8 mmol / L.
本発明の方法において、亜硝酸を含有する試薬溶液、クエン酸または酢酸を含有する試薬溶液、および、検体を混合させた溶液を保持する温度は、特に限定されないが、好ましい下限は３０℃であり、さらに好ましい下限は３５℃である。一方、好ましい上限は５０℃であり、さらに好ましくは４５℃である。
温度を保持させる方法は、種々の方法が知られており特に限定されない。例えば、市販のヒーターおよびサーミスタに、市販のヒートブロックを適宜組み合わせて用いればよい。
In the method of the present invention, the temperature at which the reagent solution containing nitrous acid, the reagent solution containing citric acid or acetic acid, and the solution in which the sample is mixed is not particularly limited, but the preferred lower limit is 30 ° C. A more preferred lower limit is 35 ° C. On the other hand, a preferable upper limit is 50 ° C, and more preferably 45 ° C.
Various methods are known for maintaining the temperature, and are not particularly limited. For example, a commercially available heat block may be appropriately combined with a commercially available heater and thermistor.
本発明の方法において、亜硝酸を含有する試薬溶液、クエン酸または酢酸を含有する試薬溶液、および、検体を混合させた溶液を保持する時間は、特に限定されないが、好ましい下限は１０秒であり、さらに好ましい下限は３０秒である。一方、好ましい上限は２分であり、さらに好ましくは１分である。 In the method of the present invention, the time for holding the reagent solution containing nitrous acid, the reagent solution containing citric acid or acetic acid, and the solution in which the sample is mixed is not particularly limited, but the preferred lower limit is 10 seconds. A more preferred lower limit is 30 seconds. On the other hand, the preferred upper limit is 2 minutes, more preferably 1 minute.
本発明の別の実施形態は、前記の前処理方法で処理された検体中の測定対象物質を、免疫学的方法で測定する方法である。免疫学的方法としては特に限定されない。ＥＬＩＳＡやイムノクロマトグラフィーなど、種々の方法を適用することができる。 Another embodiment of the present invention is a method of measuring a substance to be measured in a specimen treated by the pretreatment method by an immunological method. The immunological method is not particularly limited. Various methods such as ELISA and immunochromatography can be applied.
本発明の別の実施形態は、前記の前処理方法や免疫学的測定法に用いるためのカートリッジであって、３以上のウェルを有し、そのうち２つのウェルに、亜硝酸を含有する試薬溶液、および、クエン酸または酢酸を含有する試薬溶液が、それぞれ別々に保持されているカートリッジである。 Another embodiment of the present invention is a cartridge for use in the above-described pretreatment method or immunological measurement method, which has three or more wells, of which two wells contain a nitrous acid reagent solution. , And a reagent solution containing citric acid or acetic acid is held separately.
前記カートリッジの形態は、特に限定されるものではない。
ウェルの数は、検体の前処理に用いるのであれば、３以上であれば特に限定されない。前処理された検体をさらに免疫学的測定法に供する場合は、さらに、測定対象物質の測定原理（たとえば測定のステップ数や必要な試薬数など）に応じて適宜増やせば良く、好ましくは５以上である。ウェル数の上限は特にないが、１測定項目あたり１５以下であることが好ましく、さらに好ましくは１３以下である。
ウェルの大きさやカートリッジ上の位置は特に限定されない。例えば、入手できる検体の量、測定に必要な試薬量、適用する機器との対応関係など事情に応じて適宜決めればよい。
The form of the cartridge is not particularly limited.
The number of wells is not particularly limited as long as it is 3 or more as long as it is used for sample pretreatment. When the pretreated specimen is further subjected to an immunological measurement method, it may be appropriately increased according to the measurement principle of the substance to be measured (for example, the number of measurement steps, the number of necessary reagents, etc.), preferably 5 or more. It is. The upper limit of the number of wells is not particularly limited, but is preferably 15 or less per measurement item, and more preferably 13 or less.
The size of the well and the position on the cartridge are not particularly limited. For example, what is necessary is just to determine suitably according to circumstances, such as the quantity of the sample which can be obtained, the amount of reagent required for a measurement, and correspondence with the apparatus to apply.
本発明で用いるカートリッジの例を図１に示す。本例のカートリッジは、いくつかの区切られたセルが結合した形態をしており、自動化のためにこのカートリッジと組み合わせて用いる機器の制御動作を単純化させるために、各セルの結合は一次元方向（本例では一直線上）に直列となっている（前記一次元方向は、円周上であってもかまわない。）。各セルの大きさは同じでなくてもよく、図１の例では検体を分注するセルの大きさが他のセルとは異なっている。 An example of the cartridge used in the present invention is shown in FIG. The cartridge of this example has a form in which several divided cells are combined, and in order to simplify the control operation of the device used in combination with this cartridge for automation, the combination of each cell is one-dimensional. It is in series in the direction (in this example, on a straight line) (the one-dimensional direction may be on the circumference). The size of each cell may not be the same, and in the example of FIG. 1, the size of the cell into which the sample is dispensed is different from the other cells.
本発明で用いるカートリッジは、少なくとも、亜硝酸を含有する試薬溶液、および、クエン酸または酢酸を含有する試薬溶液が、使用直前までシールされ密封されていることが好ましい。また、前記シールは、測定時に前記チップにより穿孔される構造となっていることが好ましい。そのような構造に適したフィルムとしては、特に限定されるものではないが、アルミフィルム、アルミ蒸着フィルムが例示される。 In the cartridge used in the present invention, it is preferable that at least a reagent solution containing nitrous acid and a reagent solution containing citric acid or acetic acid are sealed and sealed until just before use. Moreover, it is preferable that the said seal | sticker becomes a structure pierced by the said chip | tip at the time of a measurement. Although it does not specifically limit as a film suitable for such a structure, An aluminum film and an aluminum vapor deposition film are illustrated.
カートリッジは、免疫学的測定に用いられる抗体の種類を、測定対象に応じて適宜変更する必要があるので、測定対象ごとに別々の試薬を充填する必要がある。これらを区別するため、カートリッジには、バーコードリーダーで読み取れるようなバーコードを貼り付けてもよい。 Since it is necessary for the cartridge to appropriately change the type of antibody used for immunological measurement in accordance with the measurement target, it is necessary to fill different reagents for each measurement target. In order to distinguish these, a barcode that can be read by a barcode reader may be attached to the cartridge.
本発明の別の実施形態は、前記の免疫学的測定方法に用いるための検査キットであって、以下の［１］から［２］の構成を含むキットである。
［１］３以上のウェルを有するカートリッジであって、そのうち２つのウェルに、亜硝酸を含有する試薬溶液、および、クエン酸または酢酸を含有する試薬溶液が、それぞれ別々に保持されているカートリッジ。
［２］検体中の測定対象物質検出用の抗体を含む試薬。
Another embodiment of the present invention is a test kit for use in the immunological measurement method described above, and includes the following [1] to [2].
[1] A cartridge having three or more wells, in which a reagent solution containing nitrous acid and a reagent solution containing citric acid or acetic acid are separately held in two wells, respectively.
[2] A reagent containing an antibody for detecting a substance to be measured in a specimen.
前記キットにおいて、検体中の測定対象物質検出用の抗体を含む試薬は、前記カートリッジとは別に用意されても良いし、前記カートリッジに保持されて提供されても良い。前記検出用試薬がカートリッジに保持される場合は、カートリッジのウェルの数は、少なくとも、３に前記検出用試薬の数を上乗せした数でなければならない。 In the kit, a reagent containing an antibody for detecting a substance to be measured in a sample may be prepared separately from the cartridge, or may be held and provided in the cartridge. When the detection reagent is held in a cartridge, the number of wells in the cartridge must be at least 3 plus the number of detection reagents.
このようなキットの構成として、測定対象物質がＡ群β溶血連鎖球菌である場合を例に、以下、説明する。
本発明のキットの構成として、例えば、特許文献２に記載の試薬カートリッジ（図１）の各ウェルに以下の溶液が別々に保持されているキットを用いることが好適である。
［Ａ］ブロック液
［Ｂ］洗浄液
［Ｃ］Ｒ１試薬（ビオチン標識抗Ａ群β溶血連鎖球菌抗体）
［Ｄ］Ｒ２試薬（アルカリフォスファターゼ標識抗Ａ群β溶血連鎖球菌抗体）
［Ｅ］Ｒ３試薬（発光基質）
［Ｆ］亜硝酸を含む溶液
［Ｇ］クエン酸を含む溶液
As an example of the configuration of such a kit, the case where the substance to be measured is group A β-hemolytic streptococci will be described below.
As a configuration of the kit of the present invention, for example, it is preferable to use a kit in which the following solutions are separately held in each well of the reagent cartridge described in Patent Document 2 (FIG. 1).
[A] Block solution [B] Wash solution [C] R1 reagent (biotin-labeled anti-group A β-hemolytic streptococcal antibody)
[D] R2 reagent (alkaline phosphatase-labeled anti-group A β-hemolytic streptococcal antibody)
[E] R3 reagent (luminescent substrate)
[F] Solution containing nitrous acid [G] Solution containing citric acid
前記ブロック液は、酵素抗体反応および酵素反応に無関係なタンパク質で固相表面を覆い、後のステップで作用させるタンパク質が固相表面に吸着されるのを防ぐためのブロッキング剤を含む。本発明で用いるブロッキング剤は、特に限定されない。例えばカゼイン、スキムミルク、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ゼラチンなどのほか、血液タンパク質または植物タンパク質を有効成分とするもの、兎血液成分などが挙げられる。なかでもカゼインが好ましい。 The blocking solution contains a blocking agent for covering the solid phase surface with an enzyme antibody reaction and a protein unrelated to the enzyme reaction and preventing the protein to be acted on in the subsequent step from being adsorbed on the solid phase surface. The blocking agent used in the present invention is not particularly limited. Examples include casein, skim milk, bovine serum albumin (BSA), gelatin, and the like, blood protein or plant protein as an active ingredient, sputum blood component, and the like. Of these, casein is preferred.
前記洗浄液はＢ／Ｆ分離等の目的で用いられる。洗浄液の組成は、測定対象物質に未結合の標識物を洗浄する機能を実用上保持するものであれば、特に限定されない。例えば、非イオン界面活性剤（例えば０．５％のＴｗｅｅｎ−２０）を含有する緩衝化生理食塩水が挙げられる。 The cleaning liquid is used for the purpose of B / F separation and the like. The composition of the cleaning solution is not particularly limited as long as it practically retains the function of cleaning the label unbound to the substance to be measured. For example, buffered saline containing a nonionic surfactant (eg, 0.5% Tween-20).
測定対象物質の検出用に用いる抗体としてはポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれも使用可能であり、産生動物種も限定されない。前記Ｒ１試薬としてはアミノ基またはスルフヒドリル基にビオチンを標識した抗体を用いることが好適であり、前記Ｒ１試薬中の成分としては防腐剤や蛋白成分等を含んでよい。 As the antibody used for detection of the substance to be measured, either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody can be used, and the species of animal produced is not limited. As the R1 reagent, it is preferable to use an antibody in which biotin is labeled on an amino group or a sulfhydryl group, and the components in the R1 reagent may include preservatives, protein components, and the like.
また、検出に利用する酵素−基質系についても限定されない。例えば、ペルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼを用いる系が挙げられる。酵素活性の検出に用いる基質も特に限定されない。これらは、市販品を用いることができる。基質を含む基質液の組成は、その機能を損ねない範囲で、特に限定されない。 Further, the enzyme-substrate system used for detection is not limited. For example, a system using peroxidase or alkaline phosphatase can be mentioned. The substrate used for detecting the enzyme activity is not particularly limited. Commercial products can be used for these. The composition of the substrate solution containing the substrate is not particularly limited as long as the function is not impaired.
例えば、前記Ｒ２試薬としてはアミノ基またはスルフヒドリル基にアルカリフォスファターゼを標識した抗体を用いることが好適であり、前記Ｒ２試薬中の成分としては防腐剤や蛋白成分等を含んでよい。 For example, it is preferable to use an antibody in which an amino group or a sulfhydryl group is labeled with alkaline phosphatase as the R2 reagent, and the components in the R2 reagent may include preservatives, protein components, and the like.
また、例えば、前記Ｒ３試薬（発光基質）としては、Ｌｕｍｉｇｅｎ−ＰＰＤ、ＡＰＳ−５（以上Ｌｕｍｉｇｅｎ社）、ＡＭＰＰＤ 、ＣＳＰＤ、ＣＤＰ−ＳＴＡＲ（以上Ｔｒｏｐｉｘ社）等を使用することができるが、これらに限定されない。 Further, for example, as the R3 reagent (luminescent substrate), Lumigen-PPD, APS-5 (Lumigen), AMPPD, CSPD, CDP-STAR (Tropix), etc. can be used. It is not limited.
また、前記試薬カートリッジとは別に、
［Ｈ］抗ビオチン抗体がメンブレン上に固相化された反応容器
を組み合わせて用いることが好適である。
In addition to the reagent cartridge,
[H] It is preferable to use a combination of reaction vessels in which an anti-biotin antibody is immobilized on a membrane.
反応容器上の固相としてはビーズ、磁性粒子、マイクロタイタープレート、チューブ、膜など種々のものが使用できる。好ましくはガラスフィルターである。固相化担体としてマイクロタイタープレートやチューブを用いる場合は、固相化担体自体を反応容器とすることができるが、固相化担体とは別途に各種の反応容器を用いることもできる。例えば、特許文献３や特許文献４などに記載の反応容器（図２）を用いることが好適である。図２において、（ａ）はこの容器の斜視図であり、（ｂ）はこの容器の断面図である。図２において、１：反応容器、２：開口部、３：多孔性担体、４：吸水層、５：液体不透過性容器、をそれぞれ示す。 As the solid phase on the reaction vessel, various materials such as beads, magnetic particles, microtiter plates, tubes and membranes can be used. A glass filter is preferable. When a microtiter plate or tube is used as the solid phase support, the solid phase support itself can be used as a reaction vessel, but various reaction vessels can be used separately from the solid phase support. For example, it is preferable to use the reaction container (FIG. 2) described in Patent Document 3, Patent Document 4, and the like. 2A is a perspective view of the container, and FIG. 2B is a cross-sectional view of the container. In FIG. 2, 1: reaction container, 2: opening, 3: porous carrier, 4: water-absorbing layer, 5: liquid-impermeable container are shown.
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples, but the present invention is not limited to the examples.
測定操作は東洋紡社製小型化学発光免疫自動分析装置ＰＯＣｕｂｅ（東洋紡社製）を用いて以下の様に行った。 The measuring operation was performed as follows using a small chemiluminescence immunoanalyzer POCube (manufactured by Toyobo) manufactured by Toyobo.
（１） 各試薬はＰＯＣｕｂｅ専用１３連容器の試薬ウェルに別々に保持されている。
７．５ｍｍｏｌ／Ｌ亜硝酸ナトリウム溶液を５０μＬ、０．０４５ｍｍｏｌ／Ｌのクエン酸溶液３０μＬ、および検体ウェルに入れた検体２０μＬを別のウェルに自動分注・混合し、所定温度で所定の時間処理した。
（２）Ｒ１試薬（２．５μｇ／ｍｌビオチン標識抗Ａ群β溶血連鎖球菌抗体液）３０μＬとＲ２試薬（３０ｎｇ／ｍｌ アルカリフォスファターゼ標識抗Ａ群β溶血連鎖球菌抗体液）４０μＬおよび（１）の検体処理液９０μＬを別のウェルに自動分注・混合し、４０℃で２分３０秒インキュベートし抗原−抗体のサンドイッチ複合体を形成した。
（３）ＰＯＣｕｂｅ専用反応容器（第一抗体に結合したリガンドを特異的に認識するリガンド捕捉剤が結合された多孔性フィルタ（抗ビオチン抗体を結合させたガラスフィルター固相）を含む容器）に、１重量％カゼインを含むブロッキング剤を５０μＬ添加した後、（２）でインキュベート後の抗原−抗体のサンドイッチ複合体検体・抗体混合液１３０μＬを反応容器に滴下し、４０℃で２０秒インキュベートし抗原−抗体のサンドイッチ複合体を反応容器に結合させた。
（４）インキュベート後、反応容器に洗浄液を８０μＬを２回分注し、ＢＦ分離を行った後、Ｒ３試薬（Ｌｕｍｉｇｅｎ社ＡＰＳ−５）３０μＬを添加し、発光強度を測定した。
(1) Each reagent is separately held in a reagent well of a 13-container dedicated container for POCube.
50 μL of a 7.5 mmol / L sodium nitrite solution, 30 μL of a 0.045 mmol / L citric acid solution, and 20 μL of a sample placed in a sample well are automatically dispensed and mixed in another well and processed at a predetermined temperature for a predetermined time. did.
(2) 30 μL of R1 reagent (2.5 μg / ml biotin-labeled anti-group A hemolytic streptococcal antibody solution) and 40 μL of R2 reagent (30 ng / ml alkaline phosphatase-labeled anti-group A hemolytic streptococcal antibody solution) and (1) 90 μL of the sample treatment solution was automatically dispensed and mixed in another well and incubated at 40 ° C. for 2 minutes 30 seconds to form an antigen-antibody sandwich complex.
(3) In a reaction container dedicated to POCube (a container containing a porous filter (a glass filter solid phase to which an anti-biotin antibody is bound) to which a ligand capture agent that specifically recognizes a ligand bound to the first antibody is bound), After adding 50 μL of a blocking agent containing 1% by weight casein, 130 μL of the antigen-antibody sandwich complex / antibody mixed solution after incubation in (2) was dropped into the reaction vessel, and incubated at 40 ° C. for 20 seconds. The antibody sandwich complex was bound to the reaction vessel.
(4) After incubation, 80 μL of the washing solution was dispensed twice into the reaction vessel, and after BF separation, 30 μL of R3 reagent (Lumigen APS-5) was added, and the luminescence intensity was measured.
上記、（１）の検体前処理条件について、例えば非特許文献１に記載されている「スタットチェックＴＭストレップＡ−ＩＩ」のような通常のキットでは室温（２５℃）で６０秒処理する手順となっている（非特許文献１、２ページ左欄上部「操作手順３」を参照）。したがって、２５℃・６０秒処理条件を比較例として、以下の通り他の条件を評価した。
加温温度；３０℃、３５℃、４０℃、４５℃、５０℃
処理時間；１０秒、３０秒、６０秒、１２０秒
With regard to the specimen pretreatment conditions in (1) above, for example, a normal kit such as “Statcheck TM Strep A-II” described in Non-Patent Document 1 is treated at room temperature (25 ° C.) for 60 seconds; (Refer to “Procedure 3” at the top of the left column of Non-Patent Documents 1 and 2). Therefore, the other conditions were evaluated as follows, using the treatment conditions at 25 ° C. for 60 seconds as a comparative example.
Heating temperature: 30 ° C, 35 ° C, 40 ° C, 45 ° C, 50 ° C
Processing time: 10 seconds, 30 seconds, 60 seconds, 120 seconds
検体はＡ群β溶血連鎖球菌（ＡＴＣＣ株１４２８９株）をＴｒｉｔｏｎＸ−１００ ２．０ｇ／Ｌを含む溶液で希釈し検体とした。希釈濃度の異なる検体１および検体２を測定した。 A specimen was prepared by diluting group A β-hemolytic streptococci (ATCC strain 14289) with a solution containing Triton X-100 2.0 g / L. Sample 1 and sample 2 having different dilution concentrations were measured.
検体１の測定結果を表１および表２に示す。表１は検体１を測定して得られた発光強度を示す。表中の数値は、発光値を単位とする。表２は検体１を測定して得られた発光強度について、比較例；２５℃・６０秒処理を基準にした相対％を示す。 The measurement results of Sample 1 are shown in Table 1 and Table 2. Table 1 shows the luminescence intensity obtained by measuring the specimen 1. The numerical values in the table are in units of luminescence values. Table 2 shows the relative percentage with respect to the emission intensity obtained by measuring the specimen 1 based on the comparative example; treatment at 25 ° C. for 60 seconds.
検体２の測定結果を表３および表４に示す。表３は検体２を測定して得られた発光強度を示す。表中の数値は、発光値を単位とする。表４は検体２を測定して得られた発光強度について、比較例；２５℃・６０秒処理を基準にした相対％を示す。 The measurement results of Sample 2 are shown in Table 3 and Table 4. Table 3 shows the luminescence intensity obtained by measuring the specimen 2. The numerical values in the table are in units of luminescence values. Table 4 shows the relative percentage of the luminescence intensity obtained by measuring the specimen 2 based on the comparative example; 25 ° C. and 60 seconds treatment.
上記の結果より３０℃〜５０℃加温・１０秒〜１２０秒処理した場合、比較例（２５℃・６０秒処理）と同等以上の感度を確認した。加温処理することでより効率よく短時間で子抗原を抽出できることを確認した。 From the above results, when the treatment was performed at 30 ° C. to 50 ° C. for 10 seconds to 120 seconds, sensitivity equal to or higher than that of the comparative example (25 ° C./60 seconds treatment) was confirmed. It was confirmed that child antigens can be extracted more efficiently and in a short time by heating treatment.
本発明により、Ａ群連鎖球菌の測定において、亜硝酸溶液と酢酸溶液またはクエン酸溶液を混合し処理する工程を自動化することで前処理試薬の用時調製を不要とし試薬の誤調製を防止することが可能となった。さらに、前処理を３０℃〜５０℃で１０秒〜２分間加温することで、効率よく短時間で抗原を抽出できることから臨床現場での測定の簡便性、迅速性を向上することができることから、産業界に大きく寄与することが期待される。 According to the present invention, in the measurement of group A streptococci, the process of mixing and treating a nitrous acid solution and an acetic acid solution or a citric acid solution is automated to eliminate the need for pretreatment reagent preparation and prevent erroneous reagent preparation. It became possible. Furthermore, by preheating the pretreatment at 30 ° C. to 50 ° C. for 10 seconds to 2 minutes, the antigen can be extracted efficiently and in a short time, thereby improving the convenience and speed of measurement at the clinical site. It is expected to make a significant contribution to industry.
Claims (8)
［１］亜硝酸を含有する試薬溶液、および、クエン酸または酢酸を含有する試薬溶液を、３以上のウェルを有するカートリッジのうち２つのウェルに、それぞれ別々に保持する工程。
［２］前記カートリッジのうち、前記２種類の試薬溶液が保持されていないウェルにて、自動で前記２種類の試薬溶液および検体を混合する工程。
［３］前記２種類の試薬溶液と検体との混合溶液を一定時間保持する工程。 A method for pretreatment of a specimen for immunological measurement, comprising the following steps [1] to [3].
[1] A step of separately holding a reagent solution containing nitrous acid and a reagent solution containing citric acid or acetic acid in two wells of a cartridge having three or more wells.
[2] A step of automatically mixing the two types of reagent solution and the specimen in a well of the cartridge in which the two types of reagent solution are not held.
[3] A step of holding a mixed solution of the two types of reagent solutions and the specimen for a predetermined time.
［１］３以上のウェルを有するカートリッジであって、そのうち２つのウェルに、亜硝酸を含有する試薬溶液、および、クエン酸または酢酸を含有する試薬溶液が、それぞれ別々に保持されているカートリッジ。
［２］検体中の測定対象物質検出用の抗体を含む試薬。 It is a test | inspection kit for using for the method in any one of Claims 1-4, Comprising: The kit containing the structure of the following [1] to [2].
[1] A cartridge having three or more wells, in which a reagent solution containing nitrous acid and a reagent solution containing citric acid or acetic acid are separately held in two wells, respectively.
[2] A reagent containing an antibody for detecting a substance to be measured in a specimen.
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